FI117288B - Menetelmä virusten inaktivoimiseksi - Google Patents

Menetelmä virusten inaktivoimiseksi Download PDF

Info

Publication number
FI117288B
FI117288B FI955690A FI955690A FI117288B FI 117288 B FI117288 B FI 117288B FI 955690 A FI955690 A FI 955690A FI 955690 A FI955690 A FI 955690A FI 117288 B FI117288 B FI 117288B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
virus
type
radiation
compound
treatment
Prior art date
Application number
FI955690A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI955690A0 (fi
FI955690A (fi
Inventor
Bernard Horowitz
Bolanle Williams
Henrietta Margolis-Nunno
Sing N Chin
Original Assignee
New York Blood Ct Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by New York Blood Ct Inc filed Critical New York Blood Ct Inc
Publication of FI955690A0 publication Critical patent/FI955690A0/fi
Publication of FI955690A publication Critical patent/FI955690A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI117288B publication Critical patent/FI117288B/fi

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0023—Agression treatment or altering
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N13/00—Treatment of microorganisms or enzymes with electrical or wave energy, e.g. magnetism, sonic waves
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0038—Radiosensitizing, i.e. administration of pharmaceutical agents that enhance the effect of radiotherapy
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0066—Psoralene-activated UV-A photochemotherapy (PUVA-therapy), e.g. for treatment of psoriasis or eczema, extracorporeal photopheresis with psoralens or fucocoumarins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/0057—Photodynamic therapy with a photosensitizer, i.e. agent able to produce reactive oxygen species upon exposure to light or radiation, e.g. UV or visible light; photocleavage of nucleic acids with an agent
    • A61K41/0071—PDT with porphyrins having exactly 20 ring atoms, i.e. based on the non-expanded tetrapyrrolic ring system, e.g. bacteriochlorin, chlorin-e6, or phthalocyanines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K41/00—Medicinal preparations obtained by treating materials with wave energy or particle radiation ; Therapies using these preparations
    • A61K41/10—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person
    • A61K41/17—Inactivation or decontamination of a medicinal preparation prior to administration to an animal or a person by ultraviolet [UV] or infrared [IR] light, X-rays or gamma rays
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0011—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using physical methods
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61L—METHODS OR APPARATUS FOR STERILISING MATERIALS OR OBJECTS IN GENERAL; DISINFECTION, STERILISATION OR DEODORISATION OF AIR; CHEMICAL ASPECTS OF BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES; MATERIALS FOR BANDAGES, DRESSINGS, ABSORBENT PADS OR SURGICAL ARTICLES
    • A61L2/00—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor
    • A61L2/0005—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts
    • A61L2/0082—Methods or apparatus for disinfecting or sterilising materials or objects other than foodstuffs or contact lenses; Accessories therefor for pharmaceuticals, biologicals or living parts using chemical substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
    • C12N7/04—Inactivation or attenuation; Producing viral sub-units
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/20011—Rhabdoviridae
    • C12N2760/20211—Vesiculovirus, e.g. vesicular stomatitis Indiana virus
    • C12N2760/20261—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2760/20263—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2770/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses positive-sense
    • C12N2770/00011—Details
    • C12N2770/32011—Picornaviridae
    • C12N2770/32611—Poliovirus
    • C12N2770/32661—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2770/32663—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2795/00—Bacteriophages
    • C12N2795/00011—Details
    • C12N2795/10011—Details dsDNA Bacteriophages
    • C12N2795/10111—Myoviridae
    • C12N2795/10161—Methods of inactivation or attenuation
    • C12N2795/10163—Methods of inactivation or attenuation by chemical treatment

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Apparatus For Disinfection Or Sterilisation (AREA)
  • Agricultural Chemicals And Associated Chemicals (AREA)
  • Food Preservation Except Freezing, Refrigeration, And Drying (AREA)

