PT1838355E

PT1838355E - Métodos de inibição melhorados destinados a um processo de inativação de glóbulos vermelhos

Info

Publication number: PT1838355E
Application number: PT58211020T
Authority: PT
Inventors: Adonis Stassinopoulos
Original assignee: Cerus Corp
Priority date: 2004-10-29
Filing date: 2005-10-31
Publication date: 2013-11-07
Also published as: AU2011201554B2; BRPI0518198B8; BRPI0518198B1; AU2011201554A1; JP2013256537A; US20060115466A1; AU2005302256B2; JP2008518952A; PL1838355T3; WO2006050328A1; ES2429088T3; CA2585621A1; EP1838355B1; JP5346468B2; JP2012107068A; HK1109594A1; CA2585621C; US7655392B2; DK1838355T3; AU2005302256A1

Description

ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

DESCRIÇÃO "Métodos de inibição melhorados destinados a um processo de inativação de glóbulos vermelhos"

Campo do Invento 0 campo deste invento refere-se a métodos de inibição de compostos eletrófilos reativos usados no tratamento de produtos do sangue para inativar possiveis contaminantes patogénicos. Em particular, os compostos nucleófilos, tais como os tiois, são usados para inibir os compostos eletrófilos reativos em composições de glóbulos vermelhos.

Antecedentes do Invento A transmissão de doenças através de produtos do sangue e de outros materiais biológicos continua a ser um sério problema de saúde. Embora tenham ocorrido importantes avanços no escrutínio de dadores de sangue e de análises sanguíneas, vírus como o da hepatite B (HBV), hepatite C (HCV), e o vírus de imunodeficiência humana (HIV) podem escapar à deteção nos produtos do sangue durante as análises devido a níveis baixos de vírus ou de anticorpos virais. Para além do perigo virai, atualmente não existem análises adequadas, licenciadas, para o escrutínio quanto à presença de micróbios não virais, tais como bactérias ou protozoários, no sangue destinado a transfusões. Existe também o risco de um agente patogénico até então desconhecido poder tornar-se prevalente no fornecimento de sangue e constituir uma ameaça de transmissão de doenças, como de facto ocorreu antes do reconhecimento do risco de transmissão do HIV através de transfusões de sangue.

Foram introduzidos agentes químicos no sangue ou no plasma sanguíneo para inativar patogénicos antes da utilização clínica de produtos do sangue. Normalmente utilizam-se compostos ativados fotoquimicamente como os psoralenos para produtos do sangue com pouco ou nenhum teor de glóbulos vermelhos, tais como plaquetas e plasma. Para produtos derivados do sangue contendo glóbulos vermelhos, desenvolveram-se compostos para inativação de agentes patogénicos que não necessitam de fotoativação. Esses compostos possuem, normalmente, grupos eletrófilos que reagem 2 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ com os agentes patogénicos, mais especificamente com o ácido nucleico do agente patogénico. Por exemplo, a Patente dos Estados Unidos da América N.° 5055485 descreve a inativação de vírus em composições contendo células e proteínas usando epóxidos de arildiol. Podem ser usados outros compostos que produzam eletrófilos in situ. LoGrippo et al. avaliaram a utilização de mostarda de azoto, CH3-N (CH2CH2CI) 2, quanto à inativação virai. LoGrippo et al., Proceedings of the Sixth Congress of the International Society of Blood Transfusion, Bibliotheca Haematologica (Hollander, ed.), 1958, pp. 225-230. Mais significativamente, as patentes dos E.U.A. números 6410219 e 5691132 descrevem a utilização de compostos que possuem um componente que tem como alvo o ácido nucleico, assim como um componente eletrófilo que reage com o ácido nucleico para inativar o agente patogénico. A patente dos E.U.A. número 6514987 descreve compostos semelhantes, onde o componente do composto que tem como alvo o ácido nucleico está ligado ao componente eletrófilo reativo via uma espécie hidrolisável. As patentes dos E.U.A. números 6136586 e 6617157 descrevem a utilização de oligómeros de etilenoimina e compostos afins para inativação de patogénicos. Esses compostos derivados de etilenoimina possuem tipicamente um grupo aziridina, que proporciona o componente eletrófilo reativo, e um componente de poliamina, que proporciona o direcionamento do composto para o ácido nucleico. A classe geral de compostos que têm como alvo o ácido nucleico que possuem um grupo eletrófilo ou semelhante reativo com o ácido nucleico é usada para inativar agentes patogénicos no sangue, produtos derivados do sangue, e uma variedade de amostras de origem biológica. Há alguma preocupação de que, embora esses compostos sejam concebidos para reagir especificamente com ácidos nucleicos, eles possam reagir ainda com outros componentes do sangue, tais como proteínas ou membranas celulares. Essas reações secundárias são desfavoráveis, e podem provocar efeitos adversos, tais como modificações das proteínas e membranas celulares que podem ser reconhecidas pelo sistema imunológico. Quando esses produtos derivados do sangue tratados são usados repetidamente, estes podem resultar numa resposta imune do recetor ao produto derivado de sangue tratado. A patente dos E.U.A. n.° 6709810 descreve métodos de inibição desses compostos de inativação de agentes 3 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ patogénicos para reduzir o nível de qualquer dessas reações secundárias adversas. 0 pedido US 2003/0113704 AI refere-se a métodos para a inativação de agentes patogénicos em material biológico por um método que compreende: (i) o contacto do material biológico com uma solução de aditivo que contém uma concentração de cloreto inferior a cerca de 10 mM, (ii) o contacto do material biológico com um composto de inativação de agente patogénico numa quantidade suficiente para inativar pelo menos 1 log das bactérias, e (iii) a incubação do material biológico em contacto com a solução de aditivo e o composto de inativação de agente patogénico durante tempo suficiente para inativar pelo menos 1 log das bactérias. Opcionalmente, o método pode incluir a utilização de um inibidor que reduz reações secundárias indesejadas dos agentes de inativação dos agentes patogénicos em materiais biológicos. No entanto, embora esses métodos reduzam significativamente reações secundárias indesejadas, pretende--se ainda uma redução de respostas imunes indesejadas. Ensaios clínicos recentes usando esses compostos para o tratamento de glóbulos vermelhos indicaram a possibilidade de tais eventos adversos. Numa publicação da V.I. Technologies, Inc., datada de 17 de Novembro de 2003, recomendou-se que o seu ensaio crónico de fase III do Sistema de Redução de Patogénicos INACTINE™ para glóbulos vermelhos fosse interrompido devido a uma preocupação com respostas de anticorpos a glóbulos vermelhos tratados com INACTINE™. Numa publicação de Cerus Corporation, datada de 4 de Setembro de 2003, indicou-se que interromperam voluntariamente um ensaio de fase III para o seu programa de glóbulos vermelhos com patogénicos inativados após dois pacientes do estudo terem desenvolvido anticorpos contra glóbulos vermelhos (eritrócitos) tratados com S-303, o composto utilizado no seu sistema de inativação de agentes patogénicos para glóbulos vermelhos. Esses anticorpos são normalmente detetados com a utilização de um teste anti-globulina indireto que pode ser efetuado sem um conhecimento detalhado da natureza ou homogeneidade do anticorpo real. Esses testes são bastante conhecidos dos especialistas na matéria e são muito sensíveis, permitindo a deteção de quantidades tão baixas quanto 500 moléculas por glóbulo vermelho (RBC). O método mais comum de deteção destes anticorpos é através da mistura 4 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ de soro dos doentes com a preparação de glóbulos vermelhos candidata a infusão e da deteção se ocorre uma reação de aglutinação: chama-se, a isto, correspondência cruzada da unidade de glóbulos vermelhos com o soro do paciente. Proporciona-se uma maior sensibilidade pela inclusão de uma anti- imunoglobulina humana de reação cruzada com o anticorpo. Isto aumenta a reatividade entre IgGs ou outros anticorpos na superfície dos glóbulos vermelhos. Finalmente, pode obter-se uma sensibilidade de deteção ainda maior pela inclusão de potencializadores, no meio de reação, que aumenta a taxa de aparecimento de anticorpos com uns e os outros (AABB manual, 13° edição) . Esses ensaios são mais sensíveis que, por exemplo, ensaios de citometria de fluxo e podem ser observados mesmo quando outros métodos indicam a ausência de qualquer potencial anticorpo. Esses fenómenos ocorrem em ensaios clínicos e muitas vezes estão associados a populações específicas de pacientes que podem ter uma tendência maior para desenvolver estes anticorpos.

Assim, existe necessidade de métodos para reduzir ainda mais as reações secundárias eletrófilas indesejadas de compostos de inativação de agentes patogénicos que reagem com os agentes patogénicos através de um grupo eletrófilo, preservando a capacidade do composto de inativação de agentes patogénicos inativar agentes patogénicos prejudiciais. Especificamente existe necessidade de métodos aperfeiçoados de inibição de compostos de inativação de agentes patogénicos nos glóbulos vermelhos. Esse novo método é necessário para reduzir significativamente o risco de uma resposta imunológica adversa aos glóbulos vermelhos devido ao tratamento com um composto de inativação dos agentes patogénicos.

Breve resumo do Invento 0 presente invento proporciona uma variedade de métodos para o tratamento de composições de glóbulos vermelhos com compostos de inativação dos agentes patogénicos sob condições melhoradas para inibir uma reação secundária indesejada do composto de inativação dos agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, a inibição melhora corrigindo o pH e/ou aumentando a concentração de inibidor. 5 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Num aspeto, ο presente invento proporciona um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos conforme se descreve na reivindicação 1. Numa concretização ainda, o método inclui o passo c) corrigir o pH da composição contendo os glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log de um contaminante patogénico. Em alguns exemplos, a composição de glóbulos vermelhos contém leucócitos e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log ou pelo menos 3 log de leucócitos. Em algumas concretizações, o inibidor é misturado com a composição que contém os glóbulos vermelhos, antes da adição de composto de inativação dos agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o pH da composição contendo glóbulos vermelhos é corrigido antes da mistura com o composto de inativação de agentes patogénicos e com o inibidor. Em algumas concretizações, o pH da composição contendo glóbulos vermelhos é corrigido após a adição do composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o pH da composição contendo glóbulos vermelhos é corrigido pela adição do inibidor. Em alguns exemplos, a mistura do inibidor, composto de inativação dos agentes patogénicos e composição contendo glóbulos vermelhos, possui um pH, à temperatura ambiente, no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0, uma vez misturados os três componentes. Em alguns exemplos, a mistura de inibidor, composto de inativação de agentes patogénicos e composição contendo glóbulos vermelhos é incubada durante um intervalo de tempo adequado, tal como durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 24 horas, também cerca de 8 a 24 horas. Num exemplo ainda, a incubação é numa gama de temperaturas de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18 a 25°, ou cerca da temperatura ambiente. Em algumas concretizações, a concentração de inibidor, uma vez misturados todos os três componentes, encontra-se no intervalo de cerca de 2 mM a cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM a cerca de 30 mM, também cerca de 5 mM a cerca de 30 mM, também cerca de 10 mM a cerca de 3 0 mM, também cerca de 2 0 mM. Em algumas concretizações, a concentração de inibidor na mistura resultante é maior do que cerca de 2 mM, pelo menos cerca de 6 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 4 mM, pelo menos cerca de 5 mM, pelo menos cerca de 10 mM, ou pelo menos cerca de 15 mM. Em alguns exemplos, a razão molar de inibidor para composto de inativação de agentes patogénicos, uma vez misturados os três componentes todos, é de cerca de 10:1 a cerca de 400 : 1, também cerca de 10:1 a cerca de 200:1, também cerca de 20:1 a cerca de 200:1, também cerca de 50:1 a cerca de 200 : 1, também cerca de 100:1. Em alguns exemplos, o inibidor compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em alguns exemplos, o inibidor é um peptídeo composto por pelo menos uma cisteína ou um derivado de cisteína. No método do invento, o inibidor é glutationa. Em algumas concretizações, o inibidor é neutralizado e a adição do inibidor neutralizado afeta a correção do pH, da composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o inibidor neutralizado compreende cisteína ou um derivado de cisteína. Em alguns exemplos, o inibidor neutralizado é um peptídeo composto por cisteína ou um derivado de cisteína. Em alguns exemplos, o composto que inativa os agentes patogénicos compreende um grupo de ligação ao ácido nucleico. Em alguns exemplos, o grupo de ligação ao ácido nucleico é um intercalador, tal como um grupo de acridina. Em alguns exemplos, o grupo de ligação de ácido nucleico é uma poliamina. Em alguns exemplos, o composto de inativação de agentes patogénicos compreende um grupo de ligação ao ácido nucleico, ligado ao grupo eletrófilo reativo, através de uma ligação hidrolisável. Em alguns exemplos, o grupo de ligação ao ácido nucleico é um intercalador e o grupo eletrófilo reativo é selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. Numa concretização preferida, o inibidor é glutationa neutralizada, onde a glutationa protonada é neutralizada com cerca de 2 equivalentes de uma base adequada, e o composto de inativação de agentes patogénicos é o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina.

Num aspeto adicional, o invento proporciona um método para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos de acordo com a reivindicação 18. Em alguns exemplos, a composição de glóbulos vermelhos contém leucócitos e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log dos leucócitos. Em alguns exemplos, o inibidor é misturado com a composição que contém os glóbulos vermelhos antes da mistura com o 7 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos, o inibidor é misturado com a composição composta por glóbulos vermelhos, posteriormente à mistura com o composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos, o inibidor e o composto de inativação de agentes patogénicos são misturados com a composição composta por glóbulos vermelhos, simultaneamente ou quase simultaneamente, como por exemplo num intervalo de cerca de 1 minuto um do outro. Em alguns exemplos, a mistura de inibidor e a composição contendo os glóbulos vermelhos é incubada durante cerca de 1 a 30 minutos antes da mistura com o composto de inativação dos agentes patogénicos. Em alguns exemplos, esta incubação dá-se a uma temperatura no intervalo de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18°C a 25°C, ou cerca da temperatura ambiente. Em alguns exemplos, a mistura do inibidor, composto de inativação de agentes patogénicos e a composição contendo os glóbulos vermelhos é incubada durante um intervalo de tempo adequado, tal como por exemplo durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 24 horas, também cerca de 8 a 24 horas. Num outro exemplo, a incubação dá-se num intervalo de temperaturas de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18°C a 25°C, ou cerca da temperatura ambiente. Em alguns exemplos, um pH adequado na mistura do inibidor com a composição composta por glóbulos vermelhos encontra-se na gama de aproximadamente 6,8 a 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0, medidos à temperatura ambiente. Em alguns exemplos, uma vez misturados todos os três componentes, o pH da mistura encontra-se no intervalo de aproximadamente 6,8 a 8.5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8.5, ou cerca de 7,2 a 8,0, medidos à temperatura ambiente. Em alguns exemplos, a concentração de inibidor, uma vez misturados todos os três componentes, encontra-se na gama de cerca de 2 mM a cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, também cerca de 4 mM a cerca de 30 mM, também cerca de 5 mM a cerca de 3 0 mM, também cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, também cerca de 20 mM. Em alguns exemplos, a razão molar entre o inibidor e o composto de inativação dos agentes patogénicos, uma vez misturados todos os três componentes, é cerca de 10:1 a cerca de 400:1, também aproximadamente 10:1 a cerca de 200:1, também cerca de 20:1 a cerca de 200:1, também cerca de 50:1 a cerca de 200:1, também cerca de 100:1. Em 8 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ alguns exemplos, ο inibidor é um peptídeo composto por pelo menos uma cisteína ou um derivado de cisterna. No método, o inibidor é glutationa. Em alguns exemplos, o inibidor está neutralizado ou numa forma que afeta a desejada correção do pH da composição. Em alguns exemplos, o inibidor é neutralizado pela adição de 1 equivalente, também cerca de 2 equivalentes de base ao inibidor. Em alguns exemplos, o inibidor está numa forma neutralizada, como um sal apropriado. Em alguns exemplos, o inibidor está neutralizado. Em alguns exemplos, o inibidor neutralizado é um peptideo neutralizado composto por cisteína ou um derivado de cisteína. No método, o peptídeo neutralizado é glutationa neutralizada. Em alguns exemplos, o grupo de ligação de ácido nucleico do composto de inativação dos agentes patogénicos é um intercalador, tal como um grupo de acridina. Em alguns exemplos, o grupo de ligação do ácido nucleico é uma poliamina. Em alguns exemplos, o grupo de ligação do ácido nucleico está ligado ao grupo eletrófilo reativo através de uma ligação hidrolisável. Em alguns exemplos, o grupo de ligação do ácido nucleico é um intercalador e o grupo eletrófilo reativo é selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. Em alguns exemplos, o grupo de ligação do ácido nucleico é uma poliamina e o grupo eletrófilo é um grupo aziridina ou um grupo aziridinio. Num exemplo preferido, o inibidor é glutationa neutralizada e o composto de inativação de agentes patogénicos é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina.

Neste documento divulga-se um método para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos que compreende, na seguinte ordem, a)proporcionar i) éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, ii) glutationa neutralizada, e iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, onde existe a possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico, b) misturar a glutationa neutralizada com a composição composta por glóbulos vermelhos c) incubar a mistura durante um intervalo de tempo adequado, e d) misturar éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina com a mistura de glutationa neutralizada e a composição composta por glóbulos vermelhos, na qual o agente patogénico, se estiver presente na composição composta por 9 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ glóbulos vermelhos, é inativado em pelo menos 1 log, também em pelo menos 2 log, também em pelo menos 3 log. Em alguns exemplos, a composição de glóbulos vermelhos contém leucócitos e o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log, também pelo menos 2 log, ou pelo menos 3 log dos leucócitos. Em alguns exemplos, a glutationa neutralizada é disponibilizada na forma de um sal apropriado. Em alguns exemplos, proporciona-se a glutationa neutralizada através da neutralização de glutationa protonada com cerca de 1 equivalente de base, também cerca de 2 equivalentes de base. Em algumas concretizações, a glutationa neutralizada encontra-se em solução. Em alguns exemplos, a glutationa neutralizada é um sólido, como por exemplo um pó liofilizado é um sal apropriado. Em alguns exemplos, o intervalo de tempo para a incubação de glóbulos vermelhos misturados com glutationa é cerca de 1 a 30 minutos, também cerca de 5 a 20 minutos, onde a incubação é efetuada a uma temperatura no intervalo de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18°C e 25°C, ou à temperatura ambiente. Em alguns exemplos, após a mistura com o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina, a mistura é incubada durante um intervalo de tempo adequado, como por exemplo durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 24 horas, também cerca de 8 a 24 horas. Em mais um exemplo, a incubação é efetuada num intervalo de temperaturas de cerca de 1°C, a 30°C, também cerca de 18°C e 25°C, ou aproximadamente à temperatura ambiente. Em alguns exemplos, na mistura de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, a concentração de glutationa na mistura encontra--se no intervalo de cerca de 5 mM a cerca de 30 mM e a concentração de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina encontra-se na gama de cerca de 0,05 mM a cerca de 0,5 mM. Em alguns exemplos, na mistura de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, a concentração de glutationa na mistura encontra--se no intervalo de cerca de 10 mM a cerca de 30 mM e a concentração de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina encontra-se no intervalo de cerca de 0,05 mM a cerca de 0,3 mM. Em alguns exemplos, na mistura de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, a concentração de glutationa na mistura é cerca de 10 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 20 ιηΜ e a concentração de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina é cerca de 0,2 mM.

Neste documento divulga-se um método para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, compreendendo: a)proporcionar i) um composto de inativação de agente patogénico constituído por um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo reativo, ii) um inibidor que compreende um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo reativo do composto de inativação de agentes patogénicos, e iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, na qual há a possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénicos, b) misturar o composto de inativação dos agentes patogénico e o inibidor com a composição composta por glóbulos vermelhos, onde a concentração do inibidor na mistura resultante é maior que 2 mM, onde o pH da mistura resultante, à temperatura ambiente, é cerca de 6,7 ou superior. Em alguns exemplos, o pH da mistura resultante, à temperatura ambiente, encontra-se no intervalo de cerca de 7,0 a 8,5.

Neste documento divulga-se um método para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, compreendendo a mistura do seguinte com a composição de glóbulos vermelhos: (a) um composto de inativação de agentes patogénicos, no qual o composto de inativação de agentes patogénicos compreende um ligando de ligação ao ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo capaz de reagir com os ácidos nucleicos; (b) um inibidor compreendendo um tiol, no qual o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para reduzir o nível de uma reação indesejada do composto de inativação do agente patogénico com glóbulos vermelhos na mistura que inclui a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor e a base, em relação à mistura sem a base. Em alguns exemplos, a reação indesejada do composto de inativação de agentes patogénicos com glóbulos vermelhos é a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos.

Neste documento divulga-se um método para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, compreendendo a mistura 11 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ do seguinte com a composição de glóbulos vermelhos: (a) um composto de inativação de agentes patogénicos, no qual o composto de inativação de agentes patogénicos compreende um ligando de ligação ao ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo capaz de reagir com os ácidos nucleicos; (b) um inibidor compreendendo um tiol, no qual o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo; e c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para aumentar o pH da mistura que inclui a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor e a base, em relação à mistura sem a base. Em alguns exemplos (por exemplo, em alguns exemplos onde o inibidor é um composto com carácter ácido), adiciona-se uma quantidade suficiente da base adequada para aumentar o pH da mistura até pelo menos cerca do valor de pH da mistura sem a base ou sem o inibidor.

Neste documento divulga-se um método para melhorar a inibição de uma reação secundária indesejada de composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos durante o tratamento de uma composição composta por glóbulos vermelhos com o composto de inativação de agentes patogénicos na presença de um inibidor, em que o inibidor compreende um tiol, e em que o composto de inativação de agentes patogénicos compreende um grupo funcional que é, ou que forma, um eletrófilo reativo com o tiol do inibidor, no qual o método inclui aumentar o pH da mistura de reação, composta pela composição de glóbulos vermelhos, pelo composto de inativação de agentes patogénicos e pelo inibidor. Em alguns exemplos, o método compreende ainda o passo de aumentar a concentração do inibidor na mistura reacional. Em alguns exemplos, a reação indesejada do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos é a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos.

Em alguns exemplos de cada um dos métodos acima mencionados, bem como de outros métodos descritos neste documento, o método compreende ainda o passo de redução da concentração do composto de inativação de agentes patogénicos na mistura.

Em alguns exemplos de cada um dos métodos acima mencionados, bem como de outros métodos descritos neste 12 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ documento, a composição de glóbulos vermelhos é tratada ex vivo. Em alguns outros exemplos de cada um dos métodos acima mencionados, bem como de outros métodos descritos neste documento, a composição de glóbulos vermelhos é tratada in vitro.

As composições de glóbulos vermelhos produzidas por cada um dos métodos acima mencionados, bem como por outros métodos descritos neste documento, são também proporcionadas.

Noutro aspeto, o invento proporciona kits, tais como kits descartáveis para uso no processamento de uma composição de glóbulos vermelhos. Estes kits podem ser usados para processamento manual, processamento automatizado, ou para processamento manual e automatizado. Em alguns exemplos, o kit é composto por um composto de inativação de agentes patogénicos constituído por um grupo eletrófilo reativo, incluindo quaisquer seus sais, um inibidor compreendendo um grupo tiol, incluindo quaisquer seus sais e 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor no kit. Numa concretização preferida, o kit é composto por éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina, incluindo quaisquer seus sais, glutationa, incluindo quaisquer seus sais e 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de glutationa no kit. Em alguns exemplos, o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina ou um qualquer seu sal encontra-se numa forma sólida. Em alguns exemplos, o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina ou um qualquer seu sal está em solução. Em alguns exemplos, a glutationa ou um qualquer seu sal está na forma sólida. Em alguns exemplos, a glutationa ou um qualquer seu sal está em solução. Em alguns exemplos, os 1 ou 2 equivalentes de base estão numa forma sólida. Em alguns exemplos, os 1 ou 2 equivalentes de base estão em solução. Em alguns exemplos, a glutationa ou qualquer seu sal e os 1 ou 2 equivalentes de base estão presentes como mistura. Em alguns exemplos, a mistura de glutationa ou de um seu sal e 1 ou 2 equivalentes de base é uma mistura homogénea. Em alguns exemplos, esta mistura homogénea está sob a forma de sólido. Em algumas 13 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concretizações esta mistura homogénea é na solução. Em alguns exemplos, o kit é composto por uma solução para dissolver o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, ou um qualquer seu sal, que está na forma de sólido. Em alguns exemplos, o kit é composto por uma solução para dissolver a glutationa, ou um qualquer seu sal, que está na forma sólida. Em alguns exemplos, o kit é composto por uma solução para dissolver os 1 ou 2 equivalentes de base, que se encontram na forma de sólido. Em alguns exemplos, o kit é composto por uma solução para dissolver o inibidor, ou quaisquer seus sais e os 1 ou 2 equivalentes da base, que estão na forma de sólido. Em alguns exemplos, o kit é composto por uma solução para dissolver a mistura de inibidor e 1 ou 2 equivalentes de base. Em alguns exemplos, os sólidos ou soluções do kit compreendem ainda excipientes, adjuvantes, estabilizantes ou diluentes aceitáveis.

Neste documento apresenta-se um kit útil, por exemplo, para o tratamento de composições de glóbulos vermelhos para inativar agentes patogénicos, que compreende um composto de inativação de agentes patogénicos contendo um ligando de ligação a ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo (incluindo quaisquer seus sais), um inibidor compreendendo um grupo tiol (incluindo qualquer seu sal) e pelo menos cerca de 1 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor no kit. Em alguns exemplos, o kit é composto por cerca de 1 ou cerca de 2 equivalentes de uma base adequada.

Neste documento apresenta-se um kit para o tratamento de composições de glóbulos vermelhos para inativar agentes patogénicos, que compreende um ligando de ligação a ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo (por exemplo, PIC-1), incluindo quaisquer seus sais, e um inibidor neutralizado compreendendo um grupo tiol (por exemplo, glutationa neutralizada), incluindo qualquer seu sal.

