KR0180917B1 - 세포함유 조성물내 바이러스의 광역학적 불활성화방법 - Google Patents

세포함유 조성물내 바이러스의 광역학적 불활성화방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세포의 실질적인 파괴 또는 불활성을 야기하지 않고 1×109세포/ml를 함유하는 조성물에서 세포외 지질 피막 병원성 바이러스 또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성시켜 생산되는 생성물에 관한 것이다. 이 불활성 방법은 630nm 이상의 최대 흡수를 가지는 적어도 하나의 광반응 화합물의 바이러스 박멸 유효량, 광선 및 산화제로 조성물을 접촉시켜 80% 이상의 세포의 기능을 유지하면서 바이러스를 실질적으로 불활성시키는 것으로 이루어진다.
또한 본 발명은 적어도 하나의 광반응 화합물의 바이러스 박멸 유효량, 광선 및 퀸처로 조성물을 접촉시켜 상기 물질의 기능을 유지하면서 바이러스를 불활성시키는 것으로 이루어지는 생물학적 조성물에서 실질적 파괴 또는 불활성을 유발하지 않고 바이러스를 불활성시킴으로써 얻어지는 생성물에 관한 것이다.

Description

세포함유 조성물내 바이러스의 광역학적 불활성화방법
제1도는 알루미늄 프탈로시아닌 클로라이드(AlPc)로의 무세포 소수포성구내염 바이러스(VSV)의 불활성화를 도시한 4개의 그래프.
제1a도는 전혈(全血)을 사용한 결과를 도시한다.
제b도는 적혈구 농축물을 사용한 결과를 도시한다.
제1c도는 PBS로 5배 희석한 전혈을 사용한 결과를 도시한다.
제1d도는 PBS로 2배 희석한 적혈구 농축물을 사용한 결과를 도시한다.
제2도는 술폰화된 알루미늄 프탈로시아닌으로 무세포 VSV의 불활성화를 도시한 4개의 그래프.
제2a도는 전혈과 AlPcS2를 사용한 결과를 도시한다.
제2b도는 적혈구 농축물과 AlPcS2를 사용한 결과를 도시한다.
제2c도는 전혈과 AlPcS4를 사용한 결과를 도시한다.
제2d도는 적혈구 농축물과 AlPcS4를 사용한 결과를 도시한다.
제3도는 AlPc로 처리하기 전과 후의 적혈구 삼투 파괴성을 도시한 그래프이다.
본 발명은 빛을 조사하면서 예컨대 프탈로시아닌과 같은 광반응 화합물을 사용하여 생물학적 조성물 예컨대 전혈 또는 적혈구 농축물에서 세포의 실질적 파괴 또는 불활성을 유발하지 않고(예컨대 적혈구의 구조 또는 기능의 역효과) 바이러스를 불활성시키는 방법에 관한 것이다.
개선된 공여자 선택과정 및 공여자 혈액 스크리닝 과정을 통하여 전혈 및 그 구성성분의 바이러스 감염을 감소시키는데 실질적인 발전이 있어왔다. 이러한 발전에도 불구하고, 전혈 및 혈액산물에 의한 간염바이러스 및 인간면역결핍 바이러스(HIV) 등과 같은 바이러스의 전파의 위험성은 계속 존재하였다.
제조과정중의 바이러스 박멸 과정을 통하여 응고인자 농축물에서 특정 바이러스(예컨대 B형간염 바이러스(HBV), C형 간염바이러스(HCV), 인간의 면역 결핍바이러스(HIV))의 전파 위험성은 상당히 감소되었으며 가능한 제거되었다(Prince, A.M., Horowitz, B., Horowitz, M.S., Zang, E., The Development of Virus-Free Labile Blood Derivatives-A Review Eur. J. Epidemiol., 1987; 3:103-118 및 Mannucci, P.M., Colombo, M., Virucidal Treatment of Clotting Factor Concentrates, The Lancet, 1988; 782-785).
그러나 응고인자 농축물을 처리할 때 일부 바이러스(예컨대 파르보바이러스)는 감염성을 가진채로 남아 있다. 또한, 세포는 단백질보다 더 파괴되기 쉽고 바이러스를 품어 바이러스의 불활성화를 방지하는 작용을 하기 때문에, 세포구성성분 즉, 적혈구나 혈소판과 같은 혈액 세포단편에 사용할 수 있는 바이러스 박멸과정의 개발은 더디다. 그럼에도 불구하고, 전혈 또는 혈액 구성분에 의한 바이러스 전파를 제거하려면 혈액 세포에 사용가능한 효과적인 바이러스의 제거 또는 강력한 바이러스 박멸법이 요구된다.
적혈구와- 혈소판 모두 비-복제적이기 때문에 핵산 변형을 지향한 연구는 필요한 특성을 제공할 수 있을지도 모른다.
바이러스 박멸과정을 평가하는데 있어서, 바이러스는 세포-함유 용액에서 다양한 형태, 예컨대 무세포 바이러스, 세포와 연관된 형성 바이러스, 기능적이지만 세포내의 패키지되지 않은 바이러스 핵산 미 세포 게놈에 통합된 바이러스 핵산으로 존재한다는 사실을 인식하는 것이 중요하다.
각각의 형태는 감염성이 있으며 생체내에서 바이러스 질병을 유발할 수 있는 것으로 여겨진다.
예컨대 무세포 바이러스의 한 형태에서 바이러스를 불활성화하는 바이러스 박멸법은 예컨대 세포-연관 형태의 다른 형태에서는 바이러스를 불활성화시킬 수 없다. 또한, 세포의 존재는 바이러스를 불활성화시키기 위한 물리적, 화학적 접근 작용을 저해하는 것으로 알려져 있다.
따라서, 예컨대 적외선 조사가 염용액 또는 희석 단백질 용액에서 바이러스 박멸이 높은 반면 세포-함유 용액에서 처리할 경우 바이러스 박멸작용의 정도가 불완전하다.
더욱이, 이와 관련해서 바이러스만을 불활성화시키는 것은 충분하지 못하며 예컨대 적혈구와 같은 중요한 세포구성분에 나쁜 영향을 미치지 않고 바이러스 감영성을 제거할 수 있도록 충분한 효력으로 불활성화시키는 것이 필요하다.
예컨대 저온살균 또는 용매/세제 처리와 같은 지금까지 개발된 대부분의 바이러스 박멸과정은 세포를 손상시켜 수혈에 적합하지 않게 함으로 혈액세포 제제로 사용될 수 없다.
지금까지, 세포에 역효과를 미치지 않고 및/또는 독성이 매우높은 시약을 사용함이 없이 적어도 104감염단위(ID50), 바람직하게는 ≥106ID50의 세포내 및 세포의 바이러스가 불활성화된 전혈 또는 적혈구 농축물 또는 혈소판 농축물의 바이러스 멸균형태를 제조하는 것은 불가능하였다.
암세포 치료를 위한 프탈로시아닌의 사용에 관심이 증가하여 왔지만(Rosenthal, I.와 Ben Hur, E., Phthalocyanines in Photobiology, Lezhoff C.C.와 Lever A.B.P. eds., Phthalocyanines, VCH Publishers, Inc., New York, New York, 1989, 393-425), 일반적으로 프탈로시아닌은 용혈적인 것으로 여기지는데 명세서에서 출원인의 결과를 더욱 놀라운 것으로 만들었다.
예컨대 Ben-Hur 및 Rosenthal(Photohemolysis of Human Erthrocytes Induced by Aluminum Phthalocyanine Tetrasulfonate, Cancer Lett., 30:321-327, 1986)은 알루미늄 프탈로시아닌 테트라술포네이트에 의해 유발되는 사람 적혈구의 광용혈현상을 연구하였다. 실질적인(20-100%) 용혈현상은 총광속량 40KJ/m2(4J/cm2) 이상에서 2.5 내지 10μM AlPcS4로 처리함으로써 유발되었다.
Ben-Hur 및 Rosenthal은 바이러스 파괴문제에 대하여서는 언급하지 않았다. 이와 유사하게, Sonoda, Krishna 및 Riesz(The Role of Singlet Oxygen in the Photohemolysis of Red Blood Cells Sensitized by Phthalocyanine, Photochem. Photobiol., 46:625-631, 1987)는 일부 프탈로시아닌 유도체의 각각에 의하여 유발되는 광용혈현상을 연구하였다.
알루미늄 및 아연 프탈로시아닌은 각각 용혈성인 반면, 중심금속 양이온으로서 철, 구리 또는 코발트를 가지는 프탈로시아닌 또는 프리(금속을 가지지 않는) 프탈로시아닌은 용혈성이 아니다.
바이러스 파괴는 연구되지 않았다.
Singer 등(C.R.J. Singer, T. Azim 및 Q. Sattentau, Preliminary Evaluation of Phthalocyanine Photosensitization For Inactivation of Viral Pathogens in Blood Products, [요약서] British J. Homatology, March 23-25, 1988:Abs. 31)은 프탈로시아닌으로 실시된 바이러스 파괴에 대한 유일한 연구로 믿어지는 그의 저서에서 술폰화된 알루미늄 프탈로시아닌 5 및 25μg/mL 및 2mW/cm2로 30분간(3.6J/cm2) 처리한 결과 혈장에 첨가된 엡스테인 바르 바이러스 및 HIV의 미지의 양이 불활성화된다는 사실을 밝히고 있다.
