JP2002513400A - Ｎｏ修飾ヘモグロビンおよびそのための使用 - Google Patents

Ｎｏ修飾ヘモグロビンおよびそのための使用

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スタムラー，ジョナサン，エス．
ゴー，アンドリュー，ジェイ．
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Abstract

(57)【要約】 Ｓ−ニトロソヘモグロビン（ＳＮＯ−Ｈｂ）は、ヘムＦｅの酸化を生じないＨｂとＳ−ニトロソチオールとの反応および本明細書に記載のその他の方法により生成することができる。チオール基のみに特異的でないがＨｂをより広範にニトロソ化するその他の方法を用いることが可能であり、該方法の産物または中間産物としてのポリニトロソ化メトＨｂを生成してもよい。種々の型のＳＮＯ−Ｈｂおよびそれらの組合せ（オキシ、デオキシ、メト；特に種々の含有物のＳ−ニトロシル化またはニトロソ化またはニトロ化）を動物またはヒトに投与することができ、ここで、酸素化されること、フリーラジカルを捕捉することまたは組織にＮＯ+基を放出することが望まれる。また、チオールおよび／またはＮＯ供与剤を投与して、ＮＯ+基の転移を促進することも可能である。ＳＮＯ−Ｈｂまたはその他のＨｂのニトロソ化もしくはニトロ化型により治療される状態の例には、虚血性損傷、高血圧、アンギナ、再灌流損傷および炎症、ならびに血栓症を特徴とする障害が含まれる。本発明のさらなる態様は、血液中のＳＮＯ−Ｈｂおよびニトロシルヘモグロビンを測定することにより哺乳動物の組織への酸素送達を評価する方法である。

Description

【発明の詳細な説明】 ＮＯ修飾ヘモグロビンおよびそのための使用 関連出願 本出願は、１９９５年９月１５日に出願した米国暫定出願第６０／００３，８ ０１号に対して優先権を主張する１９９６年３月１５日に出願した米国特許出願 第０８／６１６，３７１号の一部継続出願である１９９６年６月２０日に出願し た米国特許出願第０８／６６７，００３号の継続出願である１９９６年９月１３ 日に出願したＰＣＴ／ＵＳ９６／１４６５９号の一部継続出願である１９９７年 ２月６日に出願した米国特許出願第０８／７９６，１６４号の一部継続出願であ る１９９７年６月１２日に出願した米国特許出願番号０８／８７４，９９２号の 一部継続出願である。また、本出願は、１９９５年９月１５日に出願した米国暫 定出願第６０／００３，８０１号に対して優先権を主張する１９９６年３月１５ 日に出願した米国特許出願第０８／６１６，２５９号の継続出願である１９９６ 年９月１３日に出願したＰＣＴ／ＵＳ９６／１４６６０号の一部継続出願でもあ る。前記出願の教示はすべて、その全体が参照により本明細書にそれぞれ取り込 まれる。政府助成 本発明は、ナショナル・インスティチュート・オブ・ヘルス（National Insti tutes of Health）によって授与された補助金第ＨＬ５２５２９およびＨＲ５９ １３０の政府助成を受けてなされたものである。米国政府は本発明において相応 の権利を有する。発明の背景 ヘモグロビン（Hb）とO2、CO2、NOなどといった小さな拡散性リガンドとの相 互作用は、その金属中心とアミノ末端で起こることが知られている。肺と全身の 微小脈管構造で起こるO2/CO2送達機能はアロステリックに制御される。環境に対 するそのような応答が、NOの場合にもあてはまることは知られていない。具体的 に述べると、NOはHbの機能的な特徴を生理学的に有意なほどには変更しないと以 前は考えられていた。速度論的モデル研究によれば、脈管構造中の遊離NOの大半 はHbによって捕捉されるはずであると予想される（Lancaster 1994）。したがっ て、仮に平静な器官ではそうでないとしても、アテローム性動脈硬化症に認めら れるような酸化剤ストレス（oxidant stress）が加われば、NOの定常状態レベル は、グアニル酸シクラーゼなどの標的酵素に対するKmよりも低くなるだろう（La ncaster 1994）。これらの考察は、NOがどのようにしてその生理活性を発揮する のかという根本的な疑問を生じさせる。 この疑問に対する１つの回答は、一酸化窒素が、NO様の血管弛緩因子活性を持 つが(Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992))、Hb とは異なって細胞の内外を自由に通過できるＳ−ニトロソチオール（RSNO）生成 傾向に見出すことができる(Gaston，B.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:10 957-10961(1993))。具体的に述べると、RSNOのNO基は、NOそのものとは異なるニ トソニウム（NO+）特性を持つ。NOがなしえない一定の機能を引き出す能力をRSN Oが持っていることは、ますます理解されつつある(DeGroote，M.A.ら，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA，92:6399-6403(1995)；Stamler，J．S.，Cell，78:931-936 (1994))。また、タンパク質中の-SNO基が、おそらくはリン酸化と同様のシグナ ル伝達機能を果たすという可能性も考慮されている（Stamler，J.S．ら，Proc． Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992)；Stamler，J.S.，Cell，78:931-926( 1994)）。タンパク質のＳ−ニトロシル化はタンパク質機能を調節することがで きるが（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:444-448(1992)；S tamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）、細胞内でのＳ−ニトロソタンパク質 の同定（調節的翻訳後修飾の必須条件）は、これまでのところ実 証されていない。 ヘモグロビンは２つのアルファサブユニットと２つのベータサブユニットから なる四量体である。ヒトHbでは、各サブユニットが１つのヘムを含有し、ベータ （β）サブユニットは反応性の高いSH基（cys β93）をも含有する(Olson，J.S. ，Methods in Enzymology，76:631-651(1981)；Antonini,E．およびBrunori,M． Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands（American Elsev ier Publishing Co.，Inc.，ニューヨーク）の29〜31頁(1971))。これらのシス テイン残基は、その機能はまだ不明であるが、種間で高度に保存されている。 NO（一酸化窒素）は、数ある機能の中でも特に血圧を下げ血小板機能を阻害す る生物学的「伝達分子」である。NOは内皮から血管平滑筋および血小板へ自由に 拡散し、神経単位のシナプスを横切って生物学的応答を引き起こす。条件によっ ては、NOと細胞および血清中に存在する他の成分との反応によって、毒性の中間 体と産物が、感染性生物の増殖を阻害するのに有効な組織内局所濃度で生成しう る。したがって、NOまたはその生理活性型の有効濃度を投与する方法は、ある種 の医学的障害に有益であろうと考えることができる。 血小板活性化は、血液凝固および血栓症素因の本質的な要素である。また、血 小板の活性化は、局所的な血栓症が痛みを伴う発症の中枢であると考えられる鎌 状赤血球症などの血液異常において見られる。したがって、血小板凝集の阻害は 、心臓発作、鼓動およびショック（転移血管内凝集）において、ならびに末梢血 管疾患、心臓疾患、脳疾患、肺疾患およびアテローム性動脈硬化症のような慢性 状態において重要な治療目標である。研究者らは、前記疾患段階の全てにおける 酸素送達を促進するために人工ヘモグロビンを与える試みをなしている。しかし ながら、最近オルセン（Olsen）および共同研究者らによって指摘されたように 、非誘導ヘモグロビンの投与は、血管損傷部位での血小板活性化を導く（オルセ ン，Ｓ．Ｂ．(Olsen，S．B.)ら、Circulation 93:327-332（1996））。この主要 な問題は、専門家を、無細胞非誘導ヘモグロビンが血管疾患または凝固異常を有 する患者において血液凝固を生じるという重大な危険を提起すると結論する方向 に導いている（マーカス，Ａ．Ｊ．（Marcus，A．J.）およびＪ．Ｂ．ブローク マン(J．B．Broekman)、Circulation 93:208-209（1996））。新規な酸素キャリ アーの提供方法および／または血小板活性化の阻害方法は、血管疾患を有する患 者またはさもなければ血栓症の危険のある患者に利益があるであろう。発明の概要 本発明は、ヘムの酸化を回避する方法におけるＨｂとＳ−ニトロソチオールと の反応による、ＳＮＯ−Ｈｂ（治療に使用するオキシ−、デオキシ−、またはメ ト−ヘモグロビン等を含むＳ−ニトロソヘモグロビン）の製造および単離方法に 関する。また、本発明は、該方法の工程に依存して、ヘムＦｅが酸化されてもよ く、または酸化されなくてもよいヘモグロビンの単離されたニトロソ化誘導体（ チオールまたは金属でのニトロシル化を含む）および単離されたニトロ化誘導体 の製造方法も含む。また、本発明は、酸素を送り込むこと、遊離ラジカルを捕捉 すること、または組織にＮＯ+基もしくは他の型の生理活性ＮＯを放出すること が望ましい状態に対する治療方法に関する。その様々な型およびその組合せのＳ ＮＯ−Ｈｂ（オキシ、デオキシ、メト；具体的にはＳ−ニトロシル化、または様 々な程度のニトロソ化もしくはニトロ化）を含有する組成物は、これらの方法に おいて動物またはヒトに投与し得る。また、チオールおよび／またはＮＯ供与剤 を含有する組成物を投与して、ＮＯ+基の転移を促進することもできる。ヘモグ ロビンのニトロソ化型もしくはニトロ化型による処置対象の状態の具体例として は、虚血損傷、高血圧、アンギナ、再灌流損傷および炎症ならびに血栓症によっ て特徴付けられる疾患などが挙げられる。本発明のさらなる態様は、血中ＳＮＯ −Ｈｂおよびニトロシルヘモグロビンを測定することにより哺乳動物の組織への 酸素送達を評価する方法である。図面の簡単な説明 図1A〜1Dは、実施例１に記載の異なる型のHbの分光グラフである。 図2Aは、Ｓ−ニトロシル化によるSNO-Hbの生成を経時的に示すグラフである。 図2Bは、オキシ型およびデオキシ型SNO-Hbの分解を経時的に示すグラフである 。 図3Aは、赤血球に対するＳ−ニトロソシステインの負荷を経時的に示すグラフ である。挿入図は、実施例３に記載するHbの形態の一連の分光グラフである。 図3Bは、ウサギ大動脈環を実施例３に記載の種々の薬剤で処理した後に、その 大動脈環の等尺性緊張（isometric tone）を記録した一連の軌跡である。 図4Aは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わ すグラフである。 図4Bは、実験に使用したHbの濃度に対するウサギ大動脈環の張力の変化を表わ すグラフであり、ここでは、グルタチオンをも加えて、その効果を図4Aと比較検 討した。 図4Cは、時間に対する生成Ｓ−ニトロソグルタチオン/出発SNO-Hb濃度の比を 表わすグラフであり、オキシ型およびメト型HbからグルタチオンへのNO基転移の 速度を示している。 図4Dは、負荷赤血球から輸出されたＳ−ニトロソチオール種の経時変化を表わ すグラフである。 図５は、様々な用量のオキシHb（▲）、SNO-オキシHb（■）またはSNO-メトHb （●）を与えた後のラットの平均動脈血圧を示すグラフである。 図6A〜6Fは、麻酔した犬にＳ−ニトロソヘモグロビンを投与した後の、血圧（ 図6Aおよび6B）、冠状動脈直径（図6Cおよび6D）および冠状動脈流量（図6Eおよ び6F）を記録した一連の軌跡である。 図７Ａは、血小板凝集における非修飾ＨｂＡ0の効果を図示したグラフである 。血小板の凝集の最大の範囲は、血小板とプレインキュベートしたＨｂＡ（１０ ｎＭ〜１００μｍ）の濃度に対してプロットされている。実験は、実施例９のよ うに行われた。各データポイントでプロットされた垂直の棒は、標準偏差を示し ている。 図７Ｂは、血小板凝集におけるＳ−ニトロソ（オキシ）ヘモグロビンの効果を 図示したグラフである。血小板の凝集の正規化した最大の範囲は、血小板とプレ インキュベートしたＨｂＡ（１０ｎＭ〜１００μｍ）の濃度に対してプロットさ れている。 図７Ｃは、Ｓ−ニトロソ（メト）ヘモグロビンによる血小板の抗凝集効果を図 示したグラフである。 図８は、実施例１０でアッセイされた、１０8個の血小板と相互作用する１、 １０および１００μＭ濃度の天然Ｈｂ、ＳＮＯ−オキシＨｂまたはＳＮＯ−メト Ｈｂに対するｃＧＭＰ（グアノシン３’，５’−サイクリックリン酸）の量を示 す棒グラフである。 図９Ａは、実施例１１記載のように処理されたＨｂＡ0のスペクトル（吸光度 対ナノメーターでの波長）を示すグラフである。スペクトルＡと比較したスペク トルＢの最大吸光度の波長におけるシフトは、ＨｂＡ0へのＮＯ基の付加の程度 を図示する。 図９Ｂは、実施例１１記載の１００倍過剰のＳ−ニトロソグルタチオンで処理 されたＨｂのスペクトルを示すグラフである。 図９Ｃは、実施例１１記載の過剰のＳ−ニトロソシステインで処理されたＨｂ Ａ0のスペクトルを示すグラフである。 図９Ｄは、１００倍過剰のＳ−ニトロソシステインで処置されたラットＨｂの スペクトルを示すグラフである。スペクトルＡは、さらに亜ジチオン酸塩で処理 されなかったニトロソ化Ｈｂを示す；スペクトルＢは、さらに亜ジチオン酸塩で 処理されたニトロソ化Ｈｂを示す。 図９Ｅは、１００倍過剰のＳ−ニトロソシステイン（上の曲線）または１０倍 過剰のＳ−ニトロソシステイン（真ん中の曲線）のいずれかとＨｂＡ0を反応さ せることによる、ニトロソ化Ｈｂ産物の経時的増加を図示したグラフである。Ｈ ｂＡ0を、１００μＭのイノシトールヘキサホスフェートとプレインキュベート したのちに、１０倍過剰のＳ−ニトロソシステインと反応させた（下の曲線、三 角形のポイント）（実施例１１参照）。 図１０は、○：１００ｎｍｏｌ／ｋｇ ＳＮＯ−Ｈｂ、●：１０００ｎｍｏｌ ／ｋｇ ＳＮＯ−Ｈｂ、または■：１０００ｎｍｏｌ／ｋｇ 非誘導Ｈｂでのラ ットの注射ののちのラットの尾状核被殻において測定された血流の経時的変化の パーセントを図示したグラフである（実施例１２参照）。 図１１は、試験したヘモグロビンのモル濃度の対数の関数としてプロットした 、ウサギ由来の大動脈環の張力変化のパーセントを図示したグラフである（実施 例１３参照）。●：１：１のＣＹＳＮＯ／Ｈｂの比でＳ−ニトロソシステインで 処理したＨｂ、○：１０：１のＣＹＳＮＯ／Ｈｂの比でＣＹＳＮＯで処理したＨ ｂ、◆：１００：１の比でＣＹＳＮＯで処理したＨｂ。 図１２は、１７μＭデオキシヘモグロビン、１μＭ ＮＯおよび室内の空気の 連続注入により添加された種々の量の溶解酸素に関する光の波長（ｎｍ）に対す る吸光度のグラフである。最初の溶液（空気の添加なし）の吸光度を約４３０ｎ ｍで最高のピークを有する曲線で示す。５０μｌの空気の連続添加は、曲線をグ ラフの左側にシフトさせる。実施例１４を参照のこと。 図１３は、ヘム：ＮＯの種々の比で作られたニトロシル−デオキシＨｂが酸素 に曝露されたときに、ヘム：ＮＯ比に対してプロットしたマイクロモル濃度とし て（左軸、菱形）、および添加したＮＯの％として（右軸、四角）、ＳＮＯ−Ｈ ｂの収量を示すグラフである。実施例１５を参照のこと。 図１４Ａは、示されたＮＯの濃度に対して、１７μＭヘモグロビンとＮＯとの 混合物に関する示差スペクトル（それぞれ、出発原料のデオキシＨｂのスペクト ルを引いたＮＯとＨｂとの混合物のスペクトル）を示すグラフである。実施例１ ６を参照のこと。 図１４Ｂは、図１４Ｂにおける溶液に添加した一酸化窒素の濃度に対してプロ ットした示差スペクトルのピーク波長を示すグラフである。 図１５Ａは、空気の連続添加に関する示差スペクトル（最初のデオキシヘモグ ロビンスペクトルを引いたデオキシヘモグロビンと空気との混合物）を示すグラ フである。 図１５Ｂは、示差スペクトル（最初のデオキシヘモグロビンスペクトルを引い た、空気の連続添加での２０μＭデオキシヘモグロビンと１μＭ ＮＯ混合物） を示すグラフである。実施例１７を参照のこと。 図１６は、変異体β９３Ａｌａ Ｈｂおよび野生型β９３Ｃｙｓ Ｈｂに関す る２つの示差スペクトル（最初のデオキシヘモグロビンＡ418を引いたヘム：Ｎ Ｏ ２０：１でのヘモグロビンとＮＯ溶液のＡ418）を示すグラフである。実施 例１８を参照のこと。 図１７は、ヘム：ＮＯの種々の比で作られたニトロシル−デオキシＨｂが酸素 に曝露されたときに、ヘム：ＮＯ比に対してプロットしたマイクロモル濃度とし て（左軸、菱形）、および添加したＮＯの％として（右軸、四角）、ＳＮＯ−Ｈ ｂの収量を示すグラフである。実施例１９を参照のこと。 図１８Ａは、種々の最終濃度（水平軸）に達するようにＮＯを添加した種々の 濃度のＨｂ（下記記号）に関する酸化ヘモグロビン（メトＨｂ）のパーセンテー ジ量を示すグラフである。◆は１．２６μＭヘモグロビンを示し、■は５．６μ Ｍヘモグロビンを示し、▲は７．０μＭヘモグロビンを示し、Ｘは１０．３μＭ ヘモグロビンを示す。実施例２０を参照のこと。 図１８Ｂは、図１８Ａと同様の記号で示した濃度で、Ｈｂの溶液に添加したＮ Ｏの最終濃度に対してプロットした酸化ヘモグロビン（μＭ）の収量を示すグラ フである。 図１９は、実施例２１に記載されたように行われた実験における、１０ｍＭ（ でのＮＯ濃度に対してプロットした酸化Ｈｂ（メトＨｂ）の濃度を示すグラフで ある。 図２０Ａおよび２０Ｂは、ウサギから単離した胸部大動脈環におけるオキシＨ ｂ、ＳＮＯ−オキシＨｂ、デオキシＨｂおよびＳＮＯ−デオキシＨｂの収縮作用 を示すグラフである。測定値は、ヘモグロビンまたはＳＮＯ−ヘモグロビン濃度 の対数関数として、大動脈環の張力における増加パーセントである。測定値は、 張力が安定化した後になされた。 図２０Ｃは、１０μＭグルタチオンに添加した、示されたＯ2濃度でのＳＮＯ −ヘモグロビンの対数濃度の関数として、胸部大動脈環の張力における変化パー セントを示すグラフである。 図２０Ｄは、示されたＯ2濃度でのＳＮＯ−グルタチオンの対数濃度の関数と して、胸部大動脈環の張力における変化パーセントを示すグラフである。 図２１Ａおよび図２１Ｂは、それぞれ、示されたＯ2濃度で、示されたように 、Ｓ−ニトロソシステインで処理した赤血球（「一酸化窒素を負荷された赤血球 」）または未処理の赤血球の添加の際に、ウサギ胸部大動脈環の張力における経 時変化を示す一連の４つのグラフである。図２１Ｃは、低酸素条件下（６〜７ト ル）でフェニレフリンで収縮させ、次いで１μＭ ＨｂまたはＳＮＯ−Ｈｂのい ずれかに曝露したウサギ胸部大動脈環の張力における経時変化を示すグラフであ る。 図２２は、実施例２４で測定した静脈血または動脈血におけるＦｅＮＯ／Ｈｂ およびＳＮＯ／Ｈｂの濃度を表す棒グラフである。ＡＴＡ＝絶対気圧。 