CN1203900C - 用于淬灭生物材料中病原体灭活剂的方法 - Google Patents

用于淬灭生物材料中病原体灭活剂的方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供了用于淬灭生物材料中的病原体灭活化合物的不必要副反应的方法。在一个具体实施方案中，提供了用于淬灭包括本身是或能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物的不必要副反应的方法。在该实施方案中，材料用病原体灭活化合物及淬灭剂处理，其中所述淬灭剂包括能与所述亲电子基团共价反应的亲核性基团。病原体灭活化合物上的亲电子基团优选非游离基形式的阳离子基团。在一个实施方案中，所述病原体灭活化合物包括可结合核酸的配体以及芥基团，其中所述芥基团能在原位反应以形成亲电子基团。优选的淬灭剂是硫醇类，如谷胱甘肽。可处理的生物材料包括全血、红细胞、血浆及血小板。这些方法能在灭活病原体期间抑制对含红细胞的材料中红细胞的修饰。

Description

用于淬灭生物材料中病原体灭活剂的方法
                  相关申请的交叉参考
本申请要求1998年1月6日提交之美国临时申请流水号60/070,597(所公开内容已引入本文作为参考)的权利。
                       技术领域
本申请涉及用亲核化合物处理生物材料如血制品以淬灭该材料中活性亲电化合物的方法。
                       技术背景
疾病通过血制品及其它生物材料的传播一直是一个严重的健康问题。尽管迄今已在供血者筛选及血液检查方面有了显著进步，但诸如乙型肝炎病毒(HBV)、丙型肝炎病毒(HCV)、及人类免疫缺陷病毒(HIV)等病毒因在血制品中病毒或病毒抗体水平太低，而可以逃避检测。除了病毒的危害，目前尚无正式批准的检验可用于筛选输血用血液中是否有细菌或原生动物。因目前未知的病原体可能在血液供应中普遍存在而传播疾病的危险仍然存在，就如同认识到HIV通过输血传播的危险性之前所发生的一样。
实验室工作人员接触血液或其它体液也存在健康危害。据疾病控制中心估计，到1989年，每年有12,000名因工作而接触血液的医务工作人员被乙型肝炎病毒感染。“医务人员及公共卫生人员预防人类免疫缺陷病毒和乙型肝炎病毒传播指南”发病及死亡周刊(Morbidity andMortality Weekly Report)，卷38，第S-6期，1989年6月。该统计说明需要能灭活生物材料中病原体的方法。
现在已经在血制品临床应用前将化学试剂加入血液或血浆以灭活病原体。有关光化学灭活病原体的方法和组合物已有描述。美国专利第5,587,490号和第5,418,130号描述了用于光化学灭活体液中的病毒或细菌污染物的取代型补骨脂素。酚噻嗪类如亚甲蓝已显示在光照下可灭活血制品中的病原体。Wagner等，输血， 33：30-36(1993)。美国专利第5,637,451号描述了通过加入酞菁化合物并进行辐射而灭活含红细胞之材料中的病毒的方法。
光化学灭活病原体法的不利之处是，同时产生的活性自由基及各种氧也可导致对血制品的损害，使它们的预期应用的适用性减小。自由基淬灭剂已在灭活病原体的光化学方法中应用，以减小光化学反应期间发生的自由基损害并使其最小化，如美国专利第4,727,027、5,587,490、5,418,130、5,232,844、5,658,722和5,637,451号，和国际专利申请WO97/16966所述。
已开发了无需光活化就可灭活病原体的化合物。这些化合物通常为可与病原体反应的亲电子物质。例如，美国专利第5,055,485号描述了用芳香基二酚环氧基灭活细胞以及含有蛋白的组合物中的病毒。其它化合物可原位产生亲电子基团。LoGrippo等评估了氮芥CH3-N(CH2CH2Cl)2在病毒灭活中的应用。LoGrippo等，国际输血协会第六次大会汇编，Bibiotheca Haematologica(Hollander编)，1958，第225-230页。更明显的是，美国专利第5,691,132和5,559,250号(所公开内容已引入本文作为参考)描述了用N1，N1-双(2-氯乙基)-N4-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)-1，4-戊二胺(“奎吖因芥”)和5-[N，N-双(2-氯乙基)氨基]甲基-8-甲氧基补骨脂素灭活血液、血制品及各种生物来源样品中的病原体。已应用的还有包括共价连接至多胺部分的氮丙啶的病原体灭活化合物，如Budowsky等，疫苗研究 5：29-39(1996)所述。
理想地，将可被亲电反应或中间产物灭活的病原体灭活化合物加入血制品或其它生物样品中可灭活病原体，而不会对样品造成任何不必要的改变。病原体灭活化合物与病原体通过亲电过程反应，无需光活化。因此不会产生各种活性氧或自由基，不需考虑因氧化所致损害。但可能出现其它不必要副反应。例如，可能与不同生物材料包括蛋白质发生亲电反应。这些副反应有可能损及生物样品用于预定目的。
因此，需要有方法可阻止与病原体产生亲电相互作用之病原体灭活化合物的不必要的亲电副反应，并同时保持病原体灭活化合物灭活有害病原体的能力。需要有方法可灭活生物材料中的病原体而又减小不必要副反应。
                       发明公开
本发明提供了用于淬灭材料中含活性基团的化合物的方法。材料如生物材料中的各种化合物可用本文所述方法淬灭。可淬灭的化合物包括含有、或能形成并已在原位形成活性基团如亲电子基团的官能团的化合物。例如，官能团可能是能原位形成活性基团如亲电子氮丙啶、吖丙啶鎓离子硫杂丙环或硫杂丙环鎓离子(thiiraniium ion)的芥基团。在另一实施方案中，该官能团可以是环氧基(epoxide)。
在一个实施方案中，提供了对用于灭活生物材料中病原体的病原体灭活化合物的副反应进行淬灭的方法。在一个具体实施方案中，提供了用于淬灭含有本身为、或能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物不需要的副反应的方法。在该实施方案中，生物材料用病原体灭活化合物和含有能与亲电子基团共价反应之亲核性官能团的淬灭剂进行处理。病原体灭活化合物上的亲电子基团在一个优选实施方案中是阳离子基团。生物材料可用病原体灭活化合物及淬灭剂在例如体外或离体进行处理。在一个优选实施方案中，将病原体灭活化合物与淬灭剂以有效量加入材料中以灭活其中的病原体，并同时使淬灭剂淬灭病原体灭活化合物的不必要副反应。
在一个实施方案中，可将淬灭剂加入多相系统如两相系统。例如，可将淬灭剂施与以膜分隔第一相和第二相的两相系统。在一个实施方案中，一个相与所述膜结合。例如，所述膜可限定致病性生物体的外膜，第一相可以是内含该致病性生物体的相，第二相可以是该致病性生物体的内部。膜可以是例如病毒的脂质包被，第一相可以是含有病毒的体液，如血液，第二相可以是含病毒核酸的病毒内部。在另一实施方案中，所述膜可以是细胞膜，膜结合相可以是致病性单细胞生物体如细菌的内部。在该实施方案中，病原体灭活化合物被导入优选能动力地或热力地跨膜的两相系统中，而淬灭剂相对于病原体灭活化合物基本上不能动力或热力地跨膜。
在一个实施方案中，提供了用于淬灭两相生物材料中病原体灭活化合物的不必要副反应的方法，其中所述生物材料包括含有有膜病原体的第一液相，以及被病原体的膜结合的第二相。因此第二相是包含在病原体膜内的内容物。生物材料用含有能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物处理。在用病原体灭活化合物处理之前、同时、或之后，生物材料用含有能与亲电子基团共价反应之亲核性基团的淬灭剂处理。优选地，淬灭剂在加入病原体灭活化合物之前或同时加入。优选地，病原体灭活化合物能在形成亲电子基团之前动力地或热力地跨膜。优选地，病原体灭活化合物的穿膜速率在形成亲电子基团后相对于形成亲电子基团之前大大降低。优选地，病原体灭活化合物在形成亲电子基团后相对于形成亲电子基团前，基本上不能动力地或热力地跨膜。优选淬灭剂相对于形成亲电子基团之前的病原体灭活化合物基本上不能动力地或热力地跨膜。使淬灭剂与病原体灭活化合物的亲电子基团反应，淬灭剂与病原体灭活化合物亲电子基团的反应优选基本上发生在第一相。含亲电子基团的病原体灭活化合物与病原体核酸在第二膜结合相反应，从而灭活该病原体。这些方法可通过病原体灭活化合物与病原体膜内的病原体核酸的反应而使病原体灭活，同时在有病原体的相中淬灭活性病原体灭活化合物，以及它们所形成的活性物质。
本文公开的方法的好处是，在两相系统中，淬灭剂施用于第一相，基本上不能穿越病原体外膜，因此基本上不出现在第二相即病原体内部。病原体灭活化合物施用于如第一相，并能在形成亲电子基团前穿越病原体膜。原位形成亲电子基团后，病原体灭活化合物基本上不再能跨膜。因此，淬灭只选择性地在第一相中发生，而在第二相即病原体内部，病原体灭活化合物与病原体核酸反应，不被淬灭。因此，在生物材料如血制品中，病原体灭活化合物及其降解产物上活性基团的淬灭选择性地发生在悬浮有病原体的第一相中。因此第一相中的淬灭减少了病原体灭活化合物上活性基团的不必要副反应，如对血液中蛋白质或细胞表面的共价修饰。在该方法中，病原体灭活化合物和淬灭剂以有效量施与，以灭活材料中的病原体并淬灭病原体灭活化合物的不必要副反应。由此，淬7灭剂在减少材料如血液中的不必要副反应，并使得发生病原体的灭活反应方面具有保护效应。
这些方法可用于处理含病原体，如原核生物和真核生物以及脂质包被病毒的生物材料。尤其，这些方法可用于处理有膜病原体，如脂质包被病毒，和包括细胞膜形式的膜的细菌。处理生物材料如血制品(其中含有带膜病原体)的淬灭剂实施例包括谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、巯基乙烷磺酸盐(mercaptoethanesulfonate salt)、或二巯基丙醇。
病原体灭活化合物可包括核酸结合配体和自身是或能形成亲电子基团的官能团，其中所述亲电子基团能与核酸反应以形成与核酸的共价键。病原体灭活化合物还可以进一步包括连接核酸结合配体和官能团的易断裂连接子。例如，所述官能团可以是能原位反应形成亲电子基团的芥基团如吖丙啶鎓离子。病原体灭活化合物实例包括奎吖因芥、N-(2-氯乙基)-N-乙基-N’-(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)-1，3-丙二胺二盐酸盐，和5-[N，N-双(2-氯乙基)氨基]甲基-8-甲氧基补骨脂素。其它病原体灭活化合物包括含有共价连接至多胺部分的氮丙啶的化合物，如Budowsky等，疫苗研究， 5：29-39(1996)所述。
所用淬灭剂可以包括亲核性官能团如硫醇、硫代酸(thioacid)、二硫代羧酸(dithioic acid)、磷酸盐、硫代磷酸盐和胺。淬灭剂实例包括谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、硫代硫酸盐、巯基乙烷磺酸盐和二巯基丙醇。在一个优选实施方案中，该淬灭剂是谷胱甘肽。