Description

117288
Menetelmä virusten inaktivoimiseksi - Förfarande för inakti-vering av ett virus
Hallituksen oikeudet Tätä työtä on osittain tuettu National Heart, Lung and Blood Instituten suostumuksella nro HL 41221.
Tämä hakemus on jatkohakemus US-hakemukselle sarjanumeroltaan 08/031,787, joka on jätetty 15. maaliskuuta 1993, ja joka puolestaan on jaettu hakemus US-hakemuksesta sarjanumeroltaan 07/706,919, jätetty 29. toukokuuta 1991, nyt hyväksytty, ja joka puolestaan on jatkohakemus US-hakemukselle sarjanumeroltaan 07/524,208, jätetty 15. toukokuuta 1990, ja on nykyisin US-patentti nro 5,120,649.
Keksinnön tausta Keksinnön alue Tämä keksintö koskee menetelmää tehdä biologinen koostumus olennaisesti vapaaksi niissä olevista kapselillisista ja kap- .···. selittomista viruksista, ilman että olennaisesti hajotetaan * * 1' tai inaktivoidaan niissä olevia soluja, ja ilman että merkit- * » · ' . tävästi hävitetään niissä myös olevia labiileja proteiineja * * · /··* tai muita arvokkaita biologisia komponentteja.
« « · • · · ··· i * » • » · : Tekniikan tason kuvaus * * · * * · « i · •
Ongelmiin, jotka liittyvät viruksia hävittävien menetelmien käyttöön biologisiin koostumuksiin, sekä yrityksiin, joita tä-hän mennessä on tehty näiden ongelmien voittamiseksi, kuten ·*« *. valon ja kemiallisten aineiden käyttäminen, on lyhyesti vii- • · · tattu US-patentissa nro 5,120,649, joka on liitetty tähän yh-·...* teyteen viitteeksi. Katso siinä oleva palsta 1, rivi 27 - palsta 4, rivi 41.
* * » • «
Erilaisia fotodynaamisia sterilointimenetelmiä on arvioitu niiden veren solukomponenteissa olevien virusten inaktivointi-kyvyn suhteen. Vaikka monet näistä näyttävät lupaavilta pu- 2 117288 nasolukonsentraattien käsittelyyn (Matthews et al., "Photodynamic therapy of viral contaminants with potential for blood banking applications", Transfusion. 28.:81-83 (1988); O'Brien et al., "Evaluation of merocyanine 540-sensitized photoirradiation as a means to inactivate enveloped viruses in blood products", J. Lab. Clin, Med.. 116:439-47 (1990); ja Horowitz et al·, "Inactivation of viruses in blood with aluminum phtha-locyanine derivatives", Transfusion, 31:102-8 (1991)), ovat fotodynaamiset virusten inaktivointimenetelmät, jotka perustuvat pelkästään hapesta riippuvaisiin reaktioihin, osoittautuneet tähän mennessä soveltumattomiksi verihiutalekonsentraat-tien käsittelyyn (Proudouz et al·, "Inhibition by albumine of merocyanine 540-mediated photosensitization of platelets and viruses", Transfusion, 3^1:415-22 (1991); Dodd et al., "Inactivation of viruses in platelet suspensions that retain their in vitro characteristics: comparison of psoralen-ultraviolet A and merocyanine 540-visible light methods", Transfusion. 31:483-90 (1991); ja Horowitz et al·, "Inactivation of viruses in red cell and platelet concentrates with aluminum phthalocy-anine (AIPc) sulfonates", Blood Cells- 18:141-50 (1992)).
Eräs viimeisimmistä kehitysaskeleista on valoaktiivisten yhdisteiden käyttäminen. Katso esim. US-patentti nro 5,120,649 ···. ja US-hakemus sarjanro 07/706,919, jätetty 29. toukokuuta « s 1991. Psoraleenin yhdessä UVA:n kanssa on osoitettu tappavan * · · viruksia sekä soluja sisältävissä että soluttomissa liuoksissa • · *·; ilman tarpeetonta vauriota arvokkaille komponenteille, joita »s * |-·: tarvitaan verensiirtoon. Metyleenisinista yhdessä näkyvän va- ί.:: lon kanssa käytetään kokoplasman käsittelyyn. Ftaalosyaniinien *.* * ja muiden hemeanalogien soveltuvuutta yhdessä näkyvän valon kanssa punaisten verisolujen konsentraattien ja muiden veri-komponenttien käsittelyyn ollaan tutkimassa.
• «t • « 9 • « · • Käsittelyn psoraleeneilla ja pitkäaaltoisella ultraviolettiva-... lolla (UVA) tiedetään synnyttävän erilaisia biokemiallisia vaikutuksia, kuten happiriippuvaiset vuorovaikutukset nukle-iinihappojen kanssa (esim. psoraleeni-DNA-monoadduktin muodos-tuminen ja DNA:n ristisilloittuminen), ja fotodynaamisen luon- • * 117288 3 teen omaavat hapesta riippuvaiset reaktiot (katsauksen saamiseksi katso Gasparro, F.P. (toin.) (1988) Psoralen DMA Photo-biolocrv. Voi I, Voi II, CRC Press, Boca Roton, FL) . Vastoin puhtaasti fotodynaamisia punasoluille sopivia menetelmiä (edellä), on psoraleenien ja UVA:n käyttö osoittautunut lupaa-vaksi keinoksi inaktivoida valon avulla viruskontaminantteja verihiutalekonsentraateissa, vaikka useimmissa tutkimuksissa (Lin et ai*, "Use of 8-methoxypsoralen and long-wavelength ultraviolet radiation for decontamination of platelet concentrates", Blood* ΤΙ\5Π-525 (1989); ja Dodd et ai., edellä, ami-nomethyltrimethylpsoralen (AMT)), suurten virusmäärien inakti-voinnin ja verihiutaleiden toiminnan säilyttämisen yhdistelmä oli mahdollista vain, kun ilma vaihdettiin typpeen ennen UVA-säteilytystä, vaivalloinen menetelmä ilman luontaista muuntelua* Äskettäin kuitenkin osoitettiin (Margolis-Nunno et ai., "Virus Sterilization in Platelet Concentrates with Psoralen and OVA in the Presence of Quenchers", Transfusion. 22:541-547 (1992)), että > 6,0 log10 soluvapaan rakkulaista suutulehdusta aiheuttavan viruksen (VSV) inaktivomiseksi AMT:llä ja UVAslla hapenpoiston tarve keinona suojata verihiutaleita voitiin välttää käyttämällä mannitolia, vapaiden radikaalien huuhteli-jaa (sammuttajaa)* (Sammuttajien lisäämistä tyypin I (vapaara-dikaalivälitteiset) tai tyypin II (singlet-happivälitteiset) •*\ fotodynaamisiin reaktioihin käytetään usein muissa yhteyksissä l\\ erottamaan, mikä aktiivinen happilaji tuottaa kunkin foto- • · · dynaamisen vaikutuksen.) Tässä tutkimuksessa käytetyissä olo-
* ; suhteissa, s.o* 25 μg/ml AMT ja 30 minuuttia UVA:ta sekä 2 mM
* · · : mannitolia, soiuttoman VSV:n inaktivointi ilmassa oli osittain * * •*2 : happiriippuvainen, koska ekvivalenttinen viruksen tappaminen # *· : (> 6,0 log10) happi poistettuna vaati 3-4 kertaa pitemmän UVA- säteilytysajan (90 minuuttia - 2 tuntia).
m t « * • · » • *
Kuitenkin samalla, kun näillä menetelmillä saavutettiin se, * ' , että tapettiin suuri määrä soluttomia lipidikapselillisiä vi-
Mf#* ruksia ja aktiivisesti replikoituvia, soluun liittynyttä vi- f ♦ .·** rusta, eivät kapselittomat virukset ja latentit soluun liitty-neet virukset kuolleet kovin suuressa määrin näissä raportoi- *\J duissa olosuhteissa. Sen vuoksi näiden jälkimmäisten virusmuo- i 117288 4 tojen kuoleminen täytyi aikaansaada aiheuttamatta merkittävää vahinkoa halutuille, arvokkaille komponenteille biologisessa seoksessa. Olosuhteet, jotka johtavat siihen, että > 10* infek-toivaa annosta latenttia tai kapselitonta virusta kuolee, ovat osoittautuneet sellaisiksi, että ne muuntavat punaisia verisoluja ja verihiutaleita, ja johtavat labiilien proteiinien, kuten faktori VIII:n, huonompaan talteensaamiseen.
Eräs menestyksellisimmistä lukuisista menetelmistä, jotka on kehitetty inaktivoimaan viruksia biologisissa nesteissä, on käsittely orgaanisilla liuottimilla ja detergenteillä; erityisesti käsittely tri(n-butyyli)fosfaatilla (TNBP) ja ionitto-milla detergenteillä, kuten Tween 80 tai Triton X-100. Katso esim. US-patentti nro 4,540,573. Tämä menetelmä johtaa erinomaiseen labiilien proteiinien, esim. koaguloivan faktorin VIII ja IX, talteenottoon, samalla kuin suuri määrä virusta kuolee, esim. tapetaan > 106 - > 108 ID kapselillisia viruksia; kapselittomat virukset inaktivoituvat kuitenkin vain vähän. Katso myös US-patentti nro 4,481,189, jossa virusten inakti-vointi tapahtuu käsittelemällä ionittomalla detergentillä, alkoholeilla, eettereillä tai niiden seoksilla.
Muita virusten inaktivointimenetelmiä, joita tavallisesti käy- ·". tetään biologisiin nesteisiin, ja joita voidaan käyttää veren- ,··*, siirtotapahtumassa, on lämpökäsittely lämpötiloissa >60° tai * * * käsittely UVC:llä yhdessä B-propiolaktonin (B-PLJ kanssa. Kum-,*; pikin näistä käsittelyistä johtaa joko merkittävään labiilien * 4 « / proteiinien häviämiseen ja/tai epätäydelliseen virusten tappa- J * * ·· : miseen. Katso esim. Horowitz, B., Biotechnology of Blood. "In- *.* * activation of viruses found with plasma proteins”, Goldstein, J., toim., Butterworth-Heinemann, Stoneham, 417-432 (1991).
; Lisäksi B-PLsn hyväksyminen käyttöön on ollut hidasta, koska ·*;*: se on karsinogeeninen. Uudempia menetelmiä, jotka on tarkoi- i * . tettu lisäämään virusturvallisuutta, on kehitteillä. Gamma- säteilyn käyttäminen on ollut tutkimuksen kohteena laborato- I · *··* riossa, mutta ei ole tähän mennessä käytetty käsiteltäessä ;\i kaupallisesti saatavaa tuotetta. Katso Horowitz, B. et ai., * s i\: "Inactivation of viruses in labile blood derivatives 1. Dis- * « 5 117288 ruption of lipid-enveloped viruses by tri(n-butyl)phosphate/ detergent combinations”, julkaisussa Transfusion. 25:516-521 (1985); ja Singer et al., "Preliminary Evaluation of Phtalocy-anine Photosensitization For Inactivation Of Viral Pathogens in Blood Products", [tiivistelmä] British J. Hematology, maaliskuu 23-25 (1988: abs. 31). On kehitetty suodattimia, jotka näyttävät poistavan > 10fi ID50 kutakin useista viruksista; kuitenkaan pienten virusten, kuten parvoviruksen tai hepatiitti A-viruksen, ei odotettaisi poistuvan täydellisesti. Lisäksi ei tiedetä, voidaanko näitä suodattimia valmistaa kaupallisiin tarkoituksiin sillä koostumuksella, jota tarvitaan virusturvallisuuteen .
Huolimatta näistä edistymisistä tarvitaan jatkuvasti uusia menetelmiä, joilla pystytään tappamaan suuria määriä sekä kap-selillisia että kapselittomia viruksia, ilman että menetetään merkittävästi labiileja proteiineja tai muita arvokkaita biologisia komponentteja.
Keksinnön yhteenveto Tämän keksinnön kaikenkaikkinen tarkoitus oli saada tapahtumaan suurten määrien inaktivoituminen sekä kapselillisia että ***. kapselittomia viruksia biologisissa koostumuksissa, ilman että tapahtuu olennaista sellaisten solujen hajoamista tai inakti- ...
voitumista, joiden on tarkoitettu olevan mukana, ja ilman että „merkittävästi häviää labiileja proteiineja tai muita arvokkai- * 1 v ta biologisia komponentteja, joita myös on mukana. Tämä tar- s · koitus saavutettiin tässä keksinnössä, joka koskee yleisesti * 1 i : menetelmää inaktivoida solunulkoista ja solunsisäistä virusta biologisessa koostumuksessa, ilman että aiheutetaan sen olen-naista hajoamista tai inaktivoitumista, jolloin mainittu mene-:1Γ: telmä käsittää sen, että koostumus altistetaan viruksia tappa- ββ1β. valle määrälle säteilyä siten, että läsnä on (a) seos yhdis-teestä, joka sammuttaa tyypin I fotodynaamisia reaktioita ja | ·;' yhdisteestä, joka sammuttaa tyypin II fotodynaamisia reaktioi-:\j ta, tai (b) bifunktionaalinen yhdiste, joka pystyy sammutta- maan sekä tyypin I että tyypin II reaktioita, jolloin kyseinen 6 117288 virus inaktivoituu samalla kuin koostumuksen funktionaalisuus säilytetään· Keksinnön menetelmää voidaan siis käyttää inakti-voimaan viruksia kokoveressä, punasolukonsentraateissä ja ve-rihiutalekonsentraateissa, ilman että vaikutetaan haitallisesti punasolun tai verihiutaleen rakenteeseen tai toimintaan· Samoin voidaan keksinnön menetelmää käyttää inaktivoimaan viruksia biologisissa koostumuksissa ilman, että aiheutetaan olennaista inaktivoitumista halutuissa, liukoissa biologisissa aineissa (esim. koaguloitumisfaktorikonsentraatit, hemoglo-biiniliuokset), joita niihin sisältyy.
Keksinnön toisen piirteen mukaisesti keksinnön menetelmä on edullinen suoritettuna säteilylle herkistävän aineen läsnäollessa.
Vielä muun keksinnön piirteen mukaisesti keksinnön menetelmä on edullinen yhdistettynä erilaisen viruksia tappavan menetelmän kanssa lisäämään virusten inaktivoitumista.
Joko plasman tai AHF-konsentraattien UV-käsittely yksinään johtaa siihen, että suhteellisen suuri määrä koaguloivan faktorin aktiivisuutta häviää niissä olosuhteissa, joissa kuolee > 105 IDS0 virusta; on kuitenkin havaittu, että tämä hävikki ···, alenee merkittävästi (s.o. talteensaaminen on suuri), kun li- ' sätään fotodynaamisen reaktion sammuttajia ennen UV-käsitte- • * < lyä. Vertaa Murray et ai., "Effect of ultraviolet radiation on „*; the infectivity of icterogenic plasma", julkaisussa JAMA. 157: * * j·! ! 8-14 (1955); ja myöhemmin Kallenbach et al., "Inactivation of • * · ·.: : viruses by ultraviolet light" julkaisussa Morgenthaler J-J,
It· *.· : toim., "Virus inactivation in plasma products", Cum stud Hema- tol Blood Transfus.. 56:70-82 (1982). Niinpä yhdistetty käsitit: tely tämän keksinnön mukaan johtaa erittäin suuren virusmäärän :*·* kuolemiseen samalla kun koaguloitumisfaktorin aktiivisuus säi-* * . lyy suuressa määrin.
| * *«·* Veren solukomponenttien gammasäteilytys on valintatekniikka estää verensiirtoon liittyvä (TA) graft-versus-host-sairaus B · (GVHD), kuten on UVB-säteily PC:lle HLA-alloimmunisäätiön eh- • « 7 käisyyn. Jonkin verran huonontumista näyttää liittyvän RBC:n (kaliumvuoto säilytyksessä) ja verihiutaleiden (alentunut vuotoajan korjaus) ehjyyteen nykyisten säteilytysoheiden kanssa (Linden, J.V. and Pisciotto, P. 1992, "Transfusion associated graft-versus-host disease and blood irradiation," Trans. Med. Rev.. 6.:116-123). Sammuttajien (esim* flavonoidien) tai sam-muttajaseoksien lisääminen gammasäteilyn tai UVB-säteilyn aikana, jotka sammuttavat sekä tyypin I että tyypin II valoreak-tiotuotteet, ehkäisee RBC:den ja verihiutaleiden vauriota niissä olosuhteissa, joissa WBC:t inaktivoituvat tai muuten muuttuvat. Viimeaikaiset raportit aktiivisista happilajeista pääasiallisina myötävaikuttajina kaliumvuotoon ja punasolumem-braanin vaurioitumiseen, jota gammasäteily aiheuttaa (Anderson and Mintz, 1992; Sadrzadeh et ai., 1992) tukevat tätä teoriaa ja ehdottavat, että näiden sammuttajien lisääminen ehkäisee K+-vuotoa lisäämällä nukleiinihappospesifisyyttä tässä WBC-inak-tivointimenetelmassä·
Lisäksi gammasäteilyn käyttäminen sammuttajalisäyksen kanssa lisänä virusten kapseliin suunnattujen virussterilointimene-telmiin RBCCsille ja PC:ille varmistaa latentin viruksen tai proviruksen inaktivoitumisen kontaminoivissa lymfosyyteissä.
Lvhvt kuvaus piirroksista ·* * • a • * * « · a
Kuva 1 käsittää neljä graafista esitystä, jotka kuvaavat tu- • · . loksia VSV:n ja bakteriofaagin Ml3 inaktivoinnista AMT:llä ja
I I I
UVA:lla mannitolin, glyserolin tai mannitolin ja glyserolin ··: ϊ muodostaman seoksen läsnäollessa. Kuva la esittää tuloksia V · verihiutaleiden toiminnasta. Kuva Ib esittää viruksen tappa- mistuloksia soluvapaan VSV:n inaktivoinnille. Kuva le esittää viruksen tappamistuloksia soluihin liittyneelle VSV:lle. Kuva :*·*· Id esittää viruksen tappamistuloksia bakteriofaagille M13.
* ft*»» »
Kuva 2 käsittää kaksi graafista esitystä, jotka osoittavat j * «··’ tuloksia VSV:n inaktivoinnista AMT:llä ja UVAslla a-tokofero-lifosfaatin, tryptofäänin tai α-tokoferolin ja tryptofäänin * a »'•'j muodostaman seoksen läsnäollessa. Kuva 2a esittää tuloksia • a 8 117288 verihiutaleiden toiminnalle. Kuva 2b esittää viruksen tappa-mistuloksia VSVslle.
Kuva 3 käsittää neljä graafista esitystä, jotka esittävät tuloksia VSV:n ja bakteriofaagi Ml3:n inaktivoinnista AMTsllä ja UVA:lla mannitolin, a-tokoferolifosfaatin tai mannitolin ja «-tokoferolifosfaatin läsnäollessa. Kuva 3a esittää tuloksia verihiutaleiden toiminnalle. Kuva 3b esittää viruksen tappa-mistuloksia soluttoman VSV:n inaktivoinnille. Kuva 3c esittää viruksen tappamistuloksia soluihin liittyneelle VSVslle. Kuva 3d esittää viruksen tappamistuloksia bakteriofaagi H13:lle.
Kuva 4 käsittää kaksi graafista esitystä, jotka esittävät tuloksia VSV:n inaktivoinnista AMTsllä ja UVA:lla kversetiinin tai rutiinin tai «-tokoferolifosfaatin ja mannitolin seoksen läsnäollessa. Kuva 4a esittää tuloksia verihiutaletoiminnalle. Kuva 4b esittää viruksentappotuloksia VSV:lle.
Kuva 5 käsittää kaksi graafista esitystä, jotka esittävät tuloksia VSVsn inaktivoinnista AMTsllä ja UVAslla kversetiinin tai rutiinin tai mannitolin läsnäollessa. Kuva 5a esittää tuloksia verihiutaletoiminnalle. Kuva 5b esittää viruksentappotuloksia VSVslle.
