CN110526982B

CN110526982B - 一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法

Info

Publication number: CN110526982B
Application number: CN201810498398.4A
Authority: CN
Inventors: 谷类燃; 罗天学; 荣艳珍
Original assignee: Xinlitai Chengdu Biotechnology Co ltd
Current assignee: Xinlitai Chengdu Biotechnology Co ltd
Priority date: 2018-05-23
Filing date: 2018-05-23
Publication date: 2023-08-01
Anticipated expiration: 2038-05-23
Also published as: CN110526982A

Abstract

本发明提供了一种人胰高血糖素样肽‑1(hGLP‑1)类似物融合蛋白(包括度拉鲁肽)的纯化方法，包括采用三步层析法进行纯化：所述样品先经粗纯步骤Protein A亲和层析，以有效去除HCP、内毒素等杂质且维持较高的目的蛋白收率；然后再使用阴离子交换层析和疏水层析来进一步精细纯化，以有效去除所述样品中的电荷异构体、残留的HCP和其它痕量杂质，并将各杂质含量控制在用药安全范围以内，且维持较高的目的蛋白收率和活性。本发明方法在分离纯化目的蛋白时具有良好的重现性和稳定性，适用于hGLP‑1类似物融合蛋白的下游纯化工艺线性放大以用于生产制备为治疗2型糖尿病或减肥药物。

Description

一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法

技术领域

本发明属于蛋白质分离纯化领域，具体涉及一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化新工艺。该工艺适用于规模化分离纯化GLP-1类似物融合蛋白及其在制备为治疗和/预防用蛋白质药物中的应用。

背景技术

人胰高血糖素样肽-1(human glucogan like peptide-l，hGLP-1)是由肠道L细胞合成和分泌的由37个氨基酸组成的多肽，hGLP-1具有刺激胰岛素分泌、促进葡萄糖吸收和血糖降低的作用；hGLP-1还可以降低胰高血糖素分泌，抑制胃排空，控制食欲，减轻体重和增加葡萄糖的利用；此外，hGLP-1还可促进胰岛β细胞再生和防止其凋亡，且hGLP-1发挥降血糖的作用受血糖水平的控制，当血糖浓度降低到某一阈值时，hGLP-1则无活性，因此可避免与hGLP-1治疗相关的低血糖发生并缓解肥胖所造成的胰岛素耐受。因此，hGLP-1在治疗胰岛素非依赖型糖尿病和减肥中发挥着巨大的潜能。然而，hGLP-1的活性形式hGLP(7-37)在体内易被一种二肽酰基肽酶Ⅳ(dipeptidyl-peptidaseⅣ，DPPⅣ)降解，使得hGLP-1(7-37)血清半衰期仅为3-5min，其新陈代谢的速率为13min左右。由于hGLP-1在体内易被快速清除和较短的半衰期，因此需要频繁、重复给药才能在较长时间内维持其血药浓度以达到满意的疗效，这极大限制了hGLP-1在临床中的应用。目前，主要通过对hGLP-1氨基酸位点的修饰、替换和连接大分子蛋白的方法来延长hGLP-1半衰期，具有代表性的hGLP-1类似物有重组hGLP-1-Fc融合蛋白Dulaglutide(杜拉鲁肽)、Liraglutide(利拉鲁肽)和albiglutide(阿必鲁泰)。

重组Fc融合蛋白通常采用哺乳动物细胞表达系统进行大规模生产制备，且该类融合蛋白在制备为临床治疗和/或预防药物时对其工艺质量要求高，须符合FDA或SFDA质量标准才能应用于人类疾病的防治中。由于哺乳动物细胞表达系统在表达目标重组融合蛋白过程中会产生宿主细胞蛋白(Host Cell Protein，HCP)、宿主细胞DNA、培养基添加物、内毒素、外来细胞因子和与目的蛋白相关副产物等，药用级重组融合蛋白在临床应用中须将这些杂质去除以符合药物质量标准，从而保证药物治疗的安全性和有效性，因此，开发有效地、可大规模分离纯化重组Fc融合蛋白是目前生物制药工艺所面临的重大挑战。

目前已开发了许多从收获哺乳动物细胞培养液中分离纯化hGLP-1类似物的方法，如采用粗纯步骤Protein A亲和层析和精纯步骤中的离子层析。Protein A亲和层析可特异性吸附重组Fc融合蛋白，而其它杂质较难与其结合，因此Protein A亲和层析可清除很大部分收获细胞培养液中的杂质，使重组Fc融合蛋白的纯度达到90％以上。但是由于亲和层析后的目的蛋白中仍含有残留的微量杂质，如HCP、宿主细胞DNA、内毒素、脱落的Protein A、培养基添加物和与目的蛋白相关杂质(如聚集体、电荷异构体等)，因此需要进一步采用精细纯化步骤将重组Fc融合蛋白中的痕量杂质去除到药用级质量标准范围内。

HCP是在生产表达抗体或重组蛋白过程中由CHO宿主细胞所产生的内源性蛋白，是工艺相关杂质中的关键杂质。由于HCP在药物的使用过程中会引起免疫原反应，从药物的安全性方面考虑，需要将HCP进行有效去除且将HCP含量降至标准范围之内，但是目前在重组hGLP-1类似物融合蛋白(rhGLP-1Fc融合蛋白)的分离纯化过程中很难将HCP含量降低到100ppm(或0.01％)以下；另外，由于重组GLP-1类似物融合蛋白是一种Fc融合蛋白，作为复杂的糖蛋白具有质量不均一的特点，即“异质性”。异质性可能来自于蛋白分子复杂的生物合成途径(如哺乳动物细胞系及细胞培养工艺对重组蛋白糖基化产生影响)，也可能来自于纯化工艺中产生的蛋白降解或聚集。这种异质性可以表现为分子大小差异，也可以表现为电荷差异。由于蛋白的异质性不仅会对最终药物产品的安全性产生影响，使病人产生免疫反应，甚至很会使患者对药物产生免疫耐受性，从而大大降低了药物的药效，而且蛋白的异质性还会影响重组蛋白药物的生物学活性、稳定性及保存期等，因此需将异质蛋白含量控制在标准范围(目的蛋白主峰含量≥70％)内；第三方面，现有的hGLP-1类似物融合蛋白纯化工艺不易进行线性放大，从而无法实现重组hGLP-1融合蛋白药物的规模化生产制备。

现有技术已知多种用于抗体或者蛋白纯化的方法，例如CN102257006A公开了一种用于从包括抗体和至少一种宿主细胞蛋白质(HCP)的样品混合物中产生宿主细胞蛋白质减少的抗体制剂的方法，所述方法包括：(a)对所述样品基质实施pH的减少，从而形成初步回收样品，其中所述pH的减少是约3-约4；(b)将所述初步回收样品调整至约6.0-约8的pH，随后使所述初步回收样品与亲和层析树脂接触，且收集亲和层析样品；(c)使所述亲和层析样品与离子交换树脂接触且收集离子交换样品；(d)使所述离子交换样品与疏水作用层析(HIC)树脂接触，且收集HIC样品，其中所述HIC样品包括所述HCP减少的抗体制剂。由于抗体的氨基酸组成不同导致理化性质差异明显，且各自的杂质差异性也较大，较难有较通用的抗体纯化方法，采用该纯化方法用于纯化hGLP-1类似物融合蛋白，较难达到理想的纯化效果。此外，该纯化方法采用的阴离子交换层析柱，如Q Sepharose^TM柱和HIC层析柱，如柱苯基Sepharose^TM柱，不利于hGLP-1类似物融合蛋白原液中的HCP和电荷异构体的去除，且不利于纯化工艺的放大。

由此可见，亟需开发一种高效且能够实现规模化分离纯化hGLP-1类似物融合蛋白的方法，以生产制备符合临床用药标准的高质量低成本的重组hGLP-1-Fc融合蛋白药物。

