JPS61501510A

JPS61501510A - ビ−ルスリスクを減らしたヘモグロビンおよびその製造方法

Info

Publication number: JPS61501510A
Application number: JP60500980A
Authority: JP
Inventors: エステツプ，チモニー　エヌ
Original assignee: バクスタ−、トラベノ−ル、ラボラトリ−ズ、インコ−ポレイテッド
Priority date: 1984-03-23
Filing date: 1985-02-19
Publication date: 1986-07-24
Also published as: EP0179075B1; DE3587351T3; CA1258230A; EP0179075A1; IT8520016A0; WO1985004407A1; ATE89569T1; EP0179075B2; IT1187642B; DE3587351D1; EP0179075A4; DE3587351T2

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ビー・ルスリスクを減らしたヘモグロビンおよびその製造方法本発明はヘモグロビン製剤中のビールスを不活性化する方法に関する。特にそれはヘモグロビンの生物学的活性を最小に不活性化しながら、そのようなビールスの生物学的感染性を破壊ることに関する。

種々の文献および特許ソースは血漿タンパク分画中のビールスを不活性化する方法の開示を含んでいる。効果的な方法は乾熱不活性化、すなわちビールス汚染を保持している疑いのある凍結乾燥したタンパクを、所望のビールス不活性が得られるまで、約５０℃以上の温度で乾燥状態において単に加熱する方法を採用している。この種の代表的方法はＰＣＴ公開ＷＯ３２１０３８７１に開示されている。

他の技術も熱を使用するが、しかしながらタンパク分画は乾燥でｉｔなく水溶液中において加熱される。所望のタンパクの生物学的活性を保存するために安定剤が溶液中に含まれる。例えば、米国特許第４，２９７，３４４号および第４　、３２７　、０８６号、ヨーロッパ特許出願第５３゜３３８号および第５２．８２７号を見よ。この目的に使用された安定剤はグリシン、アルファもしくはベーターアラニン、ヒドロキシプロリン、グルタミン、アルファ、ベーターもしくはガンマアミノ酪酸、モノサッカライド、オリゴサツカライド、糖アルコール、有機カルボン酸、中性アミノ酸、キレート剤およびカルシウムイオンである。

どの発表もビールス熱不活性化プロセスにおける安定剤として抗酸化剤の使用を開示もしくは示唆していない。

これら方法は両方とも、熱が研究した不安定なタンパクよりも大きい速度でビールスを不活性化するとの発見を基礎とするが、しかしながら溶液中の加熱の場合、所望のタンパクを安定化するが、しかしビールス汚染物を同時に同様に安定化しない試薬もしくは安定剤が存在することを条件とする。

抗酸化剤は過去においてヘモグロビンに関連して使用されている。

Ｈｏ１ｌｏｃｈｅｒ、　”　Ｊ、　Ｂｉｏｌ、　Ｃｈｅ＋ｉ、　”　２４１　：　９　（１９６６）はチオシアネートがヘモグロビンの熱安定性を低下させることを観察している。

ヨーロッパ特許出［７８９６１号は、抗酸化剤の使用によって架橋したヘモグロビンを酸化に対して安定化することを教える。

Ｄａｌａｎｄ　ｅｔ　ａｌ、、　”　Ｊ、　Ｌａｂ、　Ｃｌ１ｎ、　Ｍｅｄ、　 ”　３１４　：　１０８２−１０８８　（１９４Ｂ）は、鎌状赤血球血症をアッセイするため、赤血球ヘモグロブリンを還元するために還元剤を使用している。

アスコルビン酸ナトリウムは長期保存中の劣化からヘモグロビン分子を保護するのに効果がないことが開示された。　Ｒａｄｉｎｅｒ　ｅｔ　ａｌ、＋”　Ａｎｎ、　Ｓｕｒｇ、　”　１７１　：　６１５　（１９７０）。

ヘモグロビン溶液は、結晶ヘモグロビンの溶液として、または他のヘモグロビンもしくはポリサンカライドのようなマクロ分子へ架橋されたポリマーとして、代用血液として使用することが提案された。例えば米国特許第４，００１，４０１；　４，０６１，７３５；　４．０５３．５９０；　４゜ＯＱｌ、２００　；および西ドイツ公開特許３０２’１１３０７および２６１６０８６を見よ。

これらの製品のすべては出発物質として全血からのヒト赤血球を使用するプロセスによって得られる。ヘモグロビンは溶解および遠心し、ピリドキサール基の置換を含む既知の技術に従って処理することにより、赤血球の生成した物質（支質を含む）から分離される。

