KR19990087623A - 셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 혈장 혼합물의 여과 - Google Patents

셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 혈장 혼합물의 여과 Download PDF

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Abstract

본 발명은 단백질 혼합물로부터 1종 이상의 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다. 보다 구체적으로, 본 발명은 셀룰로스계 여과 보조제를 이용하는 1회 이상의 분리 단계를 포함하여 혈장에 함유된 1종 이상의 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 치료제, 구체적으로 인간에 사용하기 위한 혈장계 치료제의 제조에 유용하다.

Description

셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 혈장 혼합물의 여과
본 명세서를 통해 사용된 용어, "포함한다" 또는 "포함하는" 등과 같은 용어는 문맥상 다른 의미를 나타내지 않는 한, 제시된 완전체 또는 그 완전체의 군을 포함하는 것을 의미하지만 기타 다른 완전체나 그 완전체의 군을 배제한다는 것을 의미하는 것은 아니다.
본 명세서에서 저자를 통해 제시된 공개 문헌들의 서지적 세부 내용은 본원 명세서 끝에 목록화하였다.
혈장 단백질의 기능과 각종 혈액 질환과 관련된 결손에 대한 최근의 진보된 보고와 함께 인체 혈액의 주 단백질 성분을 저장하는 기술의 향상을 통해, 치료 목적을 위하여 전혈액 보다는 인체 혈액중 특정 분획, 구체적으로 세포성 성분(적혈구, 혈소판 및 백혈구)과 혈장 단백질 분획(알부민, 섬유소원 및 진성글로불린, 가성글로불린, α-글로불린, β-글로불린 및 γ-글로불린을 비롯한 글로불린류)의 이용이 증가되었다.
특히, 인체 혈액의 혈장 단백질 분획은 기타 많은 질환중에서도 섬유소생성 질환, 섬유소용해성 질환 및 응고 질환과 면역결핍증, 예컨대 헤모필러스증, 폰 빌레브란트 질환 및 섬유소원 결핍증을 치료하기 위한 치료제 생산에 관한 의약 산업에 매우 중요하다. 치료용의 주분획은 다양한 순도의 알부민; 정상 면역 혈청 글로불린과 특정 면역 혈청 글로불린; 항혈우병성 인자 또는 제VIII인자; 제II인자, 제VII인자, 제IX인자 및 제X인자를 함유하는 프로트롬빈 복합체이다. 치료적으로 활성인 혈장 분획을 이용하면 과다혈증의 위험이 없어지고 단백질 오염의 위험도 감소하게 된다. 또한, 응집 질환이 있는 환자에 대한 적당한 대체 치료법은 응집 인자 농축물의 이용을 통해서만 가능하다. 예방이나 치료에 충분한 높은 항체 역가는 면역 혈청 글로불린 농축물의 이용을 통해서만 얻을 수 있다.
혈장의 각종 성분들, 구체적으로 응집 인자 V 및 VIII과 면역 혈청 글로불린은 불안정하며 치료 효과를 최대화하고 혈액 생성물의 이용과 관련된 위험을 최소화하기 위해서는 신속하고 조심스럽게 제조되어야 한다. 예컨대, 최적미만의 분별 절차로 인한 면역 혈청 글로불린의 부분 변성물은 수용체에게 독성이거나 고도로 면역원성인 생성물을 생성할 수 있다. 따라서, 혈장 분별 기술 분야에는 보다 신속하고 수율이 높으며 변성도는 적고 생성된 혈장 분획중에 바람직하지 않은 오염물의 유입을 저하시킨 개선된 분별 방법이 요구되고 있다.
저온침전(cryoprecipitation)은 혈장 분획을 대량 생산하기 위하여 오늘날 사용되는 대부분의 방법중 제1 단계이다. 이 방법은 새로 동결시킨 혈장을 모아서 5 ℃ 이하에서 해동시키고 그 침전물을 연속 유동 원심분리기로 수거하고(Guthohrleen and Falke, 1977; Avery, 1972), 일반적으로 "저온상청액"으로 당해 기술분야에 알려진 상청액 분획을 이용하기 위하여 보유한다.
저온상청액은 섬유소원, 안티트롬빈 III, 및 응집 인자(II, VII, IX 또는 X)를 함유하는 프로트롬빈 복합체, 알부민 및 면역글로불린을 비롯하여 각종 혈장 분획원으로서 사용할 수 있다.
일반적으로, 저온상청액의 후속 처리는 황산 암모늄, 에탄올, 아세톤 및 폴리에틸렌 글리콜과 같은 유기 침전제를 이용한 침전을 포함한다. 예컨대, 에탄올, 영하 온도, pH, 이온 강도 및 단백질 농도의 특정 조합을 통해, 혈장 단백질 분획을 선택적으로 침전시킨다. 이러한 원리는 알부민 정제용으로 개발된 콘 분획화 방법(Cohn et al, 1946)의 기본이 되는 것이다.
대부분의 유기 침전제, 구체적으로 저온 에탄올을 사용하는 경우, 침전되는 제1 혈장 단백질은 일반적으로 안티트롬빈 III과 섬유소원이다. 또한, 일반적으로 저온 에탄올 이용시 마지막으로 분별되는 단백질은 진성글로불린과 지단백질이다.
혈장으로부터 면역글로불린을 정제하기 위하여, 콘 분획화 방법에 대한 변형 방법이 온클레이 등(Oncley et al.1949)에 의해 개발되었다. 온클레이법은 출발 물질로서 콘 분획 II와 III을 사용하고, 콘 등(1946)에 의해 개시된 바와는 다른 조합의 저온 에탄올, pH, 온도 및 단백질 농도를 사용하여 활성 면역글로불린 혈청 분획을 생성한다. 현재, 온클레이법은 면역 혈청 글로불린 생산에 사용되는 고전적 방법이다.
또한, 콘 분획을 더욱 정제하기 위하여 에탄올이나 등전 침전법을 사용하는 단백질의 선택적 분리 방법이 이용되어 왔다. 구체적으로, 컬링(Curling, 1980)은 등전 침전법을 이용하여 혈장 유래의 알부민 풍부한 분획으로부터 진성글로불린 단백질을 분리하였다.
대안적으로 또는 부가적으로, 콘 분획은 고체상-결합성 지단백질을 제거하기 위해 더 정제할 수 있다. 지단백질을 고체상내로 분획화하는 방법은 당해 기술분야에 공지되어 있는데, 그 예로는 여러 방법중에서도 AerosilTM또는 이와 유사한 실리케이트 물질에 대한 지단백질의 흡착 방법을 포함한다.
혈장 단백질을 분획화하는데 사용되는 모든 침전 단계들을 거치면 고체상과 액체상이 분리되어야 한다. 보통, 다량의 침전물은 원심분리 방법으로 펠릿화한다. 이 단백질 침전물이나 페이스트는 원심분리 용기로부터 분리한 후 재현탁시켜 다른 분획화 처리를 더 하거나, 또는 상청액을 모은 후 직접 처리하기도 한다. 또한, 정확한 위생 요구성과 혈장 분획화, 특히 불안정한 단백질(예, 제VIII인자)의 분획화에 요구되는 낮은 작동 온도에 따라서 적합한 원심분리기가 구분되어져야 한다. 또, 원심분리기로부터 상당한 열이 소실되고 재킷에 커다란 냉각 장치가 필요로 된다. 또한, 기계에 대한 부하량을 줄이기 위하여 원심분리기는 영하 온도로 유지되는 공정실에서 유지될 필요가 있다. 종종, 원심분리기는 대량 공정에서 고체 보유력이 불충분하여 처리되는 혈장 단백질의 각 배치마다 용기를 여러번 교체해야 할 필요도 있다. 경험상으로 볼 때, 원심분리기는 상당한 작업 중단 시간, 높은 유지 비용 및 수리중 작업 능력의 손실을 유도하는 바 그 유지에 필요한 조건이 상당하다. 또한, 원료 혼합물 유래의 모액이 원심분리 후에도 페이스트와 함께 상당량 유지되어, 상청액 분획으로부터 얻어지는 목적 단백질의 수율을 감소시키고, 페이스트를 세정하지 않는 한 페이스트 유래의 생성물에는 다량의 불순물이 존재할 수 있다.
이러한 원심분리법의 대체법으로서, 또는 원심분리법과 조합하여 사용될 수 있는 방법으로서, 침전물을 제거할 수 있는 혈장 단백질의 대량 여과법이 있다. 혈장 분획을 여과하는데 사용할 수 있는 여과기는 그 종류가 다양하다. 플레이트-프레임형 여과기(plate-frame filter)가 가장 사용하기 쉽고, 액체 부피 대 면적 비가 가장 낮아 최종 잔류 부피(heel volume)가 최소이며, 여과 덩어리의 세척이 매우 효과적이다. 관형 여과기는 수직으로 배향되며, 물 정제시와 같이 고체 함량이 낮은 경우에 주로 사용된다. 회전식 엽상(leaf) 여과기는 수직 또는 수평 챔버 용기에 수평 잎이나 수직 잎을 사용하여 제조한다. 수평 잎은 고체 부하량이 적고 순환 시간이 긴 연마 여과기로서 간헐 조작에 사용된다. 수직 잎은 고체 부하량이 많은 경우와, 침전물의 용이한 제거가 요구되는 경우에 사용된다.