図２３Ａ〜２３Ｉは、実施例２５で測定した、２１％Ｏ2（図２３Ａ、２３Ｂ および２３Ｃ）において、１００％Ｏ2（図２３Ｄ、２３Ｅおよび２３Ｆ）にお いて、ならびに３つの絶対気圧雰囲気での１００％Ｏ2（図２３Ｇ、２３Ｈおよ び２３１）において、ラットの黒質（ＳＮ）、尾状被殻核および皮質壁での局在 血流に関するＳＮＯ−Ｈｂ（●）およびＨｂ（■）（１μｍｏｌ／ｋｇを３分間 注入）の作用をそれぞれ示すグラフである。 図２４Ａは、実施例２６で試験したように、ＧＳＮＯ、ＳＮＯ−ＨｂまたはＨ ｂの注入の際に、３つの異なる条件（２１％Ｏ2、１００％Ｏ2または３ＡＴＡで の１００％Ｏ2の吹き込まれたＯ2濃度）に曝露中のラットの血圧の変化パーセン トを示す棒グラフである。 図２４Ｂは、実施例２６で試験したように、ＳＮＯ−ＲＢＣ（ＲＢＣ＝赤血球 ）の注入の際に、ラット[ＮG−モノメチル−Ｌ−アルギニンを前投与（＋Ｌ−Ｎ ＭＭＡ）または前投与せず（−Ｌ−ＮＭＭＡ）]の血圧の変化パーセントを示す 棒グラフである。 図２５は、実施例２７に記載したように調製したＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅＩＩ）2 およびデオキシＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯにおいて、Ｓ−ニトロソチオール型で結合 したＮＯおよびヘムで結合したＮＯを測定する光分解化学発光アッセイの結果を 示す棒グラフである。 図２６は、例えば、哺乳動物または鳥類の循環における、（上部パネル）Ｔ構 造でのβ鎖ニトロシルヘムに提案される代替反応および（下部パネル）ヘモグロ ビンのヘムとチオールに結合するＮＯのモデルを表す図式である。発明の詳細な説明 生理学上のヘモグロビンの役割 肺循環路（右心室インポート（inport）−左心室）を横切って起こる赤血球の SNO-Hb含量の増大は、Hb分子が肺でＳ−ニトロシル化されることを示唆している 。肺（Gastonら，(1993)）と血液（Scharfstein，J．S．ら，J．Clin．Invest． 9 4:1432-1439(1995)）に認められる内因性RSNOからHbのSH基へのNO基の選択的転 移は、これらの発見を実証するものである。肺床を横切って起こるHb（FeII）NO レベルの対応する減少は、NOの除去またはヘムからcys β93への分子内転移に関 する肺の役割を明らかにする。総合すると、これらのデータは、COとCO2の排出 およびO2の取り込みを含むことが既に知られている呼吸器系内の小分子とHbとの 機能調節的相互作用のリストを拡大することになる。本明細書に示すように、Hb の酸素化は、cys β93のNOに関連する反応性を増大させる構造変化をもたらすの で、O2は、Hb Ｓ−ニトロシル化のアロステリックエフェクターであると見なす ことができる。 SNO-Hb濃度の動脈−静脈差は、このタンパク質が全身循環系でNO基供与体とし て作用することを示唆している。SNO-Hbが血管運動の緊張状態（vasomotor tone ）を調節する機能を果たすことは十分に示されている。血圧の制御が行われる微 小循環系では、赤血球が内皮表面と緊密に接触する。これらの条件下で、Hbは、 遊離NOの定常状態レベルを急激に減少させることにより脈管構造を収縮すること ができる（Lancaster，J．R.，(1994)）。これは、無細胞Hbを点滴した時に起こ る血圧の上昇に寄与すると考えられる（Vogel，W.M．ら，Am．J．Physiol.，251 :H413-H420(1986);Olsen，S.B.ら，Circulation 93:329-332（1996））。しかし 、このような一過性の高血圧応答は、それに続いてSNO-Hbが生成し、それがこの 効果を打ち消すこと（これは天然に存在する濃度における血圧の低下によって証 明される）と一致する。したがって、SNO-Hbの合成と代謝を支持するという赤血 球の能力は、正常な血流にとって重要である。 哺乳動物は、微小循環系で十分なNO送達を確保するためにユニークな分子機構 を採用したはずである。本明細書中の結果は、Hbが、NOホメオスタシスを達成す るために、電子的切替え機構とコンフォメーション的切替機構の両方を発展させ たことを示唆している。具体的に述べると、SNO-Hb（FeII）O2の金属中心による NO捕捉は、そのメト(FeIII)への変換によって感知される（図1B）。この電子的 切替は、NO基の放出を伴うSNO-Hbの分解に作用する（図3A、3B、4A）。このよう にして、SNO-HbのNO関連活性は、捕捉されたNOの量によって部分的に決定される 。NOの放出が脱酸素化によって促進されることが本明細書で観察されるので、O2 圧の変化はNOの送達を調節する機能をも有する。このアロステリック効果は、NO がミトコンドリアでの呼吸を調節しているので、O2の有効な利用を促進する(She n，W.ら、Circulation 92:3505-3512(1995))。 タンパク質中のＳ−ニトロソチオール基は、NOの代謝および細胞機能の調節と 関連付けられている（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:444- 448(1992)；Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。赤血球中のSNO-Hbの同 定は、細胞内Ｓ−ニトロソタンパク質の最初の証明であり、細胞調節に関するか かるタンパク質の役割をさらに確信させるものである。以前の理論に従って、放 出された遊離のNOがHb自身によって即座に捕捉される場合(Lancaster，J.R.，(1 994))、SNO-Hbがどのようにして血管を弛緩させるのかという疑問が生じる。こ れについては、RSNO活性がチオール受容体へのニトロシル（NO+）転移を伴う（ これはNO関連活性を金属中心での不活化から保護する機能を果たす）ことを示す 研究（Scharfstein，J.S．ら，(1994);Arnelle，D．R.およびStamler，J.S.，Ar ch．Biochem．Biophys．318;279-285(1995)；Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．A cad．Sci．USA 89:7674-7677(1992)）が注目に値する。本明細書に示した発見は 、グルタチオンとのＳ−ニトロソチオール/チオール交換（GSNOが生成する）が 赤血球内で起こること、そしてそれがヘムの酸化状態とリガンドによるその占有 によって左右されることを示している。GSNOが細菌で一定の活性を発揮するには 、無傷のジペプチド（すなわちＳ−ニトロソシステイニルグリシン）がその細胞 膜を横切って輸送される必要がある(DeGroote，M.A.ら，Proc．Natl．Acad．Sci ．USA 92:6399-6403(1995))。下記実施例に示すデータは、Ｓ−ニトロソチオー ル輸送が、真核細胞でも起こることを示す。EDRFによるカリウムチャンネルのチ オール依存的活性化が報告されていることから（Bolotina，V.M.ら， Nature，368:850-853(1994)）、赤血球によって輸出されるGSNOや関連するチオ ール運搬体（Kondo，T．ら、Methods in Enzymology，Packer，L.編，Academic Press，252:72-83(1995)）も、原形質膜内または原形質膜でシグナル伝達を開始 するのかもしれない（Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。もう１つの 可能性も考慮する価値がある。すなわち、Hbがcys β93を介して赤血球膜と会合 するという報告(Salhany，J．M.およびGaines，K．C.，Trends in Biochem．Sci .，13〜15頁(1981年1月))は、接触している内皮表面に対して、おそらくはSNO/S H交換によって、NO基を直接供与するような位置に、Hbを置くことになるだろう 。他のＳ−ニトロソタンパク質によって媒介されるシグナル伝達では、細胞表面 相互作用が機能しているようである（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，89:444-448(1992)；Stamler，J.S.，Cell，78:931-936(1994)）。 高度に保存されたHbのCys β93残基は、ヘム鉄の酸素アフィニティーと酸化還 元力およびその物理化学的性質に影響する(Garel，C．ら，Biochem．123:513-51 9(1982);Jocelyn，P.C.，ら，Biochemistry of the SH Group，243頁，Academic Press，London;(1972);Craescu，C.T.，J．Biol．Chem．261:14710-14716(1986 );Mansouri，A.，Biochem．Biophys．Res．Commun.，89:441-447(1979))。それ にもかかわらず、長年探究されてきたそれらの生理学的機能はまだ謎のままであ る。本明細書に記載の研究は、Cys β93がNO関連シグナルを血管壁に伝達する機 能を果たすという、Hbの新しい感知および調節機能を示唆している。具体的に述 べると、すべての哺乳類と鳥類に共通するCys β93の生理学的機能は、アロステ リック制御の下に、ヘムによって捕捉され得ないNO関連生理活性を送達すること である。したがって、これらのデータは、赤血球内Hbがその回路の微環境によっ てシンク（吸収体）としてもドナー（供与体）としても参加する、NO基の動的回 路を明らかにするものである。このような観察結果は、遊離NOの拡散的な分布と 反応のみに基づく概念的骨格(Lancaster，J.R.，(1994)；Woodおよび Garthwaite，J．Neuropharmacology 33:1235-1244(1994))から生じるパラドック スに解答を与え、一酸化窒素シンターゼやグアニル酸シクラーゼなどの他のチオ ールおよび金属含有（ヘム）タンパク質にも及ぶ意味を包含する。 本明細書に報告する発見は、直接的な治療的意味を持つ。すなわち、血中Hbに よる不活化ゆえのNO関連活性の喪失に関する懸念（Lancaster，J.R.,(1994)）は 、アロステリック制御を受けるRSNOの存在によって回避される。SNO-Hbの型は、 金属中心におけるNO捕捉がもたらす無細胞Hb標品の有害な高血圧特性を持ち得な い。１以上の種々の型の無細胞系SNO-Hb（例えば、SNO-Hb[FeII]O2、SNO-Hb[FeI II]、SNO-Hb[FeII]CO）を含有する組成物は、代用血液として作用するように、 ヒトまたはその他の哺乳動物に薬学的に許容されうる賦形剤で投与することがで きる。Ｓ−ニトロソヘモグロビンによる血流調節は生理学的酸素勾配により制御される 古典的なアロステリックモデルにおいて、Ｈｂは、Ｒ（弛緩した高いＯ2アフ ィニティー）およびＴ（緊張した低いＯ2アフィニティー）と称する２つの二者 択一的構造で存在する。毛細血管を通過する血液の迅速な通過時間は、効率的に Ｏ2を送達するためにはＨｂはＴ構造と仮定することを要する（M．F．Perutz，M olecular Basis of Blood Diseasesの127-178頁、G．Stammatayanopoulos編、(W ．B．Saunders Co.，Philadelphia，1987);Voet，D.とVoet，J．G.，215-235頁( John Wiley & Sons Inc.，New York，1995)。赤血球でのＲからＴへの切替は、 通常はＯ2の第２分子が遊離したときに起こる。また、このアロステリック転移 は、「ＮＯ」と反応可能な２つの高度に保存されたシステインβ９３残基の反応 性も制御する。ＮＯへのチオールアフィニティーは、Ｒまたはオキシ構造で高く 、Ｔまたはデオキシ構造で低い。このことは、ＮＯ基が低いＰＯ2でＨｂのチオ ールから放出されることを意味し、Ｓ−ニトロソヘモグロビン（ＳＮＯ−Ｈｂ） の血中レベルにおける動脈−静脈（Ａ−Ｖ）差を説明する（表２、実施例８ を参照のこと）。脈管構造における（Ｓ）ＮＯの主な機能は、小動脈抵抗により 制御される血流を調節することである（Guyton，A．C．、Textbook of Medical Physiology（W．B．Saunders Co.，フィラデルフィア，1981）の504-513頁）。 これらの血管におけるＳＮＯ−Ｈｂの（部分）脱酸素化(Duling，B.とBerne，R ．M．Circulation Research，27:669(1970);Popel，A．S．ら、(誤植Am．J．Phy siol．26(3)，パート2)．Am．J．Physiol．256，H921(1989);Swain，D．P.とPit tman，R．N．Am．J．Physiol．256，H247-H255(1989);Torres，I.ら、Microvasc ．Res.，51:202-212(1996);Buerk，D.ら、Microvasc．Res.，45:134-148(1993)) が（Ｓ）ＮＯを遊離することにより実際にＯ2送達を促進することが、本明細書 の実施例から示される。即ち、血流を増加させるために、Ｈｂにおけるアロステ リック転移が（Ｓ）ＮＯを放出させるように作用する。 組織へのＯ2送達は、血液のＯ2量と血流の関数である（Dewhirst，M．W．ら、 Cancer Res.，54:3333-3336(1994);Kerger，H．ら、Am．J．Physiol.,268:H802- H810（1995）。血中酸素量は、Ｏ2の結合と放出を促進する肺および全身の微小 脈管構造でアロステリック転移を受けるＨｂによってほとんど決まる（L．Strye r，Biochemistry L．Stryer,編(W．H．Freeman & Co.，サンフランシスコ，1981 )の43-82頁;Guyton，A．C．Textbook of Medical Physiology(W．B．Saunders C o.，フィラデルフィア，1981);Perutz，M．F.，Molecular Basis of Blood Dise asesの127-178頁、G．Stammatayanopoulos編、(W．B．Saunders Co.，フィラデ ルフィア，1987);Voet，D．とVoet，J．G．（John Wiley & Sons Inc.，ニュー ヨーク，1995）215-235頁、208-215頁、224-225、230-245、344-355)）。赤血球 と内皮との間の直接的な接触は、周囲の組織へのＯ2拡散の距離を最小にするこ とによりＯ2送達を容易にすると信じられている(Caro，C．G.ら、Oxford Univer sity Press，Oxford，363(1978))。他方、局所の血流は、組織の代謝要求度によ り調節されている：血流は、低酸素により増加し、Ｏ2供給が要求を越えたとき に減少する(Guyton，A．C.、Textbook of Medical Physio logy（W．B．Saunders Co.，フィラデルフィア，1981）の504-513頁))。これら の古典的な生理学的応答は、内皮誘導性ＮＯおよびその生物学的同等物のレベル の変化により一部媒介されていると思われる(Park，K．H．ら、Circ．Res，71:9 92-1001(1992);Hampl，V．ら、J．Appl．Physiol．75(4):1748-1757(1993))。 この標準概念は、問題を有している。まず、有意なＯ2交換が毛細血管前抵抗 で起こることは複雑である(動脈周囲のＯ2勾配により明らかである；Duling，B. とBerne，R．M．Circulation Research，27:669(1970);Popel，A．S．ら、(誤植 ，Am．J．Physiol．26(3),パート2)．Am．J．Physiol．256，H921（1989）；Swa in，D．P.とPittman，R．N．Am．J．Physiol．256，H247-H255(1989);Torres，I .ら、Microvasc．Res.，51:202-212(1996);Buerk，D.ら、Microvasc．Res.，45: 134-148(1993))。なぜＯ2が組織に到達する前に向流静脈交換で浪費されるのか ？第２に、内皮表面と赤血球との間の直接的な接触は、ＨｂによるＮＯの封鎖に 導く(Stamler，J．S.，Nature，380:108-111(1996)；Perutz，M．F.，Nature，3 80:205-206(1996))。末端動脈（King，C．E．ら、J．Appl．Physiol.，76(3):11 66-1171(1994);Shen，W.ら、Circulation，92:3505-3512(1995);Kobzik，L．ら 、Biochem．Biophys．Res．Comm.，211(2):375-381(1995);Persson，M．G.ら、B r．J．Pharmacol.，100:463-466(1990)および毛細血管(Mitchell，D．とTyml，K .、Am．J．Physiol.，270 Heart Circ．Physiol.，39)，H1696-H1703(1996)）に おけるＮＯの定常状態レベルでの減少は、血管を収縮させ、低酸素性血管拡張を 鈍らせて、赤血球速度を低下させる。この系統の理論は、パラドックス：赤血球 がそれ自体のＯ2送達機能を妨害するように見えるということに導く（図１０Ａ 〜１０ＩでのＨｂのイン・ビボ作用を注目すること）。 毛細血管前抵抗におけるＯ2勾配がＳＮＯ−ＨｂからのＮＯ基放出を促進する という知見は、これらの問題を解決するように思われる。ＳＮＯ−Ｈｂは、ＳＮ Ｏを遊離するＴ構造を仮定することによりヘム鉄でのＮＯの捕捉を埋め合わせる 。具体的には、Ｃｙｓ９３は、デオキシ構造でＮＯ基を供与するのに対し、オキ シ立体構造ではそのようにできない。したがって、Ｏ2勾配は、ＳＮＯ−Ｈｂが 血管を拡張させるか収縮させるかを決定する。言い換えれば、ＳＮＯ−Ｈｂは、 組織ＰＯ2（即ち、末梢動脈Ｏ2勾配）を感知し、次いで、動脈の緊張を制御する 手段としてアロステリック転移を利用する。組織が低酸素の場合（即ち、Ｏ2勾 配が高い）、ＳＮＯが放出されて血流を改善する。しかしながら、Ｏ2供給が需 要を越えた場合（即ち、Ｏ2勾配が小さい）、ＳＮＯ−Ｈｂは、需要系での血流 を低下させる正味の効果を有するＲ構造を維持することによりＮＯ基に保持され る。それにより、ＳＮＯ−Ｈｂは、低酸素による血管拡張と高酸素による血管収 縮の古典的な生理学的応答に寄与する。 本明細書、特に実施例２２〜２６に記載された研究に基づき、下記概念が想像 される。一部ニトロシル化されたＨｂ（Ｈｂ[ＦｅＩＩ]ＮＯ）は、Ｔ構造で肺に 進入する（図２２における静脈測定を参照のこと）。そこでは、Ｓ−ニトロシル 化がＨｂでのＯ2誘導性立体構造変化により容易になる。ＳＮＯ−オキシＨｂ（ ＳＮＯ−Ｈｂ[ＦｅＩＩ]Ｏ2）は、Ｒ構造で全身の循環系に入る（図２２におけ る動脈レベルを参照のこと）。次いで、毛細血管前抵抗での酸素の損失は、「Ｎ Ｏ」を遊離して血管を拡張させるＨｂでのアロステリック転移（ＲからＴへ）に 作用する（特に、図２０Ｄおよび２３Ａ〜Ｃを参照のこと）。Ｈｂから放出され たＮＯは、直接または、ＲＢＣから輸入されるＧＳＮＯのような低質量Ｓ−ニト ロソチオールにより内皮に移される（図４Ｄおよび実施例４を参照のこと；また 、図２０Ｃおよび２４Ａも参照のこと）。