在用淬灭剂和病原体灭活化合物处理生物材料如血制品的方法中，可在加入病原体灭活化合物之前、同时、或之后向生物材料中加入淬灭剂。优选地，淬灭剂在病原体灭活化合物之前或同时加入。在另一优选实施方案中，淬灭剂在加入病原体灭活化合物约30分钟内，例如约15-20分钟内，或约10分钟内加入。可处理的生物材料包括血制品，如全血、红细胞、血浆或其部分和血小板。这些方法可用于产生已处理、适于导入个体的血制品。例如，可将处理的材料输入需要它们的个体。任选地，使材料中病原体灭活化合物和/或淬灭剂的浓度在处理后、输入前减小，例如通过过滤或吸收进行。很多种包含或疑为包含病原体的生物材料如血制品可接受处理。
在一个具体实施方案中，提供了淬灭含红细胞的生物材料中病原体灭活化合物的不必要副反应的方法，其中所述方法包括用含本身是或能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物处理含红细胞的材料，以及用含有能与亲电子基团共价反应之亲核性基团的淬灭剂处理所述材料。在一个实施方案中，病原体灭活化合物包含核酸结合配体和能原位反应以形成亲电子基团如吖丙啶鎓离子的芥基团。所述材料可含有包装红细胞(packed red blood cell，PRBC)。所述材料可包含如血细胞比容约30-85％的血制品。例如，含红细胞的材料可用病原体灭活化合物和淬灭剂处理，然后可将处理过的材料输入需要它的个体。
病原体灭活化合物的浓度可以是如约0.1μM-5mM。提供的病原体灭活化合物的浓度可以足以灭活待处理材料中如至少约3-6log的病原体。亲核性基团优选是硫醇基团。在一个优选实施方案中，淬灭剂是谷胱甘肽。谷胱甘肽的浓度可以是如约0.5-30mM。所述材料可与病原体灭活化合物和淬灭剂一起温育例如至少约1-48小时。
优选地，淬灭剂使病原体灭活化合物对病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的病原体灭活对照减少不超过约3log。在另一优选实施方案中，在该方法中，淬灭剂使病原体灭活化合物对病毒性病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的病原体灭活对照减少不超过约1log。优选地，在处理含红细胞材料的实施方案中，红细胞功能在处理后基本没有改变。
在一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中该方法包括用有效量的病原体灭活化合物和淬灭剂处理含红细胞的材料，以灭活至少2log病原体，而且其中红细胞功能基本不会因所述处理而改变。在另一优选实施方案中，提供了一种方法，其中所述方法包括用有效量的病原体灭活化合物和淬灭剂处理材料，以灭活至少2log病原体，并且其中红细胞在贮存28天后溶血程度低于3％。
                       附图简述
图1是显示鼠红细胞在用谷胱甘肽和病原体灭活化合物处理后的存活图。
                  实施本发明的最佳方式
本发明提供了用于淬灭材料中活性化学物质如含亲电子基团的化合物的方法。在一个实施方案中，提供了淬灭材料，包括生物材料如血制品中病原体灭活化合物的方法。在另一实施方案中，提供了抑制经病原体灭活化合物处理之生物材料如红细胞的变化的方法。病原体灭活化合物和淬灭剂均以有效量施与，以灭活材料中的病原体并淬灭病原体灭活化合物的不必要副反应。因此淬灭剂具有在达到灭活病原体目的的同时减少材料如血制品中不必要副反应的保护效应。
定义
“病原体”是能导致人类、其它哺乳动物或脊椎动物疾病的含核酸的任何因子。致病性因子可以是单细胞或多细胞的。病原体实例有可导致人类、其它哺乳动物、或脊椎动物疾病的细菌、病毒、原生动物、真菌、酵母、霉菌和支原体。病原体的遗传物质可以是DNA或RNA，且遗传物质可以表现为单链或双链核酸。表I列出了一些病毒实例，但并非限制本发明。
表I
科： 病毒：
腺病毒科 腺病毒2型
犬肝炎病毒
砂粒病毒科 Pichinde
拉萨热病毒
布尼亚病毒科 Turlock
加利福尼亚脑炎病毒
疱疹病毒科 单纯疱疹病毒I型
单纯疱疹病毒II型
巨细胞病毒
假狂犬病病毒
正粘病毒科 流感病毒
乳多空病毒科 SV-40
副粘病毒科 麻疹病毒
腮腺炎病毒
副流感病毒2型和3型
小RNA病毒科 脊髓灰质炎病毒1型和2型
柯萨奇病毒A组9型
艾可病毒11型
痘病毒科 痘苗病毒
禽痘病毒
呼肠孤病毒科
蓝舌病毒
科拉多蜱热病毒
逆转录病毒科 人类免疫缺陷病毒(HIV)
禽肉瘤病毒
鼠肉瘤病毒
鼠白血病病毒
弹状病毒科(Rhabdo) 疱疹性口腔炎病毒
披膜病毒科 西方马脑炎病毒(Western equine encephalitis)
登革病毒2型
登革病毒4型
圣路易斯脑炎病毒(St.Louis encephalitis)
嗜肝DNA病毒科 乙型肝炎病毒
细菌噬菌体 λ噬菌体
R17
T2
(立克次氏体) 小蛛立克次氏体(立克次氏体痘)
材料或化合物的“体内”应用定义为将该材料或化合物导入人体、哺乳动物、或脊椎动物活体内。
材料或化合物的“体外”应用定义为在人体、哺乳动物、或脊椎动物活体外应用该材料或化合物，所述材料或化合物并不意图再导入人体、哺乳动物、或脊椎动物活体内。体外应用的一个实例是对血样成分的实验室仪器分析。
化合物的“离体”应用定义为在人体、哺乳动物、或脊椎动物活体外应用化合物处理生物材料，所处理的生物材料意图用于人类、哺乳动物或脊椎动物活体内。例如，从人体内取出血液并在血中加入化合物以灭活病原体，如果所述血液意图再导入该人体或另一人体，则所述应用定义为该化合物的离体应用。将人血液再导入同一人体或另一人体是血液的体内应用，与该化合物的离体应用相反。如果血液再导入人体时其中仍存在该化合物，则该化合物除了其离体应用之外还导入了体内。
“可处理材料”包括生物材料在内的任何材料。这类材料包括化学物、溶液(包括盐溶液或缓冲液)、及溶剂。有可能与人体、哺乳动物、或脊椎动物活体接触或将导入其中的任何物质，当这类接触有传播疾病或病原体的危险时，可如本文所述进行处理。
“生物材料”定义为源自任何类型生物体的材料。生物材料包括，但不限于血液、血制品如血浆、分层分离的血浆、血小板制剂、红细胞及压积红细胞、脑脊液、唾液、尿、汗液、粪便、精液、乳汁、组织样品、匀浆后的组织样品、以及来源于生物体的任何其它物质。生物材料还包括掺入了来源于生物体之物质的人工合成物质，如含有病原体或其部分(此时病原体是具有生物体来源的物质)的疫苗制剂或重组蛋白，制备为分析用样品的血液和分析试剂混合物、细胞培养基、细胞培养物、病毒培养物、以及源自活生物体的其它培养物。
“病原体的灭活”定义为使材料中的病原体不能增殖。灭活作用以剩余的能增殖的病原体部分的负对数表示。因此，如果一定浓度的化合物使材料中90％的病原体不能增殖，则有10％或十分之一(0.1)的病原体仍保持增殖能力。0.1的负对数是1，因而称该浓度的该化合物灭活了1log的病原体。或者说该化合物在该浓度具有1log的杀伤力。因此，如果某浓度的化合物使所有病原体中只有10％或十分之一(0.1)能增殖，则称灭活了1log的病原体。灭活所有病原体而仅剩1％或0.1％未灭活，分别相应于在该化合物的该浓度下病原体分别降低2log或3log。
待淬灭的化合物
各种化合物可在材料如生物材料中用本文所述方法淬灭。可淬灭的化合物包括含有本身就是或能(例如原位)形成并且已形成活性基团如亲电子基团的官能团的化合物。例如，所述官能团可以是能原位形成活性基团如亲电子氮丙啶、吖丙啶鎓离子、硫杂丙环或硫杂丙环鎓离子的芥类基团。在另一实施方案中，所述官能团可以是环氧基。淬灭剂包含亲核性基团，通过淬灭剂上的亲核性基团与活性亲电子基团的共价反应将亲电子活性基团诱捕于化合物上而发挥作用。淬灭剂可用于诱捕活性物质，包括含亲电子基团的化合物以及它们所形成的活性物质。
在一个实施方案中，提供了使灭活材料中的病原体所用的化合物淬灭的方法。在血制品中，需灭活的病原体包括含有核酸的微生物如原核、真核及病毒性微生物，以及这类微生物的核酸基因组或其片段。可灭活的病毒实例包括脂质包被病毒如疱疹性口腔炎病毒(VSV)、Moloney肉瘤病毒、Sindbis病毒、人类免疫缺陷病毒(HIV-1、HIV-2)、人类嗜T淋巴细胞病毒-I(HTLV-I)、乙型肝炎病毒、丙型肝炎病毒和疱疹类病毒，以及无包膜病毒包括细小DNA病毒。
已开发了可用于灭活生物材料中的病原体的化合物，其中所述化合物包括或经原位反应可形成活性亲电子基团，而无需光活化。该活性亲电子基团与病原体如病毒和细菌的核酸反应以灭活它们。但这些活性化合物也可能参与一些不必要副反应。本文提供了加入淬灭化合物以减少这些化合物(通过化合物上的亲电子基团与病原体的反应而使病原体灭活)的不必要副反应的方法。
可形成活性亲电子基团并可以用于灭活病原体的病原体灭活化合物的实例述于PCT WO96/14737、PCT WO96/39818和1997年4月15日提交的美国临时专利申请流水号60/043,696，它们的公开内容引入本文作为参考。此外，氮芥CH3-N(CH2CH2Cl)2可灭活某些病原体。LoGrippo等，国际输血协会第六次大会汇编，Bibiotheca Haematologica(Hollander编)，1958，第225-230。
病原体灭活化合物优选包括与效应物共价结合的锚着物。术语“锚着物”指能非共价结合核酸生物聚合物如DNA或RNA的组成成分。“锚着物”还指“核酸结合配体”。术语“效应物”指能与核酸反应而与核酸形成共价键的组成成分。优选地，所述效应物是本身为或能形成亲电子基团的官能团，其中所述亲电子基团能与核酸形成共价键。例如，PCTWO96/14737、PCT WO96/39818和美国专利第5,559,250号(所公开内容已引入本文)描述了包括效应物芥基团和核酸结合配体的病原体灭活化合物。包括与多胺锚着物共价吸附的氮丙啶的病原体灭活化合物也可得到应用，如Budowsky等，疫苗研究 5：29-39(1996)；和PCT WO97/07674(所公开内容已引入本文作为参考)所述。
化合物的一个实例是奎吖因芥，其结构示于以下：
                      奎吖因芥
病原体灭活化合物还能以锚着物与易断裂连接子共价结合，而该易断裂连接子与效应物共价结合的形式提供。术语“易断裂连接子”指共价连接锚着物和效应物、并能在特定条件下降解，以使锚着物和效应物不再共价连接的组成成分。这种锚着物-易断裂连接子-效应物排列使所述化合物能因锚着物的结合能力而特异性结合核酸。这使效应物更接近核酸以便与核酸反应。含有锚着物-易断裂连接子-效应物排列的病原体灭活化合物公开在1997年4月15日提交的美国临时专利申请流水号60/043,696和1998年1月6日提交的美国专利申请流水号09/003,115，其公开内容引入本文作为参考。效应物可以是，如芥基团、芥基团的等价形式、或环氧基。
病原体灭活化合物(Pathogen inactivating compound，PIC)的实例包括PIC-1和PIC-2，其结构示于下。PIC-1包括一个具有酯官能性的易断裂连接子，而PIC-2包括一个具有酰胺官能性的易断裂连接子。