これらの方法は、全血出発物質中に存在するビールスが感染性の形で最終ヘモグロビン製品中に移行しないことを保証することに関心がない。全血は肝炎Ａ、Ｂおよび非Ａ＄Ｂビールス、サイトメガロビールス、エプスタイン−バービールスを含み得ること、および後天性免疫欠乏症候群（ＡＩＤＳ）のビールス性病因剤を含むものと推測されていることは良く知られている。

本発明の目的は、患者へ投与されたヘモグロビン含有組成物の外来ビールス性汚染物による患者の感染のリスクを減らすことである。

他の目的は、ヘモグロビンがその生体内における酸素運搬機能を果たし得なくなるようにヘモグロビンの実質的な割合を変性することなく、そのようにすることである。

以下に使用するヘモグロビンなる術語は、特記しない限り、オキシカルボキシ− およびデオキシヘモグロビン、およびビルドキサール化（ピリドキサール−５” 　−リン酸との反応によってピリドキサール基へ共有結合された）および／またはそれらの架橋誘導体について共用される。架橋誘導体は、グルタルアルデヒド、開環したジオール、または３，５−ジブロムサリチルルビスーツマレート（ＤＢＢＦ）架橋ヘモグロビンを含む。これらヘモグロビン誘導体は良く知られている。

盟−一１私は、（ａｌヘモグロビン含有組成物と（ｂｌ還元剤とを、ヘモグロビンを実質上生物学的に不活性化することなくビールスが実質上生物学的に不活性化されるような条件下で加熱することよりなる、ヘモグロビン含有組成物中の生物学的に感染性ビールスのリスクを減らす方法を発見した。この方法の製品は、生物学的に活性なヘモグロブリンと、熱で不活性化されたビールス残渣とを含み、生物学的に不活性なヘモグロビンを実質上音まない。最終製品は還元剤を含み得る。そして組成物は乾燥物もしくは水溶液でよい。

皿皿坐五里星皮肌第１図は、溶液中５６℃で１０時間加熱後のヘモグロビンに対する亜ニチオン酸塩還元剤の安定効果を開示する。

韮豊亙澹ユ生物学的に活性なヘモグロビンは、生体内において天然のヘモグロビンの酸素運搬機能を果たすことのできるグロブリンである。しかしながら、該ヘモグロビンはその赤血球環境において見られる効率をもって機能することは必要ではない。

むしろここでの熱処理なしの材料と、そのような熱処理後の匹敵するロフトの間に比較がなされる。この比較はこの分野で既知の生体内もしくは試験管内アッセイにより、例えばテスト組成物による交換輸血の後ラットの動脈静脈酸素差の測定により、または処理前後のヘモグロビンの吸収スペクトルの変化によって実施することができる。生物学的に不活性なヘモグロビンは、そのタンパク成分が熱により変性または他に悪く衝撃を受けていれば、例えばメトヘモグロビンへ変化している。

ヘモグロビン組成物は、結晶ヘモグロビンを含む、天然の実質上精製したヘモグロビンのほかに、上で論じたヘモグロビン誘導体を含む。通常人はメトヘモグロビンもしくはその誘導体には、それらは前のパラグラフにおいて論じたように生物学的に不活性であるため、関心がないであろう。適当なヘモグロビン組成物は、理想的には総タンパクの重量の少なくとも９９％のヘモグロビンを含み、約３ μｇ　／　ｍ１未満の総リン脂質含量と、フォスファチジルセリンもしくはフすスファチジルエタノールアミンのどちらかの約μｇ／ｄ未満と、６％未満の不活性ヘム色素と、約２４ないし３２１ｍ）１ｇの酸素親和性（Ｐｓｏ）（３７℃、ｐ　Ｈ７，４、Ｉ）ＣＯ２４０ｍＨｇ、および１ｍＭヘモグロビン）と、少なくとも約１．８のヒル氏定数と、そして少なくとも約１７．ｄＯｚ／ａＪヘモグロビン／８液の酸素結合能力とを有するであろう。こら仕様書は臨界的ではなく、他のものも使用することができる。

ヘモグロビン組成物は、一般に水中に約１ないし４０　ｇ／ｄ！、好ましくは１ないし１４．５ｇ／ｄ１の濃度で熱処理前に溶解されるであろう。選択される濃度は、溶液がそのまま治療用途にされるのか、または限外口過等によってさらに処理もしくは凍結乾燥されるのかによるであろう。後者の場合、濃度は後の処理工程において便利に取扱える任意の濃度でよいや製品が注入される場合は、それは好ましくは約１３．５ないし１４．５ｇヘモグロビン組成物／ｄｉの濃度を持゛つであろう。

