DE69434445T2

DE69434445T2 - Verfahren zur sterilisation biologischer zusammensetzungen und das dabei erhaltene produkt

Info

Publication number: DE69434445T2
Application number: DE69434445T
Authority: DE
Inventors: Bernard Horowitz; Bolanle Williams; Henrietta Margolis-Nunno; N. Sing CHIN
Original assignee: New York Blood Center Inc
Current assignee: New York Blood Center Inc
Priority date: 1993-05-28
Filing date: 1994-05-27
Publication date: 2006-05-18
Anticipated expiration: 2014-05-28
Also published as: CA2163636C; ZA943754B; FI955690A0; NO954815D0; AU7048594A; ES2247587T3; KR960702864A; FI117288B; ATE301186T1; WO1994028120A1; KR100258377B1; DE69434445D1; CA2163636A1; FI955690A; JPH11503601A; NO954815L; EP0702719A1; EP0702719A4; JP3426237B2; AU696246B2

Description

RECHTE DER REGIERUNG
Diese Arbeit wurde teilweise von dem Fördermittel Nr. HL 41221 vom National Heart, Lung and Blood Institute unterstützt.
Diese Patentanmeldung ist eine Teilfortsetzung der am 15. März 1993 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 08/031 787, die ihrerseits ein Teil der am 29. Mai 1991 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 07/706 919 ist, die nun erteilt worden ist und ihrerseits eine Teilfortsetzung der am 15. Mai 1990 eingereichten US-Patentanmeldung Nr. 07/524 208 ist, die nun das US-Patent Nr. 5 120 649 darstellt.
STAND DER TECHNIK FÜR DIE ERFINDUNG
Gebiet der Erfindung
Die Erfindung betrifft ein Verfahren, um eine biologische Zusammensetzung im Wesentlichen von darin enthaltenen entwickelten und nicht entwickelten Viren ohne wesentliches Aufreißen bzw. Inaktivieren von darin enthaltenen Zellen und ohne deutlichen Verlust an labilen Proteinen oder anderen ebenfalls darin enthaltenen wertvollen biologischen Komponenten freizumachen.
Beschreibung des Standes der Technik
Die Probleme, die mit der Anwendung viruzider Vorgänge auf biologische Zusammensetzungen verknüpft sind, und die bisherigen Anstrengungen, diese Probleme zu lösen, einschließlich der Anwendung von Licht und chemischen Mitteln, sind kurz im US-Patent Nr. 5 120 649 (siehe Spalte 1, Zeile 27, bis Spalte 4, Zeile 41) übersichtsmäßig dargestellt.
Zur Inaktivierung von Viren in zellulären Blutkomponenten sind verschiedene photodynamische Sterilisationsverfahren untersucht worden. Obwohl viele davon als für die Behandlung von roten Blutzellkonzentraten als viel versprechend erschienen (Matthews et al., "Photodynamic therapy of viral contaminants with potential for blood banking applications", in Transfusion, 28, 81-83 (1988), O'Brien et al., "Evaluation of merocyanine 540-sensitized photoirradiation as a means to inactivate enveloped viruses in blood products", in J. Lab. Clin. Med., 116, 439-47 (1990) und Horowitz et al., "Inactivation of viruses in blood with aluminum phthalocyanine derivatives", in Transfusion, 31, 102-8 (1991), haben sich photodynamische Verfahren zur Virusinaktivierung, die ausschließlich sauerstoffabhängige Reaktionen umfassen, bisher als für die Behandlung von Blutplättchenkonzentraten als ungeeignet erwiesen (Proudouz et al., "Inhibition by albumin of merocyanine 540-mediated photosensitization of plateletes and viruses", in Transfusion, 31, 415-22 (1991), Dodd et al., "Inactivation of viruses in platelet suspensions that retain their in vitro characteristics: comparison of psoralen-ultraviolet A and merocyanine 540-visible light methods", in Transfusion, 31, 483-90 (1991) und Horowitz et al., "Inactivation of viruses in red cell and platelet concentrates with aluminum phthalocyanine (AIPc) sulfonates", in Blood Cells, 18, 141-50 (1992)).
Eine der jüngsten Entwicklungen ist die Verwendung photoaktiver Verbindungen. Siehe beispielsweise das US-Patent Nr. 5 120 649 und die US-Patentanmeldung Nr. 07/706 919, eingereicht am 29. Mai 1991. Es hat sich erwiesen, dass Psoralen, zusammen mit UVA, Viren sowohl in Zellen enthaltenden als auch in zellfreien Lösungen ohne eine unerwünschte Schädigung der für die Transfusion erforderlichen wertvollen Komponenten abtötet. Methylenblau, zusammen mit sichtbarem Licht, wird zur Behandlung von Vollplasma verwendet. Phthalocyanine und andere Hämanaloge werden zusammen mit sichtbarem Licht auf eine Behandlung von roten Blutzellkonzentraten und anderen Blutkomponenten untersucht.
Eine Behandlung mit Psoralen und langwelligem ultraviolettem Licht (UVA) ist dafür bekannt, dass sie verschiedene biochemische Effekte, einschließlich sauerstoffunabhängiger Wechselwirkungen mit Nucleinsäuren (beispielsweise Psoralen-DNA-Monoaddukt-Bildung und DNA-Vernetzung) und sauerstoffabhängiger Reaktionen mit photodynamischem Charakter (für eine Übersicht siehe Gasparro, F.P. (Hrsg.) (1988) Psoralen DNA Photobiology, Bd. I, Bd. II, CRC Press, Boca Raton, FL), hervorruft. Im Gegensatz zu den rein photodynamischen Verfahren, die für rote Blutzellen (siehe weiter oben) geeignet sind, hat sich die Verwendung von Psoralenen und UVA als viel versprechend als ein Mittel zur Photoinaktivierung viraler Schadstoffe in Plättchenkonzentraten erwiesen, obwohl in den meisten Studien (Lin et al., "Use of 8-methoxypsoralen und long-wavelength ultraviolet radiation for decontamination of plätelet concentrates", Blood, 74, 517-525 (1989) und Dodd et al., siehe weiter oben, Aminomethyltrimethylpsoralen (AMT)) die Kombination von einem hohen Maß an Virusinaktivierung und der Aufrechterhaltung der Plättchenfunktion nur möglich war, wenn Luft vor der UVA-Bestrahlung gegen Stickstoff ausgetauscht worden war, ein umständlicher Vorgang mit einer ihm eigenen Schwankungsbreite. Es wurde jedoch vor kurzem gezeigt (Margolis-Nunno et al., "Virus Sterilization in Platelet Concentrates with Psoralen and UVA in the Presence of Quenchers", Transfusion, 22, 541-547 (1992)), dass zur Inaktivierung von = 6,0log₁₀ zellfreiem vesikulärem Stomatitisvirus (VSV) durch AMT und UVA die Notwendigkeit einer Sauerstoffverarmung als Mittel zum Schutz der Blutplättchen durch Einbeziehung von Mannit, einem Fänger (Quencher) von freien Radikalen, vermieden werden konnte. (Die Zugabe von Quenchern vom Typ I (freie-Radikale-vermittelt) oder vom Typ II (Singulettsauerstoff-vermittelt) zu photodynamischen Reaktionen wird häufig in anderen Zusammenhängen angewendet, um zu unterscheiden, welche aktive Sauerstoffspezies einen bestimmen photodynamischen Effekt hervorruft.) Unter den in jener Studie eingehaltenen Bedingungen, d.h. 25 μg/ml AMT und 30 Minuten UVA mit 2 mM Mannit, war die Inaktivierung von zellfreiem VSV in Luft teilweise sauerstoffabhängig, da eine äquivalente Virusabtötung (=6,0log₁₀) mit verarmtem Sauerstoff eine drei- bis viermal längere UVA-Bestrahlungszeit (90 Minuten bis zwei Stunden) erforderte.
Obwohl mit diesen Verfahren ein hohes Maß der Abtötung von zellfreien lipidumhüllten Viren und von sich aktiv vermehrenden zellassoziierten Viren erreicht wurde, wurden nicht entwickelte Viren und latente zellassoziierte Viren unter den dort mitgeteilten Bedingungen nicht in einem großen Umfang abgetötet. Deshalb bestand die Notwendigkeit, letztere Virusformen abzutöten, ohne eine deutliche Schädigung der gewünschten wertvollen Komponenten in dem biologischen Gemisch zu verursachen. Es hat sich gezeigt, dass Bedingungen, die zum Abtöten von =10⁶ infektiösen Dosen eines latenten oder nicht entwickelten Virus führen, die roten Blutzellen und Plättchen modifizieren und in einer verschlechterten Gewinnung labiler Proteine wie dem Faktor VIII resultieren.
Eines der erfolgreichsten der zahlreichen Verfahren, die zur Inaktivierung von Viren in biologischen Fluids entwickelt worden sind, ist die Behandlung mit organischen Lösungsmitteln und Tensiden, insbesondere eine Behandlung mit Tri(n-butyl)phosphat (TNBP) und nichtionischen Tensiden wie Tween 80 oder Triton X-100. Siehe beispielsweise US-Patent Nr. 4 540 573. Dieses Verfahren ergibt eine ausgezeichnete Gewinnung labiler Proteine, beispielsweise der Gerinnungsfaktoren VIII und IX, wobei ein hohes Maß der Virusabtötung, beispielsweise das Abtöten von =10⁶ bis =10⁸ ID von entwickelten Viren, jedoch eine nur geringe Inaktivierung nicht entwickelter Viren erreicht wird. Siehe auch US-Patent Nr. 4 481 189, worin die Virusinaktivierung durch eine Behandlung mit einem nichtanionischen Tensid, Alkoholen, Ethern oder Gemischen davon erfolgt.
Weitere Verfahren zur Virusinaktivierung, die üblicherweise auf biologische Fluids angewendet werden, die für eine Transfusion verwendbar sind, umfassen die Behandlung mit Hitze bei Temperaturen von =60°C oder eine Behandlung mit UVC zusammen mit B-Propiolacton (B-PL). Dabei führt jedes dieser Verfahren entweder zu einem signifikanten Verlust an labilen Proteinen und/oder zu einer unvollständigen Virusabtötung. Siehe beispielsweise Horowitz, B., Biotechnology of Blood, "Inactivation of viruses found with plasma proteins", Goldstein, J., Hrsg., Butterworth-Heinemann, Stoneham, 417-432 (1991). Außerdem verzögert sich die Anwendung von B-PL aufgrund von dessen Karzinogenität. Neuere Verfahren, mit welchen beabsichtigt wird, die Sicherheit vor Viren zu erhöhen, befinden sich in Entwicklung. Die Anwendung von Gammastrahlen ist im Labor untersucht worden, wird jedoch bisher noch nicht zur Behandlung eines kommerziell erhältlichen Erzeugnisses angewendet. Siehe Horowitz, B. et al., "Inactivation of viruses in labile blood derivatives 1. Disruption of lipid-enveloped viruses by tri(n-butyl)phosphate/detergent combinations", in Transfusion, 25, 516-521 (1985) und Singer et al., "Preliminary Evaluation of Phthalocyanine Photosensitization For Inactivation Of Viral Pathogens in Blood Products", [abstract] British J. Hematology, 23.-25. März (1988, Abs. 31). Es sind Filter entwickelt worden, von welchen es sich gezeigt hat, dass sie =10⁶ ID₅₀ eines jeden von einigen Viren entfernen, wobei jedoch von kleinen Viren, beispielsweise Parvovirus oder Hepatitis-A-Virus, nicht erwartet wird, dass sie vollständig entfernt werden. Darüber hinaus ist es nicht bekannt, ob sich diese Filter mit der für die Virussicherheit erforderlichen Konsistenz kommerziell herstellen lassen.
In EP 0 457 196 A2 ist ein Verfahren zur Inaktivierung von Viren in biologischen Zusammensetzungen offenbart. Zu diesem Zweck wird vorgeschlagen, einen Quencher mit einer photoreaktiven Substanz zu kombinieren. Dabei lässt jenes Dokument offen, wie die Quencher zu kombinieren sind. In Transfusion, Bd. 32, Nr. 6, 1992, ist der viruzide und funktionelle Effekt der Behandlung von Plättchenkonzentraten mit langwelligem ultraviolettem Licht und einem Psoralenderivat in Gegenwart eines Quenchers beschrieben. Trotz dieser Fortschritte bleibt die Notwendigkeit von neuen Verfahren bestehen, die ein hohes Maß an Abtötung von sowohl entwickelten als auch nicht entwickelten Viren ohne merklichen Verlust an labilen Proteinen oder anderen wertvollen biologischen Komponenten erreichen.
Deshalb liegt der Erfindung die Gesamtaufgabe zugrunde, ein hohes Maß an Inaktivierung an sowohl entwickelten als auch nicht entwickelten Viren in biologischen Zusammensetzungen ohne ein wesentliches Aufreißen oder Inaktivieren von Zellen, von welchen angenommen wird, dass sie darin enthalten sind, und ohne merklichen Verlust an labilen Proteinen oder anderen wertvollen biologischen Komponenten, die ebenfalls darin enthalten sind, zu erreichen.