したがって、小動脈におけるＯ2勾配 は、Ｏ2送達を高進するのに役立つ：それは、ＮＯ関連活性を放出するＨｂにお けるアロステリック転移を促進して血流を改善する。アッセイ方法 また、本発明は、血液試料中のニトロシル（ＦｅＩＩ）−ヘモグロビンの濃度 を決定し、それにより血液試料を採取した動物またはヒトでのＮＯレベルの尺度 として役立つ方法にも関する。該方法は、血漿中のＳ−ニトロソタンパク質およ び低分子量Ｓ−ニトロソチオールの測定に前もって使用されるものに関する（米 国特許第５，４５９，０７６号；１９９５年１０月１７日。この特許の内容は、 参照によりその全体が本明細書に取り込まれる）。しかしながら、本発明の本来 の焦点は、Ｓ−ニトロソチオールよりもニトロシル（ＦｅＩＩ）−ヘモグロビン のアッセイに関するものである。 赤血球が除去されて分析対象の試料から廃棄される以前の方法と比較して、本 発明方法の対象は、赤血球を用いる。該方法は、Ｓ−ニトロソ−ヘモグロビン（ ＳＮＯ−Ｈｂ）型のヘモグロビンのチオール基と反応したＮＯならびにヘムのＦ ｅ（ニトロシル（ＦｅＩＩ）−ヘモグロビンまたはＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯ）に結 合したＮＯを測定する。表に示したように、静脈血中のＳ−ニトロソ−ヘモグロ ビンのレベルは、Ｈｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯのレベルと比較して無視できる。したが って、静脈血中のＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯのレベルを特異的に測定するためには、 Ｈｂ試料を２つのアリコートに分け、次いで、タンパク質濃度の１０倍過剰のＨ ｇＣｌ2で処理するか処理しない工程を含む必要はない。ＨｂとＨｇＣｌ2との反 応は、ヘムで結合したＮＯを妨害することなく選択的にチオール基からＮＯを除 去する。ＨｇＣｌ2反応から得られたＮＯの値は、有意ならば、Ｈｂ（ＦｅＩＩ ）ＮＯの正確な値を得るためにＨｇＣｌ2反応なしでの測定で得られた全ＮＯか ら差し引くべきである。 本発明の１つの態様において、血液試料をヒト等の哺乳動物から採取し、細胞 を含む固体部分を残りの液体から単離する。次いで、該細胞を標準法により溶解 し、タンパク質画分を溶解液から調製する。一酸化窒素付加物（低分子量Ｓ−ニ トロソチオール（Ｓ−ニトロソチオール、Ｓ−ニトロソグルタチオン等の細胞膜 を通過して自由に拡散できるに足るほど小さいもの）およびＳ−ニトロソ−タン パク質等の高分子量Ｓ−ニトロソチオールを含むニトロソニウム付加物）を定量 する前に、赤血球タンパク質から低分子量分子を分離する（脱塩と称する）工程 により、まず、ＮＯ値にも寄与する赤血球に内在する低分子量Ｓ−ニトロソチオ ールを除くことが好ましい。この工程は、例えば、分子のサイズによる分離に基 づく透析またはカラムクロマトグラフィーを含むことができる。さらなる工程は 、タンパク質画分を、適当な波長の光で照射して種々の型のヘモグロビンからＮ Ｏを遊離する光分解セルのような光分解に付すことである。生じたＮＯをオゾン との反応により検出する。 本発明の１つの態様は、光分解セルを反応チャンバーと検出部分に直接連結さ せ、それにより熱分解器を回避する化学発光装置を利用する。血液タンパク質画 分の試料を直接または、光分解セルに連結した高速液体クロマトグラフィー系ま たはガスクロマトグラフィー系からのクロマトグラフィー溶出物として、光分解 セルに注入する。 次いで、試料を水銀蒸気ランプで照射し、一連の冷却トラップを通し、そこで 、一酸化窒素（亜硝酸塩および硝酸塩等）よりも揮発しにくい液体画分および気 体画分が除去され、セル中には遊離の一酸化窒素のみが残される。次いで、一酸 化窒素をガス流、好ましくはヘリウムにより化学発光分光光度計に輸送する。代 替法では、他の不活性ガスを用いてもよい。 化学発光分光光度計に存在すれば、遊離の一酸化窒素をオゾンとの化学反応に より検出し、デジタルインテグレーターで記録されるシグナルを発生する。所望 ならば、光分解セルでの流速および照度レベルを調節して、Ｓ−ニトロソチオー ル化合物のＳ−酸化窒素結合の完全光分解を生じさせることができる。流速およ び照度レベルは、特定の付加物と、どれが結合しようとも一酸化窒素、ニトロソ ニウムまたはニトロキシルとの間の結合の最適な切断を達成するために、当該技 術分野で利用できる慣用の方法で調節してもよい。 変法として、本発明は、血液試料中に本来Ｓ−ニトロソ−ヘモグロビン（ＳＮ Ｏ−Ｈｂ）を含むＳ−ニトロソチオールの検出方法に関する。この方法は、血液 試料に由来するタンパク質画分中のチオールに付随するあらゆる一酸化窒素の化 学発光、シグナル発生能を不活性化する工程ならびに全一酸化窒素と不活性化後 に残存する一酸化窒素との間の定量的な差を測定することにより、チオール結合 一酸化窒素の量を決定する工程を含む。 この変法の具体的な態様は、血液試料に由来するタンパク質画分を、水銀イオ ン源、好ましくは第一水銀イオン源で処理した後、空気インキュベーションして 、それにより一酸化窒素およびニトロソニウムを酸化して、それらを検出できな いようにする方法に関する。前処理に適する化合物には、Ｈｇ2Ｃｌ2およびその 他の第一水銀イオン塩および有機水銀剤が含まれる。次いで、処理した試料を光 分解セルに注入し、そこでは、ＮＯ+がＮＯ・（一酸化窒素）に変換され、該一酸 化窒素を前述の化学発光法により検出する。Ｓ−ニトロソチオールから特異的に 派生した一酸化窒素の量を、水銀イオン処理試料により発生した化学発光シグナ ルと、光分解セルへの注入前に水銀イオンで処理しない同等の生物学的液体の試 料により発生した化学発光シグナルとを比較することにより決定する。 クレームした発明のさらなる態様において、本明細書に記載された方法を利用 して、血液中のＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯおよびＳＮＯ−Ｈｂレベル、より具体的に は患者由来の静脈血中のＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯをモニターすることにより、一酸 化窒素およびその生理活性な同等物の異常レベルを含む疾患状態の存在を決定す ることができる。静脈血中のＨｂ（ＦｅＩＩ）ＮＯを特異的にアッセイする可能 性は、すでに公知の方法とこのアッセイを区別する。一酸化窒素付加物は、生理 学的系での生理活性一酸化窒素のプールを表す。したがって、病因が一酸化窒素 の異常レベルの作用に由来する疾患状態において、これらの方法は、臨床医が疾 患状態の存在を決定するおよび疾患状態の程度をモニターする手段を提供する。 かかる情報は、臨床医が疾患状態を治療するのに必要な適当な薬理学的介入を決 定することを可能にする。かかる疾患状態および医学的障害には、呼吸困難、敗 血症性ショック、心臓性ショック、循環血漿量減少性ショック、アテローム性動 脈硬化症、高ホモシスチン血症、静脈血栓症、動脈血栓症、冠動脈閉塞、肺塞栓 症、脳血管性傷害、血管線維症、外反性水晶体、骨粗しょう症、精神遅滞、骨格 の奇形、肺高血圧症、悪性腫瘍、感染症、炎症、喘息、麻薬寛容および中枢神経 系障害等が含まれるが、これらに限定されるものではない。さらに、これらの方 法の使用は、これらの疾患に限定されるものではない。この方法は、一酸化窒素 が関与するいかなる疾患状態または医学的障害においても、生理活性一酸化窒素 同等物のアッセイに利用することができる。 下記実施例に記載のデータは、ニトロシルヘモグロビンおよびＳＮＯ−Ｈｂと してヘモグロビンに結合したＮＯの決定を用いて、動物またはヒト患者の組織へ の酸素送達率を評価することができることを示す。血中のニトロシルヘモグロビ ンおよびＳＮＯ−Ｈｂ値は、１つの方法で共に決定することが可能であり、また は、別々の方法で決定することができる。当該技術分野で公知の方法で測定され るような血中酸素のさらなる決定を、ニトロシルヘモグロビンおよびＳＮＯ−Ｈ ｂ濃度の決定と共に用いて、血液試料を採取したヒトまたはその他の哺乳動物の 身体の部位への酸素送達を評価することができる。さらなる態様 本発明の主題は、ニトロソ化剤を細胞に負荷する方法に関し、これを赤血球に 関して図3Aに例示するが、本発明の方法は、より普遍的な方法で行うことができ る。好適なインキュベーションのpH条件とインキュベーションの温度条件は、例 えばpH範囲７〜９（pH8が好ましい）、温度範囲25〜37℃である。赤血球につい ては、Ｓ−ニトロシル型Hbの生成を制限するために、１〜３分の短いインキュベ ーション時間が好ましい。しかし、ニトロソ化剤の細胞内濃度は1mMに達しうる 。 ニトロソ化剤はNO+の良好な供与体であり、かつ、標的とする細胞タイプの細 胞膜を通過して拡散しうるべきである。すなわち、Ｓ−ニトロソタンパク質の分 子量と比較して低分子量であることが好ましい。Ｓ−ニトロソ-N-アセチルシス テイン、Ｓ−ニトロソシステイニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステイン、Ｓ−ニ トロソホモシステイン、有機硝酸塩、有機亜硝酸塩、金属ニトロシル錯体、Ｓ− ニトロ化合物、Ｓ−ニトロソ化合物、チオ亜硝酸塩、ジアゼニウムジオラートお よび、Methods in Nitric Oxide Research（Freelisch，M．およびStamler，J.S ．編）John Wiley and Sons，Ltd.，英国チチェスター（1996）の第7章、71〜11 5頁「Donors of Nitrogen Oxides」（この章の内容はすべて参照により本明細書 に取り込まれる）に定義されるその他の関連ニトロソ化剤がその例である。ニト ロソ化剤は、金属含有タンパク質上の異なる反応基に対して異なる活性を持つ。 ニトロソ化剤は、Hbのヘム鉄の酸化が最小となり、システイン上に認められるよ うなチオール基をニトロシル化する活性が最大となるように選択することができ る。アッセイ方法は、Ｓ−ニトロソチオールを含むニトロソ化産物の検出に利用 可能である。Stamlerら、米国特許第５，４５９，０７６号を参照のこと、この 特許の内容は、参照によりその全体が本明細書に取り込まれる。また、例えば、 Keefer，L．K．とWilliams，D．L．H.，「一酸化窒素のそのニトロソ化産物を介 する検出」Methods in Nitric Oxide Research（Feelisch，M．とStamler，J．S .編）John Wiley and Sons，Ltd.，Chichester，U．K.，1996の35章、509-519頁 を参照のこと；また、Stamler，J．S.とFreelisch，M.，「Ｓ−ニトロソチオー ルの調製と検出」36章、521-539頁、同書を参照のこと。亜硝酸物および硝酸物 は、例えば、Schmidt，H．H．H．W.とKelm，M.，「グリース(Griess)反応による 亜硝酸塩および硝酸塩の決定」33章、491-497頁、同書およびLeone，A．M．とKe lm，M.，「亜硝酸塩および硝酸塩のキャピラリー電気泳動分析と液体クロマトグ ラフィー分析」34章、499-507頁、同上に記載の方法によりアッセイすることが できる。 かかる低分子量ニトロソ化剤を赤血球中で使用して、NO関連活性を組識に送達 することができる。さらに、ニトロソ化剤による赤血球の処理は、赤血球のO2送 達能を増大させるのにも役立つ。また、このような赤血球の処理により、循環系 中で酸素フリーラジカル等のフリーラジカルを捕捉することも見込まれる。例え ば（赤血球を単離する最小限の方法として）患者の身体から全血を採取する工程 、Ｓ−ニトロソロチオール溶液中で赤血球をインキュベートすること等により低 分子量ニトロソ化剤で赤血球を処理した後、該赤血球を同じ患者に再導入する工 程により、赤血球をＳ−ニトロソロチオールで負荷することができ、それにより 、組識の異常なO2代謝、酸素関連毒性、異常な血管緊張、異常な赤血球接着、お よび／または赤血球による異常なO2送達を特徴とするようないくつかのタイプの 疾患および医学的障害を治療することができる。かかる疾患には、虚血性損傷、 高血圧症、ショック、アンギナ、発作、再灌流損傷、急性肺損傷、鎌状赤血球貧 血および住血吸虫症やマラリアなどの血液感染症があるが、これらに限るわけで はない。かかる「負荷」赤血球の使用は、代用血液療法や、移植用器官などの生 きた器官の保存にも及ぶ。場合によっては、別人に由来する負荷赤血球で患者を 処置することが適当なこともあるだろう。 本明細書では、この処置法の作用機序の具体例として、鎌状赤血球貧血を考察 する。鎌状赤血球患者は、急性胸部症候群や肝機能不全などの臨床的症候群とし て顕在化する血管閉塞性クリーゼをしばしば起こす。凝血体質をもたらす内皮細 胞機能不全と赤血球に内在する機能不全は共に、主要な病因である。分子レベル では、VCAMのような血管接着分子の発現が増大して、異常なヘモグロビンを含有 する鎌状赤血球の接着を促進する。したがって、内皮細胞でのサイトカイン発現 を減じ、内皮機能を促進し、赤血球の鎌状化を減衰させることが、主要な治療目 的となる。しかし、現在用いられている治療法は、概して不成功に終わっている 。 赤血球に細胞内NO供与体Ｓ−ニトロソチオール類を負荷するこの新規方法には 、酸素親和力を増大させ（これはまたはそれ自体赤血球の鎌状化を減衰させるは ずである）、赤血球に血管拡張活性と抗血小板活性（これらは血管閉塞性クリー ゼを反転させるはずである）を与えるという効果がある。さらに、一酸化窒素は 、内皮細胞表面での接着分子の発現を減じることにより、内皮機能を回復させる はずである。 本明細書には、Ｓ−ニトロソチオール類またはその他のニトロソ化剤を赤血球 に負荷することを伴う鎌状赤血球病の治療の新規の治療法を記述する。２例の治 療法を挙げる。第１の治療法では、患者自身の赤血球を体外でＳ−ニトロシル化 し（これにより「負荷」赤血球を得る）、次いでその患者に与える。第２の方法 は、赤血球に浸透できるＳ−ニトロソシステインのような薬剤を患者に直接投与 することである。 いくつかの疾患または障害には、NO負荷赤血球の投与が特に望ましい。酸素化 状態から脱酸素化状態に変化すると、あるいはヘムFeの酸化状態が還元された状 態（FeII）から酸化された(FeIII)状態に変化すると、NOがヘモグロビンのチオ ール基から放出され、それが速やかにグルタチオンに転移して、Ｓ−ニトロソグ ルタチオンが生成する。赤血球は、高濃度のグルタチオンを含むことが知られて いる。Ｓ−ニトロソグルタチオンは、NOを効率よく組識に送達する。 もう１つの側面として、本発明は、薬剤の標的となる細胞内でチオール基のＳ −ニトロシル化を引き起こす薬剤を、感染した哺乳動物に投与することによる、 感染症の治療法でもある。例えば、リンパ球への浸透性が高いＳ−ニトロソチオ ールを、HIVに感染した患者に投与することができる。HIVに対するこのような処 置は、患者から単離した血液に対して生体外で用いることもできる。もう１つの 応用では、感染が細菌感染であり、抗細菌剤として使用するＳ−ニトロソチオー ルは、宿主細胞への浸透性と比較して、標的細菌細胞への浸透性が非常に高いも のである（例えばDe Groote，M.A．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 92:6399-6 403（1995）を参照のこと）。別法として、ニトロソチオール類を赤血球内の熱 帯熱マラリア原虫の処理に使用することもできる。 本発明のもう１つの態様は、１以上の金属原子を含有するタンパク質を、酸化 状態を変えたり、その金属原子にNOを結合させるなどの修飾をその金属に加える ことなく、そのタンパク質が１以上のチオール基でＳ−ニトロシル化されるよう に、特異的に修飾する方法である。これは、金属に結合したタンパク質のチオー ル基と特異的に反応するニトロソチオールのようなNO+特性を持つ試薬（例えば 、実施例4Aを参照）を使用することによって達成できる。 ヘモグロビンのヘムに影響を与えないＳ−ニトロソ化法が、考案されている。 SNO-Hb（SNO-Hb（FeII）O2）は、四量体あたり２つまでのSNO基とHb（FeII）O2 から、ヘムFeをFeIIからFeIIIに酸化することなくまたは最小限の酸化のみで合 成することができる。好ましくは、かかるSNO-Hb（FeII）O2組成物中のメトHbの 割合は約10％未満であり、より好ましくは約５％未満であり、さらにより好まし くは約２％未満である。これに対し、Hb（FeII）O2を過剰の一酸化窒素または亜 硝酸塩と共にインキュベートすると、メトヘモグロビン（HbFe［III］）が迅速 （実施例1B）かつ有意な程度に生成する。Hb［FeII］を一酸化窒素と共にインキ ュベートすると、NOがヘムにすばやく結合し、Hb（FeII）NOが有意な程度に生成 する（実施例1A）。 Hb（FeII）O2からSNO-Hb（FeII）O2が生成する速度はさらに速いが（実施例2A 参照）、例えば実施例1CのようにＳ−ニトロソグルタチオンやＳ−ニトロソシス テインをHb（FeII）と共にインキュベートしてSNO-Hb（FeII）を得るなどにより 、対応するSNO-デオキシHb型を得ることもできる。好ましくは、かかるSNO-Hb（ FeII）組成物に見出されるメトHbの割合が約１０％未満であり、より好ましくは 約５％未満であり、さらにより好ましくは約２％未満である。 血管拡張に対する種々の形態のHbの効果（収縮効果、拡張効果または中性効果 ）は、次の３つの要因に依存する：１）ヘムのFeが酸化されているかどうか、２ ）ヘムにO2が結合しているかどうか（すなわち、タンパク質のコンフォメーショ ンがＲ状態にあるか、Ｔ状態にあるかによって決まる酸素化状態）および３）チ オールがNO+の転移を促進するに足る濃度で存在するかどうか。 第１の要因の重要性は図4Aに示されている。Hb（FeII）O2とSNO-Hb［FeII］O2 は血管収縮因子として作用するが、SNO-Hb［FeIII］（FeIIがFeIIIに酸化された メト型）は血管拡張因子として作用する。図4Aは、ヘムに結合した酸素を持ちSN O/Hb比が2であるSNO-Hb［FeII］O2が強力な血管収縮因子として作用することを 示している。 SNO-Hb（FeII）も血管拡張因子である。図2Bは、第２の要因を説明するもので あり、RSNOの分解および転移速度が、オキシ状態にあるSNO-Hbよりもデオキシ状 態にあるSNO-Hbの方がはるかに速いことを示している。 SNO-HbのNO+供与特性が酸素濃度にどのように依存するかかわかる。SNO-Hbは 酸素濃度の低い部位または酸化条件下にある部位で酸素を放出する。SNO-Hbはそ のNO基を放出して、１）ヘムFeのFeIIIへの酸化または２）脱酸素化によるヘム からのO2の喪失のいずれかによる血管拡張を引き起こす。図2Bには、NOがデオキ シ状態でもっともよくSNO-Hbから転移除去されることが示されている。虚血では 、SNO-Hbが脱酸素化し、その後速やかにNOの喪失が起こる。このデータから、１ SNO/SNO-メトHbの比を持つSNO-メトHbは、２SNO/SNO-オキシHbの比を持つSNO-オ キシHbより強力な血管拡張因子であることがわかる。