NL1006219C2

NL1006219C2 - Werkwijze voor het met licht inactiveren van virussen in een cellenbevattende vloeistof.

Info

Publication number: NL1006219C2
Application number: NL1006219A
Authority: NL
Inventors: Thomas Marinus Alber Dubbelman; Johnny Van Steveninck
Original assignee: Univ Leiden
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 1998-12-07
Also published as: WO1998055156A1

Description

Werkwijze voor het met licht inactiveren van virussen in een cellenbevattende vloeistof

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het behandelen van een cellenbevattende vloeistof teneinde een daarin aanwezig virus in aanwezigheid van opgeloste moleculaire zuurstof te inactiveren, welke werkwij-5 ze omvat: i) het in de cellenbevattende vloeistof brengen van een sensitizer; en ii) de sensitizerhoudende vloeistof vervolgens gedurende een gekozen tijdspanne blootstellen aan licht met een 10 gekozen intensiteit en met een door de sensitizer geabsorbeerde golflengte, onder oplevering van een hoeveelheid reac-tieve zuurstof, welke hoeveelheid toereikend is voor het in hoofdzaak inactiveren van virussen terwijl de cellen in hoofdzaak gespaard blijven.

15 Een dergelijke werkwijze is bekend uit het Ameri kaanse octrooischrift 5.120.649. Volgens de uit deze publika-tie bekende werkwijze wordt fotodynamische inactivatie toegepast voor het inactiveren van een virus in een bloedcellenbe-vattende vloeistof. Een fotoreactieve verbinding, bij voor-20 keur een phthalocyanine, wordt in contact gebracht met een cellenbevattende vloeistof zoals totaal bloed. Voor het vernietigen van een virus is een hoeveelheid reactieve zuurstof, in het bijzonder singlet zuurstof, vereist. Deze hoeveelheid, door de sensitizer gevormde reactieve zuurstof is 25 afhankelijk van de lichtintensiteit van het licht waaraan de vloeistof wordt blootgesteld en de blootstellingsduur. Uit de voorbeelden blijkt dat gedurende 10 minuten tot 3 uur wordt belicht met een totale lichtenergie tot 10 tot 1000 J/cm2. Ten aanzien van bekende sensitizers wordt opgemerkt dat deze in 30 het algemeen weinig specifiek zijn en zowel aan virussen als aan cellen binden.

De onderhavige uitvinding beoogt de bekende werkwij-ze te verbeteren, en in het bijzonder de verhouding tussen aan de cellen aangerichte schade tot virusinactivatie te 35 beperken.

1006219 2

Daartoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat de vloeistof wordt blootgesteld aan licht met een gekozen grote intensiteit en gedurende een gekozen korte periode zodat een celomgeving ontstaat met een concen-5 tratie reactieve zuurstof die verlaagd is in vergelijking met de concentratie reactieve zuurstof rond het virus.

Verrassenderwijze is gevonden dat door het blootstellen aan licht met hoge intensiteit en gedurende korte tijd virussen met dezelfde effectiviteit kunnen worden ge-10 inactiveerd terwijl minder schade optreedt aan de cellen. Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn, wordt gedacht dat een diffusielimitatie van opgeloste moleculaire zuurstof hierbij een rol speelt. Gemeend wordt dat bij korte belichting met hoge intensiteit uit de omgeving van de cel 15 minder moleculaire zuurstof kan worden aangevoerd dan uit de omgeving van een virus. Een vakman kan de vereiste korte tijdsduur en vereiste grote intensiteit, waarbij de concentratie reactieve zuurstof in de celomgeving wordt verlaagd in vergelijking met de concentratie reactieve zuurstof rond het 20 virus, eenvoudig vaststellen. Hiertoe wordt de totale hoeveelheid lichtenergie gebruikt voor het inactiveren van virus constant gehouden en de tijdsduur gevarieerd, en vast te stellen wanneer de schade aan de cellen bij kortere belichting vermindert, terwijl de inactivatie van het virus gelijk 25 blijft. Bij voorkeur is de daling van de concentratie reactieve zuurstof ten minste 50%, bij voorkeur ten minste 90%.

De lengte van de korte tijdsduur en de grootte van de intensiteit hangt af van factoren zoals de concentratie sensitizer, de effectiviteit waarmee deze in staat is reac-30 tieve zuurstof te genereren en de concentratie moleculaire zuurstof.

In een kenmerkend geval zal de korte periode kleiner zijn dan 1 seconde, in het bijzonder kleiner dan 0,2 seconden en meer in het bijzonder kleiner dan 0,04 seconde. De grote 35 intensiteit zal kenmerkend groter zijn dan 20 kW/m2, in het bijzonder groter dan 100 kW/m2 en meer in het bijzonder groter dan 550 kW/m2.