여과기는 여과 공정 동안 유속을 용이하게 하기 위하여 여과 보조제와 함께 사용할 수 있다. 여과 보조제는 고체-액체 혼합물에 첨가되어 여과기 체/지지체가 막히는 것을 방지하고 유동 통로를 개방시켜 여과동안 작업처리를 용이하게 하는 작용을 한다. 최적 여과 보조제란 보통 최고 유속에서 최상의 투명도를 제공하는 것이다. 단, 여과 보조제는 최고 투과성이고 입자/섬유 크기 분포가 매우 좁아야 하며 화학적으로 불활성이고 물리적으로 경질이어야 한다.
여과 보조제는 석탄 액화(Jones et al., 1994; Shou et al., 1980), 폐수 처리(Rudenko, 1981; Martin et al., 1993), 식품 및 음료 정제(Olsen et al., 1979; Hermia and Brocheton, 1994) 및 오일 산업(Grichenko and El'shin, 1980; Soroka, 1975) 같은 각종 용도의 가공 산업에 널리 사용된다.
셀룰로스 여과 보조제는 규조토 여과 보조제 유래의 가용성 실리카가 바람직하지 않은 여과 플랜트, 예컨대 양조, 발효 및 야금 산업에 널리 사용된다(DicaliteTMTechnical Bulletin, Rettenmaier & Sohn; ArbocelTMTechnical Bulletin, Rettenmaier & Sohn). 하지만, 의약 생성물, 특히 혈액 생성물의 분획화에 대한 셀룰로스 여과 보조제의 유용성은 아직 확인되지 못한 상태이다.
혈장 분획화 산업에서, 여과는 규조토 여과 보조제를 사용하는 것에만 제한되어 있었다. 스위스 적십자사의 혈액 이식부(Swiss Red Cross Blood Transfusion Service)에 근무하는 프리들리(Friedlie)와 공동연구진들은 혈장 분획화로부터 알부민과 감마 글로불린을 생산하는데 있어서 규조토 여과 보조제(PerliteTMJ-100, CeliteTM545 및 Hyflo-Super-CelTM)를 이용한 여과에 대하여 연구하였다. 초기 연구에서는 미정제 분획의 여과가 유망한 결과를 보이지만, 보다 순수한 분획의 분리 시에는 규조토 여과 보조제의 흡착 효과가 허용될 수 없을 정도의 단백질 손실을 일으킨다는 결론을 얻었다(Friedli et al., 1976). 독일에 있는 적십자 혈액 이식부(Wolter, 1977)는 알부민 분리용으로 규조토 여과 보조제, Hyflo Super-CelTM로 예비코팅된 수직형 축의 ZHF-S 여과기를 시험하였다. 또한, 뉴욕 혈액 센터(New York Blood Centre)에 근무하는 하오(Hao, 1985)는 분획 IV-4의 여과에 여과 보조제로서 Hyflo Super-celTM을 연구하여, 사실상 알부민 손실이 일어난다는 것을 밝혔다. 드 종(De Jonge) 등(1993)은 콘(Cohn) 침전물, 분획 I, 분획 I + III, 분획 III, 분획 IV 및 분획 V를 여과하는데 규조토 여과 보조제, CeliteTM를 사용하는 방법에 대하여 보고하였다.
하지만, 최종 생성물의 높은 품질이 중요한 전제 조건인 의약 산업에 있어서 규조토 여과 보조제를 사용하는 데에는 몇가지 문제가 있다. 구체적으로, 규조토 여과 보조제는 토양에서 분리되며 전처리도 거의 되지 않는다. 이 규조토의 질은 그 분리원에 따라 본질적으로 달라지며 주로 중금속과 알루미늄을 용출시키기 때문에 의약 산업에 사용된다면 산 세척되어야 한다. 이 규조토는 펌프와 전해연마된 표면을 연삭시킨다.
또한, 특히 고품질과 불용성이 중요한 요인인 혈장 여과 산업과 관련하여, 규조토 여과 보조제는 접촉 활성화계를 활성화시켜, 임상적 부작용을 일으킬 수 있는 칼리크레인전구체(PKA) 활성인자 및 PKA 복합체를 생성한다.
본 발명과 관련하여, 본 발명자들은 여과 기법을 이용하여 혈장 단백질 혼합물과 같은 단백질 혼합물을 분획화하기 위하여 보다 우수한 신규 방법을 개발하고자 노력하였다. 구체적으로, 콘 분획, 알부민, 지단백질 및 진성글로불린과 같은 혈장 단백질 분획을 제조하기 위하여 개선시킨 일정 범위의 방법을 개발하기 위한 수단으로서 혈장 분획화 산업 분야에 신규한 여과 보조제의 사용에 대하여 제공하였다.
본 발명은 단백질 혼합물로부터 1종 이상의 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 1회 이상의 여과 단계를 포함하여, 혈장에 함유된 1종 이상의 성분을 분리하는 방법에 관한 것이다. 본 발명은 치료제, 특히 인간에게 사용하기 위한 혈장계 치료제 제조에 유용하다.
도 1은 비교군으로서 규조토 여과 보조제 CeliteTM(▲)를 사용했을 때보다 셀룰로스계 여과 보조제인 DiacelTM200(●), DiacelTM150(■) 및 VitacelTM(◇)을 이용했을 때 혈장 단백질 분획 I로부터 얻어지는 여과액의 투명도가 향상됨을 예시하는 그래프이다.
도 2는 비교군으로서 규조토 여과 보조제 CeliteTM(▲)를 사용했을 때보다 셀룰로스계 여과 보조제인 DiacelTM200(○), DiacelTM150(■) 및 VitacelTM(◇)을 이용했을 때 혈장 단백질 분획 II + IIIW 혼합물로부터 얻어지는 여과액의 투명도가 향상됨을 예시하는 그래프이다.
본 발명의 제1양태는 생물분자 혼합물과 셀룰로스계 여과 보조제를 접촉시켜 슬러리를 형성시키는 단계 및 이 슬러리를 여과 용기를 통하여 통과시키거나 펌프주입하는 단계를 포함하여, 생물분자 혼합물로부터 고체상 물질을 분리하는 방법을 제공한다.
본 발명의 제2양태는
(i) 여과 체(mesh)를 셀룰로스계 여과 보조제로 예비코팅시키는 단계, 및
(ii) 예비코팅된 여과 체를 통해 생물분자 혼합물을 통과시키거나 펌프주입시키는 단계를 포함하여, 생물분자 혼합물로부터 고체상 물질을 분리하는 방법을 제공한다.
여과 체를 예비코팅하는데 이용되는 셀룰로스계 여과 보조제 외에도, 기타 다른 여과 보조제를 생물분자 혼합물에 첨가할 수 있다. 따라서, 본 발명의 제3양태는 생물분자 혼합물에 기타 다른 셀룰로스계 여과 보조제를 첨가하여 슬러리를 만들고, 이 슬러리를 예비코팅된 여과 체를 통해 통과시키거나 펌프주입시키는 것이 특징인, 분리 방법을 제공한다.
전술한 양태들에 따라, 얻어지는 여과액은 충분히 투명해질 때까지 필요에 따라 원료나 여과 용기로 재순환시킬 수 있다. 그 다음에 여과액을 수거한다.
본 명세서에 기재한 임의의 양태의 방법에서 사용된 유속은 당업자라면 용이하게 측정할 수 있다.
또한, 얻어진 고체상이나 여과 덩어리를 그 안에 포획된 잔류 모액을 제거하기 위하여 세척하는데 사용되는 적합한 용매나 수성 완충액을 이용하여 1회 이상의 여과기 세척이나 세정을 수행하여, 수율을 증가시키고 분리 공정을 향상시키는 것이 바람직하다. 각 여과기 세척이나 세정은 여과 용기내에 존재하는 액체도 치환시켜 여과액내에 목적 생성물의 수율을 증가시킨다.
각 여과기 세척이나 세정에 사용되는 완충액의 부피는 당업자라면 쉽게 결정할 수 있다.
이러한 목적에 적합한 세척 용액과 조건은 목적하는 최종 생성물의 안정성과 생물분자 혼합물의 성질에 따라 크게 달라진다. 이러한 조건들은 많은 실험을 거치지 않아도 당업자라면 용이하게 결정할 수 있다.
