CN102305831B - 脑蛋白水解物片的检测方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种脑蛋白水解物片的检测方法。本发明方法包括对脑蛋白水解物片中小分子肽类的鉴别和含量测定等步骤。本发明方法通过对样品进行完全的酸水解，测定脑蛋白水解物片中的氨基酸总量，并对脑蛋白水解物片中所含游离氨基酸进行含量测定，制定了针对小分子肽类的合理的质量控制指标，完善了脑蛋白水解物片的检测方法，为脑蛋白水解物片提供了全面、准确的质量控制方法。保证了该产品中有效成分的含量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。适应于工业化生产的质量控制，有较大的应用价值。

Description

脑蛋白水解物片的检测方法

技术领域

本发明涉及生物制剂的检测方法，具体涉及脑蛋白水解物片的检测方法。

背景技术

脑蛋白水解物片为从健康猪新鲜大脑组织中提取的一种活性肽类水解物，含有多种氨基酸及脑磷脂、卵磷脂、肽类神经生长因子等。在临床上广泛用于改善失眠、头痛、记忆力下降、头晕及烦躁等症状，可促进脑外伤后遗症、脑血管疾病后遗症、脑炎后遗症、急性脑梗塞和急性脑外伤的康复。药理实验结果显示，脑蛋白水解物为一种大脑所特有的肽能神经营养物质。能以多种方式作用于中枢神经，调节和改善神经元的代谢，促进突触的形成，诱导神经元的分化，并进一步保护神经细胞免受各种缺血和神经毒素的损害。脑蛋白水解物可通过血脑屏障，促进脑内蛋白质的合成，影响呼吸链，具有抗缺氧的保护能力，改善脑内能量代谢，激活腺苷酸环化酶和催化其它激素系统。提供神经递质、肽类激素及辅酶前体。脑蛋白水解物片现行的质量标准收载于《中国国家药品标准》第十六册(WS₁-XG-131-2002)，药品规格为6.5mg(按氨基氮计算)：14.4mg(按总氮计算)。在该标准中，仅有2项显色反应作为鉴别反应，并只采用滴定法对产品的总氮、氨基氮含量进行控制，该方法专属性与有效性都较差。脑蛋白水解物的主要成分为小分子肽类和氨基酸，动物实验显示，脑蛋白水解物类药物可显著增强大鼠对缺氧的耐受能力，而同质的多种氨基酸混和物则无此作用。药理试验文献报道，脑蛋白水解物对于神经细胞作用与神经生长因子(NGF)相似，但不同的是，NGF为巨分子肽，而脑蛋白水解物是小分子肽，且能通过血脑屏障。脑蛋白水解物中有些肽作为神经营养因子，另一些则可能直接增加星形胶质细胞的NGF产量，或者通过调节肾上腺素神经输入到调节NGF代谢的重要靶细胞，有些还能与神经或激素相互作用，导致神经的代谢变化。(文献出处：脑蛋白水解物类药物中活性成分的比较分析，东北林业大学，李想，7-8.)，另一项药理试验结果显示，从猪脑蛋白水解物中分离出5种小分子肽组份，并采用东莨菪碱所致的小鼠记忆获得障碍模型，通过小鼠被动回避跳台试验测定组份的生物活性，结果显示，组份A4、A5具有明显的生物活性，能显著改善记忆获得障碍小鼠的学习记忆能力。(文献出处：猪脑蛋白水解物中小分子肽的制备及生物活性测定，张惠敏、王娅莉、耿亚鹏，河北医药，2006，28(3)：223-224.)。故脑蛋白水解物具有生物活性及药效作用的为小分子肽类。但目前现行的质量标准中，只对游离氨基酸(氨基氮)进行控制，并未对小分子肽类的含量进行控制，因此，缺乏对脑蛋白水解物片药效及产品质量控制的科学的方法及指标。

发明内容

本发明所要解决的技术问题在于克服上述不足之处，根据脑蛋白水解物片各组分的特性，尤其是对于发挥主要药理药效作用的小分子肽类，研究设计脑蛋白水解物片的检测方法。

本发明通过分子排阻色谱法对小分子肽类进行了鉴别，并采用氨基酸分析方法来测定本品的多肽含量。通过对样品进行完全的酸水解，测定脑蛋白水解物片中的氨基酸总量，并对脑蛋白水解物片中所含游离氨基酸进行含量测定，通过水解后氨基酸总量减去样品中游离的氨基酸含量，准确的计算脑蛋白水解物片中的多肽含量，制定出针对小分子肽类的合理的质量控制指标。提高了产品质量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。