VIII 인자 회수는 50% 정도였다. Singer 등은 적혈구 세포에의 사용에 대해 평가하였지만 세포 또는 세포 연관 바이러스에 대한 실제적 작용에 대해서는 기술하지 않았다.
Singer에 의해 기술된 VIII인자의 비교적 낮은 회수율(50%), 단백질보다 더 높은 세포파괴성 및 프탈로시아닌 처리에 대한 적혈구세포으 광용혈현상의 이전의 결과를 고려한다면 본 명세서의 결과는 휠씬 놀라운 것이다.
Cole 등(Cole, M., Stromberg, R., Friedman, L., Benade, L., Shumaker, J., Photochemical Inactivation of Virus in Red Cells, Transfusion, 29, Supp:42s Abs., 1989)은 15% 헤마토크리트로 희석된 충전 적혈구 세포의 처리과정에서 메로시아닌 540의 사용을 밝히고 있다.
농도가 2.6% 되도록 혈장을 제거할 경우에 65log의 소수포성구내염 바이러스의 감소가 달성된다. 그러나, 15% 혈장을 포함하는 샘플에서는 1log의 VSV 감소가 달성된다.
저자는 적혈구 세포를 손상으로부터 보호하는데 혈장이 필요할지라도 바이러스 파괴는 역시 상당히 감소된다는 결론을 내렸다.
5% 알부민이 존재함으로써 세정된 혈소판의 현탁액에서 바이러스 파괴가 억제되며(Prodouz, K.N., Effect of Merocyanine 540 on Platelet Fuuction and Reduction of its Autiviral Activity by Albumin, Transfusion, 29, Supp:42s Abs., 1989), 비록 메로시아닌 540에 의해 완충용액에서 6log의 표준 바이러스가 불활성되지만 12-25% 혈장의 존재하에서는 1-3log의 바이러스만이 불활성된다(Moroff, G., Benade, L.E., Dabay, M., George, V.M., Shumaker, J. 및 Dodd, R.Y., Use of Photochemical Procedures to Inactivate Viruses in Platelet Suspensions, Transfusion, 29, Supp:S15 Abs., 1989)는 관찰사실로부터 이 결론은 뒷받침된다.
더욱이, 저자는 과정이 혈소판 특성에 역화를 미침을 언급하고 있다. Matthews, J.T., Newman, J.T., Sogandares-Bernal, F., 등(Photodynamic Therapy of Viral Contaminants with Potential For Blood Banking Applications, Transfusion, 1988; 28:81-83)은 헤마토프르피린 유도체 및 광선으로 전혈을 처리한 결과를 연구하였다. 이들은 광선 및 디헤마토포르피린 에테르(DHE) 2.5μg/mL를 함유하는 배지에서의 처리결과 3×105PFU의 허피스 단순바이러스 타잎 1(HSV-1)이 불활성되는 반면 동일 조건하에서 혈액의 처리결과 103PFU만이 불활성됨을 밝히고 있다.
DHE의 농도를 20μg/mL로 증가시키는 것은 바이러스 파괴를 개선시키지 않았다.
2.5μg/mL DHE 및 5J/cm2광선하에서 적혈구 세포의 구조 및 기능은 잘 유지되는 반면 완충용액에만 첨가된 무세포 HIV(2×103ID50)은 이 조건하에서 완전히 파괴되지 않았다.
Lin 등(Lin, L., Wiesehahn, G.P., Morel, P.A. 및 Corash, L., Use of 8-Methoxypsoralen and Long-wavelength Ultraviolet Radiation for Decontamination of Platelet Concentrates, Blood, 74:517-525, 1989)은 UV-A 조사 및 소랄렌이 혈소판 농축물에 첨가된 고양이 백혈병 바이러스의 105.5ID 이상을 불활성화시킨다는 사실을 밝히고 있다. 그러나 본 연구는 전혈 또는 적혈구 세포 농축물에서는 실시되지 않았다.
혈소판 형태, 응고 및 유리반응은 처리후 즉시 잘 유지되었으며 96시간 동안 저장상의 비처리 대조군에 비하여 상당한 수치를 나타냈다.
이와는 대조적으로, Moroff 등)(Moroff G., Benade, L.E., Dabay, M., George, V.M., Shumaker, J. 및 Dodd, R.Y., Use of Photochemical Procedures to Inactivate Viruses in Platelet Suspensions, Transfusion, 29, Supp:S15 Abs., 1989)은 혈소판 처리를 위한 소랄렌의 사용을 탐구하였으며 12% 이하의 혈장의 존재는 바이러스 파괴를 억제하며 혈소판 특성은 역효과를 받는다는 결론을 내렸다. 전형적으로 제조되는 주입용 적혈구 세포 및 혈소판 농축물은 100% 혈장에 현탁된다는 사실을 주지하여야 한다.
1988년 12월 2일에 출원된 미국특허출원 제07/279, 179호 및 최근 발행된 초록(Williams 등, Blood, 1988, 72:Suppl:287a)에서 전혈에 첨가된 소수포성 구내염 바이러스가 가수분해가능한 아릴디올에폭시드로 배양한 결과 적혈구 용혈현상을 유발하지 않고 불활성됨을 밝히고 있다.
오존은 간염바이러스 109PFU/mL를 함유하는 전혈을 정화하는 것으로 확실시된다(Zee, Y.C. 및 Bolton, D.C., Ozone Decontamination of Blood and Blood Products, 미국특허 제4, 632, 980호).
그러나 이 확신을 뒷받침할 데이타는 제시되지 않았다.
Prodouz, K.N., 등(Prodouz, K.N., Fratantoni, J.C., Boone, J.E. 및 Bonner R.F., Use of Laser-UV for Inactivation of Virus in Blood Products, Blood, 1987, 70:589-592)은 혈소판 농축물을 레이저-UV 처리하여도 폴리오 바이러스의 106(ID50) 이상을 불활성시키는 조건하에서 혈소판 기능이 대부분 유지됨을 밝혔다. 그러나 바이러스 불활성은 완충배지에서만 연구되었으며 혈소판의 존재하에서는 연구되지 않았다.
또한 무세포 상태의 바이러스를 이용하였다.
Hartman 등(Hartman, F.W., Mangun, G.H., Feeley, N., Jackson, E., On the Chemical Sterilization of Blood and Blood Products, Proc. Soc. Exp. Biol. Med., 70; 248-254, 1949)은 니트로겐머스타드, 메틸-비스(베타-클로로에틸) 아민 히드로클로라이드로 전혈을 처리한 결과 적혈구세포 용혈현상이 대조군보다 더 높은 조건하에서 소수포성구내염 바이러스의 106.6ID50의 불활성화가 초래됨을 밝혔다.
니트로겐머스타드는 암유발인자임을 주지하여야 하겠다.
LoGrippo(LoGrippo, G.A., Investigations of the Use of Beta-Propiolactione in Virus Inactivation, Ann. NY Aca. Sci., 83, 578-594(195))는 혈장으로부터 분리된 적혈구 세포를 베타-프로피오락톤으로 처리하였다.
이 처리결과, 적혈구 용혈현상을 유발하지 않고 동부마뇌염 바이러스의 108ID50이상이 불활성되었다.
사람에 처리된 적혈구세포를 계속 주입하면 순환성 반감기가 짧아진다.
본 발명의 목적은 세포-함유 조성물에서 세포의 실질적인 파괴 또는 불활성은 유발하지 않고 바이러스를 불활성시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 전혈, 적혈구 농축물 및 혈소판 농축물에서 적혈구 또는 혈소판의 구조 또는 기능에는 역효과를 미치지 않고 바이러스를 불활성화 시키는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 바람직한 용해성 생물학적 물질(예컨대 응고인자 농축물, 헤모글로빈 용액)의 실질적 불활성을 유발하지 않고 생물학적 조성물에서 바이러스를 불활성시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 전혈, 적혈구 세포농축물 및 혈소판 농축물의 혈액 뱅크 및 이들로부터 유래한 제품의 바이러스에 대한 안정성을 개선하는 것이다. 본 발명의 또 다른 목적은 병원업무자 및 기타 보건업무자들이 노출될 염려가 있는 바이러스로부터의 노출을 감소시키는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 사람과 동물에 있어 순환성 바이러스 부담을 감소시키는 것이다.
본 발명의 또다른 목적은 사용하기 전에 세포-함유 조성물 예컨대 적혈구 조성물의 저장성을 개선시키는 것이다.
기타 목적과 더불어 상기 목적 및 잇점들은 본 발명에 의하여 충족될 수 있다.
본 발명은 세포-함유 조성물에서 세포의 실질적인 파괴 또는 불활성을 유발하지 않고 사람의 세포내 병원성 바이러스 또는 지질로 둘러싸인 사람의 세포외 병원성 바이러스를 불활성화시키는 방법에 관한 것으로, 1×109세포/ml 이상으로 함유하는 세포-함유 조성물을 630nm 이상의 파장에서 최대 흡수도를 가지는 적어도 하나의 광반응 화합물의 바이러스 박멸유효량, 광 및 산화제로 접촉시켜 실질적으로 바이러스를 불활성시킴으로써 80% 이상의 완전한 세포기능 및 구조를 유지하게 하는 것으로 구성된다.
본 발명의 다른 측면에 따라서, 생물학적 조성물을 적어도 하나의 광반응 화합물의 박멸유효량, 광 및 퀸처로 접촉시켜 이 물질의 기능을 유지하면서 바이러스를 불활성시키는 것으로 구성되는 방법에 의하여, 조성물의 실질적 파괴 또는 불활성을 유발하지 않고 생물학적 조성물의 세포외 및 세포내 바이러스가 불활성된다.