Diese Aufgabe wird gelöst durch ein Verfahren zum Inaktivieren eines extrazellulären oder intrazellulären gegebenenfalls entwickelten Virus, das in einer biologischen Zusammensetzung vorhanden sein kann, die mindestens eine einer Zellen enthaltenden biologischen Zusammensetzung und einer fluiden biologischen Zusammensetzung umfasst, wobei das Verfahren das Aussetzen der biologischen Zusammensetzung einer viruziden Menge einer I) UV- oder γ-Strahlung oder II) einer UV-, γ-, Röntgen- oder sichtbaren Lichtstrahlung und eines Sensibilisators in Gegenwart von a) einem Gemisch aus mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ I quencht, und mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ II quencht, b) einer Quenchingverbindung, die beide Reaktionstypen I und II quencht, oder c) einem Gemisch aus einer Quenchingverbindung, die sowohl die Reaktion vom Typ 2 als auch die vom Typ II quencht, und einer zusätzlichen Quenchingverbindung umfasst, wobei die Quenchingverbindung, die sowohl eine Reaktion vom Typ I als auch eine vom Typ II quencht, in b) und c) mit einer Konzentration von mindestens 0,2 mM vorhanden ist und die Beibehaltung der intakten Zellfunktionsfähigkeit und Struktur von über 70 % für die Zellen enthaltende Zusammensetzung und die Beibehaltung der biologischen Aktivität von über 75 % für das biologische Fluid erhalten wird.
Somit kann das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden, um Viren in Vollblut, roten Blutzellkonzentraten und Blutplättchenkonzentraten zu inaktivieren, ohne dabei die rote Blutzellen- bzw. Plättchenstruktur oder -funktion zu beeinträchtigen. Auf ähnliche Weise kann das erfindungsgemäße Verfahren angewendet werden, um Viren in biologischen Zusammensetzungen ohne wesentliche Inaktivierung von erwünschten, löslichen biologischen Substanzen (beispielsweise Gerinnungsfaktorkonzentraten und Hämoglobinlösungen), die darin enthalten sind, zu inaktivieren.
Entsprechend einem weiteren erfindungsgemäßen Merkmal wird das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise in Gegenwart einer gegenüber Strahlung sensibilisierenden Verbindung durchgeführt.
Entsprechend einem anderen erfindungsgemäßen Merkmal wird das erfindungsgemäße Verfahren vorteilhafterweise mit einem anderen viruziden Verfahren kombiniert, um die Virusinaktivierung zu verstärken.
Eine alleinige UV-Behandlung von entweder Plasma- oder AHF-Konzentraten führt zu einem relativ hohen Verlust der Gerinnungsfaktoraktivität unter Bedingungen, bei welchen = 10⁵ID₅₀ des Virus abgetötet werden; wobei jedoch festgestellt worden ist, dass dieser Verlust deutlich verringert wird (d.h. die Gewinnung hoch ist), wenn vor der UV-Behandlung Quencher von photodynamischen Reaktionen zugegeben werden. Vergleiche dazu Murray et al., "Effect of ultraviolet radiation on the infectivity of icterogenic plasma", in JAMA, 157, 8-14 (1955) und, jünger, Kallenbach et al., "Inactivation of viruses by ultraviolet light" in Morgenthaler, J.J., Hrsg., "Virus inactivation in plasma products", in Cum stud Hematol Blood Transfus., 56, 70-82 (1989). Somit resultiert die erfindungsgemäße kombinierte Behandlung in einem sehr hohen Grad der Virusabtötung, wobei die Gerinnungsfaktoraktivität in großem Maße erhalten bleibt.
Die γ-Bestrahlung zellulärer Blutkomponenten ist das Mittel der Wahl zur Verhinderung einer mit einer Transfusion einhergehenden (TA) Implantat-gegen-Empfänger-Erkrankung (GVHD), wie es die Bestrahlung von PCs mit UVB für die Verhinderung einer HLA-Alloimmunisierung ist. Jedoch scheint eine gewisse Beeinträchtigung von RBC- (Kaliumaustritt bei Lagerung) und Plättchenintegrität (gesunkene Blutungszeitkorrektur) gegenwärtigen Bestrahlungsvorschriften (Linden, J.V. und Pisciotto, P., "Transfusion associated graft-versus-host disease and blood irradiation", Trans. Med. Rev., 6, 116-123 (1992)) eigen zu sein. Durch die Einbeziehung von Quenchern (beispielsweise Flavonoiden) bzw. Quenchergemischen, die sowohl Produkte von Photoreaktionen vom Typ I als auch Typ II einfangen, bei der γ- oder UVB-Bestrahlung wird eine Schädigung von RBCS und Plättchen unter Bedingungen verhindert, unter welchen WBCs inaktiviert oder sonstwie verändert werden. Neuere Berichte über aktive Sauerstoffspezies als Hauptverursacher von Kaliumaustritt und Beschädigung der roten Blutzellmembran, die bei γ-Bestrahlung auftreten (Anderson und Mintz, 1992, und Sadrzadeh et al., 1992) unterstützen diese Theorie und legen nahe, dass durch die Zugabe dieser Quencher der K⁺-Austritt durch Verbesserung der Nucleinsäurespezifität dieses WBC-Inaktivierungsvorgangs verhindert wird.
Zusätzlich stellt die Bestrahlung mit γ-Strahlung unter der Einbeziehung von Quenchern als Zusatz zu auf die Virushülle gerichteten Virussterilisationsverfahren für RBCCs und PCs die Inaktivierung von latenten Viren oder Proviren in kontaminierenden Lymphocyten sicher.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGEN
1 enthält vier Diagramme, welche die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV und Bakteriophage M13 durch AMT und UVA in Gegenwart von Mannit, Glycerin oder einem Gemisch aus Mannit und Glycerin zeigen. In 1a sind die Ergebnisse für die Plättchenfunktion veranschaulicht. In 1b sind die Ergebnisse der Virusabtötung für die Inaktivierung des zellfreien VSV veranschaulicht. In 1c sind die Ergebnisse der Virusabtötung für das zellassoziierte VSV veranschaulicht. In 1d sind die Ergebnisse der Virusabtötung für den Bakteriophagen M13 veranschaulicht.
2 enthält zwei Diagramme, welche die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV durch AMT und UVA in Gegenwart von α-Tocopherolphosphat, Tryptophan oder einem α-Tocopherol-Tryptophan-Gemisch veranschaulichen. In 2a sind die Ergebnisse für die Plättchenfunktion veranschaulicht. In 2b sind die Ergebnisse der Virusabtötung für VSV veranschaulicht.
3 enthält vier Diagramme, welche die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV und Bakteriophage M13 durch AMT und UVA in Gegenwart von Mannit, α-Tocopherolphosphat oder einem Mannit-α-Tocopherolphosphat-Gemisch veranschaulichen. In
3a sind die Ergebnisse für die Plättchenfunktion veranschaulicht. In 3b sind die Ergebnisse der Virusabtötung zur Inaktivierung von zellfreiem VSV veranschaulicht. In 3c sind die Ergebnisse der Virusabtötung für das zellassoziierte VSV veranschaulicht. In 3d sind die Ergebnisse der Virusabtötung für den Bakteriophagen M13 veranschaulicht.
In 4 sind zwei Diagramme enthalten, welche die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV durch AMT und UVA in Gegenwart von Quercentin bzw. Rutin oder einem α-Tocopherolphosphat-Mannit-Gemisch veranschaulichen. In 4a sind die Ergebnisse für die Plättchenfunktion veranschaulicht. In 4b sind die Ergebnisse der Virusabtötung von VSV veranschaulicht.
5 enthält zwei Diagramme, welche die Ergebnisse der Inaktivierung von VSV durch AMT und UVA in Gegenwart von Quercetin, Rutin oder Mannit veranschaulichen. In 5a sind die Ergebnisse für die Plättchenfunktion veranschaulicht. In 5b sind die Ergebnisse der Virusabtötung von VSV veranschaulicht.
6 enthält ein Diagramm, das den Einfluss der Einbeziehung von Rutin während der Virusinaktivierungsbehandlung von Plasma durch AMT und UVA auf die Gewinnung des Gerinnungsfaktors VIII veranschaulicht.
7 enthält ein Diagramm, das den Einfluss einer UVC-Behandlung von AHF-Konzentrat hinsichtlich der Bakteriophage-M13-Infektiosität und FVIII-Gewinnung veranschaulicht.
8 enthält zwei Diagramme, welche die schützende und optimale Ascorbatkonzentration in Gegenwart von konstantem Quercetin (8a) und von Quercetin in Gegenwart von konstantem Ascorbat (5b) zeigen.
9 enthält zwei Diagramme, die den Einfluss einer UVC-Behandlung in Gegenwart von 0,5 mM Ascorbat und 0,2 mM Quercetin auf die Bakteriophage-Ml3-Infektiosität und FVIII- Gewinnung veranschaulichen. In 9a sind die Ergebnisse für die Behandlung von AHF-Konzentrat gezeigt. In 9b sind die Ergebnisse für die Behandlung von FFP gezeigt.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG
Blut besteht aus festen (Zellen, d.h. Erythrocyten und Leukocyten, und Plättchen) und flüssigen Stoffen (Plasma). Die Zellen werden beispielsweise bei der Behandlung von Blutarmut, Gerinnungsstörungen und Infektionen übertragen. Weiterhin enthalten die Zellen potenziell wertvolle Substanzen wie Hämoglobin, und sie können induziert werden, um andere potentiell wertvolle Substanzen wie Interferon, Wachstumsfaktoren und andere eine biologische Antwort modifizierende Stoffe zu erzeugen. Das Plasma besteht hauptsächlich aus Wasser, Salzen, Lipiden und Proteinen. Die Proteine werden in Gruppen eingeteilt, die Fibrinogen, Serumglobuline und Serumalbumin genannt werden. Im humanen Blutplasma lassen sich typische Antikörper (Immunglobuline) finden, einschließlich denjenigen, die beispielsweise gegen infektiöse Hepatitis und Influenza H gerichtet sind.
Bluttransfusionen werden vorgenommen, um eine Blutarmut, die aus einer Erkrankung oder Hämorrhagie resultiert, einen Schock, der aus dem Verlust von Plasmaproteinen oder von Kreislaufvolumen folgt, und Erkrankungen, bei welchen ein adäquater Plasmaproteinspiegel nicht erhalten bleibt, beispielsweise Hämophilie, zu behandeln und eine passive Immunisierung zu verleihen.
Bei bestimmten Krankheiten können eine oder mehrere der Blutkomponenten fehlen. Somit reicht die Gabe der richtigen Fraktion aus und werden an den Patienten die anderen Komponenten nicht "verschwendet", die dann für andere Patienten verwendet werden können. Somit erlaubt es die Auftrennung des Blutes in Komponenten und deren anschließende Fraktionierung, die Zellen und/oder Proteine aufzukonzentrieren, wodurch ihr therapeutischer Nutzen verbessert wird.
Im humanen Blut vorgefundene Zelltypen umfassen rote Blutzellen, Plättchen und einige Arten von Leukocyten. Verfahren zur Herstellung von Zellkonzentraten, die bei der Transfusion nützlich sind, lassen sich finden in Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Aufl., Interscience Publishers, Bd. 4, S. 25-37.
Im humanen Plasma vorgefundene Proteine umfassen Präalbumin, Retinol-bindendes Protein, Albumin, α-Globulin, β-Globulin und γ-Globulin (Immunserumglobuline), die Koagulationsproteine (Antithrombin III, Prothrombin, Plasminogen, antihämophiler Faktor – Faktor VIII, Fibrin-stabilisierender Faktor – Faktor XIII und Fibrinogen), Immunglobuline (Immunglobuline G, A, M, D und E) und die Komplementkomponenten. Zurzeit sind über 100 Plasmaproteine beschrieben. Eine umfassende Auflistung lässt sich finden in "The Plasma Proteins", Hrsg. Putnam, F.W., Academic Press, New York (1975).
In der Blutzellfraktion vorgefundene Proteine umfassen beispielsweise Hämoglobin, Fibronectin, Fibrinogen, den Plättchen-abgeleiteten Wachstumsfaktor, Superoxiddismutase und Kohlenhydrat- und Proteinstoffwechselenzyme. Außerdem kann die Synthese anderer Proteine wie Interferone und Wachstumsfaktoren ausgelöst werden.
Eine umfangreiche Liste induzierbarer Leukocytenproteine lässt sich finden in Stanley Cohen, Edgar Pick, J.J. Oppenheim, "Biology of the Lymphokines", Academic Press, New York (1979).
Die Blutplasmafraktionierung umfasst im Allgemeinen die Verwendung organischer Lösungsmittel wie Ethanol, Ether und Polyethylenglykol bei niedrigen Temperaturen und kontrollierten pH-Werten, um eine bestimmte Fraktion, die ein oder mehrere Plasmaproteine enthält, auszufällen. Der erhaltene Überstand kann dann seinerseits ausgefällt werden usw., bis der gewünschte Fraktionierungsgrad erreicht worden ist. In jüngerer Zeit basieren Auftrennungen auf chromatographischen Vorgängen. Einen ausgezeichneten Überblick über die Blutfraktionierung gibt auch Kirk-Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology, 3. Aufl., Interscience Publishers, Bd. 4, S. 25 bis 62, deren gesamter Inhalt hiermit als Bezugnahme aufgenommen wird.