Em ainda outros aspetos, o invento inclui uma composição de acordo com a reivindicação 19. Em alguns exemplos, o composto de inativação de agentes patogénicos contém um ligando de ligação de ácidos nucleicos e o inibidor contém um grupo tiol. Uma concretização preferida inclui uma composição 14 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ contendo glóbulos vermelhos, éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina e glutationa numa concentração no intervalo de cerca de 2 mM a 40 mM, em que o pH da composição se encontra no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou aproximadamente de 7,2 a 8,0. Em alguns exemplos, a composição encontra-se num hematócrito de glóbulos vermelhos num intervalo de cerca de 1 a 100%, também cerca de 10 a 90%, também cerca de 35 a 80%, ou cerca de 40 a 70%. Em alguns exemplos, a concentração de éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina encontra-se no intervalo de cerca de 0,05 mM a 4 mM, também cerca de 0,05 mM a 2 mM, também cerca de 0,05 mM a 0,5 mM, ou cerca de 0,1 mM a 0,3 mM e a glutationa encontra-se no intervalo de cerca de 5 mM a 40 mM, também cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM.

Neste documento apresenta-se uma composição compreendendo glóbulos vermelhos, um composto de inativação de agentes patogénicos constituído por um ligando de ligação de ácidos nucleicos e um grupo eletrófilo reativo e um inibidor que contém um grupo tiol que é capaz de reagir com o grupo eletrófilo, no qual o inibidor se encontra em concentrações superiores a 2 mM, e o pH da composição é cerca de 6,7 ou superior. Em alguns exemplos, a composição possui um pH no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5 e cerca de 7,2 a 8,0. Por exemplo, em algumas concretizações, o pH da composição situa-se no intervalo de cerca de 7,0 a 8,5. Em alguns exemplos, a composição compreende pelo menos cerca de 4 mM de inibidor ou pelo menos cerca de 10 mM de inibidor. Em alguns exemplos, o inibidor está numa concentração na gama de cerca de 4 a 40 mM, ou cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em alguns exemplos, o inibidor encontra-se numa concentração no intervalo de cerca de 4 mM a 40 mM, e o pH da composição encontra-se num intervalo de cerca de 6,8 para 8,5. Em alguns exemplos, o inibidor está numa concentração de pelo menos cerca de 4 mM, e o pH da composição está no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5. 15 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS A Figura 1 mostra o título de anticorpos do soro durante transfusões repetidas na fase 1 do Exemplo 12. Para maior clareza, apresentam-se barras de erro apenas para imunizações de KLH-acridina. As barras de erro para grupos de infusão de glóbulos vermelhos (RBC) foram aproximadamente ± 1. A Figura 2 mostra a esperança de vida de RBC com S-220 Original nos grupos 4A, 4B e 6, na fase 2, do Exemplo 12. Determinou-se a esperança de vida por extrapolação dos primeiros pontos de tempo para 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam RBC de controlo biotinilado. Mostram-se barras de erro somente para os grupos 4A, 4B e 6, para maior clareza. A Figura 3 mostra a esperança de vida de RBC com S-303 Original (PIC-1) nos grupos 2A, 2B e 5, na fase 2, do Exemplo 12. Determinou-se a esperança de vida por extrapolação dos primeiros pontos de tempo para 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam RBC de controlo biotinilado. Mostram-se barras de erro somente para os grupos 2B e 5, para maior clareza. A Figura 4 mostra a esperança de vida de RBC com S-220 modificado nos grupos 4A, 4B e 6, na fase 2, do Exemplo 12. Determinou-se a esperança de vida por extrapolação dos primeiros pontos de tempo para 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam RBC de controlo biotinilado. Mostram-se barras de erro somente para os grupos 1, 4B e 6, para maior clareza. A Figura 5 mostra a esperança de vida de RBC com S-220 modificado nos grupos 2A, 2B e 5 na fase 2 do Exemplo 12. Determinou-se a esperança de vida por extrapolação dos primeiros pontos de tempo para 100% no dia 0. Os animais do grupo 1 receberam RBC de controlo biotinilado. Mostram-se barras de erro somente para os grupos 2B e 5, para maior clareza. A Figura 6 mostra os resultados de análise por FACScan de RBC tratado com S-303. 16 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

DESCRIÇÃO DETALHADA DO INVENTO

Os métodos existentes para a inibição de espécies eletrófilas reativas em composições de glóbulos vermelhos são proporcionados, por exemplo, na Patente dos EUA número 6709810. Como exemplo não limitante destes métodos, utiliza--se glutationa em combinação com éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etilico de β-alanina (doravante referido de forma alternativa como "composto de inativação de agentes patogénicos I", "PIC-1", ou "S-303"). A glutationa é normalmente isolada na forma ácida (ou seja, protonada), e esta é a forma utilizada nesses métodos conhecidos. Como tal, quando referida nos métodos de inibição conhecidos, a glutationa será glutationa ácida ou protonada. Conforme se usa neste documento, a condição padrão para a inativação dos agentes patogénicos em glóbulos vermelhos envolve tratar uma composição de glóbulos vermelhos com glutationa protonada a 2 mM e PIC-1 a 0,2 mM. A concentração de glutationa protonada pode ser maior, proporcionando uma maior razão de inibidor para composto de inativação de agentes patogénicos, numa tentativa de proporcionar uma melhor inibição de reações secundárias indesejadas. No entanto, à medida que a concentração de glutationa protonada aumenta, o pH total da composição de glóbulos vermelhos diminui devido à acidez da glutationa. Determinou-se que este pH menor resulta numa insuficiente inibição da reação do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos, particularmente com a superfície dos glóbulos vermelhos. Determinou-se também que a condição padrão não proporciona inibição adequada para a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos. Como tal, o presente invento proporciona métodos de inibição melhorados, nos quais o pH de uma composição de glóbulos vermelhos, compreendendo um composto de inativação de agentes patogénicos e um inibidor é corrigido para um intervalo adequado, para proporcionar melhor inibição, no qual a concentração de inibidor usada é superior a 2 mM, como por exemplo cerca de 5 a 40 mM, também cerca de 10 a 30 mM, ou cerca de 20 mM. Por exemplo, proporcionam-se métodos para que após a mistura de uma composição contendo glóbulos vermelhos com um composto de inativação de agentes patogénicos e um inibidor, o pH esteja 17 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ num intervalo apropriado, como por exemplo um pH de aproximadamente 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou aproximadamente de 7,2 a 8,0, no qual a concentração de inibidor se encontra no intervalo de cerca de 5 a 40 mM.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos descritos neste documento, uma reação secundária indesejada (também referida neste documento como "indesejáveis") do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos é reduzida. Em algumas concretizações, a reação secundária indesejada que é reduzida é a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o nível de reação secundária é reduzido pelo menos em cerca de 5%, pelo menos em cerca de 10%, pelo menos em cerca de 25%, pelo menos em cerca de 50%, pelo menos em cerca de 75%, ou pelo menos em cerca de 90%. A diminuição da reação secundária (em relação a um segundo método) pode ser evidenciada, por exemplo, medindo a quantidade de ligação aos glóbulos vermelhos tratados de anticorpos específicos para o composto de inativação de agentes patogénicos e/ou medindo a esperança de vida de glóbulos vermelhos tratados in vivo e comparando essas medições a glóbulos vermelhos tratados por um segundo método, diferente. Por exemplo, em algumas concretizações dos métodos melhorados, o nível de ligação do anticorpo anti- composto de inativação de agentes patogénicos aos glóbulos vermelhos tratados é reduzido pelo menos em cerca de 10%, pelo menos em cerca de 25%, pelo menos em cerca de 50%, pelo menos em cerca de 75%, ou pelo menos em cerca de 90%, em relação a um método sem as melhorias.

Em algumas concretizações de cada um dos aspetos do invento descritos neste documento, a escala de pH adequada para proporcionar inibição adequada da ligação do composto de inativação de agentes patogénicos aos glóbulos vermelhos é a gama de pH que proporciona melhor inibição da ligação do composto de inativação de agentes patogénicos a glóbulos vermelhos em relação ao tratamento padrão de uma composição de glóbulos vermelhos com glutationa protonada a 2 mM e PIC-1 a 0,2 mM. Em algumas concretizações, a melhoria na inibição é evidenciada por uma diminuição da imunogenicidade dos glóbulos vermelhos tratados em relação aos tratados pelo 18 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ método padrão. Em algumas concretizações, a melhoria na inibição proporcionada por um determinado método em relação ao método padrão é evidenciada por uma diminuição na quantidade de ligação de anticorpos especificos para o composto de inativação de agentes patogénicos a glóbulos vermelhos tratados in vitro e/ou o aumento da esperança de vida dos glóbulos vermelhos tratados in vivo.

Neste documento, apresenta-se um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos que inclui: a) proporcionar i) um composto de inativação de agentes patogénicos constituido por um grupo eletrófilo reativo, ii) um inibidor compreendendo um grupo tiol e iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, na qual existe uma possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico; e b) misturar o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor com a composição composta por glóbulos vermelhos, onde a mistura resultante se encontra na gama de pH adequada para proporcionar inibição adequada da ligação do composto de inativação de agentes patogénicos a glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o método compreende ainda um passo de correção de pH da composição composta por glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o pH da composição composta por glóbulos vermelhos é corrigido antes da mistura com o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor. Em algumas concretizações, o pH da composição composta por glóbulos vermelhos é corrigido pela adição do inibidor. Em alguns exemplos, o inibidor é neutralizado com pelo menos cerca de um equivalente de uma base adequada antes da adição do inibidor à composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o inibidor é misturado com a composição composta por glóbulos vermelhos antes de se adicionar o composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos divulgados neste documento, o intervalo de pH adequado, à temperatura ambiente, é aproximadamente de 6,8 a 8,5, aproximadamente de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5, ou aproximadamente de 7,2 a 8,0. Em alguns exemplos, a concentração de inibidor na mistura resultante encontra-se no intervalo de cerca de 2 mM a cerca de 40 mM. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante encontra-se no intervalo de cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 a cerca de 30 mM. Em alguns exemplos do método, a 19 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concentração de inibidor na mistura resultante é pelo menos cerca de 4 mM ou pelo menos cerca de 10 mM. Em alguns exemplos, o inibidor usado no método compreende cisteina ou um derivado de cisteina. Por exemplo, em algumas concretizações, o inibidor é glutationa. O grupo de eletrófilos reativos é, em alguns exemplos, selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. Em alguns exemplos, o composto de inativação de agentes patogénicos é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino ]etílico de β-alanina. Em alguns exemplos, o tratamento resulta numa inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos.

Neste documento, apresenta-se um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos que inclui: a) proporcionar i) um composto de inativação de agentes patogénicos constituído por um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo reativo, ii) um inibidor compreendendo um grupo tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo reativo do composto de inativação de agentes patogénicos e iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, na qual existe a possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico; e b) misturar o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor com a composição composta por glóbulos vermelhos, onde a concentração do inibidor na mistura resultante é superior a 2 mM, onde o pH da mistura resultante, à temperatura ambiente, se encontra na gama de cerca de 6,7 ou superior. Em alguns exemplos, a mistura resultante tem um pH, à temperatura ambiente, de cerca de 7,0 ou superior, ou cerca de 7,2 ou superior. Em alguns exemplos, o pH da mistura resultante encontra-se num intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Por exemplo, em alguns exemplos, o pH da mistura resultante, à temperatura ambiente, encontra-se na gama de cerca de 7,0 a 8,5. Em alguns exemplos, o método compreende ainda o passo de (c) corrigir o pH da composição composta por glóbulos vermelhos, para que o pH da mistura resultante, à temperatura ambiente, esteja no intervalo indicado (por exemplo, no intervalo de cerca de 7,0 a 8,5) . Em alguns exemplos, o pH da composição composta por glóbulos vermelhos é corrigido pela adição de pelo menos cerca de 0,5 20 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ equivalentes, pelo menos cerca de 1 equivalente ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base à composição de qlóbulos vermelhos, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor na mistura. Em alguns exemplos, o inibidor é neutralizado com pelo menos um equivalente de uma base adequada antes da adição do inibidor à composição de glóbulos vermelhos e o pH da composição composta por glóbulos vermelhos é corrigido pela adição de inibidor neutralizado. Em alguns exemplos, a concentração de inibidor na mistura resultante é pelo menos cerca de 4 mM ou pelo menos cerca de 10 mM. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante é de cerca de 4 a 40 mM, ou cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em alguns exemplos, a concentração do inibidor é pelo menos cerca de 4 mM, em que a mistura tem um pH, à temperatura ambiente, no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor é de cerca de 4 a 40 mM e o pH, à temperatura ambiente, situa-se no intervalo de cerca de 7,2 a 8,5. Em alguns exemplos, o inibidor é neutralizado com pelo menos um equivalente de uma base adequada, antes da adição do inibidor à composição glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o inibidor é misturado com a composição composta por glóbulos vermelhos, antes da adição do composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o composto inibidor é ácido. Em alguns exemplos, o inibidor compreende cisteina ou um derivado de cisteina. Por exemplo, em alguns exemplos, o inibidor é glutationa. Em alguns exemplos, o grupo funcional é selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. Em alguns exemplos, o composto de inativação de agentes patogénicos é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina. Em alguns exemplos, o tratamento resulta numa inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, o tratamento resulta numa inativação de pelo menos 1 log, de pelo menos 2 log, ou de pelo menos cerca de 3 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos.

Neste documento, apresenta-se um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, que compreende a mistura da composição de glóbulos vermelhos com o seguinte: 21 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ (a) composto de inativação de agentes patogénicos, onde o composto de inativação de agentes patogénicos contém um ligando de ligação de ácidos nucleicos e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo capaz de reagir com ácidos nucleicos; (b) um inibidor contendo um tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para reduzir o nível de uma reação secundária indesejada do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos na mistura composta pela composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, em relação à mistura sem a base (isto é, uma segunda mistura composta pelos mesmos componentes da primeira, excetuando-se a adição da base de (c)). Em alguns exemplos, a reação indesejada do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos é a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos, a base e inibidor são combinados com a composição de glóbulos vermelhos, antes, ao mesmo tempo, ou não mais tarde do que cerca de uma hora, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 2 minutos ou cerca de 1 minuto após a combinação do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, a base e o inibidor são misturados com a composição de glóbulos vermelhos antes da mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, a base e o inibidor são misturados antes da mistura da base ou do inibidor com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, um sal básico compreendendo o inibidor proporciona ambos. Tanto o inibidor como a base são proporcionados por um sal básico, compreendendo o inibidor. Nalguns exemplos, a base é o NaOH. Em alguns exemplos, a base é um tampão básico. Em alguns exemplos, são adicionados pelo menos cerca de 0,5 equivalentes, pelo menos cerca de 1,0, ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor na mistura. Em alguns exemplos, a base compreende pelo menos cerca de 1 equivalente de base. Em alguns exemplos dos métodos, o intervalo adequado de pH, à temperatura ambiente, é de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 22 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 8,5, cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Em alguns exemplos, a mistura resultante tem um pH, à temperatura ambiente, de cerca de 7,0 a 8,5. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante é superior a 2 mM, superior a cerca de 4 mM, ou superior a cerca de 10 mM. Em alguns exemplos, a concentração de inibidor na mistura resultante situa-se no intervalo de cerca de 2 mM a cerca de 40 mM. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante encontra-se no intervalo de cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 a cerca de 30 mM. Por exemplo, em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante situa-se no intervalo de cerca de 10 mM a 30mM. Em alguns exemplos, o inibidor é ácido. Em alguns exemplos, o inibidor compreende cisteina ou um derivado de cisteina, tal como a glutationa. Em alguns exemplos, o grupo funcional é selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. O composto de inativação de agentes patogénicos é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina. Em alguns exemplos, o tratamento resulta numa inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos.

Neste documento, apresenta-se um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, que compreende a mistura da composição de glóbulos vermelhos com o seguinte: (a) composto de inativação de agentes patogénicos, onde o composto de inativação de agentes patogénicos contém um ligando de ligação de ácidos nucleicos e um grupo funcional que é, ou que forma, um grupo eletrófilo capaz de reagir com ácidos nucleicos; (b) um inibidor contendo um tiol, onde o tiol é capaz de reagir com o grupo eletrófilo; e (c) uma quantidade suficiente de uma base adequada para aumentar o pH da mistura composta pela composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, em relação à mistura sem a base (isto é, uma segunda mistura composta pelos mesmos componentes da primeira, excetuando-se a adição da base de (c) ) . Em alguns exemplos (por exemplo, em alguns exemplos, onde o inibidor é um composto ácido), é adicionada uma quantidade suficiente de base apropriada para aumentar o pH da mistura até pelo menos um valor aproximado do pH da mistura sem a base ou o inibidor. Em alguns exemplos, a base e inibidor são 23 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ combinados com a composição de glóbulos vermelhos, antes, ao mesmo tempo, ou não mais tarde do que cerca de uma hora, cerca de 30 minutos, cerca de 20 minutos, cerca de 10 minutos, cerca de 5 minutos, cerca de 2 minutos ou cerca de 1 minuto após a combinação do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, a base e o inibidor são misturados com a composição de glóbulos vermelhos antes da mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, a base e o inibidor são misturados antes da mistura da base ou do inibidor com a composição de glóbulos vermelhos. Em alguns exemplos, um sal básico compreendendo o inibidor proporciona ambos. Tanto o inibidor como a base são proporcionados por um sal básico, compreendendo o inibidor. Nalguns exemplos, a base é o NaOH. Em alguns exemplos, a base é um tampão básico. Em alguns exemplos, são adicionados pelo menos cerca de 0,5 equivalentes, pelo menos cerca de 1,0, ou pelo menos cerca de 2 equivalentes de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor na mistura. Em alguns exemplos, a base compreende pelo menos cerca de 1 equivalente de base. Em alguns exemplos dos métodos, o intervalo adequado de pH, à temperatura ambiente, é de cerca de 6,8 a 8,5, cerca de 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Em alguns exemplos, a mistura resultante tem um pH, à temperatura ambiente, de cerca de 7,0 a 8,5. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante é superior a 2 mM, superior a cerca de 4 mM, ou superior a cerca de 10 mM. Em alguns exemplos, a concentração de inibidor na mistura resultante situa-se no intervalo de cerca de 2 mM a cerca de 40 mM. Em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante encontra-se no intervalo de cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, cerca de 10 a cerca de 30 mM. Por exemplo, em alguns exemplos, a concentração do inibidor na mistura resultante situa-se no intervalo de cerca de 10 mM a 30mM. Em alguns exemplos, o inibidor é ácido. Em alguns exemplos, o inibidor compreende cisteina ou um derivado de cisteina, tal como a glutationa. Em alguns exemplos, o grupo funcional é selecionado do grupo constituído por uma mostarda, um intermediário de mostarda e um equivalente de mostarda. O composto de inativação de agentes patogénicos é éster 24 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ Ν-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina. Em alguns exemplos, o tratamento resulta numa inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos.

Neste documento, apresenta-se um método para melhorar a inibição de uma reação secundária indesejada de um composto de inativação de agentes patogénicos com glóbulos vermelhos durante o tratamento de uma composição contendo os glóbulos vermelhos com o composto de inativação de agentes patogénicos, na presença de um inibidor, onde o inibidor contém um tiol, e onde o composto de inativação de agentes patogénicos contém um grupo funcional que é, ou que forma, um eletrófilo reativo com o tiol do inibidor, onde o método compreende o aumento do pH da mistura reacional que contém a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, e o inibidor. Em alguns exemplos, o método compreende ainda o passo de aumentar a concentração do inibidor na mistura reacional. Em alguns exemplos, o inibidor é ácido. Em alguns exemplos, a reação indesejada do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos é a modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos.

Neste documento, apresenta-se um método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, que compreende na seguinte ordem: a) proporcionar i) éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, ii) glutationa neutralizada, e iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, na qual existe a possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico; b) misturar a glutationa neutralizada com a composição composta por glóbulos vermelhos; c) incubar a mistura durante um intervalo de tempo adequado; e d) misturar o éster N-(acridin-9-il), 2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina com a mistura de glutationa neutralizada e a composição composta por glóbulos vermelhos, onde um agente patogénico, se presente na composição contendo glóbulos vermelhos, é inativado por pelo menos 1 log. Em alguns exemplos, a glutationa neutralizada compreende glutationa, à qual foi adicionado pelo menos um equivalente de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor. Em alguns 25 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ exemplos, a glutationa neutralizada compreende glutationa (por exemplo, o ácido livre de glutationa) à qual foram adicionados cerca de dois equivalentes de base.

Apresentam-se também composições de glóbulos vermelhos produzidas por cada um dos métodos descritos neste documento. Em alguns exemplos, as composições de glóbulos vermelhos compreendem níveis reduzidos de modificação da superfície dos glóbulos vermelhos pelo composto de inativação de agentes patogénicos, em relação aos glóbulos vermelhos produzidos por outros métodos que envolvem o tratamento com o composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos, as composições de glóbulos vermelhos produzidas pelo tratamento dos métodos compreendem produtos de degradação do composto de inativação de agentes patogénicos (por exemplo, o produto da reação do inibidor com o composto de inativação de agentes patogénicos). Em alguns exemplos, as composições de glóbulos vermelhos produzidas pelos tratamentos dos métodos descritos neste documento incluem uma quantidade reduzida de composto de inativação de agentes patogénicos contendo o grupo eletrófilo reativo após a conclusão do tratamento, em relação a uma composição de glóbulos vermelhos produzida por um outro método que envolve um tratamento com o composto de inativação de agentes patogénicos. Em alguns exemplos, a quantidade de composto de inativação de agentes patogénicos que contém o grupo eletrófilo reativo na composição foi reduzida em cerca de 10%, cerca de 25%, cerca de 50%, cerca de 75%, cerca de 90%, cerca de 95%, ou cerca de 99%, em relação a uma composição tratada por um outro método que envolve o composto de inativação de agentes patogénicos (por exemplo, um método no qual nenhum inibidor e/ou base é adicionado à mistura de reação ou um tratamento a um pH inferior).

Neste documento, apresenta-se uma composição composta por glóbulos vermelhos, um composto de inativação de agentes patogénicos contendo um ligando de ligação de ácidos nucleicos e um grupo eletrófilo reativo, e um inibidor contendo um grupo tiol capaz de reagir com o grupo eletrófilo, onde o inibidor se encontra a uma concentração superior a 2 mM, e o pH da composição é cerca de 6,7 ou superior. Em alguns exemplos, a composição possui um pH no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, de cerca de 7,0 a 8,5 e de cerca de 7,2 a 8,0. Em alguns exemplos, a composição contém 26 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ pelo menos cerca de 4 mM de inibidor ou pelo menos cerca de 10 mM de inibidor. Em alguns exemplos, o inibidor tem uma concentração no intervalo de cerca de 4 a 40 mM, ou cerca de 10 a 30 mM. Por exemplo, em alguns exemplos, o inibidor encontra-se a uma concentração no intervalo de cerca de 4 mM a 40 mM, e o pH da composição situa-se no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5. Em alguns exemplos, o inibidor está numa concentração de pelo menos cerca de 4 mM, e o pH da composição situa-se no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5.

Relativamente às sequências, neste documento, que contêm substituintes aminoácido, como é evidente para um hábil na arte, cada substituinte aminoácido pode ser selecionado independentemente. Apresentam-se neste documento as sequências contendo substituintes aminoácidos, nas quais são eliminados um ou mais substituintes aminoácido.

Um contaminante patogénico a inativar nos métodos do invento inclui qualquer agente que contenha ácido nucleico capaz de causar doenças em humanos, noutros mamíferos ou em vertebrados. 0 agente patogénico pode ser unicelular ou multicelular. São exemplos de agentes patogénicos, bactérias, vírus, protozoários, fungos, leveduras, bolores e micoplasmas que causam doenças em seres humanos, noutros mamíferos ou em vertebrados. O material genético do agente patogénico pode ser ADN ou ARN, e o material genético pode estar presente na forma de ácidos nucleicos de espiral simples ou espiral dupla. 0 quadro 1 apresenta exemplos de vírus e não se destina a limitar o invento de qualquer maneira.

Quadro 1.

Exemplos não limitantes de vírus

Família Vírus Adeno Adenovírus 2 Hepatite canina Arena Pichinde Lassa Bunia Turlock Encefalite da Califórnia Herpes Herpes simplex 1 27 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Família Vírus Herpes simplex 2 Citomegalovírus Pseudorabies Ortomixo Influenza Papova SV-40 Paramixo Sarampo Papeira Parainfluenza 2 e 3 Picorna Poliovirus 1 e 2 Coxsackie A-9 Eco 11 Varíola Vaccinia Varíola aviária Reo Língua azul Febre da carraça do Colorado Retro HIV Sarcoma aviário Sarcoma de murino Leucemia de murino Rabdo Vírus da estomatite vesicular Toga Encefalite equina ocidental Dengue 2 Dengue 4 Encefalite de St. Louis Hepadna Hepatite B Bacteriófago Lambda RI 7 T2 (Rickettsia) R. akari (riquetsiose)

Para além de inativar possíveis contaminantes patogénicos, os métodos do presente invento também inativam leucócitos que possam estar presentes na composição de 28 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ glóbulos vermelhos. Os métodos de leucorredução são utilizados, de preferência, para remover a maioria dos leucócitos das composições de glóbulos vermelhos destinadas a infusão, uma vez que estes podem resultar em respostas imunes indesejáveis do recetor. No entanto, nem todo o sangue é submetido a leucorredução, ou os métodos de leucorredução não removem todos os leucócitos. Portanto, a inativação de qualquer leucócito residual pelos métodos do invento pode reduzir ainda mais o risco de tais respostas imunes.