還元剤はヘモグロビンを加熱の間デオキシ形に維持する物質もしくは薬品もしくは生理的妨害であるが、しかし一般に生理学的に許容でき、かつアスコルビン酸塩よりも大きいもしくはもっと効果的な還元電位を持つ化学還元剤である。私は、アスコルビン酸はここでの目的のためヘモグロビンを熱安定化するのに比較的効果的でないことを発見した。還元したレドックス染料およびスルフヒドリルまたはスルホキシ化合物は多数の許容し得る試薬を包含する。適当な還元剤はアルカリ金属亜ニチオン塩酸、重亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩または亜硫酸塩、還元したグルタチオンおよびジチオトレイトールである。亜ニチオン酸塩が好ましい。

これら試案は後記実施例２に示した方法によって、有効性について容易にアノセセイすることができる。

ヘモグロビン組成物の水溶液中に含むべき還元剤の量は、還元剤の還元力、ヘモグロビンの量、推定されるビールス負荷（そしてその結果熱処理の強さ）、酸化性溶質および酸素の存在、および当業者には自明である他のファクターに依存して変化するであろう。従って、最適濃度は日常的な実験によって決定されるであろう。これは、ビールス不活性化条件下ヘモグロビンの生物学的活性の実質的割合を保存するのに十分であるがしかし酸量より多くない還元剤が含まれるように、後記実施例２に記載するように、ヘモグロビンスピクトルの試験管内変化を追従することによって実施することができる。亜ニチオン酸塩は、ヘモグロビン溶液巾約１０ないし１００１、好ましくは約２０ないし４０ｍＭの濃度で使用することができる。

還元剤に加えて種々の添加剤が組成物中に存在してもよい。例えば、リン酸塩、重炭酸塩またはトリスのような緩衝剤（ｐＨ約７〜８へ）、血景中に見られるよりも一般に少ない濃度の無機イオン（例えば、約１５０　ｍｅｑ／　ｌ各自以下のナトリウムおよび塩素イオン）。

およびアミノ酸およびサツカライドのような凍結乾燥安定剤である。

凍結乾燥したヘモグロビンが熱処理される時は、マンノースまたは糖アルコールのような非還元糖を使用すべきである。

還元剤を含有しているヘモグロビン溶液の熱処理は、マイクロウェーブ、赤外線、または抵抗ヒーターもしくは水浴のような器具による熱接触のような、任意の加熱方法によって実施することができる。組成物の温度は、局部過熱を避けるために、比較的均一な加熱と矛盾せずにできるだけ速くビールス不活性化温度まで上昇させられる。この温度は、もし不活性化を合理的な短時間で発生させるべきであれば、約５０℃ないしＳＯ℃、好ましくは約６０’Ｃの範囲であろう。この時間は、典型的には溶液については約５ないし１５時間、好ましくは約１０時間であり、乾燥した組成物については約２０ないし９６時間の範囲であろう。温度が高ければ高い程短いインキュベーションが使用されるであろう。不活性化の時間および温度は・ビールス生物負荷、タンパク濃度、ヘモグロビンの性格（架橋されているか否か）、および還元剤濃度のような多数のファクターに依存するであろう。ビールス殺滅のための処理プロセスの有効性は、処理すべき組成物の部分標本へ、動物ビールスまたはハタテリオファージ、例えばシンドビス、サイトメガロビールスもしはＴ４のようなヒトに対し非感染性の候補ビールスを接種することによって最良にアッセイされる。そのようなアッセイのための適当な方法は、ＰＣＴ公開ＷＯ３２１０３８７１に開示されている。還元剤濃度および候補ビールス不活性化の時間および温度は、熱不活性化のための最適条件に達するように、ヘモグロビン生物学的活性の損失に対してバランスされる。候補ビールスの不活性化は、ビールス活性の少なくとも３および好ましくは６対数の減少が得られるまで進めなければならない。これは、本発明により、ヘモグロビン生物学的活性の実質的損失なしに、すなわちヘモグロビンのたった工ないし１５モルパーセントが晋通の場合生物学的に不活性になるだけで達成される。

生成する製品は生物学的に活性なヘモグロビンを含有し、生物学的に不活性なヘモグロビンを実質上含有せず、そして生物学的に非感染性のビールスを含有するであろう。生物学的に非感染性のビールスの残渣は、生体内（組織培養または宿主動物）ビールス感染性アッセイに匹敵する、一般にこの方法によって免疫学的に破壊されないビールス抗原についての免疫アッセイによって検出することができる。ビールス感染性の損失もしくは欠除と組み合わせたビールス抗原の存在は、本発明方法に従って処理された製品の指標である。