• ·
Kuva 6 käsittää graafisen esityksen vaikutuksesta koaguloivan * * « faktorin VIII talteenottoon rutiinia käytettäessä plasman , *;* AMTsllä ja UVAslla suoritetun virusten inaktivointikäsittelyn
» » I
*-· : aikana.
* * tl! *#* * * %· : Kuva 7 käsittää yksittäisen graafisen esityksen AHF-konsent- raatin UVC-käsittelyn vaikutuksesta bakteriofaagi Ml3 infek-; toivuuden ja FVIIIsn talteenoton suhteen.
i«« • e· • 4 · • « » * , Kuva 8 käsittää kaksi graafista esitystä, jotka esittävät as-korbaatin suojaavaa ja optimaalista konsentraatiota, kun muka-
| J
·;·* na on vakiomäärä kversetiiniä (kuva 8a) ja kversetiinin suo- ;\j jaavaa ja optimaalista konsentraatiota, kun mukana on vakio- määrä askorbaattia (kuva 8b).
e · 117288 9
Kuva 9 käsittää kaksi graafista esitystä, jotka esittävät UVC-käsittelyn vaikutusta, kun läsnä on 0,5 mM askorbaattia ja 0,2 mM kversetiiniä, bakteriofaagi M13:n infektoivuuden ja FVlIIsn talteenoton suhteen. Kuva 9a esittää tulokset AHF-konsentraa-tin käsittelylle. Kuva 9b esittää tulokset FFP:n käsittelylle.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus
Veri muodostuu kiinteistä osista {solut, s.o. punasolut, valkosolut ja verihiutaleet) ja nesteestä (plasma). Soluja siirretään anemian, hyytymissairauksien, infektioiden jne. hoidossa. Lisäksi solut sisältävät potentiaalisesti arvokkaita aineita, kuten hemoglobiinia, ja ne voidaan indusoida valmistamaan muita potentiaalisesti arvokkaita aineita, kuten interferonia, kasvutekijöitä, ja muita biologisia vasteenmuuntajia. Plasma koostuu pääasiassa vedestä, suoloista, lipideistä ja proteiineista. Proteiinit jaetaan ryhmiin, joita kutsutaan fibrinogeeneiksi, seerumin globuliineiksi ja seerumin albumiiniksi. Tyypillisiä vasta-aineita (immunoglobuliineja), joita ihmisen veriplasmasta löytyy, ovat ne, jotka ohjautuvat tarttuvaa hepatiittia, influenssa H:ta, jne. vastaan.
Verensiirtoja käytetään hoitamaan anemiaa, joka johtuu sai- raudesta tai verenvuodosta, plasmaproteiinien menetyksestä tai . verimäärän tilavuuden menetyksestä johtuvaa shokkia, sairauk- ...
siä, jossa riittävä plasmaproteiinitaso ei säily, esimerkiksi • * .*! hemofilia, ja passiivisen immunisaation antamiseksi, I » I i « ia* » * I 5 ϊ * i · **· : Tietyissä sairauksissa yksi tai useampi veren komponenteista : voi olla määrältään vähäinen. Niinpä sopivan fraktion antami nen riittää, eikä muita komponentteja "tuhlata** potilaaseen; i'1'l muut fraktiot voidaan käyttää toiselle potilaalle. Veren erotti*: tautinen komponentteihin ja niiden fraktiointi sen jälkeen mah- dollistaa solujen ja/tai proteiinien konsentroitumisen, jol-... loin niiden terapeuttinen käyttömahdollisuus lisääntyy.
f : ♦ · » * 8e*.· Ihmisen veressä olevia solutyyppejä ovat punasolut, verihiuta-•\* leet ja useat erityyppiset valkosolut. Menetelmiä verensiir- . 4 117288 ίο rosea käyttökelpoisten solukonsentraattien valmistamiseksi voidaan löytää teoksesta Kirk Othmer's Encyclopedia of Chemical Technology. 3«painos, Interscience Publishers, Volume 4, ss. 25-37, joiden koko sisältö on liitetty tähän yhteyteen viitteeksi·
Ihmisen plasmasta löytyviä proteiineja ovat prealbumiini, re-tinolia sitova proteiini, albumiini, alfa-globuliinit, beeta-globuliinit, gamma-globuliinit (immuuniseerumiglobuliinit), koagulaatioproteiinit (antitrombiini III, protrorabiini, plas-minogeeni, antihemofiilinen faktori-faktori VIII, fibriiniä stabiloiva faktori-faktori XIII, fibrinogeeni), immunoglo-biinit {immunoglobuliinit G, A, M, D ja E), ja komplementti-komponentit· Nykyään on kuvattu enemmän kuin 100 plasmaprote-iinia· Laajan luettelon voi löytää teoksesta "The Plasma Proteins", toim* Putnam, F.W., Academic Press, New York (1975).
Veren solufraktloissa tavattavia proteiineja ovat hemoglobiini, fibronektiini, fibrinogeeni, verihiutaleista saatu kasvutekijä, superoksididismutaasi, hiilihydraatti- ja proteiinime-tabolian entsyymit, jne· Lisäksi muiden proteiinien synteesi voidaan indusoida, kuten interferonien ja kasvutekijöiden.
***, Laajan luettelon indusoitavista valkosoluproteiineista voi · löytää teoksesta Stanley Cohen, Edgar Pick, J,J. Oppenheim, * v · \·β "Biology of the Lymphokines", Academic Press, New York, /'I (1979).
::: *«* * 4 * I · «
Veriplasman fraktiointi käsittää yleensä orgaanisten liuotti-*·’ : mien, kuten etanolin, eetterin ja polyetyleeniglykolin käyttä misen matalissa lämpötiloissa säädetyissä pH-arvoissa, jolloin v tapahtuu tietyn fraktion saostuminen, joka sisältää yhden tai iYi useamman plasmaproteiinin. Saatu supernatantti itsessään voi- · daan sitten saos taa ja niin edelleen, kunnes saavutetaan ha-* · luttu fraktionnin aste. Uudemmat erotusmenetelmät perustuvat I * »;*" kromatografisiin menetelmiin. Erinomainen katsaus veren frak- :\j tiointiin on myös julkaisussa Kirk-Othmer/s Encyclopedia of
Chemical Technology, 3.painos, Interscience Publishers, Volume * m 117288 11 4, sivut 25-62, joiden koko sisältö on liitetty tähän yhteyteen viitteksi.
Tänä keksintö koskee biologisen koostumuksen, kuten kokoveren, punasolukonsentraattien, verihiutalekonsentraattien, verihiu-taleuutteiden, valkosolukonsentraattien, siemennesteen, as-kiittinesteen, maidon, lymfanesteen, hybridoomasolulinjojen ja inistä tahansa näistä saatujen tuotteiden altistamista säteilylle sammuttajan tai sammuttajaseoksen läsnäollessa.
Termejä "soluja sisältävä koostumus", "biologinen koostumus" tai "biologinen neste" tässä käytettyinä ei ole muodostettu sisältämään mitään eläviä organismeja. Sen sijaan keksinnön menetelmä on tarkoitus suorittaa in vitro-vmpäristössä ja keksinnön menetelmällä saatu soluja sisältävä koostumus, biologinen koostumus tai biologinen neste on in vitro valmistettu tuote, mutta voidaan käyttää in vivo.
Tätä keksintöä voidaan käyttää käsiteltäessä koostumustuotettä, joka sisältää ei veressä olevia normaaleja tai syöpäsoluja tai geenipilkkomistuotteen.
Termi "säteilytys" on konstruoitu laajasti käsittämään minkä tahansa säteilyn muodon, jota tavallisesti käytetään inakti- m j·' voimaan soluja, esim. valkosoluja, tai viruksia tai parasiit- • · · V * teja tai muita patogeenisiä organismeja, esim. toxoplasma gon- * dii, trypanosoma cru2i. plasmodium malariae. tai babesia mic- :.! : roti, joko yksinään tai yhdessä muun aineen tai olosuhteiden kanssa. Ei-rajoittavia esimerkkejä säteilyistä ovat UV-säteily (UVA, UVB ja UVC), gammasäteily, röntgensäteet ja näkyvä valo.
ft « .·. Yksityiskohdat säteilyn käyttämisestä virusten inaktivoimisek-a*]*a si ovat alan ammattimiesten hyvin tuntemia. Tyypillisiä sätei- * i t lyvuon alueita keksintöä varten ovat 5-100 J/cm2 (edullisesti 50-100 J/cm2) UVÄslle, 0,02-2 J/cm2 (edullisesti 0,05-0,2 J/cm2) UVC2lie ja 1-40 kGy gammmasäteilylle. Yllättäen on nyt .·* ; havaittu, että virusten inaktivointia voidaan edullisesti li- * ft· • · ft · ft · · ft ft· ft · 117288 12 sätä, jos tavanomainen säteilytyskäsittely suoritetaan sammuttajan tai sanonuttajaseoksen läsnäollessa.
Sopivia sammuttajia tai sanonuttajaseoksia ovat mitkä tahansa aineet, joiden tiedetään reagoivan sekä vapaiden radikaalien (niinsanotut "tyypin I sammuttajat") että hapen reaktiivisten muotojen kanssa (niin sanotut "tyypin II sammuttajat")·
Edustavia esimerkkejä sammuttajista ovat tyydyttymättömät rasvahapot, pelkistetyt sokerit, kolesteroli, indolijohdannaiset ja vastaavat, atsidit, kuten natriumatsidi, tryptofaani, moniarvoiset alkoholit, kuten glyseroli ja mannitoli, tiolit, kuten glutationi, superoksididismutaasi, flavonoidit, kuten kversetiini ja rutiini, aminohapot, DABCO, vitamiinit ja vastaavat ·
Sammuttajaa käytetään tavanomaiset sammuttavat määrät, mutta yllättäen sitä käytettäessä tapahtuu kokonaisprosessissa edullinen viruksen tuhoutuminen, mutta ei halutun biologisen materiaalin tuhoutumista.
Tämän keksinnön mukaisesti erinomainen virusten tuhoutuminen saavutetaan sammuttamalla sekä tyypin I että tyypin II foto- ... dynaamiset reaktiot, s.o. käyttämällä seosta tyypin I ja tyy- * ·[** pin II sammuttajista tai käyttämällä yhdisteitä, esim. fla-' vonoideja, joiden tiedetään sammuttavan sekä tyypin I että • tyypin II reaktioita. Viruskuoleman alue useimmissa tapauksis- ;.· · sa on laajempi kuin se, joka saadaan käyttämällä tyypin I tai : tyypin II sammuttajia yksinään, jopa verrattuna siihen, että tyypin I tai tyypin II sammuttajan konsentraatioita lisätään -tai käyttämällä tyypin I sammuttajien tai tyypin II sammutta-. jien seoksia. Lisäksi tämä laajempi viruskuoleman alue saavu- i * · II*,' tetaan ilman että uhrataan ehjää solun toimintaa tai rakennet- • · i ta.
» · «··
Sammuttajia on aikaisemmin käytetty nostamaan reaktion spesi- ; f isyyttä monissa järjestelmissä, kuten röntgensäteilyllä ja • ♦ · l l valolla aktivoiduissa yhdisteissä. Sammuttajien käyttöä yhdes- e * · • * 117288 13 sä biologisten nesteiden, erityisesti veren proteiinien liuosten, kanssa ei kuitenkaan aikaisemmin ole raportoitu. US-pa-tentti nro 4,946,648, joka on liitetty tähän yhteyteen viitteeksi, yhdistää UV-säteilyn, liuottimet ja detergentit viruksia sisältävän AHFsn tai plasman käsittelyssä, mutta tulokset ovat onnettomia verrattuna niihin, jotka saadaan tämän keksinnön mukaisella menetelmällä. Paras käsittely aikaansai 5,4 login faagi Kappa-inaktivoitumisen, yhdistettynä siihen, että 74% FVlIl:aa saatiin talteen. Vertailun vuoksi, eräs keksinnön menetelmän toteutusmuoto johti siihen, että inaktivoitiin > 1016 ID50 VSVstä, mallina toimivaa kapselillista virusta, ja > 108 ID50 EMCVstä, mallina toimivaa kapselitonta virusta samalla, kun FVXIIsn talteenotto oli > 80%.
Keksinnön menetelmä suoritetaan tyypillisesti lämpötila-alueella 0-42°C, edullisesti 20-37°C ja edullisimmin 20-25°C. Keksinnön menetelmä suoritetaan tyypillisesti pHsssa 6,5-8, edullisimmin 7,2-7,6. Näytteet altistetaan keksinnön menetelmälle alle 24 tunnin ajaksi; edullisesti alle 4 tunniksi gamma- tai röntgensäteilylle. Näytteet voidaan myös käsitellä pakastettuina.
Tämän keksinnön toteutusmuodossa biologiselle koostumukselle ... suoritetaan säteilytys sammuttajan tai sammuttajaseoksen läs- « •y* näollessa siten, että mukana on myös säteilylle herkistävä « « · V * aine. Tässä yhteydessä sopivia säteilylle herkistäviä yhdis- teitä tässä keksinnössä käytettäväksi ovat ftaalosyaniinit, • s : purpuriinit ja muut molekyylit, jotka muistuttavat porfyrii- nien rakennetta {kuvattu edellä), sekä valoaktiiviset aineet UV-säteilyn herättäminä (esim. psoraleeni, 8-metoksipsoralee- 9 ni, 4'-aminometyyli-4,5',8-trimetyylipsoraleeni, bergapteeni . ja angelisiini), värit, jotka absorboivat valoa näkyvän valon .···. spektrissä (esim. hyperisiini, metyleenisininen, eosiini, ♦ ♦ ♦ fluoreseiinit ja flaviinit), ja värit, jotka absorboivat 9 röntgensäteilyä (esim. broraattu psoraleeni, bromattu hemato-*"/· porfyriini, jodattu ftaalosyaniini). Näiden säteilylle herkis-: tävien aineiden käyttö olisi helposti ilmeistä alan ammatti-
« M
| miehille, ja on edullisesti olennaisesti sellainen, kuin US- » ·♦ • ♦ 117288 14 patentissa nro 5,120,649 ja US-hakemuksessa, sarjanumeroltaan 07/706,919, jätetty 29· toukokuuta 1991, on kuvattu, jotka julkaisut on liitetty tähän yhteyteen viitteiksi.
Keksinnön toisen toteutusmuodon mukaan biologisen koostumuksen käsittely säteilyllä ja sammuttajalla tai sammuttajaseoksella yhdistetään toisen viruksia hävittävän menetelmän kanssa. Tämä toinen viruksia hävittävä menetelmä voi olla mikä tahansa tavanomaisesti käytetty menetelmä, joka inaktivoi kapselillisia ja/tai kapselittomia viruksia, kuten vain esimerkiksi mainittuna lämpökäsittely, kuivana tai muuten, pH:n manipulointi, käsittely lipidiliuottimilla ja/tai detergenteillä, erillinen säteilytyskäsittely, esim. gammasäteilyllä, tai käsittely kemiallisilla aineilla, kuten formaldehydilla.
Edullisessa toteutusmuodossa toinen viruksia hävittävä menetelmä on liuotin/detergentti-käsittely, kuten sellainen, joka on esitetty US-patentissa nro 4,540,573, joka on liitetty tähän yhteyteen viitteeksi. Tässä toteutuksessa biologinen neste saatetaan kosketuksiin dialkyylifosfaatin tai trialkyylifos-faatin kanssa, jossa on alkyyliryhmiä, jotka sisältävät 1-10 hiiliatomia, erityisesti 2-10 hiiliatomia. Kuvaavia trialkyy-lifosfaattiryhmän jäseniä, joita voidaan käyttää tässä keksin-... nössä, ovat tri(n-butyyli)fosfaatti, tri(t-butyyli)fosfaatti, tri(n-heksyyli)fosfaatti, tri(2-etyyliheksyyli)fosfaatti, ja » · * '·* * tri(n-dekyyli)fosfaatti, vain muutamia mainitaksemme- Erityi- * sen edullinen trialkyylifosfaatti on tri(n-butyyli)fosfaatti.
: Erilaisten trialkyylifosfaattien seoksia voidaan myös käyttää, */· : sekä fosfaatteja, joilla on erilaisen alkyyliketjun omaavia iT: alkyyliryhmiä, esimerkiksi etyylidi(n-butyyli)fosfaatti· Sa moin voidaan käyttää vastaavia dialkyylifosfaatteja, joita ..·. ovat sellaiset, joissa on dialkyylfosfaatin erilaisia alkyyli-ryhmäseoksia. Lisäksi voidaan käyttää di- ja trialkyylifos- • * faattien seoksia.
• · • #·
Di- tai trialkyylifosfaatteja, joita voidaan käyttää tässä ,·. : keksinnössä, käytetään noin 0,01 mg/ml - noin 100 mg/ml, edul- Λ·% * lisesti noin 0,1 mg/ml - noin 10 mg/ml.
• e· • » 117288 15
Di- tai trialkyylifosfaatteja voidaan käyttää yhdessä kostu-tusaineiden lisäämisen kanssa tai ilman niitä· On kuitenkin edullista käyttää di- tai trialkyylifosfaattia yhdessä kostuttavan aineen kanssa. Tämä kostutusaine voidaan lisätä joko ennen, samanaikaisesti tai sen jälkeen, kun di- tai trialkyy-lifosfaatti on saatettu kosketuksiin biologisen nesteen kanssa· Kostutusaineen tarkoitus on lisätä biologisesssa nesteessä olevan viruksen kosketusta di- tai trialkyylifosfaatin kanssa. Kostutusaine yksinään ei riittävästi inaktivoi virusta.
Edullisia kostutusaineita ovat myrkyttömät detergentit· Tutkittuja ionittomia detergenttejä ovat sellaiset, jotka disper-goivat vallitsevassa lämpötilassa ainakin 0,1 paino-% rasvasta sitä sisältävässä vesiliuoksessa, kun 1 gramma detergenttiä 100 ml:ssa liuosta lisätään tähän. Erityisesti tutkitaan detergenttejä, jotka sisältävät rasvahappojen polyoksietyleeni-johdannaisia, osittaisia sorbitolianhydridien estereitä, esimerkiksi niitä, joita myydään nimellä "Tween 80", "Tween 20" ja "polysorbaatti 80", ja ionittomat öljyliukoiset detergentit, kuten ne, joita myydään kauppanimellä "Triton X 100" (ok-sietyloitu alkyylifenoli). Tutkittu on myös natriumdeoksiko-laatti sekä "Zwittergentit", jotka ovat synteettisiä kahtais-ionisia detergenttejä, jotka tunnetaan nimellä "sulfobeta-iinit" , kuten N-dodekyyli-N,N-dimetyyli-2-ammonio-l-etaanisul-··· fonaatti ja sen kongeneerit, tai ionittomat detergentit, kuten » i ' oktyyli-beeta-D-glukopyranosidi.
♦ · • ♦ • · : Kostutusaineen määrä, jos sellaista käytetään, ei ole ratkai si | seva; voidaan käyttää esimerkiksi noin 0,001% - noin 10%, ΓΓ: edullisesti noin 0,01-1,5%, 9 . ·1. Di- ja trialkyylifosfaatteja voidaan käyttää yhdessä muiden maktivoivien aineiden kanssa, kuten alkoholi tai eetterit, • 1 · siten, että mukana voi olla samanaikaisesti kostutusaineita '"1· tai ilman niitä, US-patentin nro 4,481,189 mukaisesti, joka on f §· liitetty tähän yhteyteen viitteeksi.
« • · i 1 · 9 99 · 9 9 9 9 99 • 1 117288 16
Biologisten nesteiden käsittely trialkyylifosfaatilla suoritetaan lämpötilassa -5°C:n ja 70°C:n välillä, edullisesti välillä 0QC ja 60eC, Tällaisen käsittelyn aika (kosketuksissa olo) on ainakin 1 minuutti, edullisesti ainakin 1 tunti ja yleensä 4-24 tuntia· Käsittely suoritetaan normaalisti ilmakehän paineessa, vaikka alle ja yli ilmakehän paineita voidaan myös käyttää·
Normaalisti käsittelyn jälkeen trialkyylifosfaatti ja muut in-aktivoivat aineet, esimerkiksi eetteri, poistetaan, vaikka tämä ei kaikissa tapauksissa ole välttämätöntä, riippuen virusta inaktivoivien aineiden luonteesta ja biologisen nesteen halutusta edelleen käsittelystä·