HbのＳ−ニトロシル化がR 状態（オキシコンフォメーション）を誘導することに注目すべきである。したが って、1SNO/SNO-オキシHbの比を持つ１つのSNO-オキシHb分子は、0.1SNO/SNO-オ キシHbの比を持つ10分子のSNO-オキシHbより効力が弱いことになる。 第３の要因は、図4Bに示す結果によって例証される。これらの結果は、SNO-Hb （FeII）O2とSNO-Hb(FeIII)の血管拡張因子効果のチオールによる増強を証明し ている。SNO-Hbから低分子量ニトロソチオール類へのNO+の転移は、Hbがオキシ 状態にあるときと比べてデオキシ状態にあるときの方が効率がよく（図2B）、ま た、オキシ状態にあるときと比べてメト状態にあるときの方が効率がよい（図4C ）。 NOは、SNO-HbからNO+（ニトロシルカチオン）として放出または転移される。S NO-HbのSNO基はNO+特性を持つ。SNO-HbからのNO+の転移は、グルタチオンなどの 低分子量チオール類に対して最も効率よく起こり、ヘムが酸化されている場合（ SNO-メトHb）または該SNO-Hbがデオキシ状態にある場合に最も効率がよい。 ニトロソ化剤、特に容易に細胞、特に赤血球に容易に進入できるものを用いて 、敗血症、ショック、アンギナ、発作、再灌流損傷、急性肺損傷、鎌状赤血球貧 血、赤血球の感染および器官移植等の、影響を受ける組織での生理活性NOの増加 により緩和可能な疾患または医学的障害を有する哺乳動物を治療することができ る。これらの発見がもたらす本発明の一態様は、低分子量チオール類をある形態 のSNO-Hbと共に、前記医学状態に罹っている者などのNOの生理作用を必要とする 哺乳動物に同時投与することにより、SNO-Hbから低分子量チオール種へのNO+の 転移を増大させ、それによって組識にNO生理活性を送達する治療法である。NO放 出の効果をさらに増大させるためには、メトHbまたはデオキシHb（または等価な コンフォメーションまたはスピン状態）のSNO-型をチオールと共に投与すること が好ましい（例えば図2Bを参照のこと）。SNO-メトHbとSNO-オキシHbの混合物、 およびさらにチオール、より具体的にはＳ−ニトロソチオールをも含む混合物を 使用することもできる。これら成分の組成および比率は、その疾患状態に依存す る。例えば、鎌状赤血球貧血症では、O2送達とNO送達の両方を増大させるには、 SNO-オキシHbを含有する組成物を投与することができる。例えば急性呼吸障害症 候群のように、O2のさらなる送達が望ましくない場合は、メトHbおよびデオキシ HbのSNO-型が特に好ましい。別法として、SNO/Hbの比率を調節することによって 、O2放出を調節することもできる。 本明細書に提示された発見から生ずるさらなる発明は、ニトロソ化ヘモグロビ ンおよび低分子量チオールまたはNO供与剤を含有する組成物で器官を灌流するこ とを含む移植等のエクス・ビボでの生きた器官を保存する方法であり、ここで、 SNO-Hb(FeII)O2が好ましいニトロソ化ヘモグロビンである。 図4Aの血管環バイオアッセイのデータは、図５のイン・ビボのデータとよく一 致している。実施例５に記載の実験の結果から、Hb（FeII）O2（オキシHb）がイ ン・ビトロと同様にイン・ビボでも血圧の上昇を引き起こすことが確認される。 SNO-Hb（FeIII）(SNO-メトHb)は、イン・ビトロおよびイン・ビボで血圧の低下 を引き起こす。SNO-Hb（FeII）O2（SNO-オキシHb）は、対応する血管環バイオア ッセイで認められた張力の増大とは対照的に、イン・ビボでは血圧に対して無視 しうる程度の効果しか持たない。SNO-オキシHbの場合、そのイン・ビボの効果は 中立である。これは、ヘムに結合されることになるNOが引き起こす収縮効果が、 脱酸素化時のNOの放出によって相殺されるということによって説明される。した がって、SNO-オキシHbは、血圧に最小限の効果しか与えずにO2を送達することが できる。 本明細書に記載の結果を知れば、血管に対して収縮効果または拡張効果を持つ であろう、あるいは血管に対して何の効果も持たない、予測されたNO放出特性を 持つHbタンパク質を合成することができる。もう１つの選択は、酸素化型を作製 して、それをO2送達が望ましい医学的状態に投与するか、脱酸素化型を作製して 、それをO2送達が望ましくない医学的状態に投与するかの選択である。 特定の望ましいO2およびNO送達特性を持つ様々な修飾Hbを生産することができ る。例えば、Ｒ状態にあるHbまたはＲ構造（オキシHb）は、いくつかの既知の方 法により、Ｔ状態またはＴ構造（デオキシHb）に変換することができる。これは 、例えばイノシトール六リン酸とHbとの反応によって行うことができる。また当 業者には、例えばカルボキシペプチダーゼでHbを処理することなどにより、Ｒ状 態にあるHbを製造できることも知られている。同様に、フェリシアン化物や亜硝 酸塩を使用してメトHbを合成できることも知られている。 Ｔ状態に固定されたHb分子の製造は、NOの運搬体よりはむしろNOの生理活性供 与体の形態で存続するRSNO-Hbの合成を可能にする。Ｒ状態に固定されたHbは、 １分子あたりに最大量のNOを保持するRSNO-Hbを合成するための基質として使用 できる。 本発明のもう１つの態様は、O2放出とNO放出を制御するために、Hbの１以上の チオール基が、ある程度に、特異的にＳ−ニトロシル化されている１以上の形態 のHbからなる代用血液である。処置されるべき状態には、NOもしくはO2送達が望 まれる状態、NOもしくはO2利用が望まれる状態、またはNOもしくはO2が過剰な状 態がある。例えば、過剰な酸素フリーラジカルと過剰なNO・の存在を特徴とする 医学的状態では、SNO-HbのヘムとSNO-Hbによって放出されるNOの両方が、酸素フ リーラジカルを捕捉するのに役立つ。ヘムFeは酸素フリーラジカルとNO・を捕捉 する過程で酸化され、NOはチオールへの供与によって酸化型Hbからの非毒性RSNO+ の形で放出される。例えば炎症と再灌流損傷は、過剰なNO生産と過剰な酸素フ リーラジカルを特徴とする。種々の形態のHbは酸素ラジカルと遊離NOを捕捉し、 NOを毒性でない形態に変換する。 本発明のさらなる態様は、Ｓ−ニトロソヘモグロビン等のニトロソ化Hb型の単 独からなる、または例えば低分子量チオールと組み合わせた代用血液の投与に基 づく、生理活性型のNOもしくはO2の送達またはその両方が有益な状態の治療法で ある。例えば、SNO-Hbは心筋梗塞の処置に有用である。SNO-HbはNOを供与し、血 管を広げておく効果を有する。SNO-Hbは低酸素圧で脱酸素化して、酸素を送達す ると共に同じ部位でNOを放出し、それによって血管拡張を引き起こす（実施例７ および図6A〜6Fを参照のこと）。SNO-Hbの投与と同時に、またはその前後に、チ オールを投与することによっても、これらの効果を増大させることができる。例 えば、心筋梗塞を処置するためには、低いSNO/SNO-Hb比を持つ高濃度または高投 与量のSNO-Hbがふさわしい。別法として、SNO-メトHbをこの目的に使用すること もできる。これらの原理のさらなる応用は、図23A〜23Iに示すように、S-ニトロ ソヘモグロビンを含有する組成物を哺乳動物に投与することを含む、哺乳動物で の脳血流を増加させる方法である。 もう１つの側面として、本発明は、SNO-Hbまたは他の型のニトロソ化Ｈｂを、 そうしなければＳ−ニトロシル化されていないHbにおけるオキシHbからメトHbへ の変換によって消費されるであろうニトロソ血管拡張薬（例えばニトログリセリ ン）と同時投与することにより、NO供与体療法を強化する方法でもある。低分子 量チオールを含有する組成物は、哺乳動物での血管拡張応答を生じる効果を有す ることができる（実施例22および図20Dを参照のこと）。本明細書に記載の単離 されたいかなる型のHbも、医薬に含まれるHbの１または複数の特定の型の効果か ら相応しいように、一酸化窒素および／または酸素代謝の異常を特徴とする医学 的状態の治療用医薬の製造に使用することができる。 血小板活性化は、多数の事象および内皮下層などの非血小板表面への血小板の 接着に応答して起きる反応によって明らかにされる。膜リン脂質を加水分解する 一連の事象の進行におけるトロンビン、エピネフリンまたはコラーゲンのセット などのアゴニストの結合は、アデニル酸シクラーゼを阻害し、細胞内カルシウム に移動性を持たせ、非常に不可欠な細胞内タンパク質をリン酸化する。活性化に 続いて、血小板は、その顆粒含有物を血漿に分泌し、次に近接した血小板の止血 栓への結合を許容させる（Harrison's Principles of Internal Medicine，第１ ２版、Ｊ．Ｄ．ウィルソン，（J．D．Wilson,）ら、マクグロー−ヒル社(McGraw -Hill，Inc.)、ニューヨーク、１９９１の348-351頁を参照）。 血栓は、循環系内に形成された血の病理学的な凝固である。それは、その最初 の位置に付着したままでもよいし、または今まであった位置から移動し、循環系 内の新規な部位に移動してもよい。血栓塞栓症は、今まであった位置から移動し た血栓または血栓の一部が部分的にまたは完全に血管を閉塞し、影響が及ぼされ た組織への酸素輸送を妨げる時に起こり、ついには組織壊死を生じる。 傷害が血管の表面に起こっている部位は、特に血小板の接着および血栓の形成 を受けやすい。これらの部位としては、内皮への傷害、血管の狭くなったところ もしくは血管の狭窄、またはアテローム性動脈硬化症プラーク蓄積が起きている 血管の内部表面にある部位があげられる。 ＮＯは、血栓形成の初期段階を調節する生理学的物質として定義されるいくつ かの内皮由来血栓制御因子の１つである。特に、ＮＯは、考えられるに、血小板 グアニル酸シクラーゼを活性化することにより、内皮細胞表面における血小板接 着、活性化および補充を減少させ、これを達成し、それによって、血小板細胞内 ｃＧＭＰを増加させ（スタンラー，Ｊ．Ｓ．(Stamler，J．S.)ら、Circ．Res．6 5:789-795(1989)）、血小板内Ｃａ2+レベルを減少させる。ＮＯおよびプロスタ サイクリン プロスタグランジン（ＰＧ）Ｉ2は、共同的に作用して、内皮下層 マトリックスのコラーゲン繊維からの血小板解離を阻害および積極的に媒介する 。また、プロスタサイクリンと違い、ＮＯは、血小板接着をも阻害する。さらに 、血小板はＮＯを合成し、Ｌ−アルギニン−ＮＯ経路は、内在性の負のフィード バック機構として作用して、血小板反応性を制御する。ＮＯは、白血球と血管壁 との相互作用に関与し、好中球凝集を阻害し得る（論評記事、デービス，Ｍ．Ｇ ．（Davies，M．G.）ら、British Journal of Surgeny 82:1598-1610(1995)参照 ）。 ＮＯは、多数の方法において抗アテローム形成である（例えば、キャンディパ ン，Ｒ．Ｃ．（Candipan，R．C.）ら、Arterioscler．Thromb．Vasc．Biol．16: 44-50，1996を参照）。ＮＯは、平滑筋増殖を阻害し、ＬＤＬ（低密度リポタン パク質）酸化および他のオキシダント関連過程を弱める。 ヘモグロビンは、そのＮＯ捕捉特性の結果としてアテローム性動脈硬化症なら びに血栓症を促進する。このヘモグロビンの限界は、一酸化窒素に対するその高 い親和性から得られる。イン・ビトロでは、ＮＯは、血小板凝集ならびにコラー ゲン繊維、内皮細胞マトリックスおよび単分子層への接着の有力な阻害剤である （ラドムスキー，Ｍ．Ｗ．（Radomski，M．W.）ら、Br．J．Pharmacol．92:181- 187（1987）；ラドムスキー，Ｍ．Ｗ．ら、Lancet 2:1057-1058(1987)；ラドム スキー，Ｍ．Ｗ．ら、Biochem．Biophys．Res．Commun．148:1482-1489（1987） ）。ＮＯは、血小板におけるｃＧＭＰレベルを上昇させ、それによって、血小板 結合フィブリノーゲン分子を減少させ、細胞内Ｃａ++流動および血小板分泌を阻 害する（メリオン，Ｂ．Ｔ．(Melllon，Ｂ．T.)ら、Blood 57:946-955（1981） ；メンデルソン，Ｍ．Ｅ．(Mendelson，M．E.)ら、J．Biol．Chem．165:19028-1 9034（1990）；リーベルマン，Ｅ．（Lieberman，E.）ら、Circ．Res．68:1722- 1728(1991)）。Ｈｂによる一酸化窒素の捕捉は、その分子が血小板を阻害するの を妨げる。この説明は、イン・ビボ研究により支持されている（クレジシー，Ｋ ．(Krejcy，K.)ら、Arterioscler．Thromb．Vasc．Biol．15:2063-2067（1995） ）。 図７Ａ〜７Ｃに示された結果（実施例９参照）は、ＳＮＯ−Ｈｂを含むニトロ ソ化ヘモグロビンを、増加した血小板析出、活性化および血栓形成の結果として 起きる急性の血液凝固事象または血小板および凝固タンパク質の消耗の治療に、 治療上有効量で用い得ることを示している。かかる合併症は、当業者に公知であ り、例えば、心筋梗塞、肺血栓塞栓症、大脳血栓塞栓症、血栓静脈炎、敗血症お よび不安定アンギナ、ならびに前述の障害の結果として直接的または間接的いず れかで起きるいかなる追加の合併症があげられるが、これらに限定されるもので はない。 また、ＳＮＯ−Ｈｂおよび他のニトロソ化ヘモグロビンを予防的に用いて、例 えば、血栓症の個人歴もしくは家系図を有する患者、アテローム性動脈硬化性血 管症を有する患者、慢性うっ血性心不全を有する患者、悪性疾患を有する患者、 または妊娠した患者もしくは手術後の固定された患者などの再発の血栓症の危険 のある患者における血栓の発生を妨げることができる。 ＮＯは、ｃＧＭＰを生成する可溶性のグアニル酸シクラーゼを活性することが 知られている。ｃＧＭＰは、血小板凝集の阻害を媒介する。実施例１０の結果は 、この血小板凝集の阻害がｃＧＭＰ単独ではなく、さらにいくつかの他の機構に よって媒介されているかもしれないことを立証している。 特定の化合物または条件は、四量体の２つの可変的な四次構造、Ｔ構造または Ｒ構造のいずれかに対するＨｂのアロステリック平衡転移におけるシフトを起こ すことが知られている（例えば、ペルツ，M(Perutz，M.)、Mechanisms of Coope rativity and Allosteric Regulation in Proteins，Cambridge University Pre ss、ケンブリッジ、イギリス、１９９０の７〜２８頁参照）。これらは、例えば 、異型のリガンドＨ+、ＣＯ2、２，３−ジホスホグリセリン酸（２，３−ＤＰＧ ）およびＣｌ-であり、その濃度は酸素親和性を調節する。異型のリガンドは、 Ｔ構造を特異的に安定化して強いる追加の水素結合を形成することによって酸素 親和性を低くする。アロステリック平衡に影響する他の化合物としては、イノシ トールヘキサホスフェート（ＩＨＰ）およびベザフィブレート(bezafibrate)お よびクロフィブレートなどのフィブリン酸誘導体が含まれる。フィブリン酸誘導 体、抗脂血症剤は、デオキシヘモグロビンと結合するが、オキシヘモグロビンと は結合しないことがわかっている。それらは、ＤＰＧ結合部位とは異なる中央の 腔にある部位と結合することによってＴ構造を安定化させる。ベザフィブリン酸 塩に関連する他のアロステリックエフェクターは、合成されている。Ｒ構造を特 異的に安定化するリガンドは、酸素親和性を増加させ、Ｔ構造を安定化するリガ ンドは、逆である。他のリガンドは、ヘムのスピン状態に影響しうる。例えば、 デオキシヘモグロビンおよびメトヘモグロビンにおいて、鉄は高スピン鉄（Ｓ＝ ２）で、５つ配位結合する；オキシヘモグロビンおよびシアン−メトＨｂにおい て、鉄は低スピン鉄（Ｓ＝０）で、６つ配位結合する；H2Oが６番目のリガンド であるとき、メトヘモグロビンも高スピンである。図７Ｃにみられる血小板凝集 のＳ−ニトロソ−メトヘモグロビンによる阻害は、高スピンコンホメーションに おける促進された能力と一致する。ヘモグロビンのアロステリック平衡状態また はスピン状態をコントロールする物質は、ヒトまたはその他の哺乳動物に医薬組 成物で治療上有効量で投与して、ヘモグロビンの特定のアロステリック構造およ び／またはスピン状態の形成を促進したり、特定のアロステリック構造およ び／またはスピン状態を安定化して、それによりヘモグロビンをＲ構造からＴ構 造に変換すること等により、血小板の活性化を調節することができる。 血小板阻害の目的で、ＮＯを送達するために必要とされるＨｂの投与量を滴定 して、血圧の劇的な変化を生じさせない効果的な量のＮＯが提供される。治療の 目的が酸素を送達することであるならば、Ｈｂは、血圧の低下を回避するために 血液単位で投与してもよい。治療の目的が発作を緩和することであるならば、心 筋梗塞に与えられる量と比較して、ごくわずかのHbしか投与され得ない。心筋梗 塞に与えられる量と比較して、Ｈｂは非常にわずかしか投与されない。発作に対 しては、より重要な目標は、酸素を送達することよりもむしろＮＯを送達するこ とである。この目的のためには、好ましくは、連続的注入または１日あたり数回 の注入を用いてもよい。実施例１２（図１０参照）は、ラット脳における血流で のＳＮＯ−Ｈｂ（ＦｅII）Ｏ2の効果が２０分間にわたって持続することを示す ；他の実験においては、効果は１時間までの間みられた。血圧効果および血小板 阻害効果の間に相関があるが、血小板阻害は、血圧効果を生じるために必要とさ れるよりも低いＮＯ濃度で起き、一般的により長く続く。 実施例１１は、Ｓ−ニトロソチオールを用いて、ＮＯ基をヘモグロビンのシス テイン残基のチオール基だけでなく、ヘモグロビン分子の他の反応部位にも付加 することができることを示す。実施例１１のニトロソ化反応の生成物は、Ｈｂ四 量体あたり２個より多いＮＯ基を有するヘモグロビン分子であった。ＮＯの付加 の正確な部位は、確かめられていないが、ＮＯ付加が金属を含むＨｂ内のチオー ル基および様々な他の求核性部位で起きることが期待される。チオール基後、反 応部位は、チロシン残基およびアミン、ならびに他の求核性中心である。 他のタンパク質におけるニトロソ化反応は、以前に研究されている（Simon，D ．I.，ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:4736-4741(1996)）。タンパク質を 修飾してニトロソタンパク質を製造する方法は、当該分野において公知であり、 例えば、３７℃で１５分間０．５Ｍ ＨＣｌ（酸性化されたNO2 -）中でＮａＮ Ｏ2にタンパク質を曝露する方法などが含まれる。他の方法としては、１００ｍ Ｍリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４中のタンパク質のヘリウム脱酸素化溶液を透析 チューブ内に入れ、１５分間透析物中にバブリングしたＮＯガスにタンパク質を 曝露することである（Stamler，J．S.ら、Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:444- 448(1992)；また、ニトロソ化のさらなる方法を提供するWilliams，D．L．H．Ni trosation，Cambridge University Press，New York（1988）参照）。 