본 발명은 구체적으로 1종 이상의 혈장 단백질을 함유하는 생물분자 혼합물로부터 고체상 물질을 분리하는 방법에 관한 것이다.
셀룰로스계 여과 보조제는 여과 체 또는 여과 지지체의 막힘을 방지하는 작용을 하거나, 대안적 또는 부가적으로 여과 공정동안 유동을 용이하게 하고 화학적 불활성이며, 물리적으로 안정하고, 비연삭성이며, 바람직하게는 알루미늄을 용출시키지 않고, 활성 성분으로서 셀룰로스를 함유하는 임의의 여과 보조제일 수 있다.
본 발명자들은 특정 여과 공정에 적합한 셀룰로스계 여과 보조제로서 최적의 종류와 양이 여과할 출발 물질과 목적하는 최종 생성물에 따라 달라진다는 것을 발견하였다. 일반적으로, 특정 여과에 최적인 여과 보조제란 여과동안 가장 빠른 유속을 제공하고 준최적의 여과 보조제보다 더 투명한 여과액을 생성하는 것이다. 하지만, 본 명세서에 기재된 본 발명을 최상으로 수행하기 위해서는 여과기에 과적하지 않는 것이 중요하다. 그 이유는 과적이 여과액의 혼탁도 증가, 여과 체의 파괴와 최종적으로 구부러짐, 여과기 손상 및 여과 체 사이에 여과 덩어리의 교락을 비롯하여 1 가지 이상의 역효과를 일으킬 수 있기 때문이다.
따라서, 특히 바람직한 본 발명의 양태는 최대 농도가 약 2.0 %(w/v)인 셀룰로스계 여과 보조제(즉, 용액 1 리터 당 셀룰로스계 여과 보조제 20 g) 또는 2.0 % (w/w) 셀룰로스계 여과 보조제(즉, 혈장 1 ㎏ 당 셀룰로스계 여과 보조제 20 g)를 사용하여 본 발명을 수행하는 것이다. 보다 바람직하게는, 셀룰로스계 여과 보조제를 약 0.5 %(w/v) 내지 약 2.0 %(w/v) 또는 대안적으로 약 0.5 %(w/w) 내지 약 2.0 %(w/w) 농도로 사용하는 것이다.
이러한 바람직한 양태에 따라, 본 발명자들은 여과 이전에 원료 혼합물에 여과 보조제를 약 0.5 %(w/v) 내지 약 2.0 %(w/v)의 농도 범위로 첨가하면 유동을 용이하게 하는 치밀한 다공성 베드가 얻어진다는 것을 발견하였다. 본 명세서에 기재된 농도보다 낮은 농도의 여과 보조제는 여과 체의 주조에 불충분하여 여과 체를 통해 고체상 물질이 통과되도록 하거나, 또는 다공성이 낮은 베드를 형성시켜 고압 강하를 일으키고 여과가능한 원료 혼합물의 양을 감소시키는 경향이 있다. 셀룰로스계 여과 보조제의 농도가 본 명세서에 구체적으로 제시된 양보다 높으면 다공성이 높은 베드를 형성시켜 원료 혼합물에 존재하는 매우 많은 고체상 물질이 여과 베드를 통해 통과되도록 함으로써 여과액의 투명도를 감소시킬 뿐만 아니라 전술한 문제들을 나타내게 된다.
바람직하게는, 생물분자의 혼합물이 혈장원으로부터 유래된 1종 이상의 혈장 단백질을 함유하고 목적하는 최종 생성물이 진성글로불린 풍부한 분획이거나 지단백질 풍부한 분획인 경우에는, 예컨대 DiacelTM150, DiacelTM200, ArbocelTM200 또는 VitacelTM200을 비롯하여 다양한 셀룰로스계 여과 보조제가 적당하다. 진성글로불린이나 지단백질은 분획 I에 AerosilTM을 첨가하는 경우와 같이 발연 실리카에 결합되어 고체상 물질에 격리될 수 있으므로, 원료 혼합물에 존재하는 발연 실리카의 중량에 대한 상대적 비율(%)로 나타내는, 여과 공정에 사용되는 셀룰로스계 여과 보조제의 농도는 최상의 성능이 얻어지도록 최적화되어야 한다.
생물분자의 혼합물이 혈장원 유래의 1종 이상의 혈장 단백질을 함유하고 목적하는 최종 생성물이 면역글로불린 풍부한 분획인 경우에, 여과 보조제로는 미세등급의 셀룰로스, 예컨대 DiacelTM150이 바람직하다.
생물분자의 혼합물이 콘 등(1946)의 절차 또는 그 변법을 사용하여 얻은 분획 II + IIIW 또는 분획 III과 실질적으로 동일한 혈장 분획인 경우에 여과 보조제는 DiacelTM150과 같은 미세등급의 셀룰로스인 것이 바람직하다.
셀룰로스계 여과 보조제는 적합한 완충액이나 매질, 바람직하게는 생물분자의 혼합물과 동일한 pH이고 등오스몰 농도인 완충액이나 매질중에서 예비팽윤시킬 수 있다. 대안적으로, 셀룰로스계 여과 보조제는 생물분자 혼합물에 직접 첨가한 후 여과 보조제를 팽윤시키기에 충분한 조건과 시간동안 항온처리한 다음, 여과 체나 여과 용기를 통하여 상기 혼합물을 통과시키거나 펌프주입시키는 단계를 수행할 수 있다.
셀룰로스계 여과 보조제의 팽윤 시간과 이 보조제의 팽윤에 적당한 조건은 당해 기술 분야에 공지되어 있고 팽윤이 실시되는 용액의 이온 강도, 온도 친수성 또는 평균 입자 직경에 따라 달라진다.
본 발명은 혈장 단백질의 혼합물 등과 같은 생물분자 혼합물을 여과하기에 적합한 모든 여과 용기를 사용할 수 있으며, 그 예로는 플레이트-프레임형 여과기, 관형 여과기 또는 회전식 엽상 여과기가 있다. 플레이트-프레임형 여과기는 사용이 가장 쉽고, 액체 부피 대 면적 비가 최저로서 최종 잔류 부피가 최소이며, 여과 덩어리의 세척도 매우 효과적이다. 플레이트-프레임형 여과기는 여과 체의 예비 코팅이나 전술한 바와 같은 재순환 방법을 포함하는 여과에 적합하다. 관형 여과기는 수직으로 배향된 것으로 주로 고체 함량이 낮은 물 정제 등에 사용된다. 회전식 엽상 여과기는 수직이나 수평 챔버 용기에 수직이나 수평의 잎을 사용하여 제작한다. 수평 잎은 고체 부하량이 낮고 순환 시간이 긴 경우에 연마 여과기로서 간헐 조작에 사용된다. 수직 잎은 고체 부하량이 높고 용이한 덩어리 제거가 요구되는 경우에 사용된다. 본 발명자들은 혈장 단백질 혼합물의 여과에 있어서 여과의 재순환 방법이 바람직하다는 것을 발견하였다.
본 발명의 여과 방법은 생물분자의 복합체나 단순한 혼합물, 특히 혈장 단백질 성분의 복합체나 단순한 혼합물의 분리에 특히 유용하다.
본 명세서에 사용된 "생물분자"라는 용어는 비제한적으로, 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당, 지방 및 핵산, 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질 및 지단백질과 같은 것을 함유하는 중합체를 비롯하여 임의의 천연 발생 분자 또는 천연 유래의 분자를 의미한다.
따라서, 본 명세서에 사용된 "생물분자 혼합물"이란 용어는 생물 근원 유래인 1종 이상의 단백질, 핵산, 단백질, 펩티드, 폴리사카라이드, 지질, 지단백질, 아미노산, 뉴클레오티드, 뉴클레오시드, 당 또는 지방 화합물을 함유하는 모든 혼합물을 포함한다. 본 명세서에서, "생물분자 혼합물"이란 용어는 세포 배양물, 세포나 준세포 성분의 용액 또는 세포 추출물, 특히 혈액 및 혈장과 이 혈장 유래의 분획과 같은 혈액 유래의 생성물을 포함한다.
본 명세서에 사용된 "고체상 물질"이란 용어는 고체 형태의 모든 화합물, 거대분자 또는 생물분자를 의미하며, 이 화합물, 거대분자 또는 생물분자를 고형화시키는데 사용된 수단과는 관계가 없다. 예컨대, 혈장 분획화 산업에 속하는 본 발명의 적용면에서 "고체상 물질"이란 용어는 분획화되거나 분획화되지 않은 혈장 또는 혈액에서 유래되는 생성된 혈장 단백질 침전물과 고체상 결합된 지단백질을 모두 포함한다.
본 발명은 본 명세서에 제시된 셀룰로스계 여과 보조제를 분해하지 않는다면 앞서 제시된 고체상 물질을 생성하는데 사용된 임의의 방법이나 수단에만 제한되지 않는다.