本发明提供了一种脑蛋白水解物片的检测方法。

本发明的脑蛋白水解物片的检测方法包括下列步骤：

(1)鉴别脑蛋白水解物片中所含小分子肽类：采用高效液相法，取脑蛋白水解物片适量，研细，加水10ml溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液。以脑蛋白水解物对照溶液(购自中国生物制品检验所)为对照品，色谱柱用TSK GEL 2000SWxl型凝胶色谱柱。取磷酸氢二钾10.63g与磷酸二氢钾5.31g，加异丙醇50ml，加水至800ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000ml为流动相，检测波长为280nm，鉴别脑蛋白水解物片中所含小分子肽类。供试品的肽图与脑蛋白水解物对照溶液肽图比较，供试品溶液峰面积的保留时间应与对照溶液的基本一致。(2)测定脑蛋白水解物片中的多肽含量：采用高效液相法，以天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸盐酸盐(Lys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)16种氨基酸为对照品，D-正亮氨酸为内标物，配制适当浓度的对照品溶液及内标溶液。流动相A：取乙酸钠19.05g，加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00，流动相B：60％乙腈，梯度洗脱。检测波长为248nm。通过内标法精密测定脑蛋白水解物片水解后氨基酸总量及脑蛋白水解物片中游离的氨基酸含量，采用水解后氨基酸总量减去样品中游离的氨基酸含量，计算脑蛋白水解物片中的多肽含量。要求脑蛋白水解物片每片含肽量不少于40.0mg。

本发明方法所述多肽含量测定包括下列步骤：

i、色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A：取乙酸钠19.05g，加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00，流动相B：60％乙腈，梯度洗脱(见下表)。柱温为37.0℃，检测波长：248nm。

表1洗脱梯度表

ii、水解氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，研细，精密称取适量，置硬质安瓿中，加内标溶液1ml和盐酸2ml，摇匀，充氮封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，作为水解氨基酸供试品溶液，衍生后进样。

iii、游离氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，研细，精密称取适量，置100ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml和内标溶液1ml，加水稀释至刻度，滤过，作为游离氨基酸供试品溶液，衍生后进样。

iv、以水解后氨基酸总量减去游离氨基酸总量(色氨酸除外)，计算肽含量，每片含肽量不少于40.0mg。

本发明方法通过对脑蛋白水解物片中小分子肽类的鉴别和含量测定，完善了脑蛋白水解物片的检测方法，为脑蛋白水解物片提供了全面、准确的质量控制方法。保证了该产品中有效成分的含量可控性，使制剂各组分达到有效剂量范围，从而保证疗效。适应于工业化生产的质量控制，有较大的应用价值。

下面通过实施例对本发明方法及其方法的确定作进一步的描述。

附图说明

图1脑蛋白水解物对照品肽图谱

图2实施例1脑蛋白水解物片供试品肽图谱

图3氨基酸对照品色谱图

图4实施例1脑蛋白水解物片游离氨基酸色谱图

图5实施例1脑蛋白水解物片水解氨基酸色谱图

具体实施方式

实施例1、脑蛋白水解物片(生产厂家：上海实业联合集团长城药业，规格：36片/盒)

1、肽类的鉴别

(1)方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。

(2)仪器与试剂

仪器：Agilent 1100液相色谱仪

试剂：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸，均为分析纯。异丙醇(色谱纯)。水(双蒸水，自制)

对照品：脑蛋白水解物对照品溶液(中国生物制品检验所，批号：140697-200602)。

流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾10.63g与磷酸二氢钾5.31g，加异丙醇50ml，加水至约800ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000ml)。流速0.6ml/min。

检测波长：280nm。

色谱柱：TSK GEL 2000SWxl型凝胶色谱柱。

(3)样品溶液的制备：

对照品溶液的制备：取中检所购得脑蛋白水解物对照品溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取样品2片，研细，加水10ml溶解，滤过，作为供试品溶液。