Os métodos do invento incluem a utilização ex vivo de um composto de inativação de agentes patogénicos e um inibidor. A utilização ex vivo envolve a utilização dos compostos para o tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos, fora de um ser humano, mamífero, ou vertebrado, vivo, onde o material biológico tratado se destina à utilização no interior de um ser humano, mamífero ou vertebrado, vivo. Por exemplo, a remoção de sangue de um humano e a introdução de um composto nesse sangue para inativar os agentes patogénicos definem-se como utilização ex vivo do composto se o sangue se destina à reintrodução nesse humano ou num outro ser humano. A reintrodução do sangue humano nesse humano ou num outro ser humano seria utilização in vivo do sangue, ao contrário da utilização ex vivo do composto. Se o composto está ainda presente no sangue quando for reintroduzido no humano, então o composto, para além da sua utilização ex vivo, é também introduzido in vivo. Algumas concretizações do presente invento envolvem a utilização ex vivo de um inibidor, onde a composição de glóbulos vermelhos se destina a utilização in vivo. Em alguns casos, algum nível de inibidor permanece na composição de glóbulos vermelhos de modo que o inibidor é também introduzido in vivo. A utilização in vitro de um material ou composto envolve uma utilização do material ou composto fora de um ser humano, mamífero, ou vertebrado, vivo, onde o material ou o composto não se destina a reintrodução num humano, mamífero ou vertebrado, vivo. Um exemplo de uma utilização in vitro seria a análise diagnóstica dos componentes de uma amostra de glóbulos vermelhos. Os métodos do invento podem ser aplicados à utilização in vitro das composições de glóbulos vermelhos, uma vez que a alteração dos glóbulos vermelhos ou de outros constituintes pode afetar a análise in vitro dos componentes da amostra de sangue. Assim, os métodos do invento podem 29 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ proporcionar segurança na manipulação dessas amostras in vitro com inibição adequada de modificações da amostra, que caso contrário podiam interferir com o teste de diagnóstico da amostra.

As composições de glóbulos vermelhos do invento incluem, embora não se limitem, qualquer produto derivado do sangue composto por glóbulos vermelhos, no qual o produto derivado do sangue proporciona, ou é processado para proporcionar, glóbulos vermelhos adequados ao uso humano, tal como para infusão. As composições de glóbulos vermelhos incluem, por exemplo, sangue inteiro e concentrados de glóbulos vermelhos, tais como glóbulos vermelhos embalados. As composições de glóbulos vermelhos podem ser descritas pelo seu hematócrito, uma medida da concentração de glóbulos vermelhos na composição. As composições de glóbulos vermelhos podem ter um hematócrito no intervalo de cerca de 1 a 100%, mais provável cerca de 10 a 90%, também cerca de 35 a 80%, ou cerca de 40 a 70%. Essas composições de glóbulos vermelhos podem incluir produtos quimicos, tais como compostos de inativação de agentes patogénicos e inibidores. Eles também podem incluir soluções tampão e outras soluções, como soluções de aditivos de glóbulos vermelhos, incluindo os sais ou soluções tamponadas. Qualquer composição de glóbulos vermelhos que irá entrar em contacto com, ou ser introduzida, num humano, mamífero ou vertebrado, vivo, onde esse contato comporta um risco de transmissão de doenças devido à contaminação por patogénicos pode ser tratada conforme se divulga neste documento. A inativação dos agentes patogénicos envolve a produção dos patogénicos num material incapaz de se reproduzirem. A inativação é expressa na forma de logaritmo negativo da fração dos agentes patogénicos restantes capazes de se reproduzirem. Assim, se um composto numa determinada concentração produz 90% dos agentes patogénicos num material incapaz de reprodução, 10% ou um décimo (0,1) dos agentes patogénicos permanece capaz de reprodução. O logaritmo negativo de 0,1 é 1, e diz-se que a concentração do composto inativou os agentes patogénicos presentes em 1 log. Em alternativa diz-se que o composto tem 1 log de inativação ou redução àquela concentração. Inativar todos exceto 1% ou 0,1% dos agentes patogénicos corresponderia a uma redução de 30 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ agente patogénico de 2 log ou de 3 log, respetivamente, àquela concentração do composto. Os métodos de determinação do nivel de um agente patogénico especifico num material como uma composição contendo glóbulos vermelhos são bem conhecidos, e exemplos de tais métodos são fornecidos nos exemplos.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos e composições descritas neste documento, o tratamento da composição de glóbulos vermelhos resultará numa inativação de pelo menos cerca de 1 log, de pelo menos cerca de 2 log ou de pelo menos 3 log de um contaminante patogénico, se presente, na composição de glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, o agente patogénico é uma bactéria, como Staphylococcus epidermidis, Serratia marcescens ou Yersinia enterocolitica. Em algumas outras concretizações, o agente patogénico é um virus, como o vírus da estomatite vesicular. Em outras concretizações, o tratamento da composição de glóbulos vermelhos resulta numa inativação de pelo menos cerca de 1 log, de pelo menos cerca de 2 log ou de pelo menos 3 log de um contaminante patogénico na composição. A inativação do agente patogénico nas composições de glóbulos vermelhos é efetuada por contato do agente patogénico da composição glóbulos vermelhos com um composto de inativação de agentes patogénicos. Os compostos de inativação de agentes patogénicos que podem ser inibidos pelos métodos do invento incluem compostos que contém um grupo funcional que é, ou que é capaz de formar e formou, por exemplo, in situ, um grupo reativo, como um grupo eletrófilo. Os compostos de inativação de agentes patogénicos do presente invento não requerem fotoativação para serem reativos. Por exemplo, o grupo funcional pode ser um grupo mostarda, um grupo intermediário de mostarda, um grupo equivalente a mostarda, um epóxido, um formaldeido ou um formaldeido synthon. Esses grupos funcionais são capazes de formar in situ um grupo reativo, tal como um ião eletrófilo de aziridina, aziridinio, tiirano ou tiiranio. Um grupo mostarda pode ser um grupo mono- ou bis-(haloetil) amina ou um grupo mono(haloetil)sulfureto. Um equivalente a mostarda é um grupo que reage por um mecanismo semelhante às mostardas, por exemplo, através da formação de intermediários reativos tais como os grupos aziridinio e aziridina ou grupos tiirano e 31 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ tiiranio. Os exemplos incluem derivados de aziridina, grupos mono ou bis-(mesiletil)amina, grupos mono-(mesiletil)sulfureto, grupos mono ou grupos bis-(tosiletil)amina e mono-(tosiletil)sulfureto. Um formaldeido synthon é qualquer composto que se quebra num formaldeido, o qual inclui uma hidroxilamina tal como a hidroximetilglicina. 0 grupo reativo do composto de inativação de agentes patogénicos é capaz de reagir com os ácidos nucleicos dos agentes patogénicos, por exemplo, com grupos nucleófilos no ácido nucleico. 0 grupo reativo é também capaz de reagir com um grupo nucleófilo do inibidor. Os compostos de inibição de agentes patogénicos também podem incluir um componente que direciona o composto para os ácidos nucleicos, tal como uma porção âncora. A porção âncora é composta por uma porção que é capaz de se ligar por ligação não covalente a um biopolimero de ácidos nucleicos, tais como o DNA ou RNA e é também referido como um ligando de ligação de ácidos nucleicos, grupo de ligação de ácidos nucleicos ou porção de ligação de ácidos nucleicos. Exemplos desses compostos estão descritos nas patentes dos E.U.A., 5691132, 6410219, 6136586, 6617157 e 6709810. Uma outra classe de compostos de inativação de agentes patogénicos que pode ser inibida pelos métodos do invento compreende os grupos reativos acima mencionados, ligados a um grupo de ligação de ácidos nucleicos através de uma ligação hidrolisável, conforme descrito na patente dos E.U.A. 6514987. A porção âncora dos compostos de ativação dos agentes patogénicos tem uma afinidade pelos ácidos nucleicos. Esta afinidade pode dever-se a qualquer um dos vários modos de ligação não covalente ao ácido nucleico, incluindo, mas não se limitado, intercalação, ligação de sulco menor, ligação do sulco principal, ligação eletrostática (ou seja, ligação de espinha dorsal de fosfato) e a sequência de ligação especifica. Exemplos detalhados dessas porções de ligação ao ácido nucleico podem ser encontrados nas patentes supramencionadas.

Em alguns exemplos de cada um dos métodos, composições e kits descritos neste documento, o composto de inativação de agentes patogénicos é composto por um grupo funcional que é, ou que constitui, um grupo eletrófilo reativo com o nucleófilo do inibidor escolhido. Em alguns exemplos, o grupo de inativação dos agentes patogénicos contém um ligando de 32 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ ligação do ácido nucleico e um grupo funcional que é, ou que forma um grupo eletrófilo. 0 composto de inibição de agentes patogénicos para utilizar no presente invento é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina (alternativamente também referido neste documento como "PIC-1" ou "S-303"), cuja estrutura é a seguinte, incluindo os seus sais.

Em algumas concretizações, a concentração do composto de inativação do agente patogénico, tal como o PIC-1, na mistura com a composição glóbulos vermelhos e o inibidor encontra-se no intervalo de cerca de 0,05 mM a 4 mM, cerca de 0,05 mM a 2 mM, cerca de 0,05 mM a 0,5 mM, ou cerca de 0,1 mM a 0,3 mM. A razão molar de inibidor para composto de inativação dos agentes patogénicos, uma vez que ambos os componentes foram misturados com a composição de glóbulos vermelhos é cerca de 20:1 até cerca de 200:1, também cerca de 50:1 até cerca de 200:1, também cerca de 100:1.

Os inibidores, a utilizar em métodos do presente invento, destinam-se a reduzir as reações secundárias indesejadas da espécie eletrófila reativa usada para inativar os agentes patogénicos. Os inibidores adequados contêm um grupo nucleófilo capaz de reagir com o grupo eletrófilo do composto de inativação de agentes patogénicos e é descrito em detalhes na Patente dos E.U.A. número 6709810. Os inibidores são capazes de reduzir significativamente as reações secundárias indesejadas numa composição de glóbulos vermelhos, permitindo que o composto de inativação de agentes patogénicos inative suficientemente um agente patogénico que pode estar a contaminar a composição de glóbulos vermelhos. Os métodos 33 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ aperfeiçoados do presente invento proporcionam uma quantidade eficaz de inibidor em combinação com uma quantidade eficaz de composto de inativação de aqentes patoqénicos sob condições que proporcionam redução ideal em reações secundárias indesejáveis, combinada com suficiente inativação dos aqentes patoqénicos. Pode ser reduzida uma variedade de reações secundárias indesejáveis, tais como a reação com proteinas e componentes de qlóbulos vermelhos. Em alqumas concretizações, o inibidor proporciona redução ideal na modificação dos qlóbulos vermelhos, tais como a liqação de IgG de glóbulos vermelhos ou ligação do composto de inativação de agentes patogénicos aos glóbulos vermelhos. Embora os métodos do invento envolvam o tratamento ex vivo de composições de glóbulos vermelhos, alguns inibidores permanecem na composição aquando da introdução num indivíduo. Como tal, os inibidores do invento precisam ser adequados para infusão. Os inibidores adequados incluem, mas não estão limitados a, compostos que contenham um grupo tiol, tais como inibidores compreendendo o aminoácido cisterna ou um derivado de cisteína adequado, tal como a N-acetilcisteina. Exemplos desses inibidores incluem a cisteína e peptídeos compreendendo pelo menos uma cisteína, tal como a glutationa. Em algumas concretizações, os inibidores adequados compreendem um derivado de cisteína que pode formar um grupo tiol in situ, com ou sem a utilização de produtos químicos adicionais ou adição de enzimas, tal como a S-acetilcisteína ou outras pró-drogas de cisteína derivadas de tiol adequadas ou peptídeos compreendendo S-acetilcisteína ou outras pró-drogas de cisteína derivadas de tiol adequadas. Os derivados de cisteína adequados são aqueles que compreendem, ou que são capazes de formar in situ, um cisteiniltiol capaz de reagir com o grupo eletrófilo do composto de inativação de agentes patogénicos.

Geralmente, devido à orientação do composto de inativação de agentes patogénicos para os ácidos nucleicos, quantidades suficientes de composto de inativação de agentes patogénicos conseguem penetrar no agente patogénico e reagir com o ácido nucleico do agente patogénico antes de ser inibido. 0 composto de inativação de agentes patogénicos que permanece no meio extracelular, no entanto, é adequadamente inibido para reduzir reações secundárias indesejadas. Assim, uma quantidade eficaz de inibidor em combinação com uma 34 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ quantidade eficaz de composto de inativação de agentes patogénicos é fornecida pelos métodos do invento. Em algumas concretizações, o inibidor consegue inibir as reações secundárias indesejadas no ambiente extracelular da composição de glóbulos vermelhos, mas não entra significativamente nas células, tais como bactérias, virus e glóbulos vermelhos. Como tal, a quantidade eficaz de composto de inativação de agentes patogénicos pode ser proporcionada para que o composto de inativação de agentes patogénicos penetre no agente patogénico antes de ser inibido no meio extracelular. Em algumas concretizações, o inibidor é composto por cisteina ou um derivado de cisteina adequado e não penetra significativamente num patogénico, como um virus ou bactéria. Esses inibidores incluem peptideos em que pelo menos um dos aminoácidos é a cisteina, N-acetilcisteina, S-acetilcisteína ou outro derivado da cisteina adequado. Em algumas concretizações, o inibidor compreende um peptídeo (por exemplo, 2-10 aminoácidos) que contém cisteina. O inibidor é glutationa (também conhecida como L-glutationa e γ-L-glutamil-L-cisteinil-glicina).

Em algumas concretizações, o inibidor é glutationa na sua forma reduzida. O dissulfureto de glutationa, a forma oxidada da glutationa, pode também ser utilizado, desde que o dissulfureto de glutationa esteja suficientemente reduzido em solução antes da adição da solução à mistura compreendendo a composição de glóbulos vermelhos ou suficientemente reduzido após a adição à mistura compreendendo a composição de glóbulos vermelhos.

Em algumas concretizações, o inibidor é um derivado da glutationa, como por exemplo um éster monoalquilico ou éster dialquilico de glutationa, no qual o grupo alquilo é um grupo linear ou ramificado, contendo de 1 a 10 átomos de carbono. Exemplos específicos de grupos alquilo incluem, sem a esses se limitarem, o grupo metilo, grupo etilo, grupo propilo, grupo isopropilo, grupo butilo, grupo isobutilo, grupo t-butilo, grupo pentilo, grupo isopentilo, grupo neopentilo, grupo t-pentilo, grupo 1-Metilbutilo, grupo hexilo, grupo iso-hexilo, grupo 2-metilpentilo, grupo 1-etilbutilo, grupo heptilo, grupo octilo, grupo nonilo e grupo decilo. Por exemplo, exemplos não limitantes de derivados de glutationa incluem o éster metílico de glutationa, o éster monoetílico 35 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ de glutationa e o éster monoisopropílico de glutationa. Em algumas concretizações, utiliza-se o éster dietilico oxidado de glutationa (GSSG-(glicil)-dietil-éster). Em algumas concretizações, um tioéster de glutationa é hidrolisado após a adição às composições de glóbulos vermelhos para formar o tiol. É percetível que em algumas concretizações o inibidor seja proporcionado na forma de um ácido ou base livre, ao passo que, em outras concretizações, o inibidor seja proporcionado na forma de um sal. Se o inibidor estiver sob a forma de um sal, o sal será, de preferência, um sal farmaceuticamente aceitável. Os sais farmaceuticamente aceitáveis de compostos (sob a forma de produtos dispersáveis ou solúveis em água ou óleo) incluem os sais não tóxicos convencionais ou os sais de amónia quaternária que se formam, por exemplo, a partir de ácidos ou bases inorgânicos ou orgânicos. Exemplos desses sais de adição de ácido incluem acetato, adipato, alginato, aspartato, benzoato, benzenossulfonato, bissulfato, butirato, citrato, canforato, canforsulfonato, ciclopentanopropionato, digluconato, dodecilsulfato, etanossulfonato, fumarato, gluco-heptanoato, glicerofosfato, hemi-sulfato, heptanoato, hexanoato, cloridrato, hidrobrometo, hidroiodeto, 2-hidroxi-etanossulfonato, lactato, maleato, metanossulfonato, 2-naptalenossulfonato, nicotinato, oxalato, pamoato, pectinato, Persulfato, 3-fenilpropionato, fosfato, Picrato, pivalato, propionato, succinato, tartarato, tiocianato, tosilato e undecanoato. Os sais de base incluem sais de amónia, sais de metais alcalinos, tais como os sais de sódio e potássio, sais de metal alcalino-terroso, tais como os sais de cálcio e magnésio, sais com bases orgânicas tais como os sais diciclo-hexilamina, N-metil-D-glucamina e sais com aminoácidos como a arginina, lisina e assim por diante. Além disso, os grupos básicos que contêm azoto podem ser quaternizados com agentes como halogenetos de alquilo inferior, tais como cloretos, brometos e iodetos de metilo, etilo, propilo e butilo; sulfatos de dialquilo como dimetilo, dietilo, dibutilo; e sulfatos de diamilo, haletos de cadeia longa tais como cloretos, brometos e iodetos de decilo, laurilo, miristilo e estearilo, haletos de aralquilo como os brometos de benzilo e fenetilo e outros. Outros sais 36 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ farmaceuticamente aceitáveis incluem os sais etanolato do sal sulfato e o sulfato.

Por exemplo, em algumas concretizações, o inibidor está sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável formado a partir de glutationa. Em algumas concretizações, o inibidor está sob a forma de um sal farmaceuticamente aceitável, formado a partir de glutationa e um ou mais catiões como sódio, aluminio, cálcio, litio, magnésio, zinco ou tetrametilamónio. Em algumas concretizações, o inibidor é glutationa (reduzida) e é fornecido na forma de sal monossódico de glutationa (disponível, por exemplo, de Biomedica Foscama, Itália). Em algumas outras concretizações, a glutationa (reduzida) é disponibilizada na forma de sal cloridrato de glutationa. Em algumas outras concretizações, a glutationa é disponibilizada na forma de um sal dissódico de glutationa (reduzida). Em outras concretizações, utiliza-se um sulfato de éster monoalquílico de glutationa. Em algumas concretizações, a glutationa é disponibilizada sob a forma de sal dissódico oxidado de glutationa.

Em algumas concretizações, o inibidor é misturado com a composição de glóbulos vermelhos e/ou composto de inativação de agentes patogénicos na forma pura. Em algumas concretizações, o inibidor misturado com a composição de glóbulos vermelhos e/ou o composto de inativação de agentes patogénicos está em solução aquosa. Em algumas concretizações, o inibidor é um inibidor neutralizado em solução aquosa. Por exemplo, em algumas concretizações, o inibidor pode ser um composto ácido em solução aquosa, ao qual foi adicionado pelo menos um equivalente (por exemplo, aproximadamente um ou dois equivalentes) de base.

Os métodos de inibição do presente invento envolvem a combinação de uma composição de glóbulos vermelhos com um composto de inativação de agentes patogénicos e um inibidor em condições onde, na mistura da composição com o composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor, o pH da composição resultante se encontre num intervalo adequado para proporcionar inativação adequada do agente patogénico com maior redução de reações secundárias indesejadas, tais como a modificação dos glóbulos vermelhos. Os métodos melhorados incluem três características que podem ser importantes para os métodos de inibição. A primeira característica é o grupo 37 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ tiol, ou outro grupo nucleófilo adequado. 0 segundo é a correção do pH da solução. É possível proporcionar algum nível de inibição apenas corrigindo adequadamente o pH da solução. Como tal, os inibidores do invento proporcionam alguma capacidade de tamponização à composição composta por glóbulos vermelhos, onde a própria capacidade de tamponização proporciona inibição melhorada. Por exemplo, usar como inibidor um análogo de cisteína como a metionina, quando adequadamente modificada para proporcionar uma variação de pH adequada na composição de glóbulos vermelhos, irá resultar em algum nível de inibição da ligação do composto de inativação de agentes patogénicos aos glóbulos vermelhos. Como o átomo de enxofre na metionina não é nucleófilo, a metionina não proporciona qualquer inibição para além de proporcionar o pH necessário da solução. Assim, a combinação correção do pH e grupo tiol proporciona ainda melhoria nos métodos de inibição do invento. Uma terceira característica que pode ser importante para proporcionar melhor inibição em algumas concretizações são os inibidores preferidos que não penetram substancialmente no interior de agentes patogénicos como vírus e bactérias. Esses inibidores proporcionam inibição adequada no meio extracelular, onde ocorrem reações prejudiciais tais como ligação às superfícies de glóbulos vermelhos, sem inibição adicional de composto de inativação de agentes patogénicos, assim que penetra no interior do agente patogénico.

No que diz respeito à característica de correção do pH da composição de glóbulos vermelhos, os métodos existentes de inibição desses compostos de inativação de agentes patogénicos não percebem a importância do pH da mistura resultante. Embora se demonstrasse, em métodos conhecidos, que quantidades mais elevadas de inibidores proporcionam inativação adequada do agente patogénico, esses métodos não descrevem adequadamente os efeitos sobre a modificação dos glóbulos vermelhos quando se utilizam quantidades mais elevadas de inibidores como por exemplo glutationa protonada. Como demonstram os exemplos neste documento, a utilização de quantidades mais elevadas de inibidores tais como glutationa ácida não reduz adequadamente o nível de modificação dos glóbulos vermelhos. Porque a glutationa é ácida, os níveis mais elevados trazem o pH da composição de glóbulos vermelhos para níveis inaceitavelmente baixos, nos quais a inibição das 38 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ reações secundárias indesejadas do composto de inativação de agentes patogénicos é ineficaz. Assim, um aspeto do presente invento consiste em assegurar que o pH da composição de glóbulos vermelhos é mantido num nivel adequado ao adicionar o composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor. Em algumas concretizações, ao misturar o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor com a composição de glóbulos vermelhos, o pH da mistura situa-se no intervalo de aproximadamente 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Embora o pH numa composição de glóbulos vermelhos possa variar com o tempo, é desejável que o pH esteja num intervalo desejado quando se adiciona o inibidor à composição de glóbulos vermelhos, contenha ele já ou não o composto de inativação de agentes patogénicos. Os métodos do presente invento envolvem a adição de composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor a uma composição de glóbulos vermelhos. A gama de pH desejada é necessária na adição do composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor independentemente da ordem de adição do composto de inativação de agentes patogénicos e/ou inibidor à composição de glóbulos vermelhos. Por outras palavras, uma vez misturados todos os três componentes, o pH situa-se no intervalo desejado. Em algumas concretizações, o inibidor é adicionado antes do composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o composto de inativação de agentes patogénicos é adicionado antes do inibidor. Em algumas concretizações, o inibidor e o composto de inativação de agentes patogénicos são adicionados essencialmente em simultâneo. Assim, "após adição do composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor" significa o instante quando o inibidor e o composto de inativação de agentes patogénicos foram misturados com a composição de glóbulos vermelhos. O pH desejado pode ser alcançado por vários meios e não se limita a quando o pH da composição de glóbulos vermelhos é corrigido, ou em algumas concretizações não é corrigido significativamente a partir do pH natural do produto derivado do sangue. Por exemplo, o pH desejado da composição de glóbulos vermelhos pode ser alcançado corrigindo o pH. A correção do pH pode ser efetuada, por exemplo, pela adição de uma solução de aditivo adequada, como uma solução tamponizante, antes de adicionar o composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor. Em algumas 39 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concretizações, a composição de glóbulos vermelhos pode ser lavada uma ou mais vezes com tampão adequado antes da suspensão no mesmo ou noutro tampão apropriado. Em alternativa, o pH da composição de glóbulos vermelhos pode ser ajustado simultaneamente com a adição do composto de inativação de agentes patogénicos, do inibidor ou de ambos. Em algumas concretizações, o pH é corrigido simultaneamente com adição do inibidor. Numa concretização preferida, o inibidor está neutralizado, para que a adição do inibidor neutralizado proporcione o intervalo de valores de pH desejado na composição de glóbulos vermelhos. Como exemplo, a neutralização de glutationa pode ser usada para efetuar as correções necessárias no pH. Porque a glutationa é composta por ácido glutâmico, o pH da forma protonada é ácido. Sem estar vinculado pela teoria, a provável neutralização de glutationa protonada é apresentada no seguinte esquema: 39 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Glutationa protonada ou ácido livre de glutationa dH aDroxi madament.fi 3 0,9-1,0 equivalentes de NaOH pH aproximadamente 5 2 equivalentes de NaOH pH aproxilnadamente 9,5

Como tal, pode ser usado um nivel adequado de neutralização da glutationa, por exemplo pela adição de 2 equivalentes de base, para proporcionar um inibidor que, na adição a uma composição de glóbulos vermelhos, dará a correção de pH necessária da composição. A neutralização adequada dependerá do inibidor usado. Por exemplo, quando se utiliza um peptideo, este dependerá dos componentes aminoácidos do peptideo. Em algumas concretizações, pode ser usado um inibidor que não afete significativamente o pH da composição de glóbulos vermelhos. Por exemplo, a utilização de um peptideo composto por uma cisteina que pode compreender ainda um ou mais aminoácidos que resultam num pH mais neutro para uma solução do peptideo naturalmente isolado. Em algumas 40 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concretizações, ο peptídeo compreende ainda pelo menos um aminoácido básico, tal como a arginina ou a lisina.