고체상 물질은 알부민, 면역글로불린, 지단백질, 진성글로불린, 제VIII인자, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III 또는 기타 다른 혈액 성분들을 포함하는 군 중에서 선택되는 혈장 단백질 같은 생물분자인 것이 바람직하다.
본 발명에 있어서, "혈장 단백질"이란 용어는 비제한적으로 새로 동결된 혈장, 이전에 동결된 혈장 또는 이의 분획, 예컨대 콘 등(1946)이나 온클레이 등(1949)의 분획화 도식이나 이의 변법을 사용하여 생성된 중간 분획이나 기타 다른 혈장 분획을 포함하는 혈장 원료로부터 유래된 단백질, 폴리펩티드, 펩티드 단편을 의미한다. 따라서, "혈장 단백질"이란 용어는 에탄올 침전법을 사용하여 얻어지는 혈장 분획만을 의미하는 것이 아니다.
본 명세서에 사용된 "유래하는"이란 용어는 본 명세서에 구체화된 특정 공급원으로부터 기원하는 특정 완전체 또는 완전체 군을 나타내는 것이다. 예컨대, 혈장 단백질은 비분획화된 혈액, 미정제 혈장 또는 이의 분획에서 직접 유래하는 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는 셀룰로스계 여과 보조제를 사용하는 1회 이상의 여과 단계를 포함하여 생물분자 혼합물을 분리하는 방법에 관한 것이다.
대안적인 양태로서, 본 발명은 생물분자 혼합물이 1종 이상의 단백질 분자를 함유하는 것이 특징인, 셀룰로스계 여과 보조제를 사용하는 1회 이상의 여과 단계를 포함하여 생물분자 혼합물을 분리하는 방법을 제공한다.
특히 바람직한 양태로서, 본 발명은 생물분자 혼합물이 혈장 또는 이의 유도체, 예컨대 비제한적으로 저온상청액, 재현탁된 혈장 단백질 침전물, 콘 또는 온클레이 분획화 도식과 관련된 중간 분획 등인 것이 특징인, 셀룰로스계 여과 보조제를 사용하는 1회 이상의 여과 단계를 포함하여 생물분자 혼합물을 분리하는 방법을 제공한다.
더욱 특히 바람직한 양태에 있어서, 혈장 유도체 분획은 임의의 면역글로불린 풍부한 분획, 진성글로불린 풍부한 분획 또는 지단백질 풍부한 분획이다.
이러한 양태의 본 발명에 따르면, 면역글로불린 풍부한 분획, 진성글로불린 풍부한 분획 또는 지단백질 풍부한 분획이 저온상청액, 콘 등(1946) 또는 온클레이 등(1949)의 분획화 도식이나 이의 변법 또는 당해 기술분야에 공지된 기타 다른 방법과 관련된 중간 분획을 비롯하여 새로 동결된 혈장이나 기타 다른 혈장 공급원 또는 이의 유도체로부터 유래된다.
당업자라면 콘 등(1946)과 온클레이 등(1949)의 분획화 도식과 면역글로불린, 진성글로불린 또는 지단백질의 공급원을 생성할 가능성이 있는 기존의 방법이나 적당한 변법을 충분히 알고 있다.
본 명세서에 사용된 "저온상청액"이란 용어는 새로 동결된 혈장을 약 5 ℃ 이하의 온도에서 해동하고, 고체상이나 저온침전물을 제거하기 위하여 원심분리한 후 얻어지는 상청액 분획을 의미한다는 것이 당업자에게는 자명한 것이다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 에탄올/아세테이트 침전 단계를 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상, 보다 바람직하게는 3회 이상, 보다 더 바람직하게는 4회 이상 포함하고, 여기서 생성된 고체상과 액체상을 셀룰로스계 여과 보조제를 이용하는 1회 이상의 여과 단계에 의하여 분획화하는 것을 포함하는 것이 특징인, 생물분자 혼합물의 분리 방법을 제공한다.
특히 바람직한 양태에 있어서, 상기 생물분자 혼합물은 1종 이상의 혈장 단백질, 예컨대 지단백질, 진성글로불린, 면역글로불린, 제VIII 인자 단백질, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III, 또는 알부민을 포함한다.
따라서, 이러한 구체예의 본 발명은 콘 분획화 도식(Cohn et al, 1946) 또는 온클레이 분획화 도식(Oncley et al, 1949) 및 이의 변법과 같은 혈장 분획화 도식과 관련된 에탄올/아세테이트 침전 혼합물의 고체상 및 액체상 분리에 유용하다.
본 명세서에 기재된 방법은 임상 질환의 치료 또는 예방에 치료 시약으로서 사용하기에 적합한 분리된 생물분자의 생산, 구체적으로 혈장 유래의 단백질을 생산하는데 특히 유용하다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 생물분자의 분리 단계가 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상, 보다 바람직하게는 3회 이상인 분리 방법에 생물분자의 단순 혼합물이나 생물분자 복합체중에 존재하는 기타 다른 생물분자로부터 상기 목적하는 생물분자를 분리하기 위하여 셀룰로스계 여과 보조제를 이용하는 것을 포함하여 생물분자 분리물을 제공한다.
바람직하게는, 이 생물분자는 단백질이고, 보다 바람직하게는 치료용 단백질이며, 보다 더 바람직하게는 인간 치료용 단백질이고, 가장 바람직하게는 혈장 유래의 인간 치료용 단백질, 예컨대 지단백질, 진성글로불린, 면역글로불린, 제VIII인자, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III, 또는 알부민이다.
가장 바람직한 구체예에서, 본 발명은 치료용 혈장 단백질을 분리하는데 있어서 1회 이상, 바람직하게는 2회 이상, 보다 바람직하게는 3회 이상의 분리 단계에 셀룰로스계 여과 보조제를 사용하며, 상기 단백질이 알부민, 지단백질, 면역글로불린 또는 진성글로불린으로 구성된 군 중에서 선택되는 것이 특징인, 치료용 혈장 단백질 분리물을 제공한다.
본 발명의 방법에 따라 생성된 생성물에는 바람직하지 않은 오염물이 실질적으로 없다. 예컨대, 본 명세서에 기재된 방법에 따라 분리된 혈장 단백질, 구체적으로 면역글로불린과 알부민은 알루미늄과 PKA 양이 낮아서 특히 바람직하다. 허용되는 알루미늄과 PKA의 최소량은 영국 약전(BP), 유럽 약전(EP) 및/또는 미국 약전(USP) 기준과 같은 전세계적인 약전 기준에 규정되어 있다.
본 발명의 방법에 따라 알부민을 생산하는 경우에는 알루미늄과 PKA의 저농도 이외에도 단백질 분리물중에 존재하는 지단백질의 농도가 3.0 %(w/w) 미만, 보다 바람직하게는 2.0 %(w/w) 미만, 보다 더 바람직하게는 1.0 %(w/w) 미만, 보다 더욱 더 바람직하게는 0.5 %(w/w) 미만, 가장 바람직하게는 0.3 %(w/w) 미만인 것이 특히 바람직하다.
본 발명은 하기 실시예와 첨부되는 도면을 통해 상세히 설명될 것이다. 이하 제시되는 구체예는 본 발명을 제한하기 위한 것이 아니다.
실시예 1
여러 종류의 여과 보조제를 이용한 분획 I의 분리
배치 부피가 200 리터인, 4가지 새로 동결된 혈장 또는 저온상청액 수집물을, 표면적이 2 ㎡인 중간시험규모의 엽상(leaf) 여과기를 사용하여 각각 4개의 실험군으로 실험하였다. 원료를 ≤1℃로 냉각시키고, 주사용 물로 희석하여 농도가 4 %(w/v) 내지 6 %(w/v)인 단백질을 얻었다. 여기에 에탄올 8 %(v/v)와 최종 pH 6.6 내지 7.4의 침전 조건을 만들기 위하여 충분한 에탄올과 아세테이트 완충액을 첨가하였다. 이 조건하에 -2 ℃에서 면역글로불린과 알부민은 용액중에 남고 섬유소원은 침전되었다. 얻어진 분획 I 혼합물에 셀룰로스계 여과 보조제(DiacelTM200, DiacelTM150 또는 VitacelTM)를 혼합물 1 리터 당 5 g의 비율로 첨가하고 팽윤시켰다. 이 슬러리를 여과 용기를 통해 펌프 주입하고 투명도가 얻어질 때까지 여과액을 원료로 재순환시켰다. 원료가 없어질 때까지 여과액을 수거하였다. 여과기에 8% 에탄올과 0.14 M NaCl을 함유하는 여과 세척액을 주입하여 여과 덩어리를 세척하고 여과 덩어리에 포획된 원료 혼합물 유래의 잔류 모액을 제거하였다. 그 다음, 예비냉각된 공기 또는 질소를 이용하여 여과기의 최종 잔류 부피를 분출시키고 마지막으로 용기중에 포집된 잔류 액체를 배출시켰다. 그 다음, 예비냉각된 공기나 질소를 이용하여 덩어리를 건조시켰다. 여과기를 열고, 덩어리를 여과 체로부터 긁어내어 분리하였다.
