ES2224415T3 - Metodos para inhibir desactivadores patogenos en materiales biologicos. - Google Patents

Metodos para inhibir desactivadores patogenos en materiales biologicos.

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ES2224415T3 ES98933166T ES98933166T ES2224415T3 ES 2224415 T3 ES2224415 T3 ES 2224415T3 ES 98933166 T ES98933166 T ES 98933166T ES 98933166 T ES98933166 T ES 98933166T ES 2224415 T3 ES2224415 T3 ES 2224415T3
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Abstract

Un método para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un producto sanguíneo in vitro o ex vivo que comprende: tratar un producto sanguíneo in vitro o ex vivo con una cantidad eficaz de un compuesto que inactiva patógenos que comprende un ligando que une ácidos nucleicos y un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico donde el compuesto que inactiva patógenos no requiere fotoactivación para inactivar un patógeno; y tratar el producto sanguíneo in vitro o ex vivo con un inhibidor que comprende un grupo nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico; donde el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran en una cantidad eficaz para inactivar patógenos en el material a la vez que inhiben reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos.

Description

Métodos para inhibir desactivadores patógenos en materiales biológicos.
Esta solicitud se refiere a métodos para tratar productos sanguíneos in vitro o ex vivo, con un compuesto nucleofílico para inhibir compuestos electrofílicos reactivos en el material.
Antecedentes de la técnica
La transmisión de enfermedades mediante productos sanguíneos y otros materiales biológicos representa un problema de salud serio. Aunque se han producido avances significativos en el cribado de la sangre de los donantes y en los ensayos de la sangre, virus como el virus de la hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV), y el virus de la inmunodeficiencia humana (VIH) pueden eludir la detección en productos sanguíneos durante los ensayos debido a niveles bajos de los virus o de los anticuerpos víricos. Además del peligro de los virus, actualmente no existen ensayos autorizados para detectar la presencia de bacterias o protozoos en la sangre que va a ser utilizada en transfusiones. También existe el riesgo de que un patógeno desconocido hasta ese momento pueda ser predominante en la fuente de sangre y que presente una amenaza en cuanto a la transmisión de enfermedades, como ocurrió de hecho antes del reconocimiento del riesgo de la transmisión de VIH a través de las transfusiones sanguíneas.
La exposición de trabajadores de laboratorio a la sangre o a otros fluidos corporales también representa un peligro para la salud. Tan recientemente como 1989, el Centro para el Control de Enfermedades estimó que doce mil trabajadores sanitarios cuyos trabajos implican exposición a la sangre se infectan con el virus de la hepatitis B cada año. "Guidelines for Prevention of Transmission of Human Immunodeficiency Virus and Hepatitis B Virus to Health-Care and Public-Safety Workers", Morbidity and Mortality Weekly Report, vol. 38, no. S-6, Junio 1989. Esta estadística ilustra la necesidad de métodos para inactivar patógenos en los materiales biológicos.
Se han introducido en la sangre o en el plasma sanguíneo agentes químicos para inactivar patógenos antes de la utilización clínica del producto sanguíneo. Se han descrito métodos y composiciones para la inactivación fotoquímica de patógenos. Las Patentes de EEUU Nos. 5.587.490 y 5.418.130 describen psoralenos utilizados para inactivar fotoquímicamente contaminantes víricos o bacterianos en los líquidos corporales. Se ha visto que la fenotiacinas como el azul de metileno inactivan patógenos en productos sanguíneos tras iluminación. Wagner et al., Transfusion, 33:30-36 (1993). La Patente de EEUU No. 5.637.451 describe un método para inactivar virus en un material que contiene glóbulos rojos mediante la adición de un compuesto ftalocianina y mediante la irradiación del material.
La desventaja de los métodos fotoquímicos para la inactivación de patógenos es que los radicales libres reactivos y las especies de oxígeno que se generan también pueden dañar los productos sanguíneos y comprometer su idoneidad para el uso que se va a hacer de ellos. Los inhibidores de radicales libres se han utilizado en los métodos fotoquímicos para la inactivación de patógenos, para reducir y minimizar el daño producido por los radicales libres que se producen durante la reacción fotoquímica, como se describe en las Patentes de EEUU Nos. 4.727.027, 5.587.490, 5.418.130, 5.232.844, 5.658.722 y 5.637.451, y en la Solicitud de Patente Internacional WO 97/16966.
Se han desarrollado compuestos para la inactivación de patógenos que no requieren fotoactivación. Estos compuestos son típicamente electrófilos que reaccionan con los patógenos. Por ejemplo, la Patente de EEUU No. 5.055.485 describe la inactivación de virus en composiciones que contienen células y proteínas utilizando epóxidos aril diol. Otros compuestos generan electrófilos in situ. LoGrippo et al. evaluaron la utilización de mostaza nitrogenada, CH_{3}-N(CH_{2}CH_{2}Cl)_{2}, para la inactivación vírica. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225-230. De manera más significativa, las Patentes de EEUU Nos. 5.691.132 y 5.559.250 describen la utilización de N1, N1-bis(2-cloroetil)-N4-(6-cloro-2-metoxi-9-acridinil)-1,4-pentanodiamina ("mostaza de quinacrina") y de 5-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]metil-8-metoxipsoraleno para la inactivación de patógenos en sangre, en productos sanguíneos, y en diferentes muestras de origen biológico. También se han utilizado los compuestos que inactivan patógenos que incluyen una aziridina unida covalentemente a una fracción de poliamina, como se describe en Budowsky et al., Vaccine Research 5:29-39 (1996).
De manera ideal, la adición de los compuestos que inactivan patógenos que inactivan mediante reacciones electrofílicas o de intermediarios el producto sanguíneo u otra muestra biológica inactivarán patógenos sin producir ninguna modificación no deseada en la muestra. Los compuestos que inactivan patógenos reaccionan con los patógenos mediante un proceso electrofílico y no requieren fotoactivación. Por lo tanto, el oxígeno reactivo o las especies de radicales libres reactivas no se producen, y el daño oxidativo no representa un problema. Sin embargo pueden producirse otras reacciones laterales no deseadas. Por ejemplo, pueden producirse reacciones electrofílicas con diferentes materiales biológicos, incluyendo proteínas. Estas reacciones laterales pueden comprometer potencialmente la utilización de la muestra biológica para el propósito que se pretende.
Por lo tanto, existe una necesidad de prevenir las reacciones electrofílicas laterales no deseadas de los compuestos que inactivan patógenos que interaccionan con los patógenos de manera electrofílica, a la vez que se preserva la capacidad del compuesto que inactiva patógenos para inactivar patógenos dañinos. Existe una necesidad de métodos para inactivar patógenos en materiales biológicos a la vez que se reducen las reacciones laterales no deseadas.
Descripción de la invención
De acuerdo con la invención, el método de la reivindicación 1 se proporciona para inhibir reacciones laterales de compuestos que inactivan patógenos utilizados para inactivar patógenos en productos sanguíneos in vitro o ex vivo. El método se proporciona para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos que incluye un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico. En esta realización, un material biológico, como un producto sanguíneo, se trata in vitro o ex vivo con el compuesto que inactiva patógenos y con un inhibidor que comprende un grupo funcional nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico. El grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos es, en una realización preferida, un grupo catiónico. Los compuestos que pueden inhibirse incluyen compuestos que comprenden un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, y ha formado, in situ, un grupo reactivo como un grupo electrofílico. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo mostaza que es capaz de formar in situ un grupo reactivo como un ion electrofílico, aziridina, aziridinio, tiirano o tiiranio. Los materiales biológicos se tratan con el compuesto que inactiva patógenos y con el inhibidor, in vitro o ex vivo. De acuerdo con la invención, el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran a un material en una cantidad eficaz para que el compuesto que inactiva patógenos inactive patógenos en el material permitiendo a la vez al inhibidor inhibir las reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos.
En una realización, puede introducirse un inhibidor en un sistema de múltiples fases, como un sistema de dos fases. Por ejemplo, el inhibidor puede administrarse a un sistema de dos fases donde una membrana separa la primera y la segunda fase. En una realización, una fase está unida por una membrana. Por ejemplo, la membrana puede definir la membrana exterior de un organismo patógeno, la primera fase puede ser la fase en la que está contenido el organismo patógeno, y la segunda fase puede ser el interior del organismo patógeno. La membrana puede ser, por ejemplo, la cubierta lipídica de un virus, la primera fase puede ser un líquido en el que está el virus, como la sangre, y la segunda fase puede ser el interior del virus que comprende los ácidos nucleicos víricos. En otra realización, la membrana puede ser una membrana celular, y la fase unida a la membrana puede ser el interior de un organismo patógeno unicelular, como una bacteria. En esta realización, se introduce un compuesto que inactiva patógenos en el sistema de dos fases que preferiblemente es capaz desde un punto de vista cinético o termodinámico de atravesar la membrana, mientras que el inhibidor no es capaz, de manera sustancial desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana, respecto al compuesto que inactiva patógenos.
En una realización, se proporciona un método para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un material biológico de dos fases que comprende una primera fase líquida que tiene un patógeno que comprende una membrana, y una segunda fase unida por la membrana del patógeno. Por lo tanto, la segunda fase consta de los contenidos que están dentro de la membrana del patógeno. El material biológico se trata con un compuesto que inactiva patógenos que comprende un grupo funcional que es capaz de formar un grupo electrofílico. Antes de, simultáneamente, o después del tratamiento con el compuesto que inactiva patógenos, el material biológico se trata con un inhibidor que comprende un grupo nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico. Preferiblemente, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. Preferiblemente, el compuesto que inactiva patógenos es capaz desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana antes de la formación del grupo electrofílico. Preferiblemente, la velocidad de penetración en la membrana del compuesto que inactiva patógenos se reduce de manera sustancial después de la formación del grupo electrofílico, respecto al compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico. Preferiblemente, el compuesto que inactiva patógenos no es, de manera sustancial, capaz, desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana después de la formación del grupo electrofílico, respecto al compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico. El inhibidor no es capaz, preferiblemente, desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana, respecto al compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico. Se permite al inhibidor reaccionar con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos, y la reacción del inhibidor con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos ocurre preferiblemente en la primera fase. El compuesto que inactiva patógenos que comprende el grupo electrofílico reacciona con un ácido nucleico del patógeno en la segunda fase que está unida a la membrana, inactivando de esta manera al patógeno. Los métodos permiten la inactivación de los patógenos mediante la reacción del compuesto que inactiva patógenos con los ácidos nucleicos del patógeno dentro de la membrana del patógeno, a la vez que permiten la inhibición de los compuestos que inactivan patógenos reactivos, así como de especies reactivas formadas a partir de ellos, en la fase en la que está el patógeno.
Los métodos descritos en la presente memoria son ventajosos, porque en el sistema de dos fases, el inhibidor se administra a la primera fase y no es capaz, de manera sustancial, de atravesar la membrana exterior del patógeno, y, de esta manera, no está presente, de manera sustancial, en la segunda fase, es decir, en el interior del patógeno. El compuesto que inactiva patógenos se administra, por ejemplo, a la primera fase, y es capaz de atravesar la membrana del patógeno, antes de la formación del grupo electrofílico. Después de la formación del grupo electrofílico in situ, el compuesto que inactiva patógenos no es ya capaz, de manera sustancial, de atravesar la membrana. De esta manera, la inhibición ocurre de manera selectiva en la primera fase, mientras que en la segunda fase, es decir, en el interior del patógeno, el compuesto que inactiva patógenos reacciona con los ácidos nucleicos del patógeno sin inhibición. De esta manera, en un producto sanguíneo, la inhibición de grupos reactivos del compuesto que inactiva patógenos y de los productos de degradación de éste ocurre de manera selectiva en la primera fase en la que el patógeno está suspendido. La inhibición en la primera fase reduce de esta manera las reacciones laterales no deseadas del grupo reactivo del compuesto que inactiva patógenos, como la modificación covalente de proteínas o de superficies celulares en la sangre. En el método, el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran en una cantidad eficaz para inactivar patógenos en el material a la vez que se inhiben reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos. El inhibidor tiene por lo tanto un efecto protector al reducir las reacciones laterales no deseadas en la sangre, mientras que permite que ocurra la inactivación de los patógenos.
El método se utiliza para tratar in vitro o ex vivo productos sanguíneos que comprenden patógenos como organismos procariotas y eucariotas y virus con una cubierta lipídica. En particular, los métodos pueden utilizarse para tratar patógenos que comprenden membranas, como virus con cubierta lipídica, y bacterias que incluyen una membrana en la forma de una membrana celular. Los inhibidores ejemplares para tratar materiales biológicos, como productos sanguíneos, que tienen un patógeno que comprende una membrana, incluyen glutation, N-acetilcisteína, cisteína, sales mercaptoetanosulfonato, o dimercaprol.