发明内容

鉴于现有技术存在的技术缺陷，本发明提供了一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法，即采用三步层析法对hGLP-1类似物融合蛋白样品进行纯化：所述样品先经粗纯步骤Protein A亲和层析，以有效去除HCP、内毒素等杂质且维持较高的目的蛋白收率；然后再使用阴离子交换层析和疏水层析来进一步精细纯化，以有效去除所述样品中的电荷异构体、残留的HCP和其它痕量杂质，并将各杂质含量控制在用药安全范围以内，以及维持较高的目的蛋白收率和活性。另一方面，本发明还提供了优选的层析填料和各层析步骤优化的洗脱条件等，不仅有利于hGLP-1类似物融合蛋白的下游纯化工艺线性放大以适应于生产制备为治疗2型糖尿病或减肥药物，而且本发明方法在分离纯化目的蛋白时具有良好的重复性和稳定性，可用于hGLP-1类似物融合蛋白规模化纯化工艺中。

本发明提供的一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法，包括以下步骤：

1)澄清过滤：将含有hGLP-1类似物融合蛋白的细胞培养收获液通过离心，滤膜或滤芯过滤、或深层过滤、以及任意二者的组合方法，以获得澄清过滤液；

2)三步层析法：经过Protein A亲和层析的粗提纯和由两步层析法组成的精细纯化去除步骤1)获得的澄清过滤液中的杂质，所述两步层析法包括阴离子交换层析和疏水层析；

3)过滤：通过去病毒过滤、超滤后换液和除菌过滤进一步去除步骤2)中目的蛋白中的杂质，以获得hGLP-1类似物融合蛋白原液。

所述步骤1)的澄清过滤是含有hGLP-1类似物融合蛋白细胞培养收获液经过离心，滤膜或滤芯过滤、或深层过滤、以及任意二者的组合方法，以获得澄清过滤液。

其中，所述的hGLP-1类似物融合蛋白是度拉鲁肽(dulaglutide)；所述的离心条件为3500g，7～12min，2～8℃；所述的滤膜过滤采用的是0.2μm滤膜，所述的滤芯过滤选用的是0.2μm孔径滤膜。

所述步骤1)的澄清过滤进一步优选为将含有hGLP-1类似物融合蛋白细胞培养收获液经过深层过滤和滤芯过滤，以获得澄清液。其中，所述的深层过滤方法选用的是Millipore公司D0HC和B1HC过滤膜两级深层过滤；所述的滤芯过滤选用的是0.2μm孔径滤膜。

由于含有hGLP-1类似物融合蛋白的细胞收获液中含有蛋白酶、宿主细胞碎片等杂质，影响所述融合蛋白的纯度和稳定性，因此需要先经过澄清过滤步骤使得细胞收获液变得澄清后才有利于后续目的蛋白的分离纯化。

所述步骤2)的三步层析法中，所述的粗提纯Protein A亲和层析的填料选自MabSelect SuRe、MabSelect SuRe LX、Eshmuno A、AF-rProtein A HC-650F、MabCapture^TMA、MabCapture^TMA Select中的一种，优选的，Protein A亲和层析的填料选自MabSelect SuRe或MabSelect SuRe LX。

通过所选用的Protein A亲和层析可以减少HCP与目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白之间的非共价结合力，从而有利于去除目的蛋白中HCP。

进一步优选发现层析填料MabSelect更适合hGLP-1类似物融合蛋白与杂质的分离纯化，具有比常规亲和介质至少高5倍以上的流速。通过大量的实验研究发现，采用MabSelect层析填料提高了填料对Fc融合蛋白的结合能力。

进一步优选发现Mabselect SuRe填料和Mabselect SuRe LX填料，虽与其他Mabselect填料含有相同的亲和基质，但是应用于hGLP-1类似物融合蛋白分离纯化过程中，使得洗脱条件更加均一温和；且能耐受高达0.5mol/L的NaOH进行在位清洗(cleaning-in-place，CIP)和消毒处理，从而提高了柱层析工艺的通用性和清洗效果，有利于延长介质的使用寿命，降低了产品受到内毒素污染和批间交叉污染的风险，更适用作为本发明hGLP-1类似物融合蛋白放大生产的改良型Protein A填料。

进一步，与MabSelectSuRe相比，MabSelect SuRe LX在稍长的停留时间(例如6～10min)下提供具有20～50％更高的动态结合载量，用0.5mol/L的NaOH进行CIP处理后具有更长的使用寿命，且脱落的Protein A配体很低。由此，MabSelect SuRe LX尤其适合作为hGLP-1类似物融合蛋白规模化生产工艺中Protein A亲和层析的填料。

进一步的优选方案为，所述步骤2)的Protein A亲和层析的粗提纯和由两步层析法组成的精细纯化中，所述的粗提纯Protein A亲和层析包括以下步骤：

a.平衡：平衡缓冲液“0.15mol/L NaCl，20mmol/L PB,pH7.2±0.2”平衡前述Protein A亲和层析柱；

b.上样：将上述步骤1)获得的澄清过滤液上样到上述步骤a平衡后的层析柱中，所述的层析柱的上样载量≤25mg/ml，并保证二者接触时间不低于6min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.冲洗：分别使用中间冲洗液和冲洗液2进行冲洗杂质；

d.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

所述步骤c中中间冲洗液可以选用高盐缓冲液或含有蛋白变性剂的Tris缓冲液进行冲洗，其中，所述的高盐缓冲液为“1.0mol/L NaCl，20mmol/L PB，pH7.2±0.2”，适合于hGLP-1类似物融合蛋白纯化工艺，用于去除目的蛋白样品中的HCP；所述的含有蛋白变性剂的Tris缓冲液pH为8.5～9.0，所述的蛋白变性剂选自盐酸胍、尿素中的一种，优选的蛋白变性剂是盐酸胍，可同时保证良好的HCP去除效果和获得较高的目的蛋白收率；所述的蛋白变性剂的浓度为1.5～2.5mol/L。

所述的含有蛋白变性剂的Tris缓冲液适用于hGLP-1类似物融合蛋白大规模纯化工艺中，较所述的高盐缓冲液可以更有效去除目的蛋白样品中HCP含量，提高蛋白原液对HCP的质控标准。

所述步骤c中冲洗液2包括上述步骤a的平衡缓冲液或低盐缓冲液，其中低盐缓冲液可以选自不含NaCl的低盐缓冲液“10mmol/L PB，pH7.2±0.2”。

所述步骤d中的洗脱缓冲液选自醋酸或柠檬酸盐，pH＜3.5，进一步，所述的醋酸浓度为0.1mol/L，pH值为2.5～3.0，可以彻底洗脱目的蛋白，且洗脱速度快，有利于节约hGLP-1类似物融合蛋白的纯化工艺时间和提高其收率；所述的柠檬酸盐浓度为50mmol/L，pH值3.0～3.5，可洗脱目的蛋白。当所述洗脱缓冲液pH不低于3.5时，hGLP-1类似物融合蛋白不能被完全洗脱，且洗脱峰拖尾严重；当所述洗脱缓冲液pH＜2.5时，可能会造成所述融合蛋白变性失活。

所述步骤2)的Protein A亲和层析粗提可以从步骤1)得到的澄清过滤液中直接捕获目的蛋白hGLP-1类似物融合物，并且可以去除大量HCP(去除率为90％以上)和内毒素等杂质。但是目的蛋白中含有较多的hGLP-1类似物融合蛋白的电荷异构体，因此需要进行精细纯化。

所述步骤2)中由两步层析法组成的精细纯化包括阴离子交换层析和疏水层析。

所述的阴离子交换层析可通过采用阴离子交换层析的结合和洗脱方式来分离纯化目的蛋白，优选的强阴离子交换树脂是Poros 50HQ、Poros XQ、GE Qhp、GE Capto Q、GECapto Q ImpRes中的一种，更优选的阴离子交换层析填料是Poros 50HQ或GE Qhp，最优选的阴离子交换层析填料是Poros 50HQ。当所述的阴离子交换层析填料所处的缓冲体系pH＞6时，优选所述缓冲体系pH 6.6±0.2，易于所述目的蛋白与所述的阴离子交换层析填料实现高效的结合。

