HUT64571A - A method for producing hemoglobin preparatives containing imido ester cross bind - Google Patents
A method for producing hemoglobin preparatives containing imido ester cross bind Download PDFInfo
- Publication number
- HUT64571A HUT64571A HU9301563A HU156393A HUT64571A HU T64571 A HUT64571 A HU T64571A HU 9301563 A HU9301563 A HU 9301563A HU 156393 A HU156393 A HU 156393A HU T64571 A HUT64571 A HU T64571A
- Authority
- HU
- Hungary
- Prior art keywords
- hemoglobin
- crosslinked
- cross
- linked
- adipic acid
- Prior art date
Links
- 108010054147 Hemoglobins Proteins 0.000 title claims description 270
- 102000001554 Hemoglobins Human genes 0.000 title claims description 270
- 150000002463 imidates Chemical class 0.000 title claims description 29
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title description 6
- CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N ethyl 3-(6-hydroxynaphthalen-2-yl)-1H-indazole-5-carboximidate dihydrochloride Chemical compound Cl.Cl.C1=C(O)C=CC2=CC(C3=NNC4=CC=C(C=C43)C(=N)OCC)=CC=C21 CEIPQQODRKXDSB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 60
- BTVZFIIHBJWMOG-UHFFFAOYSA-N 2,2-dimethylhexanedioic acid Chemical group OC(=O)C(C)(C)CCCC(O)=O BTVZFIIHBJWMOG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 58
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 33
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 32
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 31
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 claims description 31
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 claims description 31
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 20
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 claims description 18
- 230000008569 process Effects 0.000 claims description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims description 15
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims description 9
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 claims description 8
- 239000006166 lysate Substances 0.000 claims description 8
- 238000004587 chromatography analysis Methods 0.000 claims description 7
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 claims description 7
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 claims description 6
- 230000007717 exclusion Effects 0.000 claims description 6
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 5
- 239000008213 purified water Substances 0.000 claims description 2
- 238000004132 cross linking Methods 0.000 description 40
- 210000003743 erythrocyte Anatomy 0.000 description 36
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 30
- 244000309466 calf Species 0.000 description 26
- SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N Glutaraldehyde Chemical compound O=CCCCC=O SXRSQZLOMIGNAQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 25
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 23
- LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N tris Chemical compound OCC(N)(CO)CO LENZDBCJOHFCAS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 16
- 239000007983 Tris buffer Substances 0.000 description 15
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 15
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 15
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 13
- HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M Sodium hydroxide Chemical compound [OH-].[Na+] HEMHJVSKTPXQMS-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 12
- 238000005571 anion exchange chromatography Methods 0.000 description 11
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 11
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 11
- INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 2-(furan-2-yl)-7-methyl-1h-1,8-naphthyridin-4-one Chemical compound N=1C2=NC(C)=CC=C2C(O)=CC=1C1=CC=CO1 INGWEZCOABYORO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000005277 cation exchange chromatography Methods 0.000 description 9
- 239000002158 endotoxin Substances 0.000 description 9
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 9
- 241000894007 species Species 0.000 description 9
- 239000012614 Q-Sepharose Substances 0.000 description 8
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 8
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 8
- 239000003431 cross linking reagent Substances 0.000 description 8
- 239000012535 impurity Substances 0.000 description 8
- 150000003904 phospholipids Chemical class 0.000 description 8
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 8
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 description 8
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 description 8
- 239000001488 sodium phosphate Substances 0.000 description 8
- 229910000162 sodium phosphate Inorganic materials 0.000 description 8
- RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K trisodium phosphate Chemical compound [Na+].[Na+].[Na+].[O-]P([O-])([O-])=O RYFMWSXOAZQYPI-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 8
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 8
- 238000011068 loading method Methods 0.000 description 7
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 7
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 6
- 241000700605 Viruses Species 0.000 description 6
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 6
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 6
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 6
- 238000000108 ultra-filtration Methods 0.000 description 6
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 6
- XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N Iron Chemical group [Fe] XEEYBQQBJWHFJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 150000001450 anions Chemical class 0.000 description 5
- OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N bis-tris Chemical compound OCCN(CCO)C(CO)(CO)CO OWMVSZAMULFTJU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- -1 dimethyl adipic acid imidate esters Chemical class 0.000 description 5
- 238000010828 elution Methods 0.000 description 5
- 238000001802 infusion Methods 0.000 description 5
- 235000018977 lysine Nutrition 0.000 description 5
- 125000003588 lysine group Chemical group [H]N([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])([H])C([H])(N([H])[H])C(*)=O 0.000 description 5
- 238000001471 micro-filtration Methods 0.000 description 5
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 5
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 5
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 4
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 4
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L Sodium Carbonate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]C([O-])=O CDBYLPFSWZWCQE-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 125000003277 amino group Chemical group 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- 239000003633 blood substitute Substances 0.000 description 4
- 150000001768 cations Chemical class 0.000 description 4
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 239000000539 dimer Substances 0.000 description 4
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 4
- 238000001914 filtration Methods 0.000 description 4
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 4
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 4
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 4
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 4
- 239000000463 material Substances 0.000 description 4
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 4
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 4
- 238000001542 size-exclusion chromatography Methods 0.000 description 4
- 239000012064 sodium phosphate buffer Substances 0.000 description 4
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 4
- 239000004472 Lysine Substances 0.000 description 3
- KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N Lysine Natural products NCCCCC(N)C(O)=O KDXKERNSBIXSRK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108010061951 Methemoglobin Proteins 0.000 description 3
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000002835 absorbance Methods 0.000 description 3
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 3
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 3
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 3
- 150000003278 haem Chemical group 0.000 description 3
- 229910052742 iron Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000002934 lysing effect Effects 0.000 description 3
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 description 3
- 239000000047 product Substances 0.000 description 3
- 239000011347 resin Substances 0.000 description 3
- 229920005989 resin Polymers 0.000 description 3
- 238000002415 sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 3
- 239000004971 Cross linker Substances 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N N-cyclohexyl-2-aminoethanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCNC1CCCCC1 MKWKNSIESPFAQN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108010016797 Sickle Hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 2
- 239000012491 analyte Substances 0.000 description 2
- 229940124574 antisickling agent Drugs 0.000 description 2
- 239000003939 antisickling agent Substances 0.000 description 2
- 230000001588 bifunctional effect Effects 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- 239000000356 contaminant Substances 0.000 description 2
- 238000002425 crystallisation Methods 0.000 description 2
- 230000008025 crystallization Effects 0.000 description 2
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 2
- 230000003247 decreasing effect Effects 0.000 description 2
- ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N dimethyl hexanediimidate Chemical compound COC(=N)CCCCC(=N)OC ZLFRJHOBQVVTOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 210000003734 kidney Anatomy 0.000 description 2
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 231100000417 nephrotoxicity Toxicity 0.000 description 2
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 2
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 2
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 2
- 239000003058 plasma substitute Substances 0.000 description 2
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 2
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 2
- 239000002510 pyrogen Substances 0.000 description 2
- 238000011084 recovery Methods 0.000 description 2
- 150000003839 salts Chemical class 0.000 description 2
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 2
- 229910000029 sodium carbonate Inorganic materials 0.000 description 2
- 238000002798 spectrophotometry method Methods 0.000 description 2
- 238000001228 spectrum Methods 0.000 description 2
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 2
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 2
- 108010001708 stroma free hemoglobin Proteins 0.000 description 2
- SGTOKVHOVUZTIK-OWOJBTEDSA-N (e)-4-[(3,5-dibromo-2-hydroxyphenyl)methoxy]-4-oxobut-2-enoic acid Chemical compound OC(=O)\C=C\C(=O)OCC1=CC(Br)=CC(Br)=C1O SGTOKVHOVUZTIK-OWOJBTEDSA-N 0.000 description 1
- 229940058020 2-amino-2-methyl-1-propanol Drugs 0.000 description 1
- IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 2-aminoacetic acid;hydron;chloride Chemical compound Cl.NCC(O)=O IVLXQGJVBGMLRR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxyethylazanium;chloride Chemical compound Cl.NCCO PMUNIMVZCACZBB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 2-hydroxypropane-1-sulfonic acid Chemical compound CC(O)CS(O)(=O)=O HSXUNHYXJWDLDK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 3-(cyclohexylamino)-2-hydroxy-1-propanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CC(O)CNC1CCCCC1 INEWUCPYEUEQTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 7028-40-2 Chemical compound CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O.CC(O)=O BDDLHHRCDSJVKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- GVNWZKBFMFUVNX-UHFFFAOYSA-N Adipamide Chemical compound NC(=O)CCCCC(N)=O GVNWZKBFMFUVNX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108091006522 Anion exchangers Proteins 0.000 description 1
- 239000008000 CHES buffer Substances 0.000 description 1
- VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M Chloride anion Chemical compound [Cl-] VEXZGXHMUGYJMC-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N Cyclohexylaminopropanesulfonic acid Chemical compound OS(=O)(=O)CCCNC1CCCCC1 PJWWRFATQTVXHA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 1
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 1
- VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N Ethene Chemical compound C=C VGGSQFUCUMXWEO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 239000005977 Ethylene Substances 0.000 description 1
- 108010085682 Hemoglobin A Proteins 0.000 description 1
- 102000007513 Hemoglobin A Human genes 0.000 description 1
- 108010081925 Hemoglobin Subunits Proteins 0.000 description 1
- 239000005909 Kieselgur Substances 0.000 description 1
- 241000239218 Limulus Species 0.000 description 1
- 241000940612 Medina Species 0.000 description 1
- 206010029155 Nephropathy toxic Diseases 0.000 description 1
- 229920002302 Nylon 6,6 Polymers 0.000 description 1
- 239000012506 Sephacryl® Substances 0.000 description 1
- 229920002684 Sepharose Polymers 0.000 description 1
- 239000000654 additive Substances 0.000 description 1
- 230000003281 allosteric effect Effects 0.000 description 1
- 239000012637 allosteric effector Substances 0.000 description 1
- 150000001409 amidines Chemical class 0.000 description 1
- 150000001412 amines Chemical group 0.000 description 1
- CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N aminomethyl propanol Chemical compound CC(C)(N)CO CBTVGIZVANVGBH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 238000005349 anion exchange Methods 0.000 description 1
- 239000003957 anion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 235000015278 beef Nutrition 0.000 description 1
- 230000008033 biological extinction Effects 0.000 description 1
- 239000010836 blood and blood product Substances 0.000 description 1
- 229940125691 blood product Drugs 0.000 description 1
- 239000002775 capsule Substances 0.000 description 1
- 125000002057 carboxymethyl group Chemical group [H]OC(=O)C([H])([H])[*] 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 238000005341 cation exchange Methods 0.000 description 1
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 1
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 238000010382 chemical cross-linking Methods 0.000 description 1
- 239000012501 chromatography medium Substances 0.000 description 1
- 238000002983 circular dichroism Methods 0.000 description 1
- 230000006378 damage Effects 0.000 description 1
- 238000006392 deoxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000003599 detergent Substances 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000010494 dissociation reaction Methods 0.000 description 1
- 230000005593 dissociations Effects 0.000 description 1
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 1
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 1
- 230000009977 dual effect Effects 0.000 description 1
- 108010072542 endotoxin binding proteins Proteins 0.000 description 1
- 238000011156 evaluation Methods 0.000 description 1
- 239000004744 fabric Substances 0.000 description 1
- 238000011049 filling Methods 0.000 description 1
- 238000009472 formulation Methods 0.000 description 1
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 1
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000002068 genetic effect Effects 0.000 description 1
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 1
- 102000018146 globin Human genes 0.000 description 1
- 108060003196 globin Proteins 0.000 description 1
- 230000001434 glomerular Effects 0.000 description 1
- 108010036302 hemoglobin AS Proteins 0.000 description 1
- ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N heparin Chemical compound CC(O)=N[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](COS(O)(=O)=O)O[C@@H]1O[C@@H]1[C@@H](C(O)=O)O[C@@H](O[C@H]2[C@@H]([C@@H](OS(O)(=O)=O)[C@@H](O[C@@H]3[C@@H](OC(O)[C@H](OS(O)(=O)=O)[C@H]3O)C(O)=O)O[C@@H]2O)CS(O)(=O)=O)[C@H](O)[C@H]1O ZFGMDIBRIDKWMY-PASTXAENSA-N 0.000 description 1
- 229920000669 heparin Polymers 0.000 description 1
- 238000004128 high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 238000000703 high-speed centrifugation Methods 0.000 description 1
- 229930195733 hydrocarbon Natural products 0.000 description 1
- 150000002430 hydrocarbons Chemical class 0.000 description 1
- 230000007062 hydrolysis Effects 0.000 description 1
- 238000006460 hydrolysis reaction Methods 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000013101 initial test Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 238000005342 ion exchange Methods 0.000 description 1
- 238000004255 ion exchange chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000003446 ligand Substances 0.000 description 1
- 230000010874 maintenance of protein location Effects 0.000 description 1
- 230000035800 maturation Effects 0.000 description 1
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 1
- MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N methamphetamine Chemical compound CN[C@@H](C)CC1=CC=CC=C1 MYWUZJCMWCOHBA-VIFPVBQESA-N 0.000 description 1
- 244000005700 microbiome Species 0.000 description 1
- 238000002156 mixing Methods 0.000 description 1
- 239000000178 monomer Substances 0.000 description 1
- 210000000885 nephron Anatomy 0.000 description 1
- 230000007694 nephrotoxicity Effects 0.000 description 1
- 238000005457 optimization Methods 0.000 description 1
- 150000002926 oxygen Chemical class 0.000 description 1
- 238000006213 oxygenation reaction Methods 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 238000002203 pretreatment Methods 0.000 description 1
- 238000001742 protein purification Methods 0.000 description 1
- 230000002797 proteolythic effect Effects 0.000 description 1
- 238000011046 pyrogen test Methods 0.000 description 1
- 238000010791 quenching Methods 0.000 description 1
- 230000000171 quenching effect Effects 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 230000013878 renal filtration Effects 0.000 description 1
- 238000009877 rendering Methods 0.000 description 1
- 208000007056 sickle cell anemia Diseases 0.000 description 1
- 238000003998 size exclusion chromatography high performance liquid chromatography Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 230000003068 static effect Effects 0.000 description 1
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 210000005239 tubule Anatomy 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 238000001429 visible spectrum Methods 0.000 description 1
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C07—ORGANIC CHEMISTRY
- C07K—PEPTIDES
- C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
- C07K14/795—Porphyrin- or corrin-ring-containing peptides
- C07K14/805—Haemoglobins; Myoglobins
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K38/00—Medicinal preparations containing peptides
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Gastroenterology & Hepatology (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)
Description
«4 A találmány tárgya új eljárás olyan, tisztított hemoglobin készítmény előállítására, amely alkalmas a vér helyettesítésére a humán vagy állati szervezetekben transzfúzió során vagy felhasználható oxigénszállító folyadékként. A keresztkötéses hemoglobintermék lényegében szennyeződésmentes, amennyiben csak nagyon kis mennyiségben tartalmaz bakteriális endotoxint és foszfolipidet.