El compuesto que inactiva patógenos puede incluir un ligando que une ácidos nucleicos, y un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico, donde el grupo electrofílico es capaz de reaccionar con un ácido nucleico para formar un enlace covalente con un ácido nucleico. El compuesto que inactiva patógenos puede incluir también un ligando frangible, que une el ligando que se une al ácido nucleico y el grupo funcional. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo mostaza que es capaz de reaccionar in situ para formar el grupo electrofílico, como un ion aziridinio. Los compuestos que inactivan patógenos ejemplares incluyen mostaza de quinacrina, dihidrocloruro de N-(2-cloroetil)-N-etil-N'-(6-cloro-2-metoxi-9-acridinil)-1,3-propanodiamina y 5-[N,N-bis(2-cloroetil)amino]metil-8-metoxipsoraleno. Otros compuestos que inactivan patógenos incluyen compuestos que comprenden una aziridina unida covalentemente a una fracción de poliamina, como se describe en Bodowsky et al., Vaccine Research, 5:29-39 (1996).
Los inhibidores que pueden utilizarse pueden incluir grupos funcionales nucleofílicos como tioles, tioácidos, ácidos ditoicos, fosfatos, tiofosfatos y aminas. Los inhibidores ejemplares incluyen glutation, N-acetilcisteína, cisteína, tiosulfato, sales mercaptoetanosulfonato, y dimercaprol. En una realización preferida, el inhibidor es glutation.
En los métodos en los que un producto sanguíneo se trata con un inhibidor y con un compuesto que inactiva patógenos, el inhibidor puede añadirse al material antes de, simultáneamente con, o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. Preferiblemente, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente, por ejemplo, en los 15-20 minutos aproximadamente, o en los 10 minutos aproximadamente después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. Los materiales biológicos que pueden tratarse in vitro o ex vivo son productos sanguíneos, como sangre completa, glóbulos rojos, plasma sanguíneo o fracciones de éstos, y plaquetas. Los métodos pueden utilizarse para producir productos sanguíneos tratados que son adecuados para ser introducidos en un individuo. Por ejemplo, el material tratado es adecuado para ser transfundido a un individuo que lo necesita. De manera opcional, la concentración del compuesto que inactiva patógenos y/o del inhibidor en el material puede reducirse después del tratamiento, y antes de la transfusión, por ejemplo, por filtración o adsorción. Se puede tratar una amplia variedad de materiales biológicos, como productos sanguíneos, que contienen, o que se sospecha que contienen, un patógeno.
En una realización particular, se proporciona un método para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un material que comprende glóbulos rojos, donde el método incluye tratar un material que comprende glóbulos rojos con un compuesto que inactiva patógenos que comprende un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico, y tratar el material con un inhibidor que comprende un grupo nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico. En una realización, el compuesto que inactiva patógenos comprende un ligando que une ácidos nucleicos y un grupo mostaza que es capaz de reaccionar in situ para formar un grupo electrofílico, como un ion aziridinio. El material puede comprender glóbulos rojos centrifugados. El material puede comprender, por ejemplo, un producto sanguíneo con un hematocrito de aproximadamente 30-85%. Por ejemplo, un material que comprende glóbulos rojos puede tratarse con un compuesto que inactiva patógenos y con un inhibidor, y después el material tratado es adecuado para ser transfundido a un individuo que lo necesite.
La concentración del compuesto que inactiva patógenos puede ser, por ejemplo, aproximadamente 0,1 \muM a 5 mM. Se puede proporcionar una concentración del compuesto que inactiva patógenos que sea suficiente para inactivar, por ejemplo, al menos aproximadamente 3 a 6 log de un patógeno en el material que se está tratando. El grupo nucleofílico es preferiblemente un grupo tiol. El inhibidor, en una realización preferida, es glutation. La concentración de glutation puede ser, por ejemplo, del orden de aproximadamente 0,5 a 30 mM. El material puede incubarse con el compuesto que inactiva patógenos y con el inhibidor, por ejemplo, durante al menos 1 a 48 horas aproximadamente.
Preferiblemente, el inhibidor reduce la inactivación de un patógeno por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 3 log en comparación con una inactivación control del patógeno que se lleva a cabo en ausencia del inhibidor. En otra realización preferida, en el método, el inhibidor reduce la inactivación de un patógeno vírico por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 1 log en comparación con una inactivación control del patógeno que se lleva a cabo en ausencia del inhibidor. Preferiblemente, en la realización en la que se trata un material que comprende glóbulos rojos, la función de los glóbulos rojos no se altera, de manera sustancial, después del tratamiento.
En una realización preferida, se proporciona un método, donde el método comprende tratar un material que contiene glóbulos rojos con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y, donde la función de los glóbulos rojos no se altera, de manera sustancial, con el tratamiento. En otra realización preferida, se proporciona un método donde el método comprende tratar el material con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la hemolisis de los glóbulos rojos es menor del 3% después de 28 días de almacenamiento.
Descripción breve de los dibujos
La Figura 1 es un gráfico que muestra la supervivencia de glóbulos rojos murinos después de tratamiento con glutation y con un compuesto que inactiva patógenos.
Mejor manera de llevar a cabo la invención
Se proporciona un método para inhibir compuestos que inactivan patógenos en productos sanguíneos in vitro o ex vivo. El método de acuerdo con la invención se define en la reivindicación 1. El compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran en una cantidad eficaz para inactivar patógenos en el material a la vez que se inhiben reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos. Por lo tanto, el inhibidor tiene un efecto protector al reducir las reacciones laterales no deseadas en los materiales como un producto sanguíneo, mientras que permite que se produzca la inactivación del patógeno.
Definiciones
"Patógeno" se define como cualquier agente que contiene ácido nucleico capaz de causar enfermedades en un ser humano, en otros mamíferos o vertebrados. El agente patógeno puede ser unicelular o multicelular. Ejemplos de patógenos son bacterias, virus, protozoos, hongos, levaduras, hongos y micoplasmas que causan enfermedades en los seres humanos, en otros mamíferos o vertebrados. El material genético del patógeno puede ser ADN o ARN, y el material genético puede estar presente como un ácido nucleico de una cadena o de doble cadena. En la Tabla I se listan ejemplos de virus, y no pretende limitar la invención de ninguna manera.
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(Tabla pasa a página siguiente)
TABLA I
1
2
La utilización "in vivo" de un material o compuesto se define como la introducción del material o compuesto en un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo.
La utilización "in vitro" de un material o compuesto se define como una utilización del material o del compuesto fuera de un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo, donde el material o el compuesto no se va a introducir de nuevo en un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo. Un ejemplo de una utilización in vitro puede ser el análisis de los componentes de una muestra de sangre utilizando equipos de laboratorio.
La utilización "ex vivo" de un compuesto se define como la utilización de un compuesto para el tratamiento de un material biológico fuera de un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo, donde este material biológico tratado se pretende utilizar dentro de un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo. Por ejemplo, la obtención de sangre de un ser humano, y la introducción de un compuesto en esa sangre para inactivar patógenos, se define como una utilización ex vivo de ese compuesto si se pretende volver a introducir la sangre en ese ser humano o en otro ser humano. El volver a introducir la sangre humana en ese ser humano o en otro ser humano sería una utilización in vivo de la sangre, en oposición a la utilización ex vivo del compuesto. Si el compuesto está todavía presente en la sangre cuando ésta se vuelve a introducir en el ser humano, entonces el compuesto, además de su utilización ex vivo, también se introduce in vivo.
Los "materiales que pueden tratarse" incluyen cualquier material, incluyendo materiales biológicos. Estos materiales incluyen productos químicos, disoluciones, que incluyen disoluciones de sales o tamponadas, y disolventes. Cualquier material que se ponga en contacto con, o sea introducido en un ser humano, mamífero, o vertebrado vivo, puede tratarse como se describe en la presente memoria cuando este contacto conlleve un riesgo de transmitir una enfermedad o patógenos,.
El "material biológico" se define como un material que se origina a partir de un organismo biológico de cualquier tipo. Los ejemplos de materiales biológicos incluyen, pero no están limitados a, sangre, productos sanguíneos como plasma, plasma fraccionado, preparaciones de plaquetas, glóbulos rojos y glóbulos rojos centrifugados, líquido cerebroespinal, saliva, orina, sudor, heces, semen, leche, muestras de tejidos, muestras de tejidos homogeneizadas, y cualquier otra sustancia que tenga su origen en un organismo biológico. Los materiales biológicos también incluyen material sintético que incorpora una sustancia que tiene su origen en un organismo biológico, como una preparación de vacuna que incluye un patógeno o una parte de éste (el patógeno, en este caso, es la sustancia que tiene su origen en un organismo biológico) o una proteína recombinante, una muestra preparada para análisis que es una mezcla de sangre y de reactivos analíticos, medio de cultivo celular, cultivos celulares, cultivos víricos, y otros cultivos derivados de un organismo vivo. De acuerdo con la invención sólo se tratan materiales biológicos relacionados con productos sanguíneos in vitro o ex vivo.
La "inactivación de patógenos" se define como la obtención de patógenos incapaces de reproducirse en un material. La inactivación se expresa como el logaritmo negativo de la fracción de patógenos remanentes capaces de reproducirse. De esta manera, si un compuesto a una determinada concentración da lugar a un 90% de los patógenos incapaces de reproducirse en un material, el 10% o un décimo (0,1) de los patógenos permanece capaz de reproducirse. El logaritmo negativo de 0,1 es 1, y esa concentración de ese compuesto se dice que ha inactivado el patógeno presente 1 log. De manera alternativa, se dice que el compuesto produce la reducción de 1 log a esa concentración. De esta manera, si un compuesto a una determinada concentración da lugar a todos a los patógenos incapaces de reproducirse menos un 10% o un décimo (0,1) de, se dice que inactiva los patógenos 1 log. La inactivación de todos los patógenos menos un 1% ó 0,1% correspondería a una reducción del patógeno a esa concentración de 2 log ó 3 log, respectivamente.
Compuestos que pueden ser inhibidos
Se pueden inhibir distintos compuestos en materiales, como materiales biológicos, utilizando los métodos descritos en la presente memoria. Los compuestos que pueden inhibirse incluyen compuestos que comprenden un grupo funcional que es, o que es capaz de formar y ha formado, por ejemplo in situ, un grupo reactivo, como un grupo electrofílico. Por ejemplo, el grupo funcional puede ser un grupo mostaza que es capaz de formar in situ un grupo reactivo, como un ion electrofílico aziridina, aziridinio, tiirano o tiiraniio. En otra realización, el grupo funcional puede ser un epóxido. El inhibidor comprende un grupo nucleofílico y actúa atrapando los grupos electrofílicos reactivos del compuesto mediante la reacción covalente del grupo nucleofílico del inhibidor con el grupo electrofílico reactivo. El inhibidor puede utilizarse para atrapar especies reactivas que incluyen el compuesto que comprende un grupo electrofílico así como especies reactivas formadas a partir de éste.
En una realización, se proporcionan métodos para inhibir compuestos que se utilizan para inactivar patógenos en materiales. En los productos sanguíneos, los patógenos que se desea inactivar incluyen microorganismos como microorganismos procariotas, eucariotas y víricos que contienen ácidos nucleicos, así como genomas de ácidos nucleicos o fragmentos de éstos de estos microorganismos. Los ejemplos de virus que pueden inactivarse incluyen virus con cubierta lipídica como el virus de la estomatitis vesicular (VSV), virus de sarcoma Moloney, virus Sindbis, virus de inmunodeficiencia humana (VIH-1, VIH-2), virus-I limfotorófico de células T humanas (HTLV-I), virus de la hepatitis B, de la hepatitis C y el grupo de virus herpes, así como virus sin cubierta incluyendo parvovirus.
Se han desarrollado compuestos que se utilizan para inactivar patógenos en materiales biológicos, donde los compuestos incluyen, o reaccionan in situ para formar, grupos electrofílicos reactivos, sin que se requiera fotoactivación. Los grupos electrofílicos reactivos reaccionan con los ácidos nucleicos de los patógenos como virus, y bacterias para inactivarlos. Estos compuestos reactivos, sin embargo, también pueden participar en reacciones laterales no deseadas. En la presente memoria se proporcionan métodos para añadir compuestos inhibidores para reducir las reacciones laterales no deseadas de estos compuestos, que inactivan patógenos por reacción de grupos electrofílicos del compuesto con el patógeno.
Los ejemplos de compuestos que inactivan patógenos que forman grupos electrofílicos reactivos y que pueden utilizarse para inactivar patógenos se describen en PCT WO 96/14737, PCT WO 96/39818 y en la Serie de Solicitud Provisional de EEUU No. 60/043.696, registrada el 15 de abril, 1997, y PCT relacionada publicada como WO 98/30545. De manera adicional, la mostaza nitrogenada, CH_{3}-N(CH_{2}CH_{2}Cl)_{2}, puede inactivar determinados patógenos. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225-230.
Los compuestos que inactivan patógenos preferidos son los que incluyen un anclaje unido covalentemente a un efector. El término "anclaje" se refiere a una fracción que es capaz de unirse de manera no covalente a un biopolímero de ácido nucleico, como ADN o ARN. El "anclaje" también es referido como "ligando que une ácido nucleico". El término "efector" se refiere a una fracción que es capaz de reaccionar con un ácido nucleico para formar un enlace covalente con el ácido nucleico. Preferiblemente, el efector es un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico, donde el grupo electrofílico es capaz de formar un enlace covalente con un ácido nucleico. Por ejemplo, PCT WO 96/14737, PCT WO 96/39818, y la Patente de EEUU No. 5.559.250, describen compuestos que inactivan patógenos que incluyen un efector que es un grupo mostaza, y un ligando que une ácido nucleico. También pueden utilizarse los compuestos que inactivan patógenos que incluyen una aziridina unida de manera covalente a un anclaje de poliamina, como se describe en Budowsky et al., Vaccine Research 5: 29-39 (1996); y en PCT WO 97/07674.
