CN1213326A - 使用以纤维素为基础的助滤剂进行血浆混合物的过滤 - Google Patents

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Abstract

本发明总的来说涉及从蛋白混合物中分离一种或多种组分的方法。更具体地说,本发明是关于从血浆中分离一种或多种组分的方法,这种方法包括使用以纤维素为基础的助滤剂的一个或多个过滤步骤。本发明在治疗剂的制备中,尤其是在人体中应用的以血浆为基础的治疗剂中有用。

Description

使用以纤维素为基础的助滤剂进行血浆混合物的过滤
本发明总的来说涉及从蛋白混合物中分离一种或多种组分的方法。更具体地说，本发明是关于从血浆中分离一种或多种组分的方法，这种方法包括使用以纤维素为基础的助滤剂的一个或多个过滤步骤。本发明在治疗剂的制备中，尤其是在人体中应用的以血浆为基础的治疗剂中有用。
本说明书全文中，除了上下文的需要以外，单词“comprise”，或其变体如“comprises”或“comprising”，应视为暗示一个所说的整体或整体群的内含物但不排除任何其他整体或整体群。
在本说明书中被作者引述的发表文章的文献细节都收录在说明书的末尾。
最近在理解血浆蛋白的功能和涉及一系列血液失调的缺陷方面取得了进展，同时人血的主要蛋白成分的贮存技术也得到改进，这些导致了为治疗目的人血特异的亚组分，而不是全血的更多利用，尤其是细胞成分(红细胞，血小板和白细胞)和血浆蛋白组分(白蛋白，纤维蛋白原和球蛋白，包括优球蛋白，假球蛋白，α-球蛋白，β-球蛋白和γ-球蛋白)。
人血的血浆蛋白组分，尤其对制药工业有巨大的价值，这些制药工业生产治疗纤维蛋白原的，纤维蛋白溶解的和凝固失调及免疫缺陷病例如血友病，冯威斯布兰特病和纤维蛋白原缺乏等等病的治疗剂。主要的治疗组分是：白蛋白，不同纯度的；免疫血清球蛋白，正常的和特异的；抗嗜血因子或因子Ⅷ；凝血酶原复合物包括因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ和Ⅹ；和纤维蛋白原或因子Ⅰ。治疗有效的血浆组分的应用，排除了血量增多的危险并减小了污染蛋白的风险。对凝固失调的病人适当的替代治疗只可能通过使用凝固因子浓缩物进行。对于预防或治疗足够高的抗体效价只能通过使用免疫血清球蛋白浓缩物达到。
一些血浆的成分，尤其是凝固因子Ⅴ和Ⅷ和免疫血清球蛋白，是不稳定的，必须小心快速地制备以得到最大的治疗效果和减小与使用血液制品相关的风险。例如，由于不是最佳分离过程，可能导致免疫血清球蛋白的部分变性，可产生对接受者有毒或高免疫原的产物。因此，在血浆分离工业中，需要改进分离的方法，使得其更快速，产量更高，变性更少并且几乎不引起由血浆组分衍生的不需要的污染物进入血浆组分。
冷沉淀作用是目前使用的大量制备血浆组分的大部分方法中的第一步。将新鲜的冷冻血浆集中，在5℃以下化冻，在连续流动离心机(Guthohrleen和Falke,1997,Avery,1972)中收集沉淀。上清部分，本领域技术人员称为“冷上清”，一般保存备用。
“冷上清”可以作为一些血浆组分的来源，包括纤维蛋白原，抗凝血酶Ⅲ，凝血酶原复合物(包括凝固因子Ⅱ,Ⅶ,Ⅸ和Ⅹ)，白蛋白和免疫球蛋白。
“冷上清”随后的加工一般涉及了使用有机沉淀剂如硫酸铵，乙醇，丙酮和聚乙二醇的沉淀作用。例如，在乙醇，零下温度，pH，离子强度和蛋白浓度的独特结合下，发生血浆蛋白组分的选择性沉淀。这些原理基本上是根据Cohn分级分离方法(Cohn等，1946)，此方法用来纯化白蛋白。
对于大部分有机沉淀剂，尤其冷乙醇，抗凝血酶原Ⅲ和纤维蛋白原一般是最先沉淀的血浆蛋白。白蛋白，优球蛋白和脂蛋白是使用冷乙醇时分离的最后的蛋白。
Oncley等(1949)已发展了Cohn分级分离的变法，来从血浆中纯化免疫球蛋白，Oncley的方法使用Cohn组分Ⅱ和Ⅲ作为起始材料，和与Cohn等(1946)描述的方法不同的冷乙醇，pH，温度，蛋白浓度的组合，来生产活性免疫球蛋白血清组分。今天，Oncley的方法已是用来生产免疫血清球蛋白的经典方法。
用乙醇或等电沉淀选择性分离蛋白已被开发用来进一步纯化Cohn组分。特别是，Curling(1980)用等电沉淀来从血浆衍生的富含白蛋白组分中去除优球蛋白。
选择性的，或附加的，Cohn组分可以进一步纯化除去固相结合的脂蛋白。将脂蛋白分离到固相里去的方法为本领域技术人员所熟知，包括，例如，吸附脂蛋白到AerosilTM或相似的硅酸盐材料上，等等。
在所有的用来分离血浆蛋白的沉淀步骤中，固相和液相必须分开。通常，通过离心的方法来形成大量的沉淀物。蛋白沉淀或膏状物从离心机转筒中取出，并重新悬浮和进一步加工成其他组分，或者收集上清直接加工。然而适当的离心机品种有限，因为血浆分离需要严格的卫生要求和低的操作温度，尤其是分离不稳定的蛋白(例如因子Ⅷ)。不幸的是，从离心机散热是显著的，需在机套上安装一个很大的冷却装置。离心机可能需要放在保持零下温度的操作室中以降低机器的负荷。它们常常不具有足够的固体装载能力以用于大量的操作，可能需要几个离心机转筒用于每一批血浆蛋白操作时更换。经验表明，离心机的维修要求很高，导致多次停工，高的维修费用和在修理期间丧失工作能力。而且，来自离心混合物明显数量的母液在离心后留在膏状物上，减少了上清部分有价值的蛋白的产量，并且如果不进行冲洗膏状物的步骤，会导致来自膏状物的产品中存在大量的杂质。