A hemoglobin szerkezetét és funkcióját a korábbiakban már részletesen áttekintették [Bunn. H. F., and
B. G. Forget, Hemoglobin: Molecular, Génétic and Clinical Aspects, W. B. Saunders Company, Philadelphia, 690 pp. , (1986)]. Az emlős hemoglobin egy tetramer, amely két, egymástól eltérő, alfa és béta alegység két-két tagját tartalmazza. Mindegyik alegység hozzávetőleges molekulatömege 16000 és egy centrális vasatommal rendelkező hemcsoportot tartalmaz. A proteinrégió vagy globin a hemben lévő vasnak a redukált vagy ferro-állapotban tartását biztosítja, lehetőséget nyújtva arra, hogy a hemoglobinmolekula az oxigént reverzibilisen megkösse.
Az emlős hemoglobint nem egy olyan, statikus tetramerként kell elképzelni, amely egy 64000-68000 molekulatömegű egyetlen proteinfajta. Valójában kovalens kötésekkel egymáshoz kapcsolódó alegységekből épül fel, és monomer-dimer, valamint dimer-tetramer kölcsönhatásokat magában foglaló dinamikus egyensúlyban létezik.
• * · · ·
4. A hemoglobin mindenkor hozzávetőleg 16000 molekulatömegű monomerek, 32000 molekulatömegű dimerek és tetramerek meghatározott összetételéből áll. A monomer-, dimer- és tetramerfajták oldatban lévő eloszlása függ a hemoglobin koncentrációjától, a hemoglobin ligandállapotától, a pH- tói, valamint a hemoglobint tartalmazó oldat sóösszetételétől .
Az emlős hemoglobint a vörösvértestek vagy eritrociták tartalmazzák. Az emlősökben ezek a különleges sejtek az érés során elvesztették sejtmagjaikat, és más proteineket csak igen alacsony koncentrációban tartalmazva, egyszerűen csak a hemoglobin zsákjaiként funkcionálnak. A hemoglobin számos okból kifolyólag kapcsolódik a keringő eritrocitákhoz. Elsőként, ha a hemoglobin nem a sejtekben volna, hanem helyette szabadon, oldatban áramlana, a kapillárisfalakon, a vesén vagy egyéb helyeken történő átjutással igen könnyen kikerülne a keringésből. Bizonyos gerinctelen organizmusok ezt a problémát úgy oldották meg, hogy milliós nagyságrendben lévő molekülatömegű polimer hemoglobinokat fejlesztenek, amelyek túlságosan nagyok ahhoz, hogy átjussanak a kapillárisokon és a vese nefronján. A vörösvértestek által nyújtott további funkciók közé tartoznak például a következők: a védett környezet, amely a hemoglobin-molekulát megvédi a proteolitikus szérumproteinektől; a hemoglobin funkciójának ellátását lehetővé tevő ionegyensúly fenntartása; a hemben lévő vas « ♦· ·**· • ·«· ··· · « • 9 9 9 ··· ··· ·«· «·· ·««· redukált (funkciós) állapotban tartását biztosító enzimrendszer; valamint az allosztérikus effektor (végrehajtó) molekulák jelenlétének irányítása (kontrollja).
F»
A humán szervezetben végzett transzfúzió során alkalmazott vér -helyettesítésére alkalmas tisztított, sztrómamentes hemoglobinoldatok előállítására igen jelentős erőfeszítések történtek már a korábbiakban. [Blood 4: 380-385, (1949); Rabiner, S. F., Helbert, J. R. , Lopás, H. , and L. H. Friedman, Evaluation of a stroma-free hemoglobin solution fór use as a plasma expander. J. Exp. Med. 126: 1127-1142 (1967); Christensen, S. M. , Medina,
F., Winslow, R. W., Snell, S. M. , Zegna, A., and M. A. Marini, Preparation of humán hemoglobin Ao fór possible use as a blood substitute. J. Biochem. Biophys. Meth. 17: 143-154 (1988); és Feola, M., Gonzalez, H., Canizaro, P. C. , Bingham, D. and P. Periman, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute. Surg. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983)]. Ezekben az oldatokban a hemoglobin egy módosítás nélküli állapotban van, s a hemoglobin szabadon az alegységeivé disszociáltat. A módosítatlan hemoglobin infúziója a hemoglobinnak a keringésből történő gyors kiválásához vezet. Ezen túlmenően a módosítás nélküli hemoglobin infúziója - a beszámolók szerint - számos káros hatással jár a szervezetben, többek között vesemérgezést okoz. A módosítatlan hemoglobinnal összefüggésben álló nefrotoxicitás annak kimondására kényszerítette az Amerikai Egyesült « 4 * ·«· ·
«· ··♦
Államok hivatalos hatóságát (Center fór Biologics Evaluation and Research of the U.S. Food and Drug Administration), hogy a hemoglobin alapú oxigénszállítókban megtiltsa a módosítatlan hemoglobin jelenlétét.
A hemoglobinoldatoknak a hemoglobin polipeptidláncai közötti kovalens kémiai kötések kialakításával történő stabilizálását számos közlemény leírja [Rausch,
C. W. , and M. Feola, Extra pure semi-synthetic blood substitute, PCT/US87/02967. bejelentési és WO/88/03408. közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (1988. 05. 19.); Bonhard, K. , and N. Kothe, Cross-linked hemoglobin of extended shelf life and high oxigén transport capacity and process fór preparing same, 4,777,244. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás; Bucci, E. , Razynska, A., Urbaitis, B. , and C. Fronticelli, Pseudo cross-link of humán hemoglobin with mono(3,5-dibromosalicyl)fumarate. J. Bioi. Chem. 264 : 61916195 (1989); valamint a 4,001,200. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás].
Keresztkötéses hemoglobin készítményeket ismertettek a korábbiakban a 4,001,200., a 4,011,401., a 4,053,590. és a 4,061,736. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírásban.
A keresztkötéses borjú (bovine) hemoglobint és annak előállítását írják le a következő helyeken: Feola,
M. , Gonzalez, H., Canizaro, P. C. , Bingham, D. and P.
Periman, Development of a bovine stroma-free hemoglobin solution as a blood substitute. Surg. Gyn. Obst. 157: 399-408 (1983); és a PCT/US87/02967. bejelentési és WO/88/03408. közzétételi számú nemzetközi szabadalmi bejelentés (1988. 05. 19.).
A dimetil-adipinsav-imidát és normál humán hemoglobin (HbA), valamint sarlósejtes hemoglobin (HbS) reakcióit ismertetik a következő helyen: Plese, C. F., and E. L. Amma, Circular dichroism as a probe of the allosteric R-T transformation in hemoglobins and modified hemoglobins (1977). A 3,925,344. számú amerikai egyesült államokbeli szabadalmi leírás egy plazmaprotein anyag vagy plazmaexpander előállításához imidoészterekkel kialakított keresztkötéses hemoglobint ír le; ugyanakkor ez az anyag nem felel meg oxigénszállító folyadékként. Beszámoltak arról, hogy az imidoészterekkel (DMA) végzett térhálósítás megnöveli az oxigénnek az affinitását a hemoglobinhoz, amely alkalmatlanná teszi ezáltal a hemoglobint az oxigén szállítására és annak felszabadítására [Pennathur-Das, R. , Heath, R. H., Mentzer, W. C. , and B. H. Lubin, Modification of hemoglobin S with dimethyl adipimidate - Contribution of individual reacted subunits to changes in properties, Biochim. Biophys. Acta 704: 389-397 (1982); Pennathur-Das, R. , Vickery, L. E., Mentzer, W. C., and B. H. Lubin, Modification of hemoglobin A with dimethyl adipimidate Contribution of individual reacted subunits to changes in • · · oxygen affinity, Biochim. Biophys. Acta 580: 356-365 (1979)].
A korábbiakból következően szükség van a térhálósított hemoglobin előállításához egy olyan eljárásra, amely a hemoglobint stabilizálja, elsősorban tetramer formában, illetve többszörös tetramer formában, oly módon azonban, hogy az előállított keresztkötéses hemoglobin még olyan P50 értékkel (P50 a féltelítésnél mért parciális oxigénnyomás) és oxigénaffinitással rendelkezzen, amely kellőképpen alacsony az oxigénnek egy élő szervezetben történő szállításához, majd az oxigénnek a sejt számára történő felszabadításához. Lényeges tehát, hogy a molekulatömeg túlnyomóan legalább 64000 legyen (ami a hemoglobin tetramer formájának felel meg), kevés 64000-nél kisebb molekulatömeggel, azaz dimer vagy monomer formával, és kevés 64000-nél nagyobb molekulatömeggel együtt, amely molekulák kellőképpen nagyok ahhoz, hogy az emlős szervezetekben előnyös hatást váltsanak ki. Egy ilyen polimerizációs eljárásnak a kifejlesztése rendkívül kívánatos volna annak érdekében, hogy egy eredményes oxigénszállító helyettesítőt találjunk.