Un compuesto ejemplar es la mostaza de quinacrina, cuya estructura se muestra abajo.
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Los compuestos que inactivan patógenos pueden proporcionarse también en una forma en la que el anclaje está unido covalentemente a un ligando frangible, que está unido covalentemente al efector. El término "ligando frangible" se refiere a una fracción que une covalentemente el anclaje y el efector, y que es capaz de degradarse bajo determinadas condiciones de manera que el anclaje y el efector dejan de estar unidos covalentemente. La disposición anclaje-ligando frangible-efector permite a los compuestos unirse de manera específica al ácido nucleico, debido a la capacidad de unión del anclaje. Esto permite al efector estar próximo para reaccionar con el ácido nucleico. Los compuestos que inactivan patógenos que incluyen una disposición anclaje-ligando frangible-efector están descritos en la Serie de Solicitud Provisional de EEUU No. 60/043.696, registrada el 15 de abril, 1997 y en la PCT relacionada publicada como WO 98/30545 y en la Serie de Solicitud Provisional de Patente de EEUU No. 09/003.115, registrada el 6 de enero, 1998. El efector puede ser, por ejemplo, un grupo mostaza, un equivalente de un grupo mostaza, o un epóxido.
Los compuestos que inactivan patógenos (PIC) ejemplares incluyen PIC-1 y PIC-2, cuyas estructuras se muestran abajo. PIC-1 incluye un ligando frangible, con una función éster, mientras que PIC-2 incluye un ligando frangible, con una función amida.
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Es posible utilizar una amplia variedad de grupos como anclajes, ligandos, y efectores. Los ejemplos de grupos de anclaje incluyen, pero no están limitados a, intercaladores, ligandos ligandos del surco menor, ligandos del surco principal, moléculas que se unen por interacciones electrostáticas, incluyendo poliaminas, y moléculas que se unen mediante interacciones específicas de secuencia. La siguiente es una lista no limitante de posibles grupos de anclaje:
acridinas (y derivados de acridina, por ejemplo, proflavina, acriflavina, diacridinas, acridonas, benzacridinas, quinacrinas), actinomicinas, antraciclinonas, rodomicinas, daunomicina, tioxantenonas (y derivados de la tioxantenona, por ejemplo, miracil D), antramicina, mitomicinas, equinomicina (quinomicina A), triostinas, elipticina (y dímeros, trímeros y análogos de ésta), norfilina A, fluorenos (y derivados, por ejemplo, fluorenonas, fluorenodiaminas), fenacinas, fenantridinas, fenotiacinas (por ejemplo, clorpromacina), fenoxacinas, benzotiazoles, xantenos y tioxantenos, antraquinonas, antrapirazoles, benzotiopiranoindoles, 3,4-benzopireno, 1-pireniloxirano, benzantracenos, benzodipironas, quinolinas (por ejemplo, cloroquina, quinina, fenilquinolina carboxamidas), furocumarinas (por ejemplo, psoralenos e isopsoralenos), etidio, propidio, coralina e hidrocarburos aromáticos policíclicos y sus derivados oxirano;
diatamicina, netropsina, otras lexitropsinas, Hoechst 33258 y otros colorantes Hoechst, DAPI (4',6-diamidino-2-fenilindol), berenil, y colorantes triarilmetano;
aflatoxinas;
espermina, espermidina, y otras poliaminas; y
ácidos nucleicos o análogos que se unen mediante interacciones específicas de secuencia como la formación de triple hélice, formación de bucle D, y apareamiento de bases directo a dianas de cadena simple. Los derivados de estos compuestos también son ejemplos no limitantes de grupos de anclaje, donde un derivado de un compuesto incluye, pero no está limitado a, un compuesto que presenta uno o más sustituyentes de cualquier tipo en cualquier localización, productos de oxidación o reducción del compuesto, etc.
Los ejemplos de ligandos frangibles incluyen, pero no están limitados a, fracciones que incluyen grupos funcionales como éster (donde el carbono carbonilo del éster está entre el anclaje y el oxígeno sp^{3} del éster; esta disposición también se denomina "éster adelantado"), "éster invertido" (donde el oxígeno sp^{3} del éster está entre el anclaje y el carbono carbonilo del éster), tioéster (donde el carbono carbonilo del tioéster está entre el anclaje y el sulfuro del tioéster, también denominado "tioéster adelantado"), tioéster invertido (donde el sulfuro del tioéster está entre el anclaje y el carbono carbonilo del tioéster, también denominado "tioéster invertido"), tionoéster adelantado e invertido, ácido ditioico adelantado e invertido, sulfato, sulfonatos adelantados e invertidos, fosfato, y grupos fosfonato adelantados e invertidos. "Tioéster" designa el grupo -C(=O)-S; "tionoéster" designa el grupo -C(=S)-O-, y "ácido ditioico" designa el grupo -C(=S)-S-. El ligando frangible también puede incluir una amida, donde el carbono carbonilo de la amida está entre el anclaje y el nitrógeno de la amida (también denominada "amida adelantada"), o donde el nitrógeno de la amida está entre el anclaje y el carbono carbonilo de la amida (también denominada "amida invertida"). Para los grupos que pueden ser designados como "adelantados" e "invertidos", la orientación adelantada es la orientación de los grupos funcionales en la que, después de la hidrólisis del grupo funcional, la función ácida resultante está unida covalentemente a la fracción del anclaje y la función alcohol, tiol o amina resultante está unida covalentemente a la fracción del efector. La orientación invertida es la orientación de los grupos funcionales en la que, después de la hidrólisis del grupo funcional, la función ácida resultante está unida covalentemente a la fracción del efector y la función alcohol, tiol o amina resultante está unida covalentemente a la fracción del anclaje.
El ligando frangible, como una fracción amida, también puede ser capaz de degradarse bajo condiciones de degradación enzimática, por enzimas endógenas del material biológico que se va a tratar, o por enzimas añadidas al material.
Los ejemplos de efectores incluyen, pero no están limitados a, grupos mostaza, equivalentes de grupos mostaza, epóxidos, aldehidos, sintones de formaldehido, y otros agentes de entrecruzamiento y alquilantes. Los grupos mostaza se definen incluyendo grupos mono o bis haloetilamina, y grupos mono haloetilsulfuro. Los equivalentes de los grupos mostaza se definen mediante grupos que reaccionan por un mecanismo similar a las mostazas, como grupos mono o bis mesiletilamina, grupos mono mesiletilsulfuro, grupos mono o bis tosiletilamina, y grupos mono tosiletilsulfuro. Los sintones de formaldehido se definen como cualquier compuesto que se degrada en formaldehido en una disolución acuosa, incluyendo hidroximetilaminas como hidroximetilglicina. En la Patente de EEUU No. 4.337.269 y en la Solicitud de Patente Internacional WO 97/02028 aparecen ejemplos de sintones de formaldehido.
La concentración del compuesto que inactiva patógenos puede seleccionarse en base a factores como los tipos de patógenos, la naturaleza del material biológico tratado, y el compuesto utilizado.
Compuestos inhibidores
Se proporcionan métodos para el tratamiento de materiales biológicos con compuestos inhibidores, también referidos en la presente memoria como "inhibidores", para reducir las reacciones laterales no deseadas de especies electrofílicas reactivas en el material. En particular, se proporcionan métodos para inhibir reacciones laterales no deseadas de los compuestos que inactivan patógenos en materiales biológicos, donde los compuestos que inactivan patógenos contienen o son capaces de formar grupos electrofílicos que dañan el ácido nucleico de los patógenos. El inhibidor reduce reacciones no deseadas del compuesto que inactiva patógenos y de los productos de reacción producidos por el compuesto que inactiva patógenos. Son preferidos los inhibidores que incluyen grupos nucelofílicos capaces de reaccionar con los grupos electrofílicos del compuesto que inactiva patógenos. El inhibidor que comprende un grupo nucleofílico atrapa grupos electrofílicos reactivos del compuesto mediante una reacción covalente del grupo nucleofílico del inhibidor con el grupo electrofílico reactivo. Las especies reactivas que pueden ser atrapadas por el inhibidor incluyen el compuesto que comprende un grupo electrofílico así como especies que comprenden un grupo electrofílico reactivo formado a partir de éste.
Una ventaja de los métodos descritos en la presente memoria es que puede utilizarse una cantidad eficaz del inhibidor de manera que se reducen las reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos y, sin embargo, todavía puede producirse la inactivación de los patógenos por el compuesto que inactiva patógenos. De esta manera, el inhibidor tiene un efecto protector reduciendo las reacciones laterales no deseadas en materiales como la sangre, a la vez que permite que se produzca la inactivación de los patógenos. Se pueden reducir distintas reacciones laterales. Por ejemplo, en los métodos en los que se tratan materiales que contienen productos sanguíneos, se puede reducir la modificación de los glóbulos rojos. Por ejemplo, puede reducirse la unión de proteínas, como IgG, y/o la unión del compuesto que inactiva patógenos a los glóbulos rojos.
En una realización, un producto sanguíneo se trata con un compuesto que inactiva patógenos que comprende un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico y con el inhibidor. En una realización preferida, el compuesto que inactiva patógenos incluye un ligando que une ácidos nucleicos y un efector que es un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico reactivo. El grupo electrofílico puede ser, por ejemplo, un ion oxirano, tiirano, tiiranio, o aziridinio o aziridina. El efector puede ser un grupo mostaza que es capaz de formar el grupo electrofílico. El grupo mostaza puede, por ejemplo, ser capaz de formar una aziridina electrofílica, o un ion electrofílico aziridinio o tiiranio, in situ.
En el método, el material biológico se trata con un inhibidor que comprende un grupo funcional nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos. El inhibidor se añade al material antes de, simultáneamente con, o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. En una realización preferida, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente a la adición del compuesto que inactiva patógenos. En una realización particularmente preferida, el inhibidor se añade simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente, por ejemplo, en los 15-20 minutos aproximadamente o, de manera opcional, en los 10 minutos aproximadamente antes o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. El material se trata in vitro o ex vivo. Los inhibidores preferidos son los que reducen las reacciones laterales no deseadas de los compuestos que inactivan patógenos sin interferir con la capacidad del compuesto que inactiva patógenos para inactivar patógenos, y sin cambiar, de manera sustancial, las propiedades del material biológico.
Los ejemplos de inhibidores son compuestos que incluyen grupos nucleofílicos, u otros grupos que reaccionan con los grupos electrofílicos. También pueden utilizarse las mezclas de compuestos inhibidores. Los grupos nucleofílicos ejemplares incluyen tiol, tioácido, ácido ditioico, tiocarbamato, ditiocarbamato, amina, fosfato, y grupos tiofosfato. El inhibidor puede ser, o contener, un heterociclo con nitrógeno como piridina. El inhibidor puede ser un compuesto que contiene fosfato como glucosa-6-fosfato. El inhibidor también puede ser un compuesto que contiene tiol, incluyendo, pero no estando limitado a, glutation, cisteína, N-acetilcisteína, mercaptoetanol, dimercaprol, mercaptano, ácido mercaptoetanosulfónico y sales de éstos, por ejemplo, MESNA, homocisteína, aminoetano tiol, dimetilaminoetano tiol, ditiotreitol, y otros compuestos que contengan tiol. Los inhibidores también pueden estar en forma de una sal, como sal sódica o hidrocloruro.
Otros compuestos que contienen tiol incluyen metil tioglicolato, ácido tioláctico, tiofenol, 2-mercaptopiridina, 3-mercapto-2-butanol, 2-mercaptobenzotiazol, ácido tiosalicílico y ácido tioctico. Los compuestos tiol aromáticos ejemplares incluyen ácido 2-mercaptobencimidazolsulfónico, ácido 2-mercapto-nicotínico, naptalentiol, quinolina tiol, 4-nitro-tiofenol, y tiofenol. Otros inhibidores incluyen nitrobencilpiridina y nucleófilos inorgánicos como sales de selenuro y selenuros orgánicos como selenurocisteína, tiosulfato, sulfito, sulfuro, tiofosfato, pirofosfato, hidrosulfuro, y ditionita. El inhibidor también puede ser un compuesto peptídico que contenga un grupo nucleofílico. Por ejemplo, el inhibidor puede ser un compuesto que contenga cisteína, por ejemplo, un dipéptido, como GlyCys, o un tripéptido, como glutation.