一种替代离心的方法，或者与离心一起使用的方法是，大规模的血浆蛋白过滤来分离沉淀。有一些种类的过滤器可用来过滤血浆组分。板式的框式过滤器是最容易使用的，具有最低的液体体积与面积比，因此剩余的体积是最小的，并且滤饼洗涤也是非常有效的。管状过滤器是垂直方向的，主要是当固体含量较低时使用，如水纯化。旋转的叶状滤机是用在垂直或水平管槽中的水平的或垂直的滤叶建成的。水平的滤叶是当固体上样量较低和循环时间较长时作为精滤器在间歇操作时使用。垂直滤叶是为易于除去滤饼而设计，和当固体上样量较高的时候使用。
过滤器可以与助滤剂一起在过滤过程中使用来促进流动。加入助滤剂到固液混合物中可防止过滤器筛网/载体窒塞/管塞并且通过提供流动的开放通道促进过滤时的通透。最佳的助滤剂常常是在最快的流速上得到最好的透明度的那一种。必须的，助滤剂不得不是高渗透性的，具有好的狭窄的颗粒/纤维大小分布，化学上惰性的和物理上稳定的。
助滤剂广泛地在加工工业中用于不同的用途如煤的液化(Jones等，1994；Shou等,1980)，废水处理(Rudenko,1981；Martin等，1993)，食品和饮料纯化(Olsen等，1979；Hermia和Brocheton,1994)和石油工业中(Grichenko和El’shin,1980；Soroka,1975)。
在硅藻土助滤剂中的可溶性硅石不受欢迎的地方，纤维素助滤剂被广泛地用在过滤设备中，如在酿造，发酵和冶金工业中(见DicaliteTM技术公报，Rettenmaier&Sohn ArbocelTM技术公报，Rettenmaier&Sohn)。纤维素助滤剂在药品，尤其血制品分离中的利用仍未被确定。
在血浆分离工业中，过滤作用仅限于使用硅藻土助滤剂。Friedlie和他的瑞士红十字献血中心的同事已开发在从血浆分级分离中生产白蛋白和γ-球蛋白时使用硅藻土助滤剂(PerliteTM J-100,CeliteTM545和Hyflo-Super-CelTM)的过滤作用。他们在早期研究中总结出，尽管粗提物的过滤显示了预期的结果，但硅藻土助滤剂的吸附效应引起了在更纯的组分分离时不能接受的蛋白丢失(Friedli等，1976)。德国红十字献血中心(Wolter,1977)也试验了用硅藻土助滤剂(Hyflo Super-CelTM)预先包被的一种垂直柄ZHF-S过滤器来分离白蛋白。纽约血液中心的Hao(1985)，也研究了在组分Ⅳ-4的分级分离中作为助滤剂的HyfloSuper-CelTM，并发现白蛋白的丢失的确发生。De Jonge等(1993)报告了在过滤出Cohn沉淀，组分Ⅰ，组分Ⅰ+Ⅲ，组分Ⅲ，组分Ⅳ和组分Ⅴ时硅藻土助滤剂(CeliteTM)的应用。
在终产品的高质量是必要先决条件时，在制药工业中几个与使用硅藻土助滤剂相关的问题，尤其是，硅藻土助滤剂是从土壤中抽提的，几乎没经过预处理。它们的品质依赖于它们的来源有内在的可变性，并且如果在制药工业中使用，它们不得不用酸洗，因为他们普遍滤出重金属和铝。它们是泵和电抛光表面的磨料。
而且，特别地考虑到血浆过滤工业，高品质和不溶性是重要的，硅藻土助滤剂活化接触活化系统，产生激肽释放酶原活化剂(PKA)和PKA复合物，此复合物会引起不良的临床后果。
在导致本发明的工作中，发明人试图发展新的更好的使用过滤技术来分离蛋白混合物，例如，血浆蛋白混合物的方法。尤其是对血浆分离工业很新颖的助滤剂的使用已提供了发展一系列为生产血浆蛋白组分如Cohn组分，白蛋白，脂蛋白和优球蛋白而改进的方法的途径。
因此，本发明的一方面是提供了一种从生物分子混合物中分离固相物质的方法，此方法包括将所说的混合物与以纤维素为基础的助滤剂混合来产生浆液并使上述浆液通过或泵过过滤容器。
在变换的实施方案中，本发明提供了从生物分子混合物中分离固相物质的方法，上述方法包含以下步骤：
ⅰ)用以纤维素为基础的助滤剂预包被过滤器筛网；和
ⅱ)使上述生物分子混合物通过或泵过预包被的过滤器筛网。
除了使用以纤维素为基础的助溶剂来预包被过滤器筛网，另外的助滤剂也可以加入生物分子混合物中，因而本发明的进一步变换的实施方案中，将附加的以纤维素为基础的助滤剂加入生物分子混合物中形成浆液，使此浆液通过或泵过预包被的过滤器筛网。
根据前述的实施方案，因此得到的滤液可以选择性地再循环返回到上样液或过滤容器中直到充分澄清，然后滤液可以收集起来。
在此描述的任何方法的实施方案中使用的流速可以由本领域的技术人员方便地确定。
优选地，可以用适当的溶剂或缓冲剂水溶液进行一次或多次洗滤或冲洗，来洗涤得到的固相或滤饼以便除去其上吸附的残留母液，并进一步提高产量，改进分离过程。每一次洗滤或冲洗都进一步置换了过滤容器中的液体，由此增加了滤液中所需产品的产量。
在每一次洗滤或冲洗中使用的缓冲液体积可以方便地由本领域技术人员确定。