Di- tai trialkyylifosfaatti ja ionittomat detergentit voidaan poistaa seuraavasti: (1) uuttaminen fysiologisesti yhteensopivilla öljyillä (US-patentti nro 4,789,545); (2) diasuodatus käyttäen eetteriin liukenemattomia, esim, "TEFLON" , mikrohuokoisia membraaneja, jotka pidättävät plasman proteiineja; * "** (3) haluttujen plasman komponenttien absorbointi kromatografi- • · · *·' * siin tai affiniteettikromografisiin alustoihin; ja s * ♦ • « ·· « · * (4) saostus, esimerkiksi suolaamalla plasmaproteiinit.
• · f · · las • ·· «
ΓΓ: Erityisesti AHF:n poisto voidaan toteuttaa saostamalla AHF
2,2-moolisella glysiinillä ja 2,0 H natriumkloridillä. Fib-. ronektiinin poistaminen voidaan toteuttaa sitomalla fibronek- tnni liukenematonta gelatiinia sisältävään kolonniin ja pese- • · * mällä sitoutunut fibronektiini pois reagenssista.
• · a · lmmm· Ei-rajoittavia esimerkkejä lipidipäällyeteisistä ihmisen pato- e ,·. : geenisistä viruksista, jotka voidaan inaktivoida tämän keksin- β·β · nön avulla, ovat rakkulainen suutulehdusvirus (VSV), Moloneyn a »· • a 117288 17 sarkoomavirus, Sindbis-virus, ihmisen immuunipuutosvirukset (HIV-1? HIV-2), ihmisen T-solun lymfotrooppinen virus (HTLV-I), hepatiitti-B-virus, non-A,non-B-hepatiittivirus (NANB) (hepatiitti C), sytomegalovirus, Epstein-Barr-virukset, lak-taattidehydrogenaasia lisäävä virus, herpesryhmän virukset, rhabdovirukset, leukovirukset, myksovirukset, alfavirukset, arbovirukset (ryhmä B), paramyksovirukset, arenavirukset ja koronavirukset. Ei-rajoittavia esimerkkejä kapselittomista viruksista, jotka voidaan inaktivoida tämän keksinnön avulla, ovat parvovirus, poliovirus, hepatiitti-A-virus, entero-non-A-ja entero-non-B-hepatiittivirus, bakteriofaagi M13 ja satel-liittiadeno-assosioitu virus (AAV).
Solupitoisissa koostumuksissa, joita on tarkoitus käsitellä keksinnön mukaisesti, on > 1 x 10® solua/ml, edullisesti > 1 x 109 solua/ml ja kaikkein edullisimmin > 1 x 1010 solua/ml, Lisäksi keksinnön mukaisesti käsiteltävissä solupitoisissa koostumuksissa on edullisesti > 4 mg/ml proteiinia ja edullisemmin > 25 mg/ml proteiinia ja edullisimmin 50-60 mg/ml proteiinia (pesemättömät solut).
Soluja sisältämättömissä koostumuksissa, joita on tarkoitus käsitellä keksinnön mukaisesti, on > 0,1 mg/ml ja edullisesti > 5 mg/ml proteiinia, • » ♦ ·· • ft « · « *·1 1 Keksinnön menetelmässä inaktivoidaan ainakin 10®, edullisesti 106 infektoivaa yksikköä virusparasiittia tai muuta patogeeniä.
ft ft • · # ft ft ft ft 1· 4 4 ft * Keksinnönmukaisesti käsiteltävissä biologisissa koostumuksis- iT: sa, jotka alunperin sisältävät > 1000 infektoivaa yksikköä virusta/1, on viruksen inaktivoit moisen ja keksinnönmukaisen . käsittelyn jälkeen solupitoisten koostumusten tapauksessa kos- ·;·. kemattornien solujen funktionaalisuuden ja rakenteen retentio t · · yli 70%, edullisesti yli 80% ja edullisimmin yli 95%. Biolo- t gisten nesteiden tapauksessa voidaan saavuttaa yli 75%, edul- ··· lisesti yli 85% ja edullisimmin yli 95% retentio biologisessa 9 : aktiivisuudessa.
« s· « · · • ft 9 • «4 ft ft 117288 18
Keksinnön inaktivointimenetelmällä inaktivoituvat useimmat mukana olevista viruksista, elleivät käytännössä kaikki. Menetelmä infektiivisyystasojen määrittämiseksi siirrostamalla viruksia simpansseihin (in vivo) on esitetty julkaisussa Prince, A .M., Stephen, W., Bortman, B. and van den Ende, M.C., "Evaluation of the Effect of Beta-propiolactoni/Ultraviolet Irradiation (BPL/UVj Treatment of Source Plasma on Hepatitis Transmission by Factor IX Complex in Chimpanzees", Thrombosis and Hemostasis- 44: 138-142 (1980).
Keksinnön mukaisesti virusten inaktivoinnissa saavutetaan määrä ainakin "4 logia", edullisesti > 6 logia, s.o. näytteessä oleva virus inaktivoituu kokonaan infektoivuustutkimuksissa määritettyyn määrään, jolloin virusta on läsnä käsittelemättömässä näytteessä sellainen pitoisuus, että senkin jälkeen, kun on suoritettu laimennus 104:ään (tai 106:een), voidaan virusten aktiivisuus mitata.
Tämä keksintö kuvaa virusten inaktivoimista samalla kun säilytetään labiilien verisolujen funktionaaliset ja rakenteelliset ominaisuudet.
Verihiutaleiden funktionaaliset aktiivisuudet määritetään nii-... den kyvyllä aggregoitua tiettyjen biologisten aineiden läsnä- ···" ollessa, sekä niiden morfologialla. Verihiutaleiden rakenteel- st V * linen yhtenäisyys varmistuu eloonjäämisellä in vivo sen jäl- ;/ keen, kun ne on radioleimattu indium-lllsllä, ja identifioitu i * : spesifisten verihiutaleantigeenien läsnäolo.
i » (· · • I • ·· · : Valoreaktiivisella yhdisteellä käsittelyn jälkeen voidaan yli- * määräinen valoreaktiivinen yhdiste poistaa sentrifugoimalla, pesudialyysillä ja/tai adsorboimalla hydrofobisiin matriisei- :::* hin.
: : : i ♦ * ***** Tämän keksinnön toteutusmuodossa käsitelty solupitoinen frak-tio keksinnön prosessista siirretään tai palautetaan luovutta-•\ : jalle, esim. ihmisluovuttajalle, josta solupitoinen fraktio
« M
I alunperin saatiin. Tällä tavalla alenee kiertävän viruksen • t· * 9 117268 19 määrä luovuttajassa, jolloin luovuttajan kyky puhdistaa virus paranee, ja/tai viruksenvastaisten lääkkeiden tehokkuus paranee.
Faktorin VIII ja faktorin IX koagulointiaktiivisuudet tutkitaan määrittämällä korjausaste APTT-ajassa plasmassa, josta puuttuuu faktori VIII ja faktori IX, vastaavasti. J.G. Lenahan, Philips and Philips, Clin. Chem., Voi. 12, sivu 269 (1966).
Sellaisten proteiinien aktiivisuus, jotka ovat entsyymejä, määritetään mittaamalla niiden entsymaattinen aktiivisuus. Faktori IX:n aktiivisuus voidaan mitata tällä menetelmällä.
Sidosproteiinien aktiivisuudet voidaan mitata määrittämällä niiden kinetiikka ja sidosaffiniteetti niiden luonnollisiin substraatteihin,
Lymfokiiniaktiivisuus mitataan biologisesti solujärjestelmis-sä, tyypillisesti tutkimalla niiden biologinen aktiivisuus soluviljelmissä.
Proteiiniaktiivisuus määritetään yleensä tunnetuilla ja stan-... dardimenetelmillä proteiinin tai kyseessä olevan proteiinityy- "·* pin aktiivisuuden määrittämiseksi.
• * · • · « s i.* Keksintöä kuvataan nyt viittaamalla seuraaviin ei-rajoittaviin * * * esimerkkeihin.
• · s * * Φ · ♦ »M ·
tT: ESIMERKIT
Aineet ia menetelmät » • i ... Veri • s · f * er#: Kokoveri oli tyypillisesti alle 48 tunnin ikäistä käytettäes- • »« sä. Ennen käyttöä sitä säilytettiin 4°C:ssa.
* • % « · * I ·· 4 « • · 6 · * t «4 • # 117288 20
Verihiutalekonsentraatit (PC:t ί PCit, erotettu rutiiniveripankkitutkimusten jälkeen, olivat tyypillisesti 24-48 tunnin ikäisiä käsiteltäessä. Ennen käsittelyä PCit säilytettiin 22-24°C:ssa pusseissa (PL 732, Fenwal Laboratories, Deerfield, XL), joihin ne oli kerätty ja sekoitettiin koko ajan verihiutalerotaattorissa (Helmer Labs, St. Paul, MN).
Psoraleeniliuokset 4'-Aminometyyli-4,5',8-trimetyylipsoraleeni (AMT) hankittiin HRI Assoc. Inc.ilta, Concord, CA. AMT:n varastoliuokset (4 mg/ml) valmistettiin tislattuun veteen.
Mallivirustutkimukset
Tutkittiin seuraavien virusten inaktivoitumistai rakkulainen suutulehdusvirus (VSV), lipidikapselillinen RNA-virus; enkefa-lomyokardiittivirus (EMC), proteiinikapselillinen RNA-virus; ihmisen imuunipuutosvirus (HIV), ihmisen patogeeninen retrovirus; hepatiitti-A-virus, kapseliton RNA-virus; adenoassosioi-tunut virus, kapseliton DNA-virus; M13, kapseliton bakterio-... faagi; ja poliovirus, kapseliton RHA-virus.
i ! ««« • « » ’·* * HAV:n pHM175-kanta kasvatettiin afrikkalaisen vihreän apinan munuaissolujen yksikerrosviljelmissä (BS-C-1), kuten Jansen et • > :.· · ai., 1988 ovat kuvanneet (Jansen R.W., J.E. Newbold and S.M.
j.f: Lemon, Virology. 161:299-307, 1988).
*·§ «t · • ·
Virusten infektoivuuden kvantitointi perustui autoradiografi-.seen määritykseen fokuksista, joita kehittyi solulevyissä, joita pidettiin 0,5% agaroosipäällysten alla sen jälkeen, kun • * * solut oli kiinnitetty 80% asetonilla ja sen jälkeen värjätty I-125-leimatulla vasta-aineella (IgG) HAV:lle.
i : : Valmistettiin kymmenkertaiset laimennukset HAVsstä MEM-viljel- * män kasvualustaan, jota oli täydennetty 2%;11a naudan vasikan t M 4 * 117288 21 seerumia; kutakin laimennusta käytettiin siirrostamaan kaksinkertaiset BS-C-l-solujen 60 mm:n Corning-alustat. 5-7 päivän inkuboinnin jälkeen 35°C:ssa kosteutetussa ympäristössä 5%:n kanssa C02, yksittäisen viruspartikkelin replikoitumisesta saadut fokukset todettiin visuaalisesti, numeroitiin ja tulokset ilmaistiin viruksen radioimmunofokuksia muodostavina yksikköinä (RFU)·
Yhdistyvät 293-solut infektoitiin samalla 10 PFU:lla Ad5, ja 10-kertaiset AAV:n sarjalaimennukset DMEM:ssä täydennettiin 2% naudan vasikan seerumilla 24-koloisilla levyillä, 48 tunnin jälki-infektoinnin ja inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa kosteutetussa ympäristössä 5%:n kanssa C02 solut raavittiin koloista, pestiin, denaturoitiin ja hybridisoitiin AAV (32P)DNA-koetti-meen, ja suoritettiin autoradiografia, kuten Carter et ai. ovat kuvanneet, Virology, 128:505-516, 1983. Kun oli suoritettu valotus röntgensädefilmille ja laskenta, piirrettiin cpm-standardikäyrät tunnetusta viruksen varastoiluoksesta ja käytettiin määrittämään AAC:n konsentraatiota kussakin tuntemattoman näytteen laimennuksessa.
VSV viljeltiin ihmisen A549-soluissa. EMC-varastoliuokset valmistettiin hiiren L929- tai ihmisen A459-soluihin. Poliovirus- ... ta kasvatettiin ihmisen HeLa-soluissa. Viljely ja tutkimus- « •y* menetelmät olivat samanlaiset, joita Horowitz, B., Wiebe, rs· * M,E., Lippin, A. ja Stryker, M.H, ovat kuvanneet: "Inactivati- !.* on of Viruses in Labile Blood Derivatives", Transfusion. 1985; « · •J * 25:516-522. VSV:n, EMC:n ja polioviruksen infektoivuus tutkit- | !*: tiin päätepisteellä, 10-kertaiset sarjalaimennukset DMEM-vil- :T; jelmän kasvualustassa (Gibco Laboratories, Grand Island, New
York) 10% naudan vasikan seerumia (FCS; MA Bioproducts, Wal- ?.% kersville, Maryland). Kutakin laimennusta käytettiin siirros- ···. tamaan kahdeksaa ihmisen A549- (VSV tai EMC) tai HeLa- (po-• · · \ liovirus) solujen replikaattikoloa 96-koloisilla mikrotiitte- t rilevyillä. Viruksen aikaansaama sytopatologia arvioitiin 72 tunnin inkuboinnin jälkeen 37°C:ssa 5% C02:ssa. Raportoitu
·* * virustiitteri laskettiin käyttäen Spearman-Karberin menetelmää S M
^ | (Spearman, C., "The Method of Right and Wrong Cases' ('Cons- • *·* » t 117288 22 tant Stimuli') Without Gauss's Formula", Br. J, Psychol«_, 1908; 2:227-242) ja osoitettiin se virusmäärä, joka infektoi 50% kudosviljelmäkoloista (TCID50).
Soluihin liittynyt VSV valmistettiin inkuboimalla ihmisen A549-solujen yhtyvää yksisolukerrosta 5 ml:n kanssa 107 IDS0/ml VSV:tä seerumittomassa DHEH:ssä 1 tunti 37°C:ssa 5%:ssa C02 150 cm2:n kudosviljelmäpulloissa. Infektion monistuminen näissä olosuhteissa oli noin 2,1 TCID50/solu. Kun neste oli dekantoitu pois, kiinnittyneet solut pestiin kolme kertaa vapaan viruksen poistamiseksi 50 ml:11a PBS/pesu. Jälkeenpäin lisättiin 40 ml DMEM, joka sisälsi 5% FCS, ja soluja inkuboitiin vielä 4 3/4 tuntia. Kiinnittyneet solut pestiin kolme kertaa PBS:llä ja erotettiin käsittelemällä 10 minuuttia normaalilla suolaliuoksella, joka sisälsi 0,01% trypsiiniä (Cooper Biomedical, Freehold, New Jersey; kaksi kertaa kiteytetty) ja 5 μς/ιηΐ EDTA. Irronneet solut kerättiin sentrifugoimalla, pestiin kolme kertaa PBS:llä ja suspendoitiin uudelleen PBS:ään.
Virusten inaktivoitumisen tutkimiseksi virusidinen reaktio pysäytettiin 10-kertaisena laimennuksella DMEM:ään, joka sisälsi 5% naudan vasikan seerumia, ja solut, jos niitä oli läsnä, poistettiin sentrifugoimalla kierrosnopeudella 1500 rpm 10 minuuttia. Virusten inaktivoitumisen puuttuminen tässä laimen-•γ* nuksessa tai ilman säteilytystä varmistettiin kaikissa tutki-V s tuissa inaktivointiolosuhteissa. Näytteet steriilisuodatettiin 9 ·,* (Swinnex-suodattimet, Millipore Corp., Bedford, Massachusetts) a « S.: 5 ja pakastettiin -70°C:ssa tai sen alapuolella koetta varten.
• 9 f * · *99 • es · *T; Menetelmät soluun liittyneen VSV:n inaktivoitumisen tutkimiseksi olivat samanlaisia kuin soluttomalle VSV:lie, paitsi , /, että kaikki kokeet soluihin kiinnittyneellä VSV:llä suoritet- • e 9 *·· tiin kokonaan kontrolloiduissa aseptisissa olosuhteissa. Ko- • ϊ ϊ \ keen lopussa infektoituneet A549-solut erotettiin sentrifugoi- <i**: maila, pestiin kolme kertaa PBS:llä sentrifugoimalla, suspen- doitiin uudelleen 1 ml:aan PBS ja välittömästi tutkittiin ; VSV:n infektoivuus päätepisteellä 10-kertaisessa sarjalaimen-*» ** . I nuksessa kuten soluttomalla viruksella.
• » «
* M
. · 117288 23
Esimerkki Is Tyypin I sammuttajien lisäämisen vaikutus veri-hiutalekonsentraatin käsittelyn aikana AMT:llä ia UVAslla
Verihiutalekonsentraatin näytteet (3 ml) käsiteltiin 25 \iq/ml:11a 4 1-aminometyyli-4, 5',8-trimetyylipsoraleenia (AMT) ja 7,5 mW/cma:lla DVA annetun ajan erilaisten tyypin I sammuttajien läsnäollessa tai ilman niitä. Ennen käsittelyä soluva-paa rakkulainen suutulehdusvirus (VSV), soluun yhdistynyt VSV, tai kapseliton bakteriofaagi M13 lisättiin erikseen verihiuta-lekonsentraattinesteisiin. Käsittelyn jälkeen virusta sisältävistä näytteistä tutkittiin infektiivisyys ja viruksettomia näytteitä säilytettiin yön yli ja tutkittiin aggregoituminen, joka saatiin vasteeksi 20 pg/ml:lle kollageenia Biodatan agg-regometrissä. Taulukossa annettu aggregoitumisvaste vertaa käsitellyn näytteen alkuperäistä aggregoitumisnopeutta käsittelemättömän kontrollinäytteen havaittuun arvoon.
Esimerkin 1 tulokset, jotka on esitetty taulukossa I, osoittavat, että täydelliseen soluttoman VSV:n inaktivoitumiseen (>6,0 log10) AMTrllä tarvittavalla 30 minuutin UVA-säteily-tysajalla tiettyjen tyypin 1 sammuttajien lisäys (esim. 2 mM mannitolia, 4 mM glyserolia) paransi verihiutaleiden aggregoi-tumistoimintaa noin 70% - yli 90% kontrollitasoista. Hiukan ... soluihin liittyneen VSV:n tai M13:n inaktivoitumista tapahtui •j·1 kuitenkin 30 minuutin käsittelyllä riippumatta siitä, oliko V 1 tyypin I sammuttajia läsnä vai ei. UVA-sateilytysajan ollessa * • 60 minuuttia tai enemmän, joka vaadittiin siihen, että yli 1 * 1 : log10 soluihin liittynyttä tai kapselitonta virusta kuoli, ve- : j1: rihiutaleiden toiminta uhrattiin (aggregoitumisnopeus oli 60% tai vähemmän, jopa silloin kun läsnä oli tyypin I sammuttajia * jopa 50 mM:n pitoisuuksina)· ♦ ♦ ♦ • « ♦
Taulukon I tiedot osoittavat myös, että tyypin I sammuttajien * · 1 \ lisäämisellä jopa ainakin 10 mM:n pitoisuuksina ei ollut il- 9 *"·ϊ meistä vaikutusta soluttoman tai soluihin liittyneen VSV:n tai Ml3:n inaktivointiin AMT:llä ja UVAslla.
• · • · · * P » • · 9 I » t » 9 9 9 · 117288 24
Taulukko I: Tyypin I sammuttajien lisäys: Vaikutukset verihiutaleiden aggregoitumisen ja virusten kuolemiseen.
Sammuttaja Aggregoit.vaste Virusten inaktivoiturn.(Log10) (3) (konsentr.) % kontrollista soluvapaa soluihin M13 30(1) 60 90 VSV kiinn. VSV
Mannitoli 95 60 32 > 6,0 1, 2(4), 1, 2<«> (2 mM) 3(5) 3<5)
Mannitoli 95 58 n.a(2i >6,0 (4 mM)
Mannitoli 91 56 n.a >6,0 1, 2(4> (10 mM) 3<s>
Mannitoli 85 55 30 5,8 (50 mM)
Glyseroli 90 50 n. a >6/0 (2 mM)
Glyseroli 95 55 35 >6,0 1, 2(4) 1, 2<4), (4 mM) 3(5) 3i5>
Glyseroli 80 50 n.a >6,0 (10 mM)
Glyseroli 85 50 n.a 5,8 (50 mM)
Glutationi 80 60 40 >6,0 (2 mM)
Glutationi 80 55 25 >6,0 (4 mM)
Glutationi 75 n.a n.a >6,0 (10 mM)
Superoksidi- 85 50 30 >6,0 ···. dismutaasi tl** (20 nq/ml) : : : Superoksidi- 75 45 n.a n.a dismutaasi • (100 μg/ml) : ei mitään 75 52 35 >6,0 1, 2<4> 1, ··* * 2(4), : (—-) 3<5' 'I!.· 3(S| f · · i · · m . (1) minuuttia UVA-altistusta; (2) n,a * ei mitattavissa; (3) ellei muuta osoitettu, annetaan vain virustulokset 30 V · minuutin UVA-säteilytyksellä, koska pitemmät käsittely- ajat vaaransivat verihiutaleiden yhtenäisyyden; (4) tuhoamistulokset 60 minuutin UVA-säteilytyksellä; ,**. (5) tuhoamistulokset 90 minuutin UVA-säteilytyksellä.
* • » » « b • ·»
* B
» * * 4 4 • 4 4 • 4 177288 25
Esimerkki 2. Tyypin II sammuttajien lisäämisen vaikutus käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia AMTtllä ia UVA:11a