A találmány egyik tárgya egy olyan stabil, térhálósított hemoglobin készítmény, amely alkalmas az oxigén szállítására és felszabadítására az élő sejtekben. A hemoglobin lényegében szennyeződésektől mentes, s a • * · V · · · • · térhálósítást egy imidoészterrel végezzük, miáltal a hemoglobin túlnyomórészt tetramer vagy annál nagyobb fór mákban van jelen. A hemoglobin keresztkötéseinek kialakítására alkalmas előnyös r· tozik a dimetil-adipinsav-imidát imidoészterek közé tarés a dimetil-parafasav-imidát. Tetramer vagy annál nagyobb formában lévő hemoglobinnak az tekinthető, amelyben a keresztkötéses hemoglobin legalább 80 %-a legalább
64000 dalton molekulatömeggel rendelkezik, még előnyösebben a keresztkötéses hemoglobin legalább 90-95 %-a legalább
64000 dalton molekulatömeggel rendelkezik. Ezen túlmenően az imidoészter keresztkötéses hemoglobin a methemoglobinhoz képest rendkívül stabil, valamint legalább
1,733 kPa (13 Hgmm) értékű oxigénaffinitással (P50) rendelkezik.
A kezelt emlős szervezetbe történő transzfúzió vagy injekció bejuttatásának elősegítésére vagy oxigénszállító folyadékként az analitikai, transzplantációs vagy laboratóriumi felhasználásra a keresztkötéses hemoglobin készítmény magában foglalhat egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközeget is. A jellegzetes, gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközegek közé tartozik a víz és a szalinoldat.
• · · · • · · · · · • · • · · · · ·
A találmány további tárgyát képezi egy eljárás keresztkötéses hemoglobin készítmény előállítására, amelynek során:
a) emlős vért gyűjtünk be,
b) a vörösvértesteket a begyűjtött vérből elkülönítjük és a vörösvértesteket mossuk,
c) a mosott vörösvértesteket lizáljuk,
d) a hemoglobin lizátum kinyeréséhez a lizált vörösvértesteket centrifugáljuk,
e) a lizátumot anioncserélő vagy kationcserélő kromatográfiával tisztítjuk,
f) a tisztított hemoglobin kinyerésére a kromatográf iából kapott eluált lizátumot ultrafiltrálásnak vagy mikrofiltrálásnak vetjük alá, és
g) a túlnyomórészt tetramer formában lévő hemoglobin kinyerésére a tisztított hemoglobint egy imidoészterrel térhálósítjuk.
A vörösvértestek feloldását (lizálását) hipoozmotikus sokk segítségével végezhetjük. Az ultrafiltrálást jellegzetesen egy 300000 molekulatömegü membránnal, míg a mikrofiltrálást általában egy körülbelül 0,025 mikrométer és körülbelül 0,040 mikrométer közötti méretű szűrővel végezzük. Alternatív módon az imidoészterrel végzett térhálósítási (g) lépést elvégezhetjük a (d) lépésben nyert hemoglobin lizátummal, • · · ·
| • · ·· ··· · · 10 ··· ·’·’ ···* ....... | |
| miáltal az | (e) lépés a keresztkötéses hemoglobin |
tisztításával kezdődik. Az eljárás magában foglalhat egy további, (h) lépést is, amelynek során a tisztított, térhálósított hemoglobint affinitáskromatografáljuk (méretkizárásnak vetjük alá), miáltal az alacsony
| (kisebb, mint | 64000 dalton) molekulatömegű hemoglobint |
eltávolítjuk. Szokásosan a méretkizárást alacsony nyomású affinitáskromatográfiával végezzük.
A találmány egy olyan, imidoészter keresztkötéses hemoglobin készítményt ismertet, amely lényegében szennyeződésmentes, továbbá alapvetően tetramer vagy annél nagyobb formában van, s a hagyo mányos, például glutáraldehiddel térhálósított hemoglobinnál jobb stabilitással rendelkezik a hemoglobin oxidációjával szemben.
A hemoglobin készítmény túlnyomórészben legalább
64000 dalton értékű molekulatömeggel és fokozott keresztkötés-stabilitással rendelkezik. A hemoglobin megfelel a véroxigén szállításának helyettesítőjeként az emlősökben vagy általánosan mint oxigénszállító folyadék.
A találmány eljárást ismertet hemoglobin tisztítására és térhálósítására olyan imidoészterekkel, amelyeket korábban még nem alkalmaztak a hemoglobin keresztkötéseinek kialakítására transzfúziós gyógyászati készítményként történő alkalmazás céljával. Ezek a bifunkciós imidoészter térhálósító anyagok egyebek között • ··
magukban foglalják a dimetil-adipinsav-imidátot és a dimetil-parafasav-imidátot. A korábbiakban már alkalmazott hemoglobin térhálósító szerekhez viszonyítva az előbbi térhálósító anyagok jelentős előnyökkel rendelkeznek. Az általunk alkalmazott reakciókörülmények egy szűk molekulatömeg-eloszlást biztosítanak és lehetővé teszik az oxigén szállítását.
Az imidoészterek, amilyen például a dimetil-adipinsav-imidát és a dimetil-parafasav-imidát, kétfunkciós térhálósító reagensek, amelyek specifikusan és gyorsan reagálnak, enyhe körülmények között. Stabil amidin adduktokat képeznek a lizincsoport epszilon-amino-csoportjaival és a polipeptidláncok aminoterminális aminjával [Wold, F. (1972) Bifunctional reagents. Methods in Enz. 25: 623-651; Peters, K. , and F. M. Richards (1977) Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membráné structure. Ann. Rév. Biochem. 46: 523-551]. A térhálósító reagens jellegzetesen egy-két aminocsoporttal reagál hemoglobin alegységenként. Néhány keresztkötés a két béta lánc lizincsoport (béta-82) között fordul elő, s ez stabilizálja a humán hemoglobin tetramer formáját. A hemoglobin S számára sarlóséjtellenes (antisickling) ágensként történő alkalmazásban már vizsgálták a dimetil-adipinsav-imidátot [Lubin, B. H., Pena, V., Mentzer, W. C., Bymun, E., Bradley, T. B., and L. Packer (1975) Dimethyl adipimidate: a new antisickling agent. Proc. Natl. Acad. U.S.A. 72: 43-46]. A béta-82 lizin módosítása megváltoztatja a HbS dezoxigenált formájának konformációját, s ily módon megakadályozza annak kristályosodását vagy gélesedését. A kristályosodás jelenti a beteg vörösvértestek formájában megjelenő sarlósejtes jelenség molekuláris alapját. Jóllehet a sarlósejtes megbetegedés meggátlásához a béta-82 lizin térhálósító szerrel történő módosítása szükséges, egy hemoglobin tetrameren belül a két béta-82 lizin adott keresztkötésére nincs szükség. A jelen találmányban a dimetil-adipinsav-imidátot alkalmazzuk borjú hemoglobin esetén, azzal a szándékkal, hogy egyrészt a béta-82 lizinek közé alegységek közötti keresztkötések bevezetésével stabilizált tetramereket alakítsunk ki, másrészt a szeparált, stabilizált hemoglobin tetramerek epszilon-amino-csoportjai közötti intermolekuláris keresztkötések bevezetésével stabilizált tetramerek nagy molekulatömegű aggregátumait képezzük.
Az imidoészterek, és különösen a dimetil-adipinsav-imidát alkalmazásával végzett hemoglobin térhálósítás kettős előnnyel jár.
Először, a keresztkötés meggátolja a
64000 molekulatömegű tetramer hemoglobin
32000 molekulatömegű dimerekre történő disszociációját. A módosítatlan hemoglobinban a tetramer és dimer fajták dinamikus egyensúlyban vannak. Az imidoészterekkel végzett térhálósítás útján a tetramer hemoglobin stabilizációja alapvetően • ······· a ·« ·· · · «· · • ··· ··· · a ··· ··· ··· ··· ···· lecsökkenti a hemoglobin átjutását a vesetubulusokba, azáltal, hogy megakadályozza az átszűrődést a glomeruláris kapszulák membránján keresztül.
Másodszor, a térhálósítás a hemoglobin tetramerek olyan, nagy molekulatömegű oligomerjeit eredményezi, amelyek különösen ellenállók a veseszűréssel szemben, s fiziológiás hőmérsékleten az oxidációval szemben lényegesen stabilabbak, mint akár a módosítatlan hemoglobin, akár a glutáraldehid térhálósító szerrel módosított hemoglobin.
A dimetil-adipinsav-imidát viszonylag olcsó, s nagy mennyiségekben is hozzáférhető reagens. A dimetil-adipinsav-imidát alkalmazásával végzett eljárás alkalmas nagyobb méretekben történő végrehajtásra is, azaz az ipari felhasználásra.
Megvizsgáltuk és mértük a borjú hemoglobin különböző formáinak az oxigénkötő tulajdonságait. Az eredményeket az I. Táblázatban tüntettük fel. A P50 az a parciális oxigénnyomás, amelynél a lehetséges helyek 50 %-a köt meg oxigént. A Hill-koefficiens vagy n érték az oxigénkötő helyek közötti együttműködési készség kifejezése; a magas n érték nagyfokú együttműködésre utal. A P50 értékeket egyaránt mértük a hemoglobinoldat oxigenálásának és dezoxigenálásának ideje alatt. A fő P50 értékek a következők voltak: 1,80 kPa (13,5 Hgmm) a
dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított hemoglobin esetén; 1,90 kPa (14,25 Hgmm) a glutáraldehiddel térhálósított hemoglobin esetén; és 3,166 kPa (23,75 Hgmm) a módosítatlan borjú hemoglobin esetén. Amennyiben imidoészterekkel vagy glutáraldehiddel extrém térhálósítást végeztünk, ezeknél a hemoglobinoknál a P50 érték nagymértékben lecsökkent. Megállapítható tehát, hogy mind az imidoészterekkel, mind a glutáraldehiddel térhálósított hemoglobin esetén lecsökkent az együttműködési készség, azonban a glutáraldehiddel kezelt minták esetén a csökkenés nagyobbnak látszott.
• 4« ··»·
| I. TÁBLÁZAT | |||
| Hb minta | P50 oxi kPa | P50 dezoxi kPa | n |
| Borjú Hb | 3,201 | 3,166 | 2,1 - 2,4 |
| Glutáraldehiddel térhálósított | 2,000 | 1,900 | 1,2 |
| DMA-tal térhálósított | 1,867 | 1,800 | 1,6 |
| Glutáraldehid feleslegével | 0,933 | 0,867 | 1,1 |
| DMA feleslegével | 1,333 | 1,200 | 1,5 |
A különböző keresztkötésű hemoglobinok stabilitását összehasonlítottuk, és azt találtuk, hogy az imidoészteres változat rendelkezett a legkiválóbb stabilitással. Az imidoészter az alábbiakban ismertetendő specifikus térhálósítási eljárás körülményei között a stabilitást és az oxigénaffinitást figyelembe véve egy jobb oxigénszállító hemoglobint eredményezett.