为此目的的适当的冲洗溶液和条件将随着生物分子混合物的性质和所需的终产物的稳定性不同而变化很大。这样的条件可以在不需过多的实验的情况下，由本领域的技术人员方便地确定。
本发明特别地给出从生物分子混合物中分离固相物质的方法，此处提到的生物分子混合物包括至少一种血浆蛋白。
以纤维素为基础的助滤剂可以是任何包含了纤维素作为活性成分的助滤剂，其功能是防止过滤筛网或载体的堵塞或选择性地，或附加地，促进过滤过程中的流动，它是化学上惰性的，物理上稳定的，非腐蚀的和优选地不滤出铝。
发明人已发现，适合于特别过滤操作的以纤维素为基础的助滤剂的最佳类型和数量将随着过滤起始材料和所需终产物的不同而变化。一般地，对一个特别的过滤作用的最佳助滤剂将提供在过滤过程中最快的流量和产出比次佳助滤剂更清亮的滤液。然而，为了得到在此所描述的本发明的最佳性能，重要的是不使滤器过载，因为过载会导致任一种或多种不良效果，包括增加滤液的混浊度，破坏并最终使过滤筛网变形，过滤器损坏，滤饼在过滤器筛网之间桥接，等等。
相应地，为本发明提供的本发明的特别优选的实施方案是使用大约2.0％(W/V)的最大浓度的以纤维素为基础的助滤剂(即每升溶液中有20g以纤维素为基础的助滤剂)或2.0％(w/w)以纤维素为基础的助滤剂(即每公斤血浆中有20g以纤维素为基础的助滤剂)来实现的。甚至更优选地，以纤维素为基础的助滤剂在浓度大约0.5(w/v)到大约2.0％(w/v)时使用或选择性地，在浓度大约0.5(w/w)到大约2.0％(w/w)时使用。
根据优选的实施方案，发明人发现浓度变化范围从大约0.5％(w/v)到大约2.0％(w/v)的助滤剂在过滤前加入到上样混合物中，有助于提供一个致密的，多孔的滤层促进流动。比上述的更低浓度的助滤剂具有不足以形成过滤筛网的倾向，由此使固相物质流过过滤筛网，或者选择性地，产生低孔隙率的滤层，引起高的压力降，减少了可过滤的上样混合物的量。比在此所具体描述的更高浓度的以纤维素为基础的助滤剂产生高孔隙率的滤层，除了产生上述问题外，允许太多的上样混合物中的固相物质流过滤层，由此减低了滤液的透明度。
优选地，此处生物分子混合物至少包括一种来自血浆来源的血浆蛋白和所需的终产物是富含优球蛋白或富含脂蛋白的组分，一些适合使用的以纤维素为基础的助滤剂包括，例如．DiacelTM150,DiacelTM200,ArbocelTM200或VitacelTM200，等等。因为优球蛋白或脂蛋白可以通过结合到煅制二氧化硅上而螯合到固相材料上，例如加入AerosilTM到组分Ⅰ中，在过滤过程中使用的以纤维素为基础的助滤剂浓度(用上样混合物中含煅制二氧化硅的重量百分比表示)也必须最佳化以获得最好的性能。
此处生物分子混合物至少包括一种来自血浆来源的血浆蛋白和所需的终产物是富含免疫球蛋白组分，优选的助溶剂是二级精度的纤维素，例如DiacelTM150，等等。
此处生物分子混合物是与用Cohn等(1946)方法或其改进方法得到的组分Ⅱ+ⅢW或组分Ⅲ基本上相同的血浆组分，优选的助滤剂是二级精度的纤维素，例如DiacelTM150，等等。
以纤维素为基础的助滤剂可以在合适的缓冲液或培养基中预溶胀，优选与生物分子混合物等渗和pH相同的缓冲液或培养基。选择性地，在使混合物通过或泵过过滤筛网或滤器之前将以纤维素为基础的助滤剂直接加入生物分子混合物中，在足以允许助滤剂溶胀的条件下温育一段时间。
以纤维素为基础的助滤剂的溶胀时间和适当的溶胀条件为相关领域的技术人员所知，并随着进行溶胀时的平均颗粒直径，温度亲水性或溶液的离子强度变化。
本发明能适应于任何适合过滤生物分子混合物如血浆蛋白混合物的滤器，例如板式和框式过滤器，管状过滤器或旋转的叶状滤机，等等。板式和框式过滤器是最容易使用的，具有最低的液体体积与面积比，因此剩余的体积是最小的，并且滤饼洗涤也是非常有效的。板式和框式过滤器适应于涉及或者过滤器筛网的预包被或者如在此前所述的再循环方法的过滤。管状滤器是垂直方向的，主要是当固体含量较低时使用，如水纯化。旋转的叶状滤机是用在垂直或水平管槽中的水平的或垂直的滤叶建成的。水平的滤叶与当固体上样较低和循环时间较长时作为精滤器在间歇操作时使用。垂直叶是为易于除去滤饼设计的，和当固体上样较高的时候使用。本发明人发现，在血浆蛋白混合物的过滤中，过滤的再循环方法是优选的。
本发明的过滤方法尤其在分离复杂的或简单的生物分子混合物中有用，尤其是复杂的或简单的血浆蛋白组分。
在此使用的术语“生物分子”是指任何天然产生的或天然衍生的分子，包括，但不限于，氨基酸，核苷酸，核苷，糖，脂肪和包含同样物质的聚合物如核酸，蛋白质，肽，多糖，脂类和脂蛋白。
相应地，在此使用的术语“生物分子混合物”可推延到包含了多于一种蛋白，核酸，肽，多糖，脂类，脂蛋白，氨基酸，核苷酸，核苷，糖或脂肪化合物的任何混合物，其来源于生物体来源，在本文中，术语“生物分子混合物”推延到细胞培养物，细胞或亚细胞组分或细胞提取物的溶液，尤其血和血衍生的产物如血浆和其衍生的组分。