더욱 상세히는, 본 발명은 전혈, 적혈구, 농축물, 혈소판 농축물 또는 이들로 부터 유래한 제품들에서 세포내 바이러스 뿐만 아니라 세포외 바이러스를 불활성시키는 방법에 관한 것으로, 상기 전혈, 적혈구 농축물 또는 이들로부터 유래된 제품들을 630nm 이상의 파장에서 최대 흡수도를 가지는, 예컨대 푸르푸린 또는 프탈로시아닌과 같은 광반응화합물의 바이러스박멸 유효량으로 접촉시키고, 얻어진 조성물을 글루타티온과 같은 선택적인 퀸처와 함께 산화제의 존재하에 광선에 노출시키는 것으로 구성된다.
또한 본 발명은 ml당 1 내지 109세포 이상의 농도로 수혈에 적합하며 주입시 70% 또는 그 이상, 바람지하게는 85% 또는 그 이상의 정상회수를 가지며, 20일 이상 바람직하게는 30일 이상의 만족스런 순환생존을 가지는 사람의 적혈구 세포 및 비감염 형태의 지질로 둘러싸인 모든 세포외 및 세포내 인간 병원성 바이러스를 함유하는 조성물에 관한 것이다.
이 조성물은 바람직하게 삼투 충격에 대해 정상적인 것보다 그 높은 내성을 가진다.
혈액은 고형물(세포, 즉 적혈구, 백혈구 및 혈소판)과 액체(혈장)으로 구성된다. 빈혈, 응고장애, 감염등의 치료에 세포를 수혈한다.
또한 세포는 헤모글로빈과 같은 중요한 물질을 포함하며 인터페론, 성장인자 및 기타 생물학적 반응 조절자와 같은 기타 중요물질을 생성하도록 유도할 수 있다. 혈장은 주로 물, 염, 지질 및 단백질로 이루어진다. 단백질은 피브리노겐, 혈청글로블린 및 혈청 알부민으로 불리우는 군으로 나누어진다. 사람의 혈장에서 발견되는 전형적인 항체(면역 글로불린)은 감염성 간염, 인플루엔자 H 등에 대항하는 것들이다.
수혈은 질병 또는 출혈로 인한 빈혈, 혈장단백질의 결손 또는 순환량의 결손으로 이한 쇼크, 혈장단백질의 적당수준이 유지되지 않는 혈우병과 같은 질병을 치료하며 또한 수동 면역을 부여하는데 이용된다.
어떤 질병에 잇어서는 하나 또는 수개의 혈액 구성분이 결손될 수도 있다. 따라서 적당한 성분만의 투여로 충분하며 기타 성분은 환자에게서 낭비되는 것이다; 다른 성분은 또 다른 환자에 사용될 수 있다.
혈액을 구성성분으로 분리하고 이들을 계속 분별함으로써 세포 및/또는 단백질이 농축되어지며 따라서 이들의 치료적 사용을 증대시킬 수 있다.
사람의 혈액에서 발견되는 세포에는 적혈구, 혈소판 및 몇가지 형태의 백혈구들이 있다. 수혈에 유용한 세포 농축물의 제조방법은 Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, 제3판, Interscience Publishers, Volume 4, pp25-37에서 찾아볼 수 있다.
이 문헌의 전체내용은 본 명세서의 참고 문헌으로 포함된다.
혈구단편에 발견되는 단백질은 헤모글로빈, 피브로넥틴, 피브리노겐, 혈소판 유래 성장인자, 과산화물, 분자변위보효소, 탄수화물 및 단백질 대사 효소 등이 있다. 또한 인터페론과 성장인자등과 같은 기타 단백질의 합성도 유도될 수 있다.
유도 백혈구 단백질의 포괄적인 리스트는 Stanley Cohen, Edgar Pick, J.J. Oppenheim, Biology of the Lymphokines, Academic Press, New York(1979)에 제시되어 있다.
본 발명은 적어도 하나의 광반응화합물을 전혈, 적혈구 농축물, 혈소판 농축물, 혈소판 추출물, 백혈구 농축물, 정액, 복수, 유즙, 임파액, 하이브리도마 세포계 및 상기의 어느것으로부터 유래된 생성물과 같은 세포-함유 조성물로 접촉시키는 것에 관한 것이다.
본 발명은 비혈액 정상 또는 암세포 또는 유전자 접속(splicing) 산물을 함유하는 조성물 제품을 처리하는데 이용될 수 있다.
퀸처가 첨가되지 않으르 경우 본 발명에 사용하기 위한 적당한 광감작 화합물로는 프로피린과 비슷한 기초 골격(또는 배열)의 몇몇 원자가 다양하더라도 구조가 프로피린과 유사한 프탈로시아닌, 푸르푸린 및 기타 화합물 등이 있다.
예컨대 프탈로시아닌은 포르피린의 메틴탄소원자에 의해 결합된 테트라피롤 고리가 아자 질소원자에 의해 연결된 4개의 이소인돌단위체로 대체되는 것만 제외하고 포르피린과 유사(아자포르피린)하다.
이들 프탈로시아닌, 포르피린 및 푸르푸린 분자는 금속 또는 비금속 중심 원자를 포함하거나 포함하지 않을 수 있으며, 기초 분자골격이 다양하게 치환되어 (a) 최대 최장파장흡수를 630nm 이상으로 적색 이동시키고, (b) 몰흡광 계수를 증가시켜 여기 적색광의 흡수도를 향상시키고, (c) 수액환경에서 광감작 분자의 용해성 및 지방친화성 또는 DNA 결합능력을 조절할 수 있다.
예컨대 게르마늄, 갈륨과 같은 금속을 함유하는 본 발명에서 사용하기 용이한 광반응 화합물은 상자성이라기보다는 반자성이다.
본 발명에서 사용될 수 있는 치환 광감작물질을 포함하는 광감작물질은 다음과 같은 특징을 가지는 화합물을 초래한다.
(a) 물 흡광계수≥50,000 Molar-1cm-1
(b) 최대 흡수도≥630nm, 바람직하게는 660 내지 730
(c) 물 및 무극성 용매에서 1μM 이상의 용해도
(d) 양친매성을 가짐
(e) 대략 2시간의 시간 간격으로 사용농도에서 식염완충수용액에 용해됨.
본 발명에서 사용하는 바람직한 광반응 화합물은 프탈로시아닌(Pc's 또는 PC's)이다. 프탈로시아닌은 화학적으로 안정하고, 잘 밝혀진 합성이 용이한 포르피린과 같은 화합물이다(Spikes, J., Phthalocyanines as Photosensitizers in Biological Systems and for the Photodynamic Therapy of Tumors, Photochemistry and Photobiology, 1986; 43:691-699 및 Ben-Hur, E.와 Rosenthal, I., The Phthalocyanines:A New Class of Mammalian Cells hotosensitizers with a Potential for Cancer Phototherapy, Int. J. Radiat. Biol., 1989; 47:145-147).
프탈로시아닌의 포유동물에 대한 독성이 결여되는 것에 대한 고무적인 증가가 문헌에 제시되어 있다(Moser, F.H. 및 Thomas, A.C., The Phthalocyanines, Boca Raton:CRC Press, 1984).
프탈로시아닌은 630nm 이상의 파장에서 매우 강한 전자흡수띠를 가진다. 헤모글로빈은 이 스펙트럼 영역에서 상대적으로 낮은 흡수를 나타낸다.
본 발명에서 사용될 수 있는 프탈로시아닌의 비-한정적인 예에는 다음과 같은 것들을 예시할 수 있다.
테트라술포프탈로시아닌 아연
테트라술포프탈로시아닌
테트라나트로프탈로시아닌 알루미늄
테트라나트로프탈로시아닌 아연
테트라카르복시프탈로시아닌
GaCl-테트라술포프탈로시아닌
AlCl-테트라술포프탈로시아닌
Ga-테트라술포프탈로시아닌 및
GaCl-, AlCl- 또는 Ga- 테트라나트로프탈로시아닌
본 발명의 바람직한 구체예에서 알루미늄 프탈로시아닌이 사용된다. 바람직한 알루미늄 프탈로시아닌에는 알루미늄 프탈로시아닌 클로라이드(AlPc) 및 알루미늄 프탈로시아닌의 술폰화형 예컨대 AlPcS2및 AlPcS4등이 있다. 아연은 중심원자로서의 알루미늄으로 대체할 수 있으며 고리는 술폰화 대신에 질산화될 수 있다.
퀸처가 첨가될 경우, 본 발명에서 사용되는 바람직한 광감응 화합물에는 프탈로시아닌, 푸르푸린 및 프로피린과 구조가 유사한 기타 분자뿐만 아니라 자외선에 의해 활성되는 광반응 화합물(예컨대 소랄렌, 8-메톡시소랄렌, 4'-아미노메틸-4, 5', 8-트리메틸 소랄렌, 베르갑텐 및 안겔리신) 및 가스스펙트럼에서 빛을 흡수하는 염료(예컨대 히페리신, 메틸렌 블루, 에오신 플루오레신 및 플라빈) 등이 있다.
적당한 퀸처에는 산소의 반응형 또는 자유기와 반응하는 것으로 알려진 물질들로 특별히 광역학적 촉매화학반응(예컨대 DNA 가닥 브리드)의 효율을 감소시키거나 또는 광역학적 세포 파괴 실험에서 세포독성을 감소시킨다. 그러나 본 발명에 따라서, 바이러스 박멸작용을 실질적으로 감소시키지 않고 놀라울 정도로 팍칭이 효과적이다.