Bij voorkeur wordt de concentratie opgeloste moleculaire zuurstof in de cellenbevattende, sensitizerhoudende 1006219 3 vloeistof gecontroleerd.

Onder de term gecontroleerd wordt in de onderhavige aanvrage verstaan dat deze concentratie wordt gemeten en/of ingesteld.

5 In het bijzonder wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding de concentratie opgeloste zuurstof verlaagd, bijvoorbeeld door het doorleiden van een zuurstofarm stikstof-zuurstofgasmengsel.

In het bijzonder wordt de concentratie opgeloste 10 moleculaire zuurstof verlaagd tot minder dan 25%, bij voorkeur minder dan 10% en met de meeste voorkeur minder dan 3%.

Volgens een eenvoudige uitvoeringsvorm wordt de concentratie opgeloste zuurstof verlaagd door het aan de vloeistof toevoegen van een foto-oxideerbare verbinding.

15 Een dergelijke foto-oxideerbare verbinding is bij voorkeur een verbinding die selectief aan de tegen schade te beschermen cellen bindt. Voor het inactiveren van niet-mem-braanvirussen kan de foto-oxideerbare verbinding bijvoorbeeld een aan de membranen van cellen bindende verbinding zijn.

20 Een belangrijke toepassing van de onderhavige uit vinding betreft het behandelen van een erytrocytenbevattende vloeistof. Deze erytrocytenbevattende vloeistof wordt bij voorkeur bij verlaagde temperatuur behandeld, in het bijzonder bij een temperatuur tussen 4-10°C.

25 Bij verlaagde temperatuur wordt zuurstof beter door in de erytrocyten aanwezige haemoglobine vastgehouden, en wordt de schade aan de erytrocyten beperkt.

Een andere belangrijke toepassing betreft het behandelen van een stamcellenbevattende vloeistof.

30 Het behandelen van erytrocytenbevattende vloeistof en stamcellenbevattende vloeistof is belangrijk voor transplantatiedoeleinden, waarbij het belangrijk is dat de recipiënt niet door virussen van de donor wordt besmet.

De uitvinding zal thans worden toegelicht aan de 35 hand van voorbeelden en een tekening, waarin de enige figuur een grafiek is van de inactivatie van Vesiculair Stomatitus Virus (VSV) en gist als functie van de belichtingsintensi-teit.

1006219 4

Voorbeeld I

Effect van tijdsduur en intensiteit op de inactivatie van gistcellen en virus

PROEFOPZET

5 a) Bereiding van Vesiculair Stomatitis Virus (VSV) VSV wordt op opzichzelf bekende wijze gekweekt op baby hamster kidney (BHK) cellen en bij -80°C als een voorraadoplos-sing bewaard. Op basis van de voorraadoplossing wordt een virusbevattende oplossing van 104·5 infectieve deeltjes per ml 10 fosfaatbuffer (PBS) gemaakt. De suspensie wordt gedurende 20 min. in het donker geïncubeerd met 0,02 /xg/ml dodecyl acridine orange (DAO) en vervolgens in een injectiespuit gebracht. Deze injectiespuit wordt in een perfusor-pomp gebracht, welke op verschillende pompsnelheden instelbaar is.

15 b) Bereiding van Kluyveromyces marxianus (CBS 397)

De gist wordt gedurende 16 uur bij 30°C aëroob gekweekt in 2% glucosemedium. Een gistcellenbevattende vloeistof wordt gemaakt door 1.106 gistcellen/ml in Dulbecco's PBS te suspenderen. De gist wordt gedurende 20 min. in het donker geincu-20 beerd met 0,25 μg/ml DAO. Ook deze gistcellenbevattende vloeistof wordt, zoals onder a) beschreven, in een injectiespuit in een perfusor-pomp gebracht.

c) De VSV- of gistbevattende vloeistof wordt door een glazen capillair met een inwendige diameter van 1 mm geleid en met 25 een Argon laser bij 488 nm belicht. De bundeldiameter is 1,5 mm. De lichtintensiteit en de doorstroomsnelheid worden gevarieerd, waarbij de totale hoeveelheid lichtenergie constant wordt gehouden (21,5 kJ/m2) , zoals aangegeven in tabel I.