También están dentro del ámbito de la invención complejos macromoleculares que incluyen el grupo nucleofílico o un compuesto que contiene el grupo nucleofílico. En otra realización, el grupo nucleofílico, como un grupo tiol, o un compuesto que incluye el grupo nucleofílico, se inmoviliza en un soporte sólido, como un material de cromatografía, para formar un inhibidor inmovilizado. El soporte sólido puede ser, por ejemplo, una agarosa, poliestireno u otro material de cromatografía. Por ejemplo, el glutation, u otros compuestos que contienen un grupo nucleofílico como un grupo sulfuro, pueden unirse a una agarosa activada con epoxi. Por ejemplo, agarosa-glutation, está disponible comercialmente en Sigma (St. Louis, MO), donde el glutation está unido a través del grupo amino a agarosa activada con epoxi entrecruzada 4% a través de un espaciador de 10 carbonos. De manera adicional, agarosa-cisteína, disponible en Sigma, está unida a través del grupo amino a agarosa activada con bromuro de cianógeno entrecruzada 4%. Cualquiera de un conjunto de resinas u otros materiales de cromatografía activados pueden derivatizarse para incluir uno, dos o más grupos nucleofílicos. Estas matrices activadas que pueden derivatizarse incluyen matrices activadas con bromuro de cianógeno, epoxi, cloroformato de nitrofenilo y N-hidroxisuccinimidilo, tiopiridilo, poliacrilhidracido, y oxirano acrílico. Otros materiales de cromatografía ejemplares que incluyen grupos nucleofílicos inmovilizados, como tioles, que están disponibles comercialmente incluyen resina que contiene poliestireno tiol Duolite GT-73 y Duolite C-467 que incluye grupo amino fosfónico (Supelco, Bellefonte, PA).
En otra realización, la reacción del inhibidor puede estar catalizada por la reacción de una enzima, como la glutation transferasa. La presencia de la glutation transferasa puede influir también en la reactividad del inhibidor con el compuesto que inactiva patógenos que comprende un grupo electrofílico. Por ejemplo, la glutation transferasa puede compartimentalizarse en un sistema de membrana para permitir que se produzca la inhibición y que se amplifique en el área en el que está presente la glutation transferasa.
El inhibidor también puede generarse in situ, por ejemplo, por la reacción de una enzima, o a través de una redisposición química, a partir de una molécula precursora. Un ejemplo de un compuesto que genera un inhibidor in situ mediante catálisis enzimática es amifosteno (Ethyol®, U.S. Bioscience, West Conshohocken, PA).
Propiedades preferidas de los inhibidores para el tratamiento de productos sanguíneos
En una realización, se proporcionan métodos para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un material biológico que comprende glóbulos rojos. Por ejemplo, el material puede ser un producto sanguíneo con un hematocrito de aproximadamente 30-85%. El compuesto que inactiva patógenos incluye preferiblemente un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico.
El inhibidor se añade al producto sanguíneo antes de, simultáneamente con, o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. Preferiblemente, en el tratamiento de un producto sanguíneo, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente, o en los 15-20 minutos aproximadamente, o de manera opcional, en los 10 minutos aproximadamente de la adición del compuesto que inactiva patógenos. Los ejemplos de los productos sanguíneos que pueden tratarse ex vivo o in vitro incluyen sangre completa, plaquetas, glóbulos rojos y plasma. Los inhibidores preferidos son compuestos que reducen las reacciones laterales no deseadas de los compuestos reactivos, sin afectar de manera significativa la inactivación de los patógenos, o el producto sanguíneo. Por ejemplo, los inhibidores pueden añadirse a un producto sanguíneo tratado con un compuesto que inactiva patógenos, donde el compuesto que inactiva patógenos incluye i) un ligando que une ácido nucleico, capaz de unirse de manera no covalente a un ácido nucleico; y ii) un grupo que es, o que es capaz de formar un grupo electrofílico, como un grupo electrofílico catiónico. Son preferidos los inhibidores que pueden reducir las reacciones laterales no deseadas de los compuestos sin afectar de manera significativa la inactivación de los patógenos o las propiedades del producto sanguíneo particular que se está tratando. Un inhibidor preferido es el glutation.
El compuesto que inactiva patógenos en una realización preferida incluye un ligando que une ácido nucleico y un grupo mostaza que es capaz de reaccionar in situ para formar el grupo electrofílico, donde el grupo electrofílico es un ion aziridinio. Los compuestos que incluyen un ligando que se une de manera no covalente a ácido nucleico y un grupo mostaza se describen, por ejemplo, en la Patente de EEUU No. 5.559.250. Los compuestos ejemplares incluyen mostaza de quinacrina. Se cree que estos compuestos inactivan los patógenos por unión a y por alquilación de su ácido nucleico. En la reacción de inactivación, el grupo mostaza del compuesto forma un ion aziridinio reactivo. Se cree que los ácidos nucleicos de los patógenos reaccionan con los compuestos mediante un ataque nucleofílico del ácido nucleico al aziridinio electrofílico intermedio formado por el compuesto. Aunque no se limite por ninguna teoría, se cree que los inhibidores como el glutation reaccionan con estos compuestos que inactivan patógenos de manera similar, mediante un ataque nucleofílico del inhibidor al aziridinio electrofílico intermedio, para producir un producto o productos de reacción que no son ya capaces de reaccionar con los ácidos nucleicos.
Aunque no se limite por ninguna teoría, en el Esquema I, abajo, se muestra un mecanismo propuesto de la reacción de nucleófilos (Nu_{1} y Nu_{2}) con un grupo mostaza de un compuesto que inactiva patógenos.
Esquema I
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El grupo mostaza puede estar en la forma protonada B, o en la forma desprotonada A, como se muestra en el Esquema I. Típicamente, a pH fisiológico, la formación intramolecular de los intermedios aziridinio C y E es sencilla. Se utilizan los inhibidores que incluyen grupos nucleofílicos que son capaces de reaccionar con los intermedios aziridinio C y E, para formar el producto final F, donde los grupos nucleofílicos han reemplazado a los átomos de cloro del grupo mostaza.
Aunque la reactividad del ion aziridinio es alta, las velocidades de la reacción dependen de las propiedades del nucleófilo que reacciona. Aún más, los inhibidores nucleófilos pueden competir con otros nucleófilos endógenos presentes, por ejemplo, cuando están presentes a concentraciones mayores que los otros nucleófilos endógenos, o cuando son más reactivos. En condiciones fisiológicas, el grupo nucleofílico preferido es un grupo tiol. Otros grupos nucleofílicos incluyen grupos fosfato y amino.
El inhibidor preferiblemente mantiene la función del producto sanguíneo y minimiza los efectos secundarios del compuesto que inactiva patógenos. Un inhibidor preferido para el tratamiento de productos sanguíneos, particularmente de productos sanguíneos que contienen glóbulos rojos, es el glutation. El glutation es particularmente útil para utilizarse en el tratamiento de materiales que contienen glóbulos rojos en combinación con agentes que inactivan patógenos que forman intermedios aziridinio, como los compuestos que inactivan patógenos que contienen grupos mostaza. El grupo tiol del glutation reacciona más rápido con el intermedio aziridinio que con el compuesto mostaza parental.
Preferiblemente el inhibidor no penetra, de manera sustancial, las membranas externas del patógeno, como las membranas celulares y las cubiertas lipídicas de los virus. Preferiblemente, el inhibidor no penetra las membranas lipídicas de los virus, bacterias y de otros patógenos diana, en un grado suficiente como para disminuir significativamente el daño producido por el compuesto que inactiva patógenos al ácido nucleico del patógeno. De manera adicional, el inhibidor preferiblemente reacciona con el grupo electrofílico formado a partir del compuesto que inactiva patógenos, en preferencia a reaccionar con el compuesto en sí mismo. Aunque no se limite por ninguna teoría, se cree que el compuesto que inactiva patógenos puede cruzar las membranas del patógeno libremente, como las cubiertas lipídicas víricas y las membranas bacterianas, pero después de que se forme el grupo electrofílico catiónico, como un ion aziridinio, el compuesto no puede cruzar las membranas de los patógenos de manera significativa. De esta manera, los cationes electrofílicos que se forman fuera del patógeno diana no pueden entrecruzar de manera sustancial los ácidos nucleicos; sin embargo, el inhibidor puede reaccionar con ellos. Por el contrario, si el catión electrofílico se forma dentro del patógeno, en una realización, el inhibidor no es eficaz atravesando la membrana del patógeno, y el entrecruzamiento de los ácidos nucleicos se produce sin interferencia significativa del inhibidor añadido.
Se prefiere que el inhibidor reaccione con el compuesto que inactiva patógenos para inhibir reacciones laterales no deseadas sin interferir con la inactivación de los patógenos por el compuesto que inactiva patógenos. Esto puede ocurrir, por ejemplo, mediante la utilización de un inhibidor que no atraviese, de manera sustancial, las membranas de los patógenos, y, por lo tanto, inhibe reacciones laterales fuera de las membranas de los patógenos. En otra realización, el inhibidor puede reaccionar tan lentamente, desde un punto de vista cinético, con el compuesto que inactiva patógenos, o con los intermediarios reactivos formados a partir de éste, que no interfiere, de manera sustancial, con la inactivación de los patógenos.
En una realización, los inhibidores pueden administrarse a sistemas de fases múltiples, como a sistemas de dos fases que comprenden una membrana que separa la primera y la segunda fase. En una realización, en el sistema de dos fases, una fase está unida por una membrana. La membrana puede ser una barrera semipermeable natural o artificial compuesta de moléculas naturales o sintéticas o de mezclas de éstas. Por ejemplo, la fase unida a la membrana puede ser el interior de un organismo patógeno, y la otra fase puede ser la fase en la que está contenido el organismo patógeno. Por ejemplo, el patógeno puede estar suspendido en una fase líquida, como una fase líquida que incluye la sangre. La fase unida a membrana, por ejemplo, puede ser el interior de una cubierta lipídica vírica que comprende los ácidos nucleicos víricos. En otra realización, la membrana puede ser una membrana celular, y la fase unida a la membrana puede ser el interior de un organismo patógeno unicelular, como una bacteria. Preferiblemente, al menos una parte del compuesto que inactiva patógenos es capaz, desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana, mientras que el inhibidor no es capaz, desde un punto de vista cinético o termodinámico, de atravesar la membrana, respecto al compuesto que inactiva patógenos.
Otras membranas incluyen liposomas, como se describe, por ejemplo, en Lasic, D., Liposomes in Gene Delivery, CRC Press, Boca Raton, FL, 1997, Capítulo 6. Los liposomas pueden formarse como partículas vesiculares utilizando moléculas amfílicas, como lectinas, esfingomielinas, y fosfatidiletanolaminas. Los liposomas también pueden formarse utilizando lípidos cargados negativamente como fosfatidilserinas, fosfatidilgliceroles y fosfatidilinositoles. Los liposomas catiónicos también pueden prepararse utilizando detergentes catiónicos que están disponibles comercialmente, o utilizando grupos policatiónicos unidos a colesterol, como se describe en Gao y Huang, Biochem. Biophys. Res. Commun., 179:280-285 (1991); Nucleic Acids Res., 21:2867-2872 (1993); y Biochemistry, 35:1027-1036 (1996). Las membranas también incluyen cubiertas víricas artificiales, como se describe en la Patente de EEUU No. 5.753.258. Las membranas incluyen además las membranas de células no patógenas como leucocitos.
En una realización, se proporciona un método para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un material biológico de dos fases que comprende una primera fase que comprende un líquido que tiene un patógeno que comprende una membrana, y una segunda fase unida por la membrana del patógeno. El material biológico se trata con un compuesto que inactiva patógenos que comprende un grupo funcional que es capaz de formar un grupo electrofílico. Antes de, simultáneamente con, o después del tratamiento con el compuesto que inactiva patógenos, el material biológico se trata con un inhibidor que comprende un grupo nucleofílico que es capaz de reaccionar de manera covalente con el grupo electrofílico. Preferiblemente, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente, o en los 15-20 minutos aproximadamente o, de manera opcional, en los 10 minutos aproximadamente antes o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos.
Preferiblemente, el compuesto que inactiva patógenos atraviesa, de manera sustancial, la membrana desde un punto de vista cinético, antes de la formación del grupo electrofílico, respecto al inhibidor. Preferiblemente, el compuesto que inactiva patógenos tampoco atraviesa, de manera sustancial, la membrana desde un punto de vista cinético después de la formación del grupo electrofílico, respecto al compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico. Se permite al inhibidor reaccionar con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos, y la reacción del inhibidor con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos ocurre, de manera sustancial, en la primera fase. El compuesto que inactiva patógenos que comprende el grupo electrofílico reacciona con un ácido nucleico del patógeno en la segunda fase, dentro de la membrana del patógeno, inactivando de esta manera el patógeno. La membrana puede comprender, por ejemplo, un lípido. El patógeno puede ser, por ejemplo, un virus que comprende una cubierta lipídica que define la membrana, donde la segunda fase se define por el interior de la cubierta lipídica. El patógeno también puede ser una bacteria que comprende una membrana celular que comprende un lípido que define la membrana del sistema de dos fases, donde la segunda fase se define por el interior de la membrana celular.