Die Erfindung ist auch darauf gerichtet, eine biologische Zusammensetzung wie Vollblut, rote Blutzellkonzentrate, Plättchenkonzentrate, Plättchenextrakte, Leukocytenkonzentrate, Sperma, Bauchwasser, Milch, Lymphfluid und Hybridomzelllinien und daraus abgeleitete Produkte einer Bestrahlung in Gegenwart eines Quenchers oder eines Quenchergemischs zu unterwerfen.
Dabei sind die hier benutzten Bezeichnungen "Zellen enthaltende Zusammensetzung", "biologische Zusammensetzung" oder "biologisches Fluid" nicht so zu verstehen, dass sie einen lebenden Organismus einschließen. Vielmehr ist das erfindungsgemäße Verfahren darauf gerichtet, in einer in-vitro-Umgebung durchgeführt zu werden, und die Zellen enthaltende Zusammensetzung, biologische Zusammensetzung oder das biologische Fluid, die durch das erfindungsgemäße Verfahren erhalten worden sind, sind ein in in vitro hergestelltes Produkt, aber üblicherweise in vivo verwendbar.
Die Erfindung kann angewendet werden, um das Produkt einer Zusammensetzung, die normale oder kanzeröse Nicht-Blut-Zellen enthält, oder das Produkt einer Genspleißung zu behandeln.
Die Bezeichnung "Bestrahlung" ist im weiteren Sinne zu verstehen, sodass sie eine beliebige Form einer Strahlung einschließt, die herkömmlicherweise zum Inaktivieren von Zellen, beispielsweise weißen Blutzellen, Viren, Parasiten oder anderen pathogenen Organismen, beispielsweise Toxoplasma gondii, Trypanosoma cruzi, Plasmodium malariae oder Babesia microti, entweder allein oder zusammen mit einem anderen Mittel oder Zustand angewendet wird. Beispiele für die Bestrahlung umfassen UV (UVA, UVB und UVC), γ-Gammastrahlung, Röntgenstrahlung und sichtbares Licht.
Die Einzelheiten der Anwendung der Strahlung, um eine Virusinaktivierung zu erreichen, sind dem Fachmann bekannt. Typische erfindungsgemäße Energiefluenzen betragen 5 bis 100 J/cm² (vorzugsweise 50 bis 100 J/cm²) für UVA, 0,02 bis 2 J/cm² (vorzugsweise 0,05 bis 0,2 J/cm²) für UVC und 1 bis 40 kGy für γ-Strahlung. Überraschenderweise ist nun festgestellt worden, dass die Virusinaktivierung vorteilhafterweise verbessert werden kann, wenn die herkömmliche Strahlungsbehandlung in Gegenwart eines Quenchers bzw. eines Quenchergemischs durchgeführt wird.
Geeignete Quencher für Quenchergemische sind beliebige Substanzen, von welchen bekannt ist, dass sie sowohl mit freien Radikalen (so genannte "Typ-I-Quencher") als auch mit reaktiven Sauerstoffformen (so genannte "Typ-II-Quencher") reagieren.
Repräsentative Quencher umfassen beispielsweise ungesättigte Fettsäuren, reduzierende Zucker, Cholesterin, Indolderivate, Azide wie Natriumazid, Tryptophan, mehrwertige Alkohole wie Glycerin und Mannit, Thiole wie Glutathion, Superoxiddismutase, Flavonoide wie Quercetin und Rutin, Aminosäuren, DABCO und Vitamine.
Der Quencher wird in herkömmlichen Anteilen verwendet, jedoch führt überraschenderweise bei seiner Verwendung das Gesamtverfahren zu einer bevorzugten Schädigung des Virus, jedoch nicht des gewünschten biologischen Materials.
Erfindungsgemäß wird eine überlegene Virusabtötung erreicht, indem sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch Typ II gequencht werden, d.h. unter Verwendung eines Gemischs von Typ-I- und Typ-II-Quenchern, oder durch Verwendung von Verbindungen, beispielsweise Flavonoiden, von welchen bekannt ist, dass sie sowohl Typ-I- als auch Typ-II-Reaktionen quenchen. Dabei ist der Bereich der Virusabtötung in den meisten Fällen breiter als derjenige, der bei Verwendung von Typ-I- oder Typ-II-Quenchern allein erreicht wird, selbst verglichen mit erhöhten Konzentrationen von Typ-I- oder Typ-II-Quenchern, oder bei Verwendung von Typ-I-Quencher-Gemischen oder Typ-II-Quencher-Gemischen. Darüber hinaus wird dieser breitere Bereich der Virusabtötung erreicht, ohne dabei die intakte Zellfunktionsfähigkeit oder -struktur zu opfern.
Quencher werden bereits verwendet, um die Reaktionsspezifität zahlreicher Systeme, einschließlich Röntgenbestrahlung und lichtaktivierter Verbindungen, zu erhöhen. Die Verwendung von Quenchern bei der UV-Behandlung von biologischen Fluids, insbesondere Blutproteinlösungen, ist jedoch bisher noch nicht berichtet worden. Im US-Patent Nr. 4 946 648 werden UV, Lösungsmittel und Tenside kombiniert, um von einem Virus angegriffenes AHF oder Plasma zu behandeln, jedoch sind die Ergebnisse denjenigen unterlegen, die erfindungsgemäß erreicht werden. Die beste Behandlung erlaubte 5,4logs der Inaktivierung des Kappa-Phagen, einhergehend mit einer 74%igen FVIII-Gewinnung. Demgegenüber ergab eine Ausführungsform des erfindungsgemäßen Verfahrens die Inaktivierung von = 10¹⁶ ID₅₀ von VSV, eines entwickelten Modellvirus, und = 10⁸ ID₅₀ von EMCV, eines nicht entwickelten Modellvirus, mit einer FVIII-Gewinnung von = 80 %.
Das erfindungsgemäße Verfahren wird typischerweise in einem Temperaturbereich von 0 bis 42°C, vorzugsweise 20 bis 37°C, und am meisten bevorzugt 20 bis 25°C durchgeführt. Das erfindungsgemäße Verfahren wird typischerweise bei pH 6,5 bis 8 und am meisten bevorzugt 7,2 bis 7,6 durchgeführt. Die Proben werden typischerweise dem erfindungsgemäßen Verfahren einen Zeitraum von unter 24 Stunden, und vorzugsweise weniger als vier Stunden bei γ- oder Röntgenstrahlung unterworfen. Die Proben können auch im gefrorenen Zustand behandelt werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die biologische Zusammensetzung einer Bestrahlung und dem Quencher oder Quenchergemisch in Gegenwart eines Strahlungssensibilisators unterworfen. In diesem Zusammenhang umfassen geeignete Strahlungssensibilisierungsverbindungen für eine erfindungsgemäße Verwendung Phthalocyanine, Purpurine und andere Moleküle, die den Porphyrinen in der Struktur ähnlich sind (wie weiter oben beschrieben) sowie von ultraviolettem Licht angeregte photoaktive Verbindungen (beispielsweise Psoralen, 8-Methoxypsoralen, 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen, Bergapten und Angelicin), Farbstoffe, die Licht im sichtbaren Bereich absorbieren (beispielsweise Hypericin, Methylenblau, Eosin, Fluoresceine und Flavine) und Farbstoffe, die Röntgenstrahlung absorbieren (beispielsweise bromiertes Psoralen, bromiertes Hämatoporphyrin und iodiertes Phthalocyanin). Die Verwendung solcher Strahlungssensibilisatoren ist für den Fachmann selbstverständlich und vorzugsweise im Wesentlichen wie in US-Patent Nr. 5 120 649 und US-Patentanmeldung 07/706 919, eingereicht am 29. Mai 1991, beschrieben, deren Offenbarungen hiermit als Bezugnahme aufgenommen werden.
Entsprechend einer anderen erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Behandlung der biologischen Zusammensetzung mit Strahlung und einem Quencher oder Quenchergemisch mit einem zweiten viruziden Verfahren kombiniert. Dabei kann das zweite viruzide Verfahren ein beliebiges Verfahren sein, das herkömmlicherweise zur Inaktivierung von entwickelten und/oder nicht entwickelten Viren angewendet wird, beispielsweise eine gegebenenfalls trockene Wärmebehandlung, pH-Wert-Veränderung, Behandlung mit Lipidlösungsmitteln und/oder -tensiden, getrennte Strahlungsbehandlung, beispielsweise mit γ-Strahlung, oder Behandlung mit chemischen Mitteln, beispielsweise Formaldehyd.
In einer bevorzugten Ausführungsform ist das zweite viruzide Verfahren eine Lösungsmittel/Tensid-Behandlung wie die im US-Patent Nr. 4 540 573 offenbarte. In dieser Ausführungsform wird das biologische Fluid mit einem Dialkylphosphat oder einem Trialkylphosphat mit Alkylgruppen, die 1 bis 10 Kohlenstoffatome, speziell 2 bis 10 Kohlenstoffatome, enthalten, in Berührung gebracht. Beispiele von Trialkylphosphaten für eine erfindungsgemäße Verwendung umfassen Tri-(n-butyl)phosphat, Tri-(t-butyl)phosphat, Tri-(n-hexyl)phosphat, Tri-(2-ethylhexyl)phosphat und Tri-(n-decyl)phosphat, um nur einige zu nennen. Ein besonders bevorzugtes Trialkylphosphat ist Tri-(n-butyl)phosphat. Mischungen aus verschiedenen Trialkylphosphaten sowie Phosphate mit Alkylgruppen mit unterschiedlichen Alkylketten, beispielsweise Ethyl-di(n-butyl)phosphat, können ebenfalls verwendet werden. Auf ähnliche Weise können die jeweiligen Dialkylphosphate verwendet werden, einschließlich denjenigen mit anderen Alkylgruppengemischen des Dialkylphosphats. Weiterhin können Di- und Trialkylphosphat-Gemische verwendet werden.
Di- oder Trialkylphosphate für eine erfindungsgemäße Verwendung werden mit einem Anteil von zwischen etwa 0,01 mg/ml und etwa 100 mg/ml und vorzugsweise zwischen etwa 0,1 mg/ml und etwa 10 mg/ml verwendet.
Das Di- oder Trialkylphosphat kann gegebenenfalls unter Zusatz von Benetzungsmitteln verwendet werden. Es ist jedoch bevorzugt, Di- oder Trialkylphosphat zusammen mit einem Benetzungsmittel zu verwenden. Ein solches Benetzungsmittel kann entweder bevor, gleichzeitig mit oder nachdem das Di- oder Trialkylphosphat mit dem biologischen Fluid in Berührung gekommen ist, zugegeben werden. Dabei besteht die Funktion des Benetzungsmittels darin, den Kontakt des Virus in dem biologischen Fluid mit dem Di- oder Trialkylphosphat zu verbessern. Das Benetzungsmittel allein inaktiviert das Virus nicht adäquat.
Bevorzugte Benetzungsmittel sind nicht-toxische Tenside. Brauchbare nichtionische Tenside umfassen diejenigen, die bei der vorherrschenden Temperatur mindestens 0,1 Gew.-% des Fetts in einer wässrigen Lösung, die dieses enthält, dispergieren, wenn 1 Gramm Tensid auf 100 ml Lösung zugegeben worden ist. Insbesondere sind Tenside geeignet, die Polyoxyethylenderivate von Fettsäuren, beispielsweise partielle Ester von Sorbitanhydriden, die kommerziell als "Tween 80", "Tween 20" und "Polysorbat 80" bekannt sind, und nichtionische öllösliche Wassertenside wie diejenigen, die kommerziell unter der Handelsmarke "Triton X 100" (oxyethyliertes Alkylphenol) vertrieben werden, umfassen. Ebenfalls geeignet sind Natriumdeoxycholat sowie die "Zwittergentien", die synthetische zwitterionische Tenside sind, die als "Sulfobetaine" bekannt sind, wie N-Dodecyl-N,N-dimethyl-2-ammonio-1-ethansulfonat und dessen Verwandte oder nichtionische Tenside wie Octyl-β-D-glucopyranosid.
Der Anteil des Benetzungsmittels, falls es eingesetzt wird, ist nicht entscheidend, so können beispielsweise etwa 0,001 bis etwa 10 % und vorzugsweise etwa 0,01 bis 1,5 % verwendet werden.
Di- und Trialkylphosphate können zusammen mit anderen inaktivierenden Mitteln wie Alkohol oder Ethern, gegebenenfalls bei gleichzeitigem Vorhandensein von Benetzungsmitteln, gemäß US-Patent Nr. 4 481 189 verwendet werden.
Die Behandlung der biologischen Fluids mit Trialkylphosphat wird bei einer Temperatur von zwischen –5 und 70°C und vorzugsweise zwischen 0 und 60°C durchgeführt. Der Zeitraum einer solchen Behandlung (Kontakt) beträgt mindestens 1 Minute, vorzugsweise mindestens 1 Stunde, und im Allgemeinen 4 bis 24 Stunden. Die Behandlung wird normalerweise bei Atmosphärendruck durchgeführt, obwohl ein unteratmosphärischer und ein überatmosphärischer Druck auch angewendet werden kann.
Normalerweise werden nach der Behandlung das Trialkylphosphat und die anderen Inaktivierungsmittel, beispielsweise Ether, entfernt, obwohl dies abhängig vom Charakter der virusinaktivierenden Mittel und der beabsichtigten weiteren Verarbeitung des biologischen Fluids nicht in allen Fällen erforderlich ist.
Di- oder Trialkylphosphat und nichtionische Tenside können wie folgt entfernt werden:

