PT99666A

PT99666A - Processo de preparacao de composicoes de hemoglobina reticulada com imidoester

Info

Publication number: PT99666A
Application number: PT99666A
Authority: PT
Inventors: Robert Lee Garlick; Joseph Patrick Martin; Stephen Baker Lyle
Original assignee: Upjohn Co
Priority date: 1990-11-29
Filing date: 1991-11-29
Publication date: 1992-10-30
Also published as: DE69108258T2; DE69108258D1; SK54993A3; AU650287B2; FI932461A0; ES2069908T3; CA2093650A1; US5362855A; WO1992009630A1; JPH06502848A; ZA918348B; EP0559655B1; US5521154A; CZ85493A3; ATE119917T1; HU211703A9; HU9301563D0; IL99785A0; NZ240377A; DK0559655T3

Description

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MEMÓRIA DESCRITIVA

ANTECEDENTES DO INVENTO 0 presente invento refere-se a um novo processo de produção de um produto de hemoglobina reticulado, purificado, adequado como um substituinte do sangue para transfusão em seres humanos e em animais ou como um fluido de transporte de oxigénio. O produto de hemoglobina reticulado, sujeito, está essencialmente isento de contaminantes visto que contém níveis muito baixos de endotoxinas bacterianas e fosfolípidos. A estrutura e função da hemoglobina foram revistas (Bunn, H.F., e B.G. Forget, Hemoalobin: Molecular. Genetic and Clinicai Aspects. w.B. Saunders Company, Philadelphia, pgs. 690, (1986)). A hemoglobina de mamífero é um tetrâmero contendo cada uma dois tipos diferentes de subunidades, alfa e beta. Cada subunidade tem uma massa molecular aproximada de 16 000 e contém um grupo heme com um átomo de ferro central. A porção de proteína ou globina actua de forma a manter o ferro do heme no estado reduzido ou ferroso, permitindo assim à molécula de hemoglobina ligar-se reversivelmente ao oxigénio. Não se devia considerar a hemoglobina de mamífero como um tetrâmero estático, isto é, uma única espécie de proteína com uma massa molecular de 64-68 000. Em vez disso, ela é composta por subunidades ligadas por ligações não covalentes e existe em equilíbrios dinâmicos que envolvem interacções monómero-dímero e dímero-tetrâmero. Em qualquer momento, a hemoglobina iria consistir numa certa proporção de monómeros com uma massa molecular de aproximadamente 16 000, dímeros de massa molecular 32 000 e tetrâmeros. A distribuição das espécies monoméricas, diméricas e tetraméricas em solução está dependente da concentração de hemoglobina, do estado de ligando da hemoglobina, assim como do pH e da composição salina da solução na qual está contida. A hemoglobina de mamífero está contida nos glóbulos

73 233 TUC 4675.1 Portugal -3-vermelhos do sangue ou eritrócitos. Nos mamíferos estas células especializadas perderam os seus núcleos durante a maturação e são simplesmente sacos de hemoglobina contendo concentrações muito baixas de outras proteínas. A hemoglobina está contida nos eritrócitos circulantes por várias razões. A primeira de todas, se a hemoglobina não estivesse em células mas em vez disso circulasse livre em solução, ela seria rapidamente eliminada da circulação por passagem através das paredes capilares, do rim e de outros locais. Certos organismos invertebrados resolveram este problema desenvolvendo hemoglobinas poliméricas com massas moleculares de milhões que são demasiadamente grandes para passarem através de capilares e do nefrónio do rim. Outras funções realizadas pelo glóbulo vermelho são as de proporcionar um meio protegido para proteger a molécula de hemoglobina das proteínas proteolíticas do soro, manter um equilíbrio de iões adequado para o funcionamento da hemoglobina, proporcionar um sistema enzimático que mantém o ferro do heme no estado reduzido (funcional) e controlar a presença de moléculas efectoras alostéricas. Têm sido realizados numerosos esforços para produzir soluções de hemoglobina isentas de estroma, clarificadas, para transfusão de substituição de sangue em humanos (Pennell, R.B., W.E. Smith, Preparation of stabilized Solutions of hemoglobin, Blood 4: 380-385 (1949); Rabiner, S.F., Helbert, J.R., Lopas, H., e L.H. Friedman, Evaluation of a strom-free hemoglobin solution for use as a plasma expander, J. Exp. Med. 126: 1127-1142 (1967)? Christensen, S.M., Medina, F., Winslow, R.W., Snell, S.M., Zegna, A., e M.A. Marini, Preparation of human hemoglobin Ao for possible use as a blood substitute, J. Biochem. Biophys, Meth. 17: 143-154 (1988); e Feola, M., Gonzalez, H., Canizaro, p.c., Bingham, D. e P. Periman, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surq. Gvn. Obst♦ 157: 399-408 (1983)). Estas soluções contêm a hemoglobina num estado não modificado, e a hemoglobina está livre para se dissociar nas suas subunidades. A infusão de hemoglobina não modificada· conduz à rápida eliminação da hemoglobina da circulação. Adicionalmente, a infusão de hemoglobina não modificada conduz confirmadamente a 73 233 TUC 4675.1 Portugal -4-

uma quantidade de efeitos perniciosos no corpo, incluindo nefrotoxicidade. A nefrotoxicidade associada à hemoglobina não modificada levou o center for Biologics Evaluation and Research of the U.S. Food and Drug Administration a afirmar que a hemoglobina não modificada não devia estar presente num portador de oxigénio à base de hemoglobina.

Tem havido numerosos relatórios que descrevem a estabilização das soluções de hemoglobina por formação de reticulações químicas covalentes entre as cadeias polipeptídicas de hemoglobina (Rausch, C.W., e M. Feola, Extra pure semi-synthetic blood substitute, Pedido de Patente International na PCT/US87/02967, publicação Int. na WO/88/03408, 19 de Maio de 1988; Bonhard, K., e N. Kothe, Cross-linked hemoglobin of extended shelf life and high oxygen transport capacity and process for preparing same, Patente U.S. Na 4 777 244; Bucci. E., Razynska, A., Urbaitis, B., e C. Fronticelli, Pseudo cross-link of human hemoglobin with mono-(3,5-dibromosalicyl)fumarate, J. Biol. Chem. 264; 6191-6195 (1989); e Patente U.S. Na 4 001 200).

ESTADO DA TÉCNICA

As composições de hemoglobina reticuladas foram descritas nas Patentes U.S. 4 001 200; 4 011 401; 4 053 590; e 4 061 736. Foram também descritas na Patente U.S. 4 857 636 formas mais elaboradas de hemoglobina reticulada para subsequente purificação. A preparação e reticulação da hemoglobina de bovino foi descrita em Feola, M., Gonzalez, H., Canizaro, P.C., Bingham, D. e P. Periman, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute, Surq. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983) e no Pedido de Patente International na PCT/US87/02967, publicação Int. na WO/88/03408 de 19 de Maio de 1988.