Em algumas concretizações dos métodos descritos neste documento onde uma base é misturada com a composição de glóbulos vermelhos, juntamente com o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor para aumentar o pH da mistura até um nível desejado e/ou melhorar a inibição de reações secundárias indesejáveis, a base é um sal básico. 0 sal básico primeiro pode ser dissolvido numa solução aquosa, antes da mistura com a composição de glóbulos vermelhos, ou pode ser adicionado diretamente à composição de glóbulos vermelhos em forma sólida. Em algumas concretizações, o sal básico compreende o inibidor e proporciona o inibidor e a base à mistura. Em algumas concretizações, a base usada no método é uma base forte, como o NaOH. Tipicamente, uma base forte como o NaOH será dissolvida primeiramente em solução aquosa, antes da mistura com a composição de glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, a base forte (em solução ou em forma sólida) é misturada com o inibidor antes da mistura do inibidor com a composição de glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, a base é um tampão básico (adicionado em quantidades suficientes e possuindo um pKa apropriado para trazer a mistura até ao intervalo de pH desejado). Se for utilizado um tampão básico, o tampão, em algumas concretizações, será um tampão farmaceuticamente aceitável. Em algumas concretizações, o tampão terá um protão titulável com um pKa na gama de cerca de 7 a 8. Exemplos de tampões que podem ser usados como tampões básicos incluem, mas sem limitações, ácido N-(2-hidroxietil)-piperazina-N'-2-etanessulfónico (HEPES), tampão de fosfato salino (PBS) e tampão fosfato de sódio. Outros tampões básicos adequados serão facilmente identificáveis por alguém de vulgar perícia na arte.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos e composições descritas neste documento, o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor, composto de inativação de agentes patogénicos e qualquer base adicionada for superior a cerca de 6,7, superior a cerca de 7,0, ou superior a cerca de 7,2. Em algumas concretizações de cada uma das composições e métodos descritos neste documento, o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor, composto de inativação de 41 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ agentes patogénicos, e base (se qualquer um for alguma for adicionada) encontra-se no intervalo de aproximadamente 6,8 a 8.5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas concretizações preferidas, o pH indicado é o pH à temperatura ambiente. Por exemplo, em algumas concretizações, a composição constituída por glóbulos vermelhos é tratada com o composto de inativação de agentes patogénicos na presença do inibidor e de qualquer base adicionada, na qual o pH da mistura se situa no intervalo de cerca de 7,2 a cerca de 8,0.

Em algumas concretizações, o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor, e a base (se for adicionada base como parte do método) encontra-se no intervalo de cerca de 6,8 a 8.5, aproximadamente 7,0 a 8,5, cerca de 7,2 a 8,5, ou aproximadamente 7,2 a 8,0, antes de se misturar o composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em algumas outras concretizações, o pH é atingido simultaneamente, ou em cerca de 1 hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos ou em cerca de 2 minutos, de mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição composta por glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações desses métodos onde o pH é corrigido, o pH é corrigido para a gama de pH desejada antes, em simultâneo, em cerca de 1 hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos ou em cerca de 2 minutos de mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição composta por glóbulos vermelhos. Nessas concretizações, em que o inibidor é a glutationa e o composto de inativação de agentes patogénicos é PIC-1, o pH da mistura composta pela composição de glóbulos vermelhos e pelo inibidor é corrigido, de preferência, até à gama de pH desejada (por exemplo, pH 7,2 a 8,0) antes da mistura do PIC-1 com a composição de glóbulos vermelhos.

Em algumas concretizações, o pH resultante da composição final não é necessariamente uma correção do pH da composição inicial de glóbulos vermelhos. Por exemplo, uma composição de glóbulos vermelhos pode ter um pH no intervalo desejado de 6,8-8,5, e o pH da composição não varia significativamente na adição de inibidor e posteriormente de composto de inativação de agentes patogénicos. Nessas concretizações, o inibidor 42 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ proporciona naturalmente ο ρΗ desejado, ou é neutralizado em conformidade para proporcionar o pH desejado. É a combinação da adição de quantidades elevadas de inibidor, como por exemplo cerca de 5 mM a cerca de 40 mM, com um pH resultante no intervalo desejado que é importante. Os métodos conhecidos que utilizam essas concentrações de glutationa, por exemplo, não foram utilizados com o intervalo de pH desejado do presente invento. Assim, para os peptideos, independentemente do inibidor de peptídeo, podem ser eficazmente neutralizados conforme necessário para proporcionar uma gama de pH adequado quando adicionado a uma composição de glóbulos vermelhos e ainda pode ser selecionado para proporcionar uma quantidade adequada de tamponização na gama de pH desejado. Deste modo, um inibidor neutralizado significa que o inibidor é titulado adequadamente com ácido ou base, conforme a necessidade, para que na adição a uma composição de glóbulos vermelhos, na mistura resultante tenha um pH que proporciona melhor inibição de reações secundárias indesejadas, tal como um pH na gama de cerca de 6,8 a 8,5, também cerca de 7,0 a 8,5, também cerca de 7,2 a 8,5, ou cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas concretizações, o peptídeo na forma naturalmente isolada está devidamente neutralizado, ou seja, não requer qualquer adição de ácido ou base para proporcionar o pH desejado na mistura final. Os inibidores preferidos, proporcionarão ainda capacidade de tamponização para manter o pH na gama desejada, durante o tempo necessário, para inibir as reações secundárias indesejadas. O inibidor está neutralizado. Diz-se que um inibidor está "neutralizado" por uma base se, com o inibidor, foi combinada uma quantidade suficiente de base para que a inibição de uma reação secundária indesejada, entre o composto de inativação de agentes patogénicos e os glóbulos vermelhos, seja melhorada numa mistura que inclui a composição composta por glóbulos vermelhos, composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor. Um "inibidor neutralizado" não tem necessariamente um pH neutro. Em algumas concretizações, em que o inibidor é muito ácido, o pH do inibidor neutralizado ainda pode ser inferior a 7,0. Em algumas concretizações, o pH da solução de inibidor neutralizado pode ser superior a 7,0. Em algumas concretizações, o pH da solução de inibidor neutralizado será visivelmente maior do que o do inibidor antes da adição da base. 0 inibidor é neutralizado com pelo 43 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ menos cerca de 0,5 equivalentes de uma base. Em algumas concretizações, o inibidor é neutralizado com cerca de 1 a cerca de 2 equivalentes de base. Em algumas concretizações, o inibidor é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base. Em outras concretizações, o inibidor é neutralizado com cerca de 2 equivalentes de base. Por exemplo, em algumas concretizações do invento, a glutationa é neutralizada com cerca de 2 equivalentes de uma base adequada, tal como o hidróxido de sódio. Neste caso, uma solução da glutationa protonada tem um pH de aproximadamente 3, enquanto a solução neutralizada com 2 equivalentes de hidróxido de sódio tem um pH de aproximadamente 9,5. Qualquer inibidor peptideo adequado, composto por pelo menos uma cisteina pode ser devidamente corrigido para proporcionar o pH desejado, mediante adição à composição de glóbulos vermelhos. Para além de proporcionar um inibidor que tem um pH devidamente corrigido ou neutralizado, em algumas concretizações, os inibidores preferidos não conseguem entrar significativamente nos agentes patogénicos, de modo que inibem idealmente as reações indesejadas no meio extracelular, mas não interferem com a inativação dos agentes patogénicos assim que o composto de inativação de agentes patogénicos penetra no interior do agente patogénico.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos descritos neste documento, o inibidor é um composto ácido. Em algumas concretizações, o inibidor é disponibilizado sob a forma de ácido livre. Em algumas concretizações, o inibidor é ácido e para neutralizar o inibidor adiciona-se pelo menos cerca de 1 equivalente de base. Uma solução composta por um desses inibidores neutralizados pode, em alguns casos, ser básica, neutra ou mesmo ácida, ainda. Em algumas concretizações, para neutralizar o inibidor, adiciona-se cerca de 1 equivalente de base. Em algumas concretizações, são adicionados cerca de 2 equivalentes de base. Em algumas concretizações, o inibidor é ácido e cerca de 1 a aproximadamente 2 equivalentes de base são usados para neutralizar o inibidor. Em algumas concretizações, são utilizados cerca de 1 ou cerca 2 equivalentes de base.

Em algumas concretizações, o inibidor é neutralizado antes da adição à composição de glóbulos vermelhos e/ou composto de inativação de agentes patogénicos. Em outras 44 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concretizações, ο inibidor é neutralizado após a combinação do inibidor com a composição de glóbulos vermelhos e/ou do composto de inativação de agentes patogénicos.

Em algumas concretizações, o inibidor é glutationa e é disponibilizado na forma de sal monossódico de glutationa e é neutralizado com cerca de 1 equivalente de base. Em algumas outras concretizações, o inibidor é glutationa e é disponibilizado na forma de sal cloridrato de glutationa e é neutralizado com cerca de 2 equivalentes de base.

Em algumas concretizações, a concentração do inibidor na mistura que compreende a composição de glóbulos vermelhos, o inibidor, o composto de inativação de agentes patogénicos e qualquer base adicionada é maior que 2 mM, maior que cerca de 4 mM, ou maior do que cerca de 10 mM. Em algumas concretizações, a concentração de inibidor na mistura encontra-se no intervalo de cerca de 2 mM a 100 mM, cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM. Em algumas concretizações, a concentração do inibidor na mistura é cerca de 2 mM. Em algumas concretizações de cada um dos métodos e composições descritos neste documento, a concentração de inibidor na mistura é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor, composto de inativação de agentes patogénicos, é superior a cerca de 6,7, maior do que cerca de 7,0 ou maior do que cerca de 7,2. Em algumas concretizações, a concentração do inibidor na mistura encontra-se no intervalo de cerca de 2 mM a 40 mM, cerca de 4 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 40 mM, cerca de 5 mM a 30 mM, ou cerca de 10 mM a 30 mM e o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor e composto de inativação de agentes patogénicos encontra-se no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5, ou de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas concretizações de cada um dos métodos e composições descritas neste documento, a concentração de inibidor na mistura é maior do que 2 mM, maior do que cerca de 4 mM, ou maior do que cerca de 10 mM, e o pH da mistura de glóbulos vermelhos, inibidor e composto de inativação de agentes patogénicos encontra-se no intervalo de cerca de 6,8 a 8,5, também de cerca de 7,0 a 8,5, também de cerca de 7,2 a 8,5, ou de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas 45 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ concretizações, a concentração de inibidor (por exemplo, a glutationa) na mistura encontra-se no intervalo de cerca de 4 mM a cerca de 40 mM, e o pH da mistura encontra-se no intervalo de cerca de 7,2 a 8,0. Em algumas concretizações, a concentração de inibidor na mistura encontra-se no intervalo de cerca de 10 mM a cerca de 30 mM, e o pH da mistura encontra-se no intervalo de cerca de 6,8 para 8,5. O inibidor é glutationa neutralizada. A glutationa tem muitas propriedades que a tornam particularmente útil como inibidor. Está normalmente presente em todos os tipos de células. Acredita-se que não consegue penetrar passivamente num agente patogénico, tal como passar através das membranas celulares ou revestimentos de lipidios, de bactérias e virus com envelope lipidico, ou passar através da cápside virai do virus sem envelope. A pH 7, a glutationa tem carga e na ausência de transporte ativo não penetra as bicamadas lipidicas de forma significativa. Isto é consistente com o facto de a inativação de virus com envelope lipidico, tais como o HIV e o VSV, não ser substancialmente afetada pela glutationa, incluindo a utilização de concentrações de glutationa neutralizada superiores a 2 mM. A utilização de glutationa tem de facto algum efeito na inativação de Yersinia enterocolitica, Staphylococcus epidermidis e Serratia marcescens. No entanto, isso pode ser gerido usando quantidades eficazes de glutationa neutralizada e composto de inativação de agentes patogénicos. Como tal, proporcionam-se métodos preferidos de inibição em que a contaminação de uma composição de glóbulos vermelhos por um agente patogénico virai ou bacteriano é inativada em pelo menos 2 log, de preferência em pelo menos 3 log. Em algumas concretizações, o Staphylococcus epidermidis pode ser inativado em até pelo menos 3 log, também cerca de 4 log, ou cerca de 5 log e o VSV pode ser inativado em até pelo menos 4 log, também cerca de 5 log ou de cerca de 6 log. Além disso, a inativação é em cerca de 3 log, também cerca de 2 log, de preferência cerca de 1 log que a do tratamento padrão da composição de glóbulos vermelhos com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1. Em algumas concretizações, a inativação de Staphylococcus epidermidis com PIC-1 situa-se em cerca de 3 log, também em cerca de 2 log ou em cerca de 1 log de uma composição semelhante inativada com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1. Em algumas concretizações, a inativação de VSV com 46 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ PIC-1 está em cerca de 2 log, ou em cerca de 1 log, ou é essencialmente igual ao de uma composição semelhante inativada com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1. A glutationa também é compatível com armazenamento in vitro de glóbulos vermelhos e a composição resultante de glóbulos vermelhos é apropriada para a introdução in vivo.

Os métodos adequados para neutralizar a glutationa e outros inibidores serão facilmente visíveis aos de vulgar perícia na arte. Em algumas concretizações, utiliza-se o hidróxido de sódio para neutralizar o inibidor. Em algumas concretizações, dissolvem-se primeiro pelotas sólidas de NaOH em água para produzir uma solução concentrada de base, tal como uma solução de NaOH IN, 5N, 10N ou 2 0N. Em algumas concretizações, adiciona-se uma quantidade adequada dessa solução de NaOH ao inibidor antes, ao mesmo tempo, ou a seguir à adição do inibidor à mistura. Em alternativa, adiciona-se o NaOH à composição de células glóbulos vermelhos ou ao composto de inativação de agentes patogénicos ou à combinação dos dois, antes da adição do inibidor à mistura. O inibidor e/ou base adicionada (ou o inibidor neutralizado) usados nos métodos descritos neste documento podem ser misturados com a composição de glóbulos vermelhos, antes, em simultâneo, ou após a adição de composto de inativação de agentes patogénicos à composição de glóbulos vermelhos. Se o inibidor e a base (ou inibidor neutralizado) forem misturados com a composição de glóbulos vermelhos após a solução de inativação de agentes patogénicos ter sido misturada com a composição de glóbulos vermelhos, o inibidor e/ou a base (ou inibidor neutralizado) serão adicionados, de preferência, à composição de glóbulos vermelhos, antes de ter ocorrido uma quantidade significativa de reação secundária do composto de inativação de agentes patogénicos com os glóbulos vermelhos, para que se atinja inativação adequada da reação secundária indesejada. Em algumas concretizações, o inibidor e/ou a base (ou inibidor neutralizado) são misturados com a composição de glóbulos vermelhos em cerca de uma hora, em cerca de 30 minutos, em cerca de 20 minutos, em cerca de 10 minutos, em cerca de 5 minutos, em cerca de 2 minutos, ou em cerca de 1 minuto após a mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Em algumas concretizações, o inibidor e/ou base (ou inibidor 47 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ neutralizado) são misturados com a composição de glóbulos vermelhos antes da mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos. Por exemplo, em algumas concretizações onde nos métodos se utiliza glutationa neutralizada e PIC-1, a glutationa neutralizada é misturada com glóbulos vermelhos antes, em simultâneo, ou em cerca de 10 minutos após a mistura do PIC-1 com a composição de glóbulos vermelhos.

Em algumas concretizações, o inibidor e/ou base (ou inibidor neutralizado) são misturados com a composição de glóbulos vermelhos antes da mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos descritos neste documento, o inibidor e a base adicionada (ou o inibidor neutralizado) são incubados com a composição de glóbulos vermelhos durante um intervalo de tempo adequado, antes da adição do composto de inativação de agentes patogénicos, tal como durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 24 horas, também cerca de 8 a 24 horas. Em algumas outras concretizações, a incubação dá-se num intervalo de temperaturas de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18°C a 25°C, ou aproximadamente à temperatura ambiente.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos descritos neste documento, o composto de inativação de agentes patogénicos é incubado com a composição de glóbulos vermelhos na presença do inibidor e da base adicionada (ou do inibidor neutralizado) durante um intervalo de tempo adequado, tal como durante cerca de 30 minutos a 48 horas, também cerca de 2 a 24 horas, também cerca de 8 a 24 horas. Em algumas concretizações ainda, a incubação dá-se num intervalo de temperaturas de cerca de 1°C a 30°C, também cerca de 18°C a 25°C, ou aproximadamente à temperatura ambiente.

Além de comparar a inativação log, conforme se discutiu acima, a eficácia dos métodos de inibição melhorada pode ser avaliada por vários outros métodos. Os métodos de inibição poderão ser avaliados, analisando a modificação da composição de glóbulos vermelhos, tanto em termos da função dos glóbulos vermelhos, como em termos de reatividade dos glóbulos 48 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ vermelhos tratados com o sistema imunológico, tal como com anticorpos. Se a composição de glóbulos vermelhos tratados se destina a uso humano, tal como a infusão, os métodos de inibição não devem danificar substancialmente a função dos glóbulos vermelhos. A falta de um efeito substancialmente prejudicial na função dos glóbulos vermelhos pode ser medida pelos métodos conhecidos na arte para testar a função dos glóbulos vermelhos. Por exemplo, os níveis de indicadores como o ATP intracelular (5'-trifosfato de adenosina), 2,3-DPG intracelular (2,3-difosfoglicerol) ou potássio extracelular podem ser medidos e comparados com um controlo não tratado. Para além desses, pode medir-se a hemólise, o pH intracelular e extracelular, o hematócrito, a hemoglobina, a fragilidade osmótica, o consumo de glicose e a produção de lactato. Os métodos melhorados do presente invento podem ser comparados à condição padrão de 2 mM de glutationa ácida combinada com 0,2 mM de PIC-1, bem como a condições com aumento de glutationa, onde os métodos conhecidos utilizam glutationa ácida, conforme descrito na patente dos E.U.A. n.° 6709810. Embora o aumento da concentração de glutationa nos métodos do invento possa resultar numa ligeira redução do nível de inativação de alguns agentes patogénicos, são ainda obtidos níveis adequados de inativação e a redução melhorada na modificação dos glóbulos vermelhos, mantendo a função adequada dos glóbulos vermelhos, resulta num produto global melhor.

Os métodos para a determinação de ATP, 2,3-DPG, glicose, hemoglobina, hemólise e potássio estão disponíveis na arte. Ver, por exemplo, Davey et al., Transfusion, 32:525-528 (1992). Os métodos para determinar a função dos glóbulos vermelhos também são descritos em Greenwalt et al, Vox Sang, 58:94-99 (1990); Hogman et al, Vox Sang, 65:271-278 (1993); Beutler et al, Blood, vol. 59 (1982) . Por exemplo, o ATP intracelular e o 2,3-DPG intracelular são medidos usando um kit de ATP ou um kit de 2,3-DPG da Sigma (Sigma, St. Louis, Mo). O kit de ATP é usado seguindo o procedimento n.° 366-UV da Sigma. Os níveis de potássio extracelular podem ser medidos usando um Analisador de K+/Na+, Modelo 614, Ciba Corning (Ciba Corning Diagnostics Corp., Medford, MA) . O pH extracelular é medido por centrifugação das células a 4°C durante 15 minutos a 12000x g e retirando o sobrenadante, do qual o pH é medido usando um medidor de pH padrão à 49 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ temperatura ambiente (por exemplo, elétrodo de calomelano epóxi, Beckman). Para o pH intracelular, a pelota restante é tapada num tubo de centrífuga e armazenada a cerca de -80°C durante pelo menos 2 horas. Esta é então submetida a lise por adição de água desionizada. A amostra resultante da lise é bem misturada e o pH da solução é medido à temperatura ambiente usando um medidor de pH padrão ou à temperatura ambiente usando um analisador de sangue de gás, modelo 238, Ciba Corning (Ciba Corning Diagnostics Corp, Medford, MA) . As medições podem ser feitas logo após o tratamento e como função de armazenamento após tratamento, por exemplo, armazenamento durante até 42 dias. Os métodos do presente invento proporcionam uma composição de glóbulos vermelhos onde a hemólise dos glóbulos vermelhos tratados é inferior a 3% após armazenamento de 28 dias, com maior preferência inferior a 2% após armazenamento de 42 dias, e de maior preferência inferior ou igual a cerca de 1% após armazenamento de 42 dias a 4°C. Os métodos preferidos proporcionam uma composição de glóbulos vermelhos onde o nível de ATP intracelular é superior ao de uma composição semelhante, tratada com a condição padrão de 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1. Em algumas concretizações, os métodos de inibição do presente invento proporcionam níveis de ATP que também são cerca de 20%, também 30%, também 40% ou cerca de 50% mais elevados do que uma composição tratada com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1, onde o nível mais elevado de ATP se mantém após 7, 14, 21, 28, 35, ou 42 dias de armazenamento. A redução na modificação dos glóbulos vermelhos nos métodos do presente invento pode ser avaliada por vários ensaios. Num ensaio, produz-se soro policlonal de coelho, que é reativo com acridina, através da injeção de coelhos brancos Nova Zelândia com um composto de acridina conjugada com KLH. Utilizou-se o composto de acridina S-197 e este tem a seguinte estrutura:

S-197 50 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Este é conjugado com o KLH adicionando 10 μΐ do composto (10 mM de água desionizada) a 990 μΐ de uma solução tamponada de KLH (10 mg/ml em 50 mM de fosfato, 150 mM de NaCl, PBS a pH = 7,2 com o estabilizante do proprietário, Pierce Cat #77600) e incubando à temperatura ambiente durante mais de 20 horas. Na sequência desta incubação, isola-se o KLH conjugado do S-197 que não reagiu e dos produtos secundários de S-197, passando através de uma coluna de dessalificação (por exemplo, colunas D-salt, Pierce) e eluindo com tampão de PBS. Combinam-se então as frações coloridas das soluções e caracterizam-se os conjugados de KLH pela relação de absorvância a 210 e 410 nm. Misturam-se as soluções do conjugado acridina-KLH com adjuvante de Freund completo para injeção intramuscular nos coelhos em vários locais para imunizar os coelhos. O soro de coelho resultante terá um titulo elevado de anticorpo policlonal que reage com a estrutura de acridina. O soro de coelho pode ser incubado com composições de glóbulos vermelhos que foram tratadas com, por exemplo, PIC-1 e glutationa. Lava-se o anticorpo de coelho não ligado e faz-se reagir a solução com um anticorpo de cabra anti-coelho. A solução resultante pode ser analisada por aglutinação, passando através de uma placa de gel tamponado ("Buffer gel-card", sistemas de Microdigitação, Pompano Beach, Flórida). As placas de gel são concebidas para permitirem a passagem de glóbulos vermelhos não aglutinados, enquanto as células aglutinadas pela reação com o soro de coelho e pela reação cruzada com o anticorpo anti-coelho permanecem na parte superior do gel. As placas são pontuadas com 0, 1 +, 2 + , 3+ ou 4 + , onde 0 indica que todas as células estão intactas e estão na parte inferior do gel, enquanto 4+ indica aglutinação completa, com todas as células na parte superior do gel. Os métodos de inibição do presente invento resultarão numa pontuação de 1+ ou inferior, de preferência 0, quando testados usando uma diluição de 1:100 de soros de coelho, ao passo que uma composição semelhante tratada com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1 resulta em pontuações de 2+ ou superior.

Além disso, os métodos de inibição do presente invento resultarão em pontuações inferiores quando comparados com uma composição semelhante, tratada com glutationa ácida na mesma concentração de inibidor que no método preferido de inibição e na mesma concentração de composto de inativação de agentes 51 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ patogénicos. Por exemplo, uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa neutralizada e 0,2 mM de PIC-1 resultará numa pontuação menor, de preferência numa pontuação de 1+ ou 0, do que uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1.

Num outro ensaio, pode fazer-se reagir o soro policlonal de coelho com glóbulos vermelhos tratados. Após a lavagem do anticorpo não ligado, adiciona-se um fragmento Fab'2 de cabra anti-coelho rotulado com FITC (anti cadeias H+L, Caltag). A ligação do rótulo FITC aos glóbulos vermelhos correlaciona--se com a quantidade de acridina ligada à superficie dos glóbulos vermelhos e é avaliada pela análise de FACScan™ (Becton, Dickinson and Co., NJ) . A modificação relativa dos glóbulos vermelhos é determinada a partir do valor de fluorescência média do FACScan™. Os métodos de inibição do presente invento, quando comparados com o tratamento usando 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1, irão resultar numa redução da fluorescência média em pelo menos 50%, também em pelo menos 75% ou em pelo menos 90%. Além disso, os métodos de inibição do presente invento irão resultar num nível inferior de fluorescência média quando comparados com uma composição semelhante, tratada com glutationa ácida na mesma concentração de inibidor que no método preferido de inibição e na mesma concentração de composto de inativação de agentes patogénicos. Por exemplo, uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa neutralizada e 0,2 mM de PIC-1 resultará num nível inferior de fluorescência média a uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1. Os métodos de inibição do presente invento, quando comparados com tratamento idêntico com glutationa ácida, resultarão numa redução da fluorescência média em pelo menos 10%, também em pelo menos 25%, também em pelo menos 50%, também em pelo menos 75% ou em pelo menos 90%, em comparação com o tratamento de glutationa ácida.

Finalmente, as amostras de soro de pacientes infundidos com glóbulos vermelhos tratados com 2 mM de glutationa e 0,2 mM de PIC-1 que parecem ter desenvolvido anticorpos anti-PIC-1 podem ser usadas para avaliar a reatividade cruzada com composições de glóbulos vermelhos tratados do presente 52 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ invento. Este ensaio é semelhante ao ensaio de placa de Gel utilizando soro policlonal de coelho. Neste ensaio, o gel contém igG anti-humano de coelho, para que os glóbulos vermelhos reativos com soros de pacientes aglutinem na parte superior do gel. As placas são pontuadas como se indicou acima. Os métodos de inibição do presente invento irão resultar em pontuações de 1+ ou inferiores, de preferência 0, para este ensaio, ao passo que uma composição semelhante tratada com 2 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1 resulta em pontuações de 2+ ou superiores. Além disso, os métodos de inibição do presente invento resultarão numa menor pontuação quando comparados com uma composição semelhante, tratada com glutationa ácida na mesma concentração de inibidor do que no método preferido de inibição e na mesma concentração de composto de inativação de agentes patogénicos. Por exemplo, uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa neutralizada e 0,2 mM de PIC-1 resultará numa pontuação menor, de preferência numa pontuação de 1+ ou 0, do que uma composição de glóbulos vermelhos tratados com 10 mM de glutationa ácida e 0,2 mM de PIC-1.