Ventajosamente, en el sistema de dos fases, el inhibidor se administra a la primera fase y no es capaz de atravesar la membrana del patógeno de manera sustancial. El compuesto que inactiva patógenos se administra, por ejemplo, a la primera fase. El compuesto que inactiva patógenos es capaz de atravesar la membrana hacia la segunda fase, antes de la formación del grupo electrofílico. Después de la formación del grupo electrofílico in situ, el compuesto que inactiva patógenos no es capaz ya de atravesar la membrana de manera sustancial. De esta manera, la inhibición ocurre selectivamente en la primera fase, mientras que en la segunda fase, es decir, en el interior del patógeno, el compuesto que inactiva patógenos reacciona con los ácidos nucleicos del patógeno sin inhibición. De esta manera, en un material biológico, como un producto sanguíneo, la inhibición de los grupos reactivos del compuesto que inactiva patógenos y de los productos de degradación de éste se produce selectivamente en la primera fase en la que el patógeno está suspendido. La inhibición en la primera fase reduce de esta manera las reacciones laterales no deseadas del grupo reactivo del compuesto que inactiva patógenos en la primera fase, como la modificación covalente de las proteínas en la sangre. En el método, el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran en una cantidad eficaz para inactivar patógenos en el material mientras que se inhiben las reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos. De esta manera, el inhibidor tiene un efecto protector en la reducción de las reacciones laterales no deseadas en materiales como un producto sanguíneo, mientras que permite que se produzca la inactivación de los patógenos.
El glutation tiene muchas propiedades que lo hacen particularmente útil como inhibidor. Normalmente, está presente en todos los tipos celulares. No se piensa que sea capaz de pasar pasivamente a través de las membranas, como las membranas celulares o las cubiertas lipídicas, de bacterias y de virus con cubiertas lipídicas. A pH 7, el glutation está cargado y en ausencia de transporte activo no penetra las bicapas lipídicas de manera significativa. Esto es consistente con el hecho de que la inactivación vírica de VSV y de otros virus con cubierta no se afecte, de manera sustancial, por el glutation. La inactivación de virus con cubierta lipídica como VIH y VSV no se ve afectada por la presencia de glutation o de N-acetilcisteína, dos agentes tiol de inhibición. El glutation tiene un efecto pequeño en la inactivación vírica, y aunque tiene algún efecto en la inactivación de Staphylococcus epidermis y Yersinia enterocolitica, esto puede solucionarse minimizando la dosis del inhibidor añadido. Por ejemplo, la presencia de aproximadamente 2-4 mM glutation reduce la inactivación por 0,3 mM PIC-1 de Yersinia enterocolitica aproximadamente 1 a 2 log de reducción. El glutation también es compatible con el almacenamiento in vitro de los glóbulos rojos.
Se prefiere los inhibidores que no dañen, de manera sustancial, la función de los glóbulos rojos y que no modifiquen los glóbulos rojos después del tratamiento, y que tampoco reduzcan, de manera sustancial, la inactivación de los patógenos por el compuesto que inactiva patógenos. La ausencia de un efecto dañino sustancial en la función de los glóbulos rojos puede determinarse mediante métodos conocidos en el campo para evaluar la función de los glóbulos rojos. Por ejemplo, pueden determinarse los niveles de indicadores como el ATP intracelular (adenosina 5'-trifosfato), 2,3-DPG intracelular (2,3-difosfoglicerol) o potasio extracelular, y compararlos con el control sin tratar. De manera adicional, pueden determinarse hemolisis, pH, hematocrito, hemoglobina, fragilidad osmótica, consumo de glucosa y producción de lactato.
Los métodos para determinar ATP, 2,3-DPG, glucosa, hemoglobina, hemolisis y potasio están disponibles en el campo, Véase, por ejemplo, Davey et al., Transfusion, 32:525-528 (1992), cuya descripción se incorpora en la presente memoria. Los métodos para determinar la función de los glóbulos rojos también se describen en Greenwalt et al., Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al., Vox Sang, 65:271-278 (1993); y Beutler et al., Blood, Vol. 59 (1982) cuyas descripciones se incorporan en la presente memoria mediante referencia. Los niveles de potasio extracelular pueden determinarse utilizando un Analizador K^{+}/Na^{+} Ciba Corning Modelo 614 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). El pH puede determinarse utilizando un Analizador de Sangre de Gas Ciba Corning Modelo 238 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA).
En el método para el tratamiento de los glóbulos rojos con un compuesto que inactiva patógenos que incluye un ligando que une ácidos nucleicos y un grupo mostaza, en presencia del inhibidor, como glutation, preferiblemente, en una realización, el nivel de potasio extracelular no es mayor de 3 veces, más preferiblemente no mayor de 2 veces la cantidad presente en el control sin tratar después de 1 día.
También, en una realización, se prefieren inhibidores que inhiben la modificación no deseada de los glóbulos rojos durante la inactivación de los patógenos, como lisis u otro daño. Preferiblemente, la hemolisis de los glóbulos rojos tratados es menor de 3% después de 28 días de almacenamiento, más preferiblemente menor de 2% después de 42 días de almacenamiento, y más preferiblemente menor que o igual a aproximadamente 1% después de 42 días de almacenamiento a 4ºC.
Se prefieren los inhibidores que pueden reducir la unión de proteínas, como la unión de IgG a los glóbulos rojos y que pueden utilizarse en condiciones que no inhiben, de manera sustancial, la inactivación de los patógenos, en comparación con un control en ausencia de un inhibidor. Se prefieren también inhibidores que inhiben la unión de los compuestos que inactivan patógenos a las superficies de los glóbulos rojos. Un inhibidor ejemplar es el glutation. El glutation reduce ventajosamente la modificación potencial de los glóbulos rojos por los compuestos que inactivan patógenos.
La unión de especies como IgG, albúmina, e IgM a los glóbulos rojos también puede determinarse utilizando métodos disponibles en el campo. En una realización, en un método para el tratamiento de los glóbulos rojos con un compuesto que inactiva patógenos que incluye un ligando que une ácidos nucleicos y un efector como un grupo mostaza, en presencia de un inhibidor, la unión de IgG a los glóbulos rojos puede reducirse en comparación con la unión de IgG en ausencia del inhibidor. La unión de IgG a los glóbulos rojos en presencia de un inhibidor, como glutation, y del compuesto que inactiva patógenos es preferiblemente menor de aproximadamente el 75%, o preferiblemente menor de aproximadamente el 50% de la unión de IgG en ausencia del inhibidor.
La unión de moléculas a los glóbulos rojos puede detectarse utilizando anticuerpos, por ejemplo, frente a acridina e IgG. Los anticuerpos para ser utilizados en los ensayos pueden obtenerse comercialmente, o pueden obtenerse utilizando los métodos disponibles en el campo, por ejemplo, como se describe en Harlow y Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory," 1988, cuya descripción se incorpora en la presente memoria. Por ejemplo, anti-IgG se puede obtener de Caltag, Burlingame, CA; Sigma Chemical Co., St. Louis, MO y Lampire Biological Laboratory, Pipersvelle, PA.
Son preferidos los inhibidores que reducen la unión del compuesto que inactiva patógenos, o de fragmentos de éste, a los glóbulos rojos. En la realización en la que un material biológico que contiene glóbulos rojos se trata con un compuesto que inactiva patógenos que incluye un efector como un grupo mostaza y un grupo que une ácidos nucleicos, como un grupo acridina, se puede reducir la unión del compuesto que inactiva patógenos, o de fragmentos de éste, a los glóbulos rojos. Por ejemplo, se puede reducir la unión de acridina derivada de un compuesto que inactiva patógenos, donde el ligando que une ácidos nucleicos es la acridina, a los glóbulos rojos en presencia de un inhibidor como glutation. En una realización preferida, la unión de acridina a los glóbulos rojos tratados con un compuesto que inactiva patógenos que incluye un grupo acridina en presencia del inhibidor es menor de aproximadamente el 75%, o preferiblemente menor de aproximadamente el 50% o, en otra realización preferida, menor de aproximadamente el 5% de la unión de acridina en ausencia del inhibidor.
En una realización, se proporcionan inhibidores que disminuyen la concentración de las especies electrofílicas reactivas alquilantes después de la inactivación de los patógenos, por ejemplo, al menos aproximadamente un 5% o, aproximadamente un 20% o, de manera opcional, aproximadamente un 50% o más, en aproximadamente 1 a 48 horas, por ejemplo, aproximadamente 24 horas. La presencia de las especies electrofílicas reactivas puede determinarse utilizando métodos disponibles en el campo, como métodos cromatográficos que incluyen LC-MS (cromatografía líquida - espectroscopía de masas).
También son preferidos en una realización los inhibidores que reducen la inactivación de un patógeno por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 1 log, o no más de aproximadamente 2 log o, de manera opcional, no más de aproximadamente 3 log o, en otra realización, no más de 4 log, en comparación con una inactivación control del patógeno en ausencia del inhibidor. Preferiblemente, el inhibidor reduce la inactivación de un patógeno vírico por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 1 log o, no más de aproximadamente 2 log o, de manera opcional, no más de aproximadamente 3 log, en comparación con una inactivación control del patógeno en ausencia del inhibidor. La concentración del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor puede ajustarse para obtener el log de reducción deseado, y para minimizar la reducción de la inactivación que puede ocurrir como consecuencia de la presencia del inhibidor.
En una realización preferida, se proporciona un método, donde el método comprende tratar un material que contiene glóbulos rojos con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la función de los glóbulos rojos no se altera de manera sustancial por el tratamiento. En otra realización preferida, se proporciona un método que comprende tratar el material con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la hemolisis de los glóbulos rojos es menor del 3% después de 28 días de almacenamiento después del tratamiento.
Los glóbulos rojos tratados con glutation no muestran una diferencia significativa en la función de los glóbulos rojos comparada con controles sin tratar. El glutation por sí mismo no contribuye de manera significativa a la lisis de los glóbulos rojos o a otro daño, como se determina mediante ensayos funcionales in vivo o in vitro. El glutation puede reducir la lisis de los glóbulos rojos en presencia de compuestos que inactivan patógenos. Los glóbulos rojos pueden tratarse con glutation in vitro o ex vivo. Algunos compuestos como tiosulfato, MESNA y N-acetilcisteína son menos activos o pueden modificar los glóbulos rojos a concentraciones eficaces para la inhibición.
Condiciones para la inactivación de patógenos y para la inhibición
Las condiciones para tratar materiales biológicos con un compuesto que inactiva patógenos y con un inhibidor para reducir las reacciones laterales no deseadas pueden seleccionarse en base al material seleccionado, al inhibidor y al compuesto que inactiva. Las condiciones se seleccionan para producir la inactivación de los patógenos sin alterar, de manera sustancial, el material biológico.
De acuerdo con la invención, los productos sanguíneos se inactivan in vitro o ex vivo con un compuesto que inactiva patógenos que incluye un ligando que une ácidos nucleicos y un efector como un grupo mostaza, donde el grupo mostaza es capaz de formar un grupo electrofílico reactivo in situ. El producto sanguíneo se trata con un inhibidor para evitar reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos sin afectar, de manera significativa, las propiedades del producto sanguíneo. El inhibidor puede añadirse al producto sanguíneo antes, después o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. Preferiblemente, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente o en los 15 a 20 minutos aproximadamente o, de manera opcional, en los 10 minutos aproximadamente, antes o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. Los materiales que contienen glóbulos rojos pueden tratarse in vitro o ex vivo.
La concentración del compuesto que inactiva patógenos y del agente de inhibición en el producto sanguíneo que se está tratando puede ajustarse según se necesite para producir la reducción deseada de las reacciones laterales no deseadas, a la vez que se protege la propiedad del material, como la función de los glóbulos rojos, y se logra también el log de reducción deseado de los patógenos.
La concentración del inhibidor puede ser, en un ejemplo no limitante, aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 30 mM o, aproximadamente 0,5 mM a 30 mM. Un ejemplo no limitante de las condiciones adecuadas para el tratamiento de glóbulos rojos es aproximadamente 0,1 mM a aproximadamente 30 mM glutation, por ejemplo, aproximadamente 0,5 mM a 20 mM o, aproximadamente 2 mM a 4 mM glutation o, en otra realización, aproximadamente 1 mM a 3 mM.
La proporción molar de inhibidor:compuesto que inactiva patógenos, en una realización no limitante, puede oscilar entre aproximadamente 100:1 a 1:1, por ejemplo, aproximadamente 50:1 o, por ejemplo, aproximadamente 10:1. Una proporción ejemplar no limitante de glutation:compuesto que inactiva patógenos que puede utilizarse para el tratamiento de glóbulos rojos puede ser de aproximadamente 100:1 a 1:1, por ejemplo, aproximadamente 50:1 a 1:1 o, en otra realización, aproximadamente 10:1 a aproximadamente 2:1. En una realización preferida, la proporción molar de glutation:compuesto que inactiva patógenos es aproximadamente 10:1. Por ejemplo, en el tratamiento de una composición que comprende glóbulos rojos, la concentración molar de glutation es preferiblemente de 5 a 20 veces, por ejemplo, aproximadamente 10 veces la concentración molar del compuesto que inactiva patógenos. La proporción del inhibidor respecto al compuesto que inactiva patógenos variará dependiendo del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor seleccionado.