대표적인 퀸처에는 불포화지방산, 환원당, 콜레스테롤, 인돌 유도체 등 및 아자이드나트륨 등의 아자이드, 터립토판, 글리세롤과 같은 다가알콜 및 만니톨, 글루타티온과 같은 티올, 수퍼옥사이드 디스무타아제, 케르세틴, DABCO 등이 있다. 이들 퀸처의 혼합물을 사용하는 것도 예상할 수 있다.
퀸처는 종래의 팍칭양으로 사용되나 사용시 놀랍게도 전체 반응이 바이러스에 우선적으로 손상을 초래하며 바람직한 생물학적 물질에는 미치지 않는다.
본 발명에 위하여 불활성화될 수 있는 지질로 피막된 사람의 병원성 바이러스의 비-한정적 예에는 소수포성구내염바이러스(VSV), 몰로니 육종 바이러스, 신드비스 바이러스, 인간면역결핍 바이러스(HIV-1, HIV-2), 사람의 T-세포 임파추향성 바이러스-I(HTLV-I), B형 간염 바이러스, QL-A 비-B 간염 바이러스(NANB)(C형 간염, 거대세포바이러스, 엡스테인 바르 바이러스, 락테이트 탈수소화효소 증진 바이러스, 허피스군 바이러스, 래브도바이러스(rhabdoviruses), 류코바이러스(leukoviruses), 믹소바이러스(myxoviruses), 알파바이러스(alphaviruses), 아르보바이러스(arboviruses)(B 그룹), 파라믹소바이러스(paramyxoviruses), 아레나바이러스(arenaviruses) 및 코로나바이러스(coronaviruses) 등이 있다.
본 발명에 의하여 불활성화 될 수 있는 비-피막 바이러스의 비-한정적인 예에는 파르바이러스(parvirus), 폴리오바이러스(poliovirus), A형 간염 바이러스 및 장내 비-A 비-B 간염 바이러스 등이 있다.
본 발명의 과정은 바람직하게는 0 내지 45℃, 더욱 바람직하게는 4 내지 37℃에서 38시간 바람직하게는 2 내지 24시간 동안 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명의 과정은 6.3 내지 7.7의 중성 pH 영역에서 실시하는 것이 바람직하다.
본 발명에서 전형적인 광속량의 범위는 5 내지 500J/cm2, 프탈로시아닌으로는 100 내지 500J/cm2, 소랄렌으로는 5 내지 100J/cm2이 바람직하다.
광선이 밝을수록 더 적은 시간이 요구된다.
혈액 주머니에 대해서는 장시간의 덜 밝은 광선이 사용된다.
퀸처가 없는 상황에서 광반응화합물의 바람직한 농도는 1 내지 100μM이다: 적혈구 농축물의 경우에는 광반응화합물의 농도는 10 내지 25μM이 가장 바람직하다. 퀸처가 사용될 경우, 관반응 화합물의 농도는 보통 사용되는 예컨대 AMT 에 25μg/ml이다.
본 발명의 과정은 산화제의 존재하에서 실시한다. 산소는 본 발명에서 사용하는 산화제의 비-제한적 예이다.
산소의 농도는 내부발생량일 수 있거나 또는 산소농도를 낮추거나 높이기 위하여 디자인 공기에서 처리되는 물질의 대체에 의해 수정될 수도 있다.
본 발명에 따라 처리되어질 세포 함유 조성물은 1×109세포/ml 이상, 바람직하게는 5×109세포/ml 이상, 더욱 바람직하게는 1×109세포/ml 이상의 농도를 가진다. 더욱이, 본 발명에 의하여 처리되어질 세포함유 조성물은 4mg/ml의 단백질, 바람직하게는 25mg/ml의 단백질, 더욱 바람직하게는 50 내지 60gm/ml의 단백질(비세정 세포)을 가진다.
발명 과정에서, 적어도 104바람직하게는 106의 바이러스 감염 단위가 불활성화된다.
발명과정은 개선된 저장 안정성 즉 액체 또는 냉동 형태에 저장될 수 있으므로써 감소된 세포파괴가 얻어질 수 있는 처리 세포를 초래한다.
본 발명에 따른 세포 함유 조성물은 초기에는 1000 감염단위이상의 바이러스/L를 함유할지라도 본 발명에 따라 처리되고 바이러스가 불활성된 후에는 80% 이상의 완전한 세포 기능 및 구조를 보유하며 바람직하게는 90% 이상 더욱 바람직하게는 98% 이상이다.
본 발명의 불활성화 고장에 의하여서도 실질적으로 함유된 거의 모든 바이러스가 불활성되지 않을 것이다.
침팬지(생체내)에 접종하여 감염정도를 측정하는 방법은 Prince, A.M., Stephen, W., Bortman, B. 및 Van den Ende, M.C.에 의하여 기술되어 있다(Evaluation of the Effect of Betapropiolactone/Ultraviolet Irradiation(BPL/UV) Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by Factor IX Complex in Chimpanzees, Thrombosis and Hemostasis, 44:138-142, (1980)).
본 발명에 따라서, 바이러스의 불활성은 적어도 4log, 바람직하게는 6log 정도까지 얻어질 수 있는 것으로 이는 104(또는 106)까지 희석한 농도에서도 비처리된 샘플에 존재하는 바이러스 활성이 측저욀 수 있는 감염도 분석에 의하여 측정하여 샘플의 바이러스가 완전히 불활성될 수 있는 정도다.
본 발명은 완전한 혈구의 기능 및 구조를 보유하면서 동시에 바이러스를 불활성화하는 것에 대해 기술한다.
적혈구의 기능적활성은 대사 수준, 효소활성,전해질 수준 및 산소운반능력을 측정함으로써 확인된다.
적혈구의 구조적 완전성은 헤모글로빈 유리, 삼투 파괴성, 크롬 51로 방사 표식한 후 생체내의 생존, 항원성 및 세포표피 단백질의 변성에 의한 평가 등에 의하여 확인될 수 있다.
혈소판의 기능적 활성은 특정 생물제제의 존재하에서의 응집능력 및 이들의 형태로부터 결정할 수 있다.
혈소판의 구조적 완전성은 인듐-111로 방사표식한 후의 생체내 활성 및 특정 혈소판 항원의 식별에 의하여 확인될 수 있다.
본 발명의 방법은 베타-프로피오락톤 또는 UV 또는 다른 광선형 예컨대 감마선 등의 기타 바이러스 불활성 제제와 결합하여 사용될 수 있다.
본 발명은 다음 사항을 제시한다.
(1) 광을 조사하면서 프탈로시아닌과 같은 광반응 화합물은 적혈구의 구조 또는 기능에 역효과를 미치지 않고 전혈 또는 적혈구 농축물에서 바이러스를 불활성시킨다.
(2) 630nm 이상의 최대흡수를 가지는 친지성 염료는 적혈구의 구조 및 기능을 유지하는 조건하에서 전혈 또는 적혈구 농축물의 많은 양의 바이러스(예컨대 ≥105.5ID50)를 불활성시킨다.
(3) 전혈에 존재하는 세포외 및 세포내 바이러스 적혈구 농축물 또는 혈소판 농축물은 세포구조 및 기능에 역효과를 미치지 않고 불활성화될 수 있다.
(4) 광선에 노출된 친지성 염료는 적혈구를 삼투파괴로부터 안정화시킬 수 있다.
(5) 상기 반응후 또는 그 동안에 광화학적 촉매 반응의 퀸처의 첨가는 실질적으로 바이러스 멸균을 감소시키지 않으면서 발생하는 세포 또는 단백질 손상을 줄인다.
헤마토포르피린 유도체와 같은 기타 친지성 염료에 대하여 프탈로시아닌늬 주요 장점은 630-700nm에서 프탈로시아닌의 매우 강한 광흡수도이다. 이 파장에서 광선은 보통의 포르피린 및 헤마토포르피린 감응제에 의해 흡수되는 짧은 파장과 비교하여 향상된 조직 투과성을 가진다.
더욱이, 프탈로시아닌의 흡수 스펙트럼은 혈액성분 특히 578nm에서 최대흡수를 가지는 헤모글로빈의 스펙트럼과 잘 분리된다.
본 멩세서에서 보듯이, 소수성 염료와의 광촉매 반응은 VSV 및 HIV와 같은 세포외 피막 바이러스의 불활성을 존재하는 반면 비-피박 바이러스인 세포외 뇌심근염 바이러스(EMC)는 불활성되지 않는다.
또한 세포의 더 강한 소수성 영역에 결합하는 AlPcS2및 AlPcS4는 적은 농도로 AlPc 보다 더 효과적인 바이러스 박멸제제이다.
무세포 및 세포 관련 바이러스 모두 시험한 조건하에서 불활성되며, 헤모글로빈 유리가 되지 않으므로써 알 수 있듯이, 처리 또는 저장후에도 적혈구 세포 본체가 유지된다는 사실을 주지하여야 하겠다.
사실, 광선과 AlPc로 적혈구 현탁액을 처리하면 저장 쇼크에 대해 적혈구 세포를 장전화시킨다. 또한 AlPcS4- 처리 적혈구 세포의 완전성의 증거는 이들의 순환반감기를 측정함으로써 얻을 수 있다.
비비의 처리된 적혈구 세포는 13.4일의 반감기를 가지는 반면 처리되지 않은 비비의 적혈구 세포는 13.9일의 반감기를 가진다.