PIC-1                                                             PIC-2
各种各样的基团可作为锚着物、连接子和效应物应用。锚着物基团的实例包括，但不限于，嵌入剂、小沟结合物、大沟结合物、可通过静电相互作用结合的分子包括多胺、和可通过序列特异性相互作用结合的分子。以下是可能使用的锚着基团的非限制性列举：
吖啶类(和吖啶衍生物，如硫酸原黄素、吖啶黄素、二吖啶类(diacridines)、吖啶酮类、苯并吖啶类、奎吖因类)、放线菌素、蒽环酮类(anthracyclinones)、紫红霉素、柔红霉素、噻吨酮(以及噻吨酮衍生物如米列西D)、茴霉素、丝裂霉素、棘霉素(醌霉素A)、三骨菌素、艾力替新(及其二聚体、三聚体和类似物)、norphilin A、芴(及其衍生物如芴酮、芴二胺(fluorenodiamines)、吩嗪类、菲啶类、吩噻嗪类(如氯丙嗪)、吩噁嗪类、苯并噻唑、呫吨类和噻吨类、蒽醌类、蒽吡唑类(anthrapyrazoles)、苯并硫代吡喃吲哚类(benzothiopyranoindoles)、3，4-苯并芘、1-芘基环氧烷(1-pyrenyloxirane)、苯并蒽类、苯并二吡喃酮类(benzodipyrones)、喹啉类(如氯喹、奎宁、氨甲酰苯基喹啉)、呋喃香豆素类(如补骨脂素类和异补骨脂素类)、乙锭鎓盐(ethidium)、丙锭鎓盐(prodidium)、coralyne和多环芳香烃以及它们的环氧烷衍生物；
偏端霉素、纺锤菌素、其它lexitropsin、Hoechst 33258及其它Hoechst染料、DAPI(4’，6-二脒基-2-苯基吲哚)、berenil和三芳甲烷染料；
黄曲霉毒素；
精胺、亚精胺、以及其它多胺；和
可通过序列特异性相互作用如三螺旋结构形成、D-环结构形成、以及与单链靶的直接碱基配对而结合的核酸或类似物。这些化合物的衍生物也是锚着基团的非限制性实例，其中化合物的衍生物包括，但不限于，在任何位点带有一或多个任意类型取代基的化合物、该化合物的氧化产物或还原产物等。
易断裂连接子的实例包括，但不限于，含有如酯(其中所述酯的羰基碳介于锚着物和该酯的sp3氧之间；这一排列也称为“正向酯”)、“反向酯”(其中所述酯的sp3氧介于锚着物和该酯的羰基碳之间)、硫酯(其中所述硫酯的羰基碳介于锚着物和该硫酯的硫之间；也称为“正向硫酯”)、反向硫酯(其中所述硫酯的硫介于锚着物和该硫酯的羰基碳之间；也称为“反向硫酯”)、正向和反向硫羰酯(thionoester)、正向和反向二硫代羧酸、硫酸酯、正向和反向磺酸酯、磷酸酯、及正向和反向膦酸酯基团之类官能团的组成成分。“硫酯”指示-C(＝O)-S-基团；“硫羰酯”指示-C(＝S)-O-基团，“二硫代羧酸”指示-C(＝S)-S-基团。易断裂连接子还可包括酰胺，其中酰胺的羰基碳介于锚着物和酰胺氮之间(也称为“正向酰胺”)、或其中的酰胺氮介于锚着物和酰胺的羰基碳之间(也称为“反向酰胺”)。就称为“正向”和“反向”的基团而言，正向是这样的官能团方向，其中该官能团水解后，产生的酸性功能与锚着物组分共价连接，产生的醇、硫醇或胺功能与效应物组分共价连接。反向是这样的官能团方向，其中该官能团水解后，产生的酸性功能与效应物组分共价连接，产生的醇或硫醇功能与锚着物组分共价连接。
所述易断裂连接子，如酰胺组分，还能被待处理生物材料中的内源性酶或加入该材料的酶在酶降解条件下降解。
效应物的实例包括，但不限于，芥基团、芥基团等价形式、环氧基、醛、甲醛合成纤维(synthon)、及其它烷基化试剂和交联剂。芥基团定义为包括单或双卤代乙基胺基团，和单卤代乙硫醚基团。芥基团等价形式定义为以类似于芥类的机制反应的基团，如单或双甲磺酰基乙基胺基团、单甲磺酰基乙硫醚基团、单或双甲苯磺酰基乙基胺基团、和单甲苯磺酰基乙硫醚基团。甲醛合成纤维定义为在水溶液中可降解为甲醛的任意化合物，包括羟甲基胺类如羟甲基甘氨酸。甲醛合成纤维的实例由美国专利第4,337,269号和国际专利申请WO97/02028号公开。
病原体灭活化合物的浓度可根据以下因素如病原体类型、待处理生物材料的特点、以及所用灭活化合物而进行选择。
淬灭化合物
本发明提供了用淬灭化合物(本文也称“淬灭剂”)处理生物材料以减少材料中活性亲电物质的不必要副反应的方法。尤其提供了淬灭灭活生物材料中病原体之病原体灭活化合物的不必要副反应的方法，其中所述病原体灭活化合物包含或能形成可损伤病原体核酸的亲电子基团。淬灭剂可减少病原体灭活化合物及其产生的反应产物的不必要反应。淬灭剂优选含有能与病原体灭活化合物上的亲电子基团反应的亲核性基团的淬灭剂。含亲核性基团的淬灭剂通过淬灭剂上的亲核性基团与所述化合物上的活性亲电子基团共价反应，诱捕这些活性亲电子基团而起作用。可被淬灭剂诱捕的活性物质包括含亲电子基团的化合物以及含有由其形成的活性亲电子基团的物质。
本文公开之方法的一个好处是，可使用有效量淬灭剂使病原体灭活化合物的不必要副反应减少，而病原体灭活化合物对病原体的灭活作用仍然能发生。淬灭剂因此而具有在减少材料如血液的不必要副反应，又能允许病原体灭活作用发生的情形下的保护效应。各种副反应均可被减少。例如，在处理含血制品的材料的方法中，可减少红细胞的改变。例如，可减少蛋白质如IgG和/或病原体灭活化合物对红细胞的结合。
在一个实施方案中，生物材料如血制品用含本身是或能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物和淬灭剂处理。在一个优选实施方案中，所述病原体灭活化合物包含核酸结合配体和效应物，该效应物是自身为或能形成活性亲电子基团的官能团。亲电子基团可以是，如环氧烷、硫杂丙环、硫杂丙环鎓离子或吖丙啶鎓离子或氮丙啶。效应物可以是能形成亲电子基团的芥基团。该芥基团例如能原位形成亲电子氮丙啶、或亲电子吖丙啶鎓离子或硫杂丙环鎓离子。
在该方法中，生物材料用含亲核官能团的淬灭剂处理，其中该亲核性基团能与病原体灭活化合物上的亲电子基团共价反应。淬灭剂在加病原体灭活化合物之前、同时或之后加入材料中。在一个优选实施方案中，淬灭剂在加入病原体灭活化合物之前或同时加入。在一个特别优选实施方案中，淬灭剂与病原体灭活化合物同时加入。在另一优选实施方案中，淬灭剂在加病原体灭活化合物之前或之后的约30分钟内，例如，约15-20分钟内，或任选地约10分钟内加入。该材料可在如体外或离体进行处理。优选不干扰病原体灭活化合物对病原体的灭活能力，并且基本不改变生物材料的性质，而又能减少病原体灭活化合物的不必要副反应的淬灭剂。
淬灭剂的实例有包含亲核性基团或能与亲电子基团反应的其它基团的化合物。也可用淬灭化合物的混合物。亲核性基团实例有硫醇、硫代酸、二硫代羧酸、硫代氨基甲酸、二硫代氨基甲酸、胺、磷酸、和硫代磷酸基团。淬灭剂可以是、或包含氮杂环如吡啶。淬灭剂可以是含磷酸根的化合物如葡萄糖-6-磷酸。淬灭剂还可以是含硫醇的化合物，包括但不限于谷胱甘肽、半胱氨酸、N-乙酰半胱氨酸、巯基乙醇、二巯基丙醇、硫醇(mercaptan)、巯基乙烷磺酸(mercaptoethanesulfonic acid)及其盐类如MESNA、同型半胱氨酸、氨基乙烷硫醇(aminoethane thiol)、二甲基氨基乙烷硫醇、二硫苏糖醇、及其它含硫醇的化合物。淬灭剂还可以是盐形式，如钠盐或盐酸盐。
含硫醇的其它化合物包括巯基乙醇酸甲酯、硫羟乳酸、苯硫酚、2-巯基吡啶、3-巯基-2-丁醇、2-巯基苯并噻唑、硫代水杨酸、和硫辛酸。芳香族硫醇化合物的实例有2-巯基苯并咪唑磺酸、2-巯基-烟酸、萘硫酚、喹啉硫酚、4-硝基-苯硫酚、和苯硫酚。其它淬灭剂包括硝基苯甲基吡啶和无机亲核物质如硒化盐或有机硒化物如硒代半胱氨酸、硫代硫酸盐、亚硫酸盐、硫醚、硫代磷酸盐、焦磷酸盐、氢硫化物、连二亚硫酸盐。淬灭剂还可以是含亲核性基团的肽化合物。例如，淬灭剂可以是含半胱氨酸的化合物，例如GlyCys之类的二肽、或谷胱甘肽之类的三肽。
本发明范围内还有包括亲核性基团的大分子复合体或含有亲核性基团的化合物。在另一实施方案中，将所述亲核性基团如硫醇基团或包含亲核性基团的化合物固定于固相支持物如层析材料上以形成固相化淬灭剂。所述固相支持物可以是如琼脂糖、聚苯乙烯或其它层析材料。例如，可将谷胱甘肽或含亲核性基团如硫基的其它化合物附着于环氧活化的琼脂糖上。例如，谷胱甘肽-琼脂糖在Sigma(St.Louis，MO)公司有售，其中谷胱甘肽通过氨基与环氧活化的4％交联琼脂糖珠经一个10碳间隔臂连接。此外，半胱氨酸-琼脂糖在Sigma有售，其中通过氨基与溴化氰活化的4％交联琼脂糖珠附着。一定范围内任何活化层析树脂或其它物质可衍生化而包括一个、两个或更多个亲核性基团。这类可被衍生的活化基质包括溴化氰、环氧、硝基苯基和N-羟基琥珀酰亚胺基氯甲酸酯、硫代吡啶基、聚丙烯酰肼(polyacrylhydrazido)、和环氧丙烯酸活化的基质。市售的包含固相化亲核性基团如硫醇的其它层析材料实例包括Duolit GT-73含聚苯乙烯硫醇的树脂和含有氨基膦酸基团的DuoliteC-467(Supelco，Bellefonte，PA)。
在另一实施方案中，淬灭剂的反应可通过谷胱甘肽转移酶之类的酶反应催化。谷胱甘肽转移酶的存在还可影响淬灭剂与含亲电子基团之病原体灭活化合物的反应能力。例如，可使谷胱甘肽转移酶在膜系统中区室化，以便在有谷胱甘肽转移酶存在之处发生淬灭和促进淬灭。
淬灭剂还可原位产生，例如，通过酶反应或通过前体分子的化学重排产生。可经酶催化而原位产生淬灭剂的化合物一个实例是amifostene(Ethylo，U.S.Bioscience，West Conshohocken，PA)。
用于处理血制品的淬灭剂的优选特点
在一个实施方案中，提供了用于淬灭含红细胞之生物材料中的病原体灭活化合物的不必要副反应的方法。例如，所述材料可以是血细胞比容约30-85％的血制品。所述病原体灭活化合物优选包括本身是或能形成亲电子基团的官能团。
将淬灭剂在加病原体灭活化合物之前、同时或之后加入血制品。优选地，处理血制品时，将所述淬灭剂在病原体灭活化合物加入之前或同时加入。在另一实施方案中，所述淬灭剂在加病原体灭活化合物的约30分钟内，或约15-20分钟内，或任选地约10分钟内加入。可进行处理的血制品实例包括全血、血小板、红细胞和血浆。优选的淬灭剂是可减少活性化合物的不必要副反应，但对病原体的灭活或对血制品没有显著影响的化合物。例如，可将淬灭剂加入用病原体灭活化合物处理的血制品中，其中所述病原体灭活化合物包括i)能非共价结合核酸的核酸结合配体；和ii)自身是或能形成亲电子基团如阳离子亲电子基团的基团。优选对病原体的灭活或对所处理的特定血制品的性质没有显著影响而可减少化合物的不必要副反应的淬灭剂。一种优选淬灭剂是谷胱甘肽。
在一个优选实施方案中，病原体灭活化合物包括核酸结合配体和能原位反应以形成亲电子基团的芥基团，其中所述亲电子基团是吖丙啶鎓离子。包括非共价核酸结合配体和芥基团的化合物如美国专利第5,559,250号所述。化合物实例包括奎吖因芥。据信这些化合物可通过与病原体的核酸物质结合并使之烷基化而灭活病原体。在灭活反应中，化合物上的芥基团形成活性吖丙啶鎓离子。据信病原体核酸与该化合物通过该化合物形成的亲电子吖丙啶鎓中间产物对核酸进行亲核攻击发生反应。不受任何理论限制，我们认为谷胱甘肽之类的淬灭剂与这些病原体灭活化合物以类似方式反应，即通过亲电子吖丙啶鎓中间产物对淬灭剂进行亲核攻击，产生不再能与核酸反应的产物。