· ·· • · · · ·4 · * ·· · · ·· · · ♦ · 4 » **· ··· ··» ··« «··» 16
A 36-37 °C hőmérsékletű inkubációs kísérletben a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses, a glutáraldehid keresztkötéses és a módosítatlan hemoglobin minták a megfelelő sorrendben 2,5 %, 8,0 % és 3,5 % *
methemoglobint tartalmaztak az inkubáció kezdetén. Öt órán keresztül végzett 36-37 C hőmérsékletű inkubációt követően a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses, a glutáraldehid keresztkötéses és a módosítatlan borjú hemoglobin mintákban a methemoglobin százalékos értéke a megfelelő sorrendben 8,9 %, 44,4 % és 8 % volt. Huszonnégy óra elteltével a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses, a glutáraldehid keresztkötéses és a módosítatlan borjú hemoglobin mintákban a methemoglobin százalékos értéke a megfelelő sorrendben 24,1 %, 87,9 % és 42 % volt. Negyvennyolc óra után a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses és a nem térhálósított borjú hemoglobin mintákban a methemoglobin százalékos értéke a megfelelő sorrendben 46,5 % és 68 % volt. A methemoglobin-képződéssel szemben a a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses hemoglobin stabilabb volt, mint a módosítatlan hemoglobin. A szakirodalom beszámol arról, hogy a glutáraldehid kersztkötéses humán hemoglobin autooxidációja négyszer gyorsabb, mint a módosítatlan humán hemoglobiné. Ennek alapján nemvárt eredmény volt, hogy a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses hemoglobin stabilabb, mint a módosítatlan hemoglobin.
A dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses, a glutáraldehid keresztkötéses és a módosítatlan borjú hemoglobin autooxidációval szembeni stabilitását vizsgáltuk úgy is, hogy a mintákat ugyanabban, a fentiekben ismertetett’' foszfátpufferben 4 'C hőmérsékleten 52 napon keresztül inkubáltuk. Huszonnyolc nap elteltével a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses borjú hemoglobinban 2,5 %-ról 9,6 %-ra nőtt a methemoglobin mennyisége. Azonos idő elteltével a glutáraldehid keresztkötéses hemoglobinban a methemoglobin mennyisége 8,0 %-ról 23,5 %-ra emelkedett. A mérést 52 nap után végezve a dimetiladipinsav-imidát keresztkötéses hemoglobin 14,3 % methemoglobint tartalmazott, míg a módosítatlan borjú hemoglobin 16,3 % methemoglobint tartalmazott már 37 nap elteltével. Akárcsak a 37 ’C hőmérsékleten végzett inkubáció során, a dimetil-adipinsav-imidát keresztkötéses hemoglobin itt is szignifikánsan stabilabb volt, mint a glutáraldehid keresztkötéses vagy a módosítatlan borjú hemoglobin.
A találmány részét képezi az emlős hemoglobinok, közöttük a borjú hemoglobin stabilitásának fokozása imidoészterekkel, köztük dimetil-adipinsav-imidáttal végzett térhálósítást követően. Ismertetjük, hogy az emlős hemoglobinok stabilitása fokozható imidoészterekkel, különösen dimetil-adipinsav-imidáttal specifikus reakciókörülmények között végzett reakcióval. A fentieken túlmenően eljárást írunk le tisztított, emlős • · hemoglobin, különösen borjú hemoglobin előállítására. A hemoglobinnak lényegében szennyeződésmentesnek kell lennie, ami azt jelenti, hogy nem tartalmaz semmilyen anyagot olyan mennyiségben, ami a kezelt emlős számára bármilyen káros hatást okozhatna. A hemoglobinnak a térhálósítást megelőzően kellőképpen mentesnek kell lennie endotoxintól (például egy legalább 40 mg/ml hemoglobin-koncentrációnál az endotoxin kevesebb, mint 0,5 EU/ml), foszfolipidtől, vírusoktól és egyéb, nemhemoglobin proteinektől. Ugyanakkor lehetőség van arra is, hogy először a lizált hemoglobin összegyűjtését követően a hemoglobint térhálósítsuk, majd a keresztkötéses hemoglobint tisztítsuk, s így az eljárás még hatékonyabb lehet az ipari előállítás során. A tisztított és térhálósított hemoglobin alkalmas humán és állati szervezetekben végrehajtott transzfúzió során oxigénszállító vérpótlékként.
Jellegzetesen a találmány szerinti hemoglobint úgy állítjuk elő, hogy aszeptikus körülmények között begyűjtjük az emlős vért, a vörösvértesteket mossuk, lizáljuk a vörösvértesteket, a lizátumot centrifugáljuk, legalább 300000 molekulatömegű membránnal ultrafiltráljuk vagy 0,025 mikrométertől körülbelül 0,040 mikrométerig terjedő szűrővel mikrofiltráljuk, a tisztított hemoglobin kinyerésére anion- vagy kationcserélő kromatográfiával tsztítjuk, majd az imidoészterrel térhálósítjuk és adott esetben affinitás- (méretkizárásos) kromatográfiát vagy • · « ·
ultrafiltrációt végzünk az alacsony molekulatömegű hemoglobin eltávolítása érdekében. Alternatív módon a hemoglobin térhálósítható a lizátum centrifugálását és összegyűjtését követően. A tisztítási lépések elvégezhetők ezt követően, beleértve az adott esetben végrehajtandó méretkizárási, lépést is.
Az így előállított hemoglobin lényegében szennyeződésmentes és túlnyomórészt egy stabilizált tetramerből áll. Más megfogalmazással, a keresztkötéses hemoglobin túlnyomórészt legalább 64000-es molekulatömeg-eloszlással rendelkezik. Az itteni alkalmazásban a túlnyomórészt vagy túlnyomóan a térhálós hemoglobin legalább 80 %-át, előnyösen a keresztkötéses hemoglobin 90-95 %-át jelenti.
A speciális oxigénszállító, keresztkötéses hemoglobin előállításának érdekében a térhálósítási reakció küönféle paramétereit specifikáljuk.
Először, a kloridion és/vagy a nátrium-klorid koncentrációja jelentős hatással van a (borjú) hemoglobin dimetil-adipinsav-imidáttal végzett térhálósításának mértékére az 1 mM Tris-HCl és az 50 mM Tris-HCl plusz 2,0 M NaCl tartomány felett. 1 és 10 mM Tris-HCl-ben dimetil-adipinsav-imidát 10 hozzáadása után a hemoglobinnak (az előbbi sorrendnek megfelelően) 90,3 %-a és 72,2 %-a marad polimerizálatlan. Ezzel szemben 50 mM Tris-HCl plusz 0,5,
1,0 és 2,0 M NaCl jelenlétében (az előbbi sorrendnek megfelelően) csak 25,8 %, 24,4 % és 20,7 % marad keresztkötés nélkül. A sókoncentráció növelésekor a polimerizálatlan hemoglobin folyamatos csökkenése és a nagy molekulatömeg (> 400000 dalton) állandó növekedése volt megfigyelhető. Amennyiben a térhálósítást 50 mM Tris-HCl-ben vagy 50 mM Tris-HCl plusz 100 mM NaCl-ban végeztük, a hemoglobin legnagyobb százaléka a 64000 400000 tartományban volt megfigyelhető.
Másodszor, megállapítottuk, hogy a puffer típusa jelentős befolyással bír a térhálósításra. Például a dimetil-adipinsav-imidáttal végzett térhálósítási reakció gyenge eredményt ad glicin-HCl-ban, etanol-amin-HClban és nátrium-foszfátot és lizint tartalmazó oldatban. Feltételezhető, hogy ezekben a puffertípusokban a primer aminocsoport gátolja a térhálósítási reakciót, ami valószínűleg hamarabb reagál, mint a protein N-terminálisának és lizincsoportjainak aminocsoportjai. A legnagyobb mennyiségű keresztkötés 2-amino-2-metil-l-propanol puffer jelenlétében volt megfigyelhető, amikoris a hemoglobinnak csak 23,4 %-a maradt térhálósítatlan. Ez a puffer ugyancsak rendelkezik primer aminocsoporttal. A dimetil-adipinsav-imidát keresztkötés szempontjából a következő négy puffer a Tris [Trisz(hidroxi-metil)-aminometán], a nátrium-karbonát, a CHES [2-(N-ciklohexilamino)-etánszulfonsav] és a CAPSO [2-(ciklohexil-amino)2-hidroxi-l-propánszulfonsav] volt. Ezek közül három • · primer aminocsoporttal rendelkezik. Ezzel ellentétben a CAPS [3-(ciklohexil-amino)-l-propánszulfonsav] nem volt megfelelő puffer a térhálósítási reakció számára, a kapott termék csak 27,2-ban volt térhálósított. A nátrium-foszfát ugyancsak nem bizonyult jó választásnak a térhálósítási reakció számára.
Harmadszor, a pH jelentős szerepet játszott a hemoglobin imidoészterrel végzett polimerizációjának hatékonyságában. Például a dimetil-adipinsav-imidáttal végzett hemoglobin térhálósítási kísérletek teljesen sikertelenek voltak 8,0 pH érték alatt. Abban a kísérletben, ahol a dimetil-adipinsav-imidátot tíz részletben hozzáadva, amikoris a dimetil-adipinsav-imidát tízszeres végső sztöchiometriai arányban volt a hemoglobinhoz viszonyítva, pH 8,0 értéken a hemoglobinnak csak 12,2 %-a volt térhálósított. A térhálósítási hatékonyságban növekedés volt tapasztalható pH 9,0, 10,0 és 10,5 értéknél, amikoris (az előbbi sorrendnek megfelelően) csak 58 %, 48 % és 50 % visszamaradt, térhálósítatlan hemoglobin volt jelen a dimetil-adipinsav-imidát beadagolásának végén. Az adatokból ugyanakkor kitűnt, hogy 9-es vagy ennél nagyobb pH érték szükséges ahhoz, hogy a dimetil-adipinsav-imidátnak és a hemoglobinnak a reakciója eredményes legyen.
Végül, megfigyeltük, hogy a dezoxigenált hemoglobin készségesebben térhálósódott, mint az oxigénéit hemoglobin.
Miután biztosítottuk a fentiekben leírt polimerizációs körülményeket az optimális térhálósításhoz, a 64000 vagy nagyobb molekulatömeg eléréséhez a térhálósítatlan hemoglobint kiszűrhetjük vagy kromatográfiás úton eltávolíthatjuk, majd további szűrés vagy kromatografálás eredményezi a túlnyomórészt 64000 molekulatömeget. A fentiekből következően a hemoglobin térhálósításának optimalizálása nagyban elősegíti a túlnyomórészt 64000 és 300000 molekulatömegű oxigénszállító anyag gazdaságos és gyakorlatilag megvalósítható előállítását.
A keresztkötéses hemoglobint az előállítását követően általában egy olyan, gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközegbe helyezzük, amely lehetővé teszi az anyagnak egy kezelt emlős szervezetébe injekció vagy infúzió útján történő bejuttatását. A jellegzetes, gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközegek magukban foglalják az injekciók és infúziók számára megfelelő fiziológiai szempontból elfogadható sóoldatokat, amilyenek például a kereskedelmi forgalomban hozzáférhető szalinoldatok. Gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozó lehet bármely olyan folyadék, amely inért a térhálósított hemoglobinnal szemben és nem okoz semmilyen káros hatást az injekcióval vagy infúzióval
kezelt emlős szerveztében. A megfelelő folyadékok ugyancsak magukban foglalnak más, természetes vagy szintetikus vértermékeket, továbbá fluorozott szénhidrogéneket. Általában a találmány szerinti térhálósított hemoglobint összekeverjük egy megfelelő gyógyszerészeti hordozóval, ahol a hemoglobin koncentrációját egyenlő mennyiségekben körülbelül 40 mg/ml-től körülbelül 140 mg/ml értékre állíthatjuk be.
A találmányt a továbbiakban részletesebben ismertetjük, bemutatva valamennyi, a fentiekben említett eljárási lépést és molekuláris készítményt. Az ismertetett eljárások bármilyen emlős hemoglobin esetén alkalmazhatók, jóllehet a bemutatás céljaira az alábbiakban ismertetendő példák (tisztítás, térhálósítás és módosítás) borjú hemoglobint alkalmazunk. A borjú hemoglobin ugyanakkor valóban rendelkezik egy előnnyel, mégpedig egy nagyon magas, az oxigénszállításra alkalmas P50 értékkel.