在此使用的术语“固相材料”被用来表示任何以其固相形式存在的化合物，大分子或生物分子，不考虑用来固化上述化合物、大分子或生物分子的方法。例如在本发明的申请中有关血浆分离工业的部分中，术语“固相材料”将用来包括由未分离的或分离的血浆或血产生的血浆蛋白沉淀物和固相结合的脂蛋白。
本发明不应被此前描述的用来产生固相物质的方法或途径所限制，从属的附加条件是上述的方法或途径不破坏在此描述的以纤维素为基础的助滤剂。
优选地，固相物质是生物分子如从包含白蛋白，免疫球蛋白，脂蛋白，优球蛋白，因子Ⅷ，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ或血的其他组分，等等的目录中所选的血浆蛋白。
本发明的上下文中，术语“血浆蛋白”是表示来自血浆来源的蛋白，多肽或肽片段，血浆来源包括但不限于新鲜的冻血浆，非新鲜的冻血浆或其中的组分，如用Cohn等(1946)或Oncley等(1949)的分级分离方案或其改进方法产生的中间组分或其他血浆组分。因此，术语“血浆蛋白”不应被用乙醇沉淀方法衍生的血浆组分所限制。
在此使用的术语“来自”用来表示起始自如在此特指的特定来源的特定整体或整体群，但不必须直接从此来源得到，例如血浆蛋白可以直接来自未分离的血，粗血浆或者其组分。
本发明的第二个方面是针对使用以纤维素为基础的助滤剂的包括至少一个过滤步骤的生物分子混合物分离方法。
在变换的实施方案中，本发明提供了使用以纤维素为基础的助滤剂的包括至少一个过滤步骤的生物分子混合物分离方法，此处所述的生物分子混合物至少包括一种蛋白分子。
在特别优选的实施方案中，本发明提供了使用以纤维素为基础的助滤剂的包括至少一个过滤步骤的生物分子混合物分离方法，此处所述的生物分子混合物是血浆或其衍生物，如但不限于，冷上清，重新悬浮的血浆蛋白沉淀或与Cohn或Oncley分离方案相关的中间组分，等等。
在更特别优选的实施方案中，上述血浆衍生组分是任何富含免疫球蛋白的，富含优球蛋白的或富含脂蛋白的组分。
根据本发明的这个实施方案，富含免疫球蛋白的，富含优球蛋白的或富含脂蛋白的组分来自新鲜的冻血浆或其他血浆来源或其衍生物，包括冷上清或与Cohn等(1946)或Oncley等(1949)的分离方法或其改进方法或者本领域技术人员已知的其他方法相关的中间组分。
本领域的技术人员将意识到Cohn等(1946)和Oncley等(1949)的分级分离方案和已存在的或合适的改进方法很可能产生免疫球蛋白，优球蛋白或脂蛋白的来源。
在此所使用的术语“冷上清”将被本领域的技术人员所知来提及新鲜的冻血浆在5℃以下温度下化冻，并离心去除固相或冷沉淀后得到的上清组分。
在进一步变换的实施方案中，本发明提供了一种分离生物分子混合物的方法，此方法包括至少1，优选2，更优选3和甚至更优选4个乙醇/乙酸沉淀步骤，在步骤中产生的固相和液相用至少一个使用了以纤维素为基础的助滤剂的过滤步骤来分离。
在特别优选的实施方案中，上述生物分子混合物包含至少一种血浆蛋白，例如脂蛋白，优球蛋白，免疫球蛋白，因子Ⅷ蛋白，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ，或白蛋白，等等。
因而，本发明的此实施方案在与血浆分级分离方案，例如Cohn的分级分离方案(Cohn等，1946)或Oncley的分级分离方案(Oncley等，1949)和其改造方法有关的乙醇/乙酸沉淀混合物的固液相分离中有用。
在此描述的方法特别地在分离生物分子的生产中有用，尤其来自血浆的，适合于用来作为治疗或预防临床失调的治疗试剂的蛋白。
本发明的进一步的方面是提供了分离的生物分子，在此至少1，优选至少2和更优选地至少3个分离上述分子的步骤中涉及了以纤维素为基础的助滤剂的使用来在简单或复杂的生物混合物中从其他分子中分离上述生物分子。
优选的上述生物分子是蛋白，更优选地是治疗蛋白，甚至更优选地是人的治疗蛋白，甚至更优选的来自血浆的人的治疗蛋白，例如脂蛋白，优球蛋白，免疫球蛋白，因子Ⅷ，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ，或白蛋白，等等。
在最优选的实施方案，本发明提供了分离的治疗的血浆蛋白，在分离上述蛋白的至少一个，优选地至少两个和更优选地至少三个步骤中，涉及到使用以纤维素为基础的助滤剂，此处中所述的蛋白是从包含白蛋白，脂蛋白，免疫球蛋白或优球蛋白的目录中所选出的。
根据本发明的方法生产的产品基本上没有不需要的污染。例如，特别优选地根据此处描述的方法分离的血浆蛋白，尤其免疫球蛋白和白蛋白具有低的铝和PKA水平。可接受的最小的铝和PKA水平由世界药典标准，如英国药典(BP)，欧洲药典(EP)和/或美国药典(USP)标准限定。
使用本发明的方法生产的白蛋白，除了低的铝和低的PKA水平，特别优选地，在上述分离的蛋白中的脂蛋白水平低于3.0％(w/w)，更优选地低于2.0％(w/w)，甚至更优选地低于1.0％(w/w)，仍然更优选地低于0.5％(w/w)和甚至还更优选地低于0.3％(w/w)。
本发明在以下的非限制性图和实施例中进一步描述。以下所举的实施方案在任何情况下不能用来限制主题发明。
图中：