완전한 적혈구 세포 농축물 단위에 첨가된 VSV가 불활성화 된다는 사실은 광선 노출 및 AlPc 첨가에 기초한 과정이 혈액 뱅킹 조건에 보충될 수 있음을 나타낸다.
광 캐비넷에 축적된 단위로 약 6 내지 24시간동안 또는 더 강한 다중 광원을 사용한다면 더 많은 시간동안 처리하는 것도 예상할 수 있다.
본 발명의 바람직한 구체예에서 250 내지 1000J/cm2의 광속량을 2 내지 4cm 두께 샘플에 적용하고 교반한다.
본 발명의 다른 바람직한 실시예에서 본 발명에 따른 과정은 혈액 주머니의 샘플에 적용한다.
광반응 화합물로 처리한 후 원심분리, 세척 및/또는 특성에 의하여 과다한 광활성 화합물을 제거할 수 있다.
본 발명은 구체화에서, 발명 과정으로부터의 처리된 세포-함유단편을 초기의 세포함유 단편이 유래한 공여체 예컨대 사람공여체에 전이 또는 환원한다.
이와같은 방법으로, 공여체에서 순환 바이러스의 수준은 감소된 것이며 따라서 공여체의 바이러스를 제거하는 능력을 향상시키고 및/또는 항바이러스 약제의 효율을 개선하게 된다.
이상에서 주지된 바와 같이, 또한 본 발명은 산화제의 유무에 상관없이 광반응 화합물, 광선 및 퀸처와 관련된 불활성 방법을 확립한다.
산소의 존재하에서 혈소판 농축물의 AMT/UVA 처리동안에 퀸처의 첨가는 표준 응집 반응에서 측정하여 정상의 혈소판 기능을 초래하고 VSV의 105.5TCID50이상을 불활성시킨다: 퀸처의 첨가가 없는 경우에는 혈소판의 응집율 및 정도는 감소된다.
놀랍게도, 양 샘플에서 바이러스 사멸은 비슷하다.
유사하게, 혈장의 AMT/UVA 처리동안 퀸처의 첨가는 응고인자 VIII의 다량 회수를 초래하며 퀸처의 첨가가 없다면 회수는 단지 77%이었다.
또한 놀랍게도, VSV 사멸에 다른 차이점은 없다.
다른 예에서, 토끼의 적혈구 세포의 순환 반감기를 알루미늄 프탈로시아닌 테트라술포네이트 및 가시광선 처리후 평가하였다.
퀸처의 첨가는 바이러스 사멸에 역효과를 초래하지 않고 처리된 적혈구 세포의 순환생존을 연장하였다.
본 발명을 다음의 비한정적인 실시예를 제사하여 설명하고자 한다.
[실시예]
[혈액]
전혈은 보통 48시간 이내의 것을 사용한다.
사용하기 전에 4℃에서 저장하여. 2000rpm에서 20분간 원심분리하여 혈장층의 대부분을 제거하여 전혈로부터 적혈구 세포농축물(RBCC)을 제조하였다. 지시된 대로 인산염 완충식염수(PBS; Gibco Laboratories, Grand Island, New York)로 전혈을 5배 희석하거나 또는 적혈구 세포농축물을 2배 희석하였다.
[알루미늄 프탈로시아닌 용액]
Kodak Laboratory Chemicals 회사(Rochester, New York)로부터 알루미늄 프탈로시아닌 클로라이드(AlPc)를 구입하였다.
분광측광 등급 N, N-디메틸포름아미드(Aldrich, Milwaukee, Wisconsin)에서 AlPc(0.01M) 원액을 제조하였다.
알루미늄 프탈로시아닌 테트라술포네이트(AlPcS4) 및 알루미늄 프탈로시아닌 디술포네이트(AlPcS2)를 Porphyrin Products 회사(Logan, Utah)로부터 구입하였다. PBS에서 AlPcS2및 AlPcS4(6.2×10-4M) 원액을 제조하였다.
2×1051mol-1cm-1의 몰흡광 계수를 사용하여 AlPc의 경우에는 670nm, AlPcS2의 경우에는 674nm 및 AlPcS4의 경우에는 675nm에서 모든 프탈로시아닌 용액의 농도를 분광측광법으로 측정하였다.
[소랄렌 용액]
HRI Assoc. 회사(Concord, CA)로부터 4'-아미노메틸-4, 5'-8-트리메틸소랄렌(AMT)를 구입하였다.
증류수에서 AMT(4mg/ml)의 원액을 제조하였다.
[모델 바이러스 연구]
다음 바이러스를 불활성을 조사하였다: 소수포성구내염 바이러스(VSV) 지질 피막 RNA 바이러스; 뇌심근염 바이러스(EMC), 단백질 피막 RNA 바이러스 및 사람의 면역결핍 바이러스(HIV), 사람의 병원성 레트로바이러스.
VSV를 사람의 A549 세포에서 배양하였다.
마우스 L929 도는 사람의 A549 세포에서 EMC 원액을 제조하였다.
배양 및 분석 과정은 Horowitz, B., Wiebe, M.E., Lippin, A. 및 Stryker, M.H., Inactivation of Viruses in Labile Blood Derivatives, Transduction, 1985; 25:516-522에 기술되어 있는 방법과 유사하다.
10% 소태아 혈청(FCS; MA Bioproducts, Wlalkersville, Maryland)가 함유된 DMEM 배지(Gibco Laboratories, Grand Island, New York)에서 단점, 10배 연속 희석함으로써 VSV 및 EMC의 감염성을 평가하였다.
각 희석액을 사용하여 96- 웰 미세적정 플레이트에 사람 A549 세포의 8 복제 웰에 접종하였다.
5% CO2, 37℃에서 접종 72시간후에 바이러스 유발 세포병리를 검정하였다. Spearman Karber방법(Spearman, C., The Method of Right and Wrong Cases'('Constant Stimuli') Without Gauss's Formula, Br. J. Psychol, 1908; 2227-242)을 이용하여 밝혀진 바이러스 적정을 계산하였으며 이는 세포배양 웰(TCID50)의 50%가 감염된 바이러스 양을 나타낸다.
150cm2조직 플라스크에서 5% CO2하의 37℃, 1시간 동안 무혈청 DMEM에서 107ID50/ml VSV 5ml을 함유하는 사람의 A549 세포의 융합 단일층을 배양하여 세포-연관 VSV를 제조하였다.
이 조건하에서의 감염 복합도는 대략 2.1TCID50/세포이었다.
액체를 천천히 따르고 제거한 후 부착된 세포를 3회 세척하여 세척당 50ml PBS로 자유 바이러스를 제거하였다.
그 다음 5% FCS를 함유하는 40ml의 DMEM를 첨가하고 세포를 43/4시간동안 배양하였다. 부착된 세포를 PBS로 3회 세척하고 0.01% 트립신(Cooper Biomedical, Freehold, New Jersey; 2회 결정화) 및 5μg/ml EDTA를 함유하는 정상 염용액으로 10분간 처리하여 유리시켰다.
유리된 세포를 윈심분리로 모아서 PBS로 3회 세척하고 PBS에 재현탁 하였다.
불활성을 평가하기 위하여, 무세포 바이러스를 1:10 희석에서 연구한 혈액 구성분에 첨가하고 이 혼합물의 3ml 분취량을 폴리스티렌 튜브(Fisher Scientific, Springfield, New Jersey; Cat. #2 027; 7ml 용량)에 분배하고 프탈로시아닌 유도체를 첨가하였다. 혈액 혼합기(Fisher Scientific, Cat. # 14-060-1)를 이용하여 심플을 계속해서 혼합하고 황색의 570nm 장경로 필터(Oriel Corp.)이 장치된 Zenith 300 watt Xe short arc 램프가 갖추어진 Solar Simulator(Oriel Corp., Stratford, Connecticut)으로부터의 광선으로 광교반하였다.
넓은 띠 경로 필터(F # 8174) 및 분산기(W#4425)가 장착된 검출기(모델 # SED038)를 갖춘 측광계(모델 # IL1350 International Light, Newburyport, Massachusetts)로 측정하여 이 샘플에서 광속량은 약 25-26mWatts/cm2이었다. 아래에 제시된 데이타와 비교하여, 검출기에 장치된 676nm 간섭필터(The Optometrics Corp., 제품 # 02-6765, Ayer, MA)를 통한 여과는 광속량의 1.3%를 전이시켰다. 광조사 시간은 44, 88 및 176J/cm2광속력에 각각 대응하여 보통 30, 60 및 120분이었다.
펜을 통하여 계속해서 공기를 공급하고 샘플의 온도를 조사동안에는 28℃ 이상 상승시키지 않았다.
600ml 용량 # 5J359 주머니(Fenwall Division, Deerfield, Illinois)에서 전체 적혈구세포 농축물(RBCC) 단위의 바이러스 불활성을 실시하였다. 광교반동안에 주머니의 샘플을 혼합하기 위하여 Thermolyne Speci-mix 혼합기(모델 M26125, Sybron Corp., Iowa)를 사용하였다.
바이러스의 불활성을 평가하기 위하여, 5% 소태아 혈청을 함유하는 DMEM에 10배 희석하여 반응을 중지하였다.
1500rpm에서 10분간 원심분리하여 적혈구 세포를 제거하였다.
바이러스 불활성의 결여는 이 희석에서 또는 광이 없는 상태에서 연구한 각 불활성 조건에서 확인되었다.
샘플을 멸균 여과하고(Swinnex filters, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) 또한 분석할 때까지 -70℃ 또는 그 이하에서 냉동하였다.