脑蛋白水解物空白溶液的制备：取糖粉120g、淀粉40g、羟苯乙酯0.1g、硬脂酸镁1.5g，混和均匀，制得脑蛋白水解物空白颗粒，取该颗粒适量，研细，加水10ml溶解，滤过，作为脑蛋白水解物空白溶液。

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与脑蛋白水解物空白溶液各10μl，注入液相色谱仪，检测波长为280nm，测定，即得。

结论：供试品的肽图与脑蛋白水解物对照溶液肽图比较，供试品溶液峰面积的保留时间应与对照溶液的基本一致。而脑蛋白水解物空白对检测无干扰。

见图2。

2、多肽含量测定

(1)方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。

(2)仪器与试剂

仪器：Waters 2695/2487液相色谱仪

试剂：乙酸钠、磷酸均为分析纯。乙腈(色谱纯)。水(双蒸水，自制)。WatersAccQ-Fluor试剂盒(美国Waters公司，氨基酸衍生用)。

对照品：16种氨基酸对照品(中检所批号：624-200104)。D-正亮氨酸(中检所批号：140687-200401)。

流动相：

流动相A：取乙酸钠19.05g，加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00。

流动相B：60％乙腈溶液。

流速：1.4ml/min，梯度洗脱，洗脱条件见下表1：

检测波长：248nm。

色谱柱：Kromasil 100-5C₁₈ 250mm×4.6mm。柱温为37.0℃。

(3)样品溶液的制备：

对照品溶液的制备：以天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸盐酸盐(Lys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)16种氨基酸为对照品，取样如下表：

表2氨基酸对照品取样表

以6mol/L盐酸溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1ml至100ml容量瓶中，精密加入内标溶液(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)1ml，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：

游离氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，精密称定，研细。称取该粉末0.72g，精密称定，置100ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml和内标溶液1ml(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)，加水稀释至刻度，滤过，作为游离氨基酸供试品溶液。

(4)测定：

水解氨基酸含量测定：称取同批号脑蛋白水解物片粉末0.24g，精密称定，置硬质安瓿中，加内标溶液1ml(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)和盐酸2ml，封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，作为水解氨基酸供试品溶液。

测定法：采用AccQ-Tag氨基酸分析法，分别对对照品溶液、游离氨基酸供试品溶液水解氨基酸供试品溶液进行衍生后进样，测定含量，以水解后氨基酸总量减去游离氨基酸总量(色氨酸除外)，计算肽含量为47.1mg/片，符合规定。见图4、图5。

实施例2、肽类的鉴别方法的专一性

(1)方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。

(2)仪器与试剂

仪器：Agilent 1100液相色谱仪

试剂：磷酸氢二钾、磷酸二氢钾、磷酸，均为分析纯。异丙醇(色谱纯)。水(双蒸水，自制)

对照品：脑蛋白水解物对照品溶液(中检所批号：140697-200602)。

流动相：磷酸盐缓冲液(取磷酸氢二钾10.63g与磷酸二氢钾5.31g，加异丙醇50ml，加水至约800ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000ml)。流速0.6ml/min。

检测波长：280nm。

色谱柱：TSK GEL 2000SWxl型凝胶色谱柱。

(3)样品溶液的制备：

对照品溶液的制备：取中检所购得脑蛋白水解物对照品溶液作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：取样品2片，研细，加水10ml溶解，滤过，作为供试品溶液。

脑蛋白水解物空白溶液的制备：取空白辅料(按处方配制，除脑蛋白水解物)适量，研细，加水10ml溶解，滤过，作为脑蛋白水解物空白溶液。

(4)测定：

测定法：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液与脑蛋白水解物空白溶液各10μl，注入液相色谱仪，测定，即得。