无任何理论限制，亲核体(Nu1和Nu2)与病原体灭活化合物上芥基团的反应的一个假想机制示于以下流程图I。
流程图I
芥基团可以是质子化形式B或去质子化形式A，如图解I所示。一般在生理pH下，易在分子内形成吖丙啶鎓离子中间产物C和E。应用能与吖丙啶鎓中间产物C和E反应形成终产物F的含亲核性基团的淬灭剂，其中所述亲核性基团已替换了芥基团的氯原子。
尽管吖丙啶鎓离子的反应能力很强，但反应速率仍取决于参与反应之亲核体的性质。而且，淬灭剂亲核体可与已存在的其它内源性亲核体竞争，例如当其浓度高于存在的其它内源性亲核体时或当它们反应能力更强时即是如此。在生理条件下，优选的亲核性基团是硫醇基团。其它亲核性基团包括磷酸根和氨基。
淬灭剂优选能维持血制品功能并使病原体灭活化合物的副反应减至最小。用于处理血制品，尤其含红细胞的血制品的优选淬灭剂是谷胱甘肽。谷胱甘肽尤其可用于与能形成吖丙啶鎓中间产物之病原体灭活化合物如含芥基团之病原体灭活化合物联合处理含红细胞材料。谷胱甘肽的硫醇基团与吖丙啶鎓中间产物的反应比与母体芥化合物的反应更快。
淬灭剂优选基本不穿透病原体的外膜，如细胞膜和病毒的脂质包被。淬灭剂优选对病毒、细菌和其它靶病原体的脂质包被的穿透不会使病原体灭活化合物对病原体核酸造成的破坏显著减小。此外，优选淬灭剂与病原体灭活化合物所形成的亲电子基团的反应优先于与化合物自身的反应。不限于任何理论地认为，病原体灭活化合物可自由穿过病原体膜如病毒脂质包被和细菌细胞膜，但形成阳离子亲电子基团如吖丙啶鎓离子后，该化合物不以任何显著程度穿过病原体膜。因此，在靶病原体外形成的亲电阳离子基本上不能与核酸交联；而淬灭剂可与它们反应。相反，在一个实施方案中，如果亲电子阳离子在病原体内形成，淬灭剂不能有效跨越病原体膜，核酸交联可进行下去，加入的淬灭剂对其基本上没有明显干扰。
优选淬灭剂可与病原体灭活化合物反应以淬灭不必要副反应，而又不干扰病原体灭活化合物对病原体的灭活作用。这可通过如用基本上不跨越病原体膜的淬灭剂而实现，因此淬灭病原体膜外的副反应。在另一实施方案中，淬灭剂可能与病原体灭活化合物或由它们所形成的活性中间产物以很慢的速率反应，从而基本上不干扰对病原体的灭活作用。
在一个实施方案中，淬灭剂可施用于多相系统中，如含有将第一相和第二相分隔的膜的两相系统。在一个实施方案中，在两相系统中，其中一个相与膜结合。膜可以是由天然或合成分子或它们的混合物组成的天然或人工半透膜。例如，膜结合相可以是致病性生物体的内部，另一相是包含该致病性生物体的相。例如，病原体可悬浮于流体相如含血的液相。膜结合相例如可以是含病毒核酸的病毒脂质包被的内部。在另一实施方案中，膜可以是细胞膜，膜结合相可以是致病性单细胞生物如细菌的内部。病原体灭活化合物的至少一部分优选能动力地或热力地跨膜，而淬灭剂相对于病原体灭活化合物基本上不能动力地或热力地跨膜。
其它膜包括脂质体，如Lasic，D.，基因转移中的脂质体，CRC Press，Boca Raton，FL，1997，第6章所述。可用自装配的两性分子如卵磷脂、鞘磷脂和磷脂酰乙醇胺形成泡状颗粒形式的脂质体。脂质体还可用带负电的脂质如磷脂酰丝氨酸、磷脂酰甘油和磷脂酰肌醇形成。阳离子脂质体还可用市售阳离子去污剂或用连接了多阳离子基团的胆固醇制备，如Gao & Huang，生物化学和生物物理学研究通讯， 179：280-285(1991)；核酸研究， 21：2867-2872(1993)；和生物化学， 35：1027-1036(1996)所述。膜还包括人工病毒包膜，如美国专利第5,753,258(所公开内容已引入本文)所述。膜还包括非致病性细胞如白细胞的膜。
在一个实施方案中，提供了淬灭两相生物材料中病原体灭活化合物的不必要副反应的方法，其中两相生物材料是第一相包含有膜病原体的液体，第二相与该病原体的膜结合。生物材料用能形成亲电子基团之官能团的病原体灭活化合物处理。病原体灭活化合物处理之前、同时或之后，该生物材料用含有能与该亲电子基团共价反应之亲核性基团的淬灭剂处理。优选地，淬灭剂在加入病原体灭活化合物之前或同时加入。在另一优选实施方案中，淬灭剂在加病原体灭活化合物之前或之后的约30分钟内，或约15-20分钟内，或任选地，约10分钟内加入。
优选地，该病原体灭活化合物基本上可在形成亲电子基团之前相对于淬灭剂动力地跨膜。病原体灭活化合物还优选在形成亲电子基团后相对于形成亲电子基团之前的病原体灭活化合物基本上不能动力地跨膜。使淬灭剂与病原体灭活化合物的亲电子基团反应，而淬灭剂与病原体灭活化合物的亲电子基团的反应基本上发生在第一相。含亲电子基团的病原体灭活化合物与病原体核酸在第二相中，即在病原体膜内反应，从而灭活病原体。膜可包含如脂质。病原体可以是如含有定义为所述膜的脂质包被的病毒，其中第二相定义为该脂质包被的内部。病原体还可以是含有具脂质的细胞膜的细菌，所述脂质限定了两相系统的膜，第二相定义为细胞膜内部。
有利的是，在两相系统中，淬灭剂施用于第一相并基本上不能跨过病原体膜。病原体灭活化合物施用于例如第一相。病原体灭活化合物能在形成亲电子基团之前跨膜到达第二相。原位形成亲电子基团后，病原体灭活化合物基本上不再能跨膜。故，淬灭选择性发生在第一相，而在第二相中，即病原体内部，病原体灭活化合物与病原体核酸反应，没有淬灭过程。因此，在生物材料如血制品中，对病原体灭活化合物及其降解产物上活性基团的淬灭选择性发生在病原体悬浮于其中的第一相。第一相中的淬灭可因此而减少第一相中病原体灭活化合物上的活性基团的不必要副反应，如对血液中蛋白质的共价修饰。在所述方法中，病原体灭活化合物和淬灭剂均施以有效量以灭活材料中的病原体并同时淬灭病原体灭活化合物的不必要副反应。所述淬灭剂因此而具有保护作用，可在允许病原体灭活过程发生的同时减少材料如血制品中的不必要副反应。
谷胱甘肽具有很多使之成为特别有效的淬灭剂的性质。它通常在所有细胞类型中都存在。基本上认为它不能被动跨膜，如细菌细胞膜或脂质包被病毒的脂质包被。在pH7，谷胱甘肽带有电荷，在没有主动转运的情况下不能明显穿越脂质双层。这与对VSV及其它包膜病毒的灭活基本上不受谷胱甘肽影响的事实一致。脂质包被病毒如HIV和VSV的灭活不因谷胱甘肽或N-乙酰半胱氨酸这两种硫醇淬灭剂的存在而受影响。谷胱甘肽对病毒灭活几乎没有影响，而尽管它对表皮葡萄球菌和小肠结肠炎耶尔森氏菌的灭活有一定影响，也可通过减小所加淬灭剂的剂量而进行控制。例如，约2-4mM谷胱甘肽的存在可使0.3mM PIC-1对小肠结肠炎耶尔森氏菌的灭活减少约1-2log杀灭量。谷胱甘肽还与红细胞的体外贮存相容。
淬灭剂优选处理后基本上不损害红细胞功能或修饰红细胞，并基本上不降低病原体灭活化合物对病原体的灭活作用。对红细胞功能基本无损伤效应可用本领域已知用于检验红细胞功能的方法进行测量。例如，可测量指示剂如胞内ATP(腺苷5’-三磷酸)、胞内2，3-DPG(2，3-二磷酸甘油)或胞外钾的水平，并与未处理的对照比较。还可测量溶血现象、pH、血细胞比容、血红蛋白、渗透不稳定性(osmotic fragility)、葡萄糖消耗量和乳酸盐产生。
测定ATP、2，3-DPG、葡萄糖、血红蛋白、溶血现象以及钾的方法本领域已有。参见如Davey等，输血， 32：525-528(1992)，所公开内容已引入作为参考。测定红细胞功能的方法亦述于Greenwalt等，Vox Sang，58：94-99(1990)；Hogman等，Vox Sang， 65：271-278(1993)；和Beutler等，血液，卷59(1982)，它们的公开内容均已引入本文作为参考。胞外钾水平可用Ciba Corning 614型K+/Na+分析仪(Ciba CorningDiagnostics Corp.，Medford，MA)测量。pH可用Ciba Corning 238型血气分析仪(Ciba Corning Diagnostics Corp.，Medford，MA)测量。
在用含有核酸结合配体及芥基团的病原体灭活化合物处理红细胞的方法中，在有淬灭剂如谷胱甘肽时，优选地，在一个实施方案中，1天后胞外钾水平比未处理对照所表现出的量不多于3倍，更优选不多于2倍。
而且，在一个实施方案中，优选淬灭剂可在灭活病原体期间抑制对红细胞的不必要修饰作用如裂解或其它损伤。优选地，接受处理的红细胞的溶血现象在4℃贮存28天后少于3％，更优选在贮存42天后少于2％，最优选在贮存42天后少于或等于约1％。
淬灭剂优选可减少蛋白质对红细胞的结合如IgG对红细胞的结合，并可在与无淬灭剂时进行的对照相比基本上不抑制病原体灭活作用的条件下应用的淬灭剂。还优选可抑制病原体灭活化合物对红细胞表面进行结合的淬灭剂。淬灭剂的一个实例是谷胱甘肽。谷胱甘肽可有利地减少病原体灭活化合物对红细胞的潜在修饰作用。
IgG、白蛋白及IgM等物质与红细胞的结合还可用本领域已有方法测量。在一个实施方案中，在用含有核酸结合配体及芥基团之类效应物的病原体灭活化合物处理红细胞的方法中，在有淬灭剂时，IgG对红细胞的结合比无淬灭剂时的减少。优选有淬灭剂如谷胱甘肽和病原体灭活化合物时IgG对红细胞的结合是在无淬灭剂时IgG的结合的约75％以下，优选约50％以下。
分子与红细胞的结合可用抗体如抗吖啶和IgG的抗体检测。试验中所用抗体可购买，或可用本领域方法，如Harlow & Lane，“抗体，实验室手册，冷泉港实验室”1988中所述方法制备，其公开内容已引入本文作为参考。例如，抗IgG可从Caltag，Burlingame，CA；Sigma ChemicalCo.，St.Louis，M0和Lampire Biological Laboratory，Pipersvelle，PA购买。
淬灭剂优选可使病原体灭活化合物或其片段对红细胞的结合减少的淬灭剂。在其中含红细胞之生物材料用含芥基团之类效应物以及核酸结合基团如吖啶基团的病原体灭活化合物进行处理的实施方案中，可使病原体灭活化合物或其片段对红细胞的结合减少。例如，其中核酸结合配体是吖啶时，病原体灭活化合物衍生的吖啶对红细胞的结合在有淬灭剂如谷胱甘肽时可被降低。在一个优选实施方案中，用含吖啶基团之病原体灭活化合物处理的红细胞与吖啶的结合在有淬灭剂存在时是无淬灭剂时的约75％以下，或优选约50％以下，或在另一优选实施方案中，是约5％以下。
在一个实施方案中，提供的淬灭剂可在约1-48小时，例如约24小时内使病原体灭活后活性亲电子烷基化物质的浓度减少例如至少约5％，或约20％，或任选地约50％或更多。活性亲电物质的存在可用本领域已有方法诸如层析方法包括LC-MS(液相层析-质谱分析法)进行测定。