세포-연관 VSV의 불활성을 평가하는 과정은 무세포 VSV의 과정과 유사하다. 단, 세포 연관 VSV의 모든 실험은 전체적으로 통제된 무균조건하에서 실시하였다.
실험의 결과에서, Ficoll-Paque(Pharmacia Fine Chemicals, Piscataway, New Jersey)의 첨가로 감염 A549 세포를 단리하고 1800 Xg에서 30분간 실온에서 회전 버킷 로터로 원심분리하였다.
A549 세포를 함유하는 층을 모아서 원심분리로 PBS로 3회 세척하고 1ml PBS에 재현탁하고 곧바로 무세로 바이러스때와 같이 단점, 10-배 연속희석하여 VSV 감염을 분석하였다.
본 실험에서 사람의 면역결핍바이러스(HIV)의 HTLV Ⅲb균주를 사용하였다. 감염성의 측정은 이미 기술되어 있는 방법과 유사하다(Prince, A.M., Pascual, D., Kosolapov, L.B., 외 Prevalence, Clinical Significance, and Strain Specificity of Neutralizing Antibody to the Human Immunodeficienty Virus, The Journal of Infectious Diseases, 1987:56-268-272).
연속 흐름 스크로스 밴딩에 의하여 제조된 무세포 HIV의 만배 농축물을 Bionetics 회사(Rockville, M.D.)로부터 구입하였다.
10% FCS를 함유하는 RPMI 1640을 이용하여 8×105mL 농도로 CEM 또는 H9 세포로 미세적정 플레이트에 연속적으로 10배 희석하여 적정하였다.
사용전에, 2μg/mL의 폴리브렌을 함유하는 상기 배지에 37℃ 상에서 1시간 배양함으로써 세포를 조절하였다.
처리 샘플의 바이러스는 암실에서 37℃ 2시간동안 세포에 흡착하였다.
2000rpm에서 10분간 플레이트를 원심분리하고 상징액을 흡입하여 처리화합물을 제거, 독성을 감소시킴으로써 배양물을 배지에서 2회 세척하였다.
그 다음 4, 7 및 10일째에 배양물 150μl를 배지 25μl로 보충하였다. 14일째에, 배양물을 PBS로 2회 세척하여 접종물에 위치한 바이러스 항원을 제거하고 0.5% Triton X-100을 함유하는 PBS에서 세포를 분쇄하였다.
재조합체 p55(Syntex Corp., Polo Alto, CA.)에 대한 토끼의 항혈청 및 과산화 효소 표식 토끼-항-p55로 코트된 플레이트를 사용한 ELISA에 의하여 HIV p55 항원에 대하여 분쇄물을 분석하였다.
이 분석은 Dupont p24 항원분석에서의 p24 측정에서와 동일한 실질적으로 동일한 감도를 가졌다.
적은 양의 잔류 바이러스의 측정 감도를 증가시키기 위하여, AlPc로 처리한 비희석된 바이러스 함유액 0.5 내지 1.0ml를 5ml마크로 배양에 접종하고 용량의 반을 제거하고 4주동안 신선하 배지로 주 2회 대체함으로써 공급하였다.
세포-연관 HIV에 대하여, H9 세포 8×105/mL CEM의 25mL 배양물을 HIV 104TCID50으로 접종하였다.
용량의 반을 제거하고 주 2회 신선한 배지로 대체함으로써 배양물을 공급하였다. 각 공급에서, 상징액을 ELISA에 의하여 p55 항원으로 분석하였다. 적정이 1:64 또는 그 이상일 때 대개 10 내지 12일째에 감염세포를 다음의 실험에 사용하였다. 실험에 사용하기 전에, 감염 세포의 106분취량을 펠리트하고 HIV 면역 글로불린(Prince, A.M., Horowitz, B., Baker, L. 외, Failure of and HIV Immune Globulin To Protect Chimpanzees Against Experimental Challenge With HIV, PNAS, 1988; 85:6944-6948) 100μL에 재현탁하고, 37℃에서 1시간 배양하고 배지에서 3회 세척하여 비 세포-연관 바이러스의 양을 감소시켰다. 그 다음 감염세포를 106/mL 농도로 CPD(citrate phoshpate dextrose)로 항응집된 전혈 또는 배지에 현탁하였다.
광의 유, 무에 상관없이 AlPc의 다양한 농도에 이들 혼합물을 노출시켰다. 처리후, 샘플을 RPMI-1640으로 1:2 희석하고 Ficoll-Hypaque을 통하여 원심분리하여 적혈구와 백혈구를 분리하였다.
회수된 백혈구를 3회 세척하고 계산하여 100μl 배지에 연속해서 희석하였다. 그 다음 비감염 CEM 세포를 첨가하고 배양물을 상기 언급된 것과 같이 감염도 적정 과정에 따랐다.
Drabkin 시약(Sigma Procedure No, 525, Sigma Diagnostics, st. Louis, Missouri)를 사용하여 총 헤모글로빈을 정량하였다.
원심분리로 세포를 제거한 후, 1mg/ml 용액에 대해 0.86의 흡수도를 띠며 A540에서 혈장의 광학밀도를 측정함으로써 혈장 헤모그로빈을 평가하였다(Antonini, E. 및 Brunori, M., Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands, Amsterdam:North-Holland Publishing Co., 1971. (Neuberger A., Tatum E.L., eds., Frontiers of Biology; Vol. 21)).
원심분리전에, 적혈구 농축물을 PBS로 1:1 희석하였다.
그 결과를 존재하는 총 헤모글로빈의 백분율로 표시하였다. 처리된 적혈구 세포의 삼투 파괴성을 Dacie, J.V., Lord, M.B., Vaughan, J.M. 및 Oxon, D.M., The Fragillity of Red Blood Cells, Its Measurements and Significance, J. Path Bact., 1938, 46:341-356에 기술된 대로 측정하였다. PHM 82 pH 측정기(Radiometer America Inc., Cleveland, Ohio.)로 pH를 측정하였다.
처리된 적혈구 세포를 세척하여 혈장 단백질을 제거하고,51Cr로 세포를 포식함으로써 자지의 토끼 적혈구 세포의 순환반감기를 측정하였다.
[실시예 1]
[AlPc에 의한 VSV 및 EMC의 불활성]
AlPc의 존재하에 적혈구 세포 농축물(1×1010적혈구/ml) 또는 전혈(5×109적혈구/ml)에 첨가된 무세포 VSV의 불활성은 그 농도 및 광속량(투사량)에 의존한다(제1도), 전혈(제1a도), 적혈구 농축물(제1b도).
PBS로 5배 희석된 전혈(제1c도) 및 PBS로 2배 희석된 적혈구 세포 농축물(제1d도)에 지시된 대로 무세포 VSV 및 AlPc를 첨가하였다.
전혈 및 적혈구 농축물의 혈장단백질 농도는 지시된 대로 희석전에 60mg/ml이었다.
샘플(3mL)를 일정한 광선세기)25-26mWatts/cm2)에 총 광속량이 44J/cm2(폐쇄원), 88J/cm2(개방원) 또는 176J/cm2(개방 삼각형)이 되도록 다양한 시간동안 노출하였다.
광선에 노출후, 바이러스 감염도를 기술된 대로 평가하였다.
각각 노출시간 60 및 10분 및 25mWatts/cm2의 광선세기에 해당하는 88 및 176J/cm2의광속량 및 10μM의 AlPc 농도에서 전혈에 첨가된 VSV(≥104.0내지 104.5TCID50)의 완전한 불활성을 관찰하였다.
44J/cm2의 세기에서, 첨가된 VSV의 완전한 불활성이 25μM의 AlPc에서 요구되었다(제1a도).
적혈구 세포 농축물(RBC 농도=1×1010/ml:제1b도)에 첨가된 VSV의 불활성은 전혈(제1a도)에서 관찰된 것과 유사하다.
PBS로 최초 5배 희석(제1c도)된 전혈 또는 최초 2배 희석된 적혈구 세포농축물(제1d도)에 첨가된 VSV의 완전한 불활성은 주어진 광속량에서 희석되지 않은 대응물에서 관찰된 것보다 더 낮은 AlPc 농도에서 일어난다. VSV 불활성은 AlPc의 부존재 또는 어둠하에서는 일어나지 않았다(데이타는 제시되지 않았음).
처리동안 유리된 헤모글로빈으로 측정하여 적혈구 세포의 완전성은 제1도에 제시된 각각의 조건하에서 잘 유지되었다(세포 분해 2%).
비피막 바이러스 무세포 EMC는 상기와 유사한 조건하에서 평가될 때 AlPc의 처리로 불활성되지 않았다(데이타는 제시되지 않음).
[실시예 2]
상기와 같이 세포내 VSV를 제조하였다.
바이러스 감염단위(1×106TCID50/50μl; 2.0×106TCID50/ml)에 트립신 처리(2.07×107/ml)후 수직한 세포의 논도비교결과는 실제적으로 모든 세포가 감염바이러스를 포함하고 있다는 사실을 제시하였다.
적혈구 세포 농축물에 첨가된 이 세포내 VSV는 10μM AlPc 및 88J/cm2로 이 적혈구 세포 농축물의 처리에서 완전히 불활성되었다.
(105.6TCID50이상)(표 1).
무세포 바이러스(제1b도)와 비교한 결과, 세포-연관형의 불활성은 더욱 어렵다는 것을 알 수 있다.