(1) Extraktion mit physiologisch verträglichen Ölen (US-Patent Nr. 4 789 545),
(2) Diafiltration unter Verwendung von etherunlöslichen, beispielsweise "TEFLON", mikroporösen Membranen, welche die Plasmaproteine zurückhalten,
(3) Absorption der gewünschten Plasmakomponenten an chromatographischen oder affinitätschromatographischen Trägern und
(4) Ausfällung, beispielsweise durch Aussalzen der Plasmaproteine.

Insbesondere kann die Entfernung aus AHF durch Ausfällung von AHF mit 2,2molalem Glycin und 2,0 M Natriumchlorid durchgeführt werden. Die Entfernung aus Fibronectin kann durch Binden des Fibronectins an eine Säule aus unlöslich gemachter Gelatine und Auswaschen des von dem Reagens freien gebundenen Fibronectins durchgeführt werden.
Beispiele für lipidumhüllte humanpathogene Viren, die erfindungsgemäß inaktiviert werden können, umfassen das vesikuläre Stomatitisvirus (VSV), Moloney-Sarcomavirus, Sindbisvirus, humane Immunschwächeviren (HIV-1 und HIV-2), humane T-Zell-lymphotorophische Virus-I (HTLV-I), Hepatitis-B-Virus, Non-A- und Non-B-Hepatitis-Virus (NANB) (Hepatitis C), Cytomegalovirus, Epstein-Barr-Viren, Lactatdehydrogenaseerhöhende Virus, Viren der Herpesgruppe, Rhabdoviren, Leukoviren, Myxoviren, α-Viren, Arboviren (Gruppe B), Paramyxoviren, Arenaviren und Coronaviren. Beispiele für nicht entwickelte Viren, die erfindungsgemäß inaktiviert werden können, umfassen das Parvovirus, Poliovirus, Hepatitis-A-Virus, enterische Non-A- und Non-B-Hepatitis-Virus, den Bakteriophagen M13 und Satelliten-adenoassoziierte Virus (AAV).
Zellen enthaltende Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß zu behandeln sind, haben ≥ 1·10⁸ Zellen/ml, vorzugsweise ≥ 1·10⁹ Zellen/ml, und am meisten bevorzugt ≥ 1·10¹⁰ Zellen/ml. Weiterhin haben Zellen enthaltende Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß zu behandeln sind, vorzugsweise > 4 mg/ml Protein, besonders bevorzugt > 25 mg/ml Protein, und am meisten bevorzugt 50 bis 60 mg/ml Protein (ungewaschene Zellen).
Keine Zellen enthaltende Zusammensetzungen, die erfindungsgemäß zu behandeln sind, haben ≥ 0,1 mg/ml und vorzugsweise ≥ 5 mg/ml Protein.
Durch das erfindungsgemäße Verfahren werden mindestens 10⁴ und vorzugsweise 10⁶ infektiöse Einheiten von Virusparasiten oder anderen Pathogenen inaktiviert.
Die erfindungsgemäß behandelten biologischen Zusammensetzungen, die zunächst ≥ 1000 infektiöse Viruseinheiten/l enthielten, haben, nachdem das Virus inaktiviert und die erfindungsgemäße Behandlung durchgeführt worden ist, bei Zellen enthaltenden Zusammensetzungen eine Beibehaltung der intakten Zellfunktionsfähigkeit und -struktur von mehr als 70 %, vorzugsweise mehr als 80 %, und am meisten bevorzugt von mehr als 95 %. Bei biologischen Fluids kann eine Beibehaltung der biologischen Aktivität von mehr als 75 %, vorzugsweise mehr als 85 %, und am meisten bevorzugt von mehr als 95 % erreicht werden.
Durch das erfindungsgemäße Inaktivierungsverfahren werden die meisten, wenn nicht tatsächlich alle der enthaltenen Viren inaktiviert. Ein Verfahren zur Bestimmung von Infektiositätsgraden durch Beimpfung von Schimpansen (in vivo) wird diskutiert von Prince, A.M., Stephen, W., Bortman, B. und van den Ende, M.C., "Evaluation of the Effect of Betapropiolactone/Ultraviolet Irradiation (BPL/UV) Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by Factor IX Complex in Chimpanzees", Thrombosis and Hemostasis, 44, 138-142 (1980).
Erfindungsgemäß wird die Virusinaktivierung bis zu dem Grad von mindestens "4logs" und vorzugsweise ≥6logs erhalten, d.h., dass das Virus in der Probe bis zu dem Maße vollständig inaktiviert worden ist, das durch Infektiositätsstudien ermittelt wird, in welchen das Virus in der unbehandelten Probe in einer solchen Konzentration vorhanden ist, dass selbst nach einer Verdünnung auf 10⁴ (oder 10⁶) die Virusaktivität gemessen werden kann.
Erfindungsgemäß werden die Viren inaktiviert, während gleichzeitig die funktionellen und strukturellen Merkmale labiler Blutzellen erhalten bleiben.
Die Funktionsfähigkeit von Blutplättchen wird von deren Fähigkeit, in Gegenwart bestimmter biologischer Agentien zu aggregieren, und ihrer Morphologie bestimmt. Die strukturelle Integrität der Plättchen wird durch das in-vivo-Überleben nach Radiomarkierung mit Indium-111 und Identifizierung des Vorhandenseins spezifischer Plättchenantigene bestimmt.
Nach Behandlung mit der photoreaktiven Verbindung kann überschüssige photoreaktive Verbindung durch Zentrifugieren, Waschen, Dialyse und/oder Adsorption an hydrophoben Matrizen entfernt werden.
In einer erfindungsgemäßen Ausführungsform wird die Zellen enthaltende Fraktion, die durch das erfindungsgemäße Verfahren behandelt worden ist, übertragen oder dem Spender, beispielsweise einem Menschen, von welchem die ursprüngliche Zellen enthaltende Fraktion erhalten worden ist, zurückgegeben. Auf diese Weise wird die Menge des im Spender zirkulierenden Virus verringert, wodurch die Fähigkeit des Spenders zur Vernichtung des Virus und/oder die Wirksamkeit antiviraler Arzneimittel verbessert wird/werden.
Die Wirksamkeit der Gerinnungsfaktoren VIII und IX wird durch Bestimmung über den Korrekturgrad der APTT-Zeit von Faktor-VIII- bzw. Faktor-IX-defizitärem Plasma bewertet. J.G. Lenahan, Philips und Philips, Clin. Chem., Bd. 12, 269 (1966).
Die Aktivität von Proteinen, die Enzyme sind, wird durch Messung ihrer Enzymaktivität bestimmt. Die Aktivität des Faktors IX kann auch durch dieses Verfahren gemessen werden.
Die Aktivität von Bindungsproteinen kann durch Bestimmung ihrer Kinetik und Affinität der Bindung an ihre natürlichen Substrate gemessen werden.
Die Lymphokinaktivität wird biologisch in Zellsystemen gemessen, typischerweise durch Bestimmung ihrer biologischen Aktivität in Zellkulturen.
Die Proteinaktivität wird im Allgemeinen durch bekannte, standardisierte Verfahren zur Messung der Aktivität des beteiligten Proteins bzw. Proteintyps bestimmt.
Die Erfindung wird durch folgende Beispiele näher erläutert.
BEISPIELE
Materialien und Verfahren
Blut
Vollblut war typischerweise vor Verwendung weniger als 48 Stunden alt. Vor Verwendung wurde es bei 4°C aufbewahrt.
Plättchenkonzentrate (PCs)
PCs, die nach routinemäßigen Blutbanktests freigegeben worden waren, waren typischerweise 24 bis 48 Stunden alt, wenn sie behandelt wurden. Vor der Behandlung wurden die PCs bei 22 bis 24°C in Beuteln (PL 732, Fenwal Laboratories, Deerfield, IL), in welchen sie gesammelt worden waren, aufbewahrt und in einem Plättchenrührer (Helmer Labs, St. Paul, MN) konstant gerührt.
Psoralenlösungen
4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (AMT) wurde von HRI Assoc. Inc., Concord, CA, bezogen. AMT-Stammlösungen (4 mg/ml) wurden in destilliertem Wasser hergestellt.
Virusmodellstudien
Die Inaktivierung folgender Viren wurde untersucht: vesikuläres Stomatitisvirus (VSV), ein lipidumhülltes RNA-Virus, Encephalomyocarditisvirus (EMC), ein proteinumhülltes RNA-Virus, humanes Immunschwächevirus (HIV), ein humanes pathogenes Retrovirus, Hepatitis-A-Virus, ein nicht entwickeltes RNA-Virus, adeno-assoziiertes Virus, ein nicht entwickeltes DNA-Virus, M13, ein nicht entwickelter Bakteriophage, und Poliovirus, ein nicht entwickeltes RNA-Virus.
Der pHM175-Stamm von HAV wurde sich in einschichtigen Nierenzellenkulturen (BS-C-1) der afrikanischen Grünen Meerkatze vermehren gelassen, wie von Jansen et al., 1988 (Jansen, R.W., J.E. Newbold und S.M. Lemon, Virology, 163, 299-307 (1988)) beschrieben.
Die Quantifizierung der Virusinfektiosität basierte auf der autoradiographischen Detektion von Fokussen, die sich in Zellschichten entwickelt hatten, die unter 0,5 Agarosedeckschichten gehalten worden waren, mit anschließender Fixierung der Zellen mit 80%igem Aceton und Anfärbung mit mit I-125-markiertem Antikörper (IgG) gegen HAV.
Es wurden zehnfache Serienverdünnung von HAV im MEM-Kulturmedium, ergänzt mit 2%igem Rinderfötusserum, hergestellt; jede Verdünnung wurde verwendet, um zwei 60-mm-Corning-Schalen mit BS-C-1-Zellen zu beimpfen. Nach 5- bis 7tägiger Inkubation bei 35°C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO₂ wurden Fokusse, die sich von der einzelnen Virusteilchenvermehrung abgeleitet hatten, sichtbar gemacht, gezählt und die Ergebnisse als Radioimmunofokus-bildende Einheiten (RFU) des Virus angegeben.
Subkonfluente 293-Zellen wurden mit 10 PFU von Ad5 und 10fachen Reihenverdünnungen von AAV in DMEM, ergänzt mit 2%igem Rinderfötusserum, in 24-Loch-Platten coinfiziert. 48 Stunden nach Infektion und Inkubation bei 37°C in einer feuchten Umgebung mit 5 % CO₂ wurden die Zellen aus den Vertiefungen gekratzt, gewaschen, denaturiert und an einer AAV-(³²P)DNA-Sonde hybridisiert, und es wurde, wie von Carter et al., Virology, 128, 505-516 (1983) beschrieben, eine Autoradiographie durchgeführt. Nach Entwicklung des Röntgenfilms und Auszählung wurden cpm-Standardkurven aus dem bekannten Virusvorrat gezogen und zur Bestimmung der AAV- Konzentration in jeder Verdünnung der unbekannten Probe verwendet.
VSV wurde in humanen A549-Zellen kultiviert. EMC-Vorräte wurden in Maus-L929- oder humanen A459-Zellen hergestellt. Das Poliovirus wurde in humanen HeLa-Zellen gezüchtet. Die Kultivierungs- und Untersuchungsvorgänge waren ähnlich den von Horowitz, B., Wiebe, M.E., Lippin, A. und Stryker, M.H., "Inactivation of Viruses in Labile Blond Derivatives", Transfusion, 25, 516-522 (1985) beschriebenen. Die Infektiosität von VSV, EMC und Poliovirus wurde durch 10fache Reihenendpunkt-Verdünnungen im DMEM-Kulturmedium (Gibco Laboratories, Grand Island, New York) mit 10%igem Rinderfötusserum (FCS, MA Bioproducts, Walkersville, Maryland) bewertet. Jede Verdünnung wurde verwendet, um achtmal humane A549-(VSV- oder EMC-) oder HeLa-(Poliovirus-)Zellen in 96-Loch-Mikrotiterplatten zu beimpfen. Die virusinduzierte Cytopathologie wurde nach 72-stündiger Inkubation bei 37°C in 5 % CO₂ bewertet. Der berichtete Virustiter wurde berechnet unter Anwendung der Spearman-Karber-Methode (Spearman, C., "The Method of Right and Wrong Cases' ('Constant Stimuli') Without Gauss's Formula", Br. J. Psychol., 2, 227-242 (1908)) und zeigt die Menge des Virus, die 50 % der Gewebekulturvertiefungen (TCID₅₀) infiziert.
Zellassoziiertes VSV wurde durch Inkubieren einer konfluenten Monoschicht aus humanen A549-Zellen mit 5 ml 10⁷ ID₅₀/ml VSV in serumfreiem DMEM eine Stunde lang bei 37°C unter 5 % CO₂ in 150-cm²-Gewebekultur-Kolben hergestellt. Die Vervielfachung der Infektion unter diesen Bedingungen betrug etwa 2,1 TCID₅₀/Zelle. Nach Abdekantieren der Flüssigkeit wurden die anhaftenden Zellen dreimal abgewaschen, um das freie Virus mit 50 ml PBS pro Waschgang zu entfernen. Danach wurden 40 ml DMEM, das 5 % FCS enthielt, zugegeben und die Zellen weitere 4 3/4 Stunden inkubiert. Die anhaftenden Zellen wurden dreimal mit PBS abgewaschen und durch eine 10 Minuten lange Behandlung mit einer normalen Kochsalzlösung, die 0,01 % Trypsin enthielt (Cooper Biomedical, Freehold, New Jersey, zweimal umkristallisiert) und 5 μg/ml EDTA enthielt, freigesetzt. Die freigesetzten Zellen wurden durch Zentrifugieren gesammelt, dreimal mit PBS gewaschen und in PBS resuspendiert.
Zur Bewertung der Virusinaktivierung wurde die viruzide Reaktion durch 10fache Verdünnung in DMEM, das 5 Rinderfötusserum enthielt, beendet und die Zellen, falls vorhanden, durch 10 Minuten langes Zentrifugieren mit 1 500 U/min entfernt. Die fehlende Virusinaktivierung bei dieser Verdünnung oder in Abwesenheit einer Bestrahlung wurde für die untersuchten Inaktivierungsbedingungen nachgewiesen. Die Proben wurden steril filtriert (Swinnex filters, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) und bis zum Versuch bei –70°C oder darunter eingefroren.
Die Verfahren zur Beurteilung der Inaktivierung des zellassoziierten VSV waren ähnlich denjenigen des zellfreien VSV, außer, dass alle Versuche mit zellassoziiertem VSV unter vollständig kontrollierten aseptischen Bedingungen durchgeführt wurden. Bei Beendigung des Versuchs wurden die infizierten A549-Zellen durch Zentrifugieren isoliert, dreimal mit PBS durch Zentrifugieren gewaschen, in 1 ml PBS resuspendiert und sofort auf VSV-Infektiosität durch 10fache Reihen-Endpunktverdünnungen wie beim zellfreien Virus untersucht.
Beispiel 1: Wirkung der Einbeziehung von Typ-I-Quenchern während der Behandlung eines Plättchenkonzentrats mit AMT und UVA
Aliquote (3 ml) aus einem Plättchenkonzentrat wurden mit 25 μg/ml 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen (AMT) und 7,5 mW/cm² UVA die Zeiträume lang, die für Anwesenheit oder Abwesenheit von verschiedenen Typ-I-Quenchern angezeigt waren, behandelt. Vor der Behandlung wurde das zellfreie vesikuläre Stomatitisvirus (VSV), das zellassoziierte VSV oder der nicht entwickelte Bakteriophage M13 separat zu den Plättchenkonzentrataliquoten zugegeben. Nach der Behandlung wurden die das Virus enthaltenden Proben auf Virusinfektiosität untersucht, die Proben ohne Virus über Nacht aufbewahrt und danach auf Aggregation als Reaktion auf 20 μg/ml Collagen in einem BioData-Aggregometer untersucht. Durch die in der Tabelle angegebene Aggregationsreaktion wird der ursprüngliche Aggregationsanteil in der behandelten Probe mit dem in der unbehandelten Kontrolle festgestellten verglichen.
Die in Tabelle I aufgeführten Ergebnisse des Beispiels 1 zeigen, dass bei der 30minütigen UVA-Bestrahlungszeit, die für die vollständige Inaktivierung des zellfreien VSV (≥ 6,0log₁₀) durch AMT erforderlich ist, durch die Zugabe bestimmter Typ-I-Quencher (beispielsweise 2 mM Mannit und 4 mM Glycerin) die Plättchenaggregationsfunktion von etwa 70 % auf mehr als 90 der Kontrollgehalte verbessert wurde. Es gab jedoch eine nur geringe Inaktivierung von zellassoziiertem VSV oder M13 bei einer 30minütigen Behandlung, unabhängig davon, ob Typ-I-Quencher vorhanden waren. Bei UVA-Bestrahlungszeiten von 60 Minuten oder länger, die für eine mehr als 1log₁₀-Abtötung des zellassoziierten oder nicht entwickelten Virus erforderlich waren, wurde die Plättchenfunktion geopfert (der Aggregationsanteil betrug 60 % oder weniger, selbst in Gegenwart von Typ-I-Quenchern mit einer Konzentration bis zu 50 mM).
Die Daten in Tabelle I zeigen auch, dass die Einbeziehung von Typ-I-Quenchern mit einer Konzentration von bis zu mindestens 10 mM keinen sichtbaren Effekt auf die Inaktivierung von zellfreiem oder zellassoziiertem VSV oder M13 durch AMT und UVA hatte. Tabelle I: Zugabe von Typ-I-Quenchern: Wirkungen auf die Plättchenaggregation und Virusabtötung
Tabelle I (Fortsetzung)