1. példa
A vér begyűjtése és a vörösvértest hemolizátum előállítása
A vért aszeptikus körülmények között vettük le fiatal Holstein marhákból a The Upjohn Company Agricultural Division farmján. Először minden fiatal marha nyakáról elektromos nyírógéppel eltávolítottuk a szőrt. A leborotvált területet jóddal átitatott törlőruhával letöröltük, majd spriccflaskából 95 %-os etanollal lemostuk. A vér levétele előtt az etanolt hagytuk a levegőn felszáradni. A vért 0,5-1,0 literes, vákuum alá helyezett üvegekbe vettük le, amely üvegek sterilek és pirogénmentesek voltak. A vér begyűjtése előtt valamennyi üvegbe megfelelő mennyiségű nátrium-heparin-oldatot mértünk be. Feltöltés után az üvegeket azonnal jégre helyeztük és jégen tartva a laboratóriumba szállítottuk. A kezdeti vizsgálatokhoz 2,5-5,0 liter vért vettünk le.
A laboratóriumban minden eljárást vagy jégen vagy 4 C hőmérsékleten végeztünk, hogy minimalizáljuk a mikroorganizmusok növekedését és az ezzel együttjáró pirogénképződést. Ezen túlmenően a tisztítási lépéseket szűrt, kis szilárdanyag-tartalmú levegővel ellátott, tiszta környezetben végeztük. A hemoglobin tisztításának első lépései magukban foglalják a vörösvértestek elkülönítését a vérplazmából, majd a vörösvértestek • · « · · · · ismételt mosását sóoldattal és a vörösvértestek pelletekké történő centrifugálását. A teljes vért először pirogénmentes, 0,5 literes centrifugacsövekbe helyeztük és 4 °C hőmérsékleten 4000 fordulat/perc értéken centrifugáltuk 30-40 percen keresztül. A vörösvértestek a centrifugálás ideje alatt pelletekké álltak össze. A felülúszóban lévő vérplazmát leszívással eltávolítottuk. A vörösvértesteket vagy eritrocitákat visszaszuszpendáltuk egy olyan, jéghideg oldatba, amely tisztított vízben 16 gramm nátrium-kloridot (NaCl) tartalmazott literenként. Ezt az oldatot 1,6 %-os szalinként említjük a továbbiakban. A vörösvértesteket egy steril és pirogénmentes üvegbottal végzett keveréssel vagy a centrifugacsövek óvatos, ismételt átfordításával szuszpendáltuk fel. Miután a vörösvértesteket visszaszuszpendáltuk, 10000 fordulat/percen ismételten centrifugáltuk 30-40 percen keresztül 4 *C hőmérsékleten. A vörösvértesteket újra visszaszuszpendáltuk 1,6 %-os szalinba, majd 10000 fordulat/percen ismételten centrifugáltuk 30-40 percen keresztül 4 °C hőmérsékleten. A vörösvértestek feltárása vagy lizálása előtt a vörösvértesteket összesen háromszor 1,6 %-os szalinnal mostuk.
A sejtek mosása után a vörösvértesteket hipoozmotikus sokkal lizáltuk, a következő módon. Egy térfogatrész mosott, pelletált vörösvértesthez hozzáadtunk négy térfogatrész jéghideg 0,0025 M nátrium-foszfát puffért (pH 7,4). A vörösvértesteket a centrifugacső • · óvatos felfordításával felszuszpendáltuk a pufferben. Mután a vörösvértestek tökéletesen szuszpendálódtak, a vörösvértest-szuszpenziót egy órán keresztül 0-4 ’C hőmérsékleten inkubáltuk, majd ezt követően 30-90 percen át 4 C hőmérsékleten 10000 fordulat/perc értékkel centrifugáltuk. A centrifugálás után a felülúszóban lévő hemoglobint leszívatással eltávolítottuk. Bizonyos kísérletekben az előírásokat a következők szerint módosítottuk. Az egy órás, 0,0025 M nátrium-foszfát pufferrel 0-4 ’C hőmérsékleten végzett inkubáció után, de a centrifugálást megelőzően 2,0 M nátrium-klorid-oldatot adtunk hozzá olyan mennyiségben, hogy a végső koncentrációja 0,2 M legyen. A nátrium-kloridnak a vörösvértestek lizátumához való hozzáadása tisztább felülúszót eredményezett a centrifugálást követően.
A hemolizátum előállítása során a centrifugálás után beépíthetünk egy kitisztító lépést is. Ebben a lépésben egy szűrést elősegítő anyagot, például egy cellulóz-, diatómaföld-, polimer- vagy szilícium-dioxid-származékot adunk mozgatás közben a centrifugált hemolizátumhoz. A szűrést elősegítő anyaggal eltávolítjuk a további sztrómafragmentumokat, így a foszfolipidet, amely a centrifugálással előzetesen nem távolítható el teljesen.
A hipoozmotikus sokkal szemben alternatívát jelent a vörösvértestek lizálásához a mechanikai • · · • · · roncsolás, például francia préssel vagy nagyobb méretű sejthomogenizátorral.
A LAL (Limulus Amoebocyte Lysate) pirogénteszt alapján az előállított négy hemolizátum pirogéntartalma 0,05 és 0,2 endotoxin egység (EU) között változott. Anioncserélő vagy kationcserélő kromatográfiával az endotoxin és foszfolipid utolsó nyomait is eltávolítottuk.
2. példa
A vírustartalom csökkentése
Amennyiben a borjúvér vírusokkal szennyezett, a virális terhelés egy részét a vörösvértestek lassú centrifugálással végzett mosása során eltávolítjuk. Egy további részt a hemolizátum nagysebességű centrifugálásával távolítunk el, amely a pelletbe kerül. Még egy továbi rész a kitisztítási lépés során kerül ki.
A virális terhelés további csökkentését mikrofiltrációval és/vagy ultrafiltrációval végezzük. Egy 0,025-0,040 mikrométeres szűrővel végzett mikrofiltrálás igen nagy mértékben csökkenti a legtöbb vírus titerét. A további eljárás előtt a hemolizátum szűrésére egy 0,04 mikrométeres Ultipor N66 nylon 66 szűrőbetétet (Pali Corporation) alkalmaztunk. Ezen túlmenően szükség esetén egy 300000 molekulatömegű ultrafiltráciős membrán • · · (Filtron Corporation) alkalmazható, amelyet egy ultrafiltráló egységbe (Amicon Corporation) merítünk. A hemoglobin szabadon átáramlott valamennyi említett ultraés mikrofiltráló membránon, míg a vírusok részei visszamaradtak azokon. A két szűrőmembrán együttes alkalmazása igen jól csökkenti a vírusterhelést. Ezeknek a szűrőtípusoknak mindkét tagja csak alacsony protein-visszatartást mutat.
A szűrésen kívül a hemolizátum vagy a szűrt hemolizátum vírustartalma megfelelő detergensek, etilén-dinitril-tetraecetsav, a U.S. Food and Drug Administration (FDA) által jóváhagyott trinitro-butil-foszfát reagens vagy ezeknek az adalékoknak kombinációban történő hozzáadásával is csökkenthető.
3. példa
A hemoglobin ioncserélő kromatográfiája
Az anioncserélő kromatográfiát kiterjedten alkalmazzák az emlős hemoglobinok tisztításában [Williams, R. C., K. Tsay (1973) Anal. Biochem. 54: 13745]. Az ajánlott pH és ionerősség körülményei között a hemoglobin úgy vihető fel egy anioncserélőre, hogy az hozzákötődik az ioncserélőhöz. A protein és nemprotein jellegű szennyeződések az oszlop kifejlesztése során leválnak a hemoglobinról. A körülmények úgy is * · · · · 4
megválaszthatok, hogy a hemoglobinnak csak csekély affinitása legyen vagy semmilyen affinitása ne legyen az anioncserélő gyantához. Ilyen körülmények között a szennyezések maradnak vissza az oszlopon. A frissen preparált hemolizátumban jelen lévő lényeges szennyezések a következők: foszfolipidek, az előzetes eljárási lépések során el nem távolított, visszamaradt potenciális vírusok, bakteriális endotoxin kis mennyisége, valamint a hemoglobintól eltérő proteinek. Az endotoxin, foszfolipid és a plazmaproteinek negatívabb töltéssel rendelkeznek, mint a hemoglobin, s a megfelelően megválasztott körülmények között nagyobb affinitást mutatnak az anioncserélőhöz. Az alkalmas terhelési és elúciós körülmények között az bizonyult a szennyezések anioncserélő hemoglobin mellől. Ezen kromatográf ia kioldására túlmenően az alkalmasnak az említett anioncserélő kromatográfia tovább csökkentette a virális terhelést is.
A hemoglobin tisztításánál három szempontot vettünk figyelembe az anioncserélő kromatográfiával kapcsolatban: kötés emelt pH értéken; elúció csökkenő pH gradiens mellett; és feltöltés olyan pH körülmények között, amelyeknél a hemoglobin nem kötődik meg az anioncserélőn, hanem maradéktalanul áthalad az oszlopon. Bár valamennyi kísérletünket oszlopokon végeztük, a tisztítás elvégezhető szakaszos üzemmódban is, közel azonos eredményekkel. Kísérleteinkben Q-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) anioncserélőt alkalmaztunk, de meg kell jegyezni, hogy ezek az eljárások számos olyan, kereskedelmi forgalomban hozzáférhető, alacsony vagy középes nyomású anioncserélővei elvégezhetők, amelyeket proteinek tisztítására fejlesztettek ki, magukban * foglalva azokat is, amelyek kvaterner aminocsoportokkal vagy dietil-amino-etil-csoportokkal rendelkeznek.
A kationcserélő kromatográfiát ugyancsak elterjedten alkalmazzák az emlős hemoglobinok tisztítására [Bucci, E. (1981) Preparation of isolated chains of humán hemoglobin, Methods in Enzymol. 76: 97-106]. A javasolt pH és ionerősség körülményei között a hemoglobin a kationcserélőre történő felvitelt követően az ioncserélőhöz kötődik. A foszfolipid és az endotoxin, valamint a plazmaproteinek csak kis affinitással rendelkeznek a kationcserélőhöz olyan körülmények között, amelyek mellet a hemoglobin kötődik. Az alkalmas terhelési és elúciős körülmények között a kationcserélő kromatográfia alkalmasnak bizonyult a hemoglobin elválasztására az említett szennyezések mellől. Ezen túlmenően a kationcserélő kromatográfia tovább csökkentette a virális terhelést is.
A hemoglobin tisztításánál két szempontot vettünk figyelembe a kationcserélő kromatográfiával kapcsolatban: először, a hemoglobint olyan körülmények között vittük fel, amelyek mellett kötődik a kationcserélőhöz, majd ezt követően lineáris pH gradienssel ···· ·* · · ·· · ·«····· * · • · « · ··· ··· «·· ··· ·*>· eluáltuk; másodszor hemoglobint olyan körülmények között vittük fel, amelyek mellett kötődik a gyantához, majd egyetlen pH gradienssel eluáltuk. Mindkét módszerben a foszfolipid és az endotoxin maradéktalanul áthalad a gyantán, s így a hemoglobintól elválaszthatók az említett szennyezőanyagok. Számos, kereskedelmi forgalomban hozzáférhető kationcserélő megfelel a kitűzött céloknak. Előnyösen egy S-Sepharose Fást Flow (Pharmacia) kationcserélőt alkalmaztunk, mivel ez kiváló proteinkötési és átfolyási jellemzőkkel rendelkezik. Megjegyzendő, hogy nagyon sok olyan, alacsony vagy közepes nyomású kromatográfiás közeg eleget tesz a kívánt követelményeknek, amely szulfopropil- vagy karboxi-metil-csoporttal rendelkezik. Ezeknek a gyantáknak az alkalmazása igen gazdaságos.
