NL1006219C2

NL1006219C2 - Method for lightly inactivating viruses in a cell-containing liquid.

Info

Publication number: NL1006219C2
Application number: NL1006219A
Authority: NL
Inventors: Thomas Marinus Alber Dubbelman; Johnny Van Steveninck
Original assignee: Univ Leiden
Priority date: 1997-06-04
Filing date: 1997-06-04
Publication date: 1998-12-07
Also published as: WO1998055156A1

Description

Werkwijze voor het met licht inactiveren van virussen in een cellenbevattende vloeistofMethod for lightly inactivating viruses in a cell-containing liquid

De onderhavige uitvinding heeft betrekking op een werkwijze voor het behandelen van een cellenbevattende vloeistof teneinde een daarin aanwezig virus in aanwezigheid van opgeloste moleculaire zuurstof te inactiveren, welke werkwij-5 ze omvat: i) het in de cellenbevattende vloeistof brengen van een sensitizer; en ii) de sensitizerhoudende vloeistof vervolgens gedurende een gekozen tijdspanne blootstellen aan licht met een 10 gekozen intensiteit en met een door de sensitizer geabsorbeerde golflengte, onder oplevering van een hoeveelheid reac-tieve zuurstof, welke hoeveelheid toereikend is voor het in hoofdzaak inactiveren van virussen terwijl de cellen in hoofdzaak gespaard blijven.The present invention relates to a method of treating a cell-containing fluid to inactivate a virus contained therein in the presence of dissolved molecular oxygen, the method comprising: i) introducing a sensitizer into the cell-containing fluid; and ii) subsequently exposing the sensitizer-containing liquid to light of a selected intensity and of a wavelength absorbed by the sensitizer for a selected period of time, yielding an amount of reactive oxygen sufficient to inactivate viruses while the cells are essentially spared.

15 Een dergelijke werkwijze is bekend uit het Ameri kaanse octrooischrift 5.120.649. Volgens de uit deze publika-tie bekende werkwijze wordt fotodynamische inactivatie toegepast voor het inactiveren van een virus in een bloedcellenbe-vattende vloeistof. Een fotoreactieve verbinding, bij voor-20 keur een phthalocyanine, wordt in contact gebracht met een cellenbevattende vloeistof zoals totaal bloed. Voor het vernietigen van een virus is een hoeveelheid reactieve zuurstof, in het bijzonder singlet zuurstof, vereist. Deze hoeveelheid, door de sensitizer gevormde reactieve zuurstof is 25 afhankelijk van de lichtintensiteit van het licht waaraan de vloeistof wordt blootgesteld en de blootstellingsduur. Uit de voorbeelden blijkt dat gedurende 10 minuten tot 3 uur wordt belicht met een totale lichtenergie tot 10 tot 1000 J/cm2. Ten aanzien van bekende sensitizers wordt opgemerkt dat deze in 30 het algemeen weinig specifiek zijn en zowel aan virussen als aan cellen binden.Such a method is known from US patent 5,120,649. According to the method known from this publication, photodynamic inactivation is used to inactivate a virus in a blood cell containing liquid. A photoreactive compound, preferably a phthalocyanine, is contacted with a cell-containing fluid such as whole blood. Destruction of a virus requires an amount of reactive oxygen, especially singlet oxygen. This amount of reactive oxygen generated by the sensitizer is dependent on the light intensity of the light to which the liquid is exposed and the duration of exposure. The examples show that the exposure is from 10 minutes to 3 hours with a total light energy of up to 10 to 1000 J / cm2. With regard to known sensitizers, it is noted that they are generally not very specific and bind to both viruses and cells.

De onderhavige uitvinding beoogt de bekende werkwij-ze te verbeteren, en in het bijzonder de verhouding tussen aan de cellen aangerichte schade tot virusinactivatie te 35 beperken.The present invention aims to improve the known method, and in particular to limit the ratio of damage caused to the cells to virus inactivation.