(1) Minuten UVA-Exposition,
(2) n.v. = nicht verfügbar,
(3) soweit nichts anderes angegeben, sind nur Virusergebnisse mit 30 Minuten UVA mitgeteilt, da längere Behandlungszeiten die Plättchenintegrität schädigten,
(4) Abtötungsergebnisse mit 60 Minuten UVA,
(5) Abtötungsergebnisse mit 90 Minuten UVA.

Beispiel 2: Wirkung der Einbeziehung von Typ-II-Quenchern während der Behandlung eines Plättchenkonzentrats mit AMT und UVA
Ein Plättchenkonzentrat (3 ml) wurde mit 25 μg/ml AMT und 11 mW/cm² UVA, gegebenenfalls in Anwesenheit verschiedener Typ-II-Quencher, die angegebenen Zeiträume lang behandelt. Die Plättchenaggregation und Inaktivierung von zellfreiem und zellassoziiertem VSV und M13 wurden wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht und mitgeteilt. Die Ergebnisse (Tabelle II) zeigen, dass bei 30 Minuten UVA-Bestrahlung durch das Vorhandensein von Typ-II-Quenchern die Inaktivierung von zellfreiem VSV durch AMT abnahm, und diese Unterdrückung der Abtötung mit steigender Typ-II-Quencher-Konzentration zunahm. Da die Plättchenfunktion nicht durch Einbeziehung eines Typ-II- Quenchers geschützt wurde, zeigte sich die effektive Virusabtötung mit AMT und UVA in Plättchenkonzentraten durch die Zugabe von Typ-II-Quenchern verschlechtert.
Aus Tabelle II geht auch hervor, dass, obwohl die Inaktivierung des lipidumhüllten Virus VSV gehemmt wurde, die Abtötung des nicht entwickelten Bakteriophagen M13 durch die Einbeziehung von Typ-II-Quenchern unverändert war. Tabelle II: Zugabe von Typ-II-Quenchern: Wirkungen auf Plättchenaggregation und Virusabtötung
Tabelle II (Fortsetzung)

(1) Minuten UVA-Exposition,
(2) n.v. = nicht verfügbar,
(3) soweit nichts anderes angegeben, sind nur Abtötungsergebnisse mit 30 Minuten UVA mitgeteilt,
(4) Abtötungsergebnisse mit 60 Minuten UVA,
(5) Abtötungsergebnisse mit 90 Minuten UVA.