通过大量的实验选择发现，当选用其他填料如Q Sepharose Fast Flow作为阴离子交换层析填料，采用NaCl性盐浓度梯度进行洗脱时，只有一个洗脱峰，无法将目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白与其电荷异构体有效分离。

另一方面，所述的阴离子交换层析需要通过提高缓冲体系的离子强度或改变pH值来实现目的蛋白的洗脱。进一步，所述的阴离子交换层析通过提高缓冲体系的离子强度进行洗脱，具体为NaCl线性盐浓度梯度洗脱，所述的洗脱方式为阶段洗脱，可保证在第一阶段洗脱时主要去除hGLP-1类似物融合蛋白电荷异构体和进一步去除HCP，第二阶段洗脱可得到99％高纯度的目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白单体；当选用0～1mol/L NaCl进行线性盐浓度梯度洗脱时，会出现多个连续为完全分离峰，无法将目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白单体与其电荷异构体进行有效的分离。当所述NaCl线性梯度洗脱浓度为0～500mmol/L，可提高未完全分离峰的分辨率，优选的NaCl洗脱浓度为50～150mmol/L，进一步，所述第一阶段的NaCl洗脱浓度为50～100mmol/L，优选70～100mmol/L，以保证碱性峰可在50～100mmol/L NaCl处被洗脱出来；所述的第二阶段的NaCl洗脱浓度为100～150mmol/L，优选110～150mmol/L，可保证目的蛋白主峰约在100～150mmol/L NaCl处被洗脱出来，而酸性峰则可在150mmol/L NaCl之后被洗脱出来。

所述的分阶段的不同NaCl洗脱浓度可提高阴离子交换层析对hGLP-1类似物融合蛋白电荷异构体的分辨率，不仅可以依次分离出碱性峰、目的蛋白主峰和酸性峰，还可以增加主峰含量和减少电荷异构体酸碱峰的含量，并且可有效去除hGLP-1类似物融合蛋白聚合物，达到目的蛋白原液质量标准。

所述的阴离子交换层析的步骤包括以下步骤：

a.平衡：使用平衡缓冲液“20mmol/L PB，pH6.6±0.2”平衡所述的阴离子交换层析填料；

b.上样：将经过上述Protein A亲和层析分离纯化得到的hGLP-1类似物融合蛋白样品上样，上样载量≤15mg/ml，保证样品与填料接触时间不低于6min；用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.阶段洗脱：

第一阶段：洗脱液“20mmol/L PB，50～100mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”洗脱杂质，优选的洗脱液为20mmol/L PB，70～100mmol/L NaCl，pH6.6±0.2；

第二阶段：洗脱液“20mmol/L PB，100～150mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”洗脱目的蛋白，收集洗脱峰，优选的洗脱液为20mmol/L PB，110～150mmol/L NaCl，pH6.6±0.2；

d.再生和清洗：用“20mmol/L PB，1mol/L NaCl，pH6.6±0.2”再生和“0.5mol/LNaOH”进行清洗阴离子交换层析柱。

所述步骤2)中精细纯化还包括疏水层析，所述的疏水层析填料选自Toyopealphenyl 650M、GE phenyl high sub、GE phenyl hp、GE butyl中的一种，优选的疏水层析填料为Toyopealphenyl 650M。当选用GE Phenyl作为疏水层析填料时，目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白与其结合太牢不易被洗脱，且会出现洗脱峰拖尾的情况；当选用GE Octyl作为疏水层析填料时，目的蛋白与其结合力较弱，冲洗速率慢，洗脱峰拖尾严重且无明显分离；而所述的疏水层析填料Toyopealphenyl 650M与目的蛋白结合能力介于上述两种疏水层析填料之间，适用于hGLP-1类似物融合蛋白进一步的精细纯化。

所述的疏水层析包括以下步骤：

a.上样样品制备：在经上述步骤2)中阴离子交换层析分离得到的hGLP-1类似物融合蛋白样品溶液中加入(NH₄)₂SO₄溶液；

b.平衡：使用含有(NH₄)₂SO₄的平衡缓冲液平衡所述的疏水层析填料；

c.上样：将上述步骤a制备的上样样品上样到经上述步骤b平衡的疏水层析柱中，上样载量≤15mg/ml，并保证上样样品与所述疏水层析填料的接触时间不低于5min，用步骤b的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

d.洗脱：用洗脱液洗脱，收集洗脱峰。

上述步骤a中所述的(NH₄)₂SO₄浓度不超过0.5mol/L。当(NH₄)₂SO₄浓度超过0.5mol/L时，hGLP-1类似物融合蛋白逐渐沉淀析出，因此所述上样样品中(NH₄)₂SO₄浓度不超过0.5mol/L；

上述步骤b中所述的平衡缓冲液选自PB、L-组氨酸、Tris-HCl中的一种，优选的平衡缓冲液为PB，所述的L-组氨酸和Tris-HCl的浓度分别为10～50mmol/L；所述的PB浓度为20mmol/L，pH7.0±0.2；所述的(NH₄)₂SO₄浓度在前述平衡缓冲液中的浓度不超过0.5mol/L。当(NH₄)₂SO₄浓度小于0.3mol/L，所述上样样品与所述疏水层析填料结合能力减弱，有可能被所述的平衡缓冲液冲洗出来，降低了目的蛋白收率。因此，结合目的蛋白hGLP-1类似融合蛋白在(NH₄)₂SO₄溶液中的溶解性，及其与所述的疏水层析填料的结合特点，优选的所述(NH₄)₂SO₄浓度为0.3～0.5mol/L，更优选的(NH₄)₂SO₄浓度为0.4mol/L。

上述步骤d中所述的洗脱液选自PB、L-组氨酸、Tris-HCl中的一种，优选的平衡液为PB；所述的L-组氨酸和Tris-HCl的浓度分别为30～50mmol/L；所述的PB浓度为＜100mmol/L，pH7.0±0.2，优选的所述的PB浓度为10～50mmol/L。当上样样品结合到所述疏水层析填料后，采用盐浓度阶段洗脱的方式，即先用洗脱液“100mmol/LPB，pH7.0±0.2”洗脱时，可洗脱出部分目的蛋白，但洗脱峰拖尾严重；然后用洗脱液“10mmol/L PB，pH7.0±0.2”洗脱时，可完全洗脱下目的蛋白，且水洗出峰很小。而采用一步洗脱的方式，即直接使用洗脱液“10～50mmol/L PB，pH7.0±0.2”可完全洗脱下目的蛋白。

通过上述步骤2)中所述的疏水层析填料的筛选、以及(NH₄)₂SO₄浓度和洗脱条件的优化，可进一步提高重组GLP-1类似物融合蛋白单体的含量(99.8％)，以及降低总聚合体的含量(0.2％)。

所述步骤2)还可以包括低pH缓冲液洗脱，所述的低pH缓冲液洗脱是低pH孵育灭活，所述的低pH孵育灭活在Protein A亲和层析之后，可以破坏hGLP-1类似物融合蛋白样品中病毒粒子的囊膜结构，使病毒失去感染活性，从而达到有效去除目的蛋白样品中的病毒，同时由于Fc融合蛋白一般具有较强的pH耐受能力，因此短期的低pH处理通常不会造成融合蛋白性质发生明显改变。