Os métodos de inibição do invento também podem ser comparados aos métodos existentes, determinando o nível de modificação dos ácidos nucleicos numa amostra. Normalmente, uma composição de glóbulos vermelhos pode conter leucócitos, e o ácido nucleico dos leucócitos pode ser isolado. Um composto de inativação de agentes patogénicos possuindo um isótopo radioativo que, após a reação do composto com ácido nucleico, continuará ligado ao ácido nucleico. Isso pode ser usado para avaliar a quantidade de composto que reage com o ácido nucleico para uma variedade de métodos de inibição, e proporciona uma medida que pode ser diretamente correlacionada com a inativação de leucócitos esperada. O número de adutos formado por 1000 pares de bases de ácidos nucleicos pode ser usado como modelo para avaliar o impacto esperado dos vários métodos na inativação de agentes patogénicos. Em alternativa, pode adicionar-se uma quantidade adequada de um agente patogénico a uma composição de glóbulos vermelhos e após o tratamento pode isolar-se o ácido nucleico do agente patogénico. No entanto, neste caso a amostra precisa ser submetida a uma leucorredução, para que os níveis 53 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ de quaisquer leucócitos residuais nao interferiram com a medição do ácido nucleico do agente patogénico.

Além de proporcionar a inativação de agentes patogénicos adequada, reduzindo simultaneamente os níveis de reações secundárias indesejadas, os métodos de inibição do presente invento também proporcionam, pelo menos em algumas concretizações, uma redução na concentração de espécies eletrófilas reativas após a inativação do agente patogénico. Se as composições de glóbulos vermelhos se destinarem a infusão, é importante que o nível de espécies eletrófilas reativas seja tão baixo quanto possível, de preferência essencialmente já não detetável. A presença de espécies eletrófilas reativas pode ser determinada usando métodos disponíveis na arte, tais como os métodos cromatográficos, incluindo espectroscopia de massa de cromatografia líquida (LC-MS). Além disso, a atividade residual de uma amostra poderá ser avaliada através da avaliação da sua capacidade de reagir com um resíduo de guanina de um ácido nucleico, como por exemplo usando o ensaio de alquilador geral descrito por Matties (Matties, WR, Anal. Biochem. 1992. Oct; 206(1):161-7) . Neste ensaio, os RBC são extraídos após um tempo de incubação adequado com o composto de inativação de agentes patogénicos e o inibidor. Qualquer composto de inativação de agentes patogénicos residual, bem como o inibidor e outras pequenas espécies, são separados das proteínas. Estas espécies são depois incubadas com os DNA sintetizados com resíduos de 8-3H-guanina. O composto de inativação de agentes patogénicos residual reage com os DNA na posição N7 de guanina, que acidifica o resíduo 8-H e liberta 3H para a solução, onde pode ser isolado e quantificado. A quantidade de trítio libertado pode ser quantificada e tem uma correlação de 1:1 com a quantidade de alquilador residual presente nas amostras extraídas testadas. O nível de espécies eletrófilas conforme se determina por esses métodos pode ser avaliado usando os métodos melhorados do invento e comparando com os métodos conhecidos.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos descritos neste documento, o método compreende ainda o passo de redução da concentração de um composto na mistura, onde o composto é selecionado do grupo constituído pelo composto de inativação de agentes patogénicos ou um produto de degradação 54 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ do composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o método compreende o passo de redução da concentração do composto de inativação de agentes patogénicos na mistura. Em algumas concretizações, o método compreende o passo de redução da concentração das espécies eletrófilas na mistura. Em algumas concretizações, o método compreende o passo de redução da concentração do inibidor na mistura. A concentração do composto de inativação de agentes patogénicos e/ou do inibidor (e produtos relacionados) num material biológico, tal como num produto derivado do sangue, pode ser reduzida após o tratamento, por exemplo por adsorção num processo de remoção de fluxo ou descontínuo. Os métodos e dispositivos que podem ser utilizados são descritos nas patentes dos E.U.A. n.°s 6544727 e 6331387 e nas publicações de patentes dos E.U.A. n° 2002/0192632, 2005/0142542, 2004/0185544 e 2001/0009756. Nesse sentido, em algumas concretizações, a concentração do composto de inativação de agentes patogénicos é reduzida fazendo contactar a mistura com um meio de adsorção, compreendendo partículas de adsorvente, tendo uma afinidade pelo composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o sistema de adsorção seria configurado para remover o composto de inativação de agentes patogénicos num processo descontinuo. Em algumas concretizações, a concentração do composto de inativação de agentes patogénicos na mistura é reduzida pela lavagem de glóbulos vermelhos.

Os métodos do invento resultam em adequada inativação de possíveis agentes patogénicos contaminantes em composições de glóbulos vermelhos com inibição melhorada quando comparados a métodos conhecidos. O composto de inativação de agentes patogénicos é o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino] etílico de β-alanina e os seus sais e o inibidor é glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base. O inibidor pode ser adicionado à composição de glóbulos vermelhos antes, depois ou em simultâneo com o composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o inibidor é adicionado no intervalo de tempo de cerca de 30 minutos antes do composto de inativação de agentes patogénicos até cerca de 10 minutos após o composto de inativação de agentes patogénicos. Em algumas concretizações, o inibidor e o composto de inativação de agentes patogénicos podem ser adicionados essencialmente em simultâneo, mas 55 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ separadamente. Por exemplo, onde o composto de inativação de agentes patogénicos é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina e o inibidor é glutationa neutralizada, estes não podem ser facilmente formulados, juntos, em solução para adição à composição de glóbulos vermelhos. Por causa da elevada concentração de glutationa necessária para a adequada inibição, o composto de inativação de agentes patogénicos precipita quando estes se encontram na mesma solução em concentrações elevadas. Uma vez adicionados à composição de glóbulos vermelhos, eles são suficientemente diluídos e tamponados de modo a ambos ficarem completamente solúveis.

Numa concretização preferida do invento, mistura-se uma composição de glóbulos vermelhos com éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina e glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base. Numa outra concretização, mistura-se a glutationa neutralizada com a composição de glóbulos vermelhos e adiciona-se posteriormente o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, até cerca de 30 minutos após a glutationa, de preferência em cerca de 10 minutos. Numa outra concretização, mistura-se o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)-amino]etílico de β-alanina e a glutationa neutralizada com a composição de glóbulos vermelhos, essencialmente em simultâneo, ou com cerca de 1 minuto um do outro. Numa outra concretização, adiciona-se primeiro o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina à composição de glóbulos vermelhos, adicionando-se a glutationa neutralizada dentro de cerca de 30 minutos, também em cerca de 10 minutos, também em cerca de 5 minutos, também em cerca de 1 minutos. Em algumas concretizações, após a mistura de todos os três componentes, por exemplo, em cerca de 1 a 5 minutos de mistura, a glutationa encontra-se a uma concentração no intervalo de cerca de 5 mM a 30 mM, de preferência de cerca de 10 mM a 30 mM, de preferência de cerca de 20 mM e o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina encontra-se a uma concentração no intervalo de cerca de 0,05 mM a 0,5 mM, de preferência de cerca de 0,1 mM a 0,3 mM, de preferência de cerca de 0,2 mM e o pH da mistura situa-se no intervalo de cerca de 7,2 a 8,0. 56 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Neste documento são divulgadas composições de glóbulos vermelhos resultantes de cada um dos métodos de tratamento descritos neste documento.

Em algumas concretizações de cada um dos métodos e composições descritas neste documento, os glóbulos vermelhos na composição de glóbulos vermelhos são glóbulos vermelhos de mamíferos. Por exemplo, os glóbulos vermelhos podem ser de roedor (por exemplo, ratos ou ratinhos ou coelhos), macaco (por exemplo, o chimpanzé) ou glóbulos vermelhos humanos. Por exemplo, em algumas concretizações, os glóbulos vermelhos são humanos. Em algumas concretizações, os glóbulos vermelhos foram submetidos a leucorredução. Em algumas outras concretizações, os glóbulos vermelhos não foram submetidos a leucorredução. Em algumas concretizações, há a possibilidade de a composição composta por glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico. Em algumas concretizações, a composição de glóbulos vermelhos está contaminada com um agente patogénico.

Além dos métodos melhorados de inibição, o presente invento proporciona kits descartáveis para processar uma composição de glóbulos vermelhos, onde o processamento pode ser feito manualmente ou automaticamente. 0 presente invento proporciona kits compreendendo o composto de inativação de agentes patogénicos, inibidor e/ou base usados em cada um dos métodos descritos neste documento. 0 kit é composto por éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, incluindo guaisguer dos seus sais e glutationa neutralizada, incluindo quaisquer seus sais. 0 éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]-etílico de β-alanina pode estar na forma de sólido ou em solução. Da mesma forma, a glutationa neutralizada pode estar na forma sólida ou em solução. Estes sólidos ou soluções podem ainda incluir excipientes, adjuvantes, estabilizantes ou diluentes aceitáveis. Em algumas concretizações, o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino ]etílico de β-alanina é o sal cloridrato e a glutationa neutralizada é neutralizada com cerca de 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Em algumas concretizações, o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina e a glutationa neutralizada estão na forma de sólido e o kit é composto ainda por uma solução adequada para a dissolução de éster 57 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ Ν-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina e uma solução adequada para dissolver a glutationa neutralizada. Em algumas concretizações, o invento disponibiliza um kit composto por um composto de inativação de agentes patogénicos, um inibidor e uma solução para dissolver o inibidor, no qual a solução neutraliza o inibidor. Os métodos e kits discutidos neste documento englobam qualquer formulação farmacêutica adequada do composto de inativação de agentes patogénicos e do inibidor, que pode ser formulada sob a forma de uma mistura ou separadamente. As formulações farmaceuticamente aceitáveis são conhecidas pelos qualificados na arte e podem ser encontrados exemplos de excipientes, adjuvantes, diluentes ou estabilizantes apropriados, por exemplo, em Gennaro, ed., Remington's The Science and Practice of Pharmacy, 20a edição, Lippincott Williams & Wilkins. O invento também inclui as composições resultantes dos métodos descritos acima, compostas por glóbulos vermelhos, um composto de inativação de agentes patogénicos e inibidor conforme descrito acima, em que a composição se situa no intervalo de pH adequado para efetuar inibição melhorada do composto de inativação de agentes patogénicos.

Neste documento é divulgado um kit útil, por exemplo, para o tratamento de composições de glóbulos vermelhos para inativar os agentes patogénicos, compreendendo um composto de inativação de agentes patogénicos contendo um ligando de ligação de ácidos nucleicos e um grupo funcional que é, ou que constitui, um grupo eletrófilo (incluindo um qualquer seu sal) um inibidor compreendendo um grupo tiol (incluindo um qualquer seu sal) e pelo menos cerca de 1 equivalente de base, em que um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor no kit. Em algumas concretizações o kit é composto por cerca de 1 ou 2 equivalentes de uma base adequada.

Neste documento é divulgado um kit para o tratamento de composições de glóbulos vermelhos para inativar agentes patogénicos, compreendendo um ligante de ligação de ácidos nucleicos e um grupo funcional que é, ou que constitui, um grupo eletrófilo (por exemplo, PIC-1), incluindo um qualquer seu sal e um inibidor neutralizado, compreendendo um grupo 58 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ tiol (por exemplo, glutationa neutralizada) , incluindo um qualquer seu sal. 0 invento é ilustrado ainda pelos seguintes exemplos não-limitantes. Nestes exemplos, todas as bactérias e virus foram obtidos no American Type Cell Culture (ATCC), Rockville, MD, ou são isolados clínicos.

Exemplo 1

Comparação da inativação de Serratia marcescens, Staphylococcus epidermidis e Yersinia enterocol itica para condições padrão

Cultivaram-se as bactérias S. marcescens durante a noite pela adição de uma única colónia de uma placa mestra a 500 ml de meio de LB a 37°C. Diluiu-se a cultura da noite a 1:1000 em meio novo. Monitorizou-se o crescimento a 37°C pelo OD da suspensão a 600 nm. Utilizou-se a preparação quando a suspensão atingiu 0,5 OD. Utilizou-se sangue inteiro (Blood Source, Sacramento, CA) para preparar uma composição de glóbulos vermelhos (RBC) por centrifugação para proporcionar os RBC embalados (34 ml de cerca de 90% de hematócrito) e, em seguida, adicionando 17 ml de Eritrosol até um hematócrito de aproximadamente 60%. O Eritrosol é um aditivo de glóbulos vermelhos (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) que pode ser preparado pela combinação de citrato de sódio di-hidratado (7,82 g); Fosfato de sódio ácido di-hidratado (0,73 g) ; fosfato de sódio di-hidratado (3,03 g) ; adenina (0,22 g) ; manitol (7,74 g) ; e glicose (9 g) em 1 litro de água destilada. Depois, adicionou-se a preparação bacteriana (1/100 do volume total) aos RBC/Eritrosol para proporcionar RBC contaminado. Dividiu-se os RBC contaminados em várias amostras e tratou-se em conformidade com o quadro 2, onde PIC-1 é o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]-etílico de β-alanina. Dissolveu-se o PIC-1 e a glutationa (Aldrich, St. Louis, Mo) numa solução de mono-hidrato de dextrose a 8% a cerca de 15x a concentração desejada na composição final de glóbulos vermelhos quando adicionados juntos, ou 30x quando adicionados separadamente. Além disso, neutralizou-se a glutationa com os equivalentes indicados de hidróxido de sódio, preparado pela adição de uma quantidade adequada de NaOH 5N à glutationa. Para cada amostra 59 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ misturaram-se 4,67 ml de RBC com 330 μΐ de PIC-1/glutationa ou 165 μΐ de cada um de PIC-1 e glutationa, separadamente. Por exemplo, preparou-se um tratamento padrão de 2 mM de glutationa e 0,2 mM de PIC-1 dissolvendo 7,6 mg de PIC-1 e 46 mg de glutationa em 5 ml de dextrose a 8% e adicionando 330 μΐ deste a 4,67 ml de RBC. Preparou-se uma amostra em glutationa neutralizada a 20 mM e PIC-1 a 0,2 mM dissolvendo 7,6 mg de PIC-1 e 460 mg de glutationa em 4,4 ml de dextrose a 8% e misturando com 0,6 ml de NaOH 5N, adicionando, em seguida, 330 μΐ deste a 4,67 ml de RBC. Para adição separada usando glutationa neutralizada a 20 mM, prepara-se o PIC-1 dissolvendo 7,6 mg em 2,5 ml de dextrose a 8%, prepara-se a glutationa dissolvendo 460 mg em 1,9 ml de dextrose a 8% e mistura-se com 0,6 ml de NaOH 5N, adicionando, em seguida, 165 μΐ de cada solução a 4,67 ml de RBC na ordem apropriada. Corrigem-se os volumes dos vários componentes em conformidade para proporcionar as amostras adequadas indicadas nos quadros. Após o tratamento, incubaram-se as amostras durante 2 horas, e submeteu-se 100 μΐ de cada um a diluições em série e colocou-se em placas de LB. Submeteu-se as mesmas a incubação durante a noite a 37°C a fim de avaliar o crescimento bacteriano. Determinou-se a concentração bacteriana por contagem de colónias nas placas e determinou--se o titulo com base na diluição da placa. Por exemplo, com diluições em série de 10 vezes, 30 colónias contadas na 5a diluição da solução original, onde na placa estão colocados 0,1 ml, indicariam um titulo inicial de (30xl05) / 0,1 = 3χ107, ou 7,47 log. Utiliza-se uma amostra de controlo não tratado (ou seja, sem adição de PIC-1 ou glutationa) como linha de base para avaliar a redução de log no titulo após o tratamento. Os quadros 2A e 2B indicam o log de titulo e o log de redução para as várias amostras. Observe-se que para a maioria das amostras no quadro 2A o PIC-1 e a glutationa foram formulados juntos. Para as amostras de 4-6, onde a glutationa foi neutralizada com diferentes quantidades de hidróxido de sódio, o PIC-1 precipitou da solução, com um aumento da precipitação à medida que a quantidade de base adicionada aumentava. Como tal, estes resultados não fornecem uma boa indicação do nível de inativação uma vez que a concentração real de PIC-1 na solução não é conhecida. Repetiu-se o estudo com a adição sequencial dos dois componentes, conforme indicado no quadro 2B (o atraso de 60 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ tempo 0 indica que foram adicionados na mesma solução). Para comparação com a condição padrão no quadro 2A (amostras 1 e 10), apenas a amostra 7, onde os componentes foram adicionados separadamente, fornece uma comparação razoável. Neste caso, também apresentado no quadro 2B, a inibição com 20 mM de qlutationa neutralizada com 2 equivalentes de base resulta em menos log de redução em cerca de 1-1,5 log em comparação com a condição padrão (glutationa ácida de 2 mM e PIC-1 de 0,2 mM).

Efetuaram-se estudos adicionais usando S. epidermidis, onde se utilizou a cultura da noite sem diluição. Nestes estudos, adicionou-se o PIC-1 e a glutationa na sequência indicada no quadro 3, com os resultados apresentados no quadro. A inativação de S. epidermidis não é significativamente reduzida quando se utiliza como inibidor 20 mM de glutationa neutralizada. O PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras.

Efetuou-se um estudo semelhante usando Y. enterocolitica, onde para além da glutationa neutralizada se utilizou como inibidor, cisteina neutralizada, onde se neutralizou a cisteina (Aldrich) com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Neste estudo, compara-se 2 mM de glutationa ácida com 20 mM de glutationa neutralizada, ou a cisteina 20 mM neutralizada, com 0,2 mM de PIC-1 em todas as amostras. Os resultados estão indicados no quadro 4. Os resultados indicam que a cisteina devidamente neutralizada é tão eficaz como a glutationa neutralizada, com uma redução de inativação de cerca de 2,5 log em relação à condição padrão. 61 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 2Α

Inativação de Serratia marcescens em RBC sob várias condições de inibição.

Glutationa Log S. marcescens Amostra mM de PIC-1 mM Equivalentes de base adicionados Titulo Redução Controlo 0 0 0 7,0 NA 1 0,2 2 0 2,9 4,14 2 0,2 2 0,9 2,8 4,27 3 0,2 20 0 4,6 2,40 4 0,2 20 0,9 4,8 2,26 5 0,2 20 1,5 5,4 1,66 6 0,2 20 2 6,3 0,76 7 (sequencial)1 0,2 20 2 4,0 3,02 8 0 20 0 7,0 0,02 9 0 20 2 7,4 0,31 10 0,2 2 0 2,5 4,50 1

Para esta amostra adicionou-se primeiro PIC-1, sendo a glutationa adicionada pouco tempo depois. Para todas as outras amostras, formulou-se o PIC-1 junto com a glutationa e adicionou-se ao RBC. 62 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 2Β

Inativação de Serratia marcescens em RBC incluindo a adição sequencial de PIC-1 e glutationa. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras).

Glutationa Atraso no tempo (minutos) Log S. marcescens Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Título Redução Controlo NA 0 0 0 6, 76 NA 1 PIC-1/ glutationa 20 2 1 3,40 3,36 2 PIC-1/ glutationa 20 2 5 2,87 3,89 3 PIC-1/ glutationa 20 2 10 1, 80 4,96 4 PIC-1/ glutationa 20 2 20 0,00 6,76 5 Glutationa/ PIC-1 20 2 1 3,10 3,66 6 Glutationa/ PIC-1 20 2 10 3,08 3,68 7 Simultânea 2 0 0 1,51 5,25 8 Simultânea 20 0 0 6,05 0,71 63 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 3

Inativação de Staphylococcus epidermidis em RBC incluindo a adição sequencial de PIC-1 e glutationa. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Glutationa Atraso no tempo (minutos) Log S. epidermidis Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Título Redução Controlo NA 0 0 0 6,62 NA 1 PIC-1/ glutationa 20 2 1 1 O O co 6,70 2 PIC-1/ glutationa 20 2 5 1 o o co 6,70 3 PIC-1/ glutationa 20 2 10 1 o o co 6,70 4 PIC-1/ glutationa 20 2 20 co o o 1 6,70 5 Glutationa/ PIC-1 20 2 1 0,52 6,10 6 Glutationa/ PIC-1 20 2 10 0,70 5,92 7 Simultânea 2 0 0 1 o o co 6,70 8 Simultânea 20 0 0 6,40 0,22 64 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 4

Inativação de Yersinia enterocolitica em RBC incluindo a adição sequencial de PIC-1 e glutationa. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Log Y. enterocolitica Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Titulo Redução Controlo NA 0 0 0 8,49 NA 1 NA 2 0 0 0,00 8, 49 2 Glutationa/ PIC-1 20 2 10 2,54 5, 95 3 Cisteina/ PIC-1 20 1 10 4, 45 4, 04 4 Cisteina/ PIC-1 20 2 10 2,70 5, 79

Realizaram-se estudos adicionais usando cisteina como inibidor. Prepararam-se as amostras e analisaram-se conforme se descreveu anteriormente, com cisteina (Cys) neutralizada com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Para estas amostras, elaborou-se a reserva de NaOH a 10 N e utilizaram--se volumes adequados dos vários componentes seguindo os procedimentos acima. Executaram-se as condições padrão e/ou 20 mM de glutationa neutralizada (GSH) para comparação. No estudo apresentado no quadro 5A utilizou-se também uma combinação de cisteina e glutationa. Os resultados são apresentados nos quadros 5A, 5B e 5C mostrando pelo menos cerca de 3 log de inativação em todas as condições. Geralmente, a cisteina e a glutationa resultam numa redução semelhante na inativação de agentes patogénicos em relação à condição padrão, onde a inativação se encontra em cerca de 1-1,5 log da condição padrão. A combinação dos dois é de interesse por a cisteina ser capaz de entrar nas células, ao passo que a glutationa não entra nas células em nenhuma quantidade substancial. Isso mostra que em condições adequadas de inibição dentro e fora das células, se observam resultados semelhantes de inativação 65 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 5Α

Inativação de Serratia marcescens em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína ou uma combinação das duas. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Log S. marcescens Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Titulo Redução RBC Não tratado NA NA NA 7,5 NA 1 PIC-l/GSH 20 2 1 4,8 2,7 2 GSH/PIC-1 20 2 10 4, 1 3,4 3 Cys/ PIC-1 20 2 10 4, 4 3,1 5 Cys, GSH/ PIC-1 10, 10 2, 2 10 4,5 3, 0 6 Cys, GSH/ PIC-1 15, 5 2, 2 10 3,8 3,7

Quadro 5B

Inativação de Serratia marcescens em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Log 5. marcescens Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Título Redução RBC Não tratado NA NA NA 7,6 NA 1 PIC-1 + GSH 2 0 0 3,5 4,1 2 GSH/ PIC-1 20 2 10 4,4 3,2 3 Cys/ PIC-1 2, 5 2 10 3,9 3,7 4 Cys/ PIC-1 5 2 5 4,4 3,2 5 Cys/ PIC-1 5 2 10 4,4 3,2 6 Cys/ PIC-1 5 2 20 4,7 2,9 7 Cys/ PIC-1 10 2 10 4,9 2,7 8 Cys/ PIC-1 15 2 10 4,5 3,1 9 Cys/ PIC-1 20 2 5 4, 4 3,2 10 Cys/ PIC-1 20 2 10 4,6 3,0 11 Apenas Cys 20 2 NA 7,3 0,3 66 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 5C

Inativação de Staphylococcus epidermidis em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Log S. epidermidis Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Titulo Redução RBC Não tratado NA NA NA 7,2 NA 1 PIC-1 + GSH 2 0 0 0 7,2 2 GSH/ PIC-1 20 2 10 0 7,2 4 Cys/ PIC-1 2, 5 1 10 0 7,2 5 Cys/ PIC-1 5 1 10 0 7,2 6 Cys/ PIC-1 10 1 10 2,3 4,9 3 Cys/ PIC-1 20 1 10 3,2 4,0 7 Cisteina apenas 20 1 NA 7,1 0,1

Exemplo 2

Comparação da inativação do vírus da estomatite vesicular (VSV) com as condições padrão

Utiliza-se uma reserva de 100x de VSV (titulo de aproximadamente 1,78χ108) para contaminar uma composição de glóbulos vermelhos preparada como para o exemplo 1. Trataram--se os RBC contaminados conforme é indicado nos Quadros 5A-B, incubando durante 2 horas. Adicionaram-se os componentes como se mostrou para as experiências semelhantes descritas acima. Tratou-se um volume de 5 ml de RBC contaminados para cada amostra. Congelaram-se os RBC em N2 liquido após o fim da incubação e analisaram-se num momento posterior. Determinou--se o título de VSV que ficou pelo ensaio de placa em células de macaco verde africano Vero 76, cultivadas em EMEM suplementado com soro de bezerro fetal a 10% e outros elementos essenciais. Calculou-se o título por determinação do número de placas obtidas mediante a aplicação de amostras diluídas nas preparações confluentes de células conforme publicado anteriormente (Hsiung GD and Melnick JL, Journal of Immunology 78, 128-136, 1957). Os resultados são apresentados 67 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ no quadro 6Α, indicando que os métodos de inibição proporcionam todos a inativação essencialmente completa de um titulo elevado de VSV. Efetuou-se um estudo adicional usando cisteina como inibidor, com ou sem neutralização com 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Os resultados estão apresentados no quadro 6B, com condição padrão e glutationa neutralizada 20mM para comparação. A cisteina a 20 mM, ácida ou neutralizada, reduz o nível de inativação em cerca de 2-3 log, com a amostra neutralizada a demonstrar o nível mais baixo de inativação. A amostra de glutationa a 20 mM também reduziu o nível de inativação, em cerca de 2 log. Todos os resultados indicam que inativação extracelular do vírus VSV não é muito sensível a condições de inibição.