1006219 21006219 2

Daartoe wordt de werkwijze volgens de uitvinding gekenmerkt doordat de vloeistof wordt blootgesteld aan licht met een gekozen grote intensiteit en gedurende een gekozen korte periode zodat een celomgeving ontstaat met een concen-5 tratie reactieve zuurstof die verlaagd is in vergelijking met de concentratie reactieve zuurstof rond het virus.To this end, the method according to the invention is characterized in that the liquid is exposed to light of a selected high intensity and for a selected short period, so that a cell environment is created with a concentration of reactive oxygen that is lowered compared to the concentration of reactive oxygen around the virus.

Verrassenderwijze is gevonden dat door het blootstellen aan licht met hoge intensiteit en gedurende korte tijd virussen met dezelfde effectiviteit kunnen worden ge-10 inactiveerd terwijl minder schade optreedt aan de cellen. Zonder aan enige theorie gebonden te willen zijn, wordt gedacht dat een diffusielimitatie van opgeloste moleculaire zuurstof hierbij een rol speelt. Gemeend wordt dat bij korte belichting met hoge intensiteit uit de omgeving van de cel 15 minder moleculaire zuurstof kan worden aangevoerd dan uit de omgeving van een virus. Een vakman kan de vereiste korte tijdsduur en vereiste grote intensiteit, waarbij de concentratie reactieve zuurstof in de celomgeving wordt verlaagd in vergelijking met de concentratie reactieve zuurstof rond het 20 virus, eenvoudig vaststellen. Hiertoe wordt de totale hoeveelheid lichtenergie gebruikt voor het inactiveren van virus constant gehouden en de tijdsduur gevarieerd, en vast te stellen wanneer de schade aan de cellen bij kortere belichting vermindert, terwijl de inactivatie van het virus gelijk 25 blijft. Bij voorkeur is de daling van de concentratie reactieve zuurstof ten minste 50%, bij voorkeur ten minste 90%.Surprisingly, it has been found that exposure to high-intensity light and short-time viruses can be inactivated with the same effectiveness while causing less damage to the cells. Without wishing to be bound by any theory, it is thought that a diffusion limitation of dissolved molecular oxygen plays a role in this. It is believed that, under high intensity short exposure, less molecular oxygen can be supplied from the environment of the cell than from the environment of a virus. One skilled in the art can easily determine the required short period of time and required high intensity, whereby the concentration of reactive oxygen in the cell environment is decreased as compared to the concentration of reactive oxygen around the virus. To this end, the total amount of light energy used to inactivate virus is kept constant and the duration varied, and to determine when the damage to the cells decreases with shorter exposure, while the inactivation of the virus remains the same. Preferably, the drop in reactive oxygen concentration is at least 50%, preferably at least 90%.

De lengte van de korte tijdsduur en de grootte van de intensiteit hangt af van factoren zoals de concentratie sensitizer, de effectiviteit waarmee deze in staat is reac-30 tieve zuurstof te genereren en de concentratie moleculaire zuurstof.The length of the short duration and the magnitude of the intensity depend on factors such as the concentration of sensitizer, the effectiveness with which it is able to generate reactive oxygen and the concentration of molecular oxygen.

In een kenmerkend geval zal de korte periode kleiner zijn dan 1 seconde, in het bijzonder kleiner dan 0,2 seconden en meer in het bijzonder kleiner dan 0,04 seconde. De grote 35 intensiteit zal kenmerkend groter zijn dan 20 kW/m2, in het bijzonder groter dan 100 kW/m2 en meer in het bijzonder groter dan 550 kW/m2.Typically, the short period will be less than 1 second, especially less than 0.2 seconds, and more particularly less than 0.04 seconds. The high intensity will typically be greater than 20 kW / m2, especially greater than 100 kW / m2, and more particularly greater than 550 kW / m2.

Bij voorkeur wordt de concentratie opgeloste moleculaire zuurstof in de cellenbevattende, sensitizerhoudende 1006219 3 vloeistof gecontroleerd.Preferably, the concentration of dissolved molecular oxygen in the cell-containing sensitizer-containing 1006219 3 liquid is monitored.