Beispiel 3: Wirkung der Einbeziehung von Typ-I-Quencher-Gemischen auf ein Plättchenkonzentrat während der Behandlung mit AMT und UVA
Plättchenkonzentrataliquote (3 ml) wurden mit 25 μg/ml AMT und 11 mW/cm² UVA die angegebenen Zeiträume lang in Abwesenheit oder in einzelner Anwesenheit der Typ-I-Quencher Mannit (2 mM) oder Glycerin (4 mM) oder in Anwesenheit des Gemischs aus diesen zwei Typ-I-Quenchern behandelt. Die Ergebnisse (1) sind für die Plättchenfunktion (1a) und für die Inaktivierung des zellfreien (1b) und zellassoziierten (1c) VSV und M13 (1d), die wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht worden waren, gezeigt.
Die Wirkungen der Zugabe des Gemischs aus den Typ-I-Quenchern Mannit und Glycerin auf die Plättchenfunktion (1a) und die Virusabtötung (1b, 1c, 1d) sind ähnlich den wie in Beispiel 1 beschriebenen Wirkungen der Zugabe der einzelnen Typ-I-Quencher. Die Virusabtötung ist in Abwesenheit oder Anwesenheit des Typ-I-Quencher-Gemischs gleich, und die Plättchenfunktion nach der 30-minütigen UVA-Behandlung, die eine vollständige Abtötung des zellfreien VSV ergab, wird von Typ-I-Quenchern verbessert. Jedoch wird bei den Behandlungszeiten von 60 Minuten oder länger, die für eine mehr als 1log₁₀-Abtötung von zellassoziiertem Virus oder M13 erforderlich sind, die Plättchenfunktion verschlechtert, ob nun Typ-I-Quencher allein oder in Kombination enthalten sind oder nicht.
Andere Typ-I-Quencher-Gemische, beispielsweise 2 mM Mannit oder 4 mM Glycerin, kombiniert mit 2 mM Glutathion (nicht gezeigt), ergaben Ergebnisse, die gleich denjenigen waren, die mit der Kombination von Mannit und Glycerin erhalten worden waren, und gaben den Plättchen nicht mehr Schutz als einer der Typ-I-Quencher, aus welchen das Gemisch bestand.
Beispiel 4: Wirkung der Einbeziehung von Typ-II-Quencher-Gemischen auf ein Plättchenkonzentrat während der Behandlung mit AMT und UVA
Ein Plättchenkonzentrat (3-ml-Aliquote) wurde mit 25 μg/ml AMT und 11 mW/cm² UVA 30, 60 oder 90 Minuten lang in Anwesenheit oder Abwesenheit des Gemischs aus den Typ-II-Quenchern α-Tocopherolphosphat (1 mM) und Tryptophan (5 mM) oder in Anwesenheit eines einzelnen Quenchers davon behandelt. Die Ergebnisse (2) für die Plättchenfunktion (2a) und die Virusabtötung des zellfreien VSV (2b) wurden wie in Beispiel 1 untersucht und beschrieben mitgeteilt.
Die Einbeziehung von Typ-II-Quenchern, ob nun einzeln oder mit anderen Typ-II-Quenchern kombiniert, ergab für die Plättchen keinen Schutz (2a). Außerdem wurde durch das Vorhandensein von Typ-II-Quenchern der durch AMT und UVA abgetötete Anteil von zellfreiem VSV an Luft gesenkt, wobei diese verringerte Abtötung bei kombinierten Typ-II-Quenchern eine additive war. Nach 30 Minuten ohne Quencher war die Abtötung vollständig (≥6,0log₁₀), während bei dem einzelnen Vorhandensein von 1 mM α-Tocopherol oder 5 mM Tryptophan die Abtötung nur etwa 4,2log₁₀ betrug und bei dem kombinierten Vorhandensein dieser Quencher die Abtötung weiter auf etwa 2,8log₁₀ (2b) verringert wurde. Andere Gemische von Typ-II-Quenchern, beispielsweise Tryptophan oder α-Tocopherol zusammen mit 5 mM Histidin (nicht gezeigt), hatten ähnliche Wirkungen; sie schützten die Plättchenfunktion nicht und ihre kombinierte Einbeziehung verursachte eine Verringerung der Abtötungsquote des zellfreien VSV, die größer war als bei jedem der einzelnen Quencher. Somit wurde die Plättchenfunktion unter allen Bedingungen der AMT- und UVA-Behandlung in Gegenwart von Typ-II-Quenchern (allein oder in Kombination), bei welchen ≥ 6log₁₀ zellfreie VSV inaktiviert worden waren, verschlechtert.
Beispiel 5: Wirkung der Einbeziehung von Typ-I-Typ-II-Quencher-Gemischen auf ein Plättchenkonzentrat während der Behandlung mit AMT und UVA
Plättchenkonzentrataliquote (3 ml) wurden mit 25 μg/ml AMT und 11 mW/cm² UVA 30, 60 oder 90 Minuten lang in Gegenwart eines Gemischs aus dem Typ-I-Quencher Mannit (2 mM) und dem Typ-II-Quencher α-Tocopherolphosphat (1 mM) oder in Gegenwart von nur Mannit oder α-Tocopherol behandelt. Die Plättchenfunktion (3a) und Virusabtötung (3b, 3c, 3d) wurden wie in Beispiel 1 untersucht und mitgeteilt.
Bei 30-minütiger Bestrahlung wurde die Plättchenfunktion (3a) entweder bei Zugabe des einzelnen Typ-I-Quenchers (Mannit) oder der Kombination aus Mannit (Typ 2) und α-Tocopherolphosphat (Typ II) erhalten. Bei 60-minütiger oder längerer UVA-Bestrahlung wurde durch das kombinierte Vorhandensein von Mannit und α-Tocopherolphosphat die Plättchenaggregation (von etwa 70 % bis zu mehr als 90 % der Kontrolle bei 60 Minuten UVA) verbessert, während das Vorhandensein von nur einem dieser Quencher dies nicht tat. Die Funktionsergebnisse unter Verwendung von Glycerin als Typ-I-Quencher waren ähnlich denjenigen für Mannit zusammen mit α-Tocopherol. Bei allen getesteten Typ-I- plus Typ-II-Kombinationen waren die Ergebnisse der Virusabtötung mit kombinierten Quenchern dieselben wie diejenigen bei dem Typ-II-Quencher allein, und die Abtötungsquote des zellfreien (3b) und zellassoziierten (3c) VSV war etwas verringert, während die von M13 (3d) durch die Typ-II-Quencher-Zugabe unbeeinflusst blieb.
Längere Bestrahlungszeiten, die durch die Zugabe der Kombination aus den Typ-I- und Typ-II-Quenchern Mannit (oder Glycerin) und α-Tocopherol ermöglicht worden waren, vergrößerten den wirksamen Bereich der Virusabtötung durch AMT und UVA in Plättchenkonzentraten.
Beispiel 6: Wirkung der Einbeziehung von Verbindungen, die sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch Typ II quenchen, auf ein Plättchenkonzentrat während der Behandlung mit AMT und UVA
Plättchenkonzentrataliquate (3 ml) wurden mit 25 μg/ml AMT und UVA (11 mW/cm²) 30, 60 oder 90 Minuten lang in Abwesenheit oder Anwesenheit von 0,25 mM Quercetin bzw. 0,25 mM Rutin oder mit dem Gemisch aus 1 mM α-Tocopherolphosphat und 2 mM Mannit behandelt. Plättchenfunktion und Virusinaktivierung wurden wie in Beispiel 1 untersucht und mitgeteilt (4).
Die Wirkungen der Einbeziehung der Flavonoide Quercetin oder Rutin, Verbindungen, die dafür bekannt sind, dass sie sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch vom Typ II effizient quenchen, waren ähnlich denjenigen, die erhalten wurden, wenn Typ-I-Typ-II-Quencher-Gemische bei der Behandlung eingesetzt wurden. Die Abtötungsquote von VSV (4b), aber nicht die von M13 (nicht gezeigt, siehe 3d), sank, und die Plättchenfunktion (4a) wurde geschützt, selbst bei den längeren Bestrahlungszeiten, die für die vollständige Abtötung des zellfreien VSV erforderlich waren.
Beispiel 7: Flavonoid-Wirkungen auf die Plättchenaggregation
Die Collagen-ausgelöste Aggregation ist ein empfindlicher Indikator für die Plättchenfunktion, und die Ergebnisse mit Collagen korrelieren üblicherweise gut mit denjenigen für die Plättchenmorphologie und -aktivierung und Thromboxan- und ATP-Freisetzung sowie mit der von anderen Agonisten ausgelösten Aggregation. Die Aggregationsreaktion (Umfang und anfänglicher Anteil der Aggregation, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle) auf Collagen nach Behandlung mit 25 μg/ml AMT und 90 Minuten UVA sind mitgeteilt (Tabelle III). Tabelle III ist zu entnehmen, dass jedes der untersuchten Flavonoide die Collagen-ausgelöste Aggregationsreaktion schützte. Tabelle III: Wirkungen der Flavonoidzugabe auf die Plättchenaggregationsreaktion nach Behandlung mit AMT und UVA

(1) Vor der Aufbewahrung über Nacht wurde die Probe mit 25 μg/ml AMT und 90 Minuten UVA gegebenenfalls in Anwesenheit des angegebenen Flavonoids behandelt.