Quadro 6A

Inativação de VSV em RBC incluindo a adição sequencial de PIC-1 e glutationa. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras)

Glutationa Atraso no tempo (minutos) Log VSV Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Titulo Redução RBC Não tratado 0 0 NA 7, 58 NA 1 PIC-1 + Glutationa 2 0 0 <-0,11 >6,32 2 PIC-1 + Glutationa 20 2 0 5, 68 0,54* 3 PIC-1 + Glutationa 20 0 0 <-0,11 >6,32 4 PIC-1/ Glutationa 20 0 1 <-0,11 >6,32 5 PIC-1/ Glutationa 20 2 1 -0, 11 6,32 6 PIC-1/ Glutationa 20 2 5 <-0,11 >6,32 7 PIC-1/ Glutationa 20 2 10 <-0,11 >6,32 8 Glutationa/ PIC-1 20 2 10 <-0,11 >6,32 9 Glutationa/ PIC-1 20 0 10 <-0,11 >6,32 68 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Glutationa Atraso no tempo (minutos) Log VSV Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Título Redução 10 Apenas Glutationa 20 2 NA 6,25 o o 1 11 Controlo não tratado 0 0 NA 6,22 NA *Α co-adição com glutationa neutralizada precipitou o PIC-1 da solução.

Quadro 6B

Inativação de VSV em RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteína. (o PIC-1 está a 0,2 mM em todas as amostras

Glutationa Atraso no tempo (minutos) Log VSV Amostra Sequência de adição mM Equivalentes de base Título Redução RBC Não tratado 0 0 NA 6,56 NA 1 PIC-1 + Glutationa 2 0 0 -0,3 >6,86 2 Glutationa/ PIC-1 20 2 10 1, 41 4,99 3 Cisteína/ PIC-1 2 2 10 <-0,3 >6,86 4 Cisteína/ PIC-1 2 0 10 <-0,3 >6,86 5 Cisteína/ PIC-1 5 2 5 0,7 5, 86 6 Cisteína/ PIC-1 5 0 5 <-0,3 >6,86 7 Cisteína/ PIC-1 5 2 10 <-0,3 >6,86 8 Cisteína/ PIC-1 5 0 10 <-0,3 >6,86 9 Cisteína/ PIC-1 20 2 10 2, 75 3,8 10 Cisteína/ PIC-1 20 0 10 1,95 4,61 69 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Exemplo 3

Determinação da frequência de aducto de PIC-1 no ADN genómico de leucócitos humanos após o tratamento de RBC com PIC-1 e glutationa ou cisteina.

Utilizou-se sangue inteiro que não sofreu leucorredução para preparar RBC em Eritrosol conforme se descreveu no Exemplo 1. Trataram-se quantidades aliquotas de 20 ml, cada uma com 0,2 mM de PIC-1, 0,2 mM de PIC-1 e 2 mM de glutationa ácida, 20 mM glutationa neutralizada (2 equivalentes de base), com adição de PIC-1 até 0,2 mM, 10 minutos mais tarde, ou com 20mM de cada de glutationa neutralizada (2 equivalentes de NaOH) e cisteina neutralizada (1 equivalente de NaOH), com adição de PIC-1 até 0,2 mM, 10 minutos depois. 0 PIC-1 usado incluiu PIC-1 radiomarcado, onde o grupo reativo incluiu um rótulo de 14C (ViTrax, Inc., Placentia, CA) . A atividade especifica do PIC-1 usado foi 1,08 pCi/pmole. Incubaram-se todas as amostras à temperatura ambiente durante 20 horas. Após a incubação, diluiu-se 20 ml de RBC com um volume de 20 ml de PBS e adicionou-se 20 ml da mistura a cada um dos dois tubos contendo 10 ml de Ficoll. Centrifugou-se então a suspensão a 400x g durante 30 minutos. Separou-se a porção de glóbulos brancos e repetiu-se o passo de centrifugação após a adição de mais 20 ml de PBS. Combinaram-se os sedimentos obtidos e voltou a fazer-se uma suspensão dos sedimentos combinados em 5 ml de tampão de lise (100 mM de NaCl, 10 mM de Tris-HCl, 25 mM de EDTA, 5% de SDS, 0,1 mg/ml de Proteinase K, Sigma, St. Louis, Mo) e incubou-se a 50 °C durante pelo menos duas horas. Efetuou-se então a extração da solução resultante com 5 ml de fenol: clorofórmio: álcool isoamilico na proporção 24:25:1, seguidos por 5 ml de clorofórmio e, depois, 5 ml de éter. Isolou-se o ADN genómico na camada aquosa e precipitou-se pela adição de 0,5 ml de NaOAc 3 M, 10 ml de etanol a 100%, seguidos de incubação da mistura final num banho de gelo seco/etanol. Isolou-se o ADN por centrifugação a 6000x g durante 10'. Removeu-se o sobrenadante, e secou-se a pelota ao ar e efetuou-se de novo uma suspensão em 1 ml de tampão TE (Tris HC1 100 mM, EDTA 1 mM, pH = 7,4) . Determinou-se a quantidade de ADN isolado por absorção de UV a 260 nm e a quantidade de adutos de PIC-1 por contagem de cintilação liquida (Perkin Elmer-Wallac, contador de cintilação liquida Winspectral 70 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 1414, Shelton, CT) da solução de ADN, usando a atividade especifica do PIC-1 para avaliar a razão molar de PIC-1 para pares de bases do ADN. 0 número de adutos por 1000 bp (kbp) são apresentados no quadro 7 abaixo, indicando que a modificação de ácido nucleico dos leucócitos é comparável nas amostras inibidas com glutationa neutralizada a 20 mM quando comparada com a condição padrão ou amostra não inibida. No quadro, bem como noutros locais neste documento, a glutationa é indicada por "GSH" e a cisteína por "Cys". Utilizou-se a determinação da frequência de aduto como uma medida substituta da inativação de leucócitos. Sabe-se que, nas condições de inativação de agentes patogénicos padrão, os leucócitos são inativados até ao nivel da deteção de um ensaio de diluição limitante, o que corresponde a 5,3 log de inativação. O mecanismo de inativação dá-se através da formação de adutos, nos ácidos nucleicos genómicos. Portanto, os resultados indicam que os métodos aperfeiçoados de inibição não têm um impacto significativo na inativação dos leucócitos. Podiam-se efetuar estudos semelhantes com um agente patogénico apropriado usando glóbulos vermelhos submetidos a leucorredução a fim de avaliar a ligação aos ácidos nucleicos de agentes patogénicos em diversas condições. 71 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 7

Frequência de aductos de PIC-1 em ADN genómico após várias condições de tratamento.

Amostra Inibidor CPM ADN recuperado (ug) Aductos por kbp Frequência de aductos* 1 Nenhum 39321 487 28 36 2 Nenhum 46293 547, 5 28 35 3 GSH ácido 2 mM 46181 502 34 29 4 GSH ácido 2 mM 47204 692,5 23 44 5 GSH neut.** 2 0 mM 89836 872 37 27 6 GSH neut. 20 mM 60829 527, 5 36 28 7 GSH neut. e Cys 20 mM cada 83392 952,5 30 33 * Número médio de pares de base entre aductos ** Neutralizado com 2 equivalentes

Exemplo 4

Efeito da correção de pH de RBC na inibição, avaliado por ligação do anticorpo anti-acridina a glóbulos vermelhos. É possível corrigir o pH da composição de RBC antes da adição de glutationa, conforme está demonstrado neste exemplo por lavagem de RBC usando várias soluções de diferentes pH. Centrifugou-se a 4100x g, durante 5 minutos, à temperatura ambiente, uma amostra de 20 ml de sangue inteiro submetido a leucorredução (Blood Source, Sacramento, CA) em cada um dos quatro tubos de 50 ml da centrifugadora. Removeu-se o sobrenadante de cada tubo para proporcionar um concentrado de glóbulos vermelhos (RCC). Para a amostra 1, adicionou-se 5 ml de Eritrosol (pH 7,3) a 10 ml do RCC. Para as amostras 2-4, lavou-se o RCC três vezes com 10 ml da solução indicada, centrifugando-o como anteriormente e removendo o sobrenadante após cada lavagem. Para cada RCC lavado, voltou a efetuar-se uma suspensão das células em 5 ml da solução usada para 72 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ lavagem. Esta é agora referida como a amostra de RBC de teste. As soluções utilizadas nas amostras 2-4 foram Eritrosol (pH 7,3), PBS pH 8 (fosfato 50 mM, NaCl 100 mM, pH 8,0) e CHES pH 9 (CHES 50 mM (Aldrich), NaCl 100 mM, pH 9,0), respetivamente. Para cada amostra de RBC, misturou-se 1,5 ml com 100 μΐ de PIC-1 mais a glutationa ( 2mM ácida ou 20 mM neutralizada com 0,9, 1,5 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio) para produzir as concentrações finais de 0,2 mM de PIC-1 e 2 mM ou 20 mM de glutationa. Incubaram-se essas amostras, durante 20 horas, à temperatura ambiente. Após a incubação, lavou-se o RBC em BBS (Blood Bank Saline, 0,9% de salino, não tamponado, Fisher Scientific) e diluiu-se até um hematócrito final de 4%. Misturou-se uma quantidade alíquota de 25 μΐ de cada um com 15 μΐ de soro anti-acridina policlonal de coelho diluido a 1:100 em BBS e incubou-se a mistura a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente lavaram-se as células com 1,5 ml de BBS. Após finalizada a lavagem, misturaram-se as células com 50 μΐ de fragmento Fab'2 anti-coelho de cabra rotulado com FITC (diluição 1:64 em BBS) e incubaram-se a 37°C durante 30 minutos. Após incubação, lavaram-se novamente as células 3x 1,5 ml de BBS. Analisaram--se então os glóbulos vermelhos por FACScan, e no quadro 8a apresenta-se a fluorescência média observada para cada amostra. Este valor correlaciona-se com a ligação de PIC-1 -acridina à superfície de glóbulos vermelhos, de modo que um valor inferior indica a inibição melhorada da reação secundária de PIC-1 com RBC. A ligação de PIC-1 a RBC foi significativamente reduzida apenas pela lavagem das células em tampão de pH mais elevado, com a glutationa neutralizada a proporcionar inibição ainda melhor. Note-se que a inibição melhora à medida que a glutationa é neutralizada com quantidades crescentes de hidróxido de sódio. Este exemplo demonstra a importância da correção do pH da composição de glóbulos vermelhos para proporcionar inibição melhorada. A lavagem com CHES pH 9, em combinação com glutationa neutralizada com 1,5 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio, reduz a ligação do PIC-1 para níveis quase de fundo. 73 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro δ

Tratamento de RBC com PIC-1 a 0,2 mM em várias condições de inibição, análise por FACScan de ligação do anticorpo anti- -acridina.

Amostra Prep. de RBC Intensidade de fluorescência média Controlo não tratado GSH 2 mM 20 mM GSH + NaOH 0,9 eq. 1,5 eq. 2 eq. 1 Eritrosol (pH 7,3) sem lavagem 1,67 108 17, 0 8,1 6,0 2 Eritrosol (pH 7,3) lavagem 3 x 1,69 199 26,7 4,9 3,4 3 PBS pH 8 lavagem 3x 1, 70 25 7,2 5, 1 5,1 4 CHES pH 9 lavagem 3x 1,62 12, 1 3,9 1,9 1,9

Exemplo 5

Comparação de várias condições de inibição no que diz respeito à ligação do anticorpo anti-acridina a glóbulos vermelhos.

Utilizou-se a análise por FACScan da ligação do soro anti-acridina de coelho para tratar glóbulos vermelhos para avaliar uma variedade de condições de inibição. Prepararam-se as amostras de RBC conforme descrito no Exemplo 1, e prepararam-se os inibidores conforme descrito nos exemplos anteriores. A sequência de adição dos componentes e as concentrações finais dos compostos mediante mistura com o RBC estão indicadas nos quadros 9A e 9B. Os quadros representam dados de duas experiências diferentes, cada uma com amostras tratadas em condições padrão ou com glutationa neutralizada 20 mM. Em todas as amostras o PIC-1 é 0,2 mM. Os dados numa experiência fornecem a eficácia relativa dos vários tratamentos. Porque o ensaio pode depender do lote de glóbulos vermelhos utilizado, os valores absolutos de fluorescência média podem variar de um estudo para o próximo, pelo que os valores relativos apenas devem ser comparados 74 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ dentro de uma determinada experiência. Por exemplo, note-se que a condição padrão resulta numa fluorescência média de 114 no quadro 9A e de 151-182 no quadro 9B. A cisteina neutralizada inibe eficazmente até essencialmente ao sinal de fundo (ou seja, essencialmente nenhuma ligação) a 15 ou 20 mM. A glutationa neutralizada a 20 mM resulta em níveis próximos dos de fundo. Do quadro 9B, os resultados de cisteina indicam que, enquanto o aumento da concentração de inibidor proporciona melhor inibição da reação com RBC, à medida que aumenta a concentração de cisteina, a neutralização da cisteina proporciona a inibição ideal da reação secundária indesejada. Saliente-se que com cisteina a 2,5 mM, há pouca diferença entre cisteina neutralizada e ácida, enquanto a 5 mM ou superior, 1 equivalente de NaOH reduz ainda o sinal em comparação com a amostra de cisteina ácida na mesma concentração.

Quadro 9A

Ligação do anticorpo anti-acridina relativa a RBC tratados medida como fluorescência média por FACScan. (em todas as amostras o PIC-1 está a 0,2 mM)

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Fluorescência média Amostra Sequência de adição mM Equivalentes NaOH 1 PIC-1 + GSH 2 0 0 114 2 GSH/ PIC-1 20 2 10 2,6 3 Controlo Cys apenas 20 2 NA 1,9 4 Cys/ PIC-1 2,5 2 10 37 5 Cys/ PIC-1 5 2 5 8 6 Cys/ PIC-1 5 2 10 10,8 7 Cys/ PIC-1 5 2 20 8 8 Cys/ PIC-1 10 2 10 2,9 9 Cys/ PIC-1 15 2 10 1,9 10 Cys/ PIC-1 20 2 5 1,9 11 Cys/ PIC-1 20 2 10 1,9 12 Cys/ PIC-1 20 2 20 2 75 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 9Β

Inibidor Atraso no tempo (minutos) Fluorescência média Amostra Sequência de adição mM Equivalentes NaOH la PIC-1 + GSH 2 0 0 151 lb PIC-1 + GSH 2 0 0 182 lc PIC-1 + GSH 2 0 0 160 2a GSH/ PIC-1 20 2 10 6.06 2b GSH/ PIC-1 20 2 10 5,62 2c GSH/ PIC-1 20 2 10 5, 6 3 Controlo Cys apenas 20 2 NA 1,99 4 Cys/ PIC-1 2,5 0 10 44 5 Cys/ PIC-1 2,5 1 10 49,5 6 Cys/ PIC-1 2,5 2 10 49 7 Cys/ PIC-1 5 0 10 49 8 Cys/ PIC-1 5 1 10 19,28 9 Cys/ PIC-1 5 2 10 14,1 10 Cys/ PIC-1 10 0 10 11,6 11 Cys/ PIC-1 10 1 10 5,1 12 Cys/ PIC-1 10 2 10 3,6 13 Cys/ PIC-1 20 0 10 4,3 14 Cys/ PIC-1 20 1 10 2,5 15 Cys/ PIC-1 20 2 10 ND

Exemplo 6

Avaliação do pH de uma composição de glóbulos vermelhos mediante a adição de PIC-1 e vários inibidores.

Determinou-se o efeito de várias condições de inibição sobre o pH de uma composição de glóbulos vermelhos para várias condições de tratamento. Prepararam-se soluções de inibidor a uma concentração de 600 mM em mono-hidrato de dextrose a 8%. Para a cisteina, misturou-se uma porção da 76 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ solução com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Avaliou-se a glutationa a 2 mM (ácida) ou 20 mM (2 equivalentes de base). Avaliaram-se também a N-acetil-cisteina, a metionina e o dimero peptídico cisteina-glicina (CysGly), onde se neutralizou a N-acetilcisteina com 1 equivalente de hidróxido de sódio, se neutralizou a metionina com 1 ou 2 equivalentes de hidróxido de sódio e se neutralizou o CysGly com 2 equivalentes de hidróxido de sódio. Mediu-se o pH da solução de inibidor, sem modificações ou neutralizado, usando um elétrodo de calomelanos epóxi padrão (Beckman Instruments) à temperatura ambiente. Preparou-se uma solução de PIC-1 a 6 mM em mono-hidrato de dextrose a 8%. Preparou-se uma composição de glóbulos vermelhos como no exemplo 1. Para cada amostra, adicionou-se sequencialmente 167 μΐ de inibidor e 167 μΐ de PIC-1 a 4,67 ml de RBC, incubando à temperatura ambiente durante 10 minutos após a adição do inibidor e a seguir adicionando PIC-1. Misturaram-se as amostras e mediu-se o pH à temperatura ambiente usando o mesmo elétrodo descrito acima. Os resultados de vários estudos estão apresentados no quadro 10 .

Quadro 10

Medição de pH usando várias condições de inibidor com PIC-1 0,2 mM em RBC.

Amostra Condições de inibidor pH do inibidor de reserva pH da mistura final 1 RBC sem tratamento Controlo* NA 6,96 2 Glutationa ácida* 2 mM 2,82 6,9 3 Glutationa 20 mM + 2 eq. de base* 9,5 7,7 4 Cisterna 20 mM 5 6,5 5 Cisterna 20 mM + 1 eq. de base 9,9 7,4 6 Cisterna 20 mM + 2 eq. de base 11,5 7,8 7 N-acetilcys 20 mM + 1 eq. de base 6 6,7 8 CysGly 20 mM + 2 eq. de base 8,5 ND 77 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Amostra Condições de inibidor pH do inibidor de reserva pH da mistura final 9 Metionina 20 mM + 2 eq. de base 13, 1 8 10 Metionina 20 mM + 1 eq. de base 11,2 7,5

Exemplo 7 A inibição como função da concentração e neutralização de glutationa; avaliação da ligação do anticorpo anti-acridina e inativação de S. epidermidis.

Nestes, adicionou-se a quantidade adequada de reserva 600 mM, misturou-se com um volume adequado de dextrose a 8% para proporcionar a adição do mesmo volume a cada amostra de RBC onde, num estudo, com concentrações variadas de glutationa, se mediu o pH após a adição de glutationa e após a adição de PIC-1. Note-se que a adição de PIC-1 reduz o pH de algumas das soluções com valores mais altos de pH após a adição do inibidor, mas o pH final está ainda num intervalo preferido para inibição melhorada e está bem acima dos valores de pH da mesma concentração de glutationa sem nenhuma neutralização. Avaliaram-se as amostras preparadas de forma idêntica ao exemplo 6 com diferentes concentrações de glutationa (quadro 11A) quanto à ligação ao soro de coelho anti-acridina, por placa de gel ou por análise de FACScan. Avaliaram-se também amostras semelhantes quanto à inativação de S. epidermidis. Tratou-se cada amostra de RBC com glutationa, seguida por PIC-1, 10 minutos mais tarde, depois incubou-se à temperatura ambiente durante 20 horas seguindo--se a mistura do PIC-1. Para a análise por placa de gel, após a incubação, lavou-se a RBC em BBS e diluíu-se em BBS até um hematócrito final de 4%. Misturou-se uma quantidade alíquota de 25 μΐ de cada um com 15 μΐ de soro anti-acridina policlonal de coelho, diluído 1:4 ou 1:100, em BBS e incubou--se a mistura a 37°C durante 30 minutos. Posteriormente lavaram-se as células com 1,5 ml de BBS. Após terminada a lavagem, misturaram-se as células com o fragmento Fab'2 anti-coelho de cabra anti-cadeias H + L (diluição 1:4 em PBS) e incubou-se a 37°C durante 30 minutos. Após a incubação, lavaram-se as células novamente com 3x 1,5 ml de BBS e 78 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ efetuou-se a carga numa placa de gel e centrifugaram-se as placas durante 10 minutos a 900x g, conforme as configurações do fabricante numa MTS Centrifuge™ (Ortho System, Pompano Beach, Fl). Atribui-se uma pontuação às placas numa escala de 0, 1 +, 2 + , 3 + , 4 + , que gradua a quantidade relativa de aglutinação, onde 0 indica que não há qualquer aglutinação, todas as células passam através do gel e 4+ indica aglutinação completa, todas as células na parte superior do gel. Estes resultados indicam que conforme aumenta a concentração de glutationa, é necessário corrigir o pH da composição de RBC, como por exemplo usando glutationa neutralizada. Mesmo a 5 mM, a glutationa neutralizada com 2 equivalentes de base proporciona melhor inibição do que 5 mM com 1 ou 0 equivalentes de base. A glutationa neutralizada mostra redução na ligação do anticorpo à medida que a concentração aumenta, ao passo que a glutationa ácida mostra pouca, se alguma, melhoria a concentrações superiores, quando comparada com a condição padrão de 2 mM. A sensibilidade deste teste é tal que, neste estudo, é necessário uma diluição de 1:100 dos soros de coelho para ver as diferenças nos métodos de inibição, como a diluição de 1:4 mostra aglutinação completa em todas as amostras (controlo não tratado, não mostra nenhuma aglutinação). Como tal, apenas as amostras diluídas 1:100 são apresentadas no quadro 11B. Os resultados entre os estudos variam dependendo da amostra de sangue utilizada. Por exemplo, embora neste estudo, o soro de coelho anti-acridina diluído 1:4 resultasse em pontuações 4+ para todas as amostras, realizou-se um outro estudo com 10, 15 e 20 mM de glutationa neutralizada (2 eq. de base) onde se observou diferenças nas amostras diluídas 1:4 enquanto as amostras diluídas 1:100 mostraram todas uma pontuação de 0. Estas amostras testadas na diluição 1:4 do sero de coelho mostraram pontuações de 4 + , 4 + , 3+ e 1+ para a condição padrão, glutationa neutralizada (2 eq. ou base), respetivamente 10 mM, 15 mM e 20 mM. Utilizou-se também uma combinação de glutationa neutralizada (2 eq. de base) e cisteína neutralizada (1 eq. de base), onde a concentração de inibidor total foi de 20 mM, e todas essas amostras resultaram em pontuações de 1+ ou 0 (ou seja, eram pelo menos tão eficazes como a glutationa neutralizada 20 mM). 79 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 11Α

Medição de pH usando várias condições de inibidor com PIC-1 0,2 mM em RBC.

Amostra Condições de inibidor pH do inibidor de reserva pH da mistura Após inibidor Final 1 RBC sem tratamento Controlo* NA ND OO KD 2 Glutationa ácida 20 mM 6,1 6,1 3 Glutationa ácida 10 mM 3,0 6,4 6,4 4 Glutationa ácida 5 mM 6,6 6,6 5 Glutationa ácida* 2 mM 6,7 6,7 6 Glutationa 20 mM + 1 eq. de base 6,7 6,7 7 Glutationa 10 mM + 1 eq. de base 6,1 6,7 6,7 8 Glutationa 5 mM + 1 eq. de base 6,7 6,7 9 Glutationa 2 mM + 1 eq. de base co co 10 Glutationa 20 mM + 2 eq. de base* 7, 4 7,2 11 Glutationa 10 mM + 2 eq. de base 9,2 7,2 7,0 12 Glutationa 5 mM + 2 eq. de base 6,9 6,9 13 Glutationa 2 mM + 2 eq. de base 00 KD OO KD 80 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 11Β

Ligação do anticorpo anti-acridina em RBC tratados com várias concentrações de glutationa e PIC-1 0,2 mM. Pontuação da placa de gel para a diluição 1:100 de soro anti-acridina de coelho e diluição 1:4 de IgG secundário anti-coelho.

Pontuação com placa de gel Amostra Sem adição de base 1 eq. de base 2 eq. de base GSH 2 mM 3 + 4 + 3 + GSH 5 mM 3+ / MX* 3 + 2 + GSH 10 mM 3+ / MX* 2 + 1 + GSH 20 mM 3 + 1 + 0 * MX = campo misto

Preparou-se um outro conjunto de amostras como as apresentadas no quadro 11a, como anteriormente, usando uma unidade diferente de RBC e avaliou-se por análise de FACScan. Após 20 horas de incubação, trataram-se estas amostras como para o exemplo 4 e analisaram-se por FACScan. Avaliou-se também uma amostra de controlo não tratado, bem como uma amostra-padrão (co-adição de glutationa ácida 2mM e PIC-10, 2 mM). Os resultados estão apresentados no quadro 11C.

Quadro 11C

Ligação do anticorpo anti-acridina (policlonal de coelho; diluição 1:100) de RBC tratados com várias concentrações de glutationa e PIC-1 0,2 mM. Avaliado por análise de FACScan usando Fab'2 anti-coelho marcado com FITC (diluição 1:64).

Fluorescência Média Amostra Sem adição de base 1 eq. de base 2 eq. de base Controlo não tratado 4,62 NA NA Co-adição padrão 144,33 NA NA GSH 2 mM 179,17 208,05 160,37 81 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Fluorescência Média Amostra Sem adição de base 1 eq. de base 2 eq. de base GSH 5 mM 95,57 87,6 67, 56 GSH 10 mM 88,21 47, 18 27, 45 GSH 20 mM 187,74 29,97 13, 37

Preparou-se como anteriormente um outro conjunto de amostras como as apresentadas no quadro 11A usando a mesma unidade de RBC e polvilharam-se com S. epidermidis e avaliaram-se quanto ao titulo como para o Exemplo 1. Os resultados são apresentados no quadro 11D. Os resultados combinados de ligação do anticorpo e de inativação de S. epidermidis demonstram a inibição melhorada usando glutationa neutralizada a concentrações mais elevadas.