As reacções do adipimidato de dimetilo com a hemoglobina humana normal (HbA) e a hemoglobina de célula em foice (HbS) foram descritas em Plese, C.F., e E.L. Amma, Circular dichroism -5- 73 233 TUC 4675.1 Portugal as a probe of the allosteric R-T transformation in hemoglobins and modified hemoglobins (1977). A Patente U.S. 3 925 344 (1975) descreve a reticulação da hemoglobina com imidoésteres para preparar um expansor de plasma ou material proteico de plasma; contudo, este material não é adequado como um fluído de transferência de oxigénio. Como descrito por Pennathur-Das, R., He ath, R.H., Mentzer, W.C., e B.H. Lubin "Modification of hemoglobin S with dimethyl adipimidate. Contribution of individual reacted subunits to changes in properties Biochim. Biophvs. Acta 704; 389-397 (1982)", a reticulação com os imidoésteres (DMA) aumentou a afinidade pelo oxigénio da hemoglobina o que a torna inadequada para o transporte de oxigénio e libertação deste. Pennathur-Das, R. , Vickery, L.E., Mentzer, W., e B.H. Lubin, Modification of hemoglobin A with dimethyl adipimidate. Contribution of individual reacted subunits to changes in oxygen affinity Biochim. Biophys. Acta 580: 356-365 (1979).

Assim, é desejável encontrar um processo de reticulação da hemoglobina que a torne estável e, predominantemente, numa forma de tetrâmero ou de tetrâmeros múltiplos mas que tenha ainda uma p50 ou uma afinidade pelo oxigénio que seja suficientemente baixa para transportar eficazmente o oxigénio e depois libertá-lo nas células de um organismo vivo. É também importante que a massa molecular seja predominantemente de, pelo menos, 64 000 que é a forma de tetrâmero da hemoglobina com pouco ou nenhum abaixo de 64 000; i.e., a forma de dímero ou monómero, e pouco ou nenhum muito superior a cerca de 64 000 que podem ser moléculas suficientemente grandes para causar a activação do complemento em orgapismos mamíferos. 0 desenvolvimento de um tal processo de polimerização é, por consequência, muito desejável de forma a se encontrar, com êxito, um substituto de transporte de oxigénio.

SUMARIO DO INVENTO

Num aspecto, o objectivo do invento é uma composição de hemoglobina reticulada, estável, capaz de transportar e libertar o oxigénio em células vivas. A hemoglobina está essencialmente

73 233 TUC 4675.1 Portugal -6-isenta cie impurezas e está reticulada com um imidoéster pelo que a hemoglobina está predominantemente presente nas formas de tetrâmero e maiores. Os imidoésteres preferidos para reticulação da hemoglobina são o adipimidato de dimetilo e o suberimidato de dimetilo. A hemoglobina predominantemente na forma de tetrâmero ou maior pode ser interpretada como uma em que, pelo menos, 80% da hemoglobina reticulada tem uma massa molecular de, pelo menos, 64 000 Daltons, mais preferivelmente onde, pelo menos, 90 a 95% da hemoglobina reticulada tem uma massa molecular de, pelo menos, 64 000 Daltons. Adicionalmente, a hemoglobina reticulada com imidoéster é muito estável à meta-hemoglobina quando comparada com o meio convencional de reticulação e tem uma afinidade para o oxigénio, p50, de pelo menos 1733 Pa (13 mmHg). A composição de hemoglobina reticulada pode também incluir um meio portador farmaceuticamente aceitável para facilitar a transfusão ou injecção num mamífero a ser tratado ou para utilização como um fluído de transporte de oxigénio para utilização analítica, de transplante ou laboratorial. 0 meio portador farmaceuticamente aceitável, típico, pode incluir água purificada ou solução salina.

Num outro aspecto, o objectivo do invento é um processo de preparação de uma composição de hemoglobina reticulada caracterizado por compreender a) a recolha de sangue de mamífero, b) a separação dos glóbulos vermelhos do sangue recolhido e a lavagem dos glóbulos vermelhos, c) a lise dos glóbulos vermelhos, d) a centrifugação dos glóbulos lisados para se obter um lisado de hemoglobina, e) a purificação do lisado por cromatografia de permuta aniónica ou catiónica, f) a realização de uma ultrafiltração ou microfiltração do lisado eluído, obtido a partir da cromatografia, pelo que é obtida a hemoglobina purificada, e g) a reticulação da hemoglobina purificada com um imidoéster para se obter uma hemoglobina presente predominantemente na forma de tetrâmero. A lise dos glóbulos vermelhos pode ser realizada por choque hipo-osmótico. A ultrafiltração é tipicamente realizada com uma 73 233 TUC 4675.1 Portugal -7-

membrana de massa molecular de 300 000 e a microfiltração é tipicamente realizada com um filtro de cerca de 0,025 a cerca de 0,040 micron. Alternativamente, a reticulação com imidoéster, passo (g), pode ser realizada após a lise das hemoglobinas obtidas no passo (d), pelo que o passo (e) começa com a purificação da hemoglobina reticulada. O processo pode incluir adicionalmente um passo (h) onde a hemoglobina reticulada, purificada, sofre exclusão por tamanhos para remover a hemoglobina de baixa massa molecular (inferior a 64 000 Daltons). Tipicamente, a exclusão por tamanhos é realizada por cromatografia de exclusão por tamanhos a baixa pressão.

Por consequência, o presente invento descreve uma composição de hemoglobina reticulada com imidoéster essencialmente isenta de quaisquer impurezas e que está presente numa forma predominantemente de tetrâmero ou maior que tem uma estabilidade melhorada à oxidação da hemoglobina relativamente às formas mais tradicionais de reticulação de hemoglobina tal como com glutaraldeído. A composição de hemoglobina tem uma massa molecular predominante de, pelo menos, 64 000 Daltons e tem uma estabilidade à reticulação melhorada. A hemoglobina é adequada para utilização como um substituto de transporte de oxigénio sanguíneo para mamíferos ou geralmente como um fluído de transporte de oxigénio.

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO 0 presente invento descreve um processo de purificação e reticulação da hemoglobina com certos imidoésteres que não têm sido utilizados para reticular a hemoglobina para utilização como uma terapêutica de transfusão. Estes reticuladores de imidoéster bifuncionais, incluem o adipimidato de dimetilo e o suberimidato de dimetilo, entre outros. Há vantagens na utilização destes agentes de reticulação em relação aos reticuladores de hemoglobina que foram utilizados no passado. Têm sido encontradas condições de reacção particulares que proporcionam uma estreita distribuição de massa molecular e o transporte adequado do oxigénio.