结论：供试品的肽图与脑蛋白水解物对照溶液肽图比较，供试品溶液峰面积的保留时间应与对照溶液的基本一致。而脑蛋白水解物空白对检测无干扰。

实施例3、多肽含量测定项方法学研究

(1)方法

照高效液相色谱法(中国药典2010年版二部附录V D)测定。

(2)仪器与试剂

仪器：Waters 2695/2487液相色谱仪

试剂：乙酸钠、磷酸均为分析纯。乙腈(色谱纯)。水(双蒸水，自制)。WatersAccQ-Fluor试剂盒(美国Waters公司，氨基酸衍生用)。

对照品：16种氨基酸对照品(中检所批号：624-200104)。D-正亮氨酸(中检所批号：140687-200401)。

流动相：

流动相A：取乙酸钠19.05g，加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00。

流动相B：60％乙腈溶液。

流速：1.4ml/min，梯度洗脱，洗脱条件见下表：

Time(min)	0.0	14.0	17.0	34.0	37.0	38.0	45
								A％	89	89	89	59	59	89	89
B％	11	11	11	41	41	11	11

检测波长：248nm。

色谱柱：Kromasil 100-5C₁₈ 250mm×4.6mm。柱温为37.0℃。

(3)样品溶液的制备：

对照品溶液的制备：以天门冬氨酸(Asp)、谷氨酸(Glu)、丝氨酸(Ser)、组氨酸(His)、甘氨酸(Gly)、精氨酸(Arg)、苏氨酸(Thr)、丙氨酸(Ala)、脯氨酸(Pro)、缬氨酸(Val)、蛋氨酸(Met)、赖氨酸盐酸盐(Lys)、异亮氨酸(Ile)、亮氨酸(Leu)、苯丙氨酸(Phe)、色氨酸(Trp)16种氨基酸为对照品，取样如下表：

表2氨基酸对照品取样表

以6mol/L盐酸溶解，转移至100ml容量瓶中，加水至刻度，摇匀，作为对照品贮备液；精密量取1ml至100ml容量瓶中，精密加入内标溶液(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)1ml，加水至刻度，摇匀，作为对照品溶液。

供试品溶液的制备：

游离氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，精密称定，研细。称取该粉末0.72g，精密称定，置100ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml和内标溶液1ml(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)，加水稀释至刻度，滤过，作为游离氨基酸供试品溶液。

水解氨基酸含量测定：称取同批号脑蛋白水解物片粉末0.24g，精密称定，置硬质安瓿中，加内标溶液1ml(2mg/ml D-正亮氨酸溶液)和盐酸2ml，封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，作为水解氨基酸供试品溶液。

测定法：采用AccQ-Tag氨基酸分析法，分别对对照品溶液、游离氨基酸供试品溶液水解氨基酸供试品溶液进行衍生后进样，测定含量，以水解后氨基酸总量减去游离氨基酸总量(色氨酸除外)，计算肽含量。

(4)16种氨基酸的线性范围

精密量取氨基酸对照品贮备液，分别稀释200倍、133倍、100倍、80倍、67倍，依法测定，结果见表3。

表3线性试验结果

结论：在该色谱条件下，16种氨基酸均在浓度范围内与峰面积呈良好的线性关系。

(5)重复性试验

取供试品，照肽含量测定法项下方法处理6份，分别进行含量测定，结果见表4。

表4重复性试验结果

	水解氨基酸含量(mg/片)	游离氨基酸含量(mg/片)
			1	82.752	35.052
2	81.911	35.494
			3	81.289	35.685
4	81.628	35.708
			5	82.517	35.066
6	82.863	35.089
			平均值	82.16	35.349
RSD％	0.78	0.89

结论：脑蛋白水解物片水解氨基酸、游离氨基酸含量测定方法重复性试验结果的RSD％＜2％，证明其方法的重现性好。

(6)中间精密度

取同一份游离氨基酸供试品溶液和水解氨基酸供试品溶液，照肽含量测定法项下方法试验，于5℃放置14天后重新测定。结果如下表5：

表5中间精密度结果

结论：脑蛋白水解物片水解氨基酸、游离氨基酸含量测定方法中间精密度试验结果的RSD％＜2％，证明其测定溶液稳定，可用于脑蛋白水解物片多肽含量测定。

(7)回收率试验

取供试品20粒，精密称定，研细。

游离氨基酸含量测定：取供试品0.72g，精密称定，加内标溶液1ml，加水稀释至100ml，滤过，衍生后进样。

游离回收：取供试品0.36g，精密称定，加内标溶液1ml，分别加标准品贮备液0.4ml、0.5ml、0.6ml，加水稀释至100ml，滤过，衍生后进样。

水解氨基酸含量测定：取供试品0.24g，精密称定，置硬质安瓿中，加内标溶液1ml和盐酸2ml，封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，滤过，衍生后进样。