Onder de term gecontroleerd wordt in de onderhavige aanvrage verstaan dat deze concentratie wordt gemeten en/of ingesteld.In the present application, the term controlled means that this concentration is measured and / or adjusted.

5 In het bijzonder wordt bij de werkwijze volgens de uitvinding de concentratie opgeloste zuurstof verlaagd, bijvoorbeeld door het doorleiden van een zuurstofarm stikstof-zuurstofgasmengsel.In particular, in the method according to the invention, the concentration of dissolved oxygen is lowered, for example by passing an oxygen-depleted nitrogen-oxygen gas mixture.

In het bijzonder wordt de concentratie opgeloste 10 moleculaire zuurstof verlaagd tot minder dan 25%, bij voorkeur minder dan 10% en met de meeste voorkeur minder dan 3%.In particular, the concentration of dissolved molecular oxygen is lowered to less than 25%, preferably less than 10%, and most preferably less than 3%.

Volgens een eenvoudige uitvoeringsvorm wordt de concentratie opgeloste zuurstof verlaagd door het aan de vloeistof toevoegen van een foto-oxideerbare verbinding.In a simple embodiment, the dissolved oxygen concentration is lowered by adding a photo-oxidizable compound to the liquid.

15 Een dergelijke foto-oxideerbare verbinding is bij voorkeur een verbinding die selectief aan de tegen schade te beschermen cellen bindt. Voor het inactiveren van niet-mem-braanvirussen kan de foto-oxideerbare verbinding bijvoorbeeld een aan de membranen van cellen bindende verbinding zijn.Such a photo-oxidizable compound is preferably a compound that selectively binds to the cells to be protected from damage. For example, to inactivate non-membrane viruses, the photo-oxidizable compound can be a compound that binds to the membranes of cells.

20 Een belangrijke toepassing van de onderhavige uit vinding betreft het behandelen van een erytrocytenbevattende vloeistof. Deze erytrocytenbevattende vloeistof wordt bij voorkeur bij verlaagde temperatuur behandeld, in het bijzonder bij een temperatuur tussen 4-10°C.An important application of the present invention concerns the treatment of an erythrocyte-containing liquid. This erythrocyte-containing liquid is preferably treated at a reduced temperature, in particular at a temperature between 4-10 ° C.

25 Bij verlaagde temperatuur wordt zuurstof beter door in de erytrocyten aanwezige haemoglobine vastgehouden, en wordt de schade aan de erytrocyten beperkt.At a reduced temperature, oxygen is better retained by hemoglobin present in the erythrocytes, and damage to the erythrocytes is limited.

Een andere belangrijke toepassing betreft het behandelen van een stamcellenbevattende vloeistof.Another important application concerns the treatment of a stem cell-containing fluid.

30 Het behandelen van erytrocytenbevattende vloeistof en stamcellenbevattende vloeistof is belangrijk voor transplantatiedoeleinden, waarbij het belangrijk is dat de recipiënt niet door virussen van de donor wordt besmet.Treatment of erythrocyte-containing liquid and stem-cell-containing liquid is important for transplantation purposes, it being important that the recipient is not contaminated by viruses from the donor.

De uitvinding zal thans worden toegelicht aan de 35 hand van voorbeelden en een tekening, waarin de enige figuur een grafiek is van de inactivatie van Vesiculair Stomatitus Virus (VSV) en gist als functie van de belichtingsintensi-teit.The invention will now be elucidated with reference to examples and a drawing, in which the only figure is a graph of the inactivation of Vesicular Stomatitus Virus (VSV) and yeast as a function of the exposure intensity.