Quadro 11D

Inativação de S. epidermidis em RBC tratados com várias concentrações de glutationa e PIC-1 0,2 mM

Variação no log titulo (titulo de RBC inicial = 6,5) Amostra Sem adição de base 1 eq. de base 2 eq. de base Controlo não tratado 0 NA NA GSH 2 mM 6,5 6,5 6, 5 GSH 5 mM 6,5 6,5 6, 5 GSH 10 mM 2,9 6,5 6, 5 GSH 20 mM 2,5 6,5 6, 5

Exemplo 8

Avaliação da ligação do anticorpo anti-acridina por análise de placa de gel em amostras inibidas com vários inibidores.

Efetuaram-se estudos semelhantes usando o ensaio de placa de gel com outras condições de inibição, tais como com 82 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ cisteína, dipeptídeo cisteína-glicina ou uma combinação de cisteína e glutationa. Testaram-se também as amostras com a diluição 1:100 ou 1:4 dos soros de coelho e nenhum anticorpo secundário, o que resultou em alguma aglutinação para amostras tratadas com a condição padrão de glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM ou com PIC-1 sem inibidor. Acredita-se que a aglutinação observada em quase todas as amostras usando a diluição 1:4 concentrada de soros de coelho com um anticorpo secundário anti-coelho (Quadros 12 e 13) se deve, em parte, a reações heterófilas. Os anticorpos heterófilos são anticorpos que ocorrem naturalmente que reconhecem RBC de uma outra espécie de um modo não especifico. Os quadros 12-13 mostram os resultados de várias experiências, para a diluição 1:4 ou 1:100 de soros de coelho e para a diluição 1:4 de anticorpo anti-coelho. Não se apresentam dados de controlos não tratados, pois esses originaram pontuações 0 para todas as amostras. Primeiro, misturaram-se todas as amostras com inibidor, depois PIC-1 a 0,2 mM. Nos Quadros indica-se a identidade do inibidor, a concentração e os equivalentes de base. Esses resultados sugerem que uma combinação de glutationa e cisteína, ou apenas cisteína, pode proporcionar inibição um pouco melhor da ligação de PIC-1 aos RBC.

Quadro 12

Ligação do anticorpo anti-acridina em RBC tratados com várias concentrações de glutationa e cisteína e PIC-1 0,2 mM.

Pontuação por placa de gel Sem anticorpos secundários Anticorpos secundários 1:4 Diluição de soros de coelho: 1: 4 1:100 1:4 1:100 Amostra Condições do inibidor 1 GSH ácido 2 mM 3 + 0 4+ 4 2 GSH 20 mM 2 eq. 0 0 3 + 0 3 Cys 2,5 mM 1 eq. 2 + 0 4+ 3 4 Cys 5 mM 1 eq. 1 + 0 4+ 1* 5 Cys 10 mM 1 eq 0 0 3 + 0 83 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Pontuação por placa de gel Sem anticorpos secundários Anticorpos secundários 1: 4 Diluição de soros de coelho: 1: 4 1:100 1: 4 1:100 Amostra Condições do inibidor 6 Cys 15 mM 1 eq 0 0 1* 0 7 Cys 20 mM 1 eq 0 0 0 0 * cor muito ligeira no cimo do gel

Quadro 13

Ligação do anticorpo anti-acridina em RBC tratados com várias concentrações de glutationa e cisteina e PIC-1 0,2 mM.

Pontuação por placa de gel Amostra de sangue 1 Amostra de sangue Diluição de soros de coelho: 1: 4 1:100 1: 4 1:100 Amostra Condições do inibidor 1 PIC-1 sem inibidor 4 + 4 + 4 + 4 + 2 GSH ácido 2 mM 4 + 4 + 4 + 4 + 3 GSH 20 mM 2 eq. 4 0 4 0 4 GSH 15 mM 2 eq./ Cys 5 mM 1 eq. 4 0 3 0 5 GSH 10 mM 2 eq./ Cys 10 mM 1 eq. 3 0 3 0 6 GSH 5 mM 2 eq./ Cys 15 mM 1 eq. 2 0 3 0 7 Cys 20 mM 1 eq. 0 0 3 0 8 GSH 15 mM 2 eq./ Cys 5 mM 2 eq. 4 0 3 0 9 GSH 10 mM 2 eq./ Cys 10 mM 2 eq. 2 0 2 0 10 GSH 5 mM 2 eq./ Cys 15 mM 2 eq. 1 0 1 0 84 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Pontuação por placa de gel Amostra de sangue 1 Amostra de sangue Diluição de soros de coelho: 1:4 1:100 1:4 1:100 Amostra Condições do inibidor 11 Cys 20 mM 2 eq. 0 0 1 0

Utilizou-se também, como inibidor, o dipeptídeo cisteina-glicina (CysGly). Comparou-se a condição padrão, assim como a cisteina neutralizada 20 mM (2 equivalentes de base) com várias concentrações da CysGly com e sem 1 equivalente de base. Os resultados são apresentados no Quadro 14. Os resultados concordam com o observado para a glutationa e a cisteina, de que, à medida que a quantidade de inibidor aumenta, é necessária a correção do pH, por exemplo por neutralização do inibidor, para melhor inibição.

Quadro 14

Comparação da inibição com CysGly com e sem neutralização com cisteina neutralizada a 20 mM, ou condições padrão. Análise pela placa de gel da ligação do anticorpo anti-acridina.

Pontuação da placa de gel Amostra Condições de inibidor Diluição 1:4 de soro Diluição 1:100 de soro 1 GSH ácido 2 mM 4 4 2 CysGly 2,5 mM 4 3 3 CysGly 2,5 mM 1 eq. de base 4 4 4 CysGly 5 mM 4 0 5 CysGly 5 mM 1 eq. de base 4 2 6 CysGly 10 mM 4 0 7 CysGly 10 mM 1 eq. de base 4 0 8 CysGly 20 mM 4 0 85 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Pontuação da placa de gel Amostra Condições de inibidor Diluição 1:4 de soro Diluição 1:100 de soro 9 CysGly 20 mM 1 eq. de base 4 0 10 CysGly 20 mM 2 eq. de base 4 0 11 Apenas dextrose, controlo sem tratamento 2 0

Exemplo 9

Eliminação de reatividade cruzada observada com glóbulos vermelhos padrão pelo tratamento de métodos do presente invento.

Utilizou-se soro de pacientes que desenvolveram anticorpos que sofrem reações cruzadas com RBC tratados com glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM para avaliar a reatividade cruzada com os métodos melhorados. Prepararam-se amostras usando sangue O negativo (Blood Source, Sacramento, CA) como se descreveu no Exemplo 1 e trataram-se com glutationa 2 mM e PIC-1 0,2 mM, PIC-1 0,2 mM seguido por glutationa neutralizada (2 equivalentes de base) 1 minuto mais tarde ou glutationa neutralizada 20 mM seguida por PIC-1 0,2 mM, 10 minutos mais tarde. Preparou-se também uma amostra de RBC de controlo não tratado. Lavou-se cada amostra três vezes com BBS, depois fez-se a suspensão para um hematócrito de 8% em salino de baixa força iónica (AABB manual, 14a edição) . Adicionou-se uma quantidade aliquota de 50 μΐ de cada um a placas de gel junto com 25 μΐ do soro do paciente, e incubou--se a mistura a 37°C durante 15 minutos. A placa de gel contém IgG anti-humano de coelho, que aglutinará os RBC que ligam anticorpos do soro dos pacientes. Centrifugaram-se as placas como para o exemplo 7. Lêem-se as placas pela mesma escala descrita no exemplo 7. As amostras testadas com três soros diferentes mostraram uma pontuação de 3+ com RBC tratados pelo padrão e 0 com o controlo sem tratamento ou as amostras tratadas com glutationa neutralizada 20 mM (2 equivalentes). 86 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Exemplo 10

Utilização de metionina como modelo para avaliar a inibição devida a correção de pH independentemente da inibição de tiol.

Porque a metionina (Met) tem um substituinte metilo no átomo de enxofre, mas caso contrário é muito semelhante a cisteina, foi usada como um modelo de aminoácido para avaliar o efeito isolado da correção do pH na inibição. A presença do grupo metilo elimina a natureza nucleofilica do átomo de enxofre, pelo que qualquer inibição pode dever-se ao aumento do pH da solução (por exemplo, a maior concentração de hidróxido pode proporcionar alguma inibição) . Utiliza-se a metionina (Aldrich) a 20 mM com adição de 1 ou 2 equivalentes de base, e compara-se com a cisteina (1 ou 2 equivalentes) e glutationa (2 equivalentes), todos com PIC-1 0,2 mM, adicionado 10 minutos após o inibidor. Incluiu-se a condição padrão, isto é, adicionou-se PIC-1 0,2 mM e glutationa ácida 2 mM, juntos. Avaliou-se as amostras por análise de placa de gel de ligação a soro de coelho anti-acridina como para o Exemplo 7, com a exceção de que as amostras para a análise de placa de gel foram incubadas a 37°C ou à temperatura ambiente. Os resultados são apresentados no Quadro 15. Os resultados mostram que a metionina neutralizada com 2 equivalentes de base proporciona melhor inibição quando comparada com a condição padrão.

Quadro 15

Inibição com metionina, cisteina ou glutationa conforme avaliada por análise de placa de gel da ligação de soros de coelho anti-acridina.

Pontuação de placa de gel Temperatura de Incubação: 3 7 °C Temperatura ambiente Diluição do soro de coelho: 1: 4 1:100 1: 4 1:100 Amostra Tratamento 1 Não tratado 0 0 0 0 2 PIC-1 0,2 mM / GSH 2 mM 4 3 4 3 3 GSH 20 mM + 2 eq. / 3 0 3 0 87 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Pontuação de placa de gel Temperatura de Incubação: 37°C Temperatura ambiente Diluição do soro de coelho: 1: 4 1:100 1: 4 1:100 Amostra Tratamento PIC-1 0,2 mM 4 Cys 20 mM + 1 eq. / PIC-1 0,2 mM 1 0 2 0 5 Cys 20 mM + 2 eq. / PIC-1 0,2 mM 0 0 1 0 6 Met 20 mM + 1 eq. / PIC-1 0,2 mM 4 3 4 3 7 Met 20 mM + 2 eq. / PIC-1 0,2 mM 3 0 3 0

Exemplo 11

Estudos funcionais in vitro em unidades inteiras tratadas com glutationa neutralizada 20 mM e PIC-1 0,2 mM.

Submeteu-se a leucorredução unidades completas de concentrados de glóbulos vermelhos (Interstate Blood Bank, Inc., Memphis, TN). Misturou-se um volume de 200 ml deste RCC (hematócrito a 80%) com 94 ml de Eritrosol ou 100 ml de Adsol (Baxter Healthcare Corp., Deerfield, IL) como controlo (unidade 1). Usou-se um volume de 20 ml de dextrose a 8% para dissolver PIC-1 (mg) e glutationa ácida (mg) e adicionou-se a uma unidade para proporcionar PIC-1 0,2 mM e glutationa 2 mM (unidade 2). Para as unidades 3 e 4, dissolveu-se separadamente PIC-1 (mg) e glutationa (mg) em 10 ml ou 8,8 ml de dextrose a 8%, respetivamente. Para a glutationa, adicionou-se 1,2 ml de NaOH 10 N (2 equivalentes). Misturou--se o PIC-1 com a unidade, seguido por glutationa, 1 minuto mais tarde (unidade 3) ou 5 minutos mais tarde (unidade 4) . Para a unidade 5, misturou-se primeiro glutationa neutralizada, seguida pelo PIC-1, 10 minutos mais tarde. Para a unidade 6, dissolveu-se a glutationa em 18,8 ml de dextrose a 8% e misturou-se com 1,2 ml de NaOH 10N, depois misturou-se com o RBC (sem PIC-1). Misturaram-se todas as unidades, segurando as extremidades do saco de sangue e misturando 30 vezes com um movimento em 8. Incubaram-se então estas à temperatura ambiente durante um total de 20 horas. Utilizou- 88 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ -se para todas, exceto para a amostra de controlo, um dispositivo de adsorção de composto (CAD) constituído por uma resina polimérica contida num saco em malha. Este dispositivo destina-se a retirar das amostras PIC-1 residual, produtos de degradação de PIC-1 e de glutationa. Incubaram-se as amostras durante 8 horas, em seguida, transferiram-se para um segundo saco de sangue contendo o CAD e incubaram-se durante mais 12 horas. Após a incubação à temperatura ambiente, transferiram--se as amostras para um frigorífico (4°C) e armazenaram-se até 43 dias. Retiraram-se quantidades alíquotas de cada unidade 12 horas e 20 horas após a mistura, e depois disso todas as semanas. Analisou-se as alíquotas quanto a hemoglobina total, pH, ATP intracelular, hemoglobina plasmática, potássio, glicose extracelular e lactato extracelular. Avaliou-se também a ligação do soro anti-coelho por análise FACScan, conforme descrito no exemplo 4. Repetiu--se o estudo, com unidades tratadas com PIC-1, tratadas com ou sem o CAD. Os resultados para ATP, hemólise e ligação de soro anti-coelho são apresentados nos quadros 16A-C e 17A-C.

Identidades de amostra do Quadro 16A-C: 1: Controlo sem tratamento

2: Tratamento padrão PIC-1 0,2 mM + GSH 2 mM 3: PIC-1 0,2 mM, 1' de atraso, GSH 20 mM + 2 equivalentes de base 4: PIC-1 0,2 mM, 5' de atraso, GSH 20 mM + 2 equivalentes de base

5: GSH 20 mM + 2 equivalentes de base, 10' de atraso, PIC-1 0,2 mM 6: GSH 0,2 mM + 2 equivalentes de base. 89 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 16Α

Dados de ATP durante 42 dias de armazenamento. ATP da amostra de RBC ymol/g de Hb Dias 1 2 3 4 5 6 0 3,66 3,62 4,20 4, 16 4,11 4,30 0,5 3,79 3, 85 2,02 5, 08 5,17 5,56 O co 3,77 3,55 5, 05 5,38 5,21 5,56 7 3,63 3,59 5,24 5, 11 5,58 5,64 14 2,84 2,58 4,20 4, 06 4,22 4,93 22 2,69 2,30 3,86 3,66 3,90 4,20 28 2,24 1,61 3,10 2,72 3,27 3,68 35 1,99 1, 46 2, 71 2, 47 2,68 3,30 43 1,65 1,21 2,28 2,06 2,28 2,61

Quadro 16B

Percentagem de hemólise durante 42 dias de armazenamento.

Percentagem de Hemólise da amostra de RBC Dias 1 2 3 4 5 6 0 0,16 0,22 0,19 0,19 0,19 0, 15 LO O 0,18 0,24 0,16 0,25 0,24 0,19 O CO 0, 18 0, 46 0,40 0,48 0,47 0,51 7 0,27 0,62 0,35 0,52 0,57 0,58 14 0,37 0,69 0,50 0,52 0,55 0,61 22 0, 46 0, 87 0,59 0,62 0,63 0,60 28 0,62 0, 86 0,63 0,64 0,65 0, 71 35 0,73 0,99 0, 74 0,76 0,71 0,70 43 0,84 1,17 0,82 0,90 0,83 0, 75 90 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 16C

Modificação de RBC medida por ligação do anticorpo anti-acridina (FACScan) durante 42 dias de armazenamento.

Fluorescência Média de unidades de RBC Dias 1 2 3 4 5 6 O co 1,67 284 20,1 46, 0 20, 0 2,16 2 1, 84 193,5 14,58 34, 07 12,31 1, 78 7 1, 72 142,1 4,96 18, 84 5,34 1,58 14 1,56 135, 7 4, 09 8, 41 3,29 1, 48 22 1,61 90,8 2,61 4, 46 2,12 1,58 28 1,95 128,7 2,6 5,69 2,83 2,02 35 2, 71 153,4 2, 74 6, 71 2,58 1,62 43 1,63 136,1 2,43 4,51 2,46 1,8

Identidades da amostra do Quadro 17A-C:

1: Tratamento padrao PIC-1 0,2 mM; GSH 2 mM + CAD 2 : Tratamento padrão PIC-1 0,2 mM; GSH 2 mM 3: PIC-1 0,2 mM, 1' de atraso , GSH neutralizado 2 0 mM + CAD 4: PIC-1 0,2 mM, 1' de atraso, GSH neutralizado 20 mM 5: GSH neutralizado 20 mM, 10' de atraso, PIC-1 0 , 2 mM + CAD 6: GSH neutralizado 20 mM, 10' de atraso, PIC-1 0, 2 mM 7: GSH neutralizado 20 mM

Controlo sem tratamento 91 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 17Α

Valores de ATP intracelular durante 42 dias de armazenamento. ATP da amostra de RBC ymol/g de Hb Dias 1 2 3 4 5 6 7 8 O O 4,02 4,38 5,21 4, 86 4,93 4, 82 5, 17 4, 46 0,5 4,63 4, 78 6,78 6,60 6,92 6,56 6,54 4,28 O co 4,58 4,69 6,37 6,31 6,58 6, 45 6, 41 4,55 7 3,55 3,77 5,21 5, 80 6,04 6,12 6,15 3,59 14 2,38 2,54 4,24 4,36 4, 44 4,62 4, 86 2, 74 28 1,51 1,67 3,00 3,11 3,16 3,44 3,21 2, 15 35 0,79 0,76 1,37 1,50 1,53 1,65 1,64 1,04 42 1,01 1, 12 2,01 2,14 2,13 2,34 2,16 1,58

Quadro 17B

Percentagem de Hemólise durante 42 dias de armazenamento.

Percentagem de Hemólise de Unidades de RBC Dias 1 2 3 4 5 6 7 8 O O 0,22 0,22 0,16 0, 18 0,21 0,21 0,16 0, 17 0,5 0,27 0,22 0,22 0,20 0,28 0,27 0,19 0, 17 O CO 0,42 0,25 0,43 0,21 0,48 0,30 0,19 0,20 7 0,54 0,34 0,48 0,31 0,57 0, 44 0,29 0,32 14 0,78 0,51 0,56 0,35 0,61 0,42 0,29 0,42 28 1,10 0,78 0, 75 0, 47 0,78 0,60 0,48 0, 74 35 1,31 0,92 0,86 0,53 0,96 0,66 0,61 0,86 42 1,62 1, 10 1,09 0,76 1, 13 0, 81 0,78 1,20 92 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Quadro 17C

Modificação de RBC medida pela ligação do anticorpo anti-acridina (FACScan) durante 42 dias de armazenamento.

Fluorescência Média de Unidades de RBC Dias 1 2 3 4 5 6 7 8 4 148,1 62,6 11,3 5, 24 5, 33 4, 56 1,94 1,55 7 181,6 81,4 9,03 4, 12 6, 01 4, 05 1,47 1,45 14 115, 9 46,7 3,73 3,09 2, 77 3,74 1,95 1,49 21 133,0 48,6 3,00 3,40 2,65 3,51 1,73 1,65 28 134, 4 46,7 4, 59 4, 94 2, 72 5, 16 1,96 2,61 35 143,3 44, 51 2,8 3,98 2,22 4, 51 1,86 1,85 42 132,4 44, 1 3,32 5, 00 2,66 5, 28 2,02 2,04

Exemplo 12

Avaliação in vitro de imunorreatividade de glóbulos vermelhos tratados em modelo de coelho.

Realizou-se, usando um modelo de transfusão alogénico, a avaliação in vivo da imunorreatividade de glóbulos vermelhos (RBC) tratados com S-303 usando um exemplo não limitante de um método de inibição melhorado, referido neste exemplo como "RBC com S-303 modificado" (ver a seguir, a descrição do protocolo para os RBC com S-303modifiçado) . 0 modelo de transfusão alogénica usado baseou-se num modelo de coelho descrito por Ness et al. (Trans Med Rev, 2001, 15: 305-17) para investigar os mecanismos para as reações de transfusão hemolitica retardadas. Nesse modelo, utilizou-se os glóbulos vermelhos HgD-positivos para imunizar animais recetores HgD-negativos. No entanto, consistente com a literatura que RBC HgD-incompativeis apenas causam formação de anticorpo pouco frequentemente, Ness et al recorreu à administração subcutânea de RBC HgD-positivos combinados com adjuvante para gerar uma concentração apreciável do anticorpo anti-HgD.

Conduziu-se a avaliação em duas fases: na fase 1, os coelhos foram repetidamente transfundidos com RBC alogénico de coelho, incompatível com o HgD locus e tratado com o processo S-303 Original (Veja descrição abaixo). O ponto final da fase 1 serviu para determinar se poderia ser gerada 93 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ uma resposta de anticorpo contra RBC com S-303 Original no contexto da transfusão alogénica crónica. Na fase 2, os coelhos estavam convencionalmente imunizados com conjugado de KLH-acridina em adjuvante para estimular a formação de anticorpos anti-acridina. Estes animais imunizados foram então transfundidos com RBC com S-303. 0 ponto final da fase 2 foi comparar a recuperação e a esperança de vida dos glóbulos vermelhos preparados pelos processos de RBC com S-303 Original e modificado. As amostras de controlo nas experiências de fase 1 e fase 2 incluíram RBC com S-220 preparados pelos processos originais e modificados. A S-220 é uma versão não-lábil do S-303 que deve representar um caso pior em termos de ligação de acridina a RBCs para cada processo de tratamento. Os resultados destes estudos demonstram que o S-303 modificado não é afetado pela presença de anticorpos de elevada concentração in vivo. A. Materiais e Métodos

Produção animal: Coelhos Brancos Nova Zelândia, machos e fémeas, com aproximadamente 5 a 7 meses de idade e peso entre 3,5-4,5 kg no inicio do estudo. Os animais dadores eram HgD-positivos; os recetores eram HgD-negativos.

Reagentes: Eritrosol sem dextrose foi fabricado pela

Baxter Healthcare, de acordo com a formulação no quadro 18. Uma solução de mono-hidrato de dextrose a 8% também foi produzida pela Baxter.

Quadro 18 A composição de Eritrosol (sem dextrose).

Componente Concentração (mg/ 100 ml) Citrato de sódio desidratado 782 Adenina 21,5 Manitol 774 Di-hidrato de di-hidrogenofosfato de sódio 73, 4 Fosfato de sódio dibásico, anidro 242 94 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ Ο composto de inativação de agentes patogénicos usado neste exemplo foi PIC-1, que é referido neste exemplo como S-303. Esterilizou-se o S-303.2HC1 por irradiação gama. Como controlo utilizou-se um análogo não-quebrável do S-303, chamado S-220. As estruturas químicas do S-303 (também referido neste documento como "PIC-1") e do S-220 são as seguintes: 94 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ Cl Cl

S-303 S-220

Os dois compostos têm estruturas muito semelhantes, com a exceção da ligação de éster frangivel presente somente em S-303. O S-303 é, por vezes, referido neste documento como um composto efetor de ancoragem frangivel (FRALE - Frangile Anchor Linker Effector) e o S-220 como um composto efetor de ancoragem (ALE - Anchor Linker Effector). O GSH foi disponibilizado de duas maneiras: na forma de um pó pré-pesado de 184 mg esterilizado por irradiação gama (Baxter Healthcare) ou na forma de uma substância em bruto (Aldrich, St. Louis MO) para pesar e formular aquando do tratamento de RBC.

Tratamento de RBC: Efetuou-se a transfusão de RBC em 24-36 horas após a preparação. Colheu-se o sangue assepticamente de doadores HgD-positivos em ACD-A. Agrupou-se cerca de 410 a 500 ml de sangue inteiro num recipiente plástico e centrifugou-se a 4200x g durante 6 minutos. Depois de remover o plasma, adicionou-se 94 ml de Eritrosol sem dextrose para produzir uma preparação de glóbulos vermelhos embalados com um hematócrito de aproximadamente 60%. Trataram-se os glóbulos vermelhos numa das três maneiras, conforme se mostra na Figura 2 e se descreve a seguir. RBC de controlo: Misturaram-se glóbulos vermelhos com 20 ml de dextrose a 8% e em seguida armazenaram-se a 4°C antes da infusão (até 2 dias). 95 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ RBC com S-303 Original: Dissolveu-se GSH (184 mg) em 20 ml de dextrose a 8%. Utilizou-se esta solução de GSH (pH 2,8-3,0) para dissolver S-303-2HC1 (33 mg). Adicionou-se posteriormente a solução de S-303/GSH aos glóbulos vermelhos e misturou-se manualmente. Incubaram-se os RBC durante 12 horas à temperatura ambiente e então expuseram-se a um dispositivo de adsorção de composto (CAD) durante mais umas 8 h com mistura. As concentrações finais de S-303 e de GSH no processo original foram 0,2 mM e 2,0 mM, respetivamente. Armazenou-se então RBC com S-303 Original a 4°C antes da infusão. Realizaram-se tratamentos com o processo original usando o mesmo kit descartável utilizado em estudos clínicos humanos. RBC com S-303 modificado: Pesou-se GSH-HC1 (2026 mg) para tubos de plástico, estéreis, e dissolveu-se em 9,32 ml de dextrose a 8%. Combinou-se então a GSH ácida com 1,32 ml de NaOH 10 N, o que representa 2 equivalentes de base. Adicionou-se 10 ml de GSH básico, filtrado e estéril em dextrose (pH 9) aos glóbulos vermelhos empacotados e misturou-se manualmente. Em 10 minutos, dissolveu-se separadamente S-303-2HC1 (33 mg) em 10 ml de dextrose a 8%, adicionou-se aos glóbulos vermelhos empacotados contendo GSH e misturou-se manualmente. Incubou-se RBC com S-303 modificado à temperatura ambiente e expôs-se a CAD de forma idêntica ao processo original. As concentrações finais de S-303 e de GSH no processo modificado foram 0,2 mM e 20 mM, respetivamente. RBC com S-220: O S-220 é um análogo do S-303 sem o éster lábil e, assim, a acridina não pode ser clivada por hidrólise do resto da molécula durante o tratamento de RBC. Preparou-se RBC com S-220 usando métodos análogos ao processo original ou ao modificado, descritos para o S-303 e, sempre que possível, usaram-se descartáveis do processo original. Para o RBC com S-220 Original, as concentrações finais de S-220 e de GSH foram 0,2 mM e 2,0 mM, respetivamente. Para o RBC com S-220 modificado, as concentrações finais de S-220 e de GSH foram 0,2 mM e 20 mM, respetivamente. 96 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Imunização de acridina: Para obter os anticorpos anti--acridina de concentração elevada, imunizou-se coelhos na fase 2 com um conjugado de KLH-acridina. Preparou-se o KLH-acridina numa escala de 2-5 ml por reação de quantidades equimolares (476 μΜ) de KLH (Pierce Biotechnology, IL) e S-220 em salino tamponado de fosfato (pH 7,4) durante 48 horas à temperatura ambiente. Separou-se os produtos de degradação de pequena molécula de S-220 da KLH-acridina, passando através de uma coluna de dessalinização. Caracterizou-se o conjugado de KLH-acridina pela sua absorção a 210 e 410 nm e determinou-se a razão de acridina para KLH utilizando o coeficiente de extinção do S-220. Tipicamente formaram-se 200-400 adutos de acridina por molécula de KLH. Refrigerou-se a solução de KLH-acridina até à sua utilização. Imunizaram-se coelhos no dia 1 com KLH-Acridina em adjuvante de Freund completo (0,5 mg/ml) por via subcutânea em 10 locais acima dos nodos linfáticos poplíteos, pré-escapulares e pré-femorais (aproximadamente 0,1 ml por local). Nos dias 8, 15, 36 e 64, impulsionou-se os animais com KLH-Acridina em adjuvante de Freund incompleto (0,25 mg/ml) nos mesmos locais (aproximadamente 0,1 ml por local). Testaram-se quinzenalmente as amostras de soro de coelho quanto à formação de anticorpos.