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Os imidoésteres tais como o adipimidato de dimetilo e o suberimidato de dimetilo são reagentes de reticulação bifuncionais que reagem específica e rapidamente com proteínas sob condições suaves, são formados aductos amidina estáveis com grupos amino-epsilon de resíduos de lisina e a amina do terminal amino das cadeias polipeptídicas (Wold, F. (1972) Bifunctional reagents, Methods in Enz. 25; 623-651; Peters, K. , e F.M. Richards (1977) Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure, Ann. Rev. Biochem. 46; 523-551. 0 reagente de reticulação reage tipicamente com um a dois grupos amino por subunidade de hemoglobina. Ocorre alguma reticulação entre os dois resíduos de lisina da cadeia beta (beta-82) o que estabiliza a forma tetramérica da hemoglobina humana. 0 adipimidato de dimetilo tem sido estudado como um agente anti-foice para a hemoglobina S (Lubin, B.H., Pena, V., Mentzer, W.C., Bymun, E., Bradley, T.B., e L. Packer (1975) Dimethyl adipimidate: a new antisickling agent, Proc. Natl. Acad. Sei. U.S.A. 72: 43-46). A modificação das lisinas beta-82 altera a conformação da forma desoxigenada de HbS e impede assim a sua cristalização ou gelificação. A cristalização é a base molecular para o fenómeno de foice observado nos glóbulos vermelhos atingidos. Embora a modificação da lisina beta-82 pelo agente de reticulação seja necessária para impedir a formação de foice, a reticulação real das duas lisinas beta-82 num tetrâmero de hemoglobina não é. o presente invento utiliza o adipimidato de dimetilo para a hemoglobina de bovino com a finalidade de formar tetrâmeros estabilizados, causados pela introdução de reticulações intersubunidade entre as lisinas beta-82, e agregados de elevada massa molecular de tetrâmeros estabilizados, causados por introdução de reticulações intermoleculares entre os grupos amino epsilon de tetrâmeros de hemoglobina estabilizados, separados.

As vantagens da reticulação da hemoglobina com imidoésteres, e especificamente adipimidato de dimetilo são duas; primeiro, a reticulação vai atrasar a dissociação da hemoglobina tetramérica de massa molecular 64 000, em dímeros de massa molecular 32 000. Na hemoglobina não modificada as espécies tetraméricas e

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diméricas estão em equilíbrio dinâmico. A estabilização da hemoglobina tetramérica por reticulação com imidoésteres vai reduzir substancialmente a passagem da hemoglobina para os túbulos renais impedindo a filtração através da membrana da cápsula glomerular.

Segundo, a reticulação vai resultar na formação de oligómeros de elevada massa molecular do tetrâmero de hemoglobina que seriam extremamente resistentes à filtração renal e mais estáveis à oxidação a temperatura fisiológica do que a hemoglobina não modificada ou a hemoglobina modificada com o agente de reticulação, glutaraldeído. 0 adipimidato de dimetilo é um reagente relativamente pouco caro e está disponível em grandes quantidades. O processo de reticulação que utiliza o adipimidato de dimetilo presta-se bem a um avimento escala.

Mediram-se as propriedades de ligação ao oxigénio das várias formas de hemoglobina de bovino e estas aparecem na Tabela I. A P50 é a pressão parcial de oxigénio à qual 50% dos locais disponíveis têm oxigénio ligado. O coeficiente de Hill ou valor n é uma expressão da cooperatividade entre os locais de ligação de oxigénio, elevados valores de n indicando uma elevada cooperatividade. Os valores de P50 foram medidos durante a oxigenação e durante a desoxigenação da solução de hemoglobina. Os valores de P50 médios foram de: 1800 Pa (13,5 mmHg) para a hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo, 1900 Pa (14,25 mmHg) para a hemoglobina reticulada com glutaraldeído e 3166 Pa (23,75 mmHg) para a hemoglobina de bovino não modificada. Se for realizada uma reticulação extrema com imidoésteres ou glutaraldeído, os valores de p50 destas hemoglobinas serão muito diminuídos. De igual modo com os imidoésteres e com o glutaraldeído, a reticulação da hemoglobina reduziu também a sua cooperatividade sendo observada a maior redução na amostra tratada com glutaraldeído. -10- 73 233 TUC 4675.1 Portugal

Comparou-se a estabilidade das várias hemoglobinas reticuladas e verificou-se que a versão de imidoéster tinha uma estabilidade superior. Por consequência, o imidoéster sob procedimentos de reticulação adequados, descritos abaixo, originou uma melhor hemoglobina de transporte de oxigénio quando se tem em consideração a estabilidade e a afinidade para o oxigénio.

Na incubação a 36-37°C, as amostras de hemoglobina reticuladas com adipimidato de dimetilo, reticuladas com glutaraldeido e não modificadas tinham 2,5%, 8,0% e 3,5% de meta-hemoglobina, respectivamente, no início da incubação. Após 5 horas a 36-37°C, as percentagens de meta-hemoglobina eram de 8,9%, 44,4% e 8% para as amostras de hemoglobina de bovino reticuladas com adipimidato de dimetilo, reticuladas com glutaraldeido e não modificadas, respectivamente. Após 24 horas, as concentrações de meta-hemoglobina eram de 24,1, 87,9 e 42%

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73 233 TUC 4675.1 Portugal -11 para as amostras de hemoglobina de bovino reticuladas com adipimidato de dimetilo, reticuladas com glutaraldeído e não modificadas, respectivamente. Após 48 horas, as concentrações de meta-hemoglobina nas amostras de hemoglobina de bovino reticuladas com adipimidato de dimetilo e não reticuladas eram de 46,5% e 68%, respectivamente. A hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo era mais estável do que a hemoglobina não modificada para a formação de meta-hemoglobina. A literatura descreve que a hemoglobina humana reticulada com glutaraldeído auto-oxida-se a uma velocidade quatro vezes superior à da hemoglobina humana não modificada. Por consequência, não se esperava que a hemoglobina reticulada com DMA fosse mais estável do que a hemoglobina não modificada. A estabilidade da hemoglobina de bovino não modificada e da hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo e reticulada com glutaraldeído à auto-oxidação foi também medida após incubação durante 52 dias a 4°C no mesmo tampão de fosfato descrito acima. Após 28 dias a hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo aumentou de 2,5% para 9,6% de meta-hemoglobina. Durante o mesmo periodo de tempo a hemoglobina reticulada com glutaraldeído aumentou de 8,0% para 23,5% de meta-hemoglobina. Quando medida após 52 dias, a hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo tinha 14,3% de meta-hemoglobina enquanto que após 37 dias a hemoglobina de bovino não modificada tinha 16,3% de meta-hemoglobina. Como na incubação a 37°C, a hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo era significativamente mais estável do que a hemoglobina reticulada com glutaraldeído ou a hemoglobina de bovino não modificada.

Num aspecto, o invento refere-se ao aumento de estabilidade das hemoglobinas de mamífero incluindo a hemoglobina de bovino, após reticulação com imidoésteres incluindo adipimidato de dimetilo. Descreve-se aqui que a estabilidade das hemoglobinas de mamífero pode ser aumentada por reacção com imidoésteres, especificamente adipimidato de dimetilo sob condições específicas de reacção. Adicionalmente, descreve-se também aqui um processo

73 233 TUC 4675.1 Portugal de produção de hemoglobina de mamífero purificada, especificamente hemoglobina de bovino. A hemoglobina estaria essencialmente isenta de impurezas, o que significa que não iria conter quaisquer materiais numa quantidade que causasse quaisquer efeitos perniciosos no animal tratado. A hemoglobina estaria suficientemente isenta de endotoxina (por exemplo, uma concentração de hemoglobina inferior a 0,5 UE/ml, pelo menos, 40 mg/ml), fosfolípido, vírus e outras proteínas diferentes da hemoglobina, antes da reticulação. Contudo, é também possível reticular primeiro a hemoglobina após recolha da hemoglobina lisada e depois purificar a hemoglobina reticulada; de facto, este processo pode ser mais eficaz para produção a grande escala. A hemoglobina purificada e reticulada seria adequada como um diluente do sangue, de transporte de oxigénio para transfusão em humanos e animais.