熱処理された溶液はそれらを治療用途に便利とするために処理することができる。希薄ヘモグロビン溶液は限外口過および／または凍結乾燥によって濃縮することができる。限外口過は、もし過剰の還元剤を除去すること、すなわち還元剤の濃度を生理学的に許容し得るレベルへ減らす必要がある時にも有用である。これは通常約５１未満のオーダーであろうが、しかし正確な量は注入の予測される速さおよび還元剤の性格に依存するであろう。例えば、還元されたグルタチオンは比較的無害であり、そして組成物中に比較的高い割合で残ってもよい。

熱処理工程は、前に述べたピリドキサール化または架橋の前または後で実施することができる。好ましくはヘモグロビンは熱処理前にピリドキサール化および架橋される。これは製造中に発生し得るビールス汚染も処理されることを確実にするのを助ける。もし熱処理中使用された還元剤の量が生理的に許容できれば、加熱はバッグまたはバイアルのような最終充填した容器中で発生してもよい。

ヘモグロビン組成物は、熱処理される時有利には水溶液中であるが、しかし乾燥組成物も熱処理することができる。例えば、もしヘモグロビン組成物を長期間貯蔵しようと意図するならば、それは還元剤を含む溶液から凍結乾燥または乾燥し、次に加熱されることができる。

以下の実施例は例証を意図し、本発明の範囲を限定するものと解してはならない。

実施例１この企図する操作は、本発明に従ってヘモグロビン組成物を処理し得る態様の例証である。支質不含ヘモグロビン１ｇ％１亜ニチオン酸ナトリウム（Ｎａ２Ｓｚ０４）　３０ｍＭ＋　そしてｐＨを７．５に維持するのに十分な重炭酸ナトリウム緩衝剤（０，１ないし０．３Ｍ）を含む溶液を調製する。この溶液１００ｍＪ２をガラスバイアル中に頭部にガス空間を残さないようにシールし、水浴中に浸漬して６０℃で１０時間加熱する。加熱後溶液をバイアルから除去し、過剰の亜ニチオン酸塩を除去しそして媒体中のイオン含量を調節するため３０，０００　ＭＷカットオフ膜の上で透析口過し、ヘモグロビン含量１４ｇ／ｄｌへ限外口過し、そして粒状物質およびバクテリアを除去するため０．２ミクロンフィルターを通過させる。

実施例２０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液中の支質を含まないヘモグロビン溶液へ亜ニチオン酸ナトリウム９２ｍＭを加えた２ｖ：、料を頭部空間なしにシールしたバイアル中で水浴中１０時間５６℃で加熱した。対照は１）亜に千オン酸ナトリウムが存在しないことを除いて他の点では同じヘモグロビン溶液と、２）加熱しないで室温において１０時間貯蔵した亜ニチオン酸塩含有溶液であった。試料の一方を亜ニチオン酸塩を除去するため透析した。両方の試料および両方の対照から部分標本を取り出し、光学密度を４００ないし７００　ｍμの範囲にわたって測定した。結果を第１図に示す。還元剤を含有している試料および対照の両方は典型的なデオキシ−・モグロビンスベクトルを示した。亜ニチオン酸塩を除去した試料は生物学的に活性なオキシヘモグロビンスペクトルを示した。他方、加熱した対照ヘモグロビンはスペクトル分析により実質上全部メトヘモグロビンであり、生物学的に不活性である。このように、ヘモグロビンの生物学的活性は還元剤の存在下において保持されるが、しかし還元剤なしの加熱によって失われる。

実施例３この企図する実施例においては、還元剤を含む加熱したテスト組成物について実施例１の操作が繰り返される。この組成物は３部分標本に分けられ、それぞれは５ｉｎｄｂｉｓ、　ｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｏｃａｒｄｉｔｉｓ（ＥＭＣ）　、　、＃よびアデノタイプ５ビールスをもって、それぞれ６〜７　ｌｏｇ＋ｏブラック形成単位（ＰＦｔｌ　）　／ｙｒｄ１．　４　］、ｏｇｍ　ＰＦＩＪ／ｍおよび４．５１ｏｇｍ組織培養５０％感染投与量（ＴＣＩＤ−５０）　／ｄのビールス濃度になるように接種された。

ＴＣＩＤ呼称は以下のように説明できる。生物学的定量化においては、エンドポイントが通常テスト系細胞の一定割合が反応もしくは死滅する希釈度として採用される。１００％エンドポイントがしばしば使用される。しかしながらその精度は小さいチャンスの変動によって大きく影響される。望ましいエンドポイントはテスト系の半分が反応するが、他の半分は反応しない状況を表すものである。