图1是说明当使用以纤维素为基础的助滤剂时，来自血浆蛋白组分Ⅰ的滤液改进了透明度的图示，助滤剂有DiacelTM200(封闭的圆形●)，DiacelTM150(封闭的方形；■)和VitacelTM(开放的菱形；◇)，与硅藻土助滤剂CeliteTM(封闭的三角形；▲)比较。
图2是说明当使用以纤维素为基础的助滤剂时，来自血浆蛋白组分Ⅰ的滤液改进了透明度的图示，助滤剂有DiacelTM200(封闭的圆形●)，DiacelTM150(封闭的方形；■)和VitacelTM(开放的菱形；◇)，与硅藻土助滤剂CeliteTM(封闭的三角形；▲)比较。实施例1使用不同的助滤剂分离组分Ⅰ
四个不同袋的新鲜的冻血浆或冷上清用于四个独立的操作，使用小型叶状过滤器，表面积为2立方米，批量大小为200升。起始材料在≤1℃冷却，用注射用的水稀释到蛋白浓度为4％到6％。加入足量的乙醇和乙酸缓冲液得到8％v/v乙醇和终pH值为6.6到7.4的沉淀条件。在这些条件下，和在-2℃，纤维蛋白原沉淀出来，留下免疫球蛋白和白蛋白在溶液中。以纤维素为基础的助滤剂(DiacelTM200,DiacelTM150或ViacelTM)加入组分Ⅰ混合物，达到每升混合物中5g的比例，使之溶胀，浆液被泵过过滤容器，滤液再循环回上样液直到得到澄清。当上样液滤净，收集滤液。含有8％乙醇和0.14M NaCl的洗滤液加入过滤器中冲洗滤饼，来除去滤饼上吸附的来自上样混合物的残留的母液。过滤器的剩余体积用预冷的空气或氮气吹干，最终吸附于容器中的残留液体被排出。然后滤饼用预冷的空气或氮气吹干。打开过滤器从过滤器筛网上清除去滤饼并丢弃。
不同助滤剂的滤液透明度曲线在图1中表示出来。用硅藻土助滤剂得到的滤液透明度也作为对照得到确定。更细级别的DiacelTM给出了最陡的曲线和最快的流过速度。
表1比较了在组分Ⅰ的过滤中不同的助滤剂在几个实验中的性能，并且通常在Parkville上操作离心机的操作性能包括在表中。一般地，过滤分离的效率优于离心分离的效率，这一点由更高的滤液透明度(低混蚀度)和滤液中更低的纤维蛋白原含量证明。在过滤操作中比离心机操作的更低的蛋白产率是因为在死体积中明显丢失。
所有测定的以纤维素为基础的助滤剂看来表现同样地好，其透明度在82NTV到96NTU之间变化。DiacelTM150需要最少的再循环时间，表明固体有效并快速地被吸附在滤层上，滤层的多孔迅速减低，然而此助滤剂也产生了最大的压力降，从此细密助滤剂可预期这一点。
表1组分Ⅰ混合物到产生组分Ⅰ滤液的过滤中的结果
助滤剂   滤液池的NTU    压力(巴) 再循环时间〔分钟〕 组分Ⅰ滤液中蛋白产量g/L血浆   纤维蛋白原含量(mg/ml)
VitacelTMLC200     103      0.20    40     52.3     未测定
CeliteTM580     114      0.15    40     50.6     未测定
DiacelTM150   129±59(n=3)    0.4±0.4(n=3)   14±5   49.8±1.4     ＜0.04
 DiacelTM200   116±43(n=3)   0.07±0.03   30±18   52.6±1.9     ＜0.04
离心机     520(n=6)(314-1000)       无     无     54-59    0.51±0.15
实施例2用不同的助滤剂分离组分Ⅱ+ⅢW
用2立方米的叶状过滤器进行小型实验，批量大小为15到18kg组分Ⅱ+Ⅲ滤饼。冷冻的组分Ⅱ和Ⅲ滤饼含有来自以前分离步骤的助滤剂，用注射用水(在0℃)悬浮来达到1％w/v蛋白浓度。加入足够的乙醇和乙酸缓冲液以达到20％v/v乙醇和终pH值6.65的沉淀条件。在这些条件和-5℃下，免疫球蛋白重新沉淀出来，留下残留的白蛋白和一些脂蛋白在溶液中。浆液应充分地混匀以确保组分Ⅱ+ⅢW混合物的均匀性。不需要加入另外的助滤剂到混合物。然后浆液被泵过过滤容器且滤液再循环回上样液直到澄清为止。当上样液滤净后收集滤液。然后含20％乙醇的洗滤液加入过滤器中冲洗滤饼来除去吸附在滤饼上的残留母液。过滤器的剩余体积用预冷的空气或氮气吹干，最终吸附于容器中的残留液体被排出。滤饼从过滤器筛网去除，冷冻保存直到进一步加工成纯的免疫球蛋白。
这种混合物的过滤只能用更细的助滤剂，CeliteTM580和DiacelTM150来实现。DiacelTM150提供很好的过滤，过滤透明度一般地在5分钟内达到，用CeliteTM580的操作最初是成功的，在最初的5分钟后滤液达到51NTU透明度，然而，一旦压力上升，迫使细密的纤维通过滤层并漏入滤液中，使滤液池的混浊度高达988NTU。VitacelTMLC200和DiacelTM200不能提供足够致密的滤层来过滤组分Ⅱ+ⅢW混合物。
表2来自组分Ⅱ+ⅢW混合物的结果
    助滤剂 滤液池的NTU   压力(巴) 再循环时间(分钟)
VitacelTMLC200    ＞2000     2.0     145
 CeliteTM580     988     2.0      5