Tipicamente, a hemoglobina do presente invento seria preparada por recolha do sangue de mamífero sob condições assépticas, lavagem dos glóbulos vermelhos, lise dos glóbulos vermelhos, centrifugação do lisado, ultrafiltração com uma membrana de massa molecular de pelo menos 300 000 ou microfiltração com um filtro de 0,025 a cerca de 0,040 micron, purificação por cromatografia de permuta aniónica ou catiónica para se obter uma hemoglobina purificada, depois reticulação com o imidoéster e realização opcional de uma cromatografia de exclusão por tamanhos ou ultrafiltração para remover qualquer hemoglobina de baixo peso molecular. Alternativamente a hemoglobina pode ter sido reticulada após centrifugação e recolha do lisado. Os passos de purificação, podem então ser realizados incluindo o passo de exclusão por tamanhos opcional. A hemoglobina assim preparada estaria essencialmente isenta de impurezas e consistiria predominantemente num tetrâmero estabilizado. Uma outra forma de caracterizar a hemoglobina reticulada seria a de afirmar que ela tem uma distribuição de massa molecular de predominantemente, pelo menos, 64 000. Predominantemente ou predominante tal como aqui utilizado significa pelo menos 80% da hemoglobina reticulada, -13- 73 233 TUC 4675.1 Portugal preferivelmente 90 a 95% da hemoglobina reticulada.

De forma a preparar a hemoglobina de transporte de oxigénio especializada, objecto, são especificados vários parâmetros da reacção de reticulação. Primeiro, a concentração de ião cloro e/ou cloreto de sódio tem um efeito profundo na extensão da reticulação da hemoglobina (bovino) como DMA numa gama de Tris-HCl 1 mM a Tris-HCl 50 mM mais NaCl 2,0 M. Em Tris-HCl 1 e 10 mM após 10 adições de DMA, 90,3% e 72,2% (respectivamente) da hemoglobina permaneceu não polimerazada. Em contraste com este resultado, na presença de Tris-HCl 50 mM mais NaCl 0,5, 1,0 e 2,0 M, só 25,8, 24,4 e 20,7% permaneceu não reticulada (respectivamente). Foi observada uma diminuição estável na hemoglobina não polimerizada e um aumento na elevada massa molecular (> 400 000 daltons) à medida que a concentração de sal aumentava. A mais alta percentagem de hemoglobina no intervalo 64-400 000 foi observada guando a reticulação foi realizada em Tris-HCl 50mM ou em Tris-HCl 50 mM mais NaCl 100 mM.

Segundo, o tipo de tampão mostrou ter uma forte influência na reticulação. Por exemplo, a reacção de reticulação com DMA que prosseguiu fracamente em glicina-HCl, etanolamina-HCl e numa solução contendo fosfato de sódio mais lisina. Nestes tipos de tampão, supõe-se que a função amino primária inibe a reacção de reticulação, que se pensa ocorrer principalmente nos grupos amino no terminal N da proteína e seus resíduos de lisina. A maior quantidade de reticulação foi observada na presença de tampão de 2- amino-2-metil-l-propanol, permanecendo não reticulada só 23,4% da hemoglobina. Este tampão, obviamente, tem também uma funcionalidade amino primária. Os quatro tampões seguintes em termos de eficácia de reticulação com DMA foram o Tris (Tris[hidroximetil]aminometano), o carbonato de sódio, o CHES (ácido 2-[N-ciclo-hexilamino]etanossulfónico) e o CAPSO (ácido 3- [ciclo-hexilamino]2-hidroxi-l-propanossulfónico); três dos quais têm funcionalidades amino primárias. Em contraste, o CAPS (ácido 3-[ciclo-hexiloamino]-l-propanossulfónico) não foi um bom tampão para a reacção de reticulação e o produto resultante só estava 27,2% reticulado. 0 fosfato de sódio também não foi uma

73 233 TUC 4675.1 Portugal -14- boa escolha para a reacção de reticulação.

Terceiro, o pH desempenhou um papel importante na polimerização eficaz da hemoglobina num imidoéster. Por exemplo, foram geralmente mal sucedidas as tentativas para reticular hemoglobina com DMA a valores de pH inferiores a 8,0. A pH 8,0 após 10 adições de DMA e uma razão estequiometrica final de DMA para hemoglobina igual a 10, a hemoglobina só estava 12,2% reticulada. Um aumento na eficácia de reticulação foi presenciado a pH 9,0, 10,0 e 10,5, permanecendo não reticulada só 58%, 48% e 50%, respectivamente, no final das adições de DMA. Contudo, foi evidente a partir dos dados, que a reacção do DMA com hemoglobina requer um pH de 9 ou superior, de forma a ser bem sucedida.

Finalmente, observou-se que a hemoglobina desoxigenada era reticulada mais rapidamente do que a hemoglobina oxigenada. Depois de se proporcionarem as condições de polimerização acima descritas para reticulação óptima, a hemoglobina não reticulada pode ser filtrada ou cromatografada para originar uma massa molecular de 64 000 ou maior e, depois, filtrada ou cromatografada adicionalmente para originar predominantemente a massa de 64 000. Por consequência a optimização da reticulação da hemoglobina facilita muito a preparação económina e prática do material de transferência de oxigénio objecto que tem predominantemente de massa molecular 64 000 a 300 000.

Após ser preparada a hemoglobina reticulada ela é tipicamente colocada num meio portador farmaceuticamente aceitável, apropriado para injecção ou infusão num mamífero a ser tratado. 0 meio portador farmaceuticamente aceitável típico pode incluir soluções salinas fisiologicamente aceitáveis apropriadas para injecção ou infusão tais como soluções salinas que estão comercialmente disponíveis. Um portador farmacêutico aceitável seria um qualquer de uma variedade de líquidos que seriam relativamente inertes para a hemoglobina reticulada e não teriam efeito pernicioso no mamífero a ser infundido ou injectado. Os fluídos adequados podem também incluir outros produtos sanguíneos naturais ou sintéticos, fluídos fluorocarbonados. Em geral, a 73 233 TUC 4675.1 Portugal -3.5- JML·. hemoglobina reticulada objecto seria misturada num portador farmacêutico adequado pelo que a concentração de hemoglobina podia ser administrada na quantidade adequada de cerca de 40 a cerca de 140 mg/ml. 0 presente invento sujeito é descrito com mais detalhe como se segue para cada um dos vários passos e composição molecular descrita acima. Os processos descritos aplicam-se a uma qualquer hemoglobina de mamífero embora para fins de demonstração dos exemplos específicos que descrevem a purificação, reticulação e modificação se utilize a hemoglobina de bovino. Contudo, a hemoglobina de bovino tem vantagem por ter um valor de p50 muito elevado adequado ao transporte de oxigénio.