所述低pH孵育灭活包括以下步骤：

a.调节pH值：用1mol/L醋酸或枸橼酸调节上述步骤2)Protein A亲和层析分离纯化的目的蛋白样品pH值至3.6±0.1；

b.孵育：20～25℃孵育1～1.5h；

c.中和：用1mol/L Tris调节目的蛋白样品pH至6.8±0.2；

上述步骤3)中所述的病毒过滤选择纳米膜过滤，所述纳米膜过滤采用的纳米膜滤器选自MilliporeViresolove Pro、HF、Asahi-Kasei Planova 20N、Asahi-KaseiBioEX，优选的纳米膜滤器Millipore公司的Viresolove Pro和A1HC系列滤器。

所述的超滤采用的超滤膜为截留分子量为10～30kD的超滤膜，所述超滤膜选自MerckMillipore Biomax、Sartorius PESU、Sartorius Hydrosart中的一种，优选的超滤膜为Hydrosart系列超滤膜包(Hydrosart ultrafiltration cassette)，可保证目的蛋白被有效截留；所述的换液选用枸橼酸缓冲液，pH6.5±0.2；所述的换液模式可以选用恒定体积换液或等体积批次换液，进一步，所述的恒定体积换液不低于6倍换液前目的蛋白样品体积；所述的等体积批次换液，其换液次数不低于6次。经所述的超滤浓缩换液所得到的目的蛋白浓度不低于6mg/ml。

所述的除菌过滤选择0.2μm孔径滤膜过滤。

本发明还提供了一种通过上述纯化方法分离纯化得到的hGLP-1类似物融合蛋白在制备为治疗和/或预防2型糖尿病和/或肥胖症的药物中的用途。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及有益效果：

1、提供了一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法，通过采用Protein A亲和层析、阴离子离子交换层析和疏水层析三步层析法进行纯化，以及通过对各层析填料筛选及洗脱条件进行一系列优化，不仅可有效去除目的蛋白中HCP(含量＜0.01％)和电荷异构体的组分，而且可以将其它相关杂质(如内毒素、残留的宿主细胞DNA、亲和层析填料脱落的Protein A蛋白等)的残留量有效地控制在安全范围内；

2、提供了一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法，通过对三步层析法的各层析填料筛选及洗脱条件进行一系列优化，分离纯化得到的目的蛋白总收率高且具有良好的生物学活性；

3、提供了一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法，方法适用性强，具有良好的重复性和稳定性，可用于hGLP-1类似物融合蛋白规模化纯化工艺中；

4、提供了一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法，有利于hGLP-1类似物融合蛋白的下游纯化工艺线性放大以适应于规模化生产制备为治疗和/或预防2型糖尿病和/或肥胖症的药物。

附图说明

图1为Protein A亲和层析选用MabSelect SuRe作为填料和“0.1mol/L醋酸，pH2.5～3.0”作为洗脱缓冲液时的层析图；

图2为阴离子层析选用填料Poros 50HQ和0～0.5mol/L NaCl线性梯度洗脱方式的层析图；

图3为阴离子交换层析选用Poros 50HQ作为填料进行阶段洗脱的层析图，所述的阶段洗脱为：第一阶段的洗脱液是“20mmol/L PB，70mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”，第二阶段的洗脱液是“20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”；

图4为疏水层析选用填料Toyopearl Phenyl-650M和含有0.5mol/L的(NH₄)₂SO₄缓冲液的层析图；

图5为疏水层析结合条件优化的层析图，优化条件为：填料Toyopearl Phenyl-650M，平衡缓冲液为“20mmol/L PB,0.4mol/L(NH₄)₂SO₄，pH7.0±0.2”；

图6为疏水层析洗脱条件优化的层析图，优化条件为：填料Toyopearl Phenyl-650M，平衡缓冲液为“40mmol/L PB，pH7.0±0.2”；

图7为Protein A亲和层析采用两步洗脱方式(洗脱液1：20mmol/L枸橼酸，pH3.5；洗脱液2：0.1mol/L醋酸，pH2.5～3.0)的层析图；

图8为阴离子交换层析选用填料Q Sepharose Fast Flow和0～1.0mol/L NaCl线性梯度洗脱方式的层析图；

图9为阴离子交换层析采用填料Poros 50HQ和0～1.0mol/L NaCl线性梯度洗脱方式的层析图；

图10为疏水层析选用填料GE Phenyl的层析图；

图11为疏水层析选用填料GE Octyl的层析图；

图12为疏水层析选用填料Toyopearl Phenyl-650M和“20mmol/L PB,0.3mol/L(NH₄)₂SO₄”作为平衡缓冲液时的层析图；

图13为疏水层析选用填料Toyopearl Phenyl-650M和采用阶段洗脱方式的层析图。

具体实施方式

下面结合实施例和附图对本发明作进一步详细的描述，但发明的实施方式不限于此。

实施例中hGLP-1类似物融合蛋白的表达和制备采用专利文献CN1802386B第【0090】-【0118】段中所述方法。

实施例1.一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

1、澄清过滤细胞培养收获液

(1)对于0～5L的细胞培养收获液可采用离心方法去除细胞及碎片等大颗粒不溶物，然后采用0.22μm滤膜过滤，以获得含有hGLP-1类似物融合蛋白的澄清过滤液。离心操作的条件为：3500g，7-12min，2～8℃。

(2)对于50L和250L的细胞培养收获液可采用Millipore公司的D0HC与B1HC两级串联方式进行深层过滤和0.2μm滤芯过滤后得到澄清过滤液。

2、Protein A亲和层析的粗提纯

将上述步骤1获得的澄清过滤液进行Protein A亲和层析的粗提纯，Protein A亲和层析的步骤如下：

a.平衡缓冲液平衡Protein A亲和层析柱；

b.上样：将实施例1获得的澄清过滤液上样到上述步骤a平衡后的层析柱中，上样载量为15mg/ml，并保证二者接触时间不低于6min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.冲洗：分别使用中间冲洗液和冲洗液2冲洗杂质；

d.洗脱：用洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

Protein A亲和层析各步骤所涉及的参数和/或条件如表1所示。

表1.Protein A亲和层析各步骤的参数和/或条件

去除HCP效果方面，在Protein A亲和层析中，使用“1.0mol/L NaCl，20mmol/L PB,pH7.2±0.2”作为中间冲洗液可有效去除澄清过滤液中的HCP达95％以上。

目的蛋白收率方面，实验结果如图1所示，当使用洗脱缓冲液“0.1mol/L HAc，pH2.5～3.0”，可以彻底洗脱目的蛋白，且洗脱速度快，有利于节约hGLP-1类似物融合蛋白的纯化工艺时间和提高其收率；当使用洗脱缓冲液“50mmol/L柠檬酸盐，pH3.0或3.5”，基本能洗脱下目的蛋白。

3、低pH孵育灭活病毒

将上述步骤2经Protein A亲和层析分离纯化的hGLP-1类似物融合蛋白样品进行低pH孵育灭活病毒，具体步骤如下：

a.调节pH值：用1mol/L HAc或枸橼酸调节样品pH值为3.6±0.1；

b.孵育：20～25℃孵育1～1.5h；

c.中和：用1mol/L Tris调节样品pH至6.8±0.2。

4、精细纯化

(1)阴离子交换层析：

将上述步骤3经低pH孵育灭活后的融合蛋白样品进行精细纯化，其中阴离子交换层析的具体步骤如下：

a.平衡：使用平衡缓冲液“20mmol/LPB，pH6.6±0.2”平衡阴离子交换层析填料Poros 50HQ；

b.上样：将上述步骤3分离纯化的融合蛋白样品上样，上样载量为10mg/ml，保证样品与填料接触时间不低于6min，并用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.阶段洗脱：

第一阶段：洗脱液“20mmol/L PB，70mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”洗脱杂质；