在一个实施方案中，还优选淬灭剂使病原体灭活化合物对病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的对照病原体灭活作用降低不超过约1log，或不超过约2log，或任选地不超过约3log，或在另一实施方案中不超过4log。优选地，所述淬灭剂使病原体灭活化合物对病毒性病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的对照病原体灭活作用降低不超过约1log，或不超过约2log，或任选地不超过约3log。可调整病原体灭活化合物和淬灭剂的浓度以获得预期的log杀灭量，并使因淬灭剂的存在而发生的灭活减弱现象降至最小。
在一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中该方法包括用有效量的病原体灭活化合物和淬灭剂处理含红细胞的材料以灭活至少2log的病原体，并且其中红细胞功能基本上不因处理而改变。在另一实施方案中，提供了一种方法，其中该方法包括用有效量病原体灭活化合物和淬灭剂处理材料以灭活至少2log的病原体，并且其中红细胞的溶解在处理后再贮存28天后少于3％。
谷胱甘肽处理的红细胞与未处理的对照细胞相比，红细胞功能方面未显示出明显差异。经体内或体外功能性试验测量，谷胱甘肽自身不造成红细胞的显著溶解或其它显著损伤。谷胱甘肽可减少有病原体灭活化合物时的红细胞溶解现象。红细胞可用谷胱甘肽体外或离体处理。一些化合物如硫代硫酸盐、MESNA和N-乙酰半胱氨酸在有效淬灭浓度下或者活性较弱，或者可能改变红细胞。
病原体灭活和淬灭所需条件
用病原体灭活化合物和淬灭剂处理生物材料以减少不必要副反应的条件可根据所选材料、淬灭剂以及灭活化合物进行选择。多种生物材料可用病原体灭活化合物和淬灭剂处理，例如经体外或离体方式处理。选择可产生病原体灭活作用而又基本上不改变生物材料的条件。
在一个优选实施方案中，血制品用含核酸结合配体和效应物如芥基团的病原体灭活化合物灭活，其中所述芥基团能原位形成活性亲电子基团。血制品用淬灭剂处理以防止病原体灭活化合物的不必要副反应，但不会明显影响血制品的性质。淬灭剂可在加入病原体灭活化合物之前、同时、或之后加入血制品。优选地，淬灭剂在病原体灭活化合物之前或同时加入血制品。在另一实施方案中，淬灭剂在加入病原体灭活化合物之前或之后约30分钟内，或约15-20分钟内，或任选地约10分钟内加入。含红细胞的材料可进行例如体外或离体处理。
所处理的血制品中病原体灭活化合物和淬灭剂的浓度可按需要调整，使之按预期减少不必要副反应，同时还保护该材料的性质如红细胞的功能，并获得所需病原体杀灭量(log kill)。
淬灭剂的浓度在一个非限制性实施例中是约0.1mM-约30mM，或约0.5mM-30mM。适于处理红细胞的条件的一个非限制性实例是约0.1mM-约30mM谷胱甘肽，例如约0.5mM-20mM、或约2mM-4mM谷胱甘肽，或在一个实施方案中是约1mM-3mM。
淬灭剂：病原体灭活化合物的摩尔比，在一个非限制性实施方案中，可以在约100∶1-1∶1的范围内，例如约50∶1，或例如约10∶1。可用于处理红细胞的谷胱甘肽∶病原体灭活化合物一个非限制性实施比率可以从约100∶1到1∶1，例如约50∶1到1∶1，或在另一实施方案中为约10∶1至约2∶1。在一个优选实施方案中，谷胱甘肽∶病原体灭活化合物的摩尔比约10∶1。例如，在处理含红细胞的组合物时，谷胱甘肽的摩尔浓度优选约5-20倍，例如约10倍于病原体灭活化合物的摩尔浓度。淬灭剂与病原体灭活化合物的比率可根据所选病原体灭活化合物和淬灭剂的不同而不同。
含核酸结合配体和效应物如芥基团的病原体灭活化合物的典型浓度为约0.1μM-5mM，例如约50-500μM。例如，可应用足以灭活样品中至少约1log，例如至少约3-6log，或任选地至少约5-6log病原体的病原体灭活化合物浓度。在一个实施方案中，病原体灭活化合物优选在浓度不高于约500μM时产生至少1log杀灭量、更优选至少3log杀灭量的化合物。在另一非限制性实施例中，所述病原体灭活化合物在浓度约0.1μM-约3mM时具有至少1log杀灭量，优选至少6log杀灭量。例如，可用约0.15mM奎吖因芥和约3mM谷胱甘肽灭活含红细胞的组合物中超过2log的VSV和HIV、并保持红细胞的功能。
在一个优选实施方案中，提供了一种方法，其中该方法包括用有效量的病原体灭活化合物及淬灭剂处理含红细胞的材料以灭活至少2log的病原体，且其中红细胞功能基本上不因处理而改变。在另一优选实施方案中，提供了一种方法，其中该方法包括用有效量的病原体灭活化合物和淬灭剂处理材料以灭活至少2log病原体，且其中贮存28天后红细胞的溶血少于3％。
可使血制品与病原体灭活化合物和淬灭剂一起温育如至少约0.5-48小时或更长时间，例如约1-48小时，或至少约1-24小时，或例如至少约8-20小时。在另一实施方案中，温育过程持续至对材料进行下一步加工或应用为止。
可在加病原体灭活化合物之前、同时或之后向材料中加入淬灭剂。优选地，在加病原体灭活化合物之前或同时加淬灭剂。在另一优选实施方案中，在加入病原体灭活化合物之前或之后的约30分钟内，或约15-20分钟内加入淬灭剂。
某些淬灭剂如谷胱甘肽可能随时间而氧化或降解或反应。例如，当淬灭剂是含硫醇化合物时，该淬灭剂可氧化为二硫化物二聚体。优选以能使淬灭剂在实质性降解或原位反应之前淬灭病原体灭活化合物的时间和浓度加入淬灭剂。例如，当淬灭剂为谷胱甘肽时，在先于病原体灭活化合物加入谷胱甘肽的实施方案中，优选在加入病原体灭活化合物的约不到12小时前加入谷胱甘肽。在一个优选实施方案中，谷胱甘肽与病原体灭活化合物同时加入。在另一实施方案中，谷胱甘肽在加入病原体灭活化合物之后的30分钟内，或约15-20分钟内，或任选地约10分钟内加入。加谷胱甘肽的时间接近加病原体灭活化合物的时间有利于使因氧化或肽裂解(如在某些生物材料如血浆中可能发生)而可能导致谷胱甘肽浓度下降的程度减至最小。
对红细胞而言，温育通常在约2℃-37℃，优选约18-25℃时进行。例如，当淬灭剂为谷胱甘肽时，红细胞可与病原体灭活化合物和谷胱甘肽一起在约22℃温育约12小时。对血小板而言，温度优选约20-24℃。对血浆而言，温度可能是约0-60℃，通常约0-24℃。
生物材料
各种生物材料可用病原体灭活化合物和淬灭化合物处理。可用淬灭化合物处理的生物材料包括如全血、包装红细胞、血小板以及新鲜或冷冻血浆等血制品。血制品还包括血浆蛋白质部分、抗血友病因子(VIII因子)、IX因子和XI因子复合物、纤维蛋白原、XIII因子、凝血酶原和凝血酶、免疫球蛋白(如IgG，IgA，IgD，IgE和IgM及它们的片段)、白蛋白、干扰素和淋巴因子。合成性血制品也包括在内。
其它生物材料包括疫苗、重组DNA产生的蛋白质和寡肽配体。还包括临床标本如尿、汗、唾液、粪便、脊髓液。还包括合成性血液或血制品贮存介质。
减少处理后材料中化合物的浓度
生物材料如血制品中病原体灭活化合物和/或淬灭剂的浓度可在处理后通过如分批吸收或流洗去除过程而减小。可利用的方法和设备述于PCT US96/09846；1997年1月6日提交的美国专利申请流水号08/779,830；以及1998年1月6日共同提交的美国专利申请流水号09/003,113，它们的公开内容均全文引入本文作为参考。
本发明通过参考以下非限制性实施例可进一步理解。
材料
下述材料在以下实施例中应用。
在这一实验以及后续实验中所用的Adsol可以从Baxter HealthcareCorp.，Deerfield，IL购买，也可通过将下述混合物无菌过滤而制备：1升蒸馏水中22g葡萄糖、9g NaCl、7.5g甘露醇和0.27g腺嘌呤。
Erythrosol购自Baxter Healthcare Corp.，Deerfield，IL，或通过在1升蒸馏水中合并二水柠檬酸钠(7.82g)；二水酸性磷酸钠(0.73g)；二水磷酸钠(3.03g)；腺嘌呤(0.22g)；甘露醇(7.74g)；以及葡萄糖(9g)而制备。
奎吖因芥购自Aldrich Chemical Co.，St.Louis，MO。谷胱甘肽和半胱氨酸购自Sigma，St.Louis，MO。PIC-1(β-丙氨酸N-(吖啶-9-基)2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯)按1997年4月15日提交的美国临时专利申请流水号60/043,696(所公开内容已引入本文)所述合成。PIC-2(β-丙氨酸N-(吖啶-9-基)2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酰胺)按1998年1月6日提交的美国专利申请流水号09/003,115(所公开内容已引入本文)所述合成。
疱疹性口腔炎病毒(VSV)得自ATCC美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD(滴度为8.8log单位)。
全血得自Sacramento血液中心(Sacramento CA)。
包装红细胞(PRBC)得自Sacramento血液中心，其血细胞比容(HCT)约55-65％，或用Adsol或Erythrosol作为附加溶液如下制备：来自Sacramento血液中心的全血在收到后20小时内在3800rpm离心5分钟，将血浆迅速转移至另一容器；使毛细管充满血样并旋转5分钟以测量血细胞比容百分率；将红细胞所占体积与标准曲线比较；加入94ml Adsol或Erythrosol；根据处理的不同，最终血细胞比容为50-60％。
                        实施例
       实施例1：磷酸根离子与病原体灭活化合物的反应
证实磷酸根离子与病原体灭活化合物的反应能力。发现在较高pH值、较高温度和较高磷酸根离子浓度条件下反应能力增强。
室温(RT)下使100μM PIC-1与25mM、pH值递增的磷酸缓冲液共同温育，观察到分解速率大大提高。在pH2.2观察到的t1/2为450分钟，而在pH≈6观察到的t1/2为25分钟。通过HPLC测定，PIC-1与磷酸根离子的反应产生至少两种可观察到的磷酸盐(酯)中间产物。PIC-1的二磷酸酯进一步在易断裂酯处水解。对PIC-1和磷酸根离子的反应混合物进行LC/MS分析。在所述反应条件(pH＝7，磷酸缓冲液)下所观察到的物质为二醇的二磷酸酯、单磷酸酯、以及羟氯化合物的磷酸酯。
缺乏易断裂连接基团的奎吖因芥也与磷酸根离子反应。100μM奎吖因芥在室温下与50mM磷酸盐的反应比在37℃与130mM磷酸盐的同样反应慢(t1/2分别为10分钟和3.5分钟)。这可以通过终产物二磷酸酯的产生较慢以及中间产物的寿命较长而证实。
奎吖因芥在pH＝7.8时易与葡萄糖-6-磷酸反应。新产物经HPLC分析，与和葡萄糖-6-磷酸一起形成的至少一种加合物一致。
实施例2：硫醇及其它亲核体与病原体灭活化合物的反应
对含硫醇化合物谷胱甘肽与病原体灭活化合物的反应能力进行了研究。发现在较高pH值、较高温度以及较高硫醇浓度下反应能力增强。将1mM奎吖因芥于25mM HEPES(N-[2-羟乙基哌嗪-N’-[2-乙烷磺酸]，Sigma，St.Louis，MO](pH7)中与4mM谷胱甘肽(GSH)共同温育。此外，100μM PIC-1与25mM HEPES在pH7与4mM GSH在室温下温育。奎吖因芥和PIC-1与谷胱甘肽的反应分别以t1/250分钟和32分钟进行。经质谱分析鉴定出PIC-1/GSH二元加合物。在较早时间点对与谷胱甘肽的反应混合物进行LC/MS分析鉴定出谷胱甘肽单加合物/吖丙啶鎓中间产物。