これらの方法により、複数のＮＯ関連修飾（ニトロソ化、ニトロシル化または ニトロ化から得られた「ＮＯ基」または「ＮＯ生物学的同等物」）は、Ｈｂにお いて求核性部位で行うことができ、求核性部位としては、チオール、アルコール においてみられるような求核性酸素原子、アミンにおいてみられるような求核性 窒素原子、またはヘム鉄があげられ得る。ヘモグロビンと接触してＨｂのニトロ ソ化、ニトロシル化またはニトロ化を促進可能な薬剤は、「ＮＯまたはＮＯ+供 与剤」として考えることができる。かかる修飾の生成物は、例えば、-SNO、-SNO2 、-ONO、0NO2、-CNO、-CNO2、-NNO、-NNO2、-FeNO、-CuNO、-SCuNO、SFeNOなど の基ならびにそれらの異なるイオン化型および酸化派生型などの基を有していて もよい（ヘモグロビンのＣｕ++による酸化について、Winterbourne，C.，Bioche mistry J．165:141-148(1977)を参照のこと）。タンパク質におけるＮＯ基のス ルフィドリル残基への共有結合は、Ｓ−ニトロシル化として定義される；ＮＯ基 のＦｅなどの金属への共有結合は、ニトロシル化と呼ばれ、金属−ニトロシル錯 体を生じる。本明細書において、通常の求核中心へのＮＯの結合は、ニトロソ化 と呼ばれる。このように、本明細書に使用されるニトロソ化ヘモグロビンという 用語は、ＳＮＯ−ＨｂおよびＨｂ（ＦｅII）ＮＯ、ならびにチオールおよび金属 に加えて他の部位でニトロソ化された他の型のヘモグロビンを含む。さらに、Ｈ ｂは、ニトロ化されてもよい。複数の異なるタイプの求核部位で一酸化窒素供与 化合物でニトロソ化および／またはニトロ化されているＨｂ（それぞれ、ポリニ トロソ化、つまりチオールおよび他の求核部位に付加されたＮＯ同等物を 有する；またはポリニトロ化と呼ぶ）を含有する組成物は、ニトロソ基転移反応 ならびに循環系における種々の速度および発生する異なる能力でのＮＯおよびそ の生物学的同等物の放出を可能にする。酸化されているかもしれないヘムＦｅを 還元することを所望するならば、ポリニトロソ化またはポリニトロ化ヘモグロビ ンを、ＦｅIIIを選択的にＦｅIIに還元する試薬（例えば、シアノボロヒドリド またはメトヘモグロビンレダクターゼ）と反応させることができる。 これらならびに他のニトロソ化反応およびニトロ化反応は、ある条件下で、あ る範囲までのヘムＦｅの酸化を起こすことができる。しかしながら、ある程度の 少ない酸化は、許容可能である。少ない程度までの酸化であれば、ニトロソ化Ｈ ｂは、いまなお治療剤として有用である。ニトロソ化ＨｂのＯ2送達機能よりも むしろＮＯ送達機能がより望ましい適用に対しては、ヘム鉄の広範囲の酸化が許 容可能である。 ヘム鉄の酸化を回避することが望ましいならば、ヘムを除去し、タンパク質に 対して必要な化学的反応を行って望ましい範囲までニトロソ化し、ヘムを修飾さ れたヘモグロビン産物中に再配置することが可能である。（ヘムの除去および再 配置について、Antonini，E.およびBrunori，M.，Hemoglobin and Myoglobin in their Reactions with Ligands，Elsevier，New York，1971を参照）。 実施例１および２に示したように、低分子量ＲＮＳＯ種への短時間の曝露など のヘムを酸化しない条件下でのニトロソ化に加え、他の方法を用いて、ヘムＦｅ が酸化されないニトロソ化ヘモグロビンを生成することができる。例えば、組み 換え法によってαグロビン鎖およびβグロビン鎖を生成し、それらを所望の程度 までニトロソ化し、次に該鎖をヘムと会合させて機能的ニトロソ化四量体を形成 することが可能である。（例えば、１９９６年３月１３日に公表された欧州特許 出願ＥＰＯ第７００９９７号、「ヘモグロビンおよびそのアナログの細菌および 酵母における製造」を参照のこと）。 最終産物としてメトＨｂ型を製造することなく、αグロビン鎖およびβグロビ ン鎖をニトロソ化する他の代替法は、無傷のＨｂの分子を所望の程度までニトロ ソ化し、それによってヘムＦｅを酸化させ、次にメトヘモグロビンリダクターゼ またはナトリウムシアノボロヒドリド（cyanoborhydride）などのシアノボロヒ ドリドのいずれかでニトロソ化Ｈｂを処理することによってヘムFeをFeIIIからF eIIに還元する方法である。 一般に、NOガスとして溶液状態にある一酸化窒素は、次に挙げる２つの主要な 様式でヘモグロビン（Hb）と反応すると考えられてきた：１）デオキシHbと反応 して安定なニトロシル（FeII）ヘム付加物を形成、および２）オキシHbと反応し て硝酸塩とメトHbを形成（NOを不活化する反応）。これら２つの反応は、HbがNO のスカベンジャーであるという概念の一因となっている。これらの反応のどちら でも、NOの生物学的活性は失われる。ここに記述する結果は、実際には、どちら の反応も生理的条件下では起こらないことを立証するものである。むしろ、NO/H b反応の生成物は、NOとHbの比およびHbのコンフォメーション、すなわちＲ（オ キシ）対Ｔ（デオキシ）によって決まる。 NO対デオキシHbの比が低い場合（例えば１：100以下の場合）は、Hb分子はＴ 構造をとる。この条件では、気体としてHb溶液に導入されたNOは、EPRによって 観察されているように、α−ヘムに結合する。酸素が導入されると、Ｒ状態への 転移と共に、NOがシステインのチオールに転移されて、100％近い効率でS-ニト ロソヘモグロビンを与える。NO/Hbの比が１：25〜１：50の場合、SNO-Hb形成の 効率は約35％である（NO/Hb比が増加するにつれて低下する）。この反応は、α ヘムからβヘムを経てβチオールに至るNOの移動を伴うようである。ヘムからチ オールへの移動に際して、ヘムまたはニトロソチオールは酸化によって電子を失 う必要がある（NO→NO+またはRSNO・→RSNO）。酸素はこの系における電子受容 体として働き、熱力学的に反応を駆動すると共に、ヘムでのその結合によってコ ンフォメーション変化を引き起こし、それがチオール基を露出させることになる 。NO対Hbの比がさらに高い場合（１：20〜１：２）、タンパク質はＴ構造にとど まったまま、βヘムからNO-を遊離させてメトHbが生成する。これはO2の不在下 で起こり、βヘムに結合したNOが不安定であることのもう一つの表れである。い ったんO2が導入されるとS-ニトロソチオール（SNO）が生成するが、その相対収 率はNO-への損失のために極めて低い。SNO-Hbの収率は、酸素の導入時に、１： ２のNO/Hb比でほぼ零に近づく。 NO対Hbの比がさらに高い場合（すなわち＞0.75〜１）は、NOそのものがＲ構造 を維持する。この条件では、分子への並外れた束縛ゆえに、NOはより安定である 。具体的に述べると、βヘムからのNOの喪失がＴ構造を促進するのに対し、SNO- Hbの形成はＲ構造を選択する。これは有利な反応ではない。その結果、少量のS- ニトロソヘモグロビンが生成するが、その収率は低い（約５％）。これはこの分 子が治療的価値を持つ可能性を排除するものではない。 NOのオキシHbとの反応も、NO対オキシHbの比に依存する。NO対Hbの比が比較的 高い（非生理的）条件（NO／オキシHb＞１：20）では、NOはO2と近位ヒスチジン の間の水素結合を（それに関する競争によって）不安定にして、多少のメトHbを 与えるようである。溶媒緩衝液のイオン組成を変えることにより(例えば0.2Mホ ウ酸塩、pH7.4)、NOが過剰（NO/Hb＝３：１）であっても、メトHbの形成を有意 に低下させることができる。これに対し、pH7.4の酢酸緩衝液ではメトHb形成が 促進され、O2と近位ヒスチジンの間の水素結合が破壊されると、O2はスーパーオ キシド様の特性を獲得するようである。そうするとNOは迅速に反応して、メトHb と硝酸塩を形成する。効率のよいメトHb形成には、実際には過剰のNO/オキシHb が必要である。これに対し、NO/Hbの比が低い場合（＜１：20）は、わずかな残 存率のデオキシHb（＜１％）と反応し、その結果、S-ニトロソヘモグロビンを極 めて効率よく生成させる。NOの濃度が上昇するにつれて、オキシHbとの反応がい くらか起こるが、生成物は亜硝酸塩と硝酸塩であって、硝酸塩だけではない。結 論としてNOは、それを硝酸塩に変換することにより、O2結合機能を不活化するこ となく、オキシHbの反応混合物中でインキュベートできる。 ニトロシルヘモグロビンは、疾患または医学的障害に冒された組織へのNOまた はその生物学的活性型の送達によって軽減されうる疾患または医学的障害を予防 または治療するための治療用NO供与体として、動物またはヒトに使用できる。ニ トロシルヘモグロビンは生理的条件下でSNO-Hbに変換されうるので、SNO-Hbと同 様にニトロシルヘモグロビンも代用血液として投与できる。NOは脱酸素化または メトHbへの変換によってチオールから放出される。 呼吸サイクルにおける一酸化窒素のヘモグロビンとの反応を図26に図解する。 図26の上図は、Ｔ構造をとっているβ鎖ニトロシルヘムについて提案される代替 反応を示す。（１）NOのα鎖ヘム鉄への転移（これはおそらく主に微小循環およ び静脈系で起こるだろう）、（２）ヘム鉄での電荷移動反応によるメトヘモグロ ビンとニトロシル陰イオンの生成（これはNO合成量が高い場合に微小循環および 静脈系で起こるにちがいない）、および（３）酸素が駆動するＲ構造へのアロス テリック転移によって媒介されるβ-Cys93とのNO基交換により、SNO-Hb（FeII） O2が生成（これは肺で起こると思われるが、酸素化された動脈血でも起こりうる ）。例えば実施例15を参照されたい。四角形、円および菱形はそれぞれＴ構造、 Ｒ構造およびメト状態にあるヘムを表す。 図26の下図は、循環中のHbのヘムとチオールに対するNO結合のモデルを表す。 部分的にニトロシル化された静脈血は、（おそらくはヘムに対するNOの、および アミンに対するCO2の、α鎖結合によって維持される）デオキシまたはＴ構造（ 四角形）で肺に入る。具体的に述べると、NOは、α（5-および6-配位）ニトロシ ルヘムとして大静脈中に検出でき（Westenberger，U.ら，Free Rad．Res．Commu n．11:167-178（1990）；Hall，D.M.ら，J．Appl．Physiol．77:548-553（1994 ）；Kosaka，H.ら，Am．J．Physiol．266:1400-1405（1994）；Kagan，V.E．ら ，Nature 383：30-31(1996)）、そのうちの一部は完全に脱酸素化された血液の 画分中に見出される。肺では、部分的にニトロシル化された（カルバミノ）Hbが より高いNO分圧とO2分圧（pO2）にさらされ、それらがアロステリック転移を ヘムからβ鎖チオールへのNO基交換と共役させるようである（例えば実施例24と 25を参照されたい）。酸素はβチオールをβヘムの近くに配置させる（Riggs，A ．およびWolbach，R.A.，J．Gen Phsyiol．39：585-605(1956)）と共に、酸化還 元によるSNOの形成を熱力学的に駆動する働きをする。したがって、動脈回路に 入る血液はSNO-オキシHb（すなわちβ-Cys93に結合したNOとヘムに結合したO2を 持つＲ構造のHb（円））を含有する。肺と動脈血中に存在する低分子量SNOは、 Ｒ構造分子のニトロソ基転移反応によるSNO-Hb形成をさらに支持する（実施例１ ）。次に、血圧と組織への血流を制御する抵抗血管中に移動した血液は低いpO2 にさらされ、それがSNO-HbにおけるＴ構造を促進し、NO基の放出をもたらす。一 部のNOは低相対質量チオールと交換して血管を拡張し、一部はヘムに自己捕捉（ autocapture）されるだろう（β→α；ちょうど一部の内皮由来NOがヘムによっ て必然的に封鎖されるのと同様である；実施例３参照）。ヘム鉄のNO酸化（メト Hb形成）もSNO-Hbの血管拡張薬機能を高めるだろう。例えば実施例４を参照され たい。O2送達は血流の関数であるから、HbにおけるＲ→Ｔ転移（そしておそらく メトHb形成）は酸素送達が最大になるように設計されている。Hbは静脈系を通っ て前進する際に、そのヘム鉄にNOをさらに結合でき、より多くのNOが結合するほ ど、メトHbとヘモグロビンＸ［Hb（αFeIIINO）(βFeIII)］を形成する傾向が強 くなる。HbにおけるＴ構造を促進するはずである約0.1％というニトロシルHbの 内生レベルがO2送達を増進するのに足りるかどうかは不明だが、内毒素ショック 時に見出されるさらに高いレベル（Kosaka，H.ら，Am．J．Physiol．266:1400-1 405（1994））はO2送達を増進するだろう。 吸入されたNOは、全身反応に影響を及ぼすことなく、選択的な肺血管拡張を引 き起こす。その使用を支えている過去に形成された理論的根拠は、Hbによる補集 が有害な全身作用を防ぐというものである。実施例14〜21に、強力な血管拡張お よび抗血小板薬であるS-ニトロソヘモグロビンを生成させるためにNOを使用でき ることを例証する。吸入NOは、内生S-ニトロソヘモグロビンのレベルを上昇させ るために使用できる。同様に、NOによる赤血球（RBC）の処理は、SNO-RBCまたは 「負荷された（loaded）」赤血球を形成させるために使用できる。 良好なNO供与体であるがそのNOを極めて迅速に放出するであろうSNO-デオキシ Hbや、より緩慢にそのNOを放出するだろうが時間が経過するとメトHbを形成する 傾向があるSNO-オキシHbと比較して、NO：ヘムの最終比が約１：100未満または 約0.75以上であるような形態で保存されたニトロシル−デオキシヘモグロビンは 安定である。これらのNO：ヘム比ではメトHbの形成が防止される。このため、そ のようなNO：ヘム比で生理学的に適合した緩衝液中に保存されたニトロシル−デ オキシヘモグロビンは、NO供与体として動物またはヒトに投与できる。ニトロシ ルヘモグロビンを含有する赤血球もNO供与体として使用できる。ニトロシルヘモ グロビンを含有する赤血球は、NOを含有する溶液中で、脱酸素化された赤血球を インキュベートすることを含む方法で製造できる。 NO供与体として使用でき、非誘導体型Hbの血管収縮薬効果を持たない代用血液 または治療血液は、オキシHbの溶液（オキシHbの形で保存された溶液を含む）を 得て、NOを溶存ガスとして添加してSNO-オキシHbを得ることによって製造できる 。緩衝液条件とNO：Hb比は、実施例21と図19で説明するように、酸化型Hb（メト Hb）の有意な生成を伴わずにS-ニトロソチオールを与えるように最適化できる。 例えば10mMリン酸緩衝液（pH7.4）中のオキシヘモグロビンに１：30未満のNO：H b比で添加されたNOは、最小量のメトHb形成を伴ってSNO−オキシHbの形成をもた らす。この比は緩衝液条件を変えることによって（例えばpH7.4の10mMリン酸塩 、200mMホウ酸塩を使用することによって）増加させうる。緩衝液陰イオンは緩 衝液濃度と共に注意深く選択されるべきである。例えば酢酸塩と塩化物はホウ酸 塩とは逆の効果を持ち、200mM（pH7.4）でメトHbと亜硝酸塩の形成を増加させる 。 これは、近位His残基のイミダゾールとの水素結合に関する遊離のNOと酸素の 間の競争によって説明できる。低濃度のNOを使用すると、低イオン強度の緩衝液 （例えば10mMリン酸塩）中ではメトHbが容易には生成しない。緩衝液のイオン強 度を増すことによって水素結合を弱めると、NOはオキシHbと容易に反応するよう になって、より多くのメトHbを与える。pH7.4より低いpKaを持つ緩衝液はFeIII を安定化する傾向がある。反応条件より少なくとも2pH単位高いpKaを持つ緩衝液 が好ましい。 NO-の供与体として作用する代用血液を製造できる。NOは１：100〜１：２の範 囲のNO：Hb比でデオキシHbの溶液に添加でき、約１：10のNO／ヘム比が好ましい 。NO：ヘムの比を約２のNO：Hb（この場合、HbはまだＴ（デオキシ）状態にある ）まで増加させると、電子受容体／フリーラジカルスカベンジャーの不在下で、 NOは、ヘム鉄の酸化によるメトHbの形成を伴って、βヘムからNO-として放出さ れる。その生成物溶液は代用血液または治療用NO供与体として使用できる。NO- は脳卒中時のN-メチル-D-グルタミン酸による脳損傷を防ぐことができ、この効 果はNOでは見出されていない。 ニトロシルヘモグロビンは、NOを組織に送達するために動物またはヒトに投与 できる、広範なNOのニトロシル−ヘム含有供与体群の一つである。NOのニトロシ ル−ヘム含有供与体には、例えばニトロソ化（本明細書に定義するところの「ニ トロソ化（nitrosated）」）ヘモグロビン、ニトロシルヘモグロビンおよびSNO- ニトロシルヘモグロビン、ニトロシル−ヘム、およびヘム鉄が異なる金属（例え ばCo++、Mg++、Cu++）で置換されているかヘムがニトロシル−ポルフィリンで置 換されている置換型ヘモグロビンなどがある。 本願出願人は、NO供与体をHbに結合させることに理論的根拠を与える生理学的 に重要な結果を教示する。そのような誘導体型Hbはそれら自体がNO供与性治療薬 として役立ち、例えば代用血液として投与される非誘導体型Hbの副作用を改善で きる。Hbによって放出されるNOはヘムによって直ちに補集されるだろうと考えら れていたので、かつては、これらの化合物は役に立たないだろうと考えられてい た。また、放出されたNOはHbを酸化し、酸素送達を制限するだろうとも考えられ ていた。ニトログリセリンやニトロプルシドなどのNO供与体の投与は、この根拠 により、従来から制限されてきた。これらはメトHbの形成を引き起こすと考えら れていたからである。 ヘモグロビンに共有結合されるNO供与体は比較的長寿命であって、ヘモグロビ ンへの化学結合に使用できる少なくとも一つの官能基を持つことが好ましい。NO 供与体の例には、ニトロプルシド、ニトログリセリン、ニトロソチオール類、構 造1を持つジアゼニウムジオラート（diazeniumdiolte）類（「NONOエート（NONO ate）」とも呼ばれる）などがある。 Ｘ＝［Ｎ（Ｏ）NO］-→Ｘ-＋2NO（pH7.4、37°） １ （Ｘ＝求核性残基） ジアゼニウムジオラート 生理的pHにおいて陰イオンとして活性化なしにNOを放出するこれら種々の化合 物が合成されている（Keefer，L.K.ら，Am．Chem．Soc．Symposium Ser．553:13 6-146(1994);Hanson，S.R．ら，Adv．Pharmacol．34:383-398(1995)）。全身投 与は、反応式１に従って全組織に及ぶ効果をもたらしうる。しかし、NOと酸素の 組織選択的送達をもたらすために、ヘモグロビンへの結合を使用できる。例えば 、共有結合的にエステル化されたNO供与体は主として肝臓で活性化されうる。種 々のNO供与体を選択してヘモグロビンに連結することにより、様々なNOのHbから の制御放出速度が得られる。 例えば化合物４（下記）は、NO放出に関して37℃、pH7.4で約２週間の半減期 を持つジアゼニウジオラートである。これはその求核性N-4メルカプトエチル誘 導体である化合物５に変換できる。ヘモグロビンは、それをγ−マレイミド酪酸 N-ヒドロキシスクシンイミドエステルと反応させることによって、カップリング 反応のために活性化できる。その場合、化合物５は、そのマレイミド官能基を介 して、活性化ヘモグロビンに共有結合させうる。付加生成物６は、pH7.4のリン 酸緩衝液中、37℃で、数日間にわたって絶え間なくNOを発生させうる。