第二阶段：洗脱液“20mmol/L PB，150mmol/L NaCl，pH6.6±0.2”洗脱目的蛋白，收集洗脱峰；

阴离子交换层析填料Poros 50HQ可提高目的蛋白主峰含量，减少电荷异构体组分含量。如图2所示，维持缓冲体系pH6.6不变，采用0～0.5mol/L NaCl进行线性盐浓度梯度洗脱时，未完全分离峰的分辨率提高，并且碱性峰可在0.05～0.1mol/L NaCl处被洗脱出来，目的蛋白主峰约在0.1～0.15mol/L NaCl处被洗脱出来，酸性峰则在0.15mol/L NaCl之后被洗脱出来；进一步，如图3所示，维持缓冲体系不变，采用阶段洗脱的方法可显著提高阴离子交换层析对hGLP-1类似物融合蛋白电荷异构体的分辨率，不仅可以依次分离出碱性峰、主峰和酸性峰，增加主峰含量(约为89％)和减少电荷异构体酸碱峰的含量(其中，酸性峰降至10％左右)，而且还可以有效去除hGLP-1类似物融合蛋白聚合物。

(2)疏水层析：

a.上样样品制备：在经上述步骤(1)阴离子交换层析分离得到的hGLP-1类似物融合蛋白样品溶液中加入“20mmol/L Tris+3.5mol/L”(NH₄)₂SO₄溶液制备为上样样品，上样样品中(NH₄)₂SO₄的浓度为0.4或0.5mol/L；

b.平衡：使用“20mmol/L PB，0.4mol/L(NH₄)₂SO₄，pH7.0±0.2”平衡缓冲液平衡疏水层析填料Toyopearl Phenyl-650M；

c.上样：将上述步骤a制备的上样样品上样到经上述步骤b平衡的疏水层析柱中，上样载量为10mg/ml，并保证上样样品与所述疏水层析填料的接触时间不低于5min，用步骤b的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

d.洗脱：用洗脱液“40mmol/L PB，pH7.0±0.2”进行洗脱，收集洗脱峰。

如图4所示，当步骤a上样样品中(NH₄)₂SO₄为0.5mol/L时，疏水层析填料ToyopearlPhenyl-650M可以与目的蛋白有效的结合，二者的结合力既不会太牢也不会太弱。

如图5所示，当步骤b的平衡液中含有0.4mol/L(NH₄)₂SO₄时，可保证hGLP-1类似物融合蛋白与所述疏水层析填料的结合力，同时可使目的蛋白与杂质有效分离，以达到进一步降低总聚合体含量至0.2％和提高目的蛋白单体含量(99.8％)的目的。

如图6所示，当步骤d的洗脱液直接选用“40mmol/L PB，pH7.0±0.2”缓冲体系一次性洗脱目的蛋白时，可将目的蛋白全部洗脱下来，保证了目的蛋白收率和高纯度。

5、通过过滤制备为目的蛋白原液

(1)纳米膜过滤去除病毒

使用Millipore公司的20nm孔径的Viresolve Pro纳米膜滤器对上述步骤4分离纯化的hGLP-1类似物融合蛋白样品进行除病毒的纳米过滤，其中，预滤器为A1HC系列深层滤器(Millipore公司)；过滤压力：20～30psi。

(2)超滤

a.使用截留分子量为10～30kD的超滤膜Hydrosart系列超滤膜包(Hydrosartultrafiltration cassette，Sartorius公司)对上述步骤(1)病毒过滤处理后的hGLP-1类似物融合蛋白样品进行超滤浓缩；

b.透滤换液：使用“10mmol/L枸橼酸-枸橼酸钠、pH6.5±0.2”对上述步骤a中得到的目的蛋白超滤液进行恒定体积换液或等体积批次换液，其中恒定体积换液应不低于6倍换液前样品体积；等体积批次换液次数应不低于6次。

超滤后目的蛋白浓度应不低于6mg/ml。

(3)除菌过滤

使用0.2μm孔径的滤膜对上述步骤(2)超滤浓缩得到的蛋白液进行过滤除菌，并无菌分钟，制备为目的蛋白原液。

实施例2一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

1、澄清过滤细胞培养收获液

同实施例1步骤1(1)；

2、Protein A亲和层析的粗提纯

步骤同实施例1步骤2，具体步骤参数详见表2；

3、低pH孵育灭活病毒

同实施例1步骤3；

4、精细纯化

步骤同实施例1步骤4，具体步骤参数详见表2；

5、通过过滤制备为目的蛋白原液

同实施例1步骤5。

表2粗提纯和精细纯化层析方法、步骤及参数条件

使用该实施例纯化方法，同样能将目的蛋白中HCP含量降至100ppm以下，可有效去除电荷异构体及其它痕量杂质。

实施例3一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

1、澄清过滤细胞培养收获液

同实施例1步骤1(1)；

2、Protein A亲和层析的粗提纯

步骤同实施例1步骤2，具体步骤参数详见表3；

3、低pH孵育灭活病毒

同实施例1步骤3；

4、精细纯化

步骤同实施例1步骤4，具体步骤参数详见表3；

5、通过过滤制备为目的蛋白原液

同实施例1步骤5。

表3粗提纯和精细纯化层析方法、步骤及参数条件

使用该实施例纯化方法，同样能将目的蛋白中HCP含量降至100ppm以下，可有效去除电荷异构体及其它衡量杂质。

实施例4一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

1、澄清过滤细胞培养收获液

同实施例1步骤1(1)；

2、Protein A亲和层析的粗提纯

步骤同实施例1步骤2，具体步骤参数详见表4；

3、低pH孵育灭活病毒

同实施例1步骤3；

4、精细纯化

步骤同实施例1步骤4，具体步骤参数详见表4；

5、通过过滤制备为目的蛋白原液

同实施例1步骤5。

表4粗提纯和精细纯化层析方法、步骤及参数条件

实施例5.一种hGLP-1类似物融合蛋白纯化方法稳定性和重现性的研究采用实施例1所述的纯化方法对3批50L工艺生产得到的细胞培养收获液进行hGLP-1类似物融合蛋白分离纯化并得到目的蛋白原液(批号分别为Y20150305、Y20160601、Y20160602)，并对对三批原液进行质量检测和统计蛋白总收率(结果如表5所示)。从表5可看出，三批50L工艺生产制备得到的蛋白样品经上述方法分离纯化后所得到的原液质量检测结果相近，具有良好的批间一致性。由此可见，本发明纯化工艺在制备hGLP-1类似物融合蛋白原液时具有良好的稳定性和重现性。

表5.三批50L工艺分离纯化得到的原液主要质量检测结果

实施例6.一种hGLP-1类似物融合蛋白纯化方法的规模化工艺对主要杂质去除的研究

6.1规模化工艺步骤

1、澄清过滤细胞培养收获液

同实施例1步骤1(2)。

2、Protein A亲和层析的粗提纯

(1)规模化工艺中Protein A亲和层析参数及步骤：如表6所示。

表6.规模化工艺中Protein A亲和层析参数及步骤

(2)规模化工艺的Protein A亲和层析中间冲洗条件对HCP去除效果的研究

由于中试工艺制备得到的目的蛋白原液中HCP残留量约0.02％左右(如表5所示)，因此在规模化工艺中对protein A亲和层析工艺进行优化，以实现在粗提纯时即可显著降低HCP残留量，再通过精细纯化进一步将HCP残留量去除至0.01％以下。在规模化工艺的Protein A亲和层析中，三种不同中间冲洗条件的去除效果如表7所示，当使用“50mmol/LTris+2mol/L GuHcl,pH8.5”或“25mmol/L Tris+2mol/L尿素，pH9.0”作为中间洗脱液较小试和中试工艺中的亲和层析中间冲洗液更能有效的去除HCP；其次，当中间冲洗液含有尿素或盐酸胍时，都具有良好的去除HCP作用，但是当中间缓冲液含有盐酸胍时还可维持较高的目的蛋白收率。

表7.规模化工艺的Protein A亲和层析中间冲洗条件对HCP的去除效果

中间冲洗条件	蛋白收率(％)	HCP含量(％)
			20mmol/L PB+1mol/L NaCl pH7.0(作为对照)	100	1.2647
25mmol/L Tris+2mol/L Urea，pH9.0	58.65	0.1203
			50mmol/L Tris+2mol/L GuHCl，pH8.5	96.08	0.2055