3A. példa
Anioncserélő kromatoqráfia lineáris pH gradienssel
Ez a kísérlet azoknak az anioncserélő kromatográfiás körülményeknek a bemutatására szolgál, amelyek között a borjú hemoglobint felvittük az ioncserélőre, majd lineáris pH gradienssel eluáltuk. Egy 2,5 x 5,5 cmes Q-Sepharose Fást Flow oszlopot készítettünk, majd egy éjszakán át 0,5 M NaOH oldattal végzett mosással tisztítottuk. Az oszlopot 100 mM Tris oldattal (pH 8,5) mindaddig mostuk, amíg az oszlopétfluens pH-ja be nem állt • ·· ·»·* • · ··· ···
4 ·
4*4 4*· * 4 4 ·
8.5 értékre. Ezt követően az oszlopot 50 mM Tris oldattal (pH 8,5) ekvilibráltuk. A hozzávetőleg 350 mg hemoglobint tartalmazó, frissen preparált borjú vörösvértest hemolizátum 5 ml-es mintáját meghígítottuk 10 ml 100 mM Tris oldattal (pH 8,5), majd 2,5 ml/perc sebességgel a Q-Sepharose oszlopra vittük. A felvitelt követően az oszlopot 50 mM Tris oldattal (pH 8,5) mostuk addig, amíg az oszlopéifluens abszorbanciája visszatért az alapvonalra. Az oszlopot ezután lineáris gradiens elúciónak vetettük alá: a kiindulási puffertői 50 mM Tris oldatig (pH 6,5), tízszeres oszloptérfogat alatt végezve a változtatást. A hemoglobin lényegében egyetlen fő csúcs formájában eluálódott, előtte és utána számos kisebb csúccsal. A fő csúcs az oszlopra felvitt hemoglobin 95 %ának felet meg. Valamennyi kromatográfiás eljárást 5 ’C hőmérsékleten végeztünk.
3B. példa
Anioncserélő kromatográfia egy fokozatú pH gradienssel
Ez a kísérlet azoknak az anioncserélő kromatográfiás körülményeknek a bemutatására szolgál, amelyek között a borjú hemoglobint felvittük az ioncserélőre, majd egyetlen lépéses pH gradienssel eluáltuk. Egy 2,5 χ
5.5 cm-es Q-Sepharose Fást Flow oszlopot készítettünk, majd egy éjszakán át 0,5 M NaOH oldattal végzett mosással tisztítottuk. Az oszlopot 100 mM Tris oldattal (pH 8,5) ·· · ··· mindaddig mostuk, állt 8,5 értékre.
amíg az oszlopét f luens pH-ja be nem
Ezt követően az oszlopot 50 mM Tris oldattal (pH 8,5) ekvilibráltuk. A hozzávetőleg
400 mg hemoglobint tartalmazó borjú vörösvértest hemolizátum mintájának 8 ml-ét meghígítottuk 16 ml 50 mM Tris oldat tal (pH 8,5), majd 2,7 ml/perc sebességgel.felvittük az oszlopra. A felvitelt követően az oszlopot 50 mM Tris oldattal (pH 8,5) mostuk addig, amíg az oszlopéifluens abszorbanciája visszatért az alapvonalra. Az oszlopot ezután 50 mM Tris oldattal (pH 7,4) fejlesztettük ki, és a hemoglobint lényegében egyetlen csúcs formájában eluáltuk az oszlopról. A hemoglobint tartalmazó frakciókban jelen lévő anyag mennyisége közel azonos volt az oszlopra felvitt anyag mennyiségével, jelezve, hogy ebben a lépés ben a visszanyerés közel kvantitatív.
3C. példa
A hemoglobint vissza nem tartó anioncserélő kromatográfia
Ez a kísérlet azoknak az anioncserélő kromatográfiás körülményeknek a bemutatására szolgál, amelyek között a borjú hemoglobin nem kötődött az anioncserélőhoz, hanem maradéktalanul áthaladt az oszlopon. Egy 2,5 χ 5,5 cm-es Q-Sepharose Fást Flow oszlopot készítettünk, majd egy éjszakán át 0,5 M NaOH oldattal végzett mosással tisztítottuk. Az oszlopot 100 mM Tris
• «4 «··· • ·
4·· «·ϋ
• ···· oldattal (pH 7,4) mindaddig mostuk, amíg az oszlopeffluens pH-ja be nem állt 7,4 értékre. A 880 mg hemoglobint tartalmazó, frissen preparált borjú vörösvértest hemolizátum 10 ml-es mintáját meghígítottuk 40 ml 50 mM Tris oldattal (pH 7,4), majd 2,5 ml/perc sebességgel ennek az oldatnak 35 ml-ét a Q-Sepharose oszlopra vittük. A felvitelt követően az oszlopot 50 mM Tris oldattal (pH 7,4) mostuk addig, amíg a hemoglobin teljes egészében eluálódott az oszlopról. A hemoglobin kötődés nélkül átjutott az oszlopon, és a visszanyerés értéke 88 % volt.
3D. példa
A hemoglobin kationcserélő kromatográfiája
Ez a kísérlet azoknak a kationcserélő kromatográfiás körülményeknek a bemutatására szolgál, amelyek között a borjú hemoglobint felvittük az ioncserélőre, majd lineáris pH gradienssel eluáltuk. Egy 2,5 x 5,5 cmes Q-Sepharose Fást Flow oszlopot készítettünk, majd egy éjszakán át 0,5 M NaOH oldattal végzett mosással tisztítottuk. Az oszlopot 100 mM Bis-Tris oldattal (pH 6,0) mindaddig mostuk, amíg az oszlopéifluens pH-ja be nem állt 6,0 értékre. Ezt követően az oszlopot 50 mM Bis-Tris oldattal (pH 6,0) ekvilibráltuk. A frissen preparált borjú vörösvértest hemolizátum 5 ml-es mintáját meghígítottuk 10 ml 50 mM Bis-Tris oldattal (pH 6,0), majd 2,5
ml/perc sebességgel a Q-Sepharose oszlopra vittük. A felvitelt követően az oszlopot 50 mM Bis-Tris oldattal (pH 6,0) mostuk addig, amíg az oszlopéifluens abszorbanciája visszatért az alapvonalra. Az oszlopot ezután lineáris gradiens elúciónak vetettük alá: az oszlop puffertől 50 mM Bis-Tris oldatig (pH 8,0), tízszeres oszloptérfogat alatt végezve a változtatást. Valamennyi kromatográfiás eljárást 5 C hőmérsékleten végeztünk.
4. példa
Borjú hemoglobin térhálősítása dimetil-adipinsav-imidáttal
Egy 170 mg/ml tisztított borjú hemoglobint tartalmazó mintát a következőképpen kezeltünk. A térhálósítási reakciót 1,75 mM vagy 112 mg/ml hemoglobin tetramer koncentráció mellett végeztük. A magas tetramer-koncentrációk elősegítik a hemoglobin tetramerek intermolekuláris térhálósodását. A hemoglobin módosítását 50 mM Tris puffer (pH 8,8) jelenlétében, 4 C hőmérsékleten végeztük. A hemoglobin módosítása ekvimoláris mennyiségű dimetil-adipinsav-imidát hozzáadásával történt (azaz 1,75 mM dimetil-adipinsav-imidátot adtunk 1,75 mM hemoglobin tetramerhez). A dimetil-adipinsav-imidátos kezelést nyolc alkalommal ismételtük meg 30 perces időközönként, 4 °C hőmérsékleten. Minden egyes alkalmazásnál egy 0,025 mM nátrium-karbonát-oldatban (pH 9,25) lévő 50 mg/ml
• e · koncentrációjú dimetil-adipinsav-imidát-oldatot adtunk a hemoglobinoldathoz, 1,75 mM végső dimetil-adipinsav
-imidát mennyiségig. A térhálósító reagens beadagolásának ideje alatt a hemoglobinoldatot kevertettük, majd jégen 30 percen keresztül inkubáltuk. A harminc perc elteltével egy 0,4 ml-es mintát vettünk ki, majd ezt hozzáadtuk 4 ml 0,25 mM nátrium-foszfát (pH 7,0) pufferhez. Az imidoészter hidrolízisével a foszfát puffer leállította a térhálósítási reakciót. A kvencselést két órán keresztül szobahőmérsékleten végeztük. A visszamaradó hemoglobinoldatot ismét reagáltattuk a térhálósító ágens friss oldatával. A nyolc reakcióciklust 3,5 óra alatt hajtottuk végre. Az ebben a kísérletben alkalmazott egyedi imidoészter a dimetil-adipinsav-imidát volt. Egyéb imidoészterek ugyancsak felhasználhatók.
5. példa
A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított hemoglobin méretkizárásos nagynyomású folyadékkromatográfiája (SEC-HPLC)
A hemoglobin koncentrációját spektrofotometriásán határoztuk meg, ismert extinkciós koefficiensek alkalmazásával [ Benesch, R. E., Benesch, R. , S. Yung, (1973) Equations fór the spectrophotometric analisys of hemoglobin mixtures. Analyt. Biochem. 55: 245-48]. A reakciótermékeket a térhálósítószer minden egyes
................
hozzáadása után méretkizárásos HPLC (SEC-HPLC) segítségével megvizsgáltuk. A kvencselt reakcióterméket 0,2 M nátrium-foszfát (pH 7,0) pufferben milliliterenként 1 mg hemoglobin tetramer koncentrációra hígítottuk. A hígított terméket két kölünálló módon analizáltuk SEC-HPLC útján. Az első módszer szerint 0,2 M nátrium-foszfát (pH 7,0) pufferrel ekvilibrált Zorbax GF-250 SEC oszlopot (Dupont) és 1 ml/perc sebességet alkalmaztunk. A második módszer szerint 0,1 M nátrium-foszfát (pH 7,0) pufferrel ekvilibrált Superose 12 FPLC oszlopot (Pharmacia) használtunk. Előzetesen mibkét oszlopot ismert molekulatömegű proteinekkel kalibráltuk.
A dimetil-adipinsav-imidáttal végzett, folyamatosan ismételt térhálósítás fokozatos növekedést eredményezett a polimerizált, tetramer stabilizált hemoglobin mennyiségében. A Superose 12 oszloppal végzett SEC-HPLC segítségével meghatározott molekulatömeg-tartományok a következők voltak: 1.) % > 400000 dalton, 2.) % > 64000 dalton és < 400000 dalton és 3.) % < 64000 dalton. A térhálósítás négyszeri ismétlést követően a százalékos értékek a következők voltak: 1.) 0 %, 2.) 40,64 %, 3.) 59,36 %. Hétszeri ismétlés után a százalékos értékek a következőképpen alakultak: 1.) 4,1 %, 2.) 50,4 % és 3.) 45,5 %. Nyolcszor! ismétlés után a következő százalékos értékeket nyertük: 1.) 7,5 %, 2.) 50,6 % és 3.) 41,9 %. A 64000 daltonnái kisebb molekulatömeget jelző, három csúcsból álló csoport szimmetrikus volt a középső, 30000
• · dalton molekulatömeget jelző csúcshoz képest.
Ez a frakció együtt eluálődott a módosítatlan borjú hemoglobinnal, s feltehetőleg főleg hemoglobin dimerekből áll. A térhálósítás hétszeri ismétlése után a hemoglobin methemoglobin-tartalma < 2,5 % volt. A keresztkötéses hemoglobin látható spektruma hasonló a módosítatlan borjú hemoglobinéhoz.