Deteção de anticorpos para acridina (fase 1): detetou-se o anticorpo para acridina usando um ensaio de citometria de fluxo. Preparou-se RBC com S-303 humanos, como reagente de teste, usando o processo original de tratamento. Diluiu-se a 1:4 o soro de coelho e misturou-se 25 μΐ de soro diluído com 50 μΐ de RBC com S-303 humanos no hematócrito de 0,8%. Testaram-se os soros de pré-imunização como controlos negativos. Incubaram-se amostras durante 30 min a 37°C e em seguida lavaram-se e efetuou-se novamente a sua suspensão em 50 μΐ de solução salina do banco de sangue. Diluiu-se 1:64 o IgG anti-coelho de cabra FITC-rotulado (fornecedor) e incubou-se 25 μΐ com a amostra de RBC durante 30 min a 37°C. Lavou-se novamente as amostras e analisaram-se por FACS usando o canal FL1 para detetar complexo do anticorpo ligado. Uma vez identificado um soro positivo, realizou-se o mesmo 97 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ procedimento com diluições do soro de coelho para determinar o titulo final.

Deteção de anticorpos para acridina (fase 2): Prepararam--se RBC com S-303 humanos como reagente de teste usando o processo de tratamento original (S-303 0,2 μΜ, 2 mM GSH) . Lavaram-se os glóbulos vermelhos três vezes em solução salina do banco de sangue (BBS, Fisher Scientific) e diluiram-se, em BBS, até cerca de 4% de hematócrito. Diluiram-se, em série, em BBS, soros de coelho do grupo V e VI. Combinou-se 25 μΐ de RBC a 4% com 15 μΐ de soro de coelho e deixou-se incubar durante 30 min a 37°C. Utilizou-se BBS em vez de soro para o controlo negativo. Após a incubação, lavaram-se os RBC três vezes em BBS e de seguida efetuou-se novamente sua suspensão em 50 μΐ de IgG anti-coelho F(ab')2 de cabra conjugado com FITC (H & L) (Caltag) diluído 1:64 em BBS. Incubaram-se RBC durante 30 min a 37°C e lavaram-se três vezes com BBS. Efetuou-se então de novo a suspensão das amostras em 1 ml de HaemaLine-2 (HL2, Sereno diagnósticos). Analisaram-se as amostras por FACS usando o canal FL1 para detetar o complexo do anticorpo acoplado.

Infusões de RBC e medição da esperança de vida de RBC: Administrou-se, por via intravenosa, através da veia da orelha, a 1 ml/min, glóbulos vermelhos, usando bombas de transfusão. Na fase 1, dosearam-se coelhos com 10 ml de RBC/kg, enquanto na fase 2, dosearam-se coelhos com 4 ml de RBC/kg. A dose de 10 ml/kg corresponde à quantidade aproximada de sangue transfundido mensalmente em regimes para pacientes de anemia falciforme e talassemia.

Efetuou-se a biotinilação de RBC após o tratamento com S-303 ou com S-220. Lavaram-se os glóbulos vermelhos (300ml), duas vezes, com 200 ml de PBSG (fosfato 12 mM, NaCl 138 mM, KC1 2,7 mM, glicose 5 mM, pH 7,4) e fez-se novamente a suspensão no mesmo meio. Misturaram-se então estes com um volume igual de PBSG contendo NHS-biotina 60 μΜ (Aldrich, St. Louis MO) e incubaram-se durante 1 h a 37°C. Após a incubação, lavaram-se, três vezes, com 200 ml de PBSG e finalmente fez-se novamente a suspensão em PBSG até 50% de 98 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ hematócrito e armazenaram-se sob refrigeração até a transfusão.

Avaliou-se a esperança de vida dos glóbulos vermelhos por análise de FACScan. Obteve-se sangue de coelho em intervalos regulares após a transfusão (1, 3, 7, 15, 21 e 28 dias) de todos os animais. Passou-se as amostras através de um filtro de 80 micron para remover micro-coágulos, diluiu-se a 0,07% de HCT em PBSG e incubou-se com Streptavidin rotulado por ficoeritrina (diluição de 1:100, sondas moleculares) no escuro, à temperatura ambiente, durante 20 minutos. Realizou--se a análise de FACS em amostras diluídas 5 vezes, e colheram-se 50000 eventos totais a uma taxa de 400 eventos/ segundo para permitir a quantificação exata da célula. Calculou-se a esperança de vida dos RBC biotinilados por extrapolação para 100% de recuperação no dia 0. Expressou-se então os valores nos dias subsequentes como uma percentagem do valor do dia 0. Quando apropriado, analisou-se a significância estatística das diferenças de esperança de vida utilizando o teste t de Student com uma análise de heterocedasticidade. B. Fase 1: Infusões repetidas de RBC incompatível

Na fase 1, efetuou-se a transfusão dos animais, quinzenalmente, durante 24 semanas, com 10 ml/kg de RBC alogénico incompatível com o HgD locus para determinar se pode ser detetada uma resposta ao RBC com S-303. Os coortes dos animais são descritos no quadro 19.

Quadro 19

Coortes de animais em Fase 1

Coorte Número Regime de Imunização Grupo 1 4 RBC de controlo, intravenoso Grupo 2 6 RBC com S-303 de processo original, intravenoso Grupo 3 2 Conjugado de KLH-Acridina, subcutâneo Grupo 4 6 RBC com S-220 de processo original, intravenoso 99 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Tiraram-se amostras de soro em intervalos semanais e testaram-se num ensaio baseado em citometria de fluxo quanto à presença do anticorpo anti-acridina. Resumidamente, incubou-se RBC com S-303 humanos preparados pelo processo original (S-303 0,2 mM e GSH 2 mM) com uma diluição de 1:4 de soro de coelho. Após a lavagem, detetou-se a presença de anticorpo do coelho ligado com um IgG anti-coelho de cabra rotulado com FITC. O único resultado positivo foi detetado no grupo 3, com a diluição de 1:4. Na Figura 1 apresentam-se os resultados ao longo de 24 semanas de infusão. Os animais imunizados com KLH-acridina demonstraram uma resposta forte de anticorpos anti-acridina. Em contrapartida, não houve nenhuma resposta significativa nos animais repetidamente transfundidos com os RBC com S-303 ou com S-220 preparados pelo processo original.

Os resultados apresentados na Figura 1 foram confirmados através da realização de ensaios de aglutinação com RBC com S-303 humanos, tratados com o processo original na maioria das amostras de soro. Apenas o soro dos animais do grupo 3 imunizados com KLH-acridina mostraram aglutinar RBC com S-303 humano. Além disso, não se observou uma resposta anti-HgD em quaisquer animais recetores. C. Fase 2: Determinação da esperança de vida de RBC em coelhos imunizados com KLH-acridina

Uma vez que as infusões repetidas com preparações de RBC antigeno-incompativeis, tratados com S-303 ou S-220, falharam na produção de uma resposta imune anti-acridina, na fase 2, fez—se uma abordagem mais rigorosa para obter o anticorpo anti-acridina. Imunizou-se os animais com KLH-acridina usando um regime de imunização prime-boost convencional, incluindo adjuvante e mediu-se então a esperança de vida in vivo de várias preparações de RBC tratados em coelhos ou titulo elevadode anticorpos. Os resultados da fase 1 demonstraram que era viável imunizar coelhos via imunização subcutânea com KLH-acridina e atingir títulos elevados de anticorpos.

Na fase 2 utilizou-se também os animais nos grupos 1, 2 e 4. Subdividiram-se estes grupos, e imunizou-se um subconjunto de animais com KLH-acridina, enquanto se manteve os restantes no seu regime de transfusão existente. Duas coortes 100 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ adicionais de coelhos HgD-negativos que eram ingénuos para infusões de RBC de qualquer tipo foram adicionados à fase 2. No quadro 20 fornece-se uma descrição das coortes experimentais na fase 2.

Quadro 20

Coortes de animais em Fase 2

Grupo Número Imunização de Fase 1 Imunização de Fase 2 IA 2 RBC de controlo RBC de controlo 1B 2 RBC de controlo KLH-Acridina 2A 2 RBC com S-303 Original RBC com S-303 Original 2B 4 RBC com S-303 Original KLH-Acridina 4A 2 RBC com S-220 Original RBC com S-220 Original 4B 4 RBC com S-220 Original KLH-Acridina 5 6 Nenhuma KLH-Acridina 6 6 Nenhuma KLH-Acridina

Durante as imunizações na fase 2, seguiu-se a produção de anticorpos semanalmente pelos mesmos ensaios FACS e de aglutinação utilizados na fase 1. Após aproximadamente 8 semanas, todos os coelhos imunizados com KLH-acridina desenvolveram uma resposta de anticorpo forte especifica para os RBC com S-303 humanos, enquanto os soros de animais imunizados com as várias preparações de RBC continuaram a ser não-reativos.

Determinou-se o titulo do anticorpo anti-acridina no soro dos Grupos V e VI. Utilizou-se a análise de citometria de fluxo para titular amostras de soro de pré-transfusão 1 (RBC processados pelo Original) e pré-transfusão 2 (RBC processados pelo modificado) de animais dos grupos V e VI. Os animais do Grupo V receberam RBC tratadas com S-303, ao passo que os animais do grupo VI foram transfundidos com RBC tratados com S-220.

Definiu-se o titulo como a diluição de soro em que a fluorescência média era superior ao fundo. Todos os coelhos tinham anticorpos anti-acridina de titulo elevado. 0 titulo para o grupo V foi ligeiramente menor no soro retirado antes 101 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ da transfusão 1 ("Pre-Tl"), em comparação com soros de pré-transfusão 2 ("Pre-T2") . No grupo VI o título foi o mesmo antes de ambas as transfusões.

Quadro 21 Título/grupo do ponto final médio antes da transfusão 1 e da transfusão 2

Pre-Tl Pre-T2 Grupo V 1:2048 1:4096 Grupo VI 1:4096 1:4096

Uma vez estabelecidos os anticorpos do soro pela imunização com KLH-acridina, transfundiu-se cada animal para determinar a esperança de vida in vivo de várias preparações de RBC. Utilizou-se um rótulo de biotina para acompanhar a circulação in vivo de RBC (Suzuki e Dale (1987), Blood, 70:791-5). A NHS-biotina forma uma ligação covalente com as proteínas da membrana dos RBC, e pode ser detetada usando estreptavidina marcada com fluorescência. Os coelhos receberam aproximadamente 4 ml de RBC/kg, de acordo com o esquema no quadro 22. Após a transfusão no dia 0, retirou-se sangue nos dias 1, 3, 7, 15, 21 e 28 para medir a percentagem de células rotuladas com biotina em circulação, em relação ao dia 0. Os RBC de teste foram RBC de controlo não tratados, RBC com S-303 preparados usando o procedimento original ou modificado ou RBC com S-220 preparados usando o procedimento original ou modificado, conforme apresentado no quadro 22.

Tabela 22

Transfusões para determinar a esperança de vida de RBC por coorte de animais

Grupo Anticorpo de acridina Transfusão 1* Transfusão 2* IA Não RBC de controlo RBC de controlo 1B Sim RBC de controlo RBC de controlo 2A Não RBC com S-303 Original RBC com S-303 Modificado 102 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ

Grupo Anticorpo de acridina Transfusão 1* Transfusão 2* 2B Sim RBC com S-303 Original RBC com S-303 Modificado 4A Não RBC com S-220 Original RBC com S-220 Modificado 4B Sim RBC com S-220 Original RBC com S-220 Modificado 5 6 RBC com S-303 Original RBC com S-303 Modificado 6 6 RBC com S-220 Original RBC com S-220 Modificado * Todas as preparações de RBC foram marcadas com biotina antes da infusão.

Esperança de vida de RBC preparados pelo processo Original:

Mediu-se a sobrevivência de RBC de controlo em coelhos não imunes e acridina-imunes (subgrupos IA e 1B, respetivamente, quadro 21) . Uma vez que não houve diferença na esperança de vida de RBC entre esses subgrupos, os dados são apresentados graficamente abaixo na forma de percentagem de recuperação média para todos os quatro animais combinados. Utilizaram-se animais a receber RBC de controlo como comparação para todos os outros grupos.

Os grupos 4 e 6 receberam RBC com S-220 preparados pelo processo original em transfusão 1. Utilizou-se o S-220 porque ele representa o "pior caso" para formação de hapteno. A acridina não pode hidrolisar durante o tratamento in vitro ou posteriormente durante a circulação in vivo. Os grupos 4A e 4B foram transfundidos com RBC com S-220 Original na fase 1 do estudo, ao passo que o grupo 6 era ingénuo para RBC com S-220 (quadro 20). Havia uma diferença marcante na esperança de vida dos RBC com S-220 Original dependendo da história de imunização dos animais (Figura 2) . Os animais do grupo 1, a receber RBC de controlo, tinham a esperança de vida de RBC mais longa e os RBC biotinilado puderam ser detetados em circulação no dia 57. A depuração dos RBC de controlo foi aproximadamente linear no tempo. Em contraste, o grupo 6, 103 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ imunizado com KLH-acridina e que nunca foi transfundido com RBC com S-220, demonstrou a rápida depuração dos RBC com S-220 Original. No dia 20 não foram essencialmente detetados quaisquer RBC com S-220. Isto demonstra que os coelhos no grupo 4B, que tinham sido imunizados pelo procedimento de KLH-acridina, mas ao contrário do grupo 6, tinham também sido repetidamente transfundidos com RBC com S-220 Original na fase 1, mostraram uma sobrevivência significativamente mais longa dos RBC. No entanto, a esperança de vida do S-220 Original no grupo 4B foi menor em relação ao grupo 4A (que não tinha sido imunizado com KLH-acridina). A esperança de vida dos RBC medida no grupo 1 (a receber RBC de controlo) e no grupo 4A (a receber RBC com S-220 Original) foi comparável, embora no grupo 1 estivesse em circulação uma maior percentagem de RBC de controlo, para além das três semanas.

Efetuou-se uma comparação semelhante medindo-se a esperança de vida dos RBC com S-303 Original nos grupos 2A, 2B e 5 (Figura 3) . A esperança de vida mais curta foi observada para RBC com S-303 em coelhos do grupo 5, que foram imunizados para KLH-acridina e eram ingénuos para RBC com S-303. Ao contrário do grupo 6, no entanto, os RBC com S-303 Original não estavam depurados no dia 20 e pôde detetar-se RBC com S-303 biotinilado no dia 57. Curiosamente, a esperança de vida do RBC com S-303 Original em coelhos do grupo 2B, que tinham um nível elevado de anticorpos anti-acridina em circulação, não foi mensuravelmente diferente do grupo 1 a receber RBC de controlo. Comparando os resultados para coelhos do grupo 2B e do grupo 5, parece que a exposição prévia ao RBC com S-303 Original melhorou os efeitos do anticorpo anti-acridina na depuração de RBC. Este resultado inesperado é semelhante ao que foi observado para os grupos 4B e 6 usando RBC com S-220 Original (Figura 2).

Esperança de vida de RBC preparados pelo processo modificado: O processo modificado foi desenvolvido para melhorar a inibição por GSH, alterando vários parâmetros. Primeiro, a quantidade de GSH aumentou dez vezes. Em segundo lugar, o GSH foi titulado com NaOH antes da adição ao RBC; isso melhora a nucleofilia do grupo -SH. Essas alterações levam a uma 104 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ redução significativa do S-303 ligado à superfície de RBC (ver, por exemplo, exemplo 5 e exemplol3) . Os RBC de S-220 modificado foram preparados usando a mesma abordagem.

Avaliou-se a esperança de vida dos RBC de S-220 modificados nos grupos 4A, 4B e 6 (Figura 4). Como observado anteriormente, para os RBC com S-220 preparados com o processo original, a esperança de vida dos RBC com S-220 modificado nos animais do grupo 6 foi significativamente menor em comparação com os RBC de controlo transfundidos nos animais do grupo 1. No entanto, a diminuição da circulação de RBC com S-220 modificado ao longo do tempo foi significativamente menor do que o observado nos mesmos animais com RBC com S-220 Original. Por exemplo, uma média de 18 por cento de RBC Modificado estava em circulação no dia 14, ao passo que se observou apenas 1,4% de RBC Original no mesmo instante. Além disso, a esperança de vida dos RBC com S-220 modificado nos grupos 4A (sem anticorpos) e 4B (anticorpos induzidos por KLH-acridina) foi equivalente ou melhor do que os RBC do controlo do grupo 1. Consistente com dados anteriores (Figura 3), a exposição ao RBC com S-220 Original anterior parece ter aumentado a esperança de vida dos RBC com S-220, mesmo na presença de anticorpos de titulo elevado.

Por fim, a esperança de vida dos RBC com S-303 modificado nos grupos 2A, 2B e 5 é apresentada na Figura 5. Em todos os casos, a esperança de vida dos RBC com S-303 modificado foi comparável aos RBC de controlo. Este foi o caso mesmo para os animais do grupo 5, que tinha demonstrado maior depuração dos RBC com S-303 Original. Estes dados importantes apoiam a verificação in vitro de que os glóbulos vermelhos tratados com S-303, preparados pelo processo modificado, não são imunorreativos in vitro com anticorpo anti-acridina proveniente de várias fontes. Isto inclui o soro dos doentes, o anticorpo monoclonal de rato e o antissoro policlonal de coelho.

Exemplo 13

Análise de FACScan adicional de RBC tratados com S-303.

Para os testes de citometria de fluxo dos RBC quanto à ligação a S-303 (PIC-1), lavou-se 50 μΐ de sangue, três 105 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ vezes, em 1,2 ml salino a 0,9% e depois efetuou-se novamente a suspensão em solução de salino de 0,75 ml de aproximadamente 4% de hematócrito. Combinaram-se 25 μΐ de RBC com 15 μΐ de soro de coelho anti-acridina, diluído 1:100. Após a incubação durante 30 min, a 37°C, lavou-se a amostra três vezes como anteriormente. Efetuou-se novamente a suspensão da pelota de RBC num volume de 50 μΐ de anticorpo anti-coelho de cabra FITC-rotulado (Caltag) preparado na diluição de 1:64 em albumina de soro bovino a 0,1%. Incubaram-se as amostras no escuro durante 30 min a 37°C. Após três lavagens adicionais, efetuou-se de novo a suspensão dos RBC em 1 ml de HaemaLine-2 (Serono Diagnostics) . Após diluição até 0,01% de hematócrito, colheram-se e analisaram--se por fluorescência a 600 nm, 20000 eventos. O processo modificado resulta em níveis significativamente inferiores de ligação de S-303 à superfície de RBC, conforme se detetou utilizando um ensaio de citometria de fluxo. Detetou-se o S-303 ligado a RBC usando um antissoro policlonal de coelho, produzido por imunização de coelhos com um conjugado de KLH-acridina em adjuvante. Detetou-se então o IgG de coelho ligado usando um IgG anti-coelho de cabra FITC-rotulado. Os resultados do FACScan são apresentados para nove painéis separados de RBC preparados usando o processo original e modificado na Figura 6. Para cada painel, utilizou-se o ensaio de FACScan para detetar a ligação de S-303 a C-RBC, O-RBC e M-RBC. A ligação do S-303 à superfície de RBC foi entre 15 a 35 vezes menor pelo processo modificado, em relação ao processo original.

Lisboa, 2013-10-31

Claims

ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 1/5 REIVINDICAÇÕES 1. Método de tratamento de uma composição de glóbulos vermelhos para inativar um agente patogénico, se presente, que compreende misturar a composição de glóbulos vermelhos com o seguinte: (a) um composto de inativação de agentes patogénicos que é éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]-etílico de β-alanina; (b) um inibidor que é glutationa, onde a razão molar de inibidor para composto de inativação de agentes patogénicos é de 20:1 a 200:1, onde a glutationa é neutralizada com 0,5 a 2 equivalentes de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor na mistura resultante composta pela composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base.
2. Método de acordo com a reivindicação 1, onde se mistura a base e o inibidor com a composição de glóbulos vermelhos antes, em simultâneo ou não mais tarde do que 30 minutos após a mistura do composto de inativação de agentes patogénicos com a composição de glóbulos vermelhos.
3. Método de acordo com a reivindicação 1 ou 2, onde a base e o inibidor são misturados antes de se misturar a base ou o inibidor com a composição de glóbulos vermelhos.
4. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde o inibidor e a base são ambos proporcionados por um sal básico contendo o inibidor.
5. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde a base é NaOH. 1 ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 2/5 a 3
6. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações onde a base é um tampão básico.
7. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 3, onde a base compreende pelo menos 1 equivalente de base.
8. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, onde a concentração de inibidor na mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, é superior a 2 mM.
9. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1-6, onde a concentração de inibidor na mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, é superior a 2 mM, e onde o pH da mistura resultante à temperatura ambiente se situa no intervalo de 7,0 a 8,5, compreendendo ainda o método o passo de: (c) correção do pH da composição composta pelos glóbulos vermelhos para que o pH da mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, à temperatura ambiente, se situe no intervalo de 7,0 a 8,5.
10. Método de acordo com a reivindicação 9, onde o pH da composição que contém os glóbulos vermelhos é corrigido pela adição de pelo menos 1 equivalente de base.
11. Método de acordo com a reivindicação 9, onde o inibidor é neutralizado com pelo menos um equivalente de uma base adequada, antes da adição do inibidor à composição de glóbulos vermelhos, e o pH da composição que contém os glóbulos vermelhos é corrigido pela adição do inibidor neutralizado. ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 3/5
12. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 11, onde a concentração de inibidor na mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base, se situa no intervalo de 4 mM a 40 mM.
13. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, onde a concentração de glutationa na mistura resultante é de 5 mM a 30 mM e a concentração do éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina é de 0,05 mM a 0,5 mM.
14. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 12, onde a concentração de glutationa na mistura resultante é de 5 mM a 30 mM e a concentração do éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina é de 0,1 mM a 0,3 mM.
15. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 14, onde a razão molar de inibidor para composto de inativação de agentes patogénicos é de 50:1 a 200:1.
16. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 15, onde o tratamento resulta na inativação de pelo menos 1 log de um contaminante patogénico na composição de glóbulos vermelhos.
17. Método de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 16, compreendendo ainda um passo final de redução da concentração do composto de inativação de agentes patogénicos na mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor, e a base. ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 4/5
18. Método de acordo com a reivindicação 1, compreendendo, na seguinte ordem: (a) proporcionar i) éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina, ii) glutationa neutralizada, e (iii) uma composição composta por glóbulos vermelhos, onde existe a possibilidade de a composição de glóbulos vermelhos estar contaminada com um agente patogénico; (b) misturar a glutationa neutralizada com a composição composta por glóbulos vermelhos; (c) incubar a mistura de glutationa neutralizada e a composição composta por glóbulos vermelhos durante um intervalo de tempo adequado; e (d) misturar o éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]etílico de β-alanina com a mistura de glutationa neutralizada e a composição composta por glóbulos vermelhos, na qual um agente patogénico, se presente na composição composta por glóbulos vermelhos, é inativado em pelo menos 1 log.
19. Composição compreendendo: (a) glóbulos vermelhos; (b) éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloroetil)amino]-etílico de β-alanina; (c) glutationa neutralizada como inibidor, em que o inibidor está a uma concentração superior a 2 mM e a razão de inibidor para composto de inativação de agentes patogénicos é de 20:1 a 200:1, e em que a glutationa é neutralizada com 0,5 a 2 equivalentes de base, onde um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor na mistura resultante contendo a composição de glóbulos vermelhos, o composto de inativação de agentes patogénicos, o inibidor e a base, e no qual o pH da composição se encontra no intervalo de 6,8 a 8,5. ΕΡ 1 838 355/ΡΤ 5/5
20. Kit, constituído por um composto de inativação de agentes patogénicos éster N-(acridin-9-il)-2-[bis(2-cloro-etil)amino]etílico de β-alanina, um inibidor que é a glutationa e pelo menos 0,5 a 2 equivalentes de base, no qual um equivalente significa uma quantidade molar que é equivalente à quantidade molar de inibidor no kit.
21. Kit de acordo com a reivindicação 20, em que a base compreende pelo menos 1 equivalente de base. Lisboa, 2013-10-31