Beispiel 8: Wirkung der Einbeziehung von Verbindungen, die sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch Typ II quenchen, auaf ein Plättchenkonzentrat während der Behandlung mit UVA und erhöhten AMT-Konzentrationen
Da nur 3log₁₀ des zellassoziierten VSV bei Verwendung einer AMT-Konzentration von 25 μg/ml inaktiviert worden waren, wurden die Wirkungen höherer AMT-Konzentrationen mit und ohne Zusatz verschiedener Quencher untersucht. Es wurden Plättchenkonzentrataliquote (3 ml) mit UVA (11 mW/cm²) 90 Minuten lang in Gegenwart von AMT mit einer Konzentration von 25, 50 oder 100 μg/ml mit oder ohne Zusatz von 0,7 mM Rutin, 0,7 mM Quercetin oder 2 mM Mannit behandelt. Die Plättchenaggregation als Reaktion auf das Collagen (5a) und die Inaktivierung des zellassoziierten VSV wurden wie in Beispiel 1 beschrieben untersucht und mitgeteilt.
Bei der Plättchenbehandlung mit 90 Minuten UVA und 25 μg/ml AMT betrug die Aggregationsreaktion auf Collagen nur etwa 35 % der Kontrolle und schützte, wie weiter oben festgestellt, die Mannitzugabe die Plättchenfunktion bei dieser Bestrahlungsbehandlung nicht. Die Aggregation wurde weiter verringert (auf weniger als 30 % mit 50 μg/ml und bis auf überhaupt keine Reaktion mit 100 μg/ml AMT) bei steigender AMT-Konzentration, ob nun Mannit vorhanden war oder nicht. Als in die Behandlung 0,7 mM Rutin einbezogen wurde, wurde die Aggregationsfunktion auf mehr als 80 % der Kontrolle bei allen untersuchten AMT-Konzentrationen (5a) erhöht. Zellfreies VSV (nicht gezeigt) wurde unter allen diesen Behandlungsbedingungen vollständig inaktiviert, und die Inaktivierung des zellassoziierten VSV betrug bei 100 μg/ml AMT und 0,7 mM Rutin (oder Quercetin) fast 6log₁₀ (5b). Somit wurde durch die Einbeziehung von Verbindungen (beispielsweise Flavonoiden wie Rutin), die sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch Typ II quenchen, während der Behandlung eines Plättchenkonzentrates mit Psoralenen und UVA die Plättchenaggregationsfunktion gut unter Bedingungen aufrechterhalten, unter welchen fast 6log₁₀ zellassoziiertes Virus in Gegenwart von Sauerstoff inaktiviert wurden.
Beispiel 9: Wirkungen der Desoxygenierung während der Behandlung eines Plättchenkonzentrates mit AMT und UVA, verglichen mit der Rutinzugabe
Plättchenkonzentrataliquote wurden mit AMT mit der angegebenen Konzentration und 90 Minuten UVA behandelt, entweder an Luft, gegebenenfalls in Anwesenheit von Rutin, oder mit der Luft in dem Reagenzglas, die gegen eine Kombination aus Stickstoff (95 %) und CO₂ (5 %) ausgetauscht worden war. Die Plättchenaggregation wurde nach Aufbewahrung über Nacht an Luft wie in Beispiel 1 bewertet. In Tabelle IV ist gezeigt, dass bei einer AMT-Konzentration von 50 μg/ml, obwohl sowohl die Desoxygenierung als auch die Rutinzugabe in der Lage war, die Plättchenfunktion nach AMT/UVA-Behandlung zu verbessern, die Ergebnisse mit Rutin von Versuch zu Versuch konsistent waren, während die mit Gasaustausch schwankender waren und häufig überhaupt keinen Vorteil zeigten.
Tabelle IV: Plättchenaggregation nach 90 Minuten AMT- und UVA-Behandlung. Wirkung von Rutin gegen Sauerstoffentfernung auf die Übereinstimmung der Ergebnisse
Beispiel 10: Verbesserte Gewinnung von Gerinnungsfaktoren bei der Behandlung von Plasma mit AMT und UVA unter Einbeziehung von Verbindungen, die sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch vom Typ II quenchen
Humanes Plasma (3-ml-Aliquote) wurde mit 25, 50, 100 oder 200 μg/ml AMT und 90 Minuten langer Bestrahlung mit UVA (11 mW/cm²) behandelt. Es wurde die Gewinnung des Gerinnungsfaktors VIII (antihämophiler Faktor, AHF) in Proben, die mit oder ohne Einbeziehung von 1, 2 oder 5 mM Rutin behandelt worden waren, verglichen. Die Ergebnisse sind in 6 gezeigt. Bei der Behandlung des Plasmas mit 25 μg/ml AMT und 90 Minuten UVA betrug die AHF-Gewinnung ohne Rutin nur 27 % der unbehandelten Kontrolle, dieser niedrige Wert sank weiter mit erhöhter Psoralen-Konzentration, und bei 200 μg/ml AMT-Behandlung betrug die Gewinnung nur 7 %.
Bemerkenswerterweise wurde die AHF-Gewinnung auf 83 % oder mehr wieder hergestellt, wenn Rutin in die Behandlung einbezogen wurde (Konzentrationen von 2 mM oder höher bei AMT-Konzentrationen von bis zu 100 μg/ml oder von 5 mM bei einer AMT-Konzentration von 200 μg/ml) und mit ≥ 25 μg/ml AMT waren diese Behandlungsbedingungen ausreichend, um mindestens 4log₁₀ des nicht entwickelten Bakteriophagen M13 zu inaktivieren).
Somit kann durch die Zugabe von Rutin, einer Verbindung, die dafür bekannt ist, dass sie sowohl photodynamische Reaktionen vom Typ I als auch Typ II quencht, während der Behandlung von Plasma mit Psoralenen und UVA eine deutliche Erhöhung der Gewinnung des Gerinnungsfaktors VIII bei vorhandenem Sauerstoff unter Bedingungen erreicht werden, unter welchen ein nicht entwickeltes Virus inaktiviert werden kann.
Der nächste Satz Beispiele, die anschließend erläutert werden, nimmt Bezug auf die "Lösungsmittel-Tensid-" und/oder "SD"-Behandlung. In jedem Fall war die Vorschrift für diese Behandlung wie folgt: AHF-Konzentrate wurden mit 0,3 % Tri(n-butyl)phosphat (TNBP) und 1 % Tween 80 6 Stunden lang bei 24°C behandelt, wonach die zugegebenen Reagenzien, wo angegeben, durch Ionenaustauschchromatographie entfernt wurden. Das Plasma wurde mit 1 % TNBP und 1 % Triton X-100 4 Stunden lang bei 30°C behandelt, wonach die zugegebenen Reagenzien durch hydrophobe Chromatographie an einem C₁₈-enthaltenden Harz entfernt wurden.
Beispiel 11: UV-Behandlung von AHF-Konzentrat ohne den Zusatz von Quenchern
Der Phage M13, ein nicht entwickeltes Virus, wurde einem AHF-Konzentrat zugegeben. Das Gemisch wurde in einer Quarzfließzelle durch einen veränderlichen Durchfluss einer variierenden UV-Strahlungsdosis unterworfen. Die UV-Lichtquelle war eine BLEIT155-Birne (Spectronic Co., Westbury, NY). Vor und nach der Bestrahlung wurde die Phagen-M13-Infektiosität durch einen Plaque-Versuch auf JM101-Wirtszellen gemessen; die AHF-Aktivität wurde in einem Blutgerinnungsversuch gemessen. Die in 7 dargestellten Ergebnisse zeigen, dass unter Bedingungen, unter welchen eine 5log₁₀-Inaktivierung des Phagen M13 erreicht wurde, die Faktor-VIII-Gewinnung geringer als 50 % war.
Beispiel 12: UV-Behandlung von Plasma in Gegenwart von Quercetin und Ascorbat
Der nicht entwickelte Phage M13 wurde zu dem Plasma zugegeben. Die Behandlung des Gemischs in Gegenwart von 0,75 mM Ascorbat und 0,20 mM Quercetin (Endkonzentration) mit 0,073 J/cm² bis 0,134 J/cm² UV führte zur Inaktivierung von 6,2 bis 6,5log₁₀ (ID₅₀) M13, während die Gewinnung von FVIII und FIX 82 bis 97 bzw. 81 bis 94 %, wie in Tabelle V gezeigt, betrug. Tabelle V
Es ist festzustellen, dass die Faktor-VIII- und Faktor-IX-Gewinnung in Gegenwart von Quenchern deutlich höher ist, während die Zugabe eines Quenchers auf die Virusabtötung keine signifikante Wirkung hat.
Beispiel 13: UV-Behandlung von AHF-Konzentrat in Gegenwart von Quercetin und Ascorbat
AHF wurde vor der Lösungsmittel-Tensid-Inaktivierungsstufe im Herstellungsverfahren mit UV bei 0,086 J/cm² nach Zugabe von EMC oder VSV behandelt. Die anderen Bedingungen waren dieselben wie in Beispiel 12 beschrieben. Tabelle VI ist zu entnehmen, dass ≥ 7,0log₁₀ EMC und VSV inaktiviert wurden. Die entsprechende FVIII-Gewinnung betrug 80,0 %, wenn bei der Bestrahlung Quencher vorhanden waren. Dies ist zu vergleichen mit 33 % ohne Quencher.
Tabelle VI
Beispiel 14: Kombinierte Behandlung von Plasma mit UV und SD
Das Virus wurde zu dem mit Lösungsmittel-Tensid behandelten Plasma gegeben und mit UV mit 0,083 J/cm² behandelt.
Tabelle VII ist zu entnehmen, dass die Abtötung von EMC ≥ 7,7, VSV ≥ 6,5 und AAV ≥ 3,0 betrug, während die Gerinnungsfaktorgewinnung im Allgemeinen 79 bis 105 % und die Fibrinogenausbeute 107 bis 113 % betrug, wenn Quencher vorhanden waren. Diese Werte sind 30 bis 50 % besser als ohne Quencher. Auch hier wieder war unter diesen Bedingungen die Virusabtötung nicht beeinflusst. Tabelle VII
Beispiel 15: Kombinierte Behandlung von AHF-Konzentrat mit UV und SD
Ein mit Lösungsmittel/Tensid behandeltes Faktor-VIII-Konzentrat, das in 10,0 ml Wasser pro Reagenzglas rehydratisiert worden war, wurde mit dem Poliovirus Typ II, das ein nicht lipidumhülltes kleines Markervirus ist, beimpft. Eine Behandlung mit UV mit 0,083 J/cm² führte zu ≥ 5,0log₁₀-Inaktivierung. FVIII-Ausbeute betrug 81 bis 94 %. Die entsprechenden Werte ohne einen Quencher waren 30 bis 40 % niedriger. In einem weiteren Beispiel, in welchem AHF-Konzentrat, das mit HAV (Hepatitis-A-Virus) beimpft worden war, behandelt wurde, betrug die HAV-Abtötung ≥ 4log, während die FVIII-Gewinnung ähnlich wie zuvor war. Die Ergebnisse sind in Tabelle VIII zusammengefasst. Tabelle VIII
Beispiel 16: Behandlung von Plasma mit UVC in Gegenwart unterschiedlicher Quencher
Plasma wurde mit UV mit 0,064 bis 0,09 J/cm² in Gegenwart verschiedener Quencher behandelt. In Tabelle IX ist die Gewinnung von verschiedenen Faktoren und Fibrinogen unter den Behandlungsbedingungen gezeigt. Basierend auf dem Vorhergehenden ist die Erhaltung von Gerinnungsfaktoren und Fibrinogen-Aktivität am besten, wenn die UV-Behandlung in Gegenwart der Flavonoide, gegebenenfalls mit zugegebenem Ascorbat oder Histidin, stattfindet. Dabei ist es wichtig festzustellen, dass durch das Vorhandensein dieser Quencher die Abtötung der getesteten Markerviren nicht verschlechtert wurde. Tabelle IX
Beispiel 17: FVIII-Gewinnung in UV-behandeltem Plasma mit verschiedenen Quencherkonzentrationen (Ascorbat und Quercetin)
Lösungsmittel/Tensid-behandeltes Plasma wurde mit UV mit 0,0865 J/cm² in Gegenwart verschiedener Quercetinkonzentrationen (0 bis 1,75 mM) behandelt, während die End-Ascorbatkonzentration im Plasma auf 0,50 mM konstant gehalten wurde. Umgekehrt wurde die End-Quercetinkonzentration auf 0,20 mM konstant gehalten, während verschiedene Ascorbatkonzentrationen (0 bis 1,50 mM) zugegeben wurden. Das Ziel bestand darin, die besten – optimalen – Gehalte dieser Verbindungen zu bestimmen. Die in den 8a und 8b dargestellten Ergebnisse zeigen, dass alle diese Stabilisatoren selbstbegrenzend waren. Quercetin hatte einen Peak bei 0,20 mM. Ascorbat hatte ein breiteres Maximum bei 0,75 bis 1,25 mM.
Beispiel 18: Kinetik der Virus-(M13-)Abtötung in Plasma und Plasmaderivat (Lösungsmittel/Tensid-behandelter AHF) bei verschiedenen UV-Dosen (254 nM)
Frisch eingefrorenes Plasma und Lösungsmittel/Tensidbehandelter AHF wurden unabhängig voneinander mit dem Phagen M13 beimpft und danach mit verschiedenen UV-Dosen (0 bis 0,6 J/cm²) in Gegenwart von Quenchern (0,75 mM Ascorbat und 0,2 mM Quercetin) behandelt. Der Durchfluss variierte mit jeder UV-Dosis. Die Ergebnisse, die in den 9a (behandeltes AHF-Konzentrat) und 9b (behandeltes FFP) veranschaulicht sind, zeigen, dass bei der Behandlung mit 0,04 bis 0,13 J/cm², in welcher eine mindestens 5log₁₀-Inaktivierung des Phagen M13 erhalten wurde, die Faktor-VIII-Gewinnung besser als 80 % war.
Beispiel 19: Behandlung eines roten Blutzellkonzentrats mit Röntgenstrahlung und einem bromierten Sensibilisator
Ein rotes Blutzellkonzentrat wurde in Gegenwart eines bromierten Hämatoporphyrinderivats mit Röntgenstrahlung behandelt. Durch das Vorhandensein von 1 mM Rutin wurde die rote Zellhämolyse von 8 % auf weniger als 2 % gesenkt. Die wie bei M13 gemessene Virusabtötung überstieg in jedem Fall 5log₁₀.
Beispiel 20: Behandlung eines Plasmas mit Gammastrahlung
Frisch eingefrorenes Plasma wurde mit 40 kGy Gammastrahlung behandelt. Die Gewinnung des Gerinnungsfaktors IX betrug 77 % ohne Rutin und 90 % in Gegenwart von 2 mM Rutin. Die VSV-Abtötung überstieg in jedem Fall 5log₁₀.
Beispiel 21: Quencher-verstärkte Photoinaktivierung von Viren
Das Folgende sind zusätzliche Beispiele, welche die Schlussfolgerung unterstützen, dass die Spezifität der Virusabtötung in Zellkomponenten und Proteinlösungen durch photoaktive Vorgänge entweder durch ein Typ-I-Typ-II-Quencher-Gemisch oder einen bifunktionellen Quencher verbessert werden kann.
(AlPcS₄, Aluminiumphthalocyanintetrasulfonat; AMT, Aminomethyltrimethylpsoralen; MB, Methylenblau, Quer., Quercetin; Asc., Ascorbat)
Unter Voraussetzung des bisher Bekannten, wird die Virusabtötung wie folgt abgeleitet: Vorhergesagte Virusabtötung bei kombinierter S/D-UV-Behandlung
Die für die UV-Behandlung angegebenen Werte wurden in Gegenwart von 0,75 mM Ascorbat und 0,20 mM Quercetin und einer Energiefluenz von 0,086 J/cm² erhalten. Die Gerinnungsfaktorgewinnung betrug 80 bis 90 %.
Beispiel 22: Lymphocyteninaktivierung und Erhaltung von RBC- und Plättchenintegrität
1. Bestrahlung mit γ-Strahlen