水解回收：取供试品0.12g，精密称定，加内标溶液1ml和盐酸2ml，分别加标准品贮备液0.4ml、0.5ml、0.6ml，封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，滤过，衍生后进样。

结果如表6、7：

表6各游离氨基酸回收率结果

表7各水解氨基酸回收率结果

结论：加样回收试验结果，游离氨基酸测定，各氨基酸的平均回收率均在97.0％-103.0％，RSD％＜5.0％，水解氨基酸测定，各氨基酸的平均回收率均在97.0％-103.0％，RSD％＜3.5％，但色氨酸在水解过程中损失，无法定量。故在计算多肽含量时，色氨酸除外，不计入含量计算。

(8)样品测定

对5批(生产厂家：上海实业联合集团长城药业，规格：36片/盒)进行了多肽含量测定，结果见表8：

表8脑蛋白水解物片多肽含量测定结果

批号	游离氨基酸含量(mg/片)	水解氨基酸含量(mg/片)	肽含量(mg/片)
				20091001	35.27	82.33	47.1
20091002	28.00	76.58	48.6
				20091004	23.99	74.64	50.7
20100604	19.78	74.51	54.7
				20100601	18.80	65.41	46.6

脑蛋白水解物片现行质量标准中规定氨基氮为6.5mg/片，总氮为14.4mg/片，即脑蛋白水解物片中肽的氮含量为7.9mg/片。而蛋白质的含氮量一般在14％-18％之间，平均为16％。故脑蛋白水解物片中含肽约为43.9mg-56.4mg/片。由表8中的5批结果可见，用氨基酸分析方法测定的肽含量在46.6mg-54.7mg/片之间，与原标准基本一致。故拟定脑蛋白水解物多肽肽含量的限度定为不少于40.0mg/片。

Claims (1)

1.脑蛋白水解物片的检测方法，其特征在于，该方法包括下列步骤：

(1)鉴别脑蛋白水解物片中所含小分子肽类：采用高效液相法，取脑蛋白水解物片适量，研细，加水10ml溶解，滤过，取滤液作为供试品溶液，以脑蛋白水解物对照溶液为对照品；色谱柱用TSK GEL 2000 SWxl型凝胶色谱柱，取磷酸氢二钾10.63g与磷酸二氢钾5.31g，加异丙醇50ml，加水至800ml，用磷酸调节pH至7.0，加水稀释至1000ml为流动相，检测波长为280nm，鉴别脑蛋白水解物片中所含小分子肽类；

(2)测定脑蛋白水解物片中的多肽含量：采用高效液相法，以天门冬氨酸、谷氨酸、丝氨酸、组氨酸、甘氨酸、精氨酸、苏氨酸、丙氨酸、脯氨酸、缬氨酸、蛋氨酸、赖氨酸盐酸盐、异亮氨酸、亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸16种氨基酸为对照品，D-正亮氨酸为内标物，配制适当浓度的对照品溶液及内标溶液；流动相A：取乙酸钠19.05g,加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00，流动相B：60%乙腈，梯度洗脱，检测波长为248nm；通过内标法精密测定脑蛋白水解物片水解后氨基酸总量及脑蛋白水解物片中游离的氨基酸含量；所述测定脑蛋白水解物片中的多肽含量包括下列步骤：

i、色谱柱用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂，流动相A：取乙酸钠19.05g,加1000ml水溶解，用磷酸调pH为5.00，流动相B：60%乙腈，梯度洗脱，柱温为37.0℃,检测波长：248nm；

ii、水解氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，研细，精密称取适量，置硬质安瓿中，加内标溶液1ml和盐酸2ml，摇匀，充氮封口，110℃水解20小时，放冷，启封，置蒸发皿中，水浴蒸干，加水稀释至100ml，作为水解氨基酸供试品溶液，衍生后进样；

iii、游离氨基酸含量测定：取脑蛋白水解物片20片，研细，精密称取适量，置100ml量瓶中，加1mol/L盐酸溶液1ml和内标溶液1ml，加水稀释至刻度，滤过，作为游离氨基酸供试品溶液，衍生后进样。

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