30

Tabel I

Pompsnelheid Laservermogen Intensiteit Belichtings- Lichtdosis 35 (ml/uur) (W) (kW/m2) tijd (kJ/m2) ____(sec.)__ 94__1__565__0,038__21,5 19__0j_2__113__0,189__21,5 _3J>__0,04__23__0,943__21,5 _0,949__0,01__5_j_€__3,802__21,5 j 0 0 6 2 19 5

Na belichting wordt een gistcel- of virusbevattend monster opgevangen en onderzocht op inactivatie.

d) Inactivatie van VSV

5 Het virusbevattende monster wordt progressief tienvoudig verdund bij de diverse concentraties op A549 cellen gebracht. Na drie dagen incuberen bij 37°C en 5% C02 wordt het cytopa-thologische effect van VSV op de A549 cellen bepaald. De virus-titer werd berekend met de Spearman-Karbermethode, en 10 geeft de hoeveelheid virus weer die 50% van de putjes infecteert. (TCIDS0) .

e) Inactivatie van gist CBS 397

Het gistcellenbevattende monster wordt uitgeplaat op 2% glucose/1% agarplaten, pH 5,2, met 500 cellen per plaat. Het 15 aantal kolonies wordt bepaald na incubatie gedurende twee dagen in het donker bij 30°C. De percentage overleving wordt berekend als 100 maal het aantal gevormde kolonies gedeeld door het aantal uitgeplate gistcellen.

RESULTATEN

20 De resultaten van de inactivatie van VSV en gist door licht zijn weergegeven in de in fig. 1 weergegeven grafiek, waarin de logaritme van de virustiter (links,·) respectievelijk het percentage overleving van gist (rechts,O) zijn uitgezet tegen de intensiteit (I) in kw/m2 (N.B. de dosis, d.w.z. de totale 25 hoeveelheid lichtenergie, is voor alle meetpunten hetzelfde, te weten 21,5 kJ/m2) .

1006219

Claims

1. Werkwijze voor het behandelen van een cellenbe-vattende vloeistof teneinde een daarin aanwezig virus in aanwezigheid van opgeloste moleculaire zuurstof te inactiveren, welke werkwijze omvat: 5 i) het in de cellenbevattende vloeistof brengen van een sensitizer; en ii) de sensitizerhoudende vloeistof vervolgens gedurende een gekozen tijdspanne blootstellen aan licht met een gekozen intensiteit en met een door de sensitizer geabsor-10 beerde golflengte, onder oplevering van een hoeveelheid reac-tieve zuurstof, welke hoeveelheid toereikend is voor het in hoofdzaak inactiveren van virussen terwijl de cellen in hoofdzaak gespaard blijven, met het kenmerk, dat de vloeistof wordt blootgesteld aan 15 licht met een gekozen grote intensiteit en gedurende een gekozen korte periode zodat een celomgeving ontstaat met een concentratie reactieve zuurstof die verlaagd is in vergelijking met de concentratie reactieve zuurstof rond het virus.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, 20 dat de korte periode kleiner is dan 1 seconde.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de korte periode kleiner is dan 0,2 seconde.

4. Werkwijze volgens conclusie 3, met het kenmerk, dat de korte periode kleiner is dan 0,04 seconde.

5. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de grote intensiteit groter is dan 20 kW/m2.

6. Werkwijze volgens conclusie 5, met het kenmerk, dat de grote intensiteit groter is dan 100 kW/m2.

7. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat de concentratie opgeloste moleculaire zuurstof in de cellenbevattende, sensitizerhoudende vloeistof wordt gecontroleerd.

8. Werkwijze volgens conclusie 7, met het kenmerk, 35 dat de concentratie opgeloste zuurstof wordt verlaagd.

9. Werkwijze volgens conclusie 8, met het kenmerk, 1006219 dat de concentratie opgeloste zuurstof wordt verlaagd tot minder dan 25%, bij voorkeur minder dan 10% en met de meeste voorkeur minder dan 3%.

10. Werkwijze volgens conclusie 8 of 9, met het 5 kenmerk, dat de concentratie opgeloste zuurstof wordt verlaagd door het aan de vloeistof toevoegen van een foto-oxideerbare verbinding.

11. Werkwijze volgens één der voorgaande conclusies, met het kenmerk, dat een erytrocytenbevattende vloeistof 10 wordt behandeld.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat de erytrocytenbevattende vloeistof bij verlaagde temperatuur wordt behandeld.

13. Werkwijze volgens conclusie 12, met het kenmerk, 15 dat de erytrocytenbevattende vloeistof bij een temperatuur tussen 4-10°C wordt behandeld.

14. Werkwijze volgens één van de conclusies 1 tot 10, met het kenmerk, dat een stamcellenbevattende vloeistof wordt behandeld. 20 1006219