硫醇与病原体灭活化合物反应后还对硫醇基团的消失现象进行监控，按Aldrichimica Acta， 4：33(1971)(所公开内容已引入本文)所述通过Ellman反应测量。Ellman反应证实，含两个2-氯乙基基团的化合物(奎吖因芥)与硫醇以1∶1.9的化学计量比率进行反应，反应时间与奎吖因芥的分解一致。这些结果证实了位于芥中心的谷胱甘肽形成共价硫醚键的定量反应能力。
也发现其它硫醇可与PIC-1反应，包括N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、同型半胱氨酸、二肽GlyCys、氨基乙烷硫醇、二甲基氨基乙烷硫醇、二硫苏糖醇、2-巯基烟酸、2-巯基苯并咪唑磺酸和喹啉硫醇。这些硫醇均可从Aldrich Chemical Company(St.Louis MO)或(Sigma，St.Louis，MO)购买。所有例子中，中间产物的形成通过对反应混合物的HPLC分析进行观察，巯基的消耗通过Ellman反应观察。还发现奎吖因芥与亲核体硫代硫酸盐、氢硫化物(HS-)及二硫代氨基甲酸盐反应。
实施例3：对谷胱甘肽穿透红细胞膜的研究
研究了谷胱甘肽穿透红细胞膜的能力，作为病毒包膜的膜系统模型，因为这两者均缺乏转运该肽的任何主动运输系统。通过测定添加外源性谷胱甘肽后红细胞(Sacramento血液中心的包装红细胞，HCT55-65％)内、外硫醇基团的量而评估GSH在红细胞内、外的分布。表2显示了谷胱甘肽总量(胞内的及上清中的)和加或不加3mM GSH时谷胱甘肽的红细胞内含量作为时间的函数。GSH浓度用Bekman DU-20(Beckman，Irvine，CA)单波长分光光度计根据412nm处吸收值计算。结果显示两区室中的巯基含量保持稳定。
                               表2
    时间(分钟)  412nm吸收值总量    GSH浓度(mM)总量 412nm吸收值上清  GSH浓度(mM)上清
                            加入3mM谷胱甘肽
    0     0.230     5.286       0.33     3.071
    60     0.227     5.217       0.318     2.96
    120     0.231     5.308       0.312     2.90
    270     0.213     4.898       0.306     2.85
    1080     0.227     5.217       0.297     2.77
    1440     0.220     5.058       0.296     2.76
                              不加谷胱甘肽
    0     0.082     1.914       0.001     0.028
    60     0.082     1.914       0.001     0.028
    120     0.086     2.005       0.001     0.028
    270     0.075     1.754       0.002     0.037
    1080     0.087     2.027       0.004     0.055
    1440     0.084     1.959       0.003     0.046
实施例4：用奎吖因芥灭活疱疹性口腔炎病毒
研究了加入病原体灭活剂后15分钟后加入各种淬灭剂的效果。疱疹性口腔炎病毒(VSV)(ATCC美国典型培养物保藏中心，Rockville，MD，滴度8.8log单位/ml)在得自Sacramento血液中心(Sacramento，CA)HCT 55-65％的包装红细胞(PRBC)中稀释，并用150μM奎吖因芥(QM)处理。加入QM 15分钟后，各种淬灭剂以1-10mM的剂量加入。这些淬灭剂是氨基乙烷硫醇(AET)、硫代硫酸盐、谷胱甘肽及N-乙酰半胱氨酸(NAC)，均购自Aldrich Chemical Co.(St.Louis，MO)。室温灭活4小时后，用病毒空斑试验分析活病毒(Markus等，病毒学， 57：321-338(1974))。
表3显示在温育15分钟后加入各种淬灭剂的情况下VSV被150μM QM灭活的结果。在没有淬灭剂时，QM灭活3.5log的VSV。AET和硫代硫酸盐以剂量依赖的方式减弱灭活作用。谷胱甘肽和NAC均不使VSV灭活作用减小。
              表3
样品  淬灭剂浓度(mM)  Log杀灭量
只有QM 无 3.5
QM+AET 1 2.8
3 2.3
10 1.8
QM+硫代硫酸盐 1 3.5
3 3.1
10 2.6
QM+谷胱甘肽 1 3.5
3 3.5
10 3.4
QM+NAC 1 3.6
3 3.8
10 3.8
实施例5：用奎吖因芥同时添加各种淬灭剂灭活疱疹性口腔炎病毒
研究了与病原体灭活混合物同时添加的各种淬灭剂的效果。疱疹性口腔炎病毒(VSV)在包装红细胞(PRBC)中稀释。然后用150μM奎吖因芥(QM)和3-30mM不同剂量的各种淬灭剂同时处理PRBC。这些淬灭剂是氨基乙烷硫醇(AET)、硫代硫酸盐、谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸(NAC)、半胱氨酸和巯基乙烷磺酸钠(MESNA)，均购自Aldrich ChemicalCo.(St.Louis，MO)。室温灭活4小时后，用CPE试验(Baxt等，病毒学， 72：383-392(1976))通过评估病毒对幼仓鼠肾(BHK)细胞的致细胞病变效应(CPE)分析活病毒。
表4显示了在同时添加AET、硫代硫酸盐、谷胱甘肽或NAC的情况下VSV被150μM QM灭活的实验结果。在该实验中，VSV被杀灭至无法检测的水平，即＞4.0log的病毒被灭活。故某些淬灭剂可能对病毒灭活作用有一定影响，但这种影响被这一局限掩盖。AET和硫代硫酸盐再次显示对病毒灭活有明显抑制作用，AET是相对较强的抑制物。谷胱甘肽和NAC浓度高达10mM时未显示对病毒杀灭有影响的证据，但当浓度达30mM时显示有一些抑制的迹象。
                  表4
样品  淬灭剂浓度(mM)  Log杀灭量
只有QM        无    ＞4.0
QM+AET        3    1.67
       10    1.5
       30    1.0
QM+硫代硫酸盐        3    3.5
       10    3.3
       30    2.7
QM+谷胱甘肽        3    ＞4.0
       10    ＞4.0
       30    3.7
QM+NAC        3    ＞4.0
       10    ＞4.0
       30    4.0
表5显示了在同时添加谷胱甘肽、半胱氨酸或MESNA的情况下VSV被150μM QM灭活的另一系列实验结果。单独用QM灭活了3.0log，且这一水平即使在谷胱甘肽达30mM也不受影响。半胱氨酸显示剂量依赖型减弱病毒灭活的效应，MESNA具有混和型效果，在30mM淬灭剂时显示有2.3log杀灭量。
                表5
样品  淬灭剂浓度(mM)  Log杀灭量
只有QM     无     3.0
QM+谷胱甘肽 3 3.3
    10     3.3
    30     3.5
QM+半胱氨酸     3     3.0
    10     2.0
    30     1.7
QM+MESNA     3     3.0
    10     3.3
    30     2.3
实施例6：用病原体灭活剂及淬灭剂灭活HIV
检查了谷胱甘肽对PRBC中病原体灭活剂灭活HIV的影响。PRBC用Adsol添加剂溶液制成血细胞比容近60％。加入无细胞HIV-IIIB贮液(Popovic等，科学， 224：497(1984)，近8log/ml)至滴度为近7log/ml。
向含HIV血液的等分样品中加入谷胱甘肽至不同的终浓度并随后加入50μM PIC-1。样品经室温放置12小时。然后使红细胞沉淀，用微量空斑试验(Hanson等，临床微生物学杂志， 28：2030(1990))检测上清中残留的病毒。对照样品只用谷胱甘肽温育以确定它对HIV活力的影响。
PIC-1和谷胱甘肽灭活HIV的结果示于表6。表6中的数据证实，对无细胞HIV的灭活作用不受谷胱甘肽抑制。HIV感染力因在室温放置了12个小时而有一定丧失，损失约0.2log(样品1比样品3)。30mM谷胱甘肽单独使感染力再减少0.3-0.6log(样品2和4，相对于样品1和3)。50μM PIC-1单独使用时，灭活约1.8log。50μM PIC-1添加30mM谷胱甘肽时灭活约2.4log。灭活作用的明显增强可完全归功于谷胱甘肽自身的效应。在0.1mM到30mM谷胱甘肽的范围内，HIV灭活作用略有增强，这与单用谷胱甘肽对HIV的效应一致。
                          表6
 样品编号  PIC-1(μM)   GSH(mM)   Log滴度  Log杀灭量
      温育对照(样品1和2为未温育；3和4为温育12小时)
    1     无     无     7.2     …
    2     无     30     6.9     0.3
    3     无     无     7.0     …
    4     无     30     6.4     0.6
              用PIC-1处理的样品(1 2小时温育)
    5     50     0     5.2     1.8
    6     50     0.1     5.2     1.8
    7     50     0.3     5.2     1.8
    8     50     1.0     5.0     2.0
    9     50     3.0     5.0     2.0
    10     50     10     4.7     2.3
    11     50     30     4.6     2.4
实施例7：用灭活剂和淬灭剂处理被细菌污染的RBC
检查了淬灭剂谷胱甘肽和半胱氨酸对灭活红细胞样品中小肠结肠炎耶尔森氏菌的影响。PRBC在Adsol中制备并用血液中常见的革兰氏阴性污染菌耶尔森氏菌(California Department of Health Services，Microbial Disease Laboratory，Berkeley，CA)攻击。样品用150μMPIC-1和淬灭剂制备，如表7所示。PIC-1在淬灭剂之后约5分钟后加入。室温温育4小时后，用营养琼脂平板将稀释液铺板并37℃过夜培养测定细菌滴度。