Exemplo 1 - Recolha de sangue e preparação do hemolisado de glóbulos vermelhos 0 sangue foi retirado de uma forma asséptica de bezerros Holstein na quinta pertencente a The Upjohn Company Agricultural Division. Primeiro, rapou-se o cabelo do pescoço de cada bezerro com tesouras eléctricas. A área rapada foi então limpa com uma toalha de pano embebida numa solução de iodo, seguida por lavagem com etanol a 95% de um frasco de esguicho. Deixou-se o etanol secar ao ar antes de se extrair o sangue. 0 sangue foi retirado para frascos de recolha de sangue de 0,5-1,0 litro, submetidos a vácuo que eram estéreis e isentos de pirogénios. Foi adicionada uma quantidade apropriada de uma solução de heparina de sódio estéril a cada frasco antes da recolha de sangue. Os frascos foram colocados em gelo imediatamente após enchimento e foram transportados para o laboratório em gelo. Para os estudos iniciais, foram retirados 2,5-5,0 litros de sangue.

No laboratório, todos os procedimentos foram realizados em gelo ou a 4o C para minimizar o crescimento de microorganismos e a concomitante formação de pirogénios. Adicionalmente, os passos de purificação deviam ser realizados num meio limpo com ar filtrado que tem um baixo teor em partículas. Os primeiros passos da purificação da hemoglobina envolvem a separação dos glóbulos vermelhos do plasma sanguíneo, seguida por lavagens repetidas dos

73 233 TUC 4675.1 Portugal -16- glóbulos vermelhos com uma solução salina e centrifugação para pelotizar os glóbulos vermelhos, o sangue completo foi primeiro transferido para frascos de centrífuga de 0f5 litro isentos de pirogénios e centrifugado durante 30-40 minutos a 4000 RPM e 4°C. Os glóbulos vermelhos foram pelotizados durante a centrifugação. 0 plasma sanguíneo no sobrenadante foi removido por aspiração. Os glóbulos vermelhos ou eritrócitos foram suspensos numa solução gelada contendo 16 gramas de cloreto de sódio (NaCl) por litro de água purificada. Esta solução é referida como solução salina a 1,6%. Os glóbulos vermelhos foram ressuspensos por agitação com uma vareta de vidro isenta de pirogénios e estéril, ou por inversão repetida suave dos frascos de centrífuga. Depois dos glóbulos vermelhos serem ressuspensos, eles foram recentrifugados a 10 000 RPM durante 30-40 minutos a 4eC. Os glóbulos vermelhos foram ressuspensos em solução salina a 1,6% e centrifugados de novo a 10 000 RPM durante 30-40 minutos a 4°C. Os glóbulos vermelhos foram lavados, um total de três vezes, com solução salina a 1,6% antes da ruptura ou lise dos glóbulos vermelhos.

Após lavagem dos glóbulos, os glóbulos vermelhos foram lisados por choque hipo-osmótico da maneira seguinte. A um volume de glóbulos vermelhos pelotizados, lavados, foram adicionados quatro volumes de tampão de fosfato de sódio 0,0025 M gelado, pH 7,4. Os glóbulos vermelhos foram suspensos neste tampão de fosfato diluído por inversão suave dos frascos de centrífuga. Depois das células estarem completamente suspensas, as suspensões de glóbulos vermelhos foram incubadas a 0-4°C durante uma hora, seguida por centrifugação a 10 000 RPM durante 30-90 minutos a 4°C. Após centrifugação, a hemoglobina no sobrenadante foi recuperada por aspiração. Em certas experiências, o protocolo foi modificado da maneira seguinte. Depois da incubação de uma hora com tampão de fosfato de sódio 0,0025 M a 0-4°C, foi adicionada uma solução 2,0 M de cloreto de sódio até uma concentração final de 0,2 M antes da centrifugação. A adição de cloreto de sódio ao lisado de glóbulos vermelhos proporcionou um sobrenadante mais límpido após centrifugação.

Pode-se incluir um passo de polimento após a centrifugação

TUC 4675.1 Portugal -17- para produzir o hemolisado. Seria adicionado ao hemolisado, centrifugado com agitação, um auxiliar de filtração que é um derivado celulósico, terra de diatomáceas, polímero ou sílica. 0 auxiliar de filtração podia então ser removido por filtração ou centrifugação. A adição de um passo de polimento com um auxiliar de filtração iria remover os fragmentos de estroma adicionais, como fosfolípidos, que não foram completamente removidos por centrifugação.

Uma alternativa ao choque hipo-osmótico para lisar os glóbulos vermelhos é o rompimento mecânico tal como com uma prensa French ou ma homogeneizador de células de maior escala. 0 teor em pirogénios dos quatro hemolisados processados varia de 0,05 a 0,2 unidades de endotoxina (UE) por ml, pelo teste de pirogénios de Lisado de Amebócitos de Limulus (LAL). O processamento a jusante por cromatografia de permuta aniónica ou de permuta catiónica iria remover os últimos vestígios de endotoxina e fosfolípido.

Exemolo 2 - Redução do teor em vírus

Se o sangue de bovino estiver contaminado com vírus, seria removida uma certa quantidade da carga virai durante a lavagem dos glóbulos vermelhos com centrifugação a baixa velocidade. Uma outra percentagem seria removida com a centrifugação a alta velocidade do hemolisado, e ficaria na pelota. Uma outra alíquota seria removida num passo de polimento. A redução posterior da carga virai seria por microfiltração e/ou ultrafiltração. A microfiltração com um filtro de 0,025-0,040 micron reduzirá muito o título da maioria dos vírus. Um cartucho de microfiltração de nilão 66 Ultipor N66 da Pall Corporation tem uma porosidade de 0,04 micron e seria utilizado para filtrar o hemolisado antes do posterior processamento a jusante. Adicionalmente, se necessário, está disponível uma membrana de ultrafiltração de exclusão a partir da massa molecular 300 000 da Filtron Corporation, a qual se insere numa

73 233 TUC 4675.1 Portugal -18-unidade de ultrafiltração à escala de produção Pellicon da Amicon Corporation. A hemoglobina passaria livremente através de todas estas membranas de ultra e microfiltração, enquanto que seria retida uma proporção dos vírus. Por consequência, uma combinação destas duas membranas de filtração reduziria muito a carga virai. Cada um destes tipos de filtros mostra fraca retenção de proteínas.

Adicionalmente à filtração, o teor virai do hemolisado ou do hemolisado filtrado podia ser reduzido pela adição de detergentes apropriados, ácido etilenodinitrilotetraacético, o fosfato de trinitrobutilo de grau reagente aprovado pela FDA, ou uma combinação destes aditivos.

Exemplo 3 - Cromatocrrafia de permuta iónica da hemoglobina A cromatografia de permuta aniónica tem sido utilizada extensivamente na purificação das hemoglobinas de mamífero (Williams, R.C., K. Tsay (1973) Anal. Biochem. 54: 137-45). Sob as condições adequadas de pH e força iónica, a hemoglobina pode ser aplicada a um permutador aniónico de modo a ligar-se ao permutador. As impurezas proteicas e não proteicas seriam removidas da hemoglobina durante o desenvolvimento da coluna. Podem também ser seleccionadas condições sob as quais a hemoglobina tem pouca ou nenhuma afinidade para a resina de permuta aniónica seleccionada. Sob estas condições, as impurezas ficariam na coluna. Os principais contaminantes presentes no hemolisado recentemente preparado são fosfolípidos, vírus potencialmente residuais que não foram removidos pelos passos de processamento a montante, baixos níveis de endotoxina bacteriana e outras proteínas diferentes da hemoglobina. A endotoxina, o fosfolípido e as proteínas plasmáticas são mais negativamente carregadas do que a hemoglobina e devem exibir uma maior afinidade para o permutador aniónico sob as condições seleccionadas. Sob as condições adequadas de carga e eluição, a cromatografia de permuta aniónica deve ser útil para resolver a hemoglobina destes contaminantes. Adicionalmente, a cromatografia de permuta aniónica devia reduzir mais a carga virai.