最良の方法は、多数のテスト系を５０％反応のための値に近い接近した希釈度において使用し、そして正確な値を補内することである。

ＴＣＩＤｉｏエンドポイントカ価の負対数＝組織培＃５０％エンドポイントは、接種した培養中の細胞の５０％に細胞病変を引き起こすビールス力価を表す。濃度の測定のため上の技術の通用において、対数希釈液が最小必須培地プラス２％ウシ胎児血清中に調製される。各希釈液０．２７ｄがマイクロタイタープレート中のＢ　ＧＭＫ　（Ｂｕｆｆａｌｏ　Ｇｒｅｅｎ　Ｍｏｎｋｅｙ　Ｋｉｄｎｅｙ　）の複製培養へ添加される。接種した培養物は３６℃において５％ＣＯｚ下においてインキュベートされ、そして７ないし８日の期間にわたって顕微鏡的に観察される。与えられた希釈度における培養物中の細胞の死滅パーセントが、屈折性の細胞によって証明される細胞の退化について観察することによって測定される。

次にＴＣＩＤ−５０は上に示したように計算することができる。

ＥＭＣ７＝ｉヨヒ５ｉｎｄｂｉｓビールス感染力価は、上に記載したようにビールス懸濁液の希釈液を調製することによって得られる。ＢＧＭＫ細胞単層が３５鶴ベトリ皿に調製された。細胞へのビールスの吸着はＲ層へ懸濁液０．２ｄを加えることによって開始された。１時間後、単層を栄養寒天培地２戚で覆い、２４〜７２時間３７℃でインキュベートした。生成したブラックは次に食塩水中重量比１：２０００のニュートラルレッドで細胞を染色することによって可視化された。

ビールスについての結果は、データへ直線が適合することを許容するため最小自乗法を使って回帰解析にかけ、そしてプロットした。

同様な結果がすべてのビールスについて得られた。３標本のすべてにおけるビールス感染力価は方法ｌ熱処理によって著しく減少し、それによって肝炎その他による患者の感染のリスクが減った。

実施例４この企図実施例においては、編集者Ｂｏｌｉｎ　ｅｔ　ａｌ−＋　Ａｄｖａｎｃｅｓ　１ｎＢｌｏｏｄ　５ｕｂｓｔｉｔｕｔｅ　Ｒｅ５ｅａｒｃｈ、　Ｎｅｗ４Ｙｏｒｋ＋　Ａｌａｎ　Ｒ，ｌ−１ｓｓ＋　（１９８３）中のＴｙｅ　ｅｔ　ａｌの論文およびそれに引用されている文献によって開示された方法に従って、支質不含ヘモグロビンが３．５−ジブロムサリチル−ビス−フマレートによって架橋され、次にピリドキサール化されたことを除き、実施例１の方法がくり返された。

Ｎ　か　、蜘　、祠国際調を報告一一−−Ａ−ａ−Ｉ−Ｎ−ｇＴＮｓ　８５　Ｉ　００２５τ

Claims

【特許請求の範囲】１．ビールス性生物学的感染性を含有する疑いのあるヘモグロビン組成物のビールス性生物学的感染性を減らす方法であって、前記組成物と還元剤とを、ビールスは実質上生物学的に不活性になるがしかしヘモグロビンは実質上生物学的に不活性化されない条件下で加熱することよりなる前記方法。前記条件は加熱時間である第１項の方法。前記加熱時間は、前記組成物の水溶液については約５ないし１５時間であり、乾燥組成物については約２０ないし９６時間である第２項の方法。加熱温度は約５０℃ないし８０℃である第１項の方法。還元剤は還元された染料、スルホキシまたはスルフヒドリル化合物である第１項の方法。６．還元剤は亜ニチオン酸塩、重亜硫酸塩、メタ重亜硫酸塩、亜硫酸塩、還元したグルタチオンまたはジチオトレイトールである第５項の方法。７．前記組成物は架橋および／またはピリドキサール化されている第１項の方法。８．生物学的に活性なヘモグロビンと、生物学的に非感染性のビールスを含み、生物学的に不活性なヘモグロビンを実質上含まない組成物。９．生物学的に不活性なヘモグロビンはメトヘモグロビンである第８項の組成物。１０．生物学的に非感染性なビールスは免疫学的に検出可能であるが、しかし実質上生物学的に非感染性である第８項の組成物。１１．約１ないし１５モル％の生物学的に不活性なヘモグロビンを含有している第８項の組成物。１２．ヘモグロビンは架橋および／またはピリドキサール化されている第８項の組成物。１３．還元剤をさらに含んでいる第８項の組成物。