 DiacelTM150    34±25(n=3)   0.6±0.5(n=3)     7±5(n=3)
 DiacelTM200     ＞2000   0.7±0.9     ＞60
    离心机     55-915      无      无
实施例3不同比例的以纤维素为基础的助滤剂在小型水平上的过滤表现
为确定在典型分离中以纤维素为基础的助滤剂合适用量，进行小型实验来分离滤液中的白蛋白和沉淀中的免疫球蛋白，使用2立方米叶状过滤器来过滤作为起始材料的250kg到500kg的组分Ⅱ+Ⅲ混合物。
不同量的DiacelTM150加入混合物中，经溶胀并使用实施例1中列出的相同方法过滤，不同之处是使用20％乙醇/NaCl洗滤液并且收集富含免疫球蛋白的沉淀和富含白蛋白的滤液。
表3中表示了过滤时间，过滤透明度和通过过滤器的压力降。更大量的以纤维来为基础的助滤剂导致得到滤液的更低的透明度(即更高的混浊度)。实验的助滤剂在最高的百分比时，压力降最低，进一步暗示滤层在这些条件下对流动更开放。对于每一种测试的助滤剂的量，几乎不表现过滤时间的变化，然而测试的助滤剂在最高的百分比时，可以看到筛网间滤饼的桥接，这种桥接表明在过滤器不过量上样和过滤筛网没有变形的情况下助滤剂的百分比不能增加到超过1.8％(w/v)的水平。
表3 DiacelTM150在不同浓度时过滤表现的比较
混合体积(升) 助滤剂用量(％w/v) 时间(小时)   滤液池的NTU   压力(巴)
285(n=1)     0.8     ＞6     nd     1.40
332(n=1)     1.0     4.0     9.8     1.30
332(n=3)     1.5     4.7     14.2     1.40
460(n=3)     1.8     6.0     37.4     0.50
实施例4从富含白蛋白的血浆组分中去除脂蛋白和优球蛋白
将大约80升的富含白蛋白的血浆组分的pH调节到5.2，使优球蛋白沉淀并且用煅制二氧化硅处理吸附脂蛋白。助滤剂DiacelTM200加入混合物，比例为每g煅制二氧化硅加2g助滤剂，使之溶胀至少30分钟。混合物被泵入已装过滤垫和预包被了DiacelTM200的板式和框式过滤器中。收集滤液，滤饼用洗滤缓冲液(5mM醋酸钠，pH5.2)冲洗。然后拆开压机并且除去滤饼。
用小型叶状过滤器(2m2)进行同样的操作，批量大小为160升。在此例中，过滤器不是预包被的，因为在过滤器上可以得到的高流量确保了助滤剂，DiacelTM200，在过滤器筛网上均匀地分布。收集前滤液再循环直到澄清，滤饼用洗涤缓冲液冲洗，收集剩余体积，除去滤饼并丢弃。
表4比较了两种过滤器的表现。
表4 DiacelTM200在优球蛋白/脂蛋白的去除步骤中的过滤情况
    参数 板式和框式 叶状过滤器
试验开始的透明度(NTU)     71     57
结束时的透明度(NTU)     16     ＜18
终液的透明度(NTU)     26     10
过滤时间(分钟)     40     100
上样液中脂蛋白含量(％w/w)     2.9     3.1
滤液中脂蛋白含量(％w/w)     0.2     0.3
蛋白回收率(％w/w)     85     82
DiacelTM200在两个过滤器中的过滤性能都同样好，实验给出了滤液的高透明度(低混浊度)和相同的蛋白回收率(因为沉淀已除去了一些蛋白，所以不能期待100％的回收率)。在两个实验中，脂蛋白的减少了至少10倍反映了板式和框式及叶状过滤器的性能。在第二个实验的过滤时间比第一个实验多得多反应了批量大小的加倍。实施例5在生产水平上用离心和过滤分离组分Ⅲ的比较
生产规模的叶状过滤器(18m2)被拿来在组分Ⅰ到组分Ⅲ滤液的过滤中有效应用。所报告的结果总结了组分Ⅲ混合物最终过滤的三个实验的数据，每一个实验操作如下：
400kg用量的组分Ⅱ+ⅢW滤饼，包含了来自前面Cohn组分步骤的DiacelTM150，在0℃用注射用的水重新悬浮得到大约1％w/v的蛋白含量。加入足量的乙醇和乙酸缓冲液得到17％v/v乙醇和终pH值为5.35的沉淀条件。在这些条件和-5℃下，免疫球蛋白M，免疫球蛋白A和几种脂蛋白仍保持沉淀，同时免疫球蛋白G重新溶解。混合物被泵过过滤容器，滤液再循环回上样液直到得到澄清。当上样液滤净时收集滤液。含有17％v/v乙醇和0.015M醋酸钠的洗滤液加入过滤器中冲洗滤饼，来除去滤饼上吸附的残留母液。过滤器的剩余体积用预冷的空气或氮气吹干，最终吸附于容器中的残留液体被排出。然后滤饼用预冷的空气或氮气吹干。打开过滤器从过滤器筛网上清除滤饼并扔掉。组分Ⅲ滤液样品取出鉴定。滤液的pH值调节到4.0，浓缩至7％w/v蛋白，然后对注射用水渗滤，之后在麦芽糖中配制。也鉴定了终产物样品以检测痕量水平的其它血浆蛋白。表5总结了从这三个实验中得到的滤液和终产物的特征，并与离心产物的数据比较。
表5：组分Ⅲ滤液和终产物的特征
   产物(离心)   产物(过滤器)
 透明度，上清/滤液中的NTU    11.8±7.5    1.4±0.2