3、低pH孵育灭活病毒

同实施例1步骤3。

4、精细纯化

同实施例1步骤4。

5、通过过滤制备为目的蛋白原液

同实施例1步骤5。

6主要杂质去除效果的研究

采用上述方法对3批规模化工艺生产得到的细胞培养收获液进行hGLP-1类似物融合蛋白分离纯化并得到目的蛋白原液(批号分别为Y20170303、Y20170304、Y20170405)，并检测上述规模化纯化方法对主要杂质(HCP、电荷异构体、聚合体、宿主细胞DNA、脱落的Protein A和内毒素)的去除效果。

(1)HCP的去除：

如表8所示，尽管上述步骤2Protein A亲和层析可以去除90％以上的HCP，但是仍然不符合目的蛋白原液对HCP残留量的标准(≤0.010％或100ppm)，而通过上述步骤4精细纯化中的阴离子交换层析则可显著降低蛋白样品中的HCP，经过此两步层析后三批中间样品的HCP均降低至0.01％以下，进一步，三批规模化纯化工艺最终制备得到的原液中HCP的残留量均低于0.008％，符合原液对HCP残留量的质量标准，表明上述规模化纯化工艺对hGLP-1类似物融合蛋白样品的HCP去除效果十分有效。

表8.三批规模化工艺每一个纯化步骤过程中HCP去除效果

(2)电荷异构体的去除：

对上述3批规模化纯化过程的中间样品进行取样，使用毛细管区带电泳法(CZE)检测样品纯度，检测结果如表9所示，上述步骤4中的阴离子交换层析可使主峰百分比提高到85％以上，酸性峰降至10％左右，表明本发明纯化方法中的阴离子交换层析可有效去除酸性蛋白峰，对碱性蛋白峰也有一定的去除效果，以及整个纯化工艺可以使分离纯化得到的目的蛋白原液中的电荷异构体符合原液的质量标准(主峰≥70.0％)。

表9.1三批规模化工艺纯化过程中CZE纯度检测结果

(3)聚合体的去除：

对上述3批规模化纯化过程的中间样品进行取样，使用SEC-HPLC(尺寸排阻-高效液相色谱)法检测样品纯度，检测结果如表10所示，经过上述步骤2的Protein A亲和层析后，三批hGLP-1类似物融合蛋白样品的单体纯度已达到95％以上，聚合体低于3％；经过上述步骤4的疏水层析后，三批中间样品的单体纯度均高于99.5％、聚合体小于0.5％。表明，本发明三步层析法(亲和层析、阴离子交换层析和疏水层析)可有效去除目的蛋白hGLP-1类似物融合蛋白样品中的聚合体，使得目的蛋白单体的纯度高达99.8％，符合蛋白原液的质量标准。

表10.三批规模化工艺纯化过程中SEC-HPLC纯度检测结果

(4)其它杂质的去除：

对上述3批规模化纯化工艺制备得到的hGLP-1类似物融合蛋白原液检测宿主细胞DNA、亲和填料脱落的Protein A蛋白和内毒素含量，检测结果如表11所示，三批原液中宿主细胞DNA含量均小于0.01％，亲和填料脱落的Protein A蛋白含量(＜0.00001％)和内毒素含量(＜2.5EU/ml)均控制在安全范围之内。

由此可见，表明本发明的纯化方法不仅可以获得较高的目的蛋白收率(45％)和蛋白纯度(≥99.5％)，而且可有效去除HCP(＜80ppm)、电荷异构体(＜30％)、聚合体(0.2％)和其它杂质(如宿主细胞DNA含量＜0.01％、亲和填料脱落的Protein A蛋白含量＜0.00001％和内毒素含量＜2.5EU/ml)。

表11.三批规模化纯化工艺制备的原液中其它杂质的去除效果

杂质类型	Y20170303	Y20170304	Y20170405
				宿主细胞DNA	＜0.01％	＜0.01％	＜0.01％
亲和填料脱落的Protein A蛋白	＜0.00001％	＜0.00001％	＜0.00001％
				内毒素(EU/ml)	＜2.5	＜2.5	＜2.5

对比实施例1.Protein A亲和层析选用不同条件对纯化效果的影响

1、0-50L不同的Protein A亲和层析洗脱条件对目的蛋白洗脱的影响

(1)填料：同实施例1步骤2的Protein A亲和层析填料；

(2)步骤：

平衡、上样、冲洗的步骤同实施例步骤2中a-c；洗脱条件和目的蛋白洗脱情况如表12所示。当采用编号1的两步洗脱时，目的蛋白与填料Mabselect SuRe结合较牢，在pH3.5时不能被完全洗脱，洗脱峰拖尾严重，在更低的pH条件下(0.1mol/L HAc，pH2.5～3.0)洗脱峰很高，实验结果如图7所示；当采用编号2-4的洗脱条件时，均无法高效的洗脱出目的蛋白。

表12.不同的Protein A亲和层析洗脱条件对目的蛋白洗脱的影响

2、规模化纯化工艺中Protein A亲和层析不同的中间冲洗条件对HCP去除效果的影响

Protein A亲和层析的步骤：

a.平衡缓冲液“0.15mol/L NaCl，20mmol/L PB,pH7.2±0.2”平衡填料MabselectSuRe LX；

b.上样：保证样品与填料接触时间不低于6min，用平衡缓冲液冲洗去除未结合物；所述的样品是hGLP-1类似物融合蛋白细胞培养收获液经过深层过滤后的上清。

c.冲洗：

中间冲洗液：按照表14中不同的中间冲洗液进行冲洗；

冲洗液2：用平衡缓冲液冲洗；

d.洗脱：用洗脱液“0.1mol/L醋酸，pH2.5～3.0”进行洗脱。

从表13中可以看出，当中间冲洗液中含有NaCl时，HCP的去除效果最差；当中间冲洗液中含有异丙醇时，HCP去除效果较好，但是目的蛋白收率低；尽管编号3和4中的尿素可以去除HCP，但是HCP的去除效果不及实施例3步骤2的Protein A亲和层析中间冲洗液的去除效果。由此看来，实施例3步骤2的Protein A亲和层析中间冲洗液对HCP的去除效果良好，同时可维持较高的蛋白收率。

表13.Protein A亲和层析不同的中间冲洗液对HCP的去除效果

编号	中间冲洗液	蛋白收率(％)	HCP含量(％)
				1	20mmol/L PB+1mol/L NaCl pH7.0(作为对照)	100	1.2647
2	25mmol/LTris+2mol/L Urea+10％异丙醇，pH9.0	44.82	0.5703
				3	50mmol/L枸橼酸+1mol/L Urea，pH4.4	107.43	0.8545
4	20mmol/LPB+2mol/L Urea pH7.4	95.71	0.9092
				5	深层过滤上清	/	38.7250

对比实施例2.阴离子交换层析选用不同的参数条件对纯化效果的影响

阴离子交换层析的步骤：

a.平衡：使用实施例1步骤4阴离子交换层析中平衡缓冲液分别平衡表15中的填料；

b.上样：方法同实施例1步骤4阴离子交换层析中的上样步骤；

c.洗脱：按照表14不同的洗脱条件进行线性盐浓度梯度洗脱目的蛋白；

d.再生和清洗：方法同实施例1步骤4阴离子交换层析中的再生和清洗步骤。

选用不同的阴离子交换层析填料和洗脱条件，表14的结果表明：capto系列的填料通过线性梯度分步洗脱的方式不适用于hGLP-1类似物融合蛋白样品中电荷异构体的分离去除；当选用QFF作为阴离子交换层析填料时，蛋白样品在pH＞6情况下可与QFF结合，但是维持缓冲体系pH不变，采用0～1.0mol/L NaCl线性盐浓度梯度洗脱时，结果如表14和图8所示，只有一个洗脱峰，未分离出电荷异构体的酸性峰和碱性峰；当选用Poros 50HQ作为阴离子交换层析填料，采用0～1.0mol/L NaCl盐浓度的梯度洗脱的方式，结果如表14和图9所示，此盐浓度的梯度洗脱出现多个连续未完全分离的峰，表明使用Poros 50HQ作为阴离子交换层析填料可提高对电荷异构体的分离能力，但是此洗脱条件的洗脱能力不如实施例1步骤4的阴离子交换层析所采用的线性梯度和分步洗脱方式(图2和图3)，因此不利于工艺放大。由此可见，0～1.0mol/L NaCl线性梯度洗脱的方式不能有效地分离出电荷异构体的酸碱峰。