Verihiutalekonsentraattia (3 ml) käsiteltiin 25 μς/ιαίϊΐΐη AMT:tä ja 11 mW/cm2:lla UVA-säteilyä annetut ajat, joko siten, että läsnä oli tai ei ollut erilaisia tyypin II sammuttajia. Verihiutaleiden aggregoituminen ja soluttoman ja soluihin liittyneen VSVsn ja Ml3:n inaktivoituminen tutkittiin ja raportoitiin, kuten esimerkissä 1 on kuvattu. Tulokset (taulukko II) osoittavat, että 30 minuutin UVA-säteilyllä tyypin II sammuttajien läsnäolo laski soluttoman VSV:n inaktivoitumista AMTillä, ja tämä lasku häviämisessä nousi lisättäessä tyypin II sammuttajan pitoisuutta. Koska verihiutaleiden toimintaa ei suojannut tyypin II sammuttajan lisääminen, näytti tehokas viruksen tappaminen AMT:llä ja UVA:11a verihiutalekonsentraa-teissa laskevan lisättäessä tyypin II sammuttajaa.
Taulukko II osoittaa myös, että samalla kun lipidikapseloitu-neen viruksen VSV:n inaktivoituminen inhiboitui, oli kapselittoman bakteriofaagin M13 kuoleminen muuttumatonta lisättäessä tyypin II sammuttajia.
• * * ι«· • 9 • · » 9 B » * 9 9 ♦ · 9 Λ 9 9 9 9 9 9 ··# * j • Φ * 9 ΓΓ: 9 9 9 *99 *9* 9 9* 9 9 9 9 9 9 9 9 *99 I t: • * 9 9 9 9 99 * 9 9 9 9*9 9 9 9 9 9 117288 26
Taulukko II: Tyypin II sammuttajien lisääminen: Vaikutukset verihiutaleiden aggregoitumiseen ja viruksen tappamiseen
Aggregoitumisvaste _% kontrollista Viruksen kuolem. tloa,„,|J)
Sammuttaja 30ΐυ 60 90 soluton soluihin Ml3
(pit.[mM]) VSV liitt.VSV
a-tokoferoli- fosfaatti (0,5) 76 55 35 4,8 ce-tokoferoli- fosfaatti (1.0) 75 60 40 4,0 0,5, 1,5<4>, 1, 2i4> 2(5) 3(5, a-tokoferoli- fosfaatti (2.0) 70 50 30 3,5
Tryptofaani (2) 70 50 30 5,5 1 1
Tryptofaani (4) 60 45 20 4,9
Tryptofaani (10) 45 20 0 4,0 0,5 1
Histidiini (5) 75 55 35 5,1
Histidiini (10) 65 n.a<2) n.a.<2) 4,8 ei mitään (---) 75 52 35 >6,0 1, 2(4>, 1, 2<4) 3(5) 3(5, ·«« ^ * • 4 44 « • · V ' (1) minuuttia UVA-säteilyä . (2) n.a = ei mitattavissa; . ** (3) ellei toisin ole mainittu, annetaan tuhoutumistulokset ; vain 30 minuutin UVA-säteilytyksellä; j (4) tuhoutumistulokset 60 minuutin UVA-säteilytyksellä; : (5) tuhoutumistulokset 90 minuutin UVA-säteilytyksellä.
• ·
Esimerkki 3. Tyypin I sammuttajien seoksen käyttämisen vaiku- a·^.· tus käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia AMT: llä ia UVA:lla ««· * · » * ♦ 4 4
Verihiutalekonsentraatteja (3 ml) käsiteltiin 25 μg/ϊnl:lla AMT ... ja 11 mW/cm2:lla UVA-säteilyä annetut ajat joko ilman sammutta- *···* jia tai siten, että läsnä oli pelkästään tyypin I sammuttajia :\i mannitolia (2 mM) tai glyserolia (4 mM), tai että läsnä oli • 4 4 4 4 • »4 4 4 27 117288 näiden kahden tyyppiä I edustavan sammuttajan sekoitus. Tulokset (kuva 1) esitetään verihiutaleiden toiminnalle (kuva la) sekä soluttoman (kuva Ib) ja soluihin liittyneen (kuva 1c) VSV:n ja M13:n (kuva Id) inaktivoinnille, joita tutkittiin samoin kuin esimerkissä 1 kuvattiin.
Tyypin I sammuttajien mannitolin ja glyserolin seoksen lisäämisen vaikutukset verihiutaleiden toimintaan (kuva la) ja viruksen tuhoutumiseen (kuvat Ib, 1c ja Id) ovat samanlaisia kuin yhden tyyppiä I edustavien sammuttajien lisäyksen vaikutukset esimerkissä 1 kuvatulla tavalla. Viruksen tuhoutuminen on ekvivalenttia seka tyypin I sammuttajien poissa- että läsnäollessa, ja verihiutaleiden toiminta 30 minuutin UVA-käsittelyn jälkeen, joka johtaa soluttoman VSV:n täydelliseen tuhoutumiseen, paranee tyypin I sammuttajan läsnäollessa. Käsit-telyajan ollessa 60 minuuttia tai enemmän, jota tarvitaan, että enemmän kuin 1 log10 soluun liittyneestä viruksesta tai Ml3:sta kuolee, verihiutaleiden toiminta kuitenkin huononee riippumatta siitä, onko tyypin I sammuttajia mukana yksinään tai yhdistelmänä.
Muut tyypin I sammuttajien seokset, esim. 2 mM mannitolia tai 4 mM glyserolia yhdistettynä 2 mM:n kanssa glutationia (ei esitetty) antoivat ekvivalenttisia tuloksia niiden kanssa, * joita saatiin yhdistämällä mannitolia ja glyserolia, eivätkä V J ne antaneet enempää suojaa verihiutaleille kuin kumpikaan tyy-iJ pin I sammuttaja, joka seosta oli muodostamassa.
f » ♦ 1 ♦ « · » ta« ·
Esimerkki 4. Tyypin II sammuttajien seoksen käyttämisen vaiku-ΓΓ: tus käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia AMTsllä ia UVA:11a , .·, Verihiutalekonsentraatteja (3 ml) käsiteltiin 25 pq/ml:11a AMT ja 11 mW/cma:lla UVA-säteilyä 30, 60 tai 90 minuuttia joko i 1 · niin, että läsnä oli tai ei ollut tyypin XI sammuttajien, «- s tokoferolifosfaatin (1 mM) ja tryptofaanin (5 mM) seosta, tai niin että läsnä oli jompaa kumpaa yksittäistä sammuttajaa.
: Tulokset (kuva 2) verihiutaleiden toiminnalle (kuva 2a), ja « · ♦ # I » • · · 117288 28 soluttoman VSVsn tuhoutumiselle (kuva 2b) tutkittiin ja raportoitiin kuten esimerkissä 1.
Tyypin II sammuttajien mukanaolo, joko yksinään tai yhdistettynä muihin tyypin II sammuttajiin, ei suojannut verihiutaleita (kuva 2a). Lisäksi tyypin II sammuttajien läsnäolo laski soluttoman VSVsn tuhoutumista AMTsn ja UVAsn vaikutuksesta ilmassa, ja tämä lasku tuhoutumisessa lisääntyi käytettäessä yhdistettyjä tyypin II sammuttajia. 30 minuutissa tuhoutuminen oli täydellistä (>6,0 log10) ilman että mitään sammuttajaa oli läsnä, kun taas silloin, kun läsnä oli pelkästään 1 mM a-toko-ferolla tai 5 mM tryptofaania, tuhoutuminen oli vain noin 4,2 log10, ja näiden sammuttajien molempien läsnäollessa tuhoutuminen aleni edlleen noin 2,8 log10:een (kuva 2b). Muilla tyypin II sammuttajien seoksilla, esim. tryptofaani tai a-tokoferoli yhdessä 5 mM;n kanssa histidiiniä (ei esitetty), oli samanlaisia vaikutuksia; ne eivät suojanneet verihiutaleiden toimintaa ja niiden yhdistetty lisääminen aiheutti laskun soluttoman VSV:n tuhoutumisnopeudessa, laskun ollessa suurempi kuin kummallakaan yksittäisellä sammuttajalla. Näin ollen verihiutaleiden toiminta huononi kaikissa AMT- ja UVA-käsittelyn olosuhteissa tyypin II sammuttajien läsnäollessa (joko yksinään tai yhdistelmänä), joissa > 6 log10 solutonta VSV:tä inaktivoitu!.
♦ · • i * Esimerkki 5. Tyypin I ia twpin II sammuttajien seosten kävt- » tämisen vaikutus käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia AMT:- \Xi llä ia UVA: 11a • ♦ t· ♦ » · *·· ♦
i*:*· Verihiutalekonsentraatteja (3 ml) käsiteltiin 25 μg/ml:lla AMT
e ja 11 mW/cm2:lla UVA-säteilyä 30, 60 tai 90 minuuttia niin, , että läsnä oli seos tyypin I sammuttajasta mannitolista (2 mM) 4 4 4 Λ·\·Λ ja tyypin II sammuttajasta a-tokoferolifosfaatista (1 mM) , tai * 4 Λ niin, että läsnä oli mannitolia tai α-tokoferolia yksinään.
* ***'· Verihiutaleiden toiminta (kuva 3a) ja viruksen tuhoutuminen ··· (kuvat 3b, 3c, 3d) tutkittiin ja raportoitiin kuten esimerkis- .·! ϊ sä 1.
• ·! ♦ 4 S 4 • I I 4 «4 4 4 117288 29 30 minuutin sateilytyksessä verihiutaleiden toiminta (kuva 3a) säilyi joko lisättäessä yksinään tyypin 1 sammuttajaa (manni-toli) tai mannitolin (tyyppi I) ja a-tokoferolifosfaatin (tyyppi II) yhdistelmää. UVA-säteilytyksen kestäessä 60 minuuttia tai kauemmin mannitolin ja α-tokofefolifosfaatin yhdistelmän läsnäolo paransi verihiutaleiden aggregoitumista (noin 70%:sta yli 90%:iin vertailuaineesta 60 minuutin UVA:-11a), kun taas jommankumman näiden sammuttajien läsnäolo yksinään ei sitä tehnyt. Toimintatulokset käytettäessä glyserolia tyypin I sammuttajana olivat samanlaiset kuin mannitolilla yhdistettynä α-tokoferoliin. Kaikilla tutkituilla tyypin I ja tyypin II yhdistelmillä viruksen tuhoutumiatulokset yhdistetyillä sammuttajilla olivat samat kuin tyypin II sammuttajilla yksinään, ja soluttoman (kuva 3b ja soluihin liittyneen (kuva 3c) VSV:n tuhoutumisnopeus oli jonkinverran alempi, kun taas Ml3:n tuhoutumisnopeuteen ei vaikuttanut tyypin II sammuttajan lisääminen.
Fitemmillä säteilytysajoilla, jotka teki mahdolliseksi tyypin I ja tyypin II sammuttajien mannitolin (tai glyserolin) ja a-tokoferolin yhdistelmän lisääminen, lisääntyi AMT:llä ja UVA:-11a saavutettu viruksen tappamisen tehokas alue verihiutale-konsentraateissa.
Esimerkki 6. Sellaisten yhdisteiden lisäämisen vaikutus, notka V 1 sammuttavat sekä tyypin I että twpin II fotodvnaamisia reak- * * tioita käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia AMT:llä ja | Xl UVAs11a * ft fit * · ♦ • · « · l1:1: Verihiutalekonsentraatteja (3 ml) käsiteltiin 25 μg/ml:lla f AMT:tä ja UVA:lla (11 mW/cm2) 30, 60 tai 90 minuuttia siten,
. ,·, että läsnä ei ollut tai oli 0,25 mM kversetiiniä tai 0,25 mM
• i · IV1 λ rutiinia, tai seosta, jossa oli 1 mM a-tokoferolifosfaattia ja ! · · \ 2 mM mannitolia. Verihiutaleiden toiminta ja virusten inakti- *ίβ1; voituminen tutkittiin ja raportoitiin kuten esimerkissä 1 (ku- • ie t : va 4).
« • 1 « · · • s# • ♦ 9 • ft · • 1· e · 30 117288
Se, että mukaan lisättiin flavonoidiyhdisteitä kversetiiniä ja rutiinia, yhdisteitä, joiden tiedetään tehokkaasti sammuttavan sekä tyypin I että tyypin II fotodynaamisia reaktioita, vaikutti samalla tavalla kuin käyttämällä tyypin I ja tyypin II sammuttajien seosta käsittelyn aikana. VSV tuhoutumianopeus (kuva 4b), mutta ei M13:n (ei esitetty, katso kuva 3d), laski, ja verihiutaleiden toiminta (kuva 4a) suojautui, jopa pitem-millä säteilytysajoilla kuin vaadittiin soluttoman VSV:n täydelliseen tuhoutumiseen.
Esimer-kki 7. Flavonoidin vaikutukset verihiutaleiden aaare-goitumiseen
Kollageenin aikaansaama aggregoituminen on herkkä indikaattori verihiutaleiden toiminnalle, ja kollageenilla saadut tulokset tavallisesti korreloivat hyvin niiden kanssa, mitä tulee verihiutaleiden morfologiaan, aktivoitumiseen ja tromboksäänin ja ATP:n vapautumiseen, sekä myös muiden agonistien aikaansaamaan aggregoitumiseen. Aggregoitumisvaste (aggregoituutisen laajuus ja alkunopeus verrattuna käsittelemättömään kontrolliin) kollageenille sen jälkeen, kun on suoritettu käsittely 25 μg/Inl:lla AMT:tä ja säteilytetty 90 minuuttia UVAslla, annetaan (taulukko III). Taulukko III osoittaa, että kumpikin tut-kitui s ta f lavonoideista suojasi kollageenin aikaansaamaa agg- “·* regoitumisvastetta.
• · « * · « * » * · ' > · ft s » · ft ft · ft ft « ««s · • « * · f * * ft ··« « • ft· ft « « « ft « ft ft ♦ ft ·« • « · ft ft ft · « « « ft · «« « • « «·« s : « · · « ft « ft a ft ft «« • « ft « « ft · ft « « 117288 31
Taulukko III: Flavonoidilisäyksen vaikutukset verihiutaleiden aggregoitumisvasteeseen AMTsllä ja UVAslla käsittelemisen jälkeen % käsittelemätöntä kontrollia -aggregoitumisvasteen laajuus/ nopeus kollageenille (1)
Flavonoidi- Glykoni- sammuttaia_muoto_käsittelemätön käsitelty ei mitään — 100/100 44/24 kversetiini — 100/100 98/98 krysiini — 100/100 90/85 rutiini + 100/100 100/100 hesperidiini + 98/90 100/86 naringiini + 90/83 78/61 (1) ennen yön yli säilyttämistä näyte käsiteltiin 25 μ9/πι1:11η AMT:ta ja 90 minuuttia UVA;lla esitettyjen flavonoidien poissa- tai läsnäollessa.
Esimerkki 8. Sellaisten yhdisteiden lisäämisen vaikutus, jotka sammuttavat sekä tyypin I että tvvoin XI fotodynaamisia reaktioita käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia sekä UVA:-11a että AMT:n suuremmilla pitoisuuksilla ♦
Koska vain 3 log10 soluihin liittyneestä VSV:stä inaktivoitu! : käyttäen 25 μg/ml:n AMT-pitoisuutta, tutkittiin suurempien a [/ AMT-pitoisuuksien vaikutusta sekä niin että lisättiin erilai-* 1 ;e! ; siä sammuttajia ja että ei lisätty. Verihiutalekonsentraatteja i jfi (3 ml) käsiteltiin UVA:lla (11 mW/cm2) 90 minuuttia AMT-pitoi- t1)1· suuksien 25, 50 tai 100μ9/ιη1 läsnäollessa, sekä lisäämällä että lisäämättä 0,7 mM rutiinia, 0,7 mM kversetiiniä tai 2 mM e mannitolia. Verihiutaleiden aggregoituminen vasteena kolia- ft 1 4 geenille (kuva 5a) ja soluun liittyneen VSV:n inaktivoituminen \ (kuva 5b) tutkittiin ja raportoitiin esimerkissä 1 kuvatulla tavalla.
• «s i : Käsiteltäessä verihiutaleita 90 minuuttia UVA:lla ja AMT-mää-« 1· l | rällä 25 pg/ml oli aggregoitumisvaste kollageenille vain noin • ·· » · 117288 32 35% kontrollista, ja kuten edellä huomattiin, mannitolin lisääminen ei suojannut verihiutaleiden toimintaa tämän säteily-tyskäsittelyn kanssa. Aggregoituminen väheni edelleen (alle 30%:iin 50 μg/ml:lla ja tilanteeseen, jossa vastetta ei ilmennyt lainkaan, 100 pg/ml:lla) lisättäessä AMT:n pitoisuutta oli mannitolia läsnä tai ei. Kun käsittelyn aikana mukana oli 0,7 inM rutiinia, aggregoitumistoiminta lisääntyi yli 80%:iin kontrollista kaikilla tutkituilla AMT-pitoisuuksi11a (kuva 5a). Soluton VSV (ei näytetty) inaktivoitui täysin kaikissa näissä käsittelyolosuhteissa, ja käytettäessä 100 μg/ml AMT:tä ja 0,7 mM rutiinia (tai kversetiiniä) oli soluihin liittyneen VSV:n inaktivoituminen melkein 6 log10 (kuva 5b)· Käin ollen lisäämällä yhdisteitä, jotka sammuttavat sekä tyypin I että tyypin II fotodynaamisia reaktioita (esim. flavonoidit, kuten rutiini) käsiteltäessä verihiutalekonsentraattia psoraleeneilla ja UVA:lla, säilyi verihiutaleiden toiminta hyvin olosuhteissa, joissa melkein 5 log10 soluihin liittynyttä virusta inaktivoitui hapen läsnäollessa.
Esimerkki 9. Hapen poistamisen vaikutukset verrattuna rutiini lisäykseen verihiutalekonsentraatin käsittelyn aikana AMT:llä ia UVA:lla
Verihiutalekonsentraattinäytteitä käsiteltiin AMT:llä anne-tuilla pitoisuuksilla ja 90 minuuttia UVA:lla, joko ilmassa ·« V : ilman rutiinia tai sen läsnäollessa, tai ilman kanssa putkes- l\i sa, johon vaihdettiin typen (95%) ja C02:n (5%) yhdistelmää.
:Verihiutaleiden aggregoituminen arvioitiin kuten esimerkissä I 1, kun niitä oli säilytetty yön yli ilmassa. Taulukko IV
Μι · osoittaa, että AMT-pitoi suudella 50 μg/ml, vaikka sekä hapen poistolla että rutiinin lisäyksellä oli mahdollisuus parantaa verihiutaleiden toimintaa AMT/UVA-käsittelyn jälkeen, tulokset 5 5.
*** rutiinin kanssa olivat yhdenmukaisia kokeesta toiseen, kun • 1 · taas kaasunmuutoksella saadut vaihtelivat enemmän, eikä niistä ♦ 1 ·1··; usein näyttänyt olevan mitään hyötyä.
• «« i : ΦΙΙ * 1 « · 1 • ·♦ • ft I I » I • tf e « 1 17288 33
Taulukko IVs Verihiutaleiden aggregoituminen 90 minuutin AMT-ja UVA-käsittelyn jälkeen. Rutiinin ja hapenpoiston vaikutus tulosten yhdenmukaisuuteen.
AMT ilma ilma happi poist.
koe pitoisuus ei sammutt. +0,5 mM rutiinia_ei^axnmutt^.
1 50 μς/ιηΐ 32/33 100/100 95/100 2 50 Mg/ml 42/31 98/95 90/85 3 50 μg/ml 36/18 95/90 56/36 4 50 μg/ml 70/30 96/96 91/94 5 50 μg/2ILl 21/13 100/84 3/13
Esimerkki 10. Parempi koaaulointifaktoreiden talteensaanti käsiteltäessä plasmaa AMTsllä ia UVAilla siten, että mukana on yhdisteitä, jotka sammuttavat sekä tyypin I että twpin II fotodvnaamisia reaktioita
Ihmisen plasmaa (3 ml:n erät) käsiteltiin 25, 50, 100 tai 200 μg/ml:lla AHTstä ja säteilyttämällä UVAilla (11 mW/cm2) 90 minuuttia. Koagulointifaktorin VIII (antihemofiilinen faktori, AHF) talteensaantia käsitellyissä näytteissä, kun niihin oli lisätty 1, 2 tai 5 mM rutiinia tai ei oltu lisätty rutiinia, verrattiin. Tulokset on esitetty kuvassa 6. Käsiteltäessä plasmaa 25 μς/ιη1:11& AMT ja 90 minuuttia UVA;lla, oli AHF:n m ·*·* talteensaanti ilman rutiinia vain 27% käsittelemättömästä ver-V : tailuaineesta, ja tämä matala arvo laski edelleen psoraleenin :/ pitoisuuden kasvaessa, ja kun käsittely suoritettiin 200 : μg/ml:lla AMT:tä, talteen saatiin vain 7%. Huomattavaa on, t että AHF:n talteensaanti palautui ennalleen 83%:iin tai suu- iT: remmaksi, kun rutiinia käytettiin käsittelyn aikana (pitoi- ft suuksilla 2 mM tai enemmän AMT-pitoisuuksilie jopa 100 μg/ml, t ja tai 5 mM AMT-pitoisuudelle 200 μg/ml, ja > 25 μg/ιnl:lla AMTstä nämä käsittelyolosuhteet riittivät inaktivoimaan aina-\ kin 4 log10 kapselittomasta bakteriofaagista M13.
ft * e
Niinpä lisäämällä rutiinia, yhdistettä, jonka tiedetään sam-•\ ; muttavan sekä tyypin I että tyypin II fotodynaamisia reaktioi- I ·* * I ta, käsiteltäessä plasmaa psoraleeneilla ja UVA:lla, voidaan 5 * · 34 117288 saada merkittävä kasvu koagulointifaktorin VIII talteensaami-sessa hapen läsnäollessa olosuhteissa, joissa kapseliton virus voidaan inaktivoida.