각 여과 보조제를 이용한 후 여과액 투명도의 프로파일은 도 1에 도시하였다. 또한, 대조군으로서 규조토 여과 보조제를 이용하여 얻은 여과액의 투명도를 측정하였다. 미세 등급의 DiacelTM이 가장 급격한 프로파일과 가장 신속한 처리율을 나타냈다.
표 1a 및 표 1b은 분획 I의 여과에 각종 여과 보조제들을 사용하여 수회 실험한 시험군의 성능을 비교한 것이고, 파크빌에서 현재 가동중인 공정 원심분리기의 성능도 표 1a 및 표 1b에 병기하였다. 일반적으로, 여과액의 보다 높은 투명도(낮은 혼탁도)와 여과액중의 보다 낮은 섬유소원 함량으로 부터 알 수 있는 바와 같이, 여과 분리의 효율이 원심분리기에 의한 분리 효율보다 우수하였다. 단백질 수율은 무용부피(dead volume)의 상당한 손실로 인하여 원심분리 실험군보다 여과 실험군에서 더 낮았다.
시험된 셀룰로스계 여과 보조제는 모두 그 성능이 균일하게 우수한 것으로 나타났는데, 그 투명도 범위는 82 NTU 내지 196 NTU였다. DiacelTM150을 이용한 경우에는 최소의 재순환 시간이 소요되었는데, 이는 고체가 여과기 베드에 효과적으로 신속하게 포획되며, 따라서 베드의 다공성이 급속하게 감소된다는 것을 나타낸다. 하지만, 이 여과 보조제는 이러한 미세 여과 보조제들이 나타내는 가장 큰 압력 강하를 나타냈다.
분획 I 혼합물의 여과를 통한 분획 I 여과액의 분리 결과
여과 보조제 여과액 수집물의 NTU 압력(Bar) 재순환 시간(분) 분획 I f/t중의 단백질 수율(g/L 혈장) 섬유소원 함량(㎎/㎖)
VitacelTMLC200 103 0.20 40 52.3 측정 안됨
CeliteTM580 114 0.15 40 50.6 측정 안됨
DiacelTM150 129±59(n=3) 0.4±0.4(n=3) 14±5 49.8±1.4 <0.04
DiacelTM200 116±43(n=3) 0.07±0.03 30±18 52.6±1.9 <0.04
원심분리기 520(n=6)(314-1000) 해당 없음 해당 없음 54 내지 59 0.51±0.15
실시예 2
여러 종류의 여과 보조제를 이용한 분획 II+IIIW의 분리
분획 II + III 덩어리 15 내지 18 ㎏ 범위의 배치 크기에 대하여 2 ㎡ 엽상 여과기를 이용하여 중간시험규모의 시험을 실시하였다. 이전 분획화 단계의 여과 보조제를 함유하는 동결 분획 II + III 덩어리를 주사용 물(0 ℃)에 현탁시켜 단백질 농도를 1 %w/v로 만들었다. 그 다음 충분한 에탄올과 아세테이트 완충액을 첨가하여 에탄올 20% v/v와 최종 pH 6.65의 침전 조건을 만들었다. 이 조건하에 -5 ℃에서, 잔류 알부민과 일부 지단백질은 용액 중에 남고 면역글로불린은 재침전되었다. 이 슬러리를 충분히 혼합하여 분획 II + IIIW 혼합물을 균질하게 만들었다. 이 혼합물에는 추가 여과 보조제를 첨가하지 않았다. 그 다음 이 슬러리를 여과 용기를 통해 펌프 주입하고 여과액은 투명도가 얻어질 때까지 원료로 재순환시켰다. 원료가 없어질 때까지 여과액을 수거하였다. 그 다음, 20% 에탄올을 함유하는 여과 세척액을 여과기에 주입하여 여과 덩어리를 세척하고 여과 덩어리에 포획된 잔류 모액을 제거하였다. 그 다음, 예비냉각된 공기 또는 질소를 이용하여 여과기의 최종 잔류 부피를 분출시키고 마지막으로 용기중에 포집된 잔류 액체를 배출시켰다. 덩어리를 여과 체로부터 긁어내어, 순수 면역글로불린에 대한 추가 가공처리 이전까지 동결 보관하였다.
이 혼합물의 여과는 미세 등급의 여과 보조제, CeliteTM580 및 DiacelTM150만을 이용하여 실시하였다. DiacelTM150은 여과능이 우수하였고, 여과액의 투명도는 일반적으로 5분 이내에 얻어졌다. CeliteTM580 을 이용한 실험군은 처음 5분 후에 여과액이 51 NTU에 달하는 결과를 나타내면서 처음에는 성공적이었으나, 일단 미세 섬유에 형성된 압력이 여과 베드를 통해 가해져 여과액으로 누출되면 988 NTU에 달하는 여과액 저장물의 혼탁도를 높이는 결과를 초래했다. VitacelTMLC200 및 DiacelTM200은 상기 분획 II + IIIW 혼합물을 여과하기에 충분히 치밀한 여과 베드를 제공할 수 없었다.
분획 II + IIIW 혼합물의 결과
여과보조제 여과액 수집물의 NTU 압력(Bar) 재순환시간(분)
VitacelTMLC200 >2000 2.0 145
CeliteTM580 988 2.0 5
DiacelTM150 34±25 (n=3) 0.6±0.5 (n=3) 7±5 (n=3)
DiacelTM200 >2000 0.7±0.9 >60
원심분리기 55 내지 915 해당없음 해당없음
실시예 3
다양한 비율의 셀룰로스계 여과 보조제에 대한 중간시험규모의 여과 성능
일반적인 분리 방법에 적당한 셀룰로스계 여과 보조제의 양을 측정하기 위하여, 출발 물질로서 분획 II + III 혼합물 250 ㎏ 내지 500 ㎏을 2 ㎡ 엽상 여과기를 이용하여 여과하는 중간시험규모의 시험을 수행하여 여과액중의 알부민과 침전물중의 면역글로불린을 분리하였다.
이 혼합물에 다양한 양의 DiacelTM150을 첨가하여 팽윤시킨 다음, 20% 에탄올/NaCl 여과 세척액을 이용하고 면역글로불린 풍부한 침전물과 알부민 풍부한 여과액을 모두 수거한다는 점을 제외하고는 실시예 1에 개략된 절차와 동일하게 여과를 수행하였다.
여과 시간, 여과액 투명도 및 여과기를 통한 압력 강하를 표 3에 나타내었다. 표 3에 제시한 바와 같이, 다량의 셀룰로스계 여과 보조제는 얻어진 여과액의 투명도를 감소(즉, 혼탁도 증가)시킨다. 여과 보조제를 가장 높은 비율로 시험한 경우에 압력 강하가 가장 낮았는데, 이것은 이러한 조건하에서 베드 여과기가 더욱 개방되어 유동이 이루어지기 때문이다. 각각의 여과 보조제 시험량에 대한 여과 시간은 거의 변화가 없는 것으로 나타났지만, 가장 높은 시험량에서는 여과 체 사이에 여과 덩어리의 교락이 관찰되었다. 이러한 교락 현상을 통해, 여과 보조제의 비율을 1.8 %(w/v) 농도 이상으로 증가시키지 않아야 여과기의 과부하와 여과기 체의 구부러짐이 일어나지 않는다는 것을 알 수 있었다.
DiacelTM150의 여러 농도에 대한 여과 성능의 비교
혼합물 부피(리터) 여과 보조제 양(%w/v) 시간(hr) 여과액 수집물의 NTU 압력(Bar)
285(n=1) 0.8 >6 nd 1.40
332(n=1) 1.0 4.0 9.8 1.30
332(n=3) 1.5 4.7 14.2 1.40
460(n=3) 1.8 6.0 37.4 0.50
실시예 4
알부민 풍부한 혈장 분획으로부터 지단백질과 진성글로불린의 분리
알부민 풍부한 혈장 분획 약 80 리터를 pH를 5.2로 조정하여 진성글로불린을 침전시키고, 그 다음 발연 실리카로 처리하여 지단백질을 흡착시켰다. 이 혼합물에 발연 실리카 1 g당 여과 보조제 2 g의 비율로 여과 보조제 DiacelTM200을 첨가하고 30분 이상동안 팽윤시켰다. 여과기 패드를 장착하고 DiacelTM200으로 예비코팅한 플레이트-프레임 여과기내로 상기 혼합물을 펌프주입하였다. 여과액을 수거하고, 여과 덩어리는 세척 완충액, 5mM 아세트산나트륨(pH 5.2)으로 세척하였다. 압축기를 분해하고 여과 덩어리를 분리하였다.