表7显示GSH和半胱氨酸对150μM PIC-1灭活耶尔森氏菌的影响。谷胱甘肽和半胱氨酸在16mM浓度时均不对耶尔森氏菌的滴度产生任何影响(样品3和10)。但加入淬灭剂后，灭活作用呈现剂量依赖式减小。16mM淬灭剂对灭活作用产生4-4.5log的抑制(样品9和16)，而2mM淬灭剂的抑制作用小于1log(样品6和13)。
                            表7
 样品     PIC-1     淬灭剂   Log滴度  Log杀灭量
  1     无     无   7.4  …
  2     150μM     无   2.3  5.1
                          谷胱甘肽样品
  3     无     16mM GSH   7.4  0
  4     150μM     0.5mM GSH   3.0  4.4
  5     150μM     1mM GSH   3.0  4.4
  6     150μM     2mM GSH   3.3  4.1
  7     150μM     4mM GSH   4.8  2.6
  8     150μM     8mM GSH   6.1  1.3
  9     150μM     16mM GSH   6.8  0.6
                         半胱氨酸样品
  10     无     16mM Cys   7.4  0
  11     150μM     0.5mM Cys   2.9  4.5
  12     150μM     1mM Cys   2.4  5.0
  13     150μM     2mM Cys   3.2  4.2
  14     150μM     4mM Cys   4.3  3.1
  15     150μM     8mM Cys   6.9  0.5
  16     150μM     16mM Cys   6.4  0.9
实施例8：在对表皮葡萄球菌灭活的过程中应用谷胱甘肽作为淬灭剂
检查了谷胱甘肽对灭活红细胞样品中表皮葡萄球菌(CaliforniaDepartment of Health Services，Microbial Disease Laboratory，Berkeley，CA)的影响。PRBC在Adsol中制备并用表皮葡萄球菌攻击。样品用75μM PIC-1和淬灭剂谷胱甘肽制备，如表8所示。PIC-1在淬灭剂之后约5分钟后加入。室温温育4小时后，用营养琼脂平板对稀释液铺板并37℃过夜培养测定细菌滴度。
表8说明了用75μM PIC-1和不同量GSH对表皮葡萄球菌的灭活。表8所示结果与观察到谷胱甘肽在一定程度上抑制对细菌的灭活作用的结果一致。表皮葡萄球菌明显不如耶尔森氏菌对谷胱甘肽敏感。
                       表8
   样品   PIC-1   GSH(mM)   Log滴度  Log杀灭量
    1   无     无     7.5     --
    2   75μM     无     2.5     5.0
3   无     16     7.5     0
    4   75μM     1     3.3     4.2
    5   75μM     2     3.5     4.0
    6   75μM     3     3.6     3.9
    7   75μM     4     4.2     3.3
    8   75μM     8     4.6     2.9
    9   75μM     16     5.0     2.5
在1-4mM的浓度范围内，淬灭剂只适当降低对细菌的杀灭作用，可灭活细菌达3log或更多。
实施例9：对淬灭剂减少含红细胞的材料中病原体灭活化合物的不必要副反应的研究
检查了谷胱甘肽和半胱氨酸对IgG、白蛋白以及病原体灭活化合物结合红细胞的影响。用含有核酸结合配体及芥基团之类活性基团的某些病原体灭活化合物，如PIC-1处理红细胞可导致IgG与红细胞表面的低水平共价结合。IgG的量通常低于在直接抗球蛋白检验(DirectAntiglobulin Test，DAT)(Walker，R.H.，编，技术手册，第10版，美国血库协会，Arlington，VA，1990)中产生阳性结果所需的水平。但包含淬灭剂可减少或消除蛋白质结合。而且，应用识别PIC-1之吖啶部分的多克隆抗体混合物，可在含有淬灭剂时使病原体灭活化合物对红细胞表面的结合减少。
PRBC制成在Adsol中血细胞比容为60％。用PIC-1处理之前，加入0.5-16mM浓度的谷胱甘肽或半胱氨酸，然后使样品混合。加入PIC-1至1mM，样品室温温育20小时。然后每份样品20μl用1ml血库盐水洗3次，再重新悬浮至终体积为0.4ml。
抗吖啶抗体如Harlow和Lane，“抗体，实验室手册，冷泉港实验室”1988(所公开内容已引入本文)所述制备。山羊抗小鼠IgG和抗人白蛋白抗体购自Caltag，Burlingame，CA。
为了分析，将稀释并洗过的红细胞按50μl等份分装4个试管，在37℃与抗人IgG、抗人白蛋白、或抗吖啶抗体温育30分钟。温育后，样品经1.0ml血库盐水洗一次。抗人抗体共价标记了荧光素，因而样品经流式细胞仪直接分析。为检测抗吖啶抗体，样品再洗一次，然后与荧光素标记的山羊抗小鼠IgG在37℃温育30分钟。样品在分析前如前述洗净。
为了分析，样品用Haemaline 2(Biochem Immunosystem，Allentown，PA)溶液作1∶1稀释，在FACScan(Becton-Dickinson，San Jose，CA)中分析，其中各散射设定值被优化以适于分辨红细胞。每份样品收集20000个荧光事件。
表9说明了谷胱甘肽和半胱氨酸对IgG、白蛋白及吖啶结合红细胞的影响。只用PIC-1处理导致IgG、白蛋白及吖啶信号明显增强(样品1和2)。与16mM谷胱甘肽或半胱氨酸温育，相对于未处理样品没有改变荧光反应(分别见样品3和10)。在有任一种淬灭剂时用PIC-1处理导致IgG、白蛋白及吖啶结合水平发生剂量依赖型降低。在有≥2mM淬灭剂时IgG和白蛋白的结合均维持在本底水平(样品6和13)。相比之下，在所检验的整个范围内，吖啶结合水平取决于淬灭剂的浓度。即使16mM谷胱甘肽或半胱氨酸也不能完全消除吖啶信号。有4mM谷胱甘肽时，吖啶信号减弱53倍(样品2比样品7)；有4mM半胱氨酸时，吖啶信号减弱83倍(样品2比样品14)。在应用0.3mM PIC-1的平行试验中，应用谷胱甘肽可见类似的倾向，尽管蛋白质与吖啶结合的起始水平因PIC-1浓度较低而减小。
                                 表9
         FACScan Fluorescence平均荧光单位
  样品     PIC-1(mM)    淬灭剂(mM)     IgG    白蛋白    吖啶
阳性和阴性对照
    1     无     无     3.1     5.0     4.2
    2     1.0     无     14.8     13.2     3184
谷胱甘肽样品
    3     无     16     3.1     4.4     4.3
    4     1.0     0.5     9.8     8.6     2095
    5     1.0     1     5.2     5.8     898
    6     1.0     2     3.0     5.0     169
    7     1.0     4     3.4     4.5     60
    8     1.0     8     4.1     4.7     25
    9     1.0     16     4.5     4.0     18
半胱氨酸样品
    10     无     16     3.6     3.5     4.1
    11     1.0     0.5     6.6     7.0     1386
    12     1.0     1     5.3     5.1     462
    13     1.0     2     3.8     4.2     180
    14     1.0     4     6.0     4.0     38
    15     1.0     8     3.6     4.0     19
    16     1.0     16     3.6     3.3     12
实施例10：谷胱甘肽对PIC-1处理过的贮存PRBC性质的影响研究
为确定谷胱甘肽对红细胞性质的影响，重复进行以下实验。收集4份ABO血型相配的全血，混合，然后分装4个血袋以产生相同的500ml。用Adsol作为添加剂溶液制备PRBC。从Sacramento血库收到血样，在20小时内，将多份全血于3800rpm离心5分钟，将血浆迅速转移至另一容器内。通过将血样装满毛细管并旋转5分钟测量血细胞比容百分率。将红细胞所吸收的体积与标准曲线比较。加入94ml Adsol。根据不同处理，最终血细胞比容在50-53％的范围内。
在每个实验中，检查4种情况：(1)对照，无PIC-1和谷胱甘肽；(2)只有3mM谷胱甘肽；(3)只有0.3mM PIC-1；(4)0.3mM PIC-1加3mM谷胱甘肽。所有样品包括对照在20℃放置14小时。然后将PRBC转移至4℃贮存一段时间。在处理完的当时及处理后约每周一次取样分析。2，3-DPG、ATP和溶血的结果概述于表10和11。这些数据证实任何处理与对照相比均没有显著性差异。对胞外钾、胞内谷胱甘肽、渗透不稳定性、葡萄糖消耗以及乳酸产生的测量也证实，谷胱甘肽不管是单独应用或与PIC-1联合，均不会明显改变红细胞的体外性质。
胞外钾水平用Ciba Corning 614型K+/Na+分析仪(Ciba CorningDiagnostics Corp.，Medford，MA)测量。溶血根据Hogman等，输血31：26-29(1991)所述测量。胞内谷胱甘肽根据Beutler，“红细胞代谢”，Grune & Stratton，第三版，1984所述测量。2，3-DPG和ATP分别用Sigma第665号和第366号方案(Sigma，St.Louis，MO)测量。葡萄糖消耗和乳酸产生分别用Sigma第115号和第735号方案(Sigma，St.Louis，MO)测量。渗透不稳定性根据Beulter等，血液，卷59(1982)所述测量。
                                     表10
  试验  样品     Day1     Day7     Day14     Day28     Day42
  2，3-DPG  对照     1.18     0.006     0.12     n.d.*     n.d.