Las concentraciones típicas del compuesto que inactiva patógenos que incluye un ligando que une ácidos nucleicos y un efector como un grupo mostaza son del orden de aproximadamente 0,1 \muM a 5 mM, por ejemplo, aproximadamente 50 a 500 \muM. Por ejemplo, se puede utilizar una concentración de un compuesto que inactiva patógenos que sea suficiente para inactivar al menos aproximadamente un log, por ejemplo, al menos aproximadamente 3 a 6 log o, de manera opcional, al menos aproximadamente 5 ó 6 log del patógeno en la muestra. En una realización, los compuestos que inactivan patógenos preferidos son aquellos que producen al menos 1 log de reducción a una concentración no mayor de aproximadamente 500 \muM, más preferiblemente al menos 3 log de reducción a una concentración no mayor de 500 \muM. En otro ejemplo no limitante, el compuesto que inactiva patógenos puede presentar al menos 1 log de reducción, y preferiblemente al menos 6 log de reducción a una concentración de aproximadamente 0,1 \muM a aproximadamente 3 mM. Por ejemplo, se puede utilizar una concentración de aproximadamente 0,15 mM mostaza de quinacrina y aproximadamente 3 mM glutation para inactivar más de 2 log de VSV y de VIH en una composición que contiene glóbulos rojos, a la vez que se mantiene la función de los glóbulos
rojos.
En una realización preferida, se proporciona un método, donde el método comprende tratar un material que contiene glóbulos rojos con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la función de los glóbulos rojos no se altera, de manera sustancial, con el tratamiento. En otra realización preferida, se proporciona un método donde el método comprende tratar el material con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la hemolisis de los glóbulos rojos es menor del 3% después de 28 días de almacenamiento.
La incubación de los productos sanguíneos con el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor puede llevarse a cabo, por ejemplo, durante al menos aproximadamente 0,5 a 48 horas o más, por ejemplo, al menos aproximadamente 1 a 48 horas o, al menos aproximadamente 1 a 24 horas o, por ejemplo, al menos aproximadamente 8 a 20 horas. En otra realización, la incubación continúa hasta un procesamiento o una utilización adicional del material.
El inhibidor puede añadirse al material, como un producto sanguíneo, antes de, simultáneamente con o después del compuesto que inactiva patógenos. Preferiblemente, el inhibidor se añade antes de o simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización preferida, el inhibidor se añade en los 30 minutos aproximadamente o, en los 15-20 minutos aproximadamente antes o después de la adición del compuesto que inactiva patógenos.
Algunos inhibidores, como el glutation, pueden oxidarse o degradarse de otra forma o reaccionar con el tiempo. Por ejemplo, cuando el inhibidor es un compuesto que contiene tiol, el inhibidor puede oxidarse para formar dímeros disulfuro. Se prefiere añadir el inhibidor al material en un tiempo y a una concentración tal que el inhibidor pueda inhibir el compuesto que inactiva patógenos antes de que se haya degradado o reaccionado in situ de otra forma de manera sustancial. Por ejemplo, cuando el inhibidor es glutation, en la realización en la que el glutation se añade antes que el compuesto que inactiva patógenos, el glutation se añade preferiblemente antes de menos de aproximadamente 12 horas de la adición del compuesto que inactiva patógenos. En una realización preferida, el glutation se añade simultáneamente con el compuesto que inactiva patógenos. En otra realización, el glutation se añade en los 30 minutos o, aproximadamente 15-20 minutos o, de manera opcional, aproximadamente 10 minutos después de la adición del compuesto que inactiva patógenos. La adición de glutation cercana al momento de la adición del compuesto que inactiva patógenos es ventajosa para minimizar la posible reducción de la concentración de glutation, por ejemplo, por oxidación o lisis peptídica, que puede ocurrir, por ejemplo, en algunos materiales biológicos, como el plasma.
En el caso de los glóbulos rojos, la incubación se lleva a cabo típicamente a una temperatura de aproximadamente 2ºC a 37ºC, preferiblemente de aproximadamente 18ºC a 25ºC. Por ejemplo, cuando el inhibidor es glutation, los glóbulos rojos pueden incubarse con el compuesto que inactiva patógenos y con el glutation durante aproximadamente 12 horas a una temperatura de aproximadamente 22ºC. En el caso de las plaquetas, la temperatura es preferiblemente de aproximadamente 20 a 24ºC. En el caso del plasma, la temperatura puede ser de aproximadamente 0 a 60ºC, típicamente de aproximadamente 0-24ºC.
Materiales biológicos
Se pueden tratar varios materiales biológicos con un compuesto que inactiva patógenos y con un compuesto inhibidor. Los materiales biológicos que se tratan in vitro o ex vivo con los compuestos inhibidores de acuerdo con la invención son productos sanguíneos como sangre completa, glóbulos rojos centrifugados, plaquetas y plasma fresco o congelado. Los productos sanguíneos comprenden además parte proteica del plasma, factor antihemofílico (Factor VIII), complejo Factor IX y Factor IX, fibrinógenos, Factor XIII, protrombina y trombina, inmunoglobulinas (como IgG, IgA, IgD, IgE e IgM y fragmentos de éstas), albúmina, interferón, y linfoquinas. También se contemplan productos sanguíneos sintéticos, que incluyen sangre sintética o medio de almacenamiento de los productos sanguíneos.
Reducción de la concentración de los compuestos en los materiales después del tratamiento
La concentración del compuesto que inactiva patógenos y/o del inhibidor en un material biológico, como un producto sanguíneo, puede reducirse después del tratamiento, por ejemplo, por adsorción en un proceso de eliminación discontinuo o en serie. Los métodos y dispositivos que pueden utilizarse se describen en PCT EEUU96/09846; Serie de Solicitud de Patente de EEUU No. 08/779.830, registrada el 6 de enero, 1997 y solicitudes PCT relacionadas publicadas como WO98/30327 y WO98/30545; y en la solicitud, Serie de Solicitud de Patente de EEUU No. 09/003.113, registrada el 6 de enero, 1998, y las solicitudes PCT correspondientes publicadas como WO99/34914 y WO99/34915, cuyas descripciones se incorporan en su totalidad en la presente memoria mediante referencia.
La invención se entenderá mejor mediante referencia a los ejemplos siguientes no limitantes.
Materiales
Los materiales siguientes se utilizaron en los Ejemplos siguientes.
Aunque está disponible comercialmente de Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL, el Adsol utilizado en éste y en los experimentos siguientes se obtuvo mediante filtración estéril de la mezcla siguiente: 22 g glucosa, 9 g NaCl, 7,5 g manitol, y 0,27 g adenina en 1 litro de agua destilada.
El eritrosol se obtuvo de Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL o mediante combinación de citrato sódico dihidratado (7,82 g); fosfato sódico ácido dihidratado (0,73 g); fosfato sódico dihidratado (3,03 g); adenina (0,22 g); manitol (7,74 g); y glucosa (9 g) en 1 litro de agua destilada.
La mostaza de quinacrina se obtuvo de Aldrich Chemical Co., St. Louis, MO. El glutation y la cisteína se obtuvieron de Sigma, St. Louis, MO. PIC-1 (éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de N-(acridin-9-il)-\beta-alanina) se sintetizó como se describe en la Serie de Solicitud Provisional de EEUU No. 60/043.696, registrada el 15 de abril, 1997, cuya descripción se incorpora en la presente memoria. PIC-2 (etil 2-[bis(2-cloroetil)amino]amida de N-(acridin-9-il)-\beta-alanina) se sintetizó como se describe en la Serie de Solicitud de Patente de EEUU No. 09/003.115, registrada el 6 de enero, 1998, cuya descripción se incorpora en la presente memoria.
El virus de la estomatitis vesicular (VSV) se obtuvo de la ATCC, American Type Cell Culture, Rockville, MD (titulación 8,8 unidades log).
La sangre completa se obtuvo de Sacramento Blood Center (Sacramento, CA).
Los glóbulos rojos centrifugados (PRBC) se obtuvieron de Sacramento Blood Center, con un hematocrito (HCT) de aproximadamente 55-65% o se prepararon utilizando Adsol o Eritrosol como disolución aditiva como sigue: en las 20 horas de la recepción, las unidades de sangre completa recibidas del Sacramente Blood Bank se centrifugaron a 3.800 rpm durante 5 minutos y el plasma se puso en otro recipiente; se determinó el % hematocrito llenando un tubo capilar con la muestra de sangre y centrifugando durante 5 minutos; el volumen captado por los glóbulos rojos se comparó con una curva de calibración; se añadieron 94 ml de Adsol o Eritrosol; el hematocrito final fue del 50 al 60 por ciento dependiendo del tratamiento.
Ejemplos Ejemplo 1 Reacción del ion fosfato con compuestos que inactivan patógenos
Se demostró la reactividad del ion fosfato con compuestos que inactivan patógenos. Se vio que la reactividad aumentaba con valores de pH mayores, a temperaturas mayores y con concentraciones de ion fosfato mayores.
Después de la incubación de 100 \muM PIC-1 con 25 mM tampón fosfato con valores de pH crecientes a temperatura ambiente (RT), se observó un gran incremento de la velocidad de descomposición. A pH 2,2 se observó un t_{1/2} de 450 minutos comparado con un t_{1/2} de 25 minutos a pH\approx6. La reacción de PIC-1 con los iones fosfato produce al menos dos intermediarios de fosfato observables en determinación por HPLC. El éster difosfato de PIC-1 se hidroliza más en el éster frangible. Se llevó a cabo un análisis LC/MS de la mezcla de reacción entre PIC-1 y los iones fosfato. Las especies observadas en las condiciones de reacción (pH=7, tampón fosfato) fueron el éster difosfato, el éster monofosfato del diol, y el éster fosfato del compuesto clorohidroxi.
La mostaza de quinacrina que no presenta un grupo ligando frangible, también reaccionó con los iones fosfato. La reacción de 100 \muM mostaza de quinacrina con 50 mM fosfato a temperatura ambiente es más lenta que la misma reacción a 37ºC con 130 mM fosfato (t_{1/2} = 10 minutos y 3,5 minutos, respectivamente). Esto se demuestra tanto por la producción más lenta del producto final bis fosfoéster como por la vida media más larga de las especies
intermedias.
La reacción de la mostaza de quinacrina con glucosa-6-fosfato también resultó fácil a pH=7,8. Se observaron por HPLC nuevas especies de producto, consistentes con al menos un aducto formado con la glucosa-6-fosfato.
Ejemplo 2 Reacción de tiol y de otros nucleófilos con compuestos que inactivan patógenos
Se estudió la reactividad del compuesto que contiene tiol, glutation, con compuestos que inactivan patógenos. Se vio que la reactividad aumentaba con valores de pH mayores, con temperaturas mayores y con concentraciones mayores de tiol. Se incubó 1 mM mostaza de quinacrina en 25 mM HEPES (N-[2-hidroxietilpiperacina-N'-[2-ácido etanosulfónico], Sigma, St. Louis, MO), a pH 7 con 4 mM glutation (GSH). Además, se incubó 100 \muM PIC-1 en 25 mM HEPES a pH 7 con 4 mM GSH a temperatura ambiente. Las reacciones de la mostaza de quinacrina y de PIC-1 con glutation se produjeron con un t_{1/2} de 50 minutos y de 32 minutos respectivamente. El aducto PIC-1/GSH se identificó por espectroscopía de masas. El análisis LC/MS de la mezcla de reacción con glutation en puntos de tiempo tempranos identificó el monoaducto glutation/aziridinio intermedio.
También se siguió la reacción de los tioles con los compuestos que inactvan patógenos mediante la monitorización de la desaparición de los grupos tiol, determinada por la reacción de Ellman, que se llevó a cabo como se describe en Aldrichimica Acta, 4:33 (1971), cuya descripción se incorpora en la presente memoria. La reacción de Ellman demostró la reacción de un compuesto que contiene dos grupos 2-cloroetilo (mostaza de quinacrina) con tioles en una estequiometría 1:1:9 y un transcurso de tiempo que es consistente con la descomposición de la mostaza de quinacrina. Estos resultados demuestran la reactividad cuantitativa del glutation en el centro mostaza para formar enlaces tioéter covalentes.
Se vio que otros tioles reaccionaban con PIC-1, incluyendo N-acetilcisteína, cisteína, homocisteína, el dipéptido GlyCys, aminoetano tiol, dimetilaminoetano tiol, ditiotreitol, ácido 2-mercaptonicotínico, ácido 2-mercaptobencimidazolsulfónico y quinolina tiol. Los tioles están disponibles comercialmente en Aldrich Chemical Company (St. Louis, MO) o (Sigma, St. Louis, MO). En todos los casos se observó por análisis de HPLC la formación de especies intermedias de las mezclas de reacción y se observó el consumo del grupo sulfhidrilo mediante la reacción de Ellman. También se vio que la mostaza de quinacrina reaccionaba con los nucleófilos, tiosulfato, sulfuro de hidrógeno (HS^{-}), y ditiocarbamato.