Seuraava esimerkkisarja, joka on esitetty jäljessä, viittaa "liuotin-detergentti"- ja/tai "SD"-käsittelyyn. Kussakin tapauksessa koejärjestely tähän käsittelyyn oli seuraava: AHF-konsentraatit käsiteltiin 0,3% tri(n-butyyli)fosfaatilla (TNBP) ja 1% Tween 80:llä 6 tunnin ajan 24°C:ssa, jonka jälkeen lisätyt reagenssit poistettiin, missä se on ilmoitettu, ioninvaihtokromatografiällä. Plasmaa käsiteltiin 1% TNBPsllä ja 1% Triton X-100:lla 4 tuntia 30°C:ssa, jonka jälkeen lisä-1 tyt reagenssit poistettiin hydrofobisella kromatografiällä C18-sisältöisellä hartsilla.
Esimerkki 11: AHF-konsentraatin UV-käsittely ilman lisättyjä sammuttania
Faagi Ml3, kapseliton virus, lisättiin AHF-konsentraattiin. Seokselle annettiin erilaisia annoksia UV-säteilyä kvartsivir-tauskennossa vaihdellen virtausnopeuksia. UV-valon lähde oli BLEIT155-Iamppu (Spectronic Co., Westbury, NY). Ennen ja jälkeen säteilytyksen faagin Ml3 infektiivisyys mitattiin plakki- w kokeella isäntänä JM101-solut; AHF-aktiivisuus mitattiin täp- * ··** läkokeella. Tulokset, jotka on esitetty kuvassa 7, osoittavat, 5 että olosuhteissa, joissa tapahtuu faagi Ml3:n 5 log10:n inak- * \J tivoituminen, oli faktorin VIII talteensaanti alle 50%.
I · 4 4 4 t · i M# * t Esimerkki 12 : Plasman UV-käsittely kversetiinin ia askorbaatin Γί\· läsnäollessa
Kapseliton faagi M13 lisättiin plasmaan. Seoksen käsittely # # * siten, että läsnä oli 0,75 mM askorbaattia ja 0,20 mM kverse-\ tiiniä (lopullinen pitoisuus) ja 0,073 J/cm2 - 0,134 J/cm2 *:**: UV-säteilyä, johti siihen, että M13:n 6,2-6,5 log10 (ID50) inak- *βββϊ tivoitui, samalla kun FVIIIsn & FIX:n talteensaanti oli 82-97% /* ja 81-94%, kuten jäljessä olevasta taulukosta V ilmenee: I li * » ft ft 5 S 4 • S · 35 117288
Taulukko V
faagin tuhout. FVIIIin FIX;n (log10) talteensaanti talteensaanti UV s n sammut- sammut- sammut- sammut- sammut- sam- annos ta ja ta ja ta ja ta ja ta ja mutta- (J/cm2) - + - + ja + 0 0 100 100 100 100 0,073 5,5 6,4 63 86 65,5 81,0 0,083 5,6 6,5 62 82 60,0 83,0 0,099 6,7 6,5 64,8 83 60 94,0 0,134 5,3 5,5 73 97 59,6 85,0
Huomaa, että faktorin VIII ja faktorin IX talteensaanti sammuttajien läsnäollessa on merkittävästi suurempi, kun taas sammuttajan lisäämisellä ei ollut merkittävää vaikutusta viruksen tuhoamiseen.
Esimerkki 13: AHF-konsentraatin UV-käsittelv kversetiinin ia askorbaatin läsnäollessa ··· ···* AHFsää käsiteltiin ennen liuotin-detergentti-inaktivointivai- V5 hetta valmistusprosessissa UVsllä 0,086 J/cm2:lla sen jälkeen, kun oli lisätty EMC tai VSV. Muut olosuhteet olivat samat kuin jj · esimerkissä 12 kuvattiin. Taulukossa VI jäljessä on esitetty, is’: että >7,0 log10 EMC:tä ja VSVstä inaktivoitu!. Vastaava tal- ... · I*;*. teenottomäärä FVIIIille oli 80,0%, kun sammuttajia oli läsnä e säteilytyksen aikana. Tätä verrattiin 33%:iin ilman sammutta-• jia.
f · * J
* % · «·» »#♦ : s: e e • e * ··· : : f • « t * * m »· • · t « * e · • «« « · 36 117288
Taulukko VI
Virusten tuh. (log10) FVIIIrn talteenotto UV: n Sammuttaja Sammuttaja Sammuttaja Sammuttaja annostus _z_ +_ - +
EMC VSV EMC VSV
0 0 0 0 0 100 100 0,086 >7,0 >7,0 >7,0 >7,0 33 80
Esimerkki 14: Plasman yhdistetty käsittely UVsllä ia SD:llä
Virusta lisättiin liuotin-detergentti-käsiteltyyn plasmaan ja käsiteltiin UV:llä 0,083 J/cm2:lla. Taulukko VII osoittaa, että EMC:n tuhoutuminen oli > 7,7, VSV:n > 6,5 ja AAV:n > 3,0, samalla, kun koagulointifaktorin talteensaanti oli yleensä 79-105% ja fibrinogeenin saanto 107-113%, kun sammuttajia oli läsnä. Nämä arvot ovat 30-50% parempia kuin silloin, kun sammuttajia ei lisätty. Näissä olosuhteissa ei taaskaan vaikutettu viruksen tuhoutumiseen.
... Taulukko VII
« 11 ·· ........ 1 « m • · • » 1 ♦ 1 1 — — . UV:n + sammuttaja Viruksen tuhoutuminen • # : annostus [askorbaatti, log™ + 2 1 : kversetiini • ♦ ♦ - '
tai rutiini] EMC AAV VSV
• 1 · • --- - - - o o o o • m, --------------------------- ------ - o +ooo • 1 · • · 0,083 - >7,7 >3,0 >6,5 • 1 ” ...... — -- ^^ . 0,083 + >7,7 >3,0 >6,5 * · ··· _|__ ___________ • 1 • # · • M • · · ♦ · 1 ♦ ♦♦ 2 • ·
Taulukko VII jatkuu 37 117-288 rann. + sam- Fibrinogeenin & koagulointifaktorien muttaja talteensaanti (%)
FV FVII FVIII FIX FXI FRN
0 - 100 100 100 100 100 100 0 + 100 103 100 93,9 112,5 106-114 0,083 - 54 46-54 58 40 70 76 0,083 + 83-93 70-87 83-100 79-94 86-105 107- 113
Esimerkki 15: AHF-konsentraatin yhdistetty käsittely UV:llä ia SDsllä
Liuotin-detergentti-käsitelty faktorin VIII konsentraatti, uudelleen 10,0 ml:aan vettä liuotettuna, siirrostettiin ampullin avulla polioviruksen tyypillä 2, joka on lipidikapseliton pieni merkkiainevirus. Käsittely UVsllä 0,083 J/cm2:lla johti > 5,0 log10 inaktivoitumiseen. FVIII:n saanto oli 81-94%· Vastaavat arvot ilman sammuttajaa olivat 30-40% alhaisemmat. Toisessa esimerkissä, jossa käsiteltiin AHF-konsentraattia, johon ... siirrostettiin HAV (hepatiitt-A-virus), HAV;n tuhoutuminen oli * # V/ > 4 log samalla kun FVIII:n talteenotto oli sama kuin edellä.
• « B
***/ Tuloksista on yhteenveto taulukossa VIII.
* · * ♦ · • ψ • » • · · i 1 · **· 1 i « f · · • · « • 1 · ♦ « ·1 • « ♦ • · · « • · · • « · ··· ♦ ·· * « ♦ • · « * · · : : * · · • · « I i • ·« • 1 • 1 • · · ♦ ·· · 38 117288
Taulukko VIII
UV: n + sammuttaja polio- PVIIIin HAV:n annostus ja viruksen talteen- tuhout.
J/cm2 sammuttajan tuhout· saanti (%) log10 pitoisuus (log10) 0 -sammuttajät 0 100 0 0 +sammuttajat 0 100 0 0,083 +0,75 mM as- > 5,6 80,8 > 4,4 korbaattia +0,2mM kver-setiiniä 0,083 +0,75 mM as- > 5,3 93,9 > 4,4 korbaattia +0,5 mM rutiinia
Esimerkki 16: Plasman käsittely UVCsllä vaihtelevien sammuttajien läsnäollessa
Plasma käsiteltiin UV:lla 0,064-0,09 J/cm2:lla erilaisten sam- • « muttajien läsnäollessa. Taulukko IX esittää erilaisten fakto- * a '“*/ reiden ja fibrinogeenin talteensaannin käsittelyolosuhteissa.
• 4
Edelläolevaan perustuen koagulointifaktoreiden ja fibrinogee-: nin aktiivisuuden retentio on paras, kun UV-käsittely tapahtuu • · l/l l f lavonoidien läsnäollessa joko niin että on lisätty tai ei ole : lisätty askorbaattia tai histidiiniä. On merkittävää huomata, että näiden sammuttajien läsnäolo ei huonontanut minkään tut- . kitun merkkiaineviruksen tuhoutumista.
• · · « « · ♦ ♦ ♦ 4 * 4 • 4 • 4« j : 44 · 4 4 » ♦ · · • 44 4 4 4 4 • · 4 • 44 4 4
Taulukko IX
39 11 7288
Virustuho (log10) Koagul.faktorin talt.otto (%) Sammuttaja Ml 3 EMC VSV FV FVII FVIII FIX FXI FBN
FLAVONOIDIT
ei mitään 5,5 >7,7 >6,5 59 67 54 50 49 75 kversetiini 5,0 >7,7 >6,5 75 97 70 46 50 82 rutiini - >7,7 >5,4 75 104 86 63 63 96 FLAVONOIDI-
SEOKSET
kversetiini+ askorbaatti - >7,7 >6,5 72 100 93 97 107 91 krysiini + askorbaatti - >6,5 >6,5 92 101 86 100 113 96 kversetiini+ histidiini - >6,0 >6,5 - - 105 136
TYYPIN I TAI TYYPIN II SAMMUTTAJAT YKSINÄÄN
askorbaatti 4,7 >7,7 >6,5 67 97 73 54 52 86 histidiini 4,0 - - - - 79 69 glutationi 4,4 - - - - 78 68 tryptofaani 4,0 - - - - 79 69 mannitoli 6,6 - - - - 60 58 glyseroli 6,6 - - - - 49 51 superoksidi- dismutaasi 3,9 - - - - 84 82 SCNAT 1,6 75 81 ♦ • * _ ________ ·*· • · *
« · I
·.* Esimerkki 17: FVIII;n talteenotto UV-käsitellvssa plasmassa j#:*: erilaisten sammuttaiapitoisuuksien kanssa (askorbaatti ia i kversetiini)
•l· I
• ft· I i · 4 * · •
Liuotin-detergentti-käsitelty plasma käsiteltiin UV-säteilyllä 0,0865 J/cm2?lla erilaisten kversetiinin pitoisuuksien (0-1,75 Ϊ * · mM) läsnäollessa, samalla kun pidettiin askorbaatin pitoisuus • · · \ plasmassa vakiona 0,50 mM. Tehtiin myös päinvastoin, eli kver- ***** setiinin pitoisuus pidettiin vakiona 0,20 mM, samalla kun asti": korbaattia lisättiin eri pitoisuuksia (0-1,50 mM) . Tarkoitus / . oli määrittää parhaat - optimaaliset - määrät kumpaakin näistä • * · * ; · yhdisteistä. Tulokset, jotka on esitetty kuvissa 8a ja 8b, • I * » ft# « ft 117288 40 osoittavat, että kumpikin näistä stabiloivista aineista on itseään rajoittava. Kversetiinin huippu oli 0,20 mM:ssa. As-korbaatilla oli leveämpi maksimi, 0,75-1,25 mM:ssa.
Esimerkki 18: Viruksen (Μ13Ϊ tuhoamisen kinetiikka plasmassa ia plasmaiohdannaisessa (liuotin-deteroentti-käsitelty AHF1 erilaisilla UV-annostuksilla (254 nm\
Tuore pakastettu plasma ja liuotin/detergentti-käsitelty AHF istutettiin erikseen faagilla M13, ja käsiteltiin sitten erilaisilla UV-annoksilla, [0 - 0,6 J/cm2], sammuttajien läsnäollessa (0,75 raM askorbaattia ja 0,2 mM kversetiinia). Virtausnopeus vaihteli kullakin UV-annoksella. Tulokset, jotka on esitetty kuvassa 9a [käsitelty AHG-konsentraattia] ja 9b [käsitelty FFPstä], osoittavat, että käsiteltäessä annoksella £ 0,04-0,13 J/cm2, jolloin saavutettiin ainakin 5 log10:n inakti-voituminen faagille M13, oli faktorin Vili talteensaanti suurempi kuin 80%.
Esimerkki 19: Punasolukonsentraatin käsittely röntqensäteilv-tvksellä ia bromatulla herkistävällä aineella
Punasolukonsentraatti käsiteltiin röntgensäteilytyksellä si-T: ten, että läsnä oli bromattu hematoporfyriinijohdannainen. 0,1 ;1$ ; mM:n rutiinimäärä alensi punasolujen hemolyysiä 8%:sta alle 2%:iin. Virustuho, mitattuna M13:lla, oli yli 5 log10 kussakin ; ", tapauksessa.
t I I • ·· 1
{ «1J
Esimerkki 20: Plasman käsittely gammasäteilyllä t J #
Tuore pakastettu plasma käsiteltiin 40 kGysllä gammasäteilyä. *.i,: Koagulointifaktorin IX talteensaanti oli 77% ilman rutiinin V · läsnäoloa ja 90%, kun läsnä oli 2 mM rutiinia. VSVsn tuhoutu-minen ylitti 5 log10 kussakin tapauksessa.
»ta t : • m · • · ί 1 1 • t* • · ♦ ♦ * tt » t 117288 41
Esimerkki 21: Sammuttajan lisääjiä virusten fotoinaktivointi
Seuraavat ovat lisäesimerkkejä, jotka tukevat sitä johtopäätöstä, että virusten tuhoamiespesifisyyttä solukomponenteissä ja proteiiniliuoksissa fotoaktiivisilla toimenpiteillä voidaan lisätä joko tyypin I ja tyypin II sammuttajien seoksella tai kaksitoimisella sammuttajalla: VIRUSTUHO LOG,» SAMMUTT.
TUOTE INAKTIVOIJA SAMMUTTAJA VSV Ml 3 ETU
Verihiut. 50μ9/πι1 AMT+ ei >6 3 agg.vaste1 2 3 konsentr. 5 7 J/cm2 UVA 0,35mM rutiinia >6 3 <30-585% AHF- 0,1 J/cm2 UVC el >7 $7% AHF talt.
konsentr. saanti1 0,5 mM rutiinia1 >7 5,5 33-594% 0,75 mM ask.
FFP 100μg/ml AMT+ ei >6 5 AHF talt.
57 J/cm2 UVA saanti^ 2 mM rutiinia >6 5 11-583% FFP 0ΤϊΎ7α^~ΐΝ0 el >6 6 AHF talt.
saanti 1 0,8 mM rutiinia >6 6 56-i95% FFP 1 μΜ MB + ei >5 iiä AHF talt.
44 J/cm2 näk.valo saanti1 40 μΜ kvers.t ···, 150 μΜ ask. >5 na 73-584% • a aa1 · (AIPcS4, alumiiniftaalosyaniinitetrasulfonaatti; AMT, amino-’. metyylitrimetyylipsoraleeni; MB, metyleenisininen; kvers., kversetiini; ask., askorbaatti) a 1 « ♦ · * ia * t t * β·β Tiedetyt asiat huomioonottaen virusten tuho päätellään seuraa- ‘11/ vaksi: ::: * * »SS * » > aa» 1 ·
» 1 I
• a a i a * * 4 2 • Sa i : 3 • a a f t 1 • aa a a a a • · · • a1 a » 117288 42 SUUNNITELTU VIRUSTUHO S/D-UV-YHDISTETYSSÄ KÄSITTELYSSÄ
Virustuho (loa,n) EMC Sindbis VSV AAV HAV Polio S/D 0 >8,8 >9,2 0 0 0 UV >7,7 >8,7 >6,5 >3,0 >4,4 >5,6 yhd. >7,7 >17,5 >15,7 >3,0 >4,4 >5,6 1 1' ----- --- " ------- =_. ___ -1-=: ^ UV-käsittelylie annetut tiedot saatiin, kun läsnä oli 0,75 mM askorbaattia ja 0,20 mM kversetiiniä, ja vuo 0,086 J/cma. Koagulointifaktorin talteensaanti oli 80-90%.
Esimerkki 22 s Imusolujen inaktivointi ia RBCsden ia verihiutaleiden yhtenäisyyden säilyttäminen 1. Gammasäteilytys: a) RBCC:n gammasäteilytys: RBCCst käsitellään gammasäteilyllä annoksilla 15, 25 tai 50 Gy (1 Gy « 1 Gray = 100 radia) käyttäen koboltti-60-lähdettä siten, että läsnä on tai ei ole 0,5, 1 tai 2 mM rutiinia. Imusolujen inaktivoituminen määritetään mittaamalla 3H-tymidiinin sitominen mitogeenistimuloinnin (lopullinen konsentraatio 2% PHA) jälkeen. Solunulkoinen (plas- * · man) kalium mitataan 7 päivän säilytyksen jälkeen 4°C:ssa ja : verrataan säteilyttämättömiin vertailuaineisiin.
fr fr fr f fr fr fr : Säteilytetyt imusolut säilyttivät vain 1,5% 3H-tymidiininsito- ... a r miskyvystään 15 Gy:n säteilytyksen jälkeen eikä mitään 50 GY:n J * · jälkeen, ja tämä oli riippumaton sammuttajan (rutiini) läsnä- t · « olosta tai pitoisuudesta. Solunulkoinen kalium lisääntyi sä- , teilyannoksen lisääntyessä ja laski kontrollitasolle, kun mu- ...
kana oli 2 mM rutiinia. 50 Gy:llä gammasäteilyä imusolut oli- • « fr V ' vat täysin inaktivoituneita ja plasman K+ oli 80 mM ilman sam- *:**; muttajien läsnäoloa ja 40 mM, kun käsittelyn aikana oli läsnä ,**·. 2 mM rutiinia. Näin ollen sammuttajia voidaan käyttää lisää- « · · / t mään gammasäteilyn spesifisyyttä RBCCsllä imusolujen inakti- * « » *· voinnissa* • I • · » fr fr» fr fr 117288 43 b. RBC-näytteet käsiteltiin ensin AlPcS4:llä ja valolla, ja sitten gammasäteilyllä flavonoidien läsnäollessa: RBCC:n (laimennettu samalla tilavuudella PBS:ää) käsittelyn jälkeen 6,5 μΜ:1^ A1PcS4 44 J/cmfsn kanssa näkyvää valoa siten, että läsnä oli 4 mM GSH, näytteet gammasäteilytetään 25 Gy:llä siten, että läsnä on tai ei ole 1 mM tai 2 mM rutiinia. Plasman kalium mitataan 2 ja 7 päivää käsittelynjälkeisen varastoinnin jälkeen ja verrataan käsittelemättömiin kontrolliaineisiin ja vain AlPcS4:llä käsiteltyihin RBCshin. (Lisäksi, rutiinilisäyk-sen vaikutuksen tutkimiseksi K+-vuotoon varastoitaessa AlPcS4:llä käsittelyn jälkeen, yksi AlPcS4:llä käsitelty näyte, jota ei oltu gammasäteilytetty, säilytettiin niin, että läsnä oli 2 mM rutiinia). Imusolujen inaktivoituminen ja K+-vuoto mitattiin kuten edellä.
Gammasäteilyn lisääminen AlPcS4-käsittelyyn nosti RBC:n vaurioita (plasman K* 2 päivässä oli 75 mM gammasäteriytettäessä ja 60 mM ilman sitä) ellei flavonoidi rutiinia ollut läsnä gammasäteilyn ja säilytyksen aikana (2 mM 2 päivänä, 4 mM 7 päivänä) · Lisäksi kun käsittelyn jälkeinen säilytys tapahtuu niin, että läsnä on 2 mM rutiinia, RBC:ssä tapahtui vähemmän kaliumvuotoa AlPcS4-käsittelyn jälkeen lisägammasäteilyn kanssa tai ilman sitä.
• · *· : c. PC:t: PC:t käsitellään gammasäteilyannoksilla 15, 25 tai 50
Gy käyttäen koboltti-60-lähdettä siten, että läsnä on tai ei j t·, ole 1 tai 2 mM rutiinia. Imusolujen inaktivoituminen määrite-
Siä . tään 3H-tymidiininsitomisella typpistimuloinnin jälkeen kuten ti! *11/ kohdassa la edellä. Verihiutaleiden yhtenäisyys määritettiin • ‘ aggregoitumisvasteella (alkuperäinen nopeus verrattuna käsit telemättömään kontrolliin) 40 μΜιΙΙβ arakidonihappoa ja 10 *·*.* μg/ml:lle ADP 1 ja 3 päivää säilytyksen jälkeen.
*•4 • « * e 4 « 4 4
Kuten RBCCsssä, säteilytetyt imusolut PC:ssä säilyttivät vain *·*, 1,5% 3H-tymidiininsitomiskyvystään 15 Gy:n säteilytyksen jäi- *** keen eikä mitään 50 Gy:n jälkeen, ja tämä tapahtui riippumatta siitä, oliko läsnä rutiinia ja sen pitoisuudesta. Verihiuta- * · leiden aggregoituminen, joka laski säteilyannostuksen kasvaes- 117288 44 sa (90% 15:llä, 80% 25:11a ja 70% vertailuaineesta 50 Gy:llä 1 päivän kuluttua) palautui lähelle kontrollitasoa (95%), kun läsnä oli 2 mM rutiinia· 50 Gy:n gammasäteilytyksella imusolut olivat täysin inaktivoituneita ja aggregoitumisnopeus 3 päivän säilytyksen jälkeen oli 50% kontrolliaineesta, kun 2 mM rutiinia oli läsnä käsittelyn aikana. Näin ollen sammuttajia voidaan käyttää nostamaan PCsden gammasäteilyspesifisyyttä imusolujen inaktivoinnissa.
2· PC:den UVB-säteilytys:
Koirilta saadut PC:t säteriytettiin 36 mJ/cm2:lla UVB (annos, jonka tiedetään ehkäisevän HLA:n ailoimmunisaatiota; Slichter et ai·, 1987, Blood· 69:414-418), siten, että läsnä oli 2 mM rutiinia tai ei ollut. Käsitellyt verihiutaleet radioleimat-tiin (51kromi) ja infusoitiin. UV-säteilyä saaneiden luovuttajien verihiutaleiden eloonjäänti aleni 2,5 päivään, kun käsittely tapahtui ilman rutiinia, mutta eloonjäänti oli sama kuin käsittelemättömissä autologisissa koiran verisoluissa (5 päivää), kun säteilytys suoritettiin rutiinin läsnäollessa.
On ilmeistä, että tämä selitys on annettu vain valaisutarkoetuksessa eikä rajoittamaan, ja että erilaisia modifikaatioita ja muutoksia voidaan tehdä poikkeamatta tämän keksinnön hen- * ,*· . gestä ja piiristä.
• * 4 I 4 • · ** * · • · * 9 9 » • 1 «M * M* I· * * * * 9 :» * I · • 99 «M Ψ 4 1 9 ♦ * «
S
·*·*« • ♦ t : ··* » » · « I i *99 9 4 9 4
« * I
9 99 4 4