この特性 は例えば非誘導体型代用血液の副作用を軽減できる。 Hbと共同して働く一酸化窒素シンターゼ（NOS）はヘムにNOを再添加でき、し たがってNOSとHbを含む組成物またはHbと複合体化したNOSは、組織に対するNOの 送達を促進できる。ニューロンのNOSは酸素分圧に反応するので、ニューロンNOS がこの組成物にとって好ましい。低い酸素分圧ではニューロンNOSはより多くのN Oを生成し、高い酸素分圧ではNOSがより少ないNOを生成する。この形態のNOSは 、Hbが脱酸素化されると、ヘムにNOを効率よく再添加するだろう。NOS-Hb複合体 は、代用血液が必要である場合、とりわけ虚血性の損傷または状態が存在する場 合に使用できる。 生物学的に適合した電子受容体は当技術分野でよく知られており、例えばスー パーオキシドジスムターゼや、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド（NAD+） 、ニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸（NADP+）、フラビンアデニン ジヌクレオチド（FAD）、フラビンモノヌクレオチド（FMN）、アスコルビン 酸、デヒドロアスコルビン酸およびニトロキシドスピントラップの酸化型などが あるが、これらに限定されない）。１つまたは複数の電子受容体をHb分子と共役 させることができ、NOがNO+の形でまたはRSNO・としてβ93Cysチオール基に転移 する際に失う電子を受容することにより、ニトロシル-Hb-電子受容体型のSNO-Hb -電子受容体型への変換を促進できる。 ニトロキシドは、フリーラジカルスカベンジャーとしても作用するそのような 電子受容体群の一つである。ニトロキシドは、スーパーオキシドジスムターゼ（ SOD）のそれによく似た抗酸化剤触媒活性を持つことが示されている安定なフリ ーラジカルであり、イン・ビボに存在する場合は、他の物質と相互作用してカタ ラーゼ型の活性を発揮できる。ニトロキシドはヘモグロビンに共有結合されてい る。Hsia，J-C.，米国特許第5,591,710号（その内容はそのまま参考文献として 本明細書に取り込まれる）を参照されたい。また、ニトロキシド結合型ウシ血清 アルブミンと、その複合体で試験されたマウスの様々な器官間の弁別的なニトロ キシド濃度について記述しているLiebmann，J.ら，Life Sci．54:503-509（1994 ）も参照されたい。 スーパーオキシドジスムターゼ（SOD）をHbに化学的に結合する方法は当技術 分野で知られている。例えばQuebec，E.A.およびT.M．Chang，Artif．Cells．Bl ood Substit．Immobil．Biotechnol．23:693-705(1995)やD'Agnillo，F．および Chang，T.M.，Biomater．Artif．Cells Immobilization Biotechnol．21:609-62 1（1993）を参照されたい。ニトロシルヘモグロビンに結合されたSODは、電子受 容体として働くことにより、NOがヘムからチオールに転移される反応を駆動でき る。 NOと同様に、COも血管拡張作用を持つことが知られている（Zakhary，R．ら， Proc．Natl．Acad．Sci．USA 93:795-798（1996）を参照されたい）。デオキシ ヘモグロビンの溶液は、それを溶液中の精製COガスにCO結合型Hbが所望の程度に 達するまでばく露することによって、COで誘導化できる。CO誘導化Hbは、非誘導 化ヘモグロビンの作用（例えば高血圧、腸痛、腸不動症など）を緩和するために 、代用血液として投与でき、または他のヘムに基づく代用血液と同時投与できる 。ヘモグロビンは、収縮剤効果を克服するために必要な程度まで（例えばCO/Hb の比が約0.1％〜10％の範囲になるまで）誘導化できる。 αサブユニットはヘムからのNO+受容基として働くチオール基を持たないので 、β鎖のみを含有する代用血液またはα鎖とβ鎖の組み合わせを含有する代用血 液とは異なる特性を持つα鎖を含有する（例えば二量体型や四量体型の）代用血 液を製造できる。ヘモグロビンのα鎖からなる代用血液は、例えば低血圧ショッ クなどでNOによって引き起こされる作用を特徴とする状態を緩和するために、動 物または人間の患者に投与できる。 β鎖はα鎖とは異なり、NOのトラップとしてではなく、むしろ組織に対するNO の活性な供与体として働く。例えばβ二量体やβ四量体などの形態のβ鎖を含有 する代用血液を製造できる。そのような代用血液は、酸素とNOまたはその生物学 的同等物を疾患（例えばアンギナ）および他の虚血状態に冒された組織に送達す ることが望まれる疾患または医学的障害を治療するために、哺乳動物に投与でき る。 ヘモグロビンをそのαサブユニットとβサブユニットに分離し再構成する方法 は知られている。ヘムを含有しない分離されたアルファグロビンとベータグロビ ンは、ヘモグロビンのヘム含有アルファおよびベータサブユニットから調製され ている（Yip，Y.K．ら，J．Biol．Chem．247:7273-7344(1972)）。天然のヒトヘ モグロビンは、ヘムを含まない分離されたアルファおよびベータグロビンとヘミ ンから完全に再構成されている。ヘムはまずアルファグロビンサブユニットに添 加されることが好ましい。次いで、ヘムを含まないベータサブユニットに、その ヘム結合型アルファグロビンを錯化させる。最後に、その半分充填されたグロビ ン二量体にヘムを加え、四量体型ヘモグロビンを得る（Yip，Y.K．ら，Proc．Na tl．Acad．Sci．USA 74:64-68（1997））。 ヒトのアルファおよびベータグロビン遺伝子は、それぞれ16番染色体と11番染 色体上にある。どちらの遺伝子もクローニングされ、配列決定されている（Lieb haberら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 77:7054-7058(1980)(アルファグロビン ゲノムDNA);Marottaら，J．Biol．Chem．252:5040-5053（1977）(ベータグロビ ンcDNA)；Lawnら，Cell 21:647(1980)(ベータグロビンゲノムDNA)）。 ヘモグロビンの分離されたαサブユニットとβサブユニットの生産には、組換 え法を利用できる。例えばNagaiとThorgerson（Nature 309:810-812(1984)）は 、ラムダcIIタンパク質の31アミノ末端残基、Ile-Glu-Gly-Argリンカーおよび完 全なヒトベータグロビン鎖からなるハイブリッドタンパク質を大腸菌中で発現さ せた。彼らはそのハイブリッドを血液凝固因子Xaを使ってリンカーの直後で切断 することにより、ベータグロビン鎖を遊離させた。後に、Nagai，K．ら（Proc． Natl．Acad．Sci．USA 82:7252-7255（1985））は、組換えDNA由来のヒトベータ グロビン、天然由来のヒトアルファグロビンおよびヘムの供給源を利用して、活 性なヒトヘモグロビンの製造に成功している。 ヒトアルファグロビン用の効率のよい細菌発現系が報告されている（1987年５ 月16日に出願されたGB 8711614；WO88/09179も参照されたい）。これは、不溶性 グロビンサブユニットを別個の細菌細胞系で個別に発現させ、酸化型ヘム補因子 の存在下にそれらの鎖をイン・サイチュで再折りたたみして四量体型ヘモグロビ ンを得ることにより、完全に合成的なヒトヘモグロビンの製造につながった。合 成ヒトヘモグロビンは酵母細胞で生産されている（EP 700997A1（出願日10.05.1 990））。 ヘモグロビンの特性はアルファ１のLys99とアルファ２のLys99の間でアルファ 鎖を特異的かつ化学的に架橋することによって変えられている（Walder，U.S．4 ,600,531および4,598,064；Snyderら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 84:847280- 7284(1987);Chaterjeeら，J．Biol．Chem．261:9927-9937(1986)）。この化学的 架橋は、イノシトールヘキサリン酸の存在下でビス（3,5-ジブロモサ リチル）フマレートをデオキシヘモグロビンＡと反応させることによって達成さ れた。また、ベータ鎖も化学的に架橋されている（Kavanaugh，M.P．ら，Bioche mistry 27:1804-1808（1988））。このような連結法や他の適当な方法は、αま たはβ二量体もしくは他の多量体を製造する方法や、α鎖とβ鎖への他のポリペ プチドの架橋に適合させうる。（タンパク質を誘導化したりタンパク質を複合体 化するさらなる方法については、Hermansoh，G.T.，Bioconjugate Techniques， Academic Press，1996を参照されたい）。 本明細書で使用するヘモグロビンまたはHbという用語には、１以上の連続もし くは不連続アミノ酸残基の付加、欠失および／または置換により異なった天然も しくは人工的な突然変異型、または１以上の残基が修飾された修飾ポリペプチド および１以上の修飾アミノ酸残基を含有する突然変異体が含まれる。また、Hbは 、化学修飾型、融合タンパク質のような遺伝子改変型、および欠失型も含まれる 。また、あらゆる動物種のHbおよびそれらの変種型も含まれる。これらの変種Hb の生物学的特性および／または化学的特性は、動物中に天然に認められるヘモグ ロビンの特性とは異なってもよい。 NOが生体系中で一酸化窒素ガスとしてだけではなく、種々の酸化還元型でも存 在し、またＳ−ニトロソタンパク質、Ｓ−ニトロソアミノ酸その他のＳ−ニトロ ソチオール種を含みうるＳ−ニトロソチオール類のような、一酸化窒素の生理活 性付加物としても存在することは理解されるだろう（Stamler，J.S.，Cell，78: 931-936(1994)）。 代用血液は、酸素の運搬および／または送達、NOの運搬および／または送達、 フリーラジカルの捕捉などといった、哺乳動物に認められる天然血液の１以上の 機能を果たす生物適合性の液体でありうる。代用血液は、哺乳動物中に注入され た時に天然の血液の１以上の機能を果たすような液体の１以上の成分からなって もよい。代用血液の例には、１以上の形態のヘモグロビンを含有する組成物が含 まれる。かかる組成物は、ニトロソ基転移を行う、低分子量のチオール、ニトロ ソチオールまたはＮＯ供与剤などの他の生理活性成分をも含んでいてもよい。低 分子量チオール（即ち、タンパク質およびその他の生物学的巨大分子に比べて） は、グルタチオン、システイン、Ｎ−アセチルシステイン、Ｓ−ニトロソシステ イニルグリシン、Ｓ−ニトロソシステインおよびＳ−ニトロソホモシステインを 含むことができる。 医学的処置に使用される本発明の化合物と治療用組成物は、当業者が決定でき る適当な組成物中で、治療上の有効量で使用されるものとする。その医学的障害 に冒された部位または系に最も適した投与法は、当該技術分野で知られている。 代用血液として使用される種々の型のヘモグロビンの好ましい投与方法は、静脈 内注射である。好適な組成物は、１または複数の生理活性成分と共に、当業者に 公知の緩衝液、担体、安定化剤または不活性成分を含んでいてもよい。 本発明の目的の「治療上の有効量」という用語は、その意図する目的を達する のに効果的な修飾Ｈｂおよび／またはニトロソ化剤の量をいう。個体によって変 える必要があるが、投与する各化合物の効果的な量の最適範囲の決定は、当業者 の技術の範囲内である。イヌ、ヒヒまたはラットなどの実験動物を用いて、投与 量を決定できる。通常、有効量の組成物または標品を提供するために必要な投与 量は、当業者によって調整可能であり、レシピエントの年齢、健康、肉体状態、 性、体重、症状の程度、処置の頻度ならびに所望の効果の性質および範囲に依存 して変化する。当業者は、従来の考察を用いることにより（例えば、適当な従来 の薬理学的プロトコルを利用することにより）、特定の患者に対する投与量を決 定することができる。例えば、ヘムに基づく代用血液の適切な用量を決定する用 量応答実験は、約１ｎＭ〜１００μＭのヘムの生理学的濃度を産するのに必要な 投与量を決定するために行うことができる。必要ならば、好適な医薬担体または 賦形剤を、治療用組成物に使用する作用成分と混合してもよい。 本発明を以下の実施例でさらにより詳しく説明するが、これに限定されるもの ではない。 実施例アッセイ用の物質および方法 R-S-NO濃度の決定（標準Saville法） 試料中のR-S-NO基の濃度は、Saville，Analyst 83:670-672(1958)で報告され た方法に基づく。水銀イオンによりチオールから置換された、NO基の定量は、こ の高感度方法の根拠を形成する。検出限界は、0.1〜0.5μMの範囲である。 2RSNO＋Hg2+→Hg(RS)2＋2NO- （5） NO+＋Ar-NH2→Ar-N2 +＋H2O （6） Ar’＋Ar-N2 +→Ar-N＝N-Ar’ （7） （式5〜7に）示したように、反応は２段階で進行する。１段階目で、NO+は水銀 イオンによりRSNOから置換され、スルファニルアミド（Ar-NH2）と酸性条件下で 反応する。２段階目で、ジアゾニウム塩（これはチオ亜硝酸塩と等量形成される ）は、次いで芳香族アミンである、N-(1-ナフチル)-エチレンジアミン(Ar')と結 合されて、540nm(ε〜50,000M-1cm-1)で測定することができる、強く発色された アゾ色素を形成する。取り除かれた水銀塩を用いて同じアッセイを行うことによ り、亜硝酸塩の同時検出が可能である。原則として、Saville手法の2番目は、亜 硝酸塩の検出のための古典的なGriess反応の類似物である。 該手法は、以下のとおり： 溶液A：0.5M HClに溶解した1%のスルファニルアミド 溶液B：0.2% HgCl2にAで用いたのと同じ溶液 溶液C：0.5M HClに溶解したN-(1-ナフチル)-エチレンジアミンジヒドロクロリド の0.02%溶液 アッセイされる既知量(50μl〜1ml)の試料を等量の溶液Aと溶液Bに添加する。 その2つの試料を5分間静置し、ジアゾニウム塩の形成を行い、その後、等量の溶 液Cをそれぞれの混合液に添加する。アゾ色素生成物を示す、色形成は、 通常、5分までに完了する。次いで、試料吸光度を、540nmで分光測光法的に読む 。RSNOを、溶液BとAとの間の吸光度における差として定量する。(即ち、B-A)。 バックグラウンドの亜硝酸塩が高い(即ち、Aでのバックグラウンドが増加される )場合、スルファニルアミドの添加5分前に酸(45mM)中に等量の0.5%アンモニウム スルファメートの添加により、測定値の精度を増加させることができる。溶液中 の亜硝酸は、過剰なアンモニウムスルファメートと速やかに反応して窒素ガスと 硫酸塩を形成する。 試料中の500μMを超えるチオールの濃度は、亜硝酸塩もマイクロモルの濃度で 存在すれば、アッセイを妨げる。亜硝酸塩は、使用される酸性条件下で無差別に ニトロソ化するので、チオールは、その濃度がミリモルの範囲に達すると、（こ のアッセイにおいて50mMで存在する）スルファニルアミドとの反応について効果 的に競争するだろう。これは、RSNOの人工的な検出を導く。(1)スルファニルア ミドに対するチオールの割合を0.01未満に維持する、(2)初めに、溶液中のチオ ールをアルキル化する、又は(3)潜在的な人工産物を中和するために標準品に遊 離チオールを添加することにより、前記問題を回避することができる。 Ｓ−ニトロソヘモグロビンとニトロシル(FeII)-ヘモグロビンのアッセイ 生体系においてRSNO類（Ｓ−ニトロソチオール）を測定するのに用いていた、 高感度の光分解−化学発光方法論を用いた(Gaston，B.ら，Proc．Natl．Acad．S ci．USA 90:10957-10961(1993);Stamler，J.S.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7674-7677(1992))。該方法は、チオールからのNOの光分解遊離を含み、次い でそれをオゾンとの反応により、化学発光分光計で検出する。同じ原理の実験を ニトロシル-金属化合物からのNOを開裂（及び測定）するために用いることがで きる(Antonini，E．とBrunori，M.，Hemoglobin and Myoglobin in Their React ions with Ligands，American Elsevier Publishing社，ニューヨーク，29-31頁 (1971))。光分解セル中の流速を調節して、Hb(FeII)NOのNOリガンドの完全 な光分解を達成する。SNO-Hb、Hb(FeII)NO、およびＳ−ニトロソグルタチオンの 合成調製物由来の標準曲線は、直線(R>0.99)で、実質的に重ね合わせることがで き、そして約１nMの限界感度を示した。次いで、２つの分析基準がHb(FeII)NOか らSNO-Hbを確実に区別することを発見した：1）Hb(FeII)NOが水銀攻撃(challeng e)に抵抗する間、10倍過剰のHgCl2で試料を前処理することによりSNO-Hbからの シグナルを削除した；そして2）HgCl2を用いたSNO-Hbの処理では、（標準Griess 反応により）亜硝酸塩を定量できる収量で生成したのに対し、Hb(FeII)NOの同様 の処理では生成しなかった。UV/VIS分光学で、残存するNOが過剰なHgCl2の存在 下でヘムに結合することを確認した。 我々は、光分解セルを、化学発光装置（モデル543熱エネルギー分析器、Therm edix，Woburn MA）の反応チャンバーと(熱分解器をバイパスする)検出部分とに 直接結合した。試料(5〜100μl)を光分解セル(Nitrolite，Thermedix，Woburn M A)中に直接導入するか、接続した高速液体クロマトグラフィー又はガスクロマト グラフィーシステムからのクロマトグラフィー流出物として導入する。このセル は、ホウ素シリケートガラスコイル（3m×外径0.64cm×内径1mm，6cmの直径およ び12cmの幅に曲げられた）からなる。試料をヘリウムのパージ流(5リットル/分) で導入し、次いで(テフロンタワー上の光分解コイルの中央部に垂直に据え付け た)200-W水銀−蒸気ランプを用いて照射する。光分解コイルからの流出物を一連 の冷却トラップに向け、そこで液体の画分と、一酸化窒素より揮発性でない気体 状（亜硝酸塩及び硝酸塩など）の画分を除去する。次いで、一酸化窒素をヘリウ ム流により、化学発光分光計内に運び、その中で遊離一酸化窒素をオゾンを用い た反応により検出する。シグナルをデジタルインテグレーター（モデル3393A，H ewlett-Packard）で記録する。Savilleの方法の基づいたセルからの流出物の分 析により確認したように、Ｓ−ニトロソチオールのS-N結合の完全な光分解を達 成するように光分解セル内の流速と照明レベルを設定した(Saville，B.，Analys t 83:670-672(1958))。 試料中で検出された全一酸化窒素のどの画分がＳ−ニトロソチオール由来のも のであるかを決定するため、いくつかの対照測定を行った。水銀イオンを用いて Ｓ−ニトロソチオールから選択的に一酸化窒素を置換した(Saville，B.