Ejemplo 3 Estudio de la penetración del glutation en la membrana de los glóbulos rojos
Se estudió la capacidad del glutation para penetrar las membranas de los glóbulos rojos, como un sistema modelo de membrana para las cubiertas de los virus, porque ambas carecen de cualquier sistema de transporte activo para este péptido. La partición del GSH dentro y fuera de los glóbulos rojos (glóbulos rojos centrifugados, Sacramento Blood Center, HCT 55-65%) se evaluó mediante la determinación de la cantidad de grupos tiol en el exterior e interior de las células después de la adición de glutation exógeno. La Tabla 2 muestra la cantidad total de glutation (intracelular y sobrenadante) y la cantidad intracelular de glutation de los glóbulos rojos en función del tiempo con y sin adición de 3 mM GSH. La concentración de GSH se calculó en base a la absorbancia a 412 nm utilizando un espectrómetro de longitud de onda única Beckman DU-20 (Beckman, Irvine, CA). Los resultados muestran que la cantidad de grupos sulfhidrilo en ambos compartimentos permanece constante.
TABLA 2
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Ejemplo 4 Inactivación del virus de la estomatitis vesicular con mostaza de quinacrina
Se estudió el efecto de varios inhibidores añadidos 15 minutos después de la adición de un inactivador de patógenos. Se diluyó el virus de la estomatitis vesicular (VSV) (ATCC American Type Cell Culture, Rockville, MD, titulación 8,8 unidades log/ml) en glóbulos rojos centrifugados (PRBC), obtenidos de Sacramento Blood Center, (Sacramento, CA), HCT 55-65%, y se trató con 150 \muM mostaza de quinacrina (QM). Quince minutos después de la adición de QM, se añadieron varios inhibidores a dosis entre 1 a 10 mM. Los inhibidores fueron aminoetanotiol (AET), tiosulfato, glutation y N-acetilcisteína (NAC), que se obtuvieron de Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Después de una inactivación de 4 horas a temperatura ambiente, se ensayaron los virus viables en un ensayo vírico en placa (Markus et al., Virology, 57:321-338 (1974)).
La Tabla 3 muestra los resultados de la inactivación de VSV por 150 \muM QM en presencia de los inhibidores añadidos después de 15 minutos de incubación. En ausencia del inhibidor, QM inactivó 3,5 log de VSV. AET y tiosulfato disminuyeron la inactivación de manera dependiente de la dosis. Ni el glutation ni NAC disminuyeron la inactivación de VSV.
TABLA 3
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Ejemplo 5 Inactivación del virus de la estomatitis vesicular con mostaza de quinacrina añadida simultáneamente con varios inhibidores
Se estudiaron los efectos de varios inhibidores añadidos simultáneamente con un compuesto que inactiva patógenos. Se diluyó el virus de la estomatitis vesicular (VSV) en glóbulos rojos centrifugados (PRBC). Los PRBC se trataron entonces simultáneamente con 150 \muM mostaza de quinacrina (QM) y con varios inhibidores añadidos a dosis entre 3 y 30 mM. Los inhibidores fueron aminoetanotiol (AET), tiosulfato, glutation, N-acetilcisteína (NAC), cisteína y sal sódica del ácido mercaptoetanosulfónico (MESNA), obtenidos de Aldrich Chemical Co. (St. Louis, MO). Después de una inactivación de 4 horas a temperatura ambiente, los virus viables se ensayaron en un ensayo CPE (Baxt et al., Virology, 72:383-392 (1976)) mediante la evaluación del efecto citopático (CPE) del virus en células de riñón de crías de hamster (BHK).
La Tabla 4 ilustra los resultados de experimentos en los que la inactivación de VSV por 150 \muM QM se llevó a cabo con la adición simultánea de AET, tiosulfato, glutation o NAC. En este experimento, se eliminó VSV por debajo del límite de detección, >4,0 log inactivados. Por lo tanto, determinados inhibidores pueden haber tenido un efecto en la inactivación vírica que resultó enmascarado por este límite. AET y tiosulfato mostraron otra vez una inhibición significativa de la inactivación vírica, siendo AET el inhibidor más potente. El glutation y NAC no mostraron evidencia de afectar la eliminación vírica a concentraciones de hasta 10 mM, con alguna evidencia de inhibición a 30 mM.
TABLA 4
8
La Tabla 5 ilustra los resultados de otro conjunto de experimentos en los que la inactivación de VSV por 150 \muM QM se llevó a cabo con la adición simultánea de glutation, cisteína o MESNA. La inactivación por QM sólo fue 3,0 log, y este valor no se afectó por el glutation incluso a 30 mM. La cisteína mostró una disminución dependiente de la dosis de la inactivación vírica, y con MESNA se obtuvieron resultados diversos con 2,3 log de reducción a 30 mM inhibidor.
TABLA 5
9
Ejemplo 6 Inactivación de VIH utilizando un inactivador de patógenos y un inhibidor
Se examinaron los efectos del glutation en la inactivación de VIH por un inactivador de patógenos en PRBC. Se prepararon PRBC con un hematocrito de aproximadamente 60% en disolución aditiva Adsol. Se añadió VIH-III_{\beta} libre de células (Popovic et al., Science, 224:497 (1984), aproximadamente 8 log/ml) con una titulación de aproximadamente 7 log por ml.
Se añadió glutation a alícuotas de sangre contaminadas con VIH a una concentración final variable seguido de adición de 50 \muM PIC-1. Las muestras se incubaron durante 12 horas a temperatura ambiente. Después, los glóbulos rojos se sedimentaron y los virus residuales en la fracción del sobrenadante se detectaron utilizando un ensayo en microplaca (Hanson et al., J. Clin. Microbiol., 28:2030 (1990)). Las muestras control se incubaron con glutation sólo para determinar su efecto en la viabilidad de VIH.
Los resultados de la inactivación de VIH por PIC-1 y glutation se muestran en la Tabla 6. Los datos de la Tabla 6 demuestran que la inactivación de VIH libre de células no se inhibió por glutation. Hubo alguna pérdida en la capacidad infecciosa de VIH, aproximadamente 0,2 log, debido a la incubación a temperatura ambiente durante 12 horas (muestra 1 frente a muestra 3). Parece que 30 mM glutation sólo reduce la capacidad infecciosa otros 0,3 a 0,6 log (muestras 2 y 4 comparadas con las muestras 1 y 3). Con 50 \muM PIC-1 sólo, la inactivación fue aproximadamente 1,8 log; 50 \muM PIC-1 más 30 mM glutation inactivaron aproximadamente 2,4 log. El incremento aparente de la inactivación puede atribuirse totalmente al efecto del glutation por sí mismo. En el intervalo de 0,1 mM a 30 mM glutation, hubo un incremento pequeño de la inactivación de VIH que fue consistente con los efectos del glutation sólo en VIH.
TABLA 6
10
Ejemplo 7 Tratamiento de RBC contaminados con bacterias con un inactivador y con un inhibidor
Se examinaron los efectos de los inhibidores glutation y cisteína en la inactivación de Yersinia enterocolitica en una muestra de glóbulos rojos. Se prepararon PRBC en Adsol y se añadió Yersinia (California Department of Health Services, Microbial Disease Laboratory, Berkeley, CA) un contaminante bacteriano gram negativo común de la sangre. Se prepararon muestras con 150 \muM PIC-1 y con inhibidor como se muestra en la Tabla 7. Se añadió PIC-1 aproximadamente 5 minutos después de los inhibidores. Después de una incubación de 4 horas a temperatura ambiente, se determinó la titulación de las bacterias plaqueando diluciones en agar nutritivo y cultivando durante toda la noche a 37ºC.
La Tabla 7 muestra los efectos de GSH y de cisteína en la inactivación de Yersinia con 150 \muM PIC-1. Ni el glutation ni la cisteína sólos a una concentración de 16 mM tuvieron efecto en la titulación de Yersinia (muestras 3 y 10). Hubo, sin embargo, una disminución dependiente de la dosis de la inactivación con los inhibidores. La inactivación se inhibió de 4 a 4,5 log con 16 mM del inhibidor (muestras 9 y 16), pero la inhibición fue menor de 1 log con 2 mM del inhibidor (muestras 6 y 13).
TABLA 7
11
Ejemplo 8 Utilización del glutation como un inhibidor en la inactivación de staphylococcus epidermidis
Se examinaron los efectos del glutation en la inactivación de Staphylococcus epidermidis (California Department of Health Services, Microbial Disease Laboratory, Berkeley, CA) en una muestra de glóbulos rojos. Se prepararon PRBC en Adsol y se añadió S. epidermidis. Se prepararon muestras con 75 \muM PIC-1 y el inhibidor, glutation, como se muestra en la Tabla 8. Se añadió PIC-1 aproximadamente 5 minutos después del inhibidor. Después de una incubación de 4 horas a temperatura ambiente, se determinó la titulación de las bacterias plaqueando diluciones en agar nutritivo y cultivando durante toda la noche a 37ºC.
La Tabla 8 ilustra la inactivación de Staphylococcus epidermidis con 75 \muM PIC-1 y varias cantidades de GSH. Los resultados presentados en la Tabla 8 son consistentes con la observación de que el glutation inhibe algo la inactivación bacteriana. S. epidermidis fue aparentemente menos sensible a la inhibición del glutation que Yersinia.
TABLA 8
12
A una concentración de 1 a 4 mM, los inhibidores disminuyen la eliminación de bacterias sólo modestamente y pueden inactivarse 3 log o más de bacterias.
Ejemplo 9 Estudio de los efectos de inhibidores en la reducción de las reacciones laterales no deseadas de los compuestos que inactivan patógenos en materiales que comprenden glóbulos rojos
Se examinaron los efectos del glutation y de la cisteína en la unión de IgG, albúmina y de un compuesto que inactiva patógenos a los glóbulos rojos. El tratamiento de los glóbulos rojos con algunos compuestos que inactivan patógenos que incluyen un ligando que une ácidos nucleicos y un grupo reactivo como un grupo mostaza, como PIC-1, puede dar lugar a la unión covalente de IgG a la superficie de los glóbulos rojos. La cantidad de IgG está generalmente por debajo de los niveles requeridos para crear un resultado positivo en el Ensayo Directo de Antiglobulina (DAT) (Walker, R.H., ed., Technical Manual, 10ª Ed., American Association of Blood Banks, Arlington, VA, 1990). Sin embargo, la inclusión de un inhibidor puede reducir o eliminar la unión de proteínas. Aún más, la utilización de una mezcla de anticuerpos policlonales que reconocen la fracción de acridina de PIC-1, reduce la unión del compuesto que inactiva patógenos a la superficie de los glóbulos rojos cuando se incluye un inhibidor.
Se prepararon PRBC en Adsol con un hematocrito de 60%. Antes del tratamiento con PIC-1, se añadió glutation o cisteína a una concentración entre 0,5 y 16 mM, y las muestras se mezclaron. Se añadió PIC-1 a 1 mM, y las muestras se incubaron durante 20 horas a temperatura ambiente. Después de la incubación, se lavaron veinte microlitros de cada muestra tres veces con 1 ml de disolución salina del banco de sangre y se resuspendieron en un volumen final de 0,4 ml.
Se prepararon anticuerpos antiacridina como se describe en Harlow y Lane, "Antibodies, a Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory," 1988, cuya descripción se incorpora en la presente memoria. La IgG antiratón de cabra y los anticuerpos antialbúmina humana se obtuvieron de Caltag, Burlingame, CA.
Para el análisis, se alicuotaron alícuotas de 50 \mul de glóbulos rojos diluidos y lavados en cuatro tubos y se incubaron con anticuerpos antiIgG humana, antialbúmina humana o antiacridina durante 30 minutos a 37ºC. Después de la incubación, las muestras se lavaron una vez con 1,0 ml de disolución salina del banco de sangre. Los anticuerpos antihumanos se marcaron covalentemente con fluoresceína y las muestras se analizaron directamente utilizando un citómetro de flujo. Para detectar el anticuerpo antiacridina, las muestras se lavaron una segunda vez y después se incubaron con IgG antiratón de cabra marcado con fluoresceína durante 30 minutos a 37ºC. Las muestras se lavaron antes del análisis como se ha descrito.
Para el análisis, las muestras se diluyeron 1:1 en disolución Haemalina 2 (Biochem Immunosystems, Allentown, PA) y se analizaron en un FACScan (Becton-Dickinson, San Jose, CA) con los ajustes de dispersión optimizados para la discriminación de glóbulos rojos. Se recogieron por muestra veinte mil datos de fluorescencia.
La Tabla 9 ilustra los resultados que muestran el efecto del glutation y de la cisteína en la unión de IgG, albúmina y acridina a los glóbulos rojos. El tratamiento con PIC-1 sólo produjo un incremento claro de las señales de IgG, albúmina y acridina (muestras 1 y 2). La incubación con 16 mM glutation o de cisteína no alteró la fluorescencia comparado con la muestra sin tratar (muestras 3 y 10, respectivamente). El tratamiento con PIC-1 en presencia de cualquier inhibidor produjo una disminución dependiente de la dosis del nivel de la unión de IgG, albúmina y acridina. Tanto la unión de IgG como de albúmina estaba a nivel basal en presencia de \geq2 mM inhibidor (muestras 6 y 13). La unión de acridina, por el contrario, fue dependiente de la concentración del inhibidor en todo el intervalo ensayado. Incluso 16 mM glutation o de cisteína no anuló completamente la señal de la acridina. Con 4 mM glutation, la señal de la acridina disminuyó 53 veces (muestra 2 frente a muestra 7); con 4 mM cisteína, la señal de la acridina disminuyó 83 veces (muestra 2 frente a muestra 14). En un estudio paralelo utilizando 0,3 mM PIC-1, se observaron tendencias similares utilizando glutation aunque el nivel inicial de unión de proteínas y de acridina se redujo debido a la menor concentración de PIC-1.