Claims (29)

1. Menetelmä solunulkoisen tai solunsisäisen kapselillisen tai kapselittoman viruksen inaktivoimiseksi, joka virus voi olla biologisessa koostumuksessa, joka biologinen koostumus on tyypiltään soluja sisältävä biologinen koostumus tai biologinen nestekoostumus, tunnettu siitä, että menetelmässä on vaiheet: altistetaan biologinen koostumus virusidisesti vaikuttavalle määrälle (i) keinotekoista UV- tai gammasäteilyä tai (ii) keinotekoista UV-, röntgen- tai näkyvän valon säteilyä ja herkistävää ainetta siten, että läsnä on (a) seos, jossa on vähintään yksi sammuttajayhdiste, joka sammuttaa tyypin I fo- todynaamisia reaktioita, ja vähintään yksi sammuttajayhdiste, joka sammuttaa tyypin II fotodynaamisia reaktioita, tai (b) sammuttajayhdiste, joka sammuttaa sekä tyypin I että tyypin II reaktioita, tai (c) seos, jossa on sammuttajayhdiste, joka sammuttaa sekä tyypin I että tyypin II reaktioita ja lisäsam- muttajayhdiste, jolloin sammuttajayhdistettä, joka pystyy sammuttamaan sekä tyypin I että tyypin II reaktioita kohdissa .···. ib) ja (c) on läsnä konsentraationa vähintään 0,2 mM, jolloin e···' saavutetaan koskemattomien solujen funktionalisuuden ja ra- » · * . kenteen yli 70-%:inen retentio soluja sisältäville koostumuk- φ · · sille ja biologisen aktiivisuuden yli 75-%:inen retentio bio- * * •••J logisille nestekoostumuksille.
• · · • · · »»« « • * * ·.·· 2. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus altistetaan virusidisesti vaikuttaja: valle määrälle keinotekoista säteilyä siten, että läsnä on seos, jossa on vähintään yksi sammuttajayhdiste, joka sammut- ·«« taa tyypin I fotodynaamisia reaktioita, ja vähintään yksi sammuttajayhdiste, joka sammuttaa tyypin II f otodynaamisia · *···* reaktioita. ··» ···»
1 1 7288 45 Fatentt ivaat iimikset
3. Patenttivaatimuksen 2 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • * että sammuttajayhdiste, joka sammuttaa tyypin I fotodynaamisia reaktioita, on ainakin yksi seuraavista: mannitoli, gly- 117288 46 seroli, glutationi ja superoksididismutaasi, ja sammuttaja-yhdiste, joka sammuttaa tyypin II fotodynaamisia reaktioita, on ainakin yksi seuraavista: (χ-tokoferolifosfataasi, trypto-faani ja histidiini.
4. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus altistetaan virusidisesti vaikuttavalle määrälle keinotekoista säteilyä sammuttajayhdisteen läsnä ollessa, joka sammuttaa sekä tyypin I että tyypin II reaktioita.
5. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sammuttajayhdiste, joka sammuttaa sekä tyypin I että tyypin II reaktioita, on flavonoidi.
6. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että sammuttajayhdistettä on läsnä konsentraationa 0,2-5 mM.
7. Patenttivaatimuksen 5 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että flavonoidi on valittu ryhmästä, johon kuuluvat kverse- .···. tiini, krysiini, katakiini, rutiini, hesperidiini ja närin- * e giini.
• * · * * « /·· 8. Patenttivaatimuksen 4 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • t * : että on lisäksi lisäsammuttajayhdiste. • · • ♦ · 4 · « ··♦ · • 4»
*.* · 9. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että lisäsammuttaja on aminohappo. e • e · • · · ···
10. Patenttivaatimuksen 8 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ··« että lisäsammuttaja on vitamiini. * · » ♦ · • · • •4 • i
*··* 11. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, ··· että biologinen koostumus sisältää punasoluja. i·** • · • * ♦ • «· • * 117288 47
12. Patenttivaatimuksen 11 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus on kokoverta tai punasolukon-sentraatteja.
13. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus sisältää verihiutaleita.
14. Patenttivaatimuksen 13 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus on verihiutalekonsentraatti.
15. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus sisältää vähintään yhden koaguloin-tifaktori.
16. Patenttivaatimuksen 15 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologisessa koostumuksessa ei ole soluja.
17. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että biologinen koostumus, jossa ei ole soluja, on ihmisen plasma. • * · • 9 # « Hl
18. Patenttivaatimuksen 16 mukainen menetelmä, tunnettu sii- * · « ’·*/ tä, että koagulointifaktori on faktori V, VII, VIII, IX • f · ja/tai fibrinogeeni . • e • · · • · ♦ ··· m
• · :.·· 19. Patenttivaatimuksen 18 mukainen menetelmä, tunnettu sii- : tä, että koagulointi faktori on faktori VIII.
: ·*· 20. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, • *f .···. että biologinen koostumus altistetaan säteilylle ja sammut- * * ei‘e tajayhdisteelle (-teille) säteilylle herkistävän aineen läsnä II· • ·* ollessa. « * • I * · « m ...
21. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu sii- • *t * .·. : tä, että säteilylle herkistävä aine on psoraleeni. • M • · 117288 48
22. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että säteilylle herkistävä aine on UVA.
23. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että psoraleeni on 4'-aminometyyli-4,57,8-trimetyylipso-raleeni.
24. Patenttivaatimuksen 20 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että säteilylle herkistävä aine on bromattu hematoporfy-riini.
25. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että joko ennen, jälkeen tai samaan aikaan, kun biologista koostumus altistetaan säteilylle ja sammuttajayhdisteelle- (-teille), biologinen koostumus altistetaan vähintään yhdelle erilaiselle viruksia tappavalle menetelmälle.
26. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, että erilainen viruksia tappava menetelmä on lämpökäsittely, pH:n manipulointi, liuotin- ja/tai detergenttikäsitte- .*··. ly, gammasäteilytys tai formaldehydikäsittely. 4 * 444 »M I > t « « « *.
27. Patenttivaatimuksen 25 mukainen menetelmä, tunnettu sii- « e * /·· tä, että erilainen viruksia tappava menetelmä on ainakin * * ··· ! liuotin- ja/tai detergenttikäsittely. • 4 4 4 4 4 4 4 444 4 * 44 V
: 28. Patenttivaatimuksen 27 mukainen menetelmä, tunnettu sii tä, että ainakin yksi liuotin- ja/tai detergenttikäsittely on : käsittely tri (n-butyyli) fosfaatilla ja Triton X-100:lla. *** 4 4 4 4 4 4 4 444
29. Patenttivaatimuksen 1 mukainen menetelmä, tunnettu siitä, 4 4 4 • ·* että biologinen koostumus sisältää ekstrasellulaarisen tai 4 4 *·*·* intrasellulaarisen viruksen, joka on rakkulainen suutulehdus- 4 ··· virus, enkefalomyokardiittivirus, ihmisen immuunipuutosvirus, 4444 hepatiitti-A-virus, hepatiitti-B-virus, ei A- eikä B-hepa- 4 4 tiittivirus, adenoassosioitunut virus, M13- tai poliovirus. 49 117268
FI955690A 1993-05-28 1995-11-24 Menetelmä virusten inaktivoimiseksi FI117288B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US6923593A 1993-05-28 1993-05-28
US6923593 1993-05-28
US9406077 1994-05-27
PCT/US1994/006077 WO1994028120A1 (en) 1991-05-10 1994-05-27 Process for the sterilization of biological compositions and the product produced thereby