  (μmol/mL)  GSH     1.21     0.37     0     n.d.     n.d.
 PIC-1     1.23     0.25     0.06     n.d.     n.d.
 PIC-1/GSH     1.16     0.29     0.02     n.d.     n.d.
  ATP  对照     78.8     80.1     74.5     60.1     42.1
  (μmol/dLHb)  GSH     79.8     83.9     79.8     63.6     42.5
 PIC-1     79.0     80.3     75.5     62.6     41.7
 PIC-1/GSH     80.1     81.3     77.6     63.0     44.5
  溶血率(％)  对照     0.05     0.07     0.15     0.25     0.37
 GSH     0.04     0.07     0.16     0.24     0.33
 PIC-1     0.06     0.08     0.15     0.24     0.33
 PIC-1/GSH     0.04     0.08     0.16     0.23     0.29
*n.d.＝未进行实验
                                  表11
  试验   样品     Day1     Day7     Day14     Day28     Day42
  2，3-DPG   对照     0.78     0.09     n.d.*     n.d.     n.d.
  (μmol/mL)   GSH     0.69     0     n.d.     n.d.     n.d.
  PIC-1     0.77     0.10     n.d.     n.d.     n.d.
  PIC-1/GSH     0.73     0.22     n.d.     n.d.     n.d.
  ATP   对照     87.8     84.6     75.5     58.1     42.5
  (μmol/dLHb)   GSH     90.3     87.2     81.1     61.0     43.1
  PIC-1     84.0     77.0     72.0     55.8     41.0
  PIC-1/GSH     87.0     82.5     75.7     58.9     42.7
  溶血率(％)   对照     0.06     0.12     0.21     0.44     0.72
  GSH     0.06     0.11     0.18     0.31     0.56
  PIC-1     0.07     0.13     0.19     0.31     0.46
  PIC-1/GSH     0.06     0.10     0.17     0.26     0.35
*n.d.＝未进行实验
实施例11：经GSH处理的小鼠RBC的恢复和存活的研究
研究了在有和没有6.0mM GSH的情况下0.6mM PIC-2对生物素标记之鼠红细胞(RBC)的体内恢复及存活的影响。对小鼠RBC进行标记，然后用PIC-2、PIC-2+谷胱甘肽、或只用谷胱甘肽处理。将已处理并标记的细胞输入受体，通过流式细胞仪对这些细胞的循环情况观察36天。任何已处理RBC与只有标记的对照相比在恢复和存活时间上没有差异。数据证实，谷胱甘肽在处理中与体内RBC功能相容，PIC-2处理本身不损害红细胞。
供体小鼠(BALB/c雄鼠)在第1和第2天注射0.1mg NHS(N-羟基琥珀酰亚胺)生物素(Pierce，Rockford，IL)。第二次注射1小时后检查标记效率，方法是从每只小鼠取少量生物素标记之全血与链霉抗生物素蛋白R-藻红蛋白偶联物(Molecular Probes，Eugene OR)反应，然后在FACScan(Becton-Dickinson，San Jose，CA)上测定荧光细胞的百分率。用有≥90％标记的RBC的所有小鼠作为供体小鼠。
从供体小鼠经心脏穿刺取血，在1282xg离心一次计6分钟。除去血浆，将PRBC在±0.6mM PIC-2±6.0mM GSH的情况下室温(RT)放置14小时。第二天上午清洗RBC并再悬浮于HBSS(Hanks缓冲盐溶液，Sigma，St.Louis，MO)。照上述测定清洗后RBC的生物素标记率。RBC总量通过在细胞计数器(Complete Blood Count Cell Counter，BiochemImmunosystems，Allentown，PA)上进行CBC(全血细胞计数)而测定。
将清洗后的RBC输入受体小鼠(BALB/c雌鼠)。每只小鼠接受约800×106个生物素标记的RBC。每只小鼠在输血时称重，根据小鼠体重、经CBC测定的RBC计数、以及按上述测定的所输入的标记RBC百分率计算标记RBC/小鼠的真实百分率。
标记RBC的存活率在1小时，以及1-40天时测定。结果按1小时时存活率为100％而标准化。所有小鼠1小时时标记RBC的真实恢复率为105.8±17.5％。将结果统一为相对于1小时时为100％存活的存活率，以便排除静脉注射标记RBC的效率方面的差异。
PIC-2处理的RBC存活情况在整个实验中与对照基本相同。平均存活值提供于图1。数据表明，用PIC-2处理，无论有没有谷胱甘肽，均不会对RBC的存活产生显著影响。因此，谷胱甘肽与处理后红细胞的体内循环相容。

Claims (32)

1.一种淬灭体外或离体血制品中病原体灭活化合物的不必要副反应的方法，所述方法包括：
用包含核酸结合配体和本身是或能形成亲电子基团之官能团的有效量病原体灭活化合物处理体外或离体血制品，其中所述病原体灭活化合物灭活病原体不需要光活化；和
用含有能与所述亲电子基团共价反应之亲核性基团的淬灭剂处理所述体外或离体血制品；其中所述病原体灭活化合物和淬灭剂以有效灭活所述材料中的病原体而淬灭病原体灭活化合物的不必要的副反应的量给予并与血液制品温育足够的时间。
2.权利要求1的方法，其中所述的血制品包含全血、红细胞、血浆、血小板、压积红细胞或具有30-85％的血细胞比容的血制品。
3.权利要求1或2的方法，其中所述亲电子基团为吖丙啶鎓离子。
4.权利要求1或2的方法，其中所述亲电子基团能与核酸反应，从而与核酸形成共价键。
5.权利要求1或2的方法，其中所述官能团是能原位反应形成亲电子基团的芥基团。
6.权利要求1或2的方法，其中所述病原体灭活化合物还包含使所述官能团与所述核酸结合配体连接的易断裂连接子。
7.权利要求1或2的方法，其中所述病原体灭活化合物包含选自下组的核酸结合配体：呋喃香豆素类、呋喃香豆素衍生物、吖啶类和吖啶衍生物；并且
其中所述官能团是芥基团。
8.权利要求1或2的方法，其中所述病原体灭活化合物是β-丙氨酸，N-(吖啶-9-基)，2-[双(2-氯乙基)氨基]乙酯或奎吖因芥。
9.权利要求1或2的方法，其中所述亲核性基团是硫醇、硫代酸、二硫代羧酸、磷酸盐、硫代磷酸盐、硫代硫酸盐或胺。
10.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂选自谷胱甘肽、N-乙酰半胱氨酸、半胱氨酸、巯基乙烷磺酸盐及二巯基丙醇。
11.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂是浓度为0.5-30mM的谷胱甘肽。
12.权利要求1或2的方法，其中所述病原体灭活化合物和所述淬灭剂与材料共同温育1-48小时。
13.权利要求1或2的方法，其中所述病原体灭活化合物的浓度为0.1μM-5mM；和/或足以灭活材料中3-6log病原体。
14.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂使病原体灭活化合物对病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的病原体灭活对照减少不超过3log。
15.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂使病原体灭活化合物对病毒性病原体的灭活比没有淬灭剂时进行的病原体灭活对照减少不超过1log。
16.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂包含含有亲核性基团的固相支持材料。
17.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂在加入病原体灭活化合物之后加入血制品中。
18.权利要求1或2的方法，其中所述淬灭剂在加入病原体灭活化合物之前或同时加入血制品中。
19.权利要求1或2的方法，其中所述血制品包含红细胞，并且其中红细胞功能在处理后没有实质性改变。
20.权利要求1或2的方法，其中所述血制品包含红细胞，并且其中所述方法包括用病原体灭活化合物及淬灭剂处理该材料，以灭活2log病原体，并且其中红细胞功能经处理没有实质性改变。
21.权利要求1或2的方法，其中所述血制品包含红细胞，并且其中所述红细胞的溶血在处理后再贮存28天后不到3％。
22.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括用有效量的病原体灭活化合物及淬灭剂处理所述材料，以灭活2log病原体。
23.权利要求1或2的方法，其中处理后血制品适于导入个体。
24.权利要求1或2的方法，其中所述方法包括处理含有病原体的血制品，所述病原体可选的是原核生物或真核生物和有脂质包被的病毒。
25.权利要求1的方法，其中所述的血制品包含两相生物材料，该两相生物材料包含第一相和第二相，所述第一相含有液体，其中具有有膜病原体，而第二相被该病原体的膜包围，
并且其中所述病原体灭活化合物在形成亲电子基团之前，相对于淬灭剂，能动力地跨膜；并且
该病原体灭活化合物在形成亲电子基团之后，相对于形成亲电子基团之前的病原体灭活化合物，不能动力地跨膜。
26.权利要求25的方法，其包括使淬灭剂与病原体灭活化合物反应，并且淬灭剂在第一相与病原体灭活化合物的亲电子基团反应。
27.权利要求25或26的方法，其包括使含有亲电子基团的病原体灭活化合物与第二相中病原体的核酸反应，从而灭活该病原体。
28.权利要求25或26的方法，其中所述膜含有脂质。
29.权利要求25或26的方法，其中所述病原体是i)含有确定该膜的脂质包被的病毒，并且所述第二相限定为脂质包被的内部；或ii)细菌，该细菌含有具脂质的细胞膜，限定两相系统的膜，第二相限定为细胞膜的内部。
30.权利要求25或26的方法，其中所述淬灭剂相对于形成亲电子基团之前的病原体灭活化合物，不能动力地跨膜。
31.权利要求25或26的方法，其中所述病原体灭活化合物包含能形成吖丙啶鎓离子亲电子基团的官能团。
32.权利要求1或2的方法，其包括在血制品处理后降低血制品中病原体灭活化合物和淬灭剂中至少一种的浓度以获得适于引入个体的产品。
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