6. példa
A térhálósított hemoglobin nátrium-dodecil-szulfát poli(akril-amid) qélelektroforézise
A nátrium-dodecil-szulfát poli(akril-amid) gélelektroforézist (SDS-PAGE) keresztkötéses és térhálósítatlan hemoglobin mintákkal végeztük, a következőkben leírtaknak megfelelően. A hemoglobin mintákat 2 mg/ml koncentrációra hígítottuk 0,005 M nátrium-foszfát (pH 7,4) és 0,15 M nátrium-klorid oldatával, majd a meghígított mintákat összekevertük három rész standard SDS-gél pufferrel, s ezt követően a mintákat 37 ’C hőmérsékleten 3 órán keresztül inkubáltuk. A mintákat 10-20 % ISS minigéleken futattuk, a nemredukált formában. A térhálósítás hétszeres ismétlését követően nyert keresztkötéses hemoglobin SDS-PAGE vizsgálata azt mutatta, hogy a minta 80 %-a térhálósítva volt az alegységek között. Az alegység molekulatömegének legalább
nyolc többszöröse volt jelen, valamennyi közel azonos mennyiségben.
7. példa
A térhálósított és a nemtérhálósított borjú hemoglobin oxigéneqyensúlya
A térhálósított és a nemtérhálósított borjú hemoglobin oxigénegyensúlyának mérését egy Hemoxanalyzer készülék (TCS Medical Industries) segítségével végeztük. A dimetil-adipinsav-imidát reakciójának hétszeri ismétlésével nyert térhálósított hemoglobin mintáját foszfát puffereit szalinban (pH 7,4) 1,5 mg/ml koncentrációra hígítottuk, majd analizáltuk. Azonos körülmények között elemeztük a módosítatlan hemoglobin mintáját is, valamint azt a glutáraldehiddel a saját laboratóriumunkban előállított térhálósított borjú hemoglobint, amelynek előállítását a korábban már ismertetett módszerrel végeztük [Guillochon, D. et al. , (1986) Effect of glutaraldehyde on hemoglobin, Biochem. Phar'm. 3J5: 31723]. Az egyes hemoglobinfajtákra a P50 értékek (P50 a féltelítésnél mért parciális oxigénnyomás) a következők voltak: a dimetil-adipinsav-irnidáttal térhálósított hemoglobin esetén 1,800 kPa (13,5 Hgmm); a glutáraldehiddel térhálósított hemoglobin esetén 1,900 kPa (14,25 Hgmm); és a módosítatlan borjú hemoglobinra 3,166 kPa (23,75 Hgmm) volt.
8. példa
A térhálósított és a nemtérhálősított borjú hemoglobin stabilitási vizsgálatai
Dimetil-adipinsav-imidáttal hétszeri ismétléssel térhálósított borjú hemoglobint, módosítatlan borjú hemoglobint, valamint glutáraldehiddel térhálósított hemoglobint 0,125 M nátrium-foszfát pufferben (pH 7,1) 36-37 °C hőmérsékleten inkubáltunk. A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobin és a módosítatlan borjú hemoglobin koncentrációja 40 mg/ml, míg a glutáraldehiddel térhálósított hemoglobin koncentrációja 28 mg/ml volt. Meghatározott időközökben valamennyi hemoglobinfajtából mintát vettünk, 0,25 M nátrium-foszfát pufferben (pH 7,3) 1/100 arányban meghígítottuk, majd 680 nm és 420 nm között egy Shimadzu Model 160 UV-látható pásztázó spektrofotométer segítségével szkenneltük. A methemoglobin-tartalmat valamennyi spektrum elemzése alapján határoztuk meg, ismert egyenletek felhasználásával [Benesch, R. E. , Benesch, R. , S. Yung, (1973) Eguations fór the spectrophotometric analisys of hemoglobin mixtures. Analyt. Biochem. 55: 245-48]. A spektrumokat 22 “C hőmérsékleten vettük fel.
A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobint, valamint a glutáraldehiddel térhálósított hemoglobint 4 ’ C hőmérsékleten további idő-
................ tartamig inkubáltuk. Időközönként mintákat vettünk, és a fentiekben ismertetett módon meghatároztuk a methemoglobin-tartalmukat.
A*36-37 ’C hőmérsékleten végzett inkubációban a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított, a glutáraldehiddel térhálósított és a módosítatlan borjú hemoglobin minták az előbbi sorrendnek megfelelően 2,5 %, 8,0 % és 3,5 % methemoglobint tartalmaztak az inkubáció kezdetén. A 36-37 ”C hőmérsékleten végzett inkubációban 5 óra elteltével a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított, a glutáraldehiddel térhálósított és a módosítatlan borjú hemoglobin minták az előbbi sorrendnek megfelelően 8,9 %, 44,4 % és 8 % methemoglobint tartalmaztak. Huszonnégy óra után a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított, a glutáraldehiddel térhálósított és a módosítatlan borjú hemoglobin minták az előbbi sorrendnek megfelelően 24,1%, 87,9 % és 42 % methemoglobint tartalmaztak. Negyvennyolc óra elteltével a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított és a módosítatlan borjú hemoglobin minták az előbbi sorrendnek megfelelően 46,5 % és 68 % methemoglobint tartalmaztak. A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított hemoglobin 36-37 °C hőmérsékleten stabilabb a methemoglobin-képződéssel szemben, mint a módosítatlan borjú hemoglobin. A szakirodalmi adatok alapján a glutáraldehiddel térhálósított humán hemoglobin négyszer gyorsabban autooxidálódik, mint a módosítatlan humán hemoglobin [Guillochon, D. et al., (1986) Effect of
I glutaraldehyde on hemoglobin, Biochem. Pharm. 35: 31723]. Nemvárt eredmény volt, hogy a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított hemoglobin az autooxidációval szemben stabilabbnak bizonyult, mint a módosítatlan borjú hemoglobin.1' A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított és a glutáraldehiddel térhálósított borjú hemoglobin autooxidációval szembeni stabilitását ugyanabban a pufferben 28 napos, 4 C hőmérsékleten végzett inkubáció után is mértük. A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobin esetén 28 nap elteltével a methemoglobin koncentrációja 2,5 %-ról 9,6 %-ra nőtt. A glutáraldehiddel térhálósított borjú hemoglobinnál azonos idő elteltével 8,0 %-ról 23,5 %-ra emelkedett a methemoglobin-koncentráció.
9. példa
A dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobin preparatív méretkizárásos kromatográf iája
A preparatív méretkizárásos kromatográfiát a kis, azaz < 64000 dalton molekulatömegű fajtáknak a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobinból történő eltávolítására alkalmaztuk. Egy 2,5 x 90 cm-es, 0,025 M nátrium-foszfát, 0,15 M NaCl (pH 7,4) oldattal 4 °C hőmérsékleten ekvilibrált Sephacryl S-200 HR (Pharmacia) oszlopra vittük fel a 40 mg/ml koncentrácóiójú, dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobint. A felvitt anyag térfogata az oszlopágy térfogatának 1 %-át tette ki; az átfolyási sebesség 0,45 ml/perc volt. A kromatográfiából származó egyes csúcsoknak megfelelő frakciókat egyesítettük, majd az így kapott, egyesített mintákat a bennük lévő hemoglobinfajták molekulatömeg-eloszlásának meghatározása céljából a fentieknek megfelelő körülmények között Superose 12 oszlopon SEC-HPLC-vel analizáltuk. Az előoszlop vagy felvitt mintát a Superose 12 oszlopon ugyancsak vizsgáltuk.
A preparatív méretkizárásos kromatográfia a dimetil-adipinsav-imidáttal térhálósított borjú hemoglobint két fő frakcióra választotta szét. Az 1. frakció, amely a kinyert hemoglobin teljes mennyiségének 51,3 %-át tartalmazta, a nagyobb molekulatömegű térhálósított hemoglobinfajtákat tartalmazta. A 2. frakció a 64000 daltonnái kisebb molekulatömegű keresztkötéses hemoglobint tartalmazta. Az előoszlop keresztkötéses hemoglobin frakció SEC-HPLC vizsgálata azt jelezte, hogy annak 2,6 %-a > 400000 dalton, 47,2 %-a > 64000 dalton és 50,2 %-a < 64000 dalton. Az analitikai SEC-HPLC alapján a preparatív méretkizárásos kromatográfiával nyert, tisztított 1. frakció 4,7 %-a > 400000 dalton, 92,7 %-a > 64000 dalton és 2,6 %-a < 64000 dalton. Ez a módszer kiválóan megfelelt a kisebb molekulatömegű hemoglobinfajták eltávolítására.
Claims (7)
- SZABADALMI IGÉNYPONTOK1. Élő sejtekhez történő oxigénszállításra alkalmas térhálósított hemoglobin készítmény, azzal jellemezve, hogy a készítményben lévő hemoglobin lényegében szennyeződésmentes és egy imidoészterrel térhálósított, miáltal a hemoglobin túlnyomóan tetramer
formában van jelen és amelynek P50 értéke legalább 1,733 kPa (13 Hgmm). 2. Az 1. igénypont szerinti térhálósított hemoglobin készítmény, a z z a 1 jel 1 e m e z v e, hogy az imidoészter dimetil-adipinsav-imidát vagy dimetil—parafasav-imidát. - 3. Az 1. igénypont szerinti térhálósított hemoglobin készítmény, azzal jellemezve, hogy a térhálósított hemoglobin legalább 80 %-a legalább 64000 értékű molekulatömeggel rendelkezik.
- 4. Az 1. igénypont szerinti térhálósított hemoglobin készítmény, azzal jellemezve, hogy a térhálósított hemoglobin legalább 95 %-a legalább 64000 értékű molekulatömeggel rendelkezik.
- 5. Az 1. igénypont szerinti térhálósított hemoglobin készítmény, azzal jellemezve, hogy a készítmény magában foglal egy gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközeget.
- 6. Az 5. igénypont szerinti térhálósított hemoglobin készítmény, azzal jellemezve, hogy a gyógyszerészeti szempontból elfogadható hordozóközeg tisztított víz vagy szalinoldat.
- 7. Eljárás élő sejtekhez történő oxigénszállításra alkalmas térhálósított hemoglobin készítmény előállítására, azzal jellemezve, hogy egy tisztított hemoglobin lizátumot egy imidoészterrel legalább 8,0 értékű pH-η egy Tris-HCl-ot tartalmazó polimerizációs oldatban térhálósítünk, miáltal a térhálósított hemoglobin túlnyomórészt 64000 értékű molekulatömeggel és legalább 1,733 kPa (13 Hgmm) P50 értékkel rendelkezik.
- 8. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polimerizációs oldat nátrium-kloridot tartalmaz.
9. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jeli e m e z v e, hogy a pH értéke 8,0-tól körülbelül 12,0-ig terjed. 10. A 7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemezve, hogy a polmerizációs oldat 50 mMTris—HCl-t és körülbelül 0,1 - 2,0M nátrium-kloridot * »4 · • 4 tartalmaz.11.7. igénypont szerinti eljárás, a j e 1 1 e ffl'e v e, hogy a tisztított hemoglobin lizátum dezoxigenált.12.7. igénypont szerinti eljárás, a jelleme v e, hogy az eljárás magában foglalja a kis molekulatömegű hemoglobin méretkizárással történő eltávolítását.13. A12.igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez v e, hogy a méretkizárást kromatográfiás úton végezzük.14. A7. igénypont szerinti eljárás, azzal jellemez v e, hogy az imidoészter dimetiladipinsav-imidát vagy dimetil-parafasav-imidát.15. A 7. igénypont szerinti eljárás, jellemezve, hogy a polimerizáció azzal során a tisztított hemoglobint az imidoészter ekvimoláris /mennyiségével; ismételt reakciókban kezeljük.