배치 부피를 160 리터로 하고 중간시험규모의 엽상 여과기(2 ㎡)를 사용하여 유사한 실험을 수행하였다. 이 경우에는, 여과기에 높은 유속이 형성되어 여과 체 에 여과 보조제 DiacelTM200이 균일하게 분포되어지므로 여과기의 예비코팅은 실시하지 않았다. 여과액은 투명해질 때까지 재순환시킨 후 수거하였다. 그 다음 여과 덩어리를 세척 완충액으로 세척하고, 최종 잔류 부피를 수거한 뒤, 여과 덩어리를 제거 분리하였다.
표 4는 전술한 2가지 여과기의 성능을 비교한 것이다.
진성글로불린/지단백질 분리 단계에 있어서 DiacelTM200의 여과기 성능
변수 플레이트-프레임형 여과기 엽상 여과기
시험 초기의 투명도(NTU) 71 57
시험 말기의 투명도(NTU) 16 <18
최종 수집물의 투명도(NTU) 26 10
여과 시간(분) 40 100
원료중의 지단백질 함량(%w/w) 2.9 3.1
여과액중의 지단백질 함량(%w/w) 0.2 0.3
단백질 회수율(%w/w) 85 82
DiacelTM200의 여과 성능은 두 여과기에서 시험군의 높은 여과액 투명도(낮은 혼탁도)와 동등한 단백질 회수율(침전으로 일부 단백질이 제거되기 때문에 회수율이 100%는 안됨)을 나타내는 바, 작업 성능이 동일하게 우수한 것으로 나타났다. 이와 같은 2가지 시험군에서 지단백질의 감소는 10배 이상으로서 플레이트-프레임형 여과기와 엽상 여과기의 성능을 반영해주었다. 2차 시험군에서의 여과 시간은 1차 시험군에서 보다 훨씬 길었고, 이는 배치 부피가 2배임을 암시한다.
실시예 5
생산규모에서의 원심분리 및 여과를 이용한 분획 III의 분리 비교
생산규모의 엽상 여과기(18 ㎡)를 분획 I 내지 분획 III 여과액의 여과에 이용하여 그 유효성을 확인하였다. 결과는 분획 III 혼합물의 최종 여과를 3회 시험한 시험군으로부터 얻은 데이터를 요약한 것이다. 각 시험은 다음과 같이 실시하였다.
앞서 콘 분획 단계에서 사용된 DiacelTM150을 함유하는 분획 II + IIIW 덩어리 400 ㎏ 배치를 0 ℃의 주사용 물에 재현탁시켜 단백질 함량을 약 1 %w/v로 만들었다. 17% v/v의 에탄올과 최종 pH 5.35의 침전 조건을 만들기 위하여 충분한 에탄올과 아세테이트 완충액을 첨가하였다. 이러한 조건과 -5 ℃하에서 면역글로불린 M, 면역글로불린 A 및 몇몇 지단백질은 침전된 상태를 유지하였고, 면역글로불린 G는 재가용화되었다. 그 다음 이 혼합물을 여과 용기를 통해 펌프 주입하고, 여과액은 투명도가 얻어질 때까지 원료로 재순환시켰다. 원료가 없어질 때까지 여과액을 수거하였다. 그 다음 17% v/v 에탄올과 0.015M 아세트산 나트륨을 함유하는 여과 세척액을 여과기에 주입하여 여과 덩어리를 세척하고 여과 덩어리내에 포획된 잔류 모액을 제거하였다. 여과기의 최종 잔류 부피는 예비냉각시킨 공기 또는 질소를 이용하여 분출시키고, 마지막으로 용기내에 포획된 잔류 액체를 배출시켰다. 그 후, 여과 덩어리를 예비냉각된 공기 또는 질소로 건조시켰다. 여과기를 개방시켜 여과 덩어리를 여과 체로부터 긁어서 분리하였다. 분획 III 여과액의 시료를 취하여 특성을 분석하였다. 여과액을 pH 4.0으로 조정하고 최대 7% v/w 단백질로 농축시킨 뒤, 주사용 물로 이중여과(diafiltration)한 후 말토즈로 조제하였다. 최종 생성물 시료에 대하여 미량 존재하는 기타 다른 혈장 단백질의 양을 검측하였다. 표 5는 전술한 3회 시험군으로부터 얻은 여과액과 최종 생성물의 특성을 요약하고 생산 원심분리기로부터 얻은 생성물의 데이터와 비교하였다.
분획 III 여과액 및 최종 생성물의 특성
생산 원심분리기 생산 여과기
투명도, 상청액내 NTU/여과액 11.8 ± 7.5 1.4 ± 0.2
최종 생성물중의 IgM, ㎎/㎖ 0.05 ± 0.01 0.09 ± 0.2
최종 생성물중의 IgA, ㎎/㎖ 0.17 ± 0.03 0.19 ± 0.05
최종 생성물중의 플라스미노겐, ㎍/㎖ 0.52 ± 0.36 0.33 ± 0.07
표 5는 여과기로부터 얻은 여과액이 낮은 NTU 값을 나타내는 바, 원심분리기로부터 얻은 상청액보다 더 투명하다는 것을 예시한다. 원심분리기에서 얻은 상청액 III은 그 다음 플레이트-프레임형 여과기를 통해 연마 여과한 결과 동일한 수준의 투명도가 얻어졌다. 최종 생성물에 존재하는 IgM, IgA 및 플라스미노겐(이 혈장 단백질들은 콘 분획화 도식의 대응 단계에서도 침전 상태로 유지된다)의 농도 비교를 통해, 분획 III 혼합물의 원심분리시와는 달리 여과가 생성물의 질을 저하시키지 않는다는 것을 명백히 알 수 있었다.
실시예 6
다양한 비율의 셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 생산규모의 여과 성능
20% 에탄올/NaCl 여과 세척액을 이용하고 면역글로불린 풍부한 침전물과 알부민 풍부한 여과액을 모두 수거한다는 점을 제외하고는 실시예 1에 개략된 바와 동일한 절차를 사용하고, 2가지 생산규모 여과기(18 ㎡)를 사용하여 분획 II + III 혼합물을 여과하였다. 여과 보조제(% w/v)의 양은 각 여과기내의 유효 공간을 최대화하기 위하여 점진적으로 감소시켰다.
그 결과를 표 6에 제시하였다. 표 6에 제시된 데이터는 혈장 2500 ㎏과 5000 ㎏에서 얻은 분획 II + III의 다른 부피의 배치를 이용하여 시험한 결과이다.
표 6에 제시된 바와 같이, 사용된 여과 보조제의 양이 많을수록 여과 시간은 빨랐다(즉, 유속이 빠름). 시험한 생산규모에서의 여과액 투명도는 중간시험규모에서의 투명도 보다 조심스럽게 조절하여, 결과적으로 여과액의 투명도는 보다 낮은 것으로 나타난다. 여과 보조제의 양이 많을수록, 수거되는 침전물의 양도 많아져, 동일한 혼합물 부피에 대한 각 여과기의 유효 용량이 감소한다.
다양한 농도의 셀룰로스계 여과 보조제에 대한 생산규모에서의 여과 성능 비교(n=3)
혼합물 부피 (리터) 여과 보조제 양 (% w/v) 시간(hr) 여과액 수집물의 NTU 침전물 질량 (㎏)
3600 1.5 4.09 6.6 254
3700 1.1 6.30 6.5 213
7100* 1.5 5.24 4.9 2 × 254
7200* 1.0 7.20 5.2 2 × 224
7000* 1.0 8.00 7.2 2 × 202
*2가지 여과기를 이용하였고, 원료 총 부피의 절반씩을 각 여과기를 통해 병렬 진행시켰다.
실시예 7
생산규모 여과 공정으로부터 얻어지는 면역글로불린의 수율
면역글로불린 제조에 생산규모 여과기를 이용하여 콘 침전 혼합물을 여과하였다. 각 단계에서, 여과 세척액을 1.5 배 또는 2.0 배 여과 용기 부피(7500 ㎏ 또는 10,000 ㎏)로 사용하여 분획 I 혼합물, 분획 II + III 혼합물, 분획 II + IIIW 혼합물 또는 분획 III 혼합물을 여과함으로써 용기로부터 여과액을 회수하였다.
표 7에 제시한 데이터는 여과 세척액을 여과 용기 부피의 1.5 배 또는 2.0 배로 사용한 경우, 3가지 다른 배치 부피에서의 면역글로불린 G의 수율을 비교한 것이다. 이 데이터는 시험된 높은 생산 규모 모두에서, 이용된 여과기 세척 부피가 많을수록 수율도 훨씬 높게 나타났다.