TABLA 9
13
Ejemplo 10 Estudio de los efectos del glutation en las propiedades de PRBC tratados con PIC-1 y almacenados
Con el fin de determinar cualquier efecto del glutation en las propiedades de los glóbulos rojos, se llevó a cabo el experimento siguiente en duplicado. Se mezclaron cuatro unidades de sangre completa compatible ABO y después se distribuyeron en cuatro bolsas de sangre para crear unidades de 500 ml idénticas. Se prepararon PRBC utilizando Adsol como disolución aditiva. En las 20 horas de la recepción, se centrifugaron las unidades de sangre completa recibidas del Sacramento Blood Bank a 3.800 rpm durante 5 minutos y el plasma se puso en otro recipiente. Se determinó el % hematocrito mediante llenado de un tubo capilar con la muestra de sangre y centrifugando durante 5 minutos. El volumen captado por los glóbulos rojos se comparó con una curva de calibración. Se añadieron 94 ml de Adsol. El hematocrito final fue del 50 al 53 por ciento dependiendo del tratamiento.
En cada experimento, se examinaron cuatro condiciones: (1) Control, sin PIC-1 ni glutation; (2) 3 mM glutation sólo; (3) 0,3 mM PIC-1 sólo: y (4) 0,3 mM PIC-1 más 3 mM glutation. Todas las unidades, incluyendo el control, se incubaron a 20ºC durante 14 horas. Los PRBC se pusieron entonces a 4ºC. Las muestras se tomaron inmediatamente después del tratamiento y después semanalmente para análisis. Los resultados de 2,3-DPG, ATP y hemolisis se resumen en las Tablas 10 y 11. Estos datos demuestran que no existe una diferencia significativa entre ninguno de los tratamientos comparados con el control. Las determinaciones de potasio extracelular, glutation intracelular, fragilidad osmótica, consumo de glucosa y producción de lactato también confirmaron que el glutation, bien sólo o con PIC-1, no altera significativamente las propiedades in vitro de los glóbulos rojos.
Los niveles de potasio extracelular se determinaron utilizando un Analizador K^{+}/Na^{+} Ciba Corning Modelo 614 (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA). La hemolisis se determinó como se describe en Hogman et al., Transfusion 31:26-29 (1991). El glutation intracelular se determinó como se describe en Beutler, "Red Cell Metabolism", Grune y Stratton, 3ª ed., 1984. 2,3-DPG y ATP se determinaron utilizando los procedimientos de Sigma No. 665 y 366, respectivamente (Sigma, St. Louis, MO). El consumo de glucosa y la producción de lactato se determinaron utilizando los procedimientos de Sigma Nos. 115 y 735, respectivamente (Sigma, St. Louis, MO). La fragilidad osmótica se determinó como se describe en Beutler et al., Blood, Vol. 59 (1982).
TABLA 10
14
TABLA 11
15
Ejemplo 11 Estudio de la recuperación y supervivencia de RBC de ratón tratados con GSH
Se estudió el efecto de 0,6 mM PIC-2 con y sin 6,0 mM GSH en la recuperación y supervivencia in vivo de glóbulos rojos (RBC) murinos marcados con biotina. Se marcaron RBC de ratón y se trataron después con PIC-2, PIC-2 + glutation, o con glutation sólo. Las células tratadas marcadas se pusieron en recipientes. Se siguió la circulación de estas células durante 36 días mediante citometría de flujo. No se observó ninguna diferencia en la recuperación o la vida media de ninguno de los RBC tratados comparados con los controles que sólo estaban marcados. Los datos demuestran que el glutation en el tratamiento es compatible con la función de los RBC in vivo y que el tratamiento con PIC-2 no daña por sí mismo los glóbulos rojos.
Se inyectaron ratones donantes (machos BALB/c) con 0,1 mg NHS (N-hidroxisuccinimida) Biotina (Pierce, Rockford, IL) los Días 1 y 2. Una hora después de la segunda inyección se chequeó la eficacia del marcaje haciendo reaccionar un pequeño volumen de sangre completa marcada con biotina de cada ratón con un conjugado Estreptavidina R-ficoeritrina (Molecular Probes, Eugene OR) y determinando entonces el porcentaje de células fluorescentes en el FACScan (Becton-Dickinson, San Jose, CA). Todos los ratones con RBC marcados \geq 90% se utilizaron como ratones donantes.
Se tomó la sangre de los ratones donantes mediante punción cardíaca y se centrifugó una vez a 1.282 x g durante 6 minutos. Se eliminó el plasma y los PRBC se incubaron durante 14 horas a temperatura ambiente (RT) \pm 0,6 mM PIC-2 \pm 6,0 mM GSH. La mañana siguiente se lavaron los RBC y se resuspendieron en HBSS (Disolución Tamponada de Sales de Hanks, Sigma, St. Louis, MO). Se determinó como se ha descrito más arriba el porcentaje del marcaje con biotina de los RBC lavados. Se determinó el número total de RBC mediante un CBC (Contaje celular de sangre completa) en un contador de células (Contador de Células en Sangre Completa, Biochem Immunosystems, Allentown, PA).
Los RBC lavados se transfundieron entonces a los ratones receptores (hembras BALB/c). Cada ratón recibió \approx 800 x 10^{6}RBC marcados con biotina. Se pesó cada ratón en el momento de la transfusión y se calculó el verdadero porcentaje de RBC marcados/ratón en base al peso del ratón, su contaje de RBC determinado por CBC, y el porcentaje de RBC marcados transfundidos determinado como se ha descrito más arriba.
El porcentaje de supervivencia de los RBC marcados se determinó en 1 hora y en los días 1-40. Los resultados se normalizaron utilizando el porcentaje de supervivencia de una hora = 100%. El porcentaje verdadero de recuperación de los RBC marcados en una hora para todos los ratones fue 105,8 \pm 17,5%. Los resultados se normalizaron a % supervivencia de una hora = 100% para permitir las diferencias en la eficacia de la inyección i.v. de los RBC marcados.
La supervivencia de los RBC tratados con PIC-2 fue la misma, de manera sustancial, que la del control a lo largo del experimento. Los valores medios de supervivencia se proporcionan en la Figura 1. Los datos sugieren que el tratamiento con PIC-2, con o sin glutation, no tuvo un efecto significativo en la supervivencia de los RBC. Por lo tanto, el glutation es compatible con la circulación de glóbulos rojos in vivo después del tratamiento.

Claims (32)

1. Un método para inhibir reacciones laterales no deseadas de un compuesto que inactiva patógenos en un producto sanguíneo in vitro o ex vivo que comprende:
tratar un producto sanguíneo in vitro o ex vivo con una cantidad eficaz de un compuesto que inactiva patógenos que comprende un ligando que une ácidos nucleicos y un grupo funcional que es, o que es capaz de formar, un grupo electrofílico donde el compuesto que inactiva patógenos no requiere fotoactivación para inactivar un patógeno; y
tratar el producto sanguíneo in vitro o ex vivo con un inhibidor que comprende un grupo nucleofílico que es capaz de reaccionar covalentemente con el grupo electrofílico;
donde el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se administran en una cantidad eficaz para inactivar patógenos en el material a la vez que inhiben reacciones laterales no deseadas del compuesto que inactiva patógenos.
2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, donde el producto sanguíneo comprende sangre completa, glóbulos rojos, plasma, plaquetas, glóbulos rojos centrifugados o un producto sanguíneo con un hematocrito de aproximadamente 30-85%.
3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 ó 2, donde el grupo electrofílico es catiónico, de manera opcional, un ion aziridinio.
4. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el grupo electrofílico reacciona con un ácido nucleico para formar un enlace covalente con el ácido nucleico.
5. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el grupo funcional es un grupo mostaza que es capaz de reaccionar in situ para formar el grupo electrofílico.
6. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el compuesto que inactiva patógenos comprende además un ligando frangible que une el grupo funcional y el ligando que une ácidos nucleicos.
7. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el compuesto que inactiva patógenos comprende un ligando que une ácidos nucleicos seleccionado de furocumarinas, derivados de furocumarinas, acridinas y derivados de acridinas; y
donde el grupo funcional es un grupo mostaza.
8. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el compuesto que inactiva patógenos es éster 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de N-(acridin-9-il)-\beta-alanina o mostaza de quinacrina.
9. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el grupo nucleofílico es un tiol, tioácido, ácido ditoico, fosfato, tiofosfato, tiosulfato, o una amina.
10. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor se selecciona de glutation, N-acetilcisteína, cisteína, sales mercaptoetanosulfonato, y dimercaprol.
11. Un método de acuerdo con la reivindicación 10, donde el inhibidor es glutation a una concentración de aproximadamente 0,5 a 30 mM.
12. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el compuesto que inactiva patógenos y el inhibidor se incuban con el material durante al menos aproximadamente 1 a 48 horas.
13. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde la concentración del compuesto que inactiva patógenos es aproximadamente 0,1 \muM a 5 mM; y/o es suficiente para inactivar al menos aproximadamente 3 a 6 log de un patógeno en el material.
14. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor reduce la inactivación de un patógeno por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 3 log en comparación con una inactivación control del patógeno que se lleva a cabo en ausencia del inhibidor.
15. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor reduce la inactivación de un patógeno vírico por el compuesto que inactiva patógenos no más de aproximadamente 1 log en comparación con una inactivación control del patógeno que se lleva a cabo en ausencia del inhibidor.
16. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor comprende un material de soporte sólido que comprende el grupo nucleofílico.
17. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el inhibidor se añade al producto sanguíneo después de la adición del compuesto que inactiva patógenos.
18. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, donde el inhibidor se añade al producto sanguíneo antes de, o simultáneamente a, la adición del compuesto que inactiva patógenos.
19. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto sanguíneo comprende glóbulos rojos y donde la función de los glóbulos rojos no se altera, de manera sustancial, después del tratamiento.
20. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto sanguíneo comprende glóbulos rojos y donde el método comprende tratar el material con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno, y donde la función de los glóbulos rojos no se altera, de manera sustancial, por el tratamiento.
21. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el producto sanguíneo comprende glóbulos rojos y donde la hemolisis de los glóbulos rojos es menor del 3% después de 28 días de almacenamiento después del tratamiento.
22. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el método comprende tratar el material con una cantidad eficaz del compuesto que inactiva patógenos y del inhibidor para inactivar al menos 2 log de un patógeno.
23. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde, después del tratamiento, el producto sanguíneo es adecuado para ser introducido en un individuo.
24. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, donde el método comprende tratar un producto sanguíneo que comprende un patógeno, que es, de manera opcional, un organismo procariota o eucariota o un virus con cubierta lipídica.
25. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, donde el producto sanguíneo comprende un material biológico de dos fases, que comprende una primera fase que comprende un líquido que tiene un patógeno que comprende una membrana, y una segunda fase unida por la membrana del patógeno,
y donde el compuesto que inactiva patógenos es capaz, desde un punto de vista cinético, de atravesar la membrana antes de la formación del grupo electrofílico, respecto al inhibidor; y
donde el compuesto que inactiva patógenos no es capaz, de manera sustancial desde un punto de vista cinético, de atravesar la membrana después de la formación del grupo electrofílico, respecto al compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico.
26. Un método de acuerdo con la reivindicación 25, que comprende permitir al inhibidor reaccionar con el compuesto que inactiva patógenos, y donde el inhibidor reacciona con el grupo electrofílico del compuesto que inactiva patógenos, de manera sustancial, en la primera fase.
27. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 25 ó 26, que comprende permitir al compuesto que inactiva patógenos que comprende el grupo electrofílico, reaccionar con un ácido nucleico del patógeno en la segunda fase, para inactivar así el patógeno.
28. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, donde la membrana comprende un lípido.
29. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 28, donde el patógeno es
i) un virus que comprende una cubierta lipídica que define la membrana, y donde la segunda fase está definida por el interior de la cubierta lipídica; o
ii) una bacteria que comprende una membrana celular que comprende un lípido que define la membrana del sistema de dos fases, y donde la segunda fase está definida por el interior de la membrana celular.
30. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, donde el inhibidor no es capaz, de manera sustancial desde un punto de vista cinético, de atravesar la membrana, en comparación con el compuesto que inactiva patógenos antes de la formación del grupo electrofílico.
31. Un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 25 a 30, donde el compuesto que inactiva patógenos comprende un grupo funcional que es capaz de formar un grupo electrofílico que es un ion aziridinio.
\newpage
32. Un método de acuerdo con cualquier reivindicación precedente, que comprende reducir la concentración de al menos el compuesto que inactiva patógenos o el inhibidor en el producto sanguíneo después del tratamiento del producto sanguíneo para obtener un producto adecuado para ser introducido en un individuo.
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