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Utilizaram-se três protocolos cromatográficos de permuta aniónica para a purificação da hemoglobina: ligação a pH elevado e eluição com um gradiente de pH descendente, ligação a pH elevado e eluição com um gradiente descontínuo de pH inferior, e carga sob condições de pH nas quais a hemoglobina não se liga ao permutador aniónico, mas passa através da coluna sem ser retida. Todas as experiências foram realizadas num modo de coluna, mas seria de esperar que pudessem ser desenvolvidas condições semelhantes em descontínuo que iriam dar origem a resultados quase idênticos. O permutador aniónico utilizado nestas experiências foi Q-Sepharose Fast Flow de Pharmacia, mas seria de esperar que estes procedimentos funcionassem com um certo número de permutadores aniónicos de pressão baixa a média, disponíveis comercialmente, que foram desenvolvidos para a purificação de proteínas, incluindo aqueles com funcionalidades amina e quaternária dietilaminoetilo. A cromatografia de permuta catiónica tem sido também extensivamente utilizada para a purificação de hemoglobinas de mamífero (Bucci, E. (1981) Preparation of isolated chains of human hemoglobin, Meth. in Enzvmol. 76: 97-106). sob as condições adequadas de pH e força iónica, a hemoglobina pode ser aplicada a um permutador catiónico de modo a ligar-se ao permutador. 0 fosfolípido e a endotoxina, assim como as proteínas plasmáticas deviam ter pouca afinidade para o permutador catiónico sob condições nas quais a hemoglobina se ligaria. Sob as condições adequadas de carga e eluição, a cromatografia de permuta catiónica deve ser útil para eliminar a hemoglobina destes contaminantes. Adicionalmente, a cromatografia de permuta catiónica daria uma redução adicional na carga virai.

Conceberam-se dois protocolos cromatográficos de permuta catiónica para a purificação da hemoglobina. No primeiro protocolo, a hemoglobina foi carregada sob condições nas quais ela se liga ao permutador catiónico e foi então eluída com um gradiente linear de pH. No segundo protocolo, a hemoglobina foi carregada sob condições nas quais ela se liga à resina e depois eluída com um gradiente em degrau de pH. Em qualquer um destes 73 233 TUC 4675.1 Portugal -20-

protocolos, o fosfolípido e a endotoxina passariam sem atrasos através da resina, resolvendo assim estes contaminantes da hemoglobina. Seria adequado um certo número de permutadores catiónicos comercialmente disponíveis. Utilizou-se, preferivelmente, ums S-Sepharose Fast Flow de Pharmacia pelas suas excelentes características de ligação a proteína e escoamento. Seria de esperar que um grande número de outros meios cromatográficos de baixa a média pressão, com uma funcionalidade sulfopropilo ou carboximetilo realizassem também a função necessária. A modificação de escala destas resinas é económica.

Exemplo 3A - Cromatoarafia de permuta aniónica com um gradiente linear de pH

Esta experiência pôs em evidência as condições de cromatografia de permuta aniónica em que a hemoglobina de bovino foi carregada no permutador e depois eluída com um gradiente linear de pH. Preparou-se uma coluna de 2,5 x 5,5 cm de Q-Sepharose Fast Flow e esta foi limpa por exposição, durante a noite a NaOH 0,5 Μ. A coluna foi lavada com Tris 100 mM, pH 8,5 até o pH do efluente da coluna ser de 8,5. A coluna foi então equilibrada com Tris 50 mM, pH 8,5. Cinco ml de uma amostra de hemolisado de glóbulos vermelhos de bovino recentemente preparado contendo aproximadamente 350 mg de hemoglobina foram diluídos para 10 ml com Tris 100 mM, pH 8,5 e carregados na coluna de Q-Sepharose a 2,5 ml por minuto. A seguir à carga, a coluna foi lavada com Tris 50 mM, pH 8,5 até a absorvância do efluente da coluna voltar à linha de base. A coluna foi então eluída com um gradiente linear consistindo no tampão de partida versus Tris 50 mM. pH 6,5 durante dez volumes de coluna. A hemoglobina eluiu essencialmente como um único pico principal com vários picos secundários que eluíram antes e depois dele. 0 pico principal único representa 95% da hemoglobina que foi carregada na coluna. Todos os procedimentos cromatográficos foram realizados a 5°C. -21- 73 233 TUC 4675.1 Portugal

Exemplo 3B - Cromatografia de permuta aniónica com um gradiente descontinuo de pH

Esta experiência pôs em evidência as condições de cromatografia de permuta aniónica em que a hemoglobina de bovino foi carregada no permutador e depois eluída com um único gradiente em degrau de pH. Preparou-se uma coluna de 2,5 x 5,5 cm de Q-Sepharose Fast Flow e esta foi limpa como no Exemplo 3A. Oito ml de uma amostra de hemolisado de glóbulos vermelhos de bovino contendo aproximadamente 400 mg de hemoglobina foram diluídos para 16 ml com Tris 50 mM, pH 8,5 e carregados na coluna a 2,7 ml por minuto. A seguir à carga,' a coluna foi lavada com Tris 50 mM, pH 8,5 até a absorvância do efluente voltar à linha de base. A coluna foi então desenvolvida com Tris 50 mM, pH 7,4 e a hemoglobina eluiu da coluna essencialmente como um único pico. A quantidade de hemoglobina presente na fracção rica em Q-Sepharose era quase idêntica àquela carregada na coluna, indicando uma recuperação quase quantitativa ao longo deste passo.

Exemplo 3C - Cromatoarafia de permuta aniónica na qual a hemoglobina não é retida

Esta experiência pôs em evidência as condições de cromatografia de permuta aniónica em que a hemoglobina de bovino não se ligou ao permutador aniónico, mas passou através da coluna não retida. Preparou-se uma coluna de 2,5 x 5,5 cm de Q-Sepharose Fast Flow e esta foi limpa por exposição durante a noite a NaOH 0,5 Μ. A coluna foi lavada com Tris 100 mM, pH 7,4 até o pH do efluente da coluna ser 7,4. Dez ml de um hemolisado de glóbulos vermelhos de bovino recentemente preparado contendo 880 mg de hemoglobina foram diluídos para 40 ml com Tris 50 mM, pH 7,4 e foram carregados na coluna 35 ml a 2,5 ml por min. A seguir à carga, a coluna foi lavada com Tris 50 mM, pH 7,4 até acabar a eluição de hemoglobina da coluna. A hemoglobina passou através da coluna sem se ligar e a recuperação foi de 88%.