여러 배치 부피와 여러 여과 세척액 부피에 대한 생산 시설의 수율 비교
처리 혈장의 질량(MPP) (㎏) 여과 세척액 부피(× MPP) 수율(g/혈장 ㎏)
2,500 1.5 3.60
5,000 2.0 4.09
7,500 2.0 4.14
실시예 8
생성물 품질 평가
본 명세서에 제시된 바와 같은 셀룰로스계 여과 보조제를 사용하여 생성한 면역글로불린 분획과 알부민 분획을 이용하여 알루미늄과 PKA의 농도를 측정하였다. 그 결과를 표 8 및 표 9에 제시하였다. 표 8의 데이터는 셀룰로스계 여과 보조제에 대한 노출로 알부민의 품질이 손상되지 않으며, 본 명세서에 제시된 바와 같은 셀룰로스계 여과 보조제를 이용하여 생산한 생성물에는 PKA 및 PKA 복합체의 농도가 낮고 알루미늄 농도도 낮다는 것을 보여준다. 표 9의 데이터는 셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 여과시 본 발명에 따라 생산된 면역글로불린 제제에 함유된 낮은 알루미늄 함량, 낮은 칼리크레인 및 낮은 PKA 함량으로 측정되는 바와 같이 최종 생성물의 특성에는 유해 영향을 미치지 않음을 나타낸다.
알부민 특성(생산 규모)
오염물 약전 단위 결과(n=5)
알루미늄 <100 ㎍/L 8±4 ㎍/L
PKA-C1에스터라제 ≤35 IU/㎖ <7 IU/㎖±3 IU/㎖
PKA ≤28.6 IU/㎖ 4.8 IU/㎖±1.3 IU/㎖
원심분리 처리 보조제를 이용하여 얻은 IgG와 셀룰로스계 여과 보조제를 이용한 여과로부터 얻은 IgG의 특성 비교(생산 규모)
오염물 원심분리(n=3) 여과(n=3)
알루미늄(㎍/L) 67 ㎍/L ± 21 ㎍/L 34 ㎍/L±3 ㎍/L
칼리크레인(표준 대조물%) 453 ± 147 167±33
PKA(IU/㎖) <1.0 IU/㎖ <1.0 IU/㎖
전술한 본 명세서에 기재된 발명은 구체적으로 기재한 것 이외의 다른 변형과 수정으로도 해석가능하다는 것을 당업자라면 충분히 이해할 것이다. 또한, 본 발명은 본 명세서에 제시한 단계, 특징, 조성물 및 화합물을 각각 또는 집합적으로, 임의의 조합 및 모든 조합이나 임의의 2 이상의 단계 또는 특징을 모두 포함한다.
참고문헌
Avery C.G., "Fractionation of blood by centrifugation. Process Biochem., 7.20, 1972"
Cohn E.J., Strong L. E., Hughes L.E., Mulford D.J., Ashworth J.N., Melin M. and Taylor H.L., "Preparation and Properties of Serum and Plasma fractions. J. American Chemical Society, 68, 459, 1946"
Curling J.M., "Methods of Plasma Protein Fractionation, Ed. J.M. Curling, Academic Press, London U.K., 1980"
De Jonge E., M.A.W. van Leeuwen, H. Radema, P.H.J.M. Linssen and J. Over, "Filtration processes in the Cohn fractionation. Biotechn. Blood Proteins, Eds C. Rivat, J.-F. Stoltz. Colloque INSERM, 227, 49-54, 1993"
Dwyer, J.L., "Filtration in the food, beverage and pharmaceutical industries. In Clyde Orr Ed., Filtration Principles and Practices., Part II. Marcel Dekker, NY. pp 121-199, 1979"
Friedli H., Mauerhofer M., Faes F. and Kistler P. "Studies on New Process Procedures in Plasma Fractionation on an Industrial Scale, Vox Sang., 31, 389-295, 1976"
Grichenko, A.A.; El'shin, A.I. "Use of Adsorbents To Increase Filtration Rate of Vnii Np-360. Chemistry and Technology of Fuels and Oils(English Translation of Khimiya i Tekhnologiya Topliv i Masel), 16(9-10), 567-569, 1980"
Hermia, J.; Brocheton, S. "Comparison of modern beer filters. Filtration and Separation 31(7), 721-725, 1994"
Hao, Y, Pilot scale Preparation of Human Serum Albumin, Vox Sang., 49, 1-8, 1985
Jones, M.A.; Kimber, G.M.; Pass, R.; Romey, I. Evaluation of cokes as filter aids in direct coal liquefaction. International Journal of Energy Research, 18(2) 287-297, 1994
Kistler P. and Nitschmann H. Large scale production of human plasma fractions, Vox Sang., 7, 414-424, 1962
Martin, H. Lee; Norford, Stephen W.; Diener, Glenn A. Metal finishing wastewater pressure filter optimization Proceedings of the AESF Annual Technical Conference 1993. Publ by American Electroplaters & Surface Finishers Soc Inc, Orlando, FL, USA. p 559-562, 1993
Olsen, B. Winstrom; Madsen, R.F.; Nielsen, W. Kofod. Sugar Beet Phenols--2. Investigation Of Phenolic Compounds From Sugar Beet in Relation to The Formation Of Colour. International Sugar Journal, 81(972) 362-367, 1979
Oncley, J.L., Melin, M., Richert, D.A., Cameron J.W., and Gross, P.M.,Jr., The separation of antibodies, isoagglutins, prothrombin, plasminogen, and β-1-lipoprotein into subfractions of human plasma. J.Am.Chem.Soc., 79, 4666-4671, 1949
Reti A.R., The Design and Use of Filtration Systems, in Methods of Plasma Protein Fractionation, Academic Press, Edt. J.M. Curling, pg 291-304, 1980
Rudenko, L.I.; Sklyar, V.Ya. Composite Filter Aids For Cleanup Of Additives. Chemistry and Technology of Fuels and Oils(English translation of Khimiya i Tekhnologiya Topliv i Masel), 19(7-8) 384-386, 1983
Schneider-W; Wolter-D; McCarty-LJ. Technical improvements in heat-ethanol isolation of serum albumin. Blut. 33(4), 275-80, 1976
Shou, J.K.; Collins, D.M.; Do, D.M.; Scharff, R.P. Precoat Filtration of Coal Liquid Feasibility Study Of Bottom Ash Precoat. Separation Science and Technology, 15(3), 201-221, 1980
Soroka, A.S. Use of Filter-Aid Powders In Removing Solid Contaminants From Intermediate Products In Manufacture Of Succinimide Additives. Chemistry and Technology of Fuels and Oils(English translation of Khimiya i Tekhnologiya Topliv i Masel), 11(9-10), 780-783, 1975
Wolter D., The use of coarse filtration for Separation of Plasma Fractions, International Workshop on Technology for Protein Separation and Improvement of Blood Plasma Fractionation, Edt. H.E. Sandberg, Virginia Sept., pg 129, 1977.

Claims (28)

  1. 생물분자 혼합물을 셀룰로스계 여과 보조제와 접촉시켜 슬러리를 만드는 단계 및 이 슬러리를 여과 용기나 여과 체를 통해 통과시키거나 펌프주입시켜 여과액과 여과 덩어리를 형성시키는 단계를 포함하여, 생물분자 혼합물로부터 고체상 물질을 분리하는 방법.
  2. (i) 여과 체를 셀룰로스계 여과 보조제로 예비코팅하는 단계, 및
    (ii) 예비코팅된 여과 체를 통해 생물분자 혼합물을 통과시키거나 펌프주입시켜 여과액과 여과 덩어리를 얻는 단계를 포함하여, 생물분자 혼합물로부터 고체상 물질을 분리하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 예비코팅된 여과 체를 통해 생물분자 혼합물을 통과시키거나 펌프주입시키는 단계 전에 생물분자 혼합물에 다른 셀룰로스계 여과 보조제를 첨가하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여과액을 원료나 여과 용기로 1회 이상 재순환시키는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  5. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항에 있어서, 여과 덩어리를 적합한 용매나 수성 완충액으로 세척하거나 세정하여 원료 혼합물 유래의 잔류 모액을 제거하는 단계를 더 포함하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  6. 제5항에 있어서, 여과 덩어리를 세척하거나 세정하는 단계에 이용되는 용매나 수성 완충액의 부피가 여과 용기 부피의 최대 3배 부피인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  7. 제1항 내지 제6항 중 어느 하나의 항에 있어서, 셀룰로스계 여과 보조제의 농도가 최대 약 2.0%(원료 혼합물 단위 부피당 중량 또는 원료 혼합물 단위 중량당 중량)인 분리 방법.