1006219 41006219 4

Voorbeeld IExample I

Effect van tijdsduur en intensiteit op de inactivatie van gistcellen en virusEffect of duration and intensity on inactivation of yeast cells and virus

PROEFOPZETTRIAL DESIGN

5 a) Bereiding van Vesiculair Stomatitis Virus (VSV) VSV wordt op opzichzelf bekende wijze gekweekt op baby hamster kidney (BHK) cellen en bij -80°C als een voorraadoplos-sing bewaard. Op basis van de voorraadoplossing wordt een virusbevattende oplossing van 104·5 infectieve deeltjes per ml 10 fosfaatbuffer (PBS) gemaakt. De suspensie wordt gedurende 20 min. in het donker geïncubeerd met 0,02 /xg/ml dodecyl acridine orange (DAO) en vervolgens in een injectiespuit gebracht. Deze injectiespuit wordt in een perfusor-pomp gebracht, welke op verschillende pompsnelheden instelbaar is.A) Preparation of Vesicular Stomatitis Virus (VSV) VSV is grown in known manner on baby hamster kidney (BHK) cells and stored at -80 ° C as a stock solution. Based on the stock solution, a virus-containing solution of 104.5 infectious particles per ml of 10 phosphate buffer (PBS) is made. The suspension is incubated with 0.02 µg / ml dodecyl acridine orange (DAO) in the dark for 20 min and then placed in a syringe. This syringe is placed in a perfusor pump, which is adjustable at different pumping speeds.

15 b) Bereiding van Kluyveromyces marxianus (CBS 397)15 b) Preparation of Kluyveromyces marxianus (CBS 397)

De gist wordt gedurende 16 uur bij 30°C aëroob gekweekt in 2% glucosemedium. Een gistcellenbevattende vloeistof wordt gemaakt door 1.106 gistcellen/ml in Dulbecco's PBS te suspenderen. De gist wordt gedurende 20 min. in het donker geincu-20 beerd met 0,25 μg/ml DAO. Ook deze gistcellenbevattende vloeistof wordt, zoals onder a) beschreven, in een injectiespuit in een perfusor-pomp gebracht.The yeast is grown aerobically in 2% glucose medium at 30 ° C for 16 hours. A yeast cell-containing liquid is made by suspending 1,106 yeast cells / ml in Dulbecco's PBS. The yeast is incubated with 0.25 μg / ml DAO for 20 min in the dark. This liquid containing yeast cells, as described under a), is also placed in a syringe in a perfusor pump.

c) De VSV- of gistbevattende vloeistof wordt door een glazen capillair met een inwendige diameter van 1 mm geleid en met 25 een Argon laser bij 488 nm belicht. De bundeldiameter is 1,5 mm. De lichtintensiteit en de doorstroomsnelheid worden gevarieerd, waarbij de totale hoeveelheid lichtenergie constant wordt gehouden (21,5 kJ/m2) , zoals aangegeven in tabel I.c) The VSV or yeast containing liquid is passed through a glass capillary with an internal diameter of 1 mm and exposed with an Argon laser at 488 nm. The beam diameter is 1.5 mm. The light intensity and flow rate are varied, keeping the total amount of light energy constant (21.5 kJ / m2), as indicated in Table I.

3030

Tabel ITable I

Pompsnelheid Laservermogen Intensiteit Belichtings- Lichtdosis 35 (ml/uur) (W) (kW/m2) tijd (kJ/m2) ____(sec.)__ 94__1__565__0,038__21,5 19__0j_2__113__0,189__21,5 _3J>__0,04__23__0,943__21,5 _0,949__0,01__5_j_€__3,802__21,5 j 0 0 6 2 19 5Pump Speed Laser Power Intensity Exposure Light Dose 35 (ml / hr) (W) (kW / m2) Time (kJ / m2) ____ (sec.) __ 94__1__565__0.038__21.5 19__0j_2__113__0.189__21.5 _3J> __ 0.04__23__0.943__21, 5 _0,949__0,01__5_j_ € __3,802__21,5 j 0 0 6 2 19 5

Na belichting wordt een gistcel- of virusbevattend monster opgevangen en onderzocht op inactivatie.After exposure, a yeast cell or virus-containing sample is collected and examined for inactivation.