，Analys t 83:670-672(1958))。測定した一酸化窒素濃度と、代わりにHgCl2で前処理した 又は前処理していない試料との比較により、光分解で得られた一酸化窒素がＳ− ニトロソチオールに特異的に由来することが確認された。同様に、確認の追加測 定の際に、我々は、代わりに光分解の照明に感光させたまたは感光させていない 試料中の一酸化窒素濃度を比較することにより、Ｓ−ニトロソチオールと遊離一 酸化窒素とを区別した。 分光測定法的実験とニトロシルヘモグロビン形成のための方法、実施例14〜20 精製ヒトHbA0をApex Biosciencesから得た（Antonini，E.とBrunori，M.，Hem oglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands，American Elsevier Publishing社，ニューヨーク(1971)）。使用した分光光度計は、Perkin Elmer UV/vis分光計Lambda 2Sであった。全ての添加を行い、密封した石英キュベット 中23℃で全ての測定を行った。脱酸素化を、密封した石英キュベット内のHb溶液 中にアルゴンを通すことにより達成した。脱酸素化の程度は、UV/visスペクトル により測定することができる。ヘムのニトロシル化を、精製したNOガスのデオキ シHbへの添加により達成し、その生成物を前記のAntoniniとBrunoriに従って、 吸光係数により定量した。実施例１：NOおよびRSNOのHbとの相互作用 NOやRSNOなどの天然に存在するN-オキシド（Gaston，B.ら，Proc．Natl．Acad ．Sci．USA 90:10957-10961(1993)；Scharfstein，J.S.ら，J．Clin．Invest.， 94:1432-1439(1994)；Clancy，R.M.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，91:3680- 3684（1994））は、Hbとの反応に関して、著しく異なることが観察された。 NOは、極めて迅速にデオキシHb（Hb［FeII］）に結合して比較的安定なHb［FeII ］NO錯体を形成し（図1A）、オキシHb（Hb［FeII］O2）をメトヘモグロビン（Hb [FeIII]）と硝酸塩に変換し（図1B）、過去の報告（Olson，J.S.，Methods in E nzymol．76:631-651(1981);Toothill，C.，Brit．J．Anaesthy.，39:405-412（1 967））を追認している。これに対し、RSNO種は、Hbのスルフヒドリル基とのニ トロソ基転移反応に参加してＳ−ニトロソヘモグロビン（SNO-Hb）を生成するこ とがわかり、デオキシHbまたはHb（FeII）O2いずれかのヘム中心とは反応しなか った（図1Cおよび1D）。 Ａ．NO のデオキシHbとの相互作用 一酸化窒素の濃度を増大させると、Hb（FeII）のインキュベーションにおいて 、デオキシHb（Hb［FeII］）のHb（FeII）NOへの変換が観察される。図1Aを参照 せよ。ａ．デオキシHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のNOと Hb（FeII）の反応混合物。反応生成物Hb（FeII）NOは、実質上、NOの添加の瞬間 に（すなわち、装置の不感時間以内に）生成した。 Ｂ．NO のオキシHbとの相互作用 NOの濃度を増大させると、オキシHbのインキュベーションにおいて、オキシHb （Hb［Fe［II］O2）のメトHb（HbFe[III]）への変換が観察される。図1Bを参照 せよ。ａ．オキシHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のNOとオ キシHbを含有する反応混合物。メトヘモグロビンの生成は、NOの添加の瞬間に（ すなわち、装置の不感時間以内に）起こった。 Ｃ．Ｓ−ニトロソチオール類のデオキシHbとの相互作用 GSNO（表示）またはＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）のデオキシHbとのイン キュベーションにおいて、Hb（FeII）のSNO-Hb（FeII）への変換が観察される。 RSNOのHbのヘム官能基との相互作用は（あったとしても）ほとんどない。図1Cを 参照せよ。ａ．デオキシHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1、2:1および10:1の GSNOとHb（FeII）の反応混合物。スペクトルは、ｂとｃでは60分間のインキュベ ーションの後、ｄでは15分後に記録した。反応生成物をさらに分析したところ、 いずれの場合にも、ほどほどの量のSNO-Hbの生成が認められた。60分の時点での ｂ、ｃおよびｄにおけるSNO-Hb（S-NO/Hb）の収率は、それぞれ2.5%、5%および1 8.5%であった（図1Dおよび図2Aを参照）。 Ｄ．Ｓ−ニトロソチオール類のオキシHbとの相互作用 GSNO（表示）またはCYSNOのオキシHbとのインキュベーションにおいて、Hb（F eII）O2のSNO-Hb（FeII）O2への変換が観察される。Hb（FeII）O2のヘム中心に おけるGSNO（またはCYSNO）の反応は（あったとしても）ほとんどない。すなわ ち、ヘムに対するO2結合能は、RSNO種によって影響されない。図1Dを参照せよ。 ａ．オキシHb。ｂ、ｃ、ｄ．それぞれ比率が1:1、2:1および10:1のGSNOとオキシ Hbの反応混合物。スペクトルは、分光光度計中で60分間のインキュベーション後 に記録した。反応生成物をさらに分析したところ、いずれの場合にも、SNO-Hbの 生成が認めれられた。スペクトルｂ、ｃおよびｄにおけるSNO-Hbの収率は、それ ぞれ5%、10%および50%（S-NO/Hb）であった。他の５回の測定では、S-NO/Hbの収 率は、GSNO（pH7.4、Hbに対して10倍過剰）を用いた場合で0.37±0.06、CYSNOを 用いた場合で約2SNO／四量体（1.97±0.06）であった（下記参照）。最後に記し たこれらのデータは、ヒトHbAが滴定可能なSH基を２つ含有するという報告と合 致している。 方法 ヒトHbA0は、既に記述されているようにして赤血球から精製した(Kilbourn，R .G.ら，Biochem．Biophy．Res．Comm.，199:155-162(1994))。一酸化窒素溶液 は厳密に脱気し、一般的な手法（Beckman，J.S．ら，Methods in Nitric Oxide Research，FeelischおよびStamler編，Wiley Chichester，英国（1996））に従 って精製し、飽和溶液を気密シリンジに移した。Hbの脱酸素化は、過剰の亜ジチ オン酸塩の添加（NO研究）、もしくはツンベルグ管での脱気によるHb（FeII）O2 の還元（RSNO研究；RSNO種は亜ジチオン酸塩と反応するため）によって行った。 RSNO種は既に記述されているように合成した(Gaston，B.ら，(1993);Arnelle，D .R．およびStamler，J.S.，Arch．Biochem．Biophys．318:270-285(1995))。HbA0 とのインキュベーションは、リン酸緩衝液pH7.4、0.5mM EDTA中で行った。SNO- Hbの定量は、セファデックスG-25カラムでタンパク質を精製した後、Savilleの 方法（Gaston，B.ら，(1993);Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA ，90:444-448（1992））に従って行った。溶液中の遊離NOxを分析するSaville法 には、スルファニルアミドとのジアゾ化反応と、それに続く発色団N-（ナフチル ）エチレンジアミンとのカップリングが必要である。低分子量S-NO複合体はいず れもこの精製過程には耐えず、すべての活性は沈澱可能なタンパク質であった。 反応とスペクトルは、Perkin Elmer UV/Vis Spectrometer，Lambda 2Sを用いて 行った。実施例２：Hb Ｓ−ニトロシル化の調節に関するO2のアロステリック機能 Hbの酸素化は、アルキル化試薬に対するcys β93の反応性を増大させるコンフ ォメーション変化を伴う（Garel，C．ら，J．Biochem.，123:513-519（1982）； Jocelyn，P.C.，Biochemistry of the SH Group，Academic Press,ロンドン，24 3頁（1972）；Craescu，C.T．ら，J．Biol．Chem.，261:14710-14716(1986)）。 この効果の生理学的意義は以前に説明されていなかった。HbのＳ−ニトロソ化速 度がコンフォメーション状態に著しく依存することが観察された。オキシコンフ ォメーション（Ｒ状態）では、Ｓ−ニトロソ化がデオキシコンフォメーション（ Ｔ状態）よりも速かった（図2A）。Ｓ−ニトロソ化の速度は、どちらのコンフ ォメーションでも、アルカリ条件（これは、アルカリ条件下でなければＣ末端の ヒスチジン146βによって反応から遮蔽されているcys β93を露出させる傾向が ある）（すなわちpH9.2での速度＞pH7.4での速度）によって加速された。このヒ スチジン残基を拘束している塩橋（asp β94---hisβ146）は高pHで緩やかにな る。これらのデータは、Ｒ状態に伴うチオール反応性の増大が、少なくとも部分 的には、コンフォメーションが誘導するpKの変化よりはむしろ、NOの接触が改善 されることに由来することを示唆している。 Ａ．酸素化はHbのＳ−ニトロシル化を加速する Ｓ−ニトロソシステイン（CYSNO）によるHb Ｓ−ニトロソ化の速度は、デオ キシ状態（Hb［FeII］）よりもオキシコンフォメーション（Hb［FeII］O2）にあ る場合の方が速い。方法 インキュベーションは、タンパク質（50μM）に対して10倍過剰のCYSNOを用い て、曝気した2%ホウ酸塩、0.5mM EDTA中（オキシHb）、もしくは迅速なO2排気後 のトノメーター中（デオキシHb）で行った。図2Aに示す時間に、試料をG-25カラ ム（リン酸緩衝食塩水、0.5mM EDTA、pH7.4で予め平衡化）に通して迅速に脱塩 してCYSNOを除去し、Savilleの方法（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sc i．USA，89:444-448（1992））によってSNO-Hbを分析した。 Ｂ．脱酸素化はHbの脱ニトロシル化を加速する RSNO分解（および転移）の速度は、オキシ状態［SNO-Hb（FeII）O2］よりもデ オキシコンフォメーション［SNO-Hb（FeII）］にある場合の方がはるかに速い。 SNO-Hb（FeII）の分解は、過剰のグルタチオンの存在によってさらに加速される 。本発明の方法に基づいて測定の不感時間（約15秒）以内に、SNO-Hb（FeII）の 大部分がGSNOに変換された。方法 PBS（0.5mM EDTA、pH7.4）中のHbを、空気下（オキシ）または予めO2を排気し たトノメーター中（デオキシ）でインキュベートした。SNO-Hb（FeII）O2分解は Savilleの方法（Saville，B.，Analyst，83:670-672（1958））によって測定し た。SNO-Hb（FeII）の自発的分解を、Hb（FeII）NOの生成により、分光測光法で 追跡した。グルタチオンとのニトロソ基転移反応は、タンパク質（50μM）に対 して100倍過剰のグルタチオンを添加することによって行い、その反応混合物を 嫌気条件下に直ちに処理し、迅速なTCA沈澱を行い、上清中のRSNOを分析した。N O基転移の速度は速すぎて、この研究で使用した標準的方法では正確には測定で きなかった。実施例３：生理学的系におけるHbのシステイン残基とのNO関連相互作用 Hbは、主として赤血球に含まれることから、細胞内タンパク質のＳ−ニトロソ 化を起こす可能性のある機構を探究した。酸素化したラット赤血球のＳ−ニトロ ソシステインとのインキュベーションにより、極めて迅速な細胞内SNO-Hb（FeII ）O2の生成が起こった（図3A）。Hbの迅速な酸化は、これらの条件下で観察され なかった。また、赤血球内SNO-Hbは、赤血球をＳ−ニトロソホモシステインまた はＳ−ニトロソシステイニルグリシンで処理した場合にも生成したが、Ｓ−ニト ロソグルタチオン（GSNO）で処理した場合には生成しなかった。したがって、RS NOの赤血球接触は、チオール基特異的である。酸素化した赤血球をNOにさらすと 、主としてメトHb生成が起こった。内皮由来弛緩因子（EDRF）とヘモグロビン 内皮依存性弛緩のHb媒介的阻害は、一般にNO応答のマーカーとして使用されて いる。Hbの金属中心またはチオール中心との反応は、NO/EDRF（内皮由来弛緩因 子）応答の減衰をもたらすはずであるから、実験を行い、阻害の分子的根拠を解 明した。β93チオール基がN-エチルマレイミド(NEM)で遮断されているHb調製品 、またはヘムがシアンメト(FeIIICN)誘導体化によって遮断されているHb調製品 を大動脈環バイオアッセイで調べ、それらの活性を天然Hbの活性と比較した。シ アンメト-HbとNEM-Hbは共に、血管張力の増大を引き起こし、アセチルコリン（E DRF）が媒介する弛緩を減衰させた（図3B）。しかし、天然Hbは、修飾されたHb 調製品のいずれよりも有意に有効であった（図3B）。総合すると、これらの研究 は、Hbのチオール基と金属基が共にそのNO関連活性に寄与することを示唆してい る。HbにおけるＳ−ニトロソチオールの生成を立証するために、胸部大動脈の2c m切片をタイゴン管に挿入し、そのタイゴン管を通して、Hb（4μM）およびACh（ 2μM）を含む3ccのクレブス溶液をローラーポンプで循環（1.5cc/分×５分）さ せるバイオアッセイを用いた。流出液を分析（Gaston，B.ら，(1993)）したとこ ろ、５実験中５実験でSNO-Hb(20±4nM)の生成が認められた。 Ａ．赤血球内HbのＳ−ニトロシル化 ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル；リン 酸緩衝液pH7.4、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内SNO-Hb（FeII）O2 が迅速に生成する。メトHbは迅速には生成しない。G-25カラムを通して細胞内RS NO種を分離すると、ほとんどの時点で、低分子量Ｓ−ニトロソチオール（例えば GSNO）として存在するのはわずかな割合にすぎないことがわかる。60分までに、 Hbの４つの利用可能なSH基のうち３つがＳ−ニトロソ化される（ラットHbは４つ の反応性SH基を含有することに注意）。図3Aを参照せよ。挿入図は、ラット赤血 球から単離したSNO-Hbのスペクトルおよびそれに関連する分析を示す。スペクト ルＡは、G-25クロマトグラフィー後に赤血球から単離したSNO-Hbのスペクトルで ある。Ａを亜ジチオン酸塩で処理するとS-NO部分の還元が起こって遊離のNOが放 出され、それがデオキシHbによって自己捕捉されてHb（FeII）NOが生成する（亜 ジチオン酸塩が同時にHbを脱酸素化することに注意）（スペクトルＣ）。このス ペクトル（Ｃ）は、四量体あたり約３個のS-NOの化学量論を示している。比較の ために、四量体あたり４個のNOを含有するHb（FeII）NOのスペクトルを示す（挿 入図、スペクトルＢ）。方法 表記の間隔で、赤血球を遠心分離によって迅速にペレット化し、３回洗浄し、 ４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25カラムに通して迅速に脱塩 した。細胞内SNO-Hbを、Savilleの方法（Gaston，B.ら，(1992);Stamler，J.S． ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448（1992））で測定し、前記のよう に分光法（図3Aの挿入図）で確認した。 Ｂ．EDRF/Hb 相互作用の分子的根拠 EDRF応答に対する天然Hbの効果を、チオールまたはヘム中心がそれぞれアルキ ル化もしくはシアンメト誘導体化によって遮断されているHb調製品と比較した。 いずれのHb調製品も収縮を引き起こしたが、天然Hb（SH中心と金属中心が共に自 由に相互作用できる）による収縮が最も著しかった。図3Bを参照せよ。同様に、 アセチルコリン(ACh)が媒介する弛緩も、天然Hbによって最も効率よく阻害され た。シアンメトHb（CN-Hb）(ヘムが反応から遮断されている)とNEM-Hb（チオー ル基がN-エチルマレイミドによってアルキル化されている）では、弛緩が阻害さ れる程度が低かった。表１を参照せよ。これらのデータは、Hbのヘムとβ93SH基 の両方が、EDRF応答の反転に寄与することを例証している。同様の条件下でEDRF から生成するSNO-Hbの直接測定は、実施例８に記述されている。方法 ウサギの胸部大動脈を3mmの環に切断し、等尺性張力の測定用の力変換器（モ デルFT03、Grass Instruments、マサチューセッツ州クインシー）に取り付けた スターラップに装着した。このバイオアッセイ系の詳細は、既に記述されている (Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992))。シアン メトHbは、ヒトHbAから、公表された手法（Kilbourn，R.G.ら，Biochem．Biophy s．Res．Comm.，199:155-162(1994)）に従って調製した。HbAをN-エチルマレイ ミドでアルキル化した後、G-25セファデックスに通して脱塩して、過剰のNEMを 除去した。修飾されていないHbcys β93の除去は、Hg含有アフィニティーカラム を通すことによって達成した。遊離SH基のアルキル化は、5,5'-ジチオ-ビス［2- ニトロ安息香酸］を用いて確認した。 実施例４：SNO-Hb血管活性の伝達 動脈赤血球は生理学的に重要な２つの形態のヘモグロビン、Hb（FeII）O2とHb (FeIII)を含有する(Antonini，E.とBrunori，M.，Hemoglobin and Myoglobin in Their Reactions with Ligands，American Elsevier Publishing社，ニューヨ ークの29-31頁(1971))。赤血球内HbのＳ−ニトロソチオール含量に関する動脈- 静脈差は、NO基が赤血球輸送の間に放出されることを示唆している。これらの発 見から、おそらくはヘムの酸化還元状態とリガンドによるその占有が、機能的結 果に影響を与えるのだろうという可能性が生じる。血管環バイオアッセイで調べ た場合、SNO-Hb（FeII）O2は、あまり強くないNO様活性を持つことがわかった。 すなわち、SNO-Hb（FeII）O2が引き起こす収縮は、天然Hb（FeII）O2の場合より 少なく、Ｓ−ニトロソ化がHbの収縮作用を一部反転させることを示した（図4A） 。これに対し、SNO-Hb(FeIII)は、血管拡張因子であることがわかった（図4A)。 遊離のNOがHb（FeII）O2またはHb(FeIII)の存在下に弛緩因子活性を全くもたな かったことは注目に値する。 赤血球はmM濃度のグルタチオンを含有する。