      终产物中IgM,mg/mL    0.05±0.01    0.09±0.2
      终产物中IgA,mg/mL    0.17±0.03    0.19±0.05
终产物中血纤维蛋白溶酶原，μg/mL    0.52±0.36    0.33±0.07
表5说明了从过滤器得到的滤液比从离心得到的上清更透明，具有更低的NTU值。从离心得到的上清Ⅲ随后通过板式和框式过滤器精滤来达到同样水平的透明度。通过比较终产品中IgM,IgA和血纤维蛋白溶酶原(这些血浆蛋白在Cohn分级分离方案的此步骤中保持为沉淀)的水平，有一点很明朗，那就是与这种组分Ⅲ混合物的离心相反，过滤不损害产品质量。实施例6：不同比例的以纤维素为基础的助滤剂在生产水平上的过滤表现。
两个生产规模的过滤器(18m2)用来过滤组分Ⅱ+Ⅲ混合物，使用实施例1中列出的程序，不同之处是使用20％乙醇/NaCl洗滤和收集富含免疫球蛋白的沉淀和富含白蛋白的滤液。助滤剂的用量(％w/v)更加减少，为了最大化每个过滤器内的可用空间。
结果表示在表6中。表6中所示数据从两个不同批量大小的组分Ⅱ+Ⅲ得到，分别来自于2500Kg和5000Kg血浆。
正如表6中所示，使用的助滤剂百分比越大，过滤时间越快(即流动更快)。在生产水平上比在小量水平上更小心地控制滤液的透明度，因此，滤液的透明度表现为更低。助滤剂的用量越大，得到的沉淀量越大，这样对于同样的混合物体积，每个过滤器的有效能力降低。
表6不同浓度的以纤维素为基础的助滤剂在生产水平上的过滤表现的比较
混合体积(升) 助滤剂用量(％w/v)    时间(小时) 滤液池的NTU   沉淀量(kg)
  3600     1.5     4.09     6.6    254
  3700     1.1     6.30     6.5    213
  7100*     1.5     5.24     4.9   2×254
  7200*     1.0     7.20     5.2   2×224
  7000*     1.0     8.00     7.2   2×202
*使用两个过滤器，总体积的一半通过每个过滤器进行平行操作。实施例7生产规模的过滤加工免疫球蛋白的产率
生产规模的过滤器在制备免疫球蛋白时用来过滤Cohn沉淀的混合物。在每一阶段，组分Ⅰ混合物，组分Ⅱ+Ⅲ混合物，组分Ⅱ+ⅢW混合物或组分Ⅲ混合物进行过滤，使用1.5或2.0倍于过滤容器体积(7500Kg或10,000kg)的洗滤液来从容器中回收滤液。
表7中所示数据比较了当使用或1.5或2.0倍于过滤容器体积的洗滤液时，三种不同批量大小的免疫球蛋白G的产率。数据表明在检测的2个高的生产水平上，当使用的洗滤液体积大时，产率明显更高。
表7不同批量大小和不同洗滤液体积从生产设备中得到的产率比较
血浆加工量(MPP)(kg) 过滤器洗滤体积(×MPP)        产率(g每kg血浆)
    2,500       1.5         3.60
    5,000       2.0         4.09
    7,500       2.0         4.14
实施例8产品质量估计
如此处描述的使用以纤维素为基础的助滤剂生产的免疫球蛋白和白蛋白组分中铝和PKA水平得到测定，结果在表8和9中表示，数据表明白蛋白的质量不会因为暴露于以纤维素为基础的助滤剂而遭到损害，并且如此处描述的使用以纤维素为基础的助滤剂生产的产品中的PKA和PKA复合物低且铝水平低。在表9中，数据表明以纤维素为基础的助滤剂对终产品的特征没有有害影响，这一点是通过根据本发明的方法生产的免疫球蛋白制备物的低铝含量，低激肽释放酶和低PKA含量来估计的。
表8白蛋白(生产水平)的特征记述
    污染物     药典限度     结果(n=5)
    铝     ＜100μg/L     8±4μg/L
    PKA-C1酯酶     ≤35IU/mL  ＜7IU/mL±3IU/mL
    PKA     ≤28.6IU/mL  4.8IU/mL±1.3IU/mL
表9用以纤维素为基础的助滤剂过滤得到的IgG的特征与用离心操作(生产水平)得到的IgG比较
    污染物     离心(n=3)     过滤(n=3)
    铝(μg/L)     67μg/L±21μg/L     34μg/L±3μg/L
激肽释放酶(％标准参考)     453±147     167±33
    PKA(IU/mL)     ＜1.0IU/mL     ＜1.0IU/mL
本领域的技术人员将完全了解，在此描述的本发明除了那些特定描述的，是可以改变和修饰的。本发明包括所有这些改变和修饰这一点将受到认可。本发明也个别地或集合地包括在说明书中提到的所有步骤，特征，组合物和化合物，和或任何二个或多个上述步骤或特征的任何和所有组合。参考文献
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Claims (28)