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Exemplo 3D - Cromatocrrafia de permuta catiónica da hemoglobina

Esta experiência pôs em evidência as condições de cromatografia de permuta catiónica em que a hemoglobina de bovino foi carregada no permutador e depois eluída com um gradiente linear de pH. Preparou-se uma coluna de 2,5 x 5,5 cm de S-Sepharose Fast Flow e esta foi limpa por exposição durante a noite a NaOH 0,5 Μ. A coluna foi lavada com Bis-Tris loo mM, pH 6,0 até o pH do efluente da coluna atingir 6,0. A coluna foi então equilibrada com Bis-Tris 50 mM, pH 6,0. Cinco ml de uma amostra de hemolisado de glóbulos vermelhos de bovino recentemente preparado foram diluídos para 10 ml com Bis-Tris 50 mM, pH 6,0, seguida por carga na coluna de S-Sepharose a 2,5 ml por hora. A seguir à carga, a coluna foi lavada com Bis-Tris 50 mM/ pH 6,0 até a absorvância do efluente da coluna atingir a linha de base. A coluna foi então eluída com um gradiente linear entre o tampão da coluna e Bis-Tris 50 mM, pH 8,0 durante dez volumes de coluna. Todos os procedimentos cromatográficos foram realizados a 5°C.

Exemplo 4 - Reticulação da hemoglobina de bovino com adipimidato de dimetilo

Uma amostra contendo 170 mg/ml de hemoglobina de bovino purificada foi tratada como se segue. A reacção de reticulação foi realizada a uma concentração de tetrâmero de hemoglobina de 1,75 mM ou 112 mg/ml. Concentrações elevadas de tetrâmero promovem a reticulação intermolecular dos tetrâmeros de hemoglobina. A hemoglobina é modificada na presença de tampão Tris 50 mM, pH 8,8, a 4°C. A hemoglobina é modificada pela adição de adipimidato de dimetilo em quantidades equimolares (i.e., adipimidato de dimetilo 1,75 mM e tetrâmero de hemoglobina 1,75 mM). O tratamento com adipimidato de dimetilo repete-se oito vezes em intervalos de 30 minutos a 4°C. Para cada aplicação são adicionados à solução de hemoglobina, 50 mg/ml de uma solução de adipimidato de dimetilo em carbonato de sódio 0,025 M, pH 9,25 até uma concentração final de 1,75 mM. A solução de hemoglobina é agitada em vórtex durante a adição do reagente reticulante e

73 233 TUC 4675.1 Portugal -23-depois incubada em gelo durante 30 min. Após 30 minutos, foi retirada uma amostra de 0,4 ml e adicionada a 4 ml de fosfato de sódio 0,25 M, pH 7,0. 0 tampão de fosfato interrompe a reacção de reticulação por hidrólise do imidoéster. A interrupção é realizada durante duas horas à temperatura ambiente. A solução de hemoglobina remanescente é deixada reagir de novo com uma solução fresca do agente de reticulação. São realizados oito ciclos de reacção durante 3,5 horas. Nesta experiência utilizou-se o imidoéster específico adipimidato de dimetilo. Podiam também ser utilizados outros imidoésteres.

Exemplo 5 - HPLC de exclusão por tamanhos da hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo A concentração de hemoglobina foi determinada espectrofotometricamente determinada utilizando os coeficientes de extinção publicados (Benesch, R.E., Benesch R., S. Yung (1973) Eguations for the spectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures, Analyt. Biochem. 55: 245-48). Os produtos de reacção foram monitorizados após cada adição do reticulador utilizando a HPLC de exclusão por tamanhos (SEC-HPLC). O produto da reacção interrompida foi diluído para 1 mg de tetrâmero de hemoglobina por ml em fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0. 0 produto diluído foi analisado por SEC-HPLC em dois modos separados. 0 primeiro foi numa coluna Zorbax GF-250 SEC (Dupont) equilibrada com fosfato de sódio 0,2 M, pH 7,0 e operada a 1 ml/min. O segundo foi numa coluna de FPLC de Superose 12 (Pharmacia) equilibrada em fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0. As duas colunas foram calibradas com proteínas de massa molecular conhecida.

As iterações sucessivas da reticulação com adipimidato de dimetilo resultaram num aumento progressivo na quantidade de hemoglobina, tetrâmero estabilizado, polimerizada. As gamas de massas moleculares podiam ser definidas em SEC-HPLC Superose 12 como se segue: 1) % >400 000 daltons, 2) % >64 000 daltons e <400 000 daltons, e 3) % <64 OOO daltons. Após quatro iterações de reticulação os valores em percentagem relativa eram de 1) 0%, 2) 40,64%, 3) 59,36%. Após sete iterações os valores em 73 233 TUC 4675.1 Portugal -24-percentagem eram de 1) 4,1%, 2) 50,4% e 3) 45,5%. Após oito iterações os valores em percentagem eram de l) 7,5%, 2) 50,6% e 3) 41,9%. O pico da classe 3 com um valor de massa molecular inferior a 64 000 daltons consistia num único pico simétrico com uma massa molecular de 30 000 daltons. Esta fracção co-eluiu com a hemoglobina de bovino não modificada e pensa-se que consiste principalmente no dimero de hemoglobina, o teor em meta-hemoglobina da hemoglobina após sete iterações de reticulação foi <2,5%. 0 espectro vísivel da hemoglobina reticulada assemelha-se ao da hemoglobina de bovino não modificada.

Exemplo 6 - Electroforese em gel de SDS noliacrilamida da hemoglobina reticulada

A electroforese em gel de dodecilsulfato de sódio-poliacrilamida (SDS-PAGE) foi realizada em amostras de hemoglobina reticulada e não reticulada, como descrito. As amostras de hemoglobina foram diluídas a 2 mg/ml em fosfato de sódio 0,005 M, pH 7,4, NaCl 0,15 e as amostras diluídas foram misturadas com três partes de um tampão de gel-SDS padrão seguida por incubação a 37°C durante 3 horas. As amostras foram operadas em mini-geles ISS a 10-20% na forma não reduzida. A SDS-PAGE da hemoglobina reticulada após 7 iterações de reticulação indicou que 80% da amostra estava reticulada entre as subunidades. Estavam presentes, pelo menos, oito multímeros de massa molecular da subunidade, todos em proporção aproximadamente igual.

Exemplo 7 - Equilíbrio do oxigénio da hemoglobina de bovino reticulada e não reticulada

Foi determinada uma medida de oxigénio em equilíbrio para a hemoglobina de bovino reticulada e não reticulada utilizando um instrumento Hemoxanalyzer da TCS Medicai Industries. Após sete iterações de reacção com adipimidato de dimetilo, uma amostra de hemoglobina reticulada foi diluida para 1,5 mg/ml em solução salina tamponada com fosfato, pH 7,4, e submetida a análise. Foram também analisadas sob condições idênticas uma amostra de 73 233 TUC 4675.1 Portugal -25- hemoglobina de bovino não modificada e uma amostra de hemoglobina de bovino que tinha sido reticulada no laboratório com glutaraldeído utilizando processos descritos (Guillochon, D. et al.. (1986) Effect of glutaraldehyde on hemoglobin, Biochem. Pharm. 35: 317-23). Os valores de P50 (pressão parcial de oxigénio a semi-saturação) para a espécie de hemoglobina foram de: 1800 Pa (13,5 mmHg) para a hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo, 1900 Pa (14,25 mmHg) para a hemoglobina reticulada com glutaraldeido e 3166 Pa (23,75 mmHg) para a hemoglobina de bovino não modificada.