적혈구 세포구조 및 기능은 영향을 받지 않았다.
* 88J/cm
[실시예 3]
AlPc의 디- 및 테트라- 술포네이트 유도체의 존재하에 무세포 VSV의 불활성화를 조사하였다. 지시된 농도의 무세포 VSV 및 AlPcS(제2a도 및 제2b도) 또는 AlPcS(제2c도 및 제2d도)를 전혈(제2a도 및 제2c도) 또는 적혈구 농축물(제2b도 및 제2d도)에 첨가하였다.
기타 세부 사항은 제1도에 대하여 상기 기술된 것과 같다.
술폰화된 유도체로 VSV의 완전한 불활성((10 TCID이상)은 주어진 광속량 하에서 술폰화되지 않은 형태(제1도에 대하여 제2도)에서 관찰된 것보다 더 낮은 AlPc 농도에서 일어났다. PBS로 5배 희석된 전혈 또는 2배 희석된 적혈구 세포 농축물에 첨가된 VSV의 완전한 불활성화는 44J/cm 의 광속량 및 술폰화된 유도체의 2μM로 관찰되었다(데이타는 제시되지 않음). 처리과정동안 헤모글로빈 유리에 관하여서는 176J/cm 까지의 광속량 및 25μM까지의 AlPcS농도에서 조금(2% 이하) 관찰되었다(표 2).
[실시예 4]
[AlPc에 의한 HIV의 불활성]
테스트 튜브의 전혈 또는 적혈구 세포 농축물에 무세포 또는 세포내 형태의 HIV를 첨가하였다. 무세포 HIV의 처리에는 10μM AlPc 및 176J/cm 를 사용하였고, 세포내 HIV dml cjfldpsms 5μM AlPc 및 44J/cm 를 사용하였다. 처리 결과에서, 샘플을 상기와 같이 공정하고 HIV 항원 측정을 하였다.
AlPc로 전혈 또는 적혈구 세포 농축물의 처리는 무세포의 10 TCID이상 및 세포내 HIV dml (10 TCID이상을 불활성화 시키는 것이로 나타났다(표 3). 적혈구 세포 구조 및 기능은 영향을 받지 않았다.
[실시예 5]
[적혈구 세포 완전성]
AlPc 유도체로 처리과정동안 적혈구 세포로부터 유리된 헤모글로빈의 백분율의 전형적인 결과는 표 2에 도시되어 있다.
유리된 백분율은 존재하는 총 헤모글로빈의 0.2 내지 1.5% 사이에서 다양하다.
전혈을 처리한 후 적혈구 삼투 파괴성을 AlPc를 제거하기 전에 측정하였다(제3도). 44J/cm (개방원), 88J/cm (개방 삼각형) 및 176J/cm (개방 사각형)의 광속량 및 10μM AlPcCl로 전혈을 처리하였다.
처리후 계속 공정하지 않고, 지시된 농도에서 염용액으로 희석함으로써 이들 샘플 및 처리되지 않은 대조샘플(폐쇄원)에서 적혈구 삼투 파괴성을 측정하였다. 30분간 배양하고 원심분리후 Drabkin 용액으로 유리 헤모글로빈을 측정하고 증류수에 희석하여 유리된 것과 비교하였다.
처리되지 않은 대조샘플과 비교하여 44, 88 및 176J/cm 광속량 및 10μM AlPc로 처리한 것은 적혈구 세포의 삼투 쇼크에 대한 저항성을 증가시킨다.
[실시예 6]
처리 적혈구 세포의 저장 안정성을 평가하기 위하여, 실시예 1에서와 같이 176J/cm 의 광속량 및 10μM AlPc로 전혈 3ml를 처리하였다. 17일간 저장후 유리된 헤모글로빈은 총 헤모글로빈의 1.8%이었으며 샘플의 pH는 6.9로서 훌륭한 저장 적합성을 나타낸다.
[실시예 7]
완전한 적혈구 세포 농축물에서 VSV 불활성 연구를 실시하였다. Fenwal 5J359 혈액 주머니에 포함된 적혈구 세포 농축물을 단지 한쪽면에서 투광하였다. 모든 검출된 무세포 VSV(10 TCID이상)의 불활성은 3시간의 처리에 상응하는 264J/cm 광속량 및 10.5μM AlPc로 달성되었다(표 4).
10배 더 민감한 마크로배양 분석은 352 및 396J/cm 에서 VSV(10 TCID이상 사멸)의 존재를 나타내지 않았다.
2% 분쇄이하가 396J/cm 에서도 관찰되었다.
[실시예 8]
프탈로시아닌 처리가 혈소판 기능에 미치는 영향 평가를 실시하였다. 5.36×10 혈소판/mL 및 60mg/ml의 혈장 단백질 농도를 함유하는 혈소판 농축물에 디메틸포름아미드의 아연 프탈로시아닌을 첨가하였다.
ZnPc의 최종농도는 20μM이었다. 지시된 시간에, 혈소판 숫자를 측정하고 혈소판 형태를 평균 부피 측정으로 평가하였고 아데노신 디포스페이트(ADP) 첨가후의 혈소판의 응집능력을 평가하였다(표 5).
총 처리 시간동안, 혈소판 수를 86-91% 정도로 유지하였다.
혈소판의 평균부피는 영향을 받지않았다.
응집정도 또는 초기 응집 속도의 관점에서 표현하여, ADP에 반응한 응집은 광조사후 15 및 30분 동안 다소 감소하더라도, 10분 동안의 광조사동안 DMF 대조만을 비교하여 변화하지 않았다.
사람의 적혈구 세포를 인산염 완충 식염수로 2회 세척하여 혈장을 제거한 후 지시된 농도로 희석하였다. 각가에 알루미늄 프탈로시아닌 테트라술포네이트(10μM)를 첨가하고 샘플을 상기와 같이 88J/cm 으로 조사하였다. 조사후, 유리된 헤모글로빈의 양으로 분쇄정도를 측정하였다.
표 6에서 보듯이, 4.5×10 세포/ml의 적혈구 세포농도로 100% 분쇄가 관찰되었다.
세포농도가 2.25×10 세포/ml 또는 그 이상까지 증가시킬 때 갑자기 개선되었다.
[실시예 10]
[헤마토포르피린 유도체와 알루미늄 프탈로시아닌의 바이러스 사멸 비교]
소수포성 구내염 바이러스(VSV)를 전혈에 첨가하고 알루미늄 프탈로시아닌 술포네이트 또는 630nm 이하에서 최대흡수를 가지는 염료, 헤마토포르피린 유도체(HPD)를 첨가하였다.
상기와 같이 각각에 광선을 조사시켰다.
그 결과(하기 표 7)은 바이러스 사멸은 HPD보다 AlPcS로 더 완전하고 더 빠르다는 사실을 제시한다.
* 추정 MW 1106.
[실시예 11]
퀸처 시약의 존재하에 알루미늄 프탈로시아닌 유도체로 처리된 자지(自知)의 토끼 적혈구 세포의 순환반감기 혈장에 현탁된 1×10 RBC/ml를 함유하는 토끼의 적혈구 세포 농축물(RBCC)를 알루미늄 프탈로시아닌 테트라술포네이트(AlPcS)로 혼합하고 배양하고 팍칭제제를 첨가하였다.
그 다음 혼합물을 25mW/cm 가시광선으로 30분간 조사하였다.
그후 처리된 RBCC를 윈심분리로 세척하고 Cr로 표식하고 원래의 토끼에 정맥내 투여하였다. 그 결과로부터 첨가된 팍칭제제의 존재하에 처리된 RBC는 생체내 생존에서 정상적인 순환을 가지는 반면 첨가된 팍칭제제없이 처리된 RBC는 짧은 생체내 순환 생존을 가진다는 사실을 알 수 있다(표 8).
알루미늄 프탈로시아닌 유도체 및 팍칭제제를 첨가하여 소수포성 구내염 바이러스를 함유하는 RBCC 샘플을 분리하고 비슷한 조사조건에 노출시켰다. 바이러스의 불활성은 퀸처의 첨가에 영향을 받지 않는다(표 8).
[실시예 12]
[첨가되는 퀸처제제의 존재와 무관하게 소랄렌으로 처리된 혈소판의 응집반응]
혈소판 농축물에 미치는 박테리아 박멸 및 기능의 영향을 팍칭제제, 환원 글루타티온(GSH)의 유·무하에서 26μg/ml의 4'-아미노메틸-4, 5', 8-트리메틸소랄렌(AMT) 첨가후 평가하였다.
산소의 존재하에 샘플을 20-30분동안 UVA 광선 6.5mW/cm 으로 혼란시켰다.
콜라겐과 반응하여 혈소판 응집정도 및 속도를 처리후 24시간에 측정하였고 GSH(표 9)의 존재하에서 개선하였다.
이것은 완전한 바이러스 사멸을 달성하는데 필요한 조건, UVA 노출, 30분으로 특히 분명하였다.
[실시예 13]
[퀸처첨가와 함께 AMT 및 UVA로 혈장 처리에서 응집인자의 개선된 회수 과정]
25μg/ml AMT로 사람혈장을 처리하고 20분간 UVA 광선 6.5mW/cm 에 노출하였다.
응고인자의 회수 과정 및 바이러스 사멸 측정을 글루타티온 첨가 유·무 하에서 처리후 비교하였다.
환원된 글루타티온(GSH)의 무 또는 1mM 및 4mM GSH의 존재하에서, 바이러스 사멸의 정도는 5.1, 5.3 및 5.3log이었다.