  8. 제7항에 있어서, 셀룰로스계 여과 보조제의 농도가 약 0.5% 내지 약 2.0%(원료 혼합물 단위 부피당 중량 또는 원료 혼합물 단위 중량당 중량) 범위인 분리 방법.
  9. 제1항 내지 제8항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물분자 혼합물이 혈액, 새로 동결시킨 혈장, 이전에 동결시킨 혈장, 저온상청액 또는 이로부터 유래되는 중간 콘(Cohn) 분획이나 온클레이(Oncley) 분획과 같은 혈장 분획, 또는 기타 다른 혈장 분획으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  10. 제9항에 있어서, 고체상 물질이 침전 형태, 복합체 형태, 응집 형태, 또는 발연 실리카 등의 불용성 담체에 결합된 형태인 알부민, 면역글로불린, 지단백질, 진성글로불린, 제VIII인자, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III 또는 기타 다른 혈액 성분으로 구성된 군 중에서 선택되는 혈장 단백질인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  11. 제10항에 있어서, 셀룰로스계 여과 보조제가
    (i) 여과 공정동안 여과 체를 통한 여과 혼합물의 유동을 용이하게 하고;
    (ii) 혈장 유래의 생성물 중에 PKA 농도를 BP(영국 약전), EP(유럽 약전) 또는 USP(미국 약전)의 기준 이상으로 생성하지 않으며;
    (iii) 혈장 유래의 생성물 중으로 BP(영국 약전), EP(유럽 약전) 또는 USP(미국 약전) 기준 이상의 알루미늄을 용출시키지 않는 특성중 1 가지 이상의 특성을 나타내는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  12. 제11항에 있어서, 셀룰로스계 여과 보조제가 DiacelTM150, DiacelTM200, ArbocelTM200 또는 VitacelTM200으로 구성된 군 중에서 선택되는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  13. 혈액, 새로 동결시킨 혈장, 이전에 동결시킨 혈장, 저온상청액 또는 이로부터 유래되는 중간 콘(Cohn) 분획이나 온클레이(Oncley) 분획과 같은 혈장 분획, 또는 기타 다른 혈장 분획으로 부터 고체상 물질을 분리하는 방법으로서, 이 고체상 물질을 회수하기 위하여 1회 이상의 여과 단계를 포함하며, 이 여과 단계에 셀룰로스계 여과 보조제를 이용하는 것이 특징인 분리 방법.
  14. 제13항에 있어서, 고체상 물질이 침전 형태, 복합체 형태, 응집 형태, 또는 발연 실리카 등의 불용성 담체에 결합된 형태인 알부민, 면역글로불린, 지단백질, 진성글로불린, 제VIII인자, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III 또는 기타 다른 혈액 성분으로 구성된 군중에서 선택되는 혈장 단백질인 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  15. 제13항 또는 제14항에 있어서, 고체상 물질을 얻기 위하여 1회 이상의 에탄올/아세테이트 침전 단계 또는 발연 실리카로의 처리 단계를 먼저 실시하는 것을 특징으로 하는 분리 방법.
  16. 제1항 내지 제15항 중 어느 하나의 항에 기재된 분리 방법에 따라 생성된 생물분자 분리물.
  17. 제16항에 있어서, 인간이나 포유동물을 치료적 또는 예방적으로 처치하기 위한 단백질인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  18. 제16항 또는 제17항에 있어서, 혈액, 새로 동결시킨 혈장, 이전에 동결시킨 혈장, 저온상청액 또는 이로부터 유래되는 중간 콘(Cohn) 분획이나 온클레이(Oncley) 분획과 같은 혈장 분획, 또는 기타 다른 혈장 분획으로 부터 유래됨을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  19. 제18항에 있어서, 지단백질, 진성글로불린, 제VIII인자, 프로트롬빈 복합체, 안티트롬빈 III 또는 알부민으로 구성된 군 중에서 선택됨을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  20. 제19항에 있어서, 알부민, 지단백질, 면역글로불린 또는 진성글로불린으로 구성된 군 중에서 선택됨을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  21. 제20항에 있어서, 알부민을 함유하는 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  22. 제21항에 있어서, 지단백질의 함유량이 중량/중량(알부민/지단백질) 기준으로 약 3.0% 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  23. 제16항 내지 제22항 중 어느 하나의 항에 있어서, 생물분자 제제 중에 존재하는 PKA 및/또는 알루미늄의 농도가 낮은 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  24. 제23항에 있어서, 생물분자 제제 중에 존재하는 PKA 및/또는 PKA-C1에스터라제 및/또는 칼리크레인 및/또는 알루미늄의 농도가 BP, EP 또는 USP 최소 기준 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  25. 제24항에 있어서, 면역글로불린 제제 중에 존재하는 알루미늄 농도가 약 50 ㎍/L 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  26. 제24항에 있어서, 알부민 제제 중에 존재하는 알루미늄 농도가 약 10 ㎍/L 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  27. 제24항에 있어서, 알부민 중에 존재하는 PKA의 농도가 약 5 IU/㎖ 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
  28. 제24항에 있어서, 알부민 제제 중에 존재하는 PKA-C1에스터라제의 농도가 약 10 IU/㎖ 미만인 것을 특징으로 하는 생물분자 분리물.
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Families Citing this family (16)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1999029396A1 (de) * 1997-12-04 1999-06-17 Filterwerk Mann+Hummel Gmbh Verfahren zur filtrierung einer flüssigkeit
ATE337049T1 (de) * 2000-10-12 2006-09-15 Ciba Sc Holding Ag Verfahren zum färben von keratinhaltigen fasern
UA94442C2 (ru) * 2006-01-25 2011-05-10 Октафарма Аг Очищение и применение белкового фактора, который содействует заживлению ран
US8202240B2 (en) * 2008-08-12 2012-06-19 Caridianbct, Inc. System and method for collecting plasma protein fractions from separated blood components
US8123713B2 (en) * 2008-08-12 2012-02-28 Caridian Bct, Inc. System and method for collecting plasma protein fractions from separated blood components
WO2011150284A2 (en) 2010-05-26 2011-12-01 Baxter International Inc. Removal of serine proteases by treatment with finely divided silicon dioxide
AU2010202125B1 (en) 2010-05-26 2010-09-02 Takeda Pharmaceutical Company Limited A method to produce an immunoglobulin preparation with improved yield
CN105008384A (zh) * 2013-02-28 2015-10-28 新加坡科技研究局 在高电导率下在非离子性有机聚合物的存在下的蛋白质纯化
GB201413227D0 (en) 2014-07-25 2014-09-10 Bioproducts Lab Ltd Process
CN105854827A (zh) * 2016-05-12 2016-08-17 上海同化新材料科技有限公司 一种应用于钛白粉生产过程中钛液过滤的颗粒状纤维素助滤剂
RU2703537C2 (ru) * 2016-08-09 2019-10-21 Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования "Удмуртский государственный университет" Способ изготовления полуфабрикатов иммуноглобулиновых и альбуминовых биопрепаратов из боенской, трупной крови животных, абортной и плацентарной крови человека
US20180079739A1 (en) 2016-09-19 2018-03-22 Arysta Lifescience North America, Llc. Manufacturing Method For and Insecticidal Compositions Comprising Thiocyclam Hydrochloride
EP3460449A1 (en) * 2017-09-26 2019-03-27 Imerys Minerals Limited Apparatus and method for selecting filter aid
TW202000655A (zh) * 2018-06-13 2020-01-01 美商愛利思達生命科學公司 用於製備硫賜安鹼及鹽之程序
CN111569523A (zh) * 2019-02-15 2020-08-25 天津天士力现代中药资源有限公司 一种中药醇沉药液分离自动控制装置
CN113176133B (zh) * 2021-03-15 2024-02-13 广州邦德盛生物科技有限公司 一种分离血浆或血清中蛋白质和脂类的方法及基质血清

Family Cites Families (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPS6059003B2 (ja) * 1977-10-18 1985-12-23 ダイセル化学工業株式会社 濾過助剤
JPS5554012A (en) * 1978-10-13 1980-04-21 Takeda Chem Ind Ltd Compostion for filtering, and clarifying method of liquid
JPS603367B2 (ja) * 1979-10-09 1985-01-28 旭化成株式会社 白血球分離法および白血球分離材
FI65070C (fi) * 1982-03-12 1984-03-12 Valtion Teknillinen Saett att separera blodets hemoglobin till hem och globin
JPH0755282B2 (ja) * 1986-08-06 1995-06-14 ダイセル化学工業株式会社 ▲ろ▼過方法
WO1990005461A1 (en) * 1988-11-18 1990-05-31 Tosoh Corporation Process for purifying blood plasma
DE4119288B4 (de) * 1991-06-12 2004-08-26 Schenk-Filterbau Gmbh Verfahren zur Schichtenfiltration von pharmazeutischen, biologischen, chemischen oder dergleichen Flüssigkeiten

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