d) Inactivatie van VSVd) Inactivation of VSV

5 Het virusbevattende monster wordt progressief tienvoudig verdund bij de diverse concentraties op A549 cellen gebracht. Na drie dagen incuberen bij 37°C en 5% C02 wordt het cytopa-thologische effect van VSV op de A549 cellen bepaald. De virus-titer werd berekend met de Spearman-Karbermethode, en 10 geeft de hoeveelheid virus weer die 50% van de putjes infecteert. (TCIDS0) .The virus-containing sample is progressively diluted tenfold at various concentrations on A549 cells. After three days of incubation at 37 ° C and 5% CO2, the cytopathological effect of VSV on the A549 cells is determined. The virus titer was calculated by the Spearman-Karber method, and 10 represents the amount of virus infecting 50% of the wells. (TCIDS0).

e) Inactivatie van gist CBS 397e) Inactivation of yeast CBS 397

Het gistcellenbevattende monster wordt uitgeplaat op 2% glucose/1% agarplaten, pH 5,2, met 500 cellen per plaat. Het 15 aantal kolonies wordt bepaald na incubatie gedurende twee dagen in het donker bij 30°C. De percentage overleving wordt berekend als 100 maal het aantal gevormde kolonies gedeeld door het aantal uitgeplate gistcellen.The yeast cell-containing sample is plated on 2% glucose / 1% agar plates, pH 5.2, with 500 cells per plate. The number of colonies is determined after incubation in the dark at 30 ° C for two days. Percent survival is calculated as 100 times the number of colonies formed divided by the number of plated yeast cells.

RESULTATENRESULTS

20 De resultaten van de inactivatie van VSV en gist door licht zijn weergegeven in de in fig. 1 weergegeven grafiek, waarin de logaritme van de virustiter (links,·) respectievelijk het percentage overleving van gist (rechts,O) zijn uitgezet tegen de intensiteit (I) in kw/m2 (N.B. de dosis, d.w.z. de totale 25 hoeveelheid lichtenergie, is voor alle meetpunten hetzelfde, te weten 21,5 kJ/m2) .The results of the inactivation of VSV and yeast by light are shown in the graph shown in Fig. 1, in which the logarithm of the virus titer (left, ·) and the percentage survival of yeast (right, O) are plotted versus the intensity (I) in kw / m2 (NB the dose, ie the total amount of light energy, is the same for all measuring points, ie 21.5 kJ / m2).

10062191006219

Claims

A method for treating a cell-containing liquid to inactivate a virus contained therein in the presence of dissolved molecular oxygen, the method comprising: i) introducing a sensitizer into the cell-containing liquid; and ii) subsequently exposing the sensitizer-containing liquid to light of a selected intensity and with a wavelength absorbed by the sensitizer for a selected period of time, yielding an amount of reactive oxygen sufficient to inactivate substantially viruses while the cells are essentially spared, characterized in that the liquid is exposed to light of a selected high intensity and for a selected short period of time to create a cell environment with a concentration of reactive oxygen which is reduced compared to the concentration of reactive oxygen around the virus.

2. Method according to claim 1, characterized in that the short period is less than 1 second.

Method according to claim 2, characterized in that the short period is less than 0.2 seconds.

Method according to claim 3, characterized in that the short period is less than 0.04 seconds.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the high intensity is greater than 20 kW / m2.

Method according to claim 5, characterized in that the high intensity is greater than 100 kW / m2.

Method according to any one of the preceding claims, characterized in that the concentration of dissolved molecular oxygen in the cell-containing sensitizer-containing liquid is controlled.

8. A method according to claim 7, characterized in that the concentration of dissolved oxygen is decreased.

The method of claim 8, characterized in 1006219, that the dissolved oxygen concentration is reduced to less than 25%, preferably less than 10%, and most preferably less than 3%.

10. A method according to claim 8 or 9, characterized in that the concentration of dissolved oxygen is lowered by adding a photo-oxidizable compound to the liquid.

11. A method according to any one of the preceding claims, characterized in that an erythrocyte-containing liquid 10 is treated.

Method according to claim 11, characterized in that the erythrocyte-containing liquid is treated at a reduced temperature.

13. Method according to claim 12, characterized in that the erythrocyte-containing liquid is treated at a temperature between 4-10 ° C.

Method according to any one of claims 1 to 10, characterized in that a stem cell-containing liquid is treated. 20 1006219