a) γ-Bestrahlung von RBCCs: RBCCS wurden durch γ-Bestrahlung mit einer Dosis von 15, 25 oder 50 Gy (1 Gy = 1 Gray = 100 Rads) unter Verwendung einer Cobalt-60-Quelle, gegebenenfalls in Anwesenheit von 0,5, 1 oder 2 mM Rutin, behandelt. Die Lymphocyteninaktivierung wurde durch Messung der ³H-Thymidin-Aufnahme nach Mitogen-(2 % PHA Endkonzentration)Stimulierung bestimmt. Extrazelluläres (Plasma-)Kalium wurde nach sieben Tagen Aufbewahrung bei 4°C gemessen und mit nicht bestrahlten Kontrollen verglichen. Bestrahlte Lymphocyten behielten nur 1,5 % ihrer ³H-Thymidinaufnahme nach einer Bestrahlung mit 15 Gy und keine nach 50 Gy, wobei dies unabhängig von dem Vorhandensein oder der Konzentration eines Quenchers (Rutin) war. Das extrazelluläre Kalium stieg mit der sich erhöhenden Strahlungsdosis und sank auf die Kontrollgehalte durch das Vorhandensein von 2 mM Rutin. Bei 50 Gy γ-Strahlung waren die Lymphocyten vollständig inaktiviert, und Plasma-K⁺ betrug 80 mM ohne Quencher und 40 mM, wenn 2 mM Rutin während der Behandlung vorhanden waren. Somit können Quencher verwendet werden, um die Spezifität einer γ-Bestrahlung von RBCCs für eine Lymphocyteninaktivierung zu erhöhen.
b. RBC-Proben wurden zunächst mit AlPcS₄ und Licht und anschließend durch γ-Strahlung in Gegenwart von Flavonoiden behandelt: Nach Behandlung eines RBCC (verdünnt mit demselben Volumen PBS) mit 6,5 μM AlPcS₄ mit 44 J/cm² sichtbarem Licht in Gegenwart von 4 mM GSH wurden die Proben mit 25 Gy γ-Strahlung in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 mM oder 2 mM Rutin bestrahlt. Plasmakalium wurde nach zwei und nach sieben Tagen Aufbewahrung nach der Behandlung gemessen und mit unbehandelten Kontrollen und mit nur mit AlPcS₄ behandelten RBCs verglichen. (Zusätzlich wurde, um die Wirkung der Rutinzugabe auf den K⁺-Austritt bei Aufbewahrung nach AlPcS₄-Behandlung zu untersuchen, eine mit AlPcS₄ behandelte Probe, die nicht mit γ-Strahlung behandelt worden war, in Gegenwart von 2 mM Rutin aufbewahrt.) Die Lymphocyteninaktivierung und der K⁺-Austritt wurden wie zuvor in a. gemessen. Durch die zur AlPcS₄-Behandlung zusätzliche γ-Bestrahlung wurde die RBC-Schädigung erhöht (Plasma-K⁺ nach zwei Tagen betrug 75 mM mit und 60 mM ohne γ-Bestrahlung), sofern das Flavonoid Rutin während der γ-Bestrahlung und Aufbewahrung (25 mM bei zwei Tagen, 40 mM bei sieben Tagen) nicht vorhanden war. Zusätzlich zeigten, wenn die Aufbewahrung nach der Behandlung in Gegenwart von 2 mM Rutin erfolgte, RBCs einen geringeren Kaliumaustritt nach AlPcS₄-Behandlung mit oder ohne zusätzliche γ-Bestrahlung.
c. PCs: PCs wurden mit γ-Strahlung mit einer Dosis von 15, 25 oder 50 Gy unter Verwendung einer Cobalt-60-Quelle in Anwesenheit oder Abwesenheit von 1 bzw. 2 mM Rutin behandelt. Die Lymphocyteninaktivierung wurde durch die ³H-Thymidinaufnahme nach Mitogenstimulation wie weiter oben in 1a. bestimmt. Die Plättchenintegrität wurde durch die Aggregationsreaktion (Anfangsanteil, verglichen mit der unbehandelten Kontrolle) auf 40 μM Arachidonsäure und 10 μg/ml ADP am ersten und dritten Tag nach der Aufbewahrung bestimmt. Wie bei RBCCs behielten die bestrahlten Lymphocyten in PCs nur 1,5 % ihrer ³H-Thymidinaufnahme nach einer Bestrahlung mit 15 Gy und keine nach 50 Gy, wobei dies unabhängig vom Vorhandensein einer Rutinkonzentration war. Die Plättchenaggregation, die mit steigender Strahlungsdosis abnahm (90 % bei 15, 80 % bei 25 und 70 % der Kontrolle bei 50 Gy nach 1 Tag) wurde durch das Vorhandensein von 2 mM Rutin nahe an die Kontrollanteile (95 %) zurückgebracht. Bei 50 Gy γ-Strahlung waren die Lymphocyten vollständig inaktiviert und betrug der Aggregationsanteil nach drei Tagen Aufbewahrung 50 % der Kontrolle ohne Quencher und 80 % der Kontrolle, wenn während der Behandlung 2 mM Rutin vorhanden waren. Somit können Quencher zur Erhöhung der Spezifität der γ-Bestrahlung von PCs für eine Lymphocyteninaktivierung verwendet werden.

2. UVB-Bestrahlung von PCs:
PCs von Hunden wurden mit 36 mJ/cm² UVB (eine Dosis, von welcher bekannt ist, dass sie eine HLA-Alloimmunisierung verhindert; Slichter et al., Blood, 69, 414–418 (1987)) in Anwesenheit oder Abwesenheit von 2 mM Rutin bestrahlt. Die behandelten Blutplättchen wurden radiomarkiert (⁵¹Chrom) und infusioniert. Das Überleben von UV-exponierten Spenderplättchen war auf 2,5 Tage verringert, wenn die Behandlung ohne Rutin durchgeführt wurde, das Überleben war jedoch dasselbe wie in unbehandelten autologen Hundeblutplättchen (5 Tage), wenn die Bestrahlung in Gegenwart von Rutin durchgeführt wurde.

Claims

Verfahren zum Inaktivieren eines extrazellulären oder intrazellulären gegebenenfalls entwickelten Virus, das in einer biologischen Zusammensetzung vorhanden sein kann, die mindestens eine einer Zellen enthaltenden biologischen Zusammensetzung und einer fluiden biologischen Zusammensetzung umfasst, wobei das Verfahren das Aussetzen der biologischen Zusammensetzung einer viruziden Menge einer I) UV- oder g-Strahlung oder II) einer UV-, g-, Röntgen- oder sichtbaren Lichtstrahlung und eines Sensibilisators in Gegenwart von a) einem Gemisch aus mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ I quencht, und mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ II quencht, b) einer Quenchingverbindung, die beide Reaktionstypen I und II quencht, oder c) einem Gemisch aus einer Quenchingverbindung, die sowohl die Reaktion vom Typ I als auch die vom Typ II quencht, und einer zusätzlichen Quenchingverbindung umfasst, wobei die Quenchingverbindung, die sowohl eine Reaktion vom Typ I als auch eine vom Typ II quencht, in b) und c) mit einer Konzentration von mindestens 0,2 mM vorhanden ist und die Beibehaltung der intakten Zellfunktionsfähigkeit und Struktur von über 70 % für die Zellen enthaltende Zusammensetzung und die Beibehaltung der biologischen Aktivität von über 75 % für das biologische Fluid erhalten wird.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Zusammensetzung einer viruziden Strahlungsmenge in Gegenwart eines Gemischs aus mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ I quencht, und mindestens einer Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ II quencht, ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 2, wobei die Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ I quencht, mindestens eine von Mannit, Glycerin, Glutathion und Superoxiddismutase ist und die Quenchingverbindung, die photodynamische Reaktionen vom Typ II quencht, mindestens eine von α-Tocopherolphosphat, Tryptophan und Histidin ist.
Verfahren nach Anspruch 1, wobei die biologische Zusammensetzung einer viruziden Strahlungsmenge in Gegenwart einer Quenchingverbindung, die sowohl Reaktionen vom Typ I als auch solche vom Typ II quencht, ausgesetzt wird.
Verfahren nach Anspruch 4, wobei die Quenchingverbindung, die sowohl Reaktionen vom Typ I als auch solche vom Typ II quencht, ein Flavonoid ist.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei die Quenchingverbindung mit einer Konzentration von zwischen 0,2 und 5 mM vorliegt.
Verfahren nach Anspruch 5, wobei das Flavonoid aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Quercetin, Chrysin, Catechin, Rutin, Hesperidin und Naringin besteht.
Verfahren nach Anspruch 4, das weiterhin eine zusätzliche Quenchingverbindung umfasst.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der zusätzliche Quencher eine Aminosäure ist, die aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Tryptophan und Histidin besteht.
Verfahren nach Anspruch 8, wobei der zusätzliche Quencher ein Vitamin ist, das aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Ascorbat und α-Tocopherolphosphat besteht.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 10, wobei die biologische Zusammensetzung rote Blutzellen enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die biologische Zusammensetzung ³ 1·109 Zellen/ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 11, wobei die biologische Zusammensetzung aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus Vollblut und roten Zellkonzentraten besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die biologische Zusammensetzung Blutplättchen enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die biologische Zusammensetzung ³ 1·109 Zellen/ml enthält.
Verfahren nach Anspruch 14, wobei die biologische Zusammensetzung ein Plättchenkonzentrat ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 10, wobei die biologische Zusammensetzung mindestens einen Koagulationsfaktor enthält.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei die biologische Zusammensetzung von Zellen abgeleitet ist.
Verfahren nach Anspruch 18, wobei die von Zellen abgeleitete biologische Zusammensetzung humanes Plasma ist.
Verfahren nach Anspruch 17, wobei der Koagulationsfaktor aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus den Faktoren V, VII, VIII, IX und XI und Fibrinogen besteht.
Verfahren nach Anspruch 20, wobei der Koagulationsfaktor der Faktor VIII ist.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 21, wobei die biologische Zusammensetzung einer Bestrahlung und der/den Quenchingverbindung/en in Gegenwart eines Strahlungssensibilisators unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Strahlungssensibilisator ein Psoralen ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei die Strahlung UVA ist.
Verfahren nach Anspruch 23, wobei das Psoralen 4'-Aminomethyl-4,5',8-trimethylpsoralen ist.
Verfahren nach Anspruch 22, wobei der Strahlungssensibilisator ein bromiertes Hämatoporphyrin ist.
Verfahren nach den Ansprüchen 1 bis 26, wobei die biologische Zusammensetzung, die der Bestrahlung und der/den Quenchingverbindung/en ausgesetzt wird, entweder vorher, danach oder gleichzeitig mindestens einem anderen viruziden Verfahren unterworfen wird.
Verfahren nach Anspruch 27, wobei das andere viruzide Verfahren aus der Gruppe ausgewählt wird, die aus einer pH-Wert-Änderung, Wärme-, Lösungsmittel- und/oder Tensid-, g-Strahlungs- und Formaldehydbehandlung besteht.
Verfahren nach Anspruch 26, wobei das andere viruzide Verfahren mindestens eine von Lösungsmittel- und Tensidbehandlung ist.
Verfahren nach Anspruch 29, wobei mindestens eine von Lösungsmittel- und Tensidbehandlung aus einer Behandlung mit Tri(n-butyl)phosphat und Triton X-100 besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 30, wobei die biologische Zusammensetzung ein extrazelluläres oder intrazelluläres Virus enthält, das aus der Gruppe ausgewählt ist, die aus vesikulärem Stomatitis-Virus, Enzephalomyokarditis-, HI-, Hepatitis-A-, Hepatitis-B-, Non-A- und Non-B-Hepatitisvirus, adeno-assoziiertem Virus, M13- und Poliovirus besteht.
Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 31, wobei die Strahlung UV-, g- und Röntgenstrahlung oder sichtbares Licht ist.
Verfahren nach Anspruch 32, wobei die Strahlung UVA, UVB oder UVC ist.