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| US61984090A | 1990-11-29 | 1990-11-29 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| HU9301563D0 HU9301563D0 (en) | 1993-09-28 |
| HUT64571A true HUT64571A (en) | 1994-01-28 |
Family
ID=24483529
Family Applications (2)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU9301563A HUT64571A (en) | 1990-11-29 | 1991-10-03 | A method for producing hemoglobin preparatives containing imido ester cross bind |
| HU95P/P00661P HU211703A9 (en) | 1990-11-29 | 1995-06-30 | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
Family Applications After (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| HU95P/P00661P HU211703A9 (en) | 1990-11-29 | 1995-06-30 | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions |
Country Status (22)
| Country | Link |
|---|---|
| US (2) | US5362855A (hu) |
| EP (1) | EP0559655B1 (hu) |
| JP (1) | JPH06502848A (hu) |
| AT (1) | ATE119917T1 (hu) |
| AU (1) | AU650287B2 (hu) |
| CA (1) | CA2093650A1 (hu) |
| CZ (1) | CZ281912B6 (hu) |
| DE (1) | DE69108258T2 (hu) |
| DK (1) | DK0559655T3 (hu) |
| ES (1) | ES2069908T3 (hu) |
| FI (1) | FI932461A (hu) |
| HU (2) | HUT64571A (hu) |
| IE (1) | IE914144A1 (hu) |
| IL (1) | IL99785A (hu) |
| MX (1) | MX9102239A (hu) |
| NO (1) | NO931956D0 (hu) |
| NZ (1) | NZ240377A (hu) |
| PL (1) | PL167340B1 (hu) |
| PT (1) | PT99666A (hu) |
| SK (1) | SK54993A3 (hu) |
| WO (1) | WO1992009630A1 (hu) |
| ZA (1) | ZA918348B (hu) |
Families Citing this family (17)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP0646130B1 (en) * | 1993-03-16 | 1996-12-11 | Hemosol Inc. | Selective crosslinking of hemoglobins by oxidized, ring-opened saccharides |
| US6242417B1 (en) | 1994-03-08 | 2001-06-05 | Somatogen, Inc. | Stabilized compositions containing hemoglobin |
| US5631219A (en) * | 1994-03-08 | 1997-05-20 | Somatogen, Inc. | Method of stimulating hematopoiesis with hemoglobin |
| DE4418973A1 (de) * | 1994-05-31 | 1995-12-14 | Barnikol Wolfgang | Verfahren zur Herstellung molekular-einheitlicher hyperpolymerer Hämoglobine |
| US6150507A (en) * | 1995-03-23 | 2000-11-21 | Biopure Corporation | Method for producing a purified hemoglobin product |
| US5981716A (en) * | 1995-06-07 | 1999-11-09 | Gruppo Lepettit, S.P.A. | Process for the purification of proteins |
| FR2736930B1 (fr) * | 1995-07-17 | 1997-09-19 | Biocem | Procede de production, par des cellules vegetales, de proteines heminiques, proteines ainsi obtenues et produits contenant ces proteines |
| US5872015A (en) * | 1996-05-10 | 1999-02-16 | Board Of Trustees Of The University Of Illinois | Molecular diversity screening method |
| EP0941130B1 (en) * | 1996-11-05 | 2003-03-26 | Challenge Bioproducts Co., Ltd. | Chemical modification of biomedical materials with genipin |
| US7282220B1 (en) | 1996-11-05 | 2007-10-16 | Hsing-Wen Sung | Genipin-crosslinked gelatin microspheres as drug carrier |
| US6949384B2 (en) * | 2001-12-21 | 2005-09-27 | Spectromedical Inc. | Method for monitoring degradation of Hb-based blood substitutes |
| US7449339B2 (en) * | 1999-11-23 | 2008-11-11 | Nir Diagnostics Inc. | Spectroscopic method and apparatus for total hemoglobin measurement |
| CN100431602C (zh) * | 2003-01-29 | 2008-11-12 | 北原实验室有限公司 | 具有低量四聚体的聚合血红蛋白溶液及制备方法 |
| US7135554B1 (en) * | 2004-01-27 | 2006-11-14 | Biopure Corporation | Method of forming a polymerized hemoglobin solution from stabilized hemoglobin |
| DE102011105525B4 (de) * | 2011-06-24 | 2015-03-26 | Sartorius Stedim Biotech Gmbh | Verfahren zur Abtrennung von Biopolymer-Aggregaten und Viren aus einem Fluid |
| WO2019018403A1 (en) | 2017-07-18 | 2019-01-24 | Virtech Bio, Llc | BLOOD SUBSTITUTES COMPRISING HEMOGLOBIN AND METHODS OF MAKING |
| CN111989568B (zh) * | 2018-04-18 | 2024-05-28 | 积水医疗株式会社 | 血红蛋白分析方法 |
Family Cites Families (12)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US3925344A (en) * | 1973-04-11 | 1975-12-09 | Community Blood Council | Plasma protein substitute |
| US4001200A (en) * | 1975-02-27 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Novel polymerized, cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4001401A (en) * | 1975-02-02 | 1977-01-04 | Alza Corporation | Blood substitute and blood plasma expander comprising polyhemoglobin |
| US4061736A (en) * | 1975-02-02 | 1977-12-06 | Alza Corporation | Pharmaceutically acceptable intramolecularly cross-linked, stromal-free hemoglobin |
| US4053590A (en) * | 1975-02-27 | 1977-10-11 | Alza Corporation | Compositions of matter comprising macromolecular hemoglobin |
| DE3144705C2 (de) * | 1981-11-11 | 1983-12-08 | Biotest-Serum-Institut Gmbh, 6000 Frankfurt | Verfahren zur Herstellung eines lagerstabilen, vernetzten Hämoglobinpräparates mit hoher Sauerstoff-Transportkapazität, sowie das nach diesem Verfahren hergestellte Hämoglobinpräparat |
| US4600531A (en) * | 1984-06-27 | 1986-07-15 | University Of Iowa Research Foundation | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield |
| US4711852A (en) * | 1984-11-05 | 1987-12-08 | Akzo N.V. | Control for blood gas analyzers and hemoglobin analysis |
| US4826811A (en) * | 1986-06-20 | 1989-05-02 | Northfield Laboratories, Inc. | Acellular red blood cell substitute |
| WO1988003408A1 (en) * | 1986-11-10 | 1988-05-19 | Biopure Corporation | Extra pure semi-synthetic blood substitute |
| GB8710598D0 (en) * | 1987-05-05 | 1987-06-10 | Star Medical Diagnostics Ltd | Hemoglobin based blood substitute |
| IL87708A (en) * | 1988-09-08 | 1994-04-12 | Technion Inst For Research And | Hemoglobin-based blood substitute possessing a colloid oncotic pressure substantially similar to human blood and method for the preparation thereof |
-
1991
- 1991-10-03 AT AT91917174T patent/ATE119917T1/de not_active IP Right Cessation
- 1991-10-03 JP JP3516187A patent/JPH06502848A/ja active Pending
- 1991-10-03 EP EP91917174A patent/EP0559655B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 WO PCT/US1991/007155 patent/WO1992009630A1/en active Search and Examination
- 1991-10-03 PL PL91299380A patent/PL167340B1/pl unknown
- 1991-10-03 ES ES91917174T patent/ES2069908T3/es not_active Expired - Lifetime
- 1991-10-03 SK SK54993A patent/SK54993A3/sk unknown
- 1991-10-03 DE DE69108258T patent/DE69108258T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1991-10-03 AU AU85466/91A patent/AU650287B2/en not_active Ceased
- 1991-10-03 HU HU9301563A patent/HUT64571A/hu unknown
- 1991-10-03 CZ CZ93854A patent/CZ281912B6/cs unknown
- 1991-10-03 DK DK91917174.4T patent/DK0559655T3/da active
- 1991-10-03 CA CA002093650A patent/CA2093650A1/en not_active Abandoned
- 1991-10-18 IL IL9978591A patent/IL99785A/en not_active IP Right Cessation
- 1991-10-18 ZA ZA918348A patent/ZA918348B/xx unknown
- 1991-10-29 NZ NZ240377A patent/NZ240377A/xx unknown
- 1991-11-27 MX MX9102239A patent/MX9102239A/es not_active IP Right Cessation
- 1991-11-28 IE IE414491A patent/IE914144A1/en unknown
- 1991-11-29 PT PT99666A patent/PT99666A/pt not_active Application Discontinuation
-
1993
- 1993-05-20 US US08/065,170 patent/US5362855A/en not_active Expired - Fee Related
- 1993-05-28 NO NO931956A patent/NO931956D0/no unknown
- 1993-05-28 FI FI932461A patent/FI932461A/fi unknown
-
1994
- 1994-06-15 US US08/260,173 patent/US5521154A/en not_active Expired - Fee Related
-
1995
- 1995-06-30 HU HU95P/P00661P patent/HU211703A9/hu unknown
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| WO1992009630A1 (en) | 1992-06-11 |
| IL99785A (en) | 1996-05-14 |
| ZA918348B (en) | 1993-04-19 |
| US5362855A (en) | 1994-11-08 |
| AU650287B2 (en) | 1994-06-16 |
| PT99666A (pt) | 1992-10-30 |
| AU8546691A (en) | 1992-06-25 |
| MX9102239A (es) | 1992-07-08 |
| US5521154A (en) | 1996-05-28 |
| PL167340B1 (pl) | 1995-08-31 |
| EP0559655A1 (en) | 1993-09-15 |
| FI932461A0 (fi) | 1993-05-28 |
| IE914144A1 (en) | 1992-06-03 |
| ATE119917T1 (de) | 1995-04-15 |
| NZ240377A (en) | 1993-01-27 |
| DE69108258T2 (de) | 1995-08-10 |
| IL99785A0 (en) | 1992-08-18 |
| DK0559655T3 (da) | 1995-07-24 |
| HU211703A9 (en) | 1995-12-28 |
| ES2069908T3 (es) | 1995-05-16 |
| FI932461A (fi) | 1993-05-28 |
| HU9301563D0 (en) | 1993-09-28 |
| CA2093650A1 (en) | 1992-05-30 |
| CZ85493A3 (en) | 1994-02-16 |
| CZ281912B6 (cs) | 1997-03-12 |
| NO931956L (no) | 1993-05-28 |
| SK54993A3 (en) | 1993-10-06 |
| EP0559655B1 (en) | 1995-03-15 |
| JPH06502848A (ja) | 1994-03-31 |
| DE69108258D1 (de) | 1995-04-20 |
| NO931956D0 (no) | 1993-05-28 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| US5362855A (en) | Imidoester cross-linked hemoglobin compositions | |
| EP0231236B1 (en) | Purification of hemoglobin and modified hemoglobin by affinity chromatography | |
| EP0195558B1 (en) | Composition of alpha-alpha- cross-linked hemoglobins | |
| US4704274A (en) | Method for the purification of LPF-HA | |
| JP2000513377A (ja) | プリオンのクロマトグラフィー除去方法 | |
| USRE34271E (en) | Production of alpha-alpha cross-linked hemoglobins in high yield | |
| FI104722B (fi) | Pyridoksiloidun hemoglobiinin valmistusmenetelmä | |
| US5115100A (en) | Purification of hemoglobin and methemoglobin by bioselective elution | |
| US5387672A (en) | Hemoglobin intramolecularly cross-linked withlong chain divalent reagents | |
| CA2072081C (en) | Polyhemoglobin stabilized by purine derivatives and glutathione | |
| US5349054A (en) | Activated benzenepentacarboxylate-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin | |
| US5334705A (en) | Benzenetricarboxylate derivative-crosslinked low oxygen affinity hemoglobin | |
| Fronticelli et al. | [10] Conformational and functional characteristics of bovine hemoglobin | |
| Roth et al. | Production of modified crosslinked cell‐free hemoglobin for human use: the role of quantitative determination of endotoxin contamination | |
| KR100361894B1 (ko) | 치환크로마토그라피방법및정제된헤모글로빈생성물 | |
| Acharya et al. | Reductive hydroxyethylation of the α-amino groups of amidated hemoglobin S | |
| Menu et al. | Haemoglobin Pyridoxalation in Phosphate Buffer: Comparison of Results with Those Obtained with Tris-Hcl Buffer |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| DFD9 | Temporary protection cancelled due to non-payment of fee |