表14.阴离子交换层析选用不同参数和洗脱条件对分离纯化目的蛋白的影响

对比实施例3.疏水层析选用不同的参数条件对纯化效果的影响

(1)不同疏水层析填料对目的蛋白结合力的影响

对不同的疏水层析填料对目的蛋白的结合力影响进行考察，如表15所示，当使用GE Phenyl作为疏水层析填料时，目的蛋白与此填料结合力太强，即使用不含(NH₄)₂SO₄的缓冲液进行洗脱，洗脱峰也拖尾(如图10)；当缓冲液中含有0.5mol/L的(NH₄)₂SO₄时，目的蛋白与填料GE Octyl结合较弱，平衡液冲洗体积较大时目的蛋白可被缓慢冲洗下来，但是进行(NH₄)₂SO4浓度梯度洗脱时，洗脱峰拖尾严重且无明显分离(如图11)。

表15.不同疏水层析填料对目的蛋白结合力的影响

(2)不同疏水层析平衡条件对分离纯化目的蛋白的影响

当平衡缓冲液“20mmol/L PB，pH7.0±0.2”中含有0.3mol/L的(NH4)₂SO₄时，如果上样量较大，结果如图12所示，会有穿透峰出现，表明目的蛋白与填料Toyopearl Phenyl-650M的结合能力减弱，有可能被平衡缓冲液冲洗出来，降低了目的蛋白收率。

(3)疏水层析采用阶段洗脱对分离纯化目的蛋白的影响

当蛋白样品结合到Toyopearl Phenyl-650M填料上后，使用阶段洗脱的方式，即先用“100mmol/L PB，pH7.0±0.2”进行洗脱，然后用“10mmol/L PB，pH7.0±0.2”洗脱出峰，结果如图13所示，洗脱液“100mmol/L PB，pH7.0±0.2”可洗脱部分目的蛋白，但是洗脱峰拖尾严重，而洗脱液“10mmol/L PB，pH7.0±0.2”可完全洗脱下目的蛋白，且水洗出峰很小。由此可见，阶段洗脱不如实施例1步骤4的疏水层析的一步洗脱方式可以有效地洗脱出目的蛋白。

对比实施例4.一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

1、纯化方法：如表16所示。

表16.一种hGLP-1类似物融合蛋白的纯化方法

2、纯化结果：

按照上述方法制备三批hGLP-1类似物融合蛋白原液(批号分别为：Y20151001、Y20151002、Y20151101)，并检测三批蛋白样品每一步层析步骤后的HCP及原液的HCP。结果如表17所示，使用该对比实施例方法时，经过Protein A亲和层析，收获的中间样品含有200～500ppm的HCP，而精细纯化的阴离子交换层析对HCP的去除效果不明显，收获液中HCP含量约为200ppm，而实施例1-6精细纯化步骤的阴离子交换层析可以将HCP的残留量降至0.01％以下，而本对比实施例以及实施例1-6所述的纯化方法通过后续的疏水层析均可将HCP含量降低至约100ppm，但是实施例1-6所述的纯化方法得到的原液所含的HCP含量较本对比实施例所述方法得到的原液中所含的HCP含量更低。由此可见，该对比实施例所述方法不适用于hGLP-1类似物融合蛋白的规模化生产制备。

表17.hGLP-1类似物融合蛋白层析中间样品HCP检测结果(ppm)

原液批号	Y20151001	Y20151002	Y20151101
				亲和层析及低pH灭活后收获液	301	231	255
阴离子交换层析收获液	246	201	95
				疏水层析收获液	127	63	91
原液	80	80	90

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

SEQUENCE LISTING

<110> 成都金凯生物技术有限公司

<120> 一种人胰高血糖素样肽-1类似物融合蛋白的纯化方法

<130>

<160> 1

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 275

<212> PRT

<213> Artificial Sequence

<220>

<221> UNSURE

<223> 人工序列

<400> 1

His Gly Glu Gly Thr Phe Thr Ser Asp Val Ser Ser Tyr Leu Glu Glu

1 5 10 15

Gln Ala Ala Lys Glu Phe Ile Ala Trp Leu Val Lys Gly Gly Gly Gly

20 25 30

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Ala Glu

35 40 45

Ser Lys Tyr Gly Pro Pro Cys Pro Pro Cys Pro Ala Pro Glu Ala Ala

50 55 60

Gly Gly Pro Ser Val Phe Leu Phe Pro Pro Lys Pro Lys Asp Thr Leu

65 70 75 80

Met Ile Ser Arg Thr Pro Glu Val Thr Cys Val Val Val Asp Val Ser

85 90 95

Gln Glu Asp Pro Glu Val Gln Phe Asn Trp Tyr Val Asp Gly Val Glu

100 105 110

Val His Asn Ala Lys Thr Lys Pro Arg Glu Glu Gln Phe Asn Ser Thr

115 120 125

Tyr Arg Val Val Ser Val Leu Thr Val Leu His Gln Asp Trp Leu Asn

130 135 140

Gly Lys Glu Tyr Lys Cys Lys Val Ser Asn Lys Gly Leu Pro Ser Ser

145 150 155 160

Ile Glu Lys Thr Ile Ser Lys Ala Lys Gly Gln Pro Arg Glu Pro Gln

165 170 175

Val Tyr Thr Leu Pro Pro Ser Gln Glu Glu Met Thr Lys Asn Gln Val

180 185 190

Ser Leu Thr Cys Leu Val Lys Gly Phe Tyr Pro Ser Asp Ile Ala Val

195 200 205

Glu Trp Glu Ser Asn Gly Gln Pro Glu Asn Asn Tyr Lys Thr Thr Pro

210 215 220

Pro Val Leu Asp Ser Asp Gly Ser Phe Phe Leu Tyr Ser Arg Leu Thr

225 230 235 240

Val Asp Lys Ser Arg Trp Gln Glu Gly Asn Val Phe Ser Cys Ser Val

245 250 255

Met His Glu Ala Leu His Asn His Tyr Thr Gln Lys Ser Leu Ser Leu

260 265 270

Ser Leu Gly

275

Claims

1.一种人胰高血糖素样肽-1(Human Glucagon-like Peptide 1，hGLP-1)类似物融合蛋白的纯化方法，其特征在于，包括以下步骤：

所述的hGLP-1类似物融合蛋白为度拉鲁肽(dulaglutide)；

1)澄清过滤：将含有hGLP-1类似物融合蛋白的细胞培养收获液通过离心和滤膜过滤、或离心和滤芯过滤、或深层过滤和滤芯过滤、或深层过滤和滤膜过滤的方法，以获得澄清过滤液；

2)三步层析法：经过Protein A亲和层析的粗提纯和由两步层析法组成的精细纯化去除步骤1)获得的澄清过滤液中的杂质，所述的两步层析法包括阴离子交换层析和疏水层析；

所述Protein A亲和层析的粗提纯包括平衡，上样，冲洗和洗脱步骤；

所述Protein A亲和层析的填料选自MabSelect SuRe、Eshmuno A、AF-rProtein A HC-650F、MabCapture^TMA和MabCapture^TMA Select、MabSelect SuRe LX中的任意一种；