GSH의 무하에서 AHF 회수가 단지 77%인 반면 4mM GSH의 존재하에서는 회수가 실질적으로 100%로 증가하였다.
[실시예 14]
[바이러스를 불활성하기 위해 AMT로 처리된 혈장응고인자의 회수증진; 퀸처의 사용에 대한 산소함량의 감소]
질소가스 교환을 통한 감소된 산소농도하의 처리에 대하여 뭬처로서 첨가된 1nN 글루타티온 유·무하에서 정상 공기조건하의 AMT 25μg/ml로 사람 혈장을 처리하였다.
정상적으로 통기한 샘플을 20분간 UVA 광선으로 조사하는 반면 탈산소된 샘플은 120분간 조사하여 대략 동일한 바이러스 사멸을 얻었다.
데이타로 부터, 퀸처의 무하에서 정상적으로 통기된 혈장의 처리와 비교하여 (1) 1mM 글루타티온의 첨가는 상당한 바이러스 사멸이 없이 AHF 회수를 증가시킨다. (2) 바이러스 사멸의 높은 수준 및 응고인자회수의 높은 회수는 처리기간이 연장된다면 산소함량의 감소에 의하여 성취될 수 있다. (3) 퀸처의 사용은 가스교환을 실시할 필요성을 제거하고 높은 바이러스 박멸 수준에 요구되는 처리기간을 감소시킨다.
[실시예 15]
[소랄렌 유도체로 처리된 혈소판에서 증가된 바이러스 사멸; 탈산소에 대한 퀸처첨가의 효과]
표준혈액뱅크 혈소판 농축물을 25μg/ml의 AMT 및 UVA(6.5mW/CM ) 노출로 처리하였다. 처리전에, 질소를 사용하여 용액위의 가스를 대체함으로써 지시된 대로 정상적으로 통기된 혈소판의 산소를 질소로 교환하고 1분간 평형상태를 유지하고 3회 과정을 반복하였다.
한편, 퀸처 글루타티온 1mM를 처리전에 첨가하였다.
바이러스 마아크로 작용하는 샘플에 첨가된 소수포성구내염 바이러스의 불황성화 속도를 UVA 조사동안에 평가하였다.
혈소판의 응집반응을 콜라겐의 존재하에서 처리후 24시간에 평가하였다. 그 결과는 바이러스 사멸이 통기되지 않은 샘플보다 퀸처를 함유하는 정상적으로 통기된 샘플에서 더 빠르게 일어난다는 것을 나타낸다(표 12).
각 경우에서 24시간에 측정될 때 훌륭한 혈소판 기능적 회복을 성취하였다. 따라서 퀸처의 사용은 바이러스 사멸 또는 혈소판 기능성의 소실없이 가스 교환의 힘들고 시간을 많이 요하는 단계르 피하게 한다.
실시예는 예시의 수단으로 제시된 것이며 한정적인 의미로 사용된 것이 아니다. 본 발명의 사상 및 범위를 벗어나지 않고 다양한 변형 또는 변화가 있을 수 있는 것으로 이해되어야 한다.

Claims (31)

  1. 혈구조성물내에 포함된 최소한 하나의 유형의 혈구의 80% 이상의 완전한 구조를 유지하면서, 혈구조성물내에 존재할 수 있는 세포의 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화 시키는 방법에 있어서, 상기 조성물을, 최소한 하나의 프탈로시아닌의 바이러스 박멸 유효량 및 광과 접촉시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  2. 제1항에 있어서, 상기 혈구조성물은 적혈구, 혈소판 및 전혈로 구성되는 군으로부터 선택되는 최소한 하나의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  3. 제2항에 있어서, 적혈구 및/또는 혈소판이 농축된 것을 특징으로 하는 방법.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈구의 유형은 적혈구이고, 상기 적혈구의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 산화제로 처리한 후 방출되는 헤모글로빈의 양을 평가함으로써 확인되고, 헤모글로빈의 20%이하의 방출은, 상기 프탈로시아닌 및 광으로 처리한 후 상기 적혈구의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  5. 제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서, 혈구의 유형은 혈소판이고, 상기 혈소판의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 산화제로 처리한 후 남아있는 혈소판의 수를 계수함에 의하여 확인되고, 상기 혈소판의 80% 이상의 유지는, 상기 프탈로시아닌 및 광으로 처리한 후 상기 혈소판의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 특징으로 하는 방법.
  6. 제1항에 있어서, 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는, 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 인간 면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  7. 제6항에 있어서, 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는 인간면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 수혈이 필요한 수혈자에게 수혈하는데 적합한 혈구조성물을 제조하는 방법에 있어, 제1항의 방법에 따라서 상기 조성물 내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 혈구조성물 내에 포함된 최소한 하나의 유형의 혈구의 80% 이상의 완전한 구조를 유지하면서, 혈구조성물내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 방법에 있어서, 상기 조성물을 최대흡수 ≥630nm를 가지는 최소한 하나의 광반응 화합물의 바이러스 박멸 유효량, 광 및 퀸처(quencher)와 접촉시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  10. 제9항에 있어서, 상기 혈구조성물은 적혈구, 혈소판 및 전혈로 구성되는 군으로 부터 선택되는 최소한 하나의 성분을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  11. 제10항에 있어서, 적혈구 및/또는 혈소판이 농축된 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제9항, 제10항 또는 제11항에 있어서, 혈구의 유형은 적혈구이고, 상기 적혈구의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 퀸처로 처리한 후 방출되는 헤모글로빈의 양을 평가함으로써 확인되고, 헤모글로빈의 20% 이하의 방출은, 상기 광반응 화합물, 광 및 퀸처로 처리한 후 상기 적혈구의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  13. 제9항 제10항 또는 제11항에 있어서, 혈구의 유형은 혈소판이고, 상기 혈소판의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 퀸처로 처리한 후 남아있는 혈소판의 수를 계수함으로써 확인되고, 상기 혈소판의 80% 이상의 유지는 상기 광반응 화합물, 광 및 퀸처는 처리한 후 상기 혈소판의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 지시하는 것을 특징으로하는 방법.
  14. 제9항에 있어서, 상기 방법 중에, 산소가 존재하는 것을 특징으로 하는 방법.
  15. 제9항에 있어서, 광은 630nm 내지 700nm의 파장의 가시광선인 것을 특징으로 하는 방법.
  16. 제15항에 있어서, 광반응 화합물은 프탈로시아닌인 것을 특징으로 하는 방법.
  17. 제9항에 있어서,세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 인간면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  18. 제17항에 있어서, 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는 인간면역결핍 바이스러(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  19. 수형이 필요한 수혈자에게 수혈하는데 적합한 혈구조성물을 제조하는 방법에 있어서, 제9항의 방법에 따라서 상기 조성물 내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  20. 응고인자의 최소한 77%를 유지하면서 최소한 하나의 응고인자를 함유하는 조성물내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 방법에 있어서, 상기 조성물을, 최대흡수 ≥630nm를 가지는 최소한 하나의 바이러스 박멸 유효량, 광 및 퀸처와 접촉시키는 것으로 이루어지는 것을 특징으로 하는 방법.
  21. 제20항에 있어서, 광반응 화합물은 소랄렌이고, 광은 UVA인 것을 특징으로 하는 방법.
  22. 제20항에 있어서, 광반응 화합물은 프탈로시아닌이고, 광은 630nm 내지 700nm의 파장의 가시광선인 것을 특징으로 하는 방법.
  23. 제20항, 제21항 또는 제22항에 있어서, 상기 조성물이 인간혈장인 것을 특징으로 하는 방법.
  24. 제20항에 있어서, 상기 응고인자는, 인자 Ⅷ인 것을 특징으로 하는 방법.
  25. 제20항에 있어서, 세포외 지지피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는 수포성 구내염 바이러스(VSV) 또는 인간면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  26. 제25항에 있어서, 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스는 인간면역결핍 바이러스(HIV)인 것을 특징으로 하는 방법.
  27. 수혈이 필요한 수혈자에게 수혈하는데 적합한 최소한 하나의 응고인자를 함유하는 조성물의 제조방법에 있어서, 제20항의 방법에 따라서 상기 조성물내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 및/또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  28. 혈구-함유 조성물내에 존재할 수 있는 세포외 지질피막 병원성 바이러스 또는 세포내 병원성 바이러스를 불활성화시키는 방법에 있어서, 혈구함유 조성물을, 프탈로시아닌의 바이러스 박멸 유효량 및 광과 접촉시키는 것을 포함하는 것을 특징으로 하는 방법.
  29. 제1항에 있어서, 상기 혈구조성물은 최소한 ≥1×109세포/ml를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
  30. 제29항에 있어서, 혈구의 유형은 적혈구이고, 상기 적혈구의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 산화제로 처리한 후 방출되는 헤모글로빈의 양을 평가함으로써 확인되고, 헤모글로빈의 20% 이하의 방출은, 상기 프탈로시아닌 및 광으로 처리한 후 상기 적혈구의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
  31. 제29항에 있어서, 혈구의 유형은 혈소판이고, 상기 혈소판의 완전한 구조는 상기 조성물을 상기 광반응 화합물, 광 및 산화제로 처리한 후 남아있는 혈소판의 수를 계수함에 의하여 확인되고, 상기 혈소판의 80% 이상의 유지는, 상기 프탈로시아닌 및 광으로 처리한 후 상기 혈소판의 80% 이상의 완전한 구조가 유지되었다는 것을 지시하는 것을 특징으로 하는 방법.
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