Exemplo 8 - Estudos de estabilidade na hemoglobina de bovino reticulada e não reticulada

J

A hemoglobina de bovino que tinha sido submetida a sete iterações de reticulação com adipimidato de dimetilo, a hemoglobina de bovino não modificada e a hemoglobina reticulada com glutaraldeído foram submetidas a incubação a 36-37eC em fosfato de sódio 0,125 M, pH 7,1. As concentrações de hemoglobina eram de 40 mg/ml para a hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo e para a hemoglobina de bovino não modificada, e 28 mg/ml para a hemoglobina de bovino reticulada com glutaraldeído. A certos intervalos de tempo foram removidas amostras de cada espécie de hemoglobina, diluídas a 1/100 em tampão de fosfato de sódio 0,25 M, pH 7,3 e analisadas entre 680 nm e 420 nm num espectrofotómetro de análise em UV-visível Shimadzu Modelo 160. 0 teor em meta-hemoglobina foi determinado por análise de cada espectro utilizando as equações publicadas (Benesch, R.E. et al.. (1973) Equations for de spectrophotometric analysis of hemoglobin mixtures, Anal. Biochem. 55: 245-48). Os espectros foram registados a 22°C. A hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo e a hemoglobina reticulada com glutaraldeído foram também incubadas a 4°c durante um período de tempo mais prolongado. Foram retiradas amostras a vários intervalos de tempo e o teor em meta-hemoglobina foi determinado como descrito acima. 73 233 TUC 4675.1 Portugal -26-

Na incubação a 36-37°C7 as amostras de hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo, reticulada com glutaraldeído e não modificada tinham 2,5%, 8f0% e 3,5% de meta-hemoglobina, respectivamente, no início da incubação. Após 5 horas a 36-37°C as percentagens de meta-hemoglobina eram de 8,9%, 44,4% e 8%, respectivamente, para as amostras de hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo, reticulada com glutaraldeído e não modificada, respectivamente. Após 24 horas, as concentrações de meta-hemoglobina eram de 24,1, 87,9 e 42% para as amostras de hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo, reticulada com glutaraldeído e não modificada, respectivamente. Após 48 horas, as concentrações de meta-hemoglobina nas amostras de hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo e não reticulada eram de 46,5% e 68%, respectivamente. A hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo é mais estável à formação de meta-hemoglobina do que a hemoglobina de bovino não modificada a 36-37°C. A literatura descreve que a hemoglobina humana reticulada com glutaraldeído auto-oxida-se a uma velocidade quatro vezes superior à da hemoglobina humana não modificada (Guillochon, D. et al.. (1986) Effect of glutaraldehyde on hemoglobin, Biochem. Pharm. 35: 317-23). Não se esperava que a hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo fosse mais estável do que a hemoglobina de bovino não modificada, relativamente à auto-oxidação. A estabilidade da hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo e reticulada com glutaraldeído à autooxidação foi também medida após incubação durante 28 dias a 4'C no mesmo tampão de fosfato que o descrito acima. Após 28 dias a hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo aumentou de 2,5% para 9,6% de meta-hemoglobina. Durante o mesmo período de tempo a hemoglobina reticulada com glutaraldeído aumentou de 8,0% para 23,5% de meta-hemoglobina.

Exemolo 9 - Cromatoorafia de exclusão por tamanhos preparativa da hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo A cromatografia de exclusão por tamanhos preparativa foi

73 233 TUC 4675.1 Portugal -27- utilizada para remover as espécies de baixa massa molecular, i.e. < 64 000 daltons, da hemoglobina de bovino reticulada com adipimidato de dimetilo. A hemoglobina reticulada com adipimidato de dimetilo, 40 mg/ml, foi aplicada a uma coluna de 2,5 x 90 cm de Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) equilibrada em fosfato de sódio 0,025 M, NaCl 0,15 M, pH 7,4, a 4°C. O volume de carga foi de 1% do volume de leito da coluna, e o caudal foi de 0,45 ml/min. Os picos da cromatografia foram reunidos e as amostras reunidas foram analisadas por SEC-HPLC numa coluna Superose 12 (como descrito acima) para determinar a distribuição de massa molecular da espécie de hemoglobina. A amostra de pré-coluna ou de carga foi também analisada numa coluna Superose 12. A cromatografia de exclusão por tamanhos preparativa separou a hemoglobina reticulada por DMA em duas fracções principais. A fracção 1 continha a espécie de hemoglobina reticulada de maior massa molecular e representava 51,3% da hemoglobina recuperada total. A fracção 2 continha a hemoglobina reticulada de massa molecular inferior a 64 000. A SEC-HPLC da fracção de hemoglobina reticulada de pré-coluna indicou que esta continha 2,6% como >400 000 daltons, 47,2% >64 000 daltons e 50,2% <64 000 daltons. A partir da SEC-HPLC analítica, a fracção 1 purificada por cromatografia de exclusão por tamanhos preparativa continha 4,7% como >400 000 daltons, 92,7% como >64 000 daltons e 2,6% como <64 000 daltons. Este processo foi bem sucedido na remoção da espécie de hemoglobina de massa molecular mais baixa.

Claims

73 233 TUC 4675.1 Portugal -28- REIVINDICACÕES 1 - Processo de preparação de uma composição de hemoglobina reticulada útil para transportar oxigénio, caracterizado por compreender a reticulação de um lisado de hemoglobina purificado com um imidoéster a um pH de, pelo menos, 8,0, numa solução de polimerização compreendendo o tampão Tris-HCl, pelo que a referida hemoglobina reticulada tem um peso molecular de, predominantemente, 64 000 e uma P50 de, pelo menos, 1732,90 Pa 13 (mm Hg).
2 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida solução de polimerização incluir NaCl.
3 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido pH ser de 8,0 a cerca de 12,0.
4 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida solução de polimerização conter 50 mM de Tris-HCl e de cerca de 0,1 a cerca de 2,0 M de NaCl.
5 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido lisado de hemoglobina purificado ser desoxigenado.
6 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir a remoção da hemoglobina de baixo peso molecular por exclusão por tamanhos.
7 - Processo de acordo com a reivindicação 6, caracterizado por a referida exclusão por tamanhos ser efectuada por cromato-grafia.
8 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por o referido imidoéster ser adipimidato de dimetilo ou suberi-midato de dimetilo.
9 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por a referida polimerização ser realizada por tratamentos repetidos da referida hemoglobina purificada com quantidades equimo- -29- 73 233 TUC 4675.1 Portugal lares do referido imidoéster.
10 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos 80% da referida hemoglobina reticulada ter um peso molecular de, pelo menos, 64 000.
11 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por pelo menos 95% da referida hemoglobina reticulada ter vim peso molecular de, pelo menos, 64 000.
12 - Processo de acordo com a reivindicação 1, caracterizado por incluir a adição de um meio portador farmaceuticamente aceitável.
13 - Processo de acordo com a reivindicação 12, caracterizado por o referido meio portador farmaceuticamente aceitável ser água purificada ou solução salina. Lisboa, m 1991 Por THE UPJOHN COMPANY