所述Protein A亲和层析中的平衡缓冲液选自PB和NaCl；

所述Protein A亲和层析中的冲洗步骤包括采用中间冲洗液和冲洗液2冲洗，所述中间冲洗液选自氯化钠和PB，所述冲洗液2选自氯化钠和PB，或者PB；

或者，所述Protein A亲和层析中的冲洗步骤采用中间冲洗液冲洗，所述中间冲洗液选自Tris和GuHcl、Tris和Urea中的一种组合；

所述Protein A亲和层析中洗脱缓冲液选自醋酸或柠檬酸盐；

所述阴离子交换层析包括平衡，上样，阶段洗脱、再生和清洗步骤：

所述阴离子交换层析填料选自Poros 50HQ、Poros XQ、GE Qhp、GE Capto Q中的一种；

所述阴离子交换层析中的平衡缓冲液选自PB和NaCl；

所述阴离子交换层析中的阶段洗脱包括第一阶段洗脱和第二阶段洗脱，所述第一阶段和所述第二阶段的洗脱液均选自PB和NaCl；

所述再生和清洗缓冲液选自PB、NaCl和NaOH；

所述疏水层析包括平衡，上样和洗脱步骤：

所述疏水层析的填料选自Toyopeal phenyl 650M、GE phenyl high sub、GEphenylhp、GE butyl中的一种；

所述疏水层析的平衡缓冲液选自含有(NH₄)₂SO₄的PB、L-组氨酸、Tris-HCl中的一种，所述的(NH₄)₂SO₄在平衡缓冲液中浓度不超过0.5mol/L；

所述疏水层析的洗脱步骤包括采用洗脱液一步洗脱，所述洗脱液选自PB、L-组氨酸、Tris-HCl中的一种；3)过滤：通过去病毒过滤、超滤换液和除菌过滤进一步去除步骤2)中目的蛋白中的杂质，以获得hGLP-1类似物融合蛋白。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的亲和层析的填料为MabSelect SuRe或MabSelect SuRe LX，所述阴离子交换层析填料是Poros 50HQ或Qhp；所述疏水层析填料为Toyopealphenyl 650M。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，步骤2)中，所述的Protein A亲和层析包括以下步骤：

a.平衡：使用平衡缓冲液平衡所述的填料填充的层析柱，所述的平衡缓冲液为0.15mol/L NaCl，20mmol/L PB,pH7.2±0.2；

b.上样：将权利要求1所述的澄清过滤液上样到所述步骤a平衡后的层析柱中，所述的层析柱的载量≤25mg/ml，并保证二者接触时间不低于6min，用所述步骤a的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.冲洗：采用中间冲洗液和冲洗液2冲洗，所述中间冲洗液选自氯化钠和PB，所述冲洗液2选自氯化钠和PB，或者PB；或者，所述Protein A亲和层析中的冲洗步骤采用中间冲洗液冲洗，所述中间冲洗液选自Tris和GuHcl、Tris和Urea中的一种组合；

d.洗脱：用所述洗脱缓冲液洗脱目的蛋白。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，

步骤c中，当所述冲洗步骤采用中间冲洗液和冲洗液2冲洗时，所述的中间冲洗液选自1.0mol/L NaCl和20mmol/L PB，pH7.2±0.2；

所述冲洗液2选自0.15mol/L NaCl和20mmol/L PB,pH7.2±0.2，或10mmol/L PB，pH7.2±0.2；

当所述冲洗步骤采用中间冲洗液冲洗时，所述中间冲洗液选自25mmol/L Tris+2mol/LUrea，pH9.0；50mmol/L Tris+2mol/L GuHCl，pH8.5；步骤d中，所述洗脱缓冲液选自0.1mol/L，pH值为2.5～3.0醋酸，或50mmol/L柠檬酸盐，pH值3.0～3.5。

5.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，

所述阴离子交换层析包括以下步骤：

a.平衡：使用平衡缓冲液平衡所述的阴离子交换层析填料；

b.上样：将所述的Protein A亲和层析分离纯化得到的hGLP-1类似物融合蛋白样品上样，上样载量≤15mg/ml，保证样品与填料接触时间不低于6min；用步骤a所述的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

c.NaCl阶段洗脱；

d.再生和清洗：用缓冲液进行清洗阴离子交换层析柱。

6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，

所述步骤a的平衡缓冲液为20mmol/L PB，pH6.6±0.2；

所述步骤d中，所述缓冲液为20mmol/L PB，1mol/L NaCl，pH6.6±0.2和0.5mol/LNaOH。

7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述步骤c中，所述第一阶段的NaCl洗脱浓度为50～100mmol/L，所述第二阶段的NaCl洗脱浓度为50～150mmol/L，第一阶段和所述第二阶段的所述PB的浓度均为20mmol/L，pH6.6±0.2。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述第一阶段洗脱中NaCl洗脱浓度为70～100mmol/L；所述第二阶段洗脱中NaCl洗脱浓度为100～150mmol/L。

9.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述的疏水层析包含以下步骤：

a.上样样品制备：将hGLP-1类似物融合蛋白样品溶液中加入所述(NH₄)₂SO₄溶液；

b.平衡：使用含有所述(NH₄)₂SO₄的平衡缓冲液平衡所述的疏水层析填料；

c.上样：将上述步骤a制备的上样样品上样，上样载量≤15mg/ml，并保证上样样品与所述疏水层析填料的接触时间不低于5min，用步骤b的平衡缓冲液冲洗去除未结合物；

d.洗脱：用所述洗脱液洗脱，收集洗脱峰。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述步骤b中，所述的平衡缓冲液中所述的L-组氨酸和Tris-HCl的浓度为10～50mmol/L，所述的PB浓度为20mmol/L，pH7.0±0.2，所述的(NH₄)₂SO₄浓度为0.3～0.5mol/L；

所述步骤d中，所述洗脱液中的L-组氨酸和Tris-HCl的浓度为30～50mmol/L，PB浓度为＜100mmol/L，pH7.0±0.2。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述(NH₄)₂SO₄在平衡缓冲液中浓度为0.4mol/L，所述的PB浓度为10～50mmol/L。

12.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述澄清过滤包括：

步骤1)中，所述的离心条件为3500g，7～12min，2～8℃；所述的滤膜过滤采用的是0.2μm滤膜；所述的深层过滤方法选用的是Millipore公司的D0HC和B1HC过滤膜两级深层过滤；所述的滤芯过滤选用的是0.2μm滤膜；

步骤2)中还可以包括低pH缓冲液洗脱，所述的低pH缓冲液洗脱是低pH孵育灭活，所述的低pH孵育灭活在Protein A亲和层析之后，所述的低pH孵育灭活包括以下步骤：

a.调节pH值：用1mol/L醋酸或枸橼酸调节所述Protein A亲和层析分离纯化的目的蛋白样品pH值至3.6±0.1；

b.孵育：20～25℃孵育1～1.5h；

c.中和：用1mol/L Tris调节目的蛋白样品pH至6.8±0.2；

步骤3)中，所述的病毒过滤采用的是纳米膜过滤，所述的纳米膜过滤采用的过滤器选自MilliporeViresolove Pro、HF、Asahi-Kasei Planova 20N和Asahi-KaseiBioEX中的一种；所述的超滤采用的超滤膜为截留分子量为10～30kD的超滤膜，所述超滤膜选自MerckMillipore Biomax、Sartorius PESU、Sartorius Hydrosart中的一种，所述的超滤过滤所得到的目的蛋白浓度不低于6mg/ml；所述的除菌过滤选用0.2μm孔径滤膜。

13.根据权利要求12所述的方法，其特征在于，所述纳米膜滤器是Viresolove Pro和A1HC系列深层滤器，所述超滤膜为Hydrosart系列超滤膜包(Hydrosart ultrafiltrationcassette)。