1．一种从生物分子混合物中分离固相物质的方法，该方法包括使上述混合物与以纤维素为基础的助滤剂接触来产生浆液并使上述浆液通过或泵过过滤容器和过滤筛网来得到滤液和滤饼。
2．一种从生物分子混合物中分离固相物质的方法，所述方法包括以下的步骤
ⅰ)用以纤维素为基础的助滤剂预包被过滤筛网；和
ⅱ)使上述生物分子混合物通过或泵过预包被的过滤筛网来得到滤液和滤饼。
3．根据权利要求2所述的方法，此处在使所述生物分子混合物通过或泵过预包被的过滤筛网的步骤之前，加入附加的以纤维素为基础的助滤剂到生物分子混合物中。
4．根据权利要求1到3中任何一项所述的方法，包括一次或多次再循环滤液进入上样液或过滤容器的进一步步骤。
5．根据权利要求1到4中任何一项所述的方法，包括用适当的溶剂或水溶液缓冲液洗涤或冲洗滤饼来除去来自上样混合物的残留母液的进一步步骤。
6．根据权利要求5所述的方法，此处洗涤或冲洗滤饼的步骤涉及多达3倍于过滤容器体积的溶剂或水溶液缓冲液。
7．根据权利要求1到6中任何一项所述的方法，此处以纤维素为基础的助滤剂的浓度是高达大约2.0％(每单位上样混合物体积中重量或每单位上样混合物重量中重量)。
8．根据权利要求7中所述的方法，此处以纤维素为基础的助滤剂的浓度在大约0.5％到大约2.0％的范围间变化(每单位上样混合物体积中重量或每单位上样混合物重量中重量)。
9．根据权利要求1到8中任何一项所述的方法，此处生物分子混合物选自包括血，新鲜冻血浆，非新鲜冻血浆，冷上清或由此衍生的血浆组分，如中间物Cohn组分或Oncley组分，或其他血浆组分的目录中。
10．根据权利要求9中所述的方法，此处固相物质是选自包括白蛋白，免疫球蛋白，脂蛋白，优球蛋白，因子Ⅷ，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ或血的其他成分等等的目录中的血浆蛋白以沉淀的或复合的或凝集的形式或结合到不溶性载体例如，但不限于煅制二氧化硅上。
11．根据权利要求10所述的方法，此处以纤维素为基础的助滤剂有一个或多个以下特征：
Ⅰ)在过滤过程中促进上样混合物流过过滤筛网；
ⅱ)不在血浆衍生产品中产生高于BP,EP或USP标准的PKA水平
ⅲ)不会滤出在水平上高于BP,EP或USP标准的铝进入血浆衍生产品。
12．根据权利要求11所述的方法，此处以纤维素为基础的助滤剂选自包括DiacelTM150,DiacelTM200,ArbocelTM200或VitacelTM200等的目录中。
13．一种从血、新鲜冻血浆，非新鲜冻血浆，冷上清或其衍生的血浆组分，如中间物Cohn组分或Oncley组分，或其它血浆组成中分离固相物质的方法，此方法包括至少一个过滤步骤来回收上述固相物质，其中所述的使用的过滤步骤应用以纤维素为基础的助滤剂。
14．根据权利要求13所述的方法，此处固相物质是选自包括白蛋白，免疫球蛋白，脂蛋白，优球蛋白，因子Ⅷ，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ或血的其他成分等等的目录中的血浆蛋白以沉淀的或复合的或凝集的形式或结合到不溶性载体例如，但不限于煅制二氧化硅上。
15．根据权利要求13或14所述的方法，在此之前通过至少一个乙醇/乙酸沉淀或用煅制二氧化硅处理来生产固相物质。
16．一种分离的生物分子，根据权利要求1到15中任何一项所述的方法生产得到。
17．根据权利要求16所述的分离的生物分子，其特征还在于是人或动物治疗或预防处理用的蛋白。
18．根据权利要求16或17所述的分离的生物分子，来自血，新鲜冻血浆，非新鲜冻血浆、冷上清或其衍生的血浆组分，如中间物Cohn组分或Oncley组分，或其他血浆组分。
19．根据权利要求18所述的分离的生物分子，选自包含脂蛋白，优球蛋白，免疫球蛋白，因子Ⅷ，凝血酶原复合物，抗凝血酶Ⅲ，或白蛋白等等的目录中。
20．根据权利要求19所述的分离的生物分子，选自包括白蛋白，脂蛋白，免疫球蛋白或优球蛋白的目录中。
21．根据权利要求20所述的分离的生物分子，包括白蛋白。
22．根据权利要求21所述的分离的生物分子，其中在重量与重量(白蛋白/脂蛋白)比的基础上，此处脂蛋白水平低于大约3.0％。
23．根据权利要求16到22所述的分离的生物分子，此处在上述生物分子的制备物中，PKA和/或铝的水平是低的。
24．根据权利要求23所述的分离的生物分子，此处在上述生物分子的制备物中，PKA和/或PKA-C1酯酶和/或激肽释放酶和/或铝的水平低于BP,EP或USP最小标准。
25．根据权利要求24所述的分离的生物分子，此处在免疫球蛋白制备物中铝的水平低于50μg/L。
26．根据权利要求24所述的分离的生物分子，此处白蛋白制备物中铝的水平低于大约10μg/L。
27．根据权利要求24所述的分离的生物分子，此处白蛋白中PKA的水平低于5IU/ml。
28．根据权利要求24所述的分离的生物分子，此处白蛋白制备物中PKA-C1酯酶的水平低于10IU/ml。
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