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI955690A0 FI955690A0 (fi) 1995-11-24
FI955690A FI955690A (fi) 1996-01-22
FI117288B true FI117288B (fi) 2006-08-31

Family

ID=22087612

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI955690A FI117288B (fi) 1993-05-28 1995-11-24 Menetelmä virusten inaktivoimiseksi

Country Status (12)

Country Link
EP (1) EP0702719B1 (fi)
JP (1) JP3426237B2 (fi)
KR (1) KR100258377B1 (fi)
AT (1) ATE301186T1 (fi)
AU (1) AU696246B2 (fi)
CA (1) CA2163636C (fi)
DE (1) DE69434445T2 (fi)
ES (1) ES2247587T3 (fi)
FI (1) FI117288B (fi)
NO (1) NO954815L (fi)
WO (1) WO1994028120A1 (fi)
ZA (1) ZA943754B (fi)

Families Citing this family (24)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6077659A (en) * 1990-05-15 2000-06-20 New York Blood Center, Inc. Vitamin E and derivatives thereof prevent potassium ion leakage and other types of damage in red cells that are virus sterilized by phthalocyanines and light
ATE367830T1 (de) * 1995-07-14 2007-08-15 Caf Dcf Cvba Scrl Vorrichtung zur inaktivierung von viralen kontaminationen in blutprodukten
US6329136B1 (en) 1998-10-30 2001-12-11 The Regents Of The University Of California Method for laser inactivation of infectious agents
US7655252B2 (en) 1999-04-28 2010-02-02 The Regents Of The University Of Michigan Antimicrobial nanoemulsion compositions and methods
US6635676B2 (en) * 1999-04-28 2003-10-21 Regents Of The University Of Michigan Non-toxic antimicrobial compositions and methods of use
EP1286706A2 (en) * 2000-05-17 2003-03-05 The American National Red Cross Gamma irradiation of protein-based pharmaceutical products
JP2010209109A (ja) * 2001-06-25 2010-09-24 Regents Of The Univ Of Michigan 抗微生物ナノエマルジョンの組成物および方法
JP4634039B2 (ja) * 2002-02-01 2011-02-16 カリディアンビーシーティ バイオテクノロジーズ，エルエルシー 光増感剤を使用する西ナイルウイルスおよびマラリアの不活化
EP1596888B1 (en) 2003-02-27 2012-01-11 Baxter International Inc. Method for the validatable inactivation of pathogens in a biological fluid by irradiation
WO2009131606A2 (en) * 2008-02-01 2009-10-29 Belanger Julie M Viral inactivation using crosslinkers and detergents
US8613934B2 (en) 2004-03-22 2013-12-24 The United States Of America, As Represented By The Secretary, Department Of Health And Human Services Cellular and viral inactivation
DK1737492T3 (da) 2004-04-16 2013-03-11 Bredent Medical Gmbh & Co Kg Præparat til fotodynamisk bekæmpelse af mikroorganismer samt anvendelse af præparatet
PL1737492T3 (pl) 2004-04-16 2013-05-31 Bredent Medical Gmbh & Co Kg Preparat do fotodynamicznego zwalczania mikroorganizmów i zastosowanie preparatu
DE102006008613A1 (de) 2006-02-24 2007-08-30 Dade Behring Marburg Gmbh Stabilisierte Zubereitungen von Serin-Endopeptidasen, deren Herstellung und Verwendung
US8580192B2 (en) 2006-10-31 2013-11-12 Ethicon, Inc. Sterilization of polymeric materials
US8747872B2 (en) 2007-05-02 2014-06-10 The Regents Of The University Of Michigan Nanoemulsion therapeutic compositions and methods of using the same
EP2008669A1 (en) * 2007-06-22 2008-12-31 Maco Pharma S.A. Irradiation apparatus for inactivating pathogens and/or leukocytes in a biological fluid and process
US9974844B2 (en) 2008-11-17 2018-05-22 The Regents Of The University Of Michigan Cancer vaccine compositions and methods of using the same
JP6200805B2 (ja) * 2010-05-03 2017-09-20 グラクソスミスクライン バイオロジカルズ ソシエテ アノニム 新規な方法
US10634589B2 (en) * 2011-10-26 2020-04-28 Amgen Inc. Methods of reducing or eliminating protein modification and degradation arising from exposure to UV light
KR101936559B1 (ko) * 2016-07-13 2019-01-09 국립암센터 분해가능 연결자를 포함하는 광증감제-펩타이드 결합체 및 그를 포함하는 광역학 진단 또는 치료용 조성물
JP2022537457A (ja) 2019-06-22 2022-08-25 シーラス コーポレイション 生物学的流体処理システム
CA3143732A1 (en) 2019-06-28 2020-12-30 Cerus Corporation System and methods for implementing a biological fluid treatment device
EP4268849A1 (en) 2020-12-24 2023-11-01 National University Corporation Kobe University Virus inactivation method using ultraviolet irradiation

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4049798A (en) * 1974-12-11 1977-09-20 William K. Bottomley Method for the treatment of Herpes Simplex
US4693981A (en) * 1983-12-20 1987-09-15 Advanced Genetics Research Institute Preparation of inactivated viral vaccines
JPS61275228A (ja) * 1985-03-14 1986-12-05 バクスタ−、トラベノ−ル、ラボラトリ−ズ、インコ−ポレイテツド 治療用タンパク組成物中のビ−ルスの光動的不活性化
JPH01175942A (ja) * 1987-12-28 1989-07-12 Sanyo Kokusaku Pulp Co Ltd 抗ウイルス性医薬用組成物
GB8817240D0 (en) * 1988-07-20 1988-08-24 Univ Salford Business Services Sterilising methods
US5232844A (en) * 1990-05-15 1993-08-03 New York Blood Center Photodynamic inactivation of viruses in cell-containing compositions
US5120649A (en) * 1990-05-15 1992-06-09 New York Blood Center, Inc. Photodynamic inactivation of viruses in blood cell-containing compositions
US5211944A (en) * 1990-10-12 1993-05-18 Shaman Pharmaceuticals, Inc. Proanthocyanidin polymers having antiviral activity and methods of obtaining same

Also Published As

Publication number Publication date
ATE301186T1 (de) 2005-08-15
ZA943754B (en) 1995-02-09
JP3426237B2 (ja) 2003-07-14
NO954815L (no) 1996-01-26
FI955690A0 (fi) 1995-11-24
JPH11503601A (ja) 1999-03-30
AU696246B2 (en) 1998-09-03
EP0702719A4 (en) 1996-08-14
ES2247587T3 (es) 2006-03-01
KR960702864A (ko) 1996-05-23
FI955690A (fi) 1996-01-22
EP0702719A1 (en) 1996-03-27
CA2163636C (en) 2002-01-08
CA2163636A1 (en) 1994-12-08
AU7048594A (en) 1994-12-20
DE69434445T2 (de) 2006-05-18
EP0702719B1 (en) 2005-08-03
KR100258377B1 (ko) 2000-06-01
DE69434445D1 (de) 2005-09-08
WO1994028120A1 (en) 1994-12-08
NO954815D0 (no) 1995-11-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI117288B (fi) Menetelmä virusten inaktivoimiseksi
US5712086A (en) Process for transfusing cell containing fractions sterilized with radiation and a quencher of type I and type II photodynamic reactions
US5981163A (en) Process for the sterilization of biological compositions using irradiation and quenchers of type I and type II photodynamic reactions
US6548242B2 (en) Process for the sterilization of biological compositions and the product thereby
KR0180917B1 (ko) 세포함유 조성물내 바이러스의 광역학적 불활성화방법
US5789150A (en) Process for the sterilization of biological compositions using UVA1 irradiation
CN1203900C (zh) 用于淬灭生物材料中病原体灭活剂的方法
US4727027A (en) Photochemical decontamination treatment of whole blood or blood components
US6077659A (en) Vitamin E and derivatives thereof prevent potassium ion leakage and other types of damage in red cells that are virus sterilized by phthalocyanines and light
JP2003527210A (ja) 生体材料を滅菌するための方法
JP2002509518A (ja) 血液製剤からソラレンを除去するための方法およびデバイス
US20030113704A1 (en) Methods for inactivation of pathogens in biological materials
US5985331A (en) Methods of use of phthalocyanines to inactivate blood borne parasites
AU2001279556B2 (en) Photodynamic treatment and UV-B irradiation of a platelet suspension
Corash New technologies for the inactivation of infectious pathogens in cellular blood components and the development of platelet substitutes
Lachert Methods of pathogen inactivation in whole blood and red blood cells: current state of knowledge
US7678538B2 (en) Disinfection of biological fluids using asymmetric cyanine dyes

Legal Events

Date Code Title Description
FG Patent granted

Ref document number: 117288

Country of ref document: FI