RSNO種間の平衡はRSNO／チオール 交換によって迅速に確立されるので（Arnelle，D．R.およびStamler，J．S.，Ar ch．Biochem．Biophy.，318:279-285(1995)）、SNO-Hbの血管活性をグルタチオ ンの存在下で再評価した。図4Bは、グルタチオンがSNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb(F eIII)両方の血管拡張因子活性を強化したことを示している。これらの条件にお けるGSNO生成（化学的実験とバイオアッセイ試験によって確認した）は、この効 果の完全な説明となるようであった。さらに速度論的な分析を行ったところ、グ ルタチオンが関与するニトロソ基交換は、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb(FeIII )との平衡により強く偏っていることがわかった（図4C）。赤血球におけるSNO-H bの定常状態レベルに関する発見（表２および図3A）からすると、これらの結果 は、１）天然に存在するRSNO種とHb（cys β93）の間の平衡が生理学的条件下で はSNO-Hb側にあること、２）SNO-HbとGSHが関与するニトロソ基転換反応が赤血 球内で起こるらしいこと（これらの研究において、SNO-Hbを負荷した赤血球中に 低分子量RSNO種がみられた）、および３）Hbの金属中心の酸化が平衡をGSNO側に 移動させ、それによって生理活性に影響を与える可能性があることを示唆してい る。 SNO-HbからのNO基放出のもう１つの機構を探求した。SNO-Hbのレベルに関する 動脈-静脈差から、S-NO結合の安定性が脱酸素化に付随するHbコンフォメーショ ンの変化によって調節されるのかもしれないという可能性が生じた。この可能性 を試験するために、SNO-Hb（FeII）O2とSNO-Hb(FeIII)からのNO基放出速度を比 較した。脱酸素化はSNO-Hbの分解速度を増大させることがわかった（図2B）。こ れらの速度は、GSNOを与える反応ではグルタチオンにより著しく加速された（図 2B）。結果は、O2-金属相互作用がS-NO親和力に影響を与えることを示しており 、Hbの新しいアロステリック機能を示唆している。 SNO-Hbが生理学的な意義を持つには、そのNO関連活性が赤血球膜を横切って伝 達されなければならない。SNO-Hbを含有する赤血球を生理学的緩衝液中でインキ ュベートし、細胞外RSNO種の蓄積を経時的に測定することにより、この可能性を 調査した。図4Dは、赤血球が低分子量の（トリクロロ酢酸沈澱可能な）Ｓ−ニト ロソチオール種をこれらの条件下に輸出することを示している。重要なことに、 これらの実験における溶血の程度がわずか（＜0.5%）であり、溶解に関する補正 はRSNO放出速度に有意な影響を与えなかった。これらの結果により、赤血球内で 低分子量RSNO種とタンパク質RSNO種の間に平衡が存在すること、および細胞内に 位置することが、血管壁へのNO関連活性の伝達に関して制限的な因子ではないら しいことが確認される。 Ａ．異なるSNO-Hb調製品の濃度−作用応答 Hb（FeII）O2（▲）の収縮作用は、Ｓ−ニトロシル化によって一部反転される ことがわかる（SNO-Hb［FeII］O2（■）；Hb（FeII）O2に対してＡＮＯＶＡでP= 0.02）（図4A参照）。SNO-Hb(SNO-Hb［FeIII］(●))の金属中心の酸化は、この タンパク質を、他のＳ−ニトロソタンパク質種（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl ．Acad．Sci．USA，89:444-448（1992））と同等の効力を持つ血管拡張因子に変 換する（SNO-Hb［FeII］O2に対してＡＮＯＶＡでＰ＜0.0001）。比較のため、Hb (FeIII)の収縮特性を示す（□）；各データポイントにつきｎ＝６〜17。方法 この血管環バイオアッセイの詳細は公表されている(Stamler，J.S．ら，Proc ．Natl．Acad．Sci．USA，89:444-448(1992))。SNO-Hb（FeII）O2調製品は、Hb （FeII）O2タンパク質に対して10倍過剰のＳ−ニトロソシステイン（CYSNO）を 使用して合成（2%ホウ酸、0.5mM EDTA、約15分保温）した後、セファデックスG- 25カラムを通して脱塩を行った。CYSNOは、0.5N HCl、0.5mM EDTA中で合成した 後、0.5mMのEDTAを含む1Mリン酸緩衝液中で中和(1:1)した。SNO-Hb(FeIII)調製 品は同様の手法で、ただしHb(FeIII)を出発物質として、調製した。後者はHb（F eII）O2を過剰のフェリシアン化物で処理した後、G-25カラムに通して脱塩する ことにより合成した。SNO-Hb濃度は分光法で確認し、Ｓ−ニトロソチオール含量 はSavilleの方法（Stamler，J.S．ら，Proc．Nat．Acad．Sci．USA，89:444-448 (1992)）によって決定した。S-NO／四量体化学量論は、どちらのSNO-Hb調製品に ついても約2だった。ヘムの酸化はuv-分光測光法では検出不可能だった。 Ｂ．グルタチオンによるSNO-Hb作用の増強 バイオアッセイ槽にグルタチオン（100μM）を添加すると、SNO-Hb（FeII）O2 （■）とSNO-Hb（FeIII）（●）に対する用量-応答が共に増強される（図4B参照 。ｎ＝６〜12；図4Aにおける各軌跡と比較してどちらの場合もＡＮＯＶＡにより ｐ＜0.0001）。グルタチオンは、いくつかの実験で基礎張力に対して一時的な 影響を持ち、Hb（FeII）O2（▲）に対する応答には有意な影響を与えなかった。 Ｃ．SNO-Hb とグルタチオンの間のニトロソ基交換 SNO-Hb（100μM）からグルタチオン（10mM）へのNO基転移の速度を、SNO-Hb（ FeII）O2（オキシ）とSNO-Hb（FeIII）(メト)について示す（ｎ＝５）。データ は、出発SNO-Hb濃度に対する生成したGSNOの量として表わしてある。この転移は 、SNO-Hb（FeII）O2よりもSNO-Hb(FeIII)の場合の方が速く（ＡＮＯＶＡにより ｐ＜0.002）、GSNO/SNO-Hb平衡がメトHbの生成によりGSNO側にシフトすることが 示唆される。方法 GSNOが生成するチオール/SNO-Hb交換は、トリクロロ酢酸沈澱後にしたがって 、化学的に立証された（Stamler，J.S．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，89:4 44-448(1992)）(ｎ＝５)。これらの結果は、別個の実験で、反応混合物をG-25カ ラムに通して分離した後、残存するSNO-Hb濃度を測定することによって検証した 。 Ｄ．赤血球によるＳ−ニトロソチオール種の輸出 SNO-Hbを含有するヒト赤血球が、経時的に低分子量RSNO種を輸出することを示 している。溶血は、１時間で０〜＜0.5%の範囲にあって、RSNO放出速度とは相関 せず、測定された細胞外RSNOのごく一部の原因にしかならなかった。方法 遠心分離によって保存用ヒト赤血球を得、洗浄し、5mM SNOCYSを含むリン酸緩 衝食塩水（0.5mM EDTA、pH7.4）中に１時間再懸濁した。これにより、0.5S-NO ／四量体の化学量論を持つSNO-Hb（FeIIO2/FeIII混合物）を含む赤血球調製品が 得られる。次に、その赤血球を繰返し洗浄することにより、残存するCYSNOを除 去し（確認した）、その赤血球をクレブス溶液中（1:4）でインキュベートした 。細胞外RSNOの蓄積を、Savilleの方法（Saville，B.，Analyst，83:670-672（1 958））で経時的に測定した。遠心分離の後、赤血球上清を分光法で分析するこ とにより、溶血を測定した。実施例５：イン・ビボでのSNO-Hb生理活性 無細胞Hbの全身投与は、高血圧応答をもたらすが、これはNOがヘムによって捕 捉されるからであるとされている（Vogel，W.M．ら，Am J．Physiol.，251:H413 -H420(1986);Olsen，S.B．ら，Circulation，93:329-332(1996)）。SNO-Hbがこ の有害な影響を持たないかどうかを決定するため、また、NO放出のイン・ビトロ 機構がイン・ビボ環境にも及ぶかどうかを調べるため、麻酔したラットの大腿静 脈にボーラスとして注入したHbとSNO-Hbに対する応答を比較した。図５に示すよ うに、Hb（FeII）O2（200nmol/kg）は、平均動脈圧に20±3mmHgの上昇をもたら した（ｎ＝４；Ｐ＜0.05）。これに対して、SNO-Hb（FeII）O2は、高血圧作用を 示さず、SNO-Hb(FeIII)は、低血圧応答を引き出した（図５）。したがって、こ れらの化合物のイン・ビボでの特性は、イン・ビトロで認められたもの（図4A） とよく似ている。さらに、赤血球の生理学的応答が無細胞Hb調製品と同等である ことを立証するために、SNO-Hbを含有する赤血球を、L-NMMA（50mg/kg）で予備 処置して内因性RSNO種を枯渇させたラットの大腿静脈に注射した。正常なラット に認められるレベルと同等なSNO-Hbレベル（0.1〜0.5μM）で、SNO-Hb含有赤血 球は、低血圧応答を引き出したが（8±1mmHg；平均±SEM；ｎ＝９）、天然（SNO -Hb枯渇）赤血球はそのような応答を引き出さなかった(Ｐ＝0.001)。これら約10 %の平均血圧変化は、人間の高血圧と正常血圧を区別する変化にほぼ相当し、い くつかの抗高血圧治療の治療範囲内にある。HbとSNO-Hbの効果はいずれ も（無細胞であるか、赤血球内に含まれるかにかかわらず）一過性であり、この ことは、HbのＳ−ニトロシル化とSNO-Hbの代謝がイン・ビボで起こって、それが 血圧の復旧をもたらしていることを示唆している。S-NO／ヘム化学量論がほぼ1: 50,000である血液中でのSNO-Hbの生理活性は、Hb（Fe）不活化に対するこのNO関 連活性の抵抗性の劇的な実例である。無細胞HbとSNO-Hbのイン・ビボ効果 スプレーグ・ドーリーラットの大腿静脈に2〜200nmol/kgのHb（FeII）O2を（ ボーラスとして）投与すると、平均動脈圧が用量依存的に上昇することが示され る。200nmol/kgでは、平均動脈圧が25mmHg（20±3mmHg；ｎ＝４；Ｐ＜0.05）上 昇した。血圧の上昇は、10〜15分以内に反転した。（同じ用量範囲での）SNO-Hb （FeII）O2注入は、明白な血圧変化を引き起こさず、Hb（FeII）O2によって誘発 される高血圧を改善することが示される。より高い投与量でも、同様の応答が認 められた。これに対し、SNO-Hb(FeIII)注入は、最高投与量（200nmol/kg）で平 均動脈圧の有意な低下（前108±5mmHg；後74±6mmHg、ｎ＝５；Ｐ＜0.05）を引 き起こした。高血圧応答は、一過性の傾向があり、10分間で血圧が正常化した。 血圧の減少は、SNO-Hbを含有する赤血球の注射でも認められた。方法 ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により、 大腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould記録 計を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した 。データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。実施例６：Ｓ−ニトロソチオール種の赤血球への負荷 ラット赤血球をＳ−ニトロソシステイン（ヘム（5mM）に対して等モル；リン 酸緩衝液pH7.4、25℃）と共にインキュベートすると、細胞内Ｓ−ニトロソチオ ール種の迅速な生成が起こる。メトHbは迅速には生成しない。細胞内容物をG-25 カラムに通して分離すると、赤血球内低分子量Ｓ−ニトロソチオール、例えばＳ −ニトロソグルタチオン（GSNO）の生成が確認される。２分までに、mM程度のGS NOを得ることができる。RSNO のアッセイ法 Ｓ−ニトロソシステイン（5mM）処理した赤血球を遠心分離によりすばやくペ レット化し、３回洗浄し、４℃の脱イオン水中で溶解し、その細胞質画分をG-25 カラムに通してすばやく脱塩する。細胞内RSNOはSavilleの方法で測定し、分光 法で確認することができる。負荷赤血球からの血圧に対する効果 （SNO-RBCを調製するために）Ｓ−ニトロソシステイン（S-nitroscysteine） で処理し、スプレーグ・ドーリーラットの大腿静脈に導入した赤血球は、用量依 存的に平均動脈圧を低下させた。SNO-Hbが0.3μM（内因性イン・ビボSNO-Hb濃度 ）でアッセイされた赤血球の場合、動脈圧は8±1mmHg（９回の実験に関する平均 ±SEM；非処置赤血球対照と比較してｐ＜0.001）低下した。SNO-Hbで0.5μMと測 定された赤血球の場合、動脈圧が10mmHg低下した。SNO-Hbが0.1μM（内因性SNO- Hb濃度未満）で測定された赤血球の場合は、動脈圧が6mmHg低下した。非処置赤 血球の投与は、動脈血圧に何の効果も持たないか、もしくはわずかに上昇させた 。L-モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA；50mg/kg）の投与は、約20mmHgの血圧上 昇を引き起こした。負荷赤血球のボーラス投与による血圧の変化は、15〜20分間 持続した。その他の方法 ラットをペントバルビタールの腹膜内注射によって麻酔し、局所切開により大 腿動脈と大腿静脈を確保した。次に、動脈にカニューレを挿入し、Gould記録計 を取り付けたViggo Spectramed圧力変換器を用いて、血圧を連続的に監視した。 データの取得にはIBM PC（DATA Q Codas）を使用した。実施例７：冠状動脈血管拡張、冠状動脈流および血圧に対するSNO-Hbの効果 SNO-Hbを実施例4Aに記述したように合成した。反応の完了は、実施例4Aに記載 のように決定した。24頭の健康な雑種犬（25〜30kg）を静脈内チアミラルナトリ ウム（60〜80mg/kg）で麻酔し、第４肋間腔に左開胸術を施した。左過剰耳より 遠位の左回旋冠状動脈を最小限切開した。一対の7-MHz圧電性結晶（1.5×2.5mm 、15〜20mg）をダクロン裏材に取り付け、切開した血管部分の反対側表面の動脈 血管外膜を6-0プロレンで縫合した。オシロスコープ監視とオンライン音波測微 法（ソノミクロメーター120-2、Triton Technology,カリフォルニア州サンディ エゴ）を用いて、適切な結晶位置を確保した。パルスドップラー流量プローブ（ 10MHz、加圧帯型）を結晶より遠位に埋め込んだ。膨張型気球閉塞具も流量プロ ーブより遠位に設置した。結晶と閉塞具の間にある回旋動脈の全ての分岐を結紮 した。ヘパリンナトリウム充填ポリビニルカテーテルを、尖から左心室腔内に、 過剰耳から左心房に、左内胸動脈から上行大動脈に挿入した。カテーテル、管お よび線材は、首の付け根にある皮下嚢までくぐらせた。 10〜15日の回復期間後に、カテーテルと線材を全身麻酔下に体外に出し、２〜 ３日後に、各犬にSNO-Hb（0.4mg）のボーラス注射を与えて血管応答を評価した 。5%未満の心外膜冠状血管拡張を示した２頭の犬を以降の試験から除外し、別の 技術的理由で２頭を除外した。 犬を緩く拘束して外側横臥位に目をさましたまま横たわらせながら、調教し、 研究した。実験室は薄暗く照明し、静かに保った。大動脈圧、左心室端-拡張期 圧dP/dt、冠状動脈外径および冠状動脈流を連続的に監視した。10頭に、0.1ml のSNO-Hb溶液（50nM/kg）を左心房カテーテルから注射した。脈管構造に対する 溶媒の潜在効果を確かめるために、蒸留水中の30%エタノール0.1mlを賦形剤対照 として与えた。注射の間に、位相性冠状血流（phasic coronary blood flow）と 冠状動脈直径を注射前のレベルに戻らせた（最低15分間）。注射間に15分の間隔 を置くと、反復注射に変化が起こらなかった。コンダクタンス血管（conductanc e vessels）に対するSNO-Hbの直接的血管拡張効果と潜在的な流量媒介性の間接 的血管拡張効果を評価するため、冠状血流が注射前のレベルかそれよりわずかに 低く維持されるように可調式閉塞具を一部膨張させながら、10頭中６頭に投与を 繰返した。塩化アセチルコリン（Sigma Chemical）に対する応答を、SNO-Hbの場 合と同様の操作を行った後、10頭の別の群で評価した。 心外膜冠状動脈直径、冠状血管流、心拍数、大動脈および左心室端-診断圧(di agnostic pressure)を各SNO-Hb注射の前後で比較した。冠状動脈寸法と血流の最 大変化を、増大するSNO-Hb投与量の関数として表した。増大する投与量に対する 冠状動脈寸法の応答は、下記の等式で記述しうる独特なＳ字型用量-応答曲線に 従った： ［式中、KDは薬物-受容体複合体解離定数であり、最大応答の50%が達成される投 与量（EC50）である］。各動物で、その用量-応答曲線に対して非線型最小二乗 回帰（r2＞0.90）を行った。この回帰は上記の等式に束縛された。回帰から、個 々の動物それぞれに対して、最大応答値とKD値が得られた。次に、これらの値の 平均値を計算し、各試験群について平均KDと最大応答を得た。これらの値を用い て平均曲線を作成し、平均用量-応答値と共にプロットした（図6A〜6Fを参照の こと）。実施例８：血液におけるＳ−ニトロソヘモグロビンとニトロシル（FeII）-ヘモ グロビンの内因性レベル SNO-Hbが血液中に天然に存在するかどうか、また天然に存在するならば、その O2輸送能との関係および赤血球のニトロシル化ヘム含量を決定するために、赤血 球のＳ−ニトロソチオールおよびニトロシル−ヘム含量をアッセイするための分 析法を開発した（表２）。麻酔したラットの左心室から直接穿刺によって動脈血 を得、頚静脈(juglular vein)と下大静脈から静脈血を得た。次に、赤血球からH bを精製し、RSNO含量と（FeII）NO含量を測定した。動脈血には有意なレベルのS NO-Hbが含まれていたが、静脈血では実質上検出できなかった（表２）。NOシン ターゼ阻害因子Ｎ−モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA）を注入（50mg/kg）した 45分後に行った測定は、SNO-Hbと総Hb-NOの枯渇を示した（それぞれ82および52 ±18％；ｎ＝３〜５；ｐ＜0.05）。これらのデータは、多少の環境的寄与は排除 されないものの、SNO-Hbの内因性起源を確立するものである。SNO-Hbについて認 められた動脈-静脈分布は、Hb（FeII）NOの場合は逆転し、Hb（FeII）NOは、部 分的に脱酸素化された（静脈）赤血球中に、より高い濃度で検出される（図２） 。したがって、ニトロシル化されたタンパク質チオールとヘムの比率は、血液の 酸素化状態に依存するようである。これらの発見と一致して、Wennmalmとその共 同研究者らは、Hb（FeII）NOが主として静脈（部分的に脱酸素化された）血液中 で生成することを示している(Wennmalm，A.ら，Br．J．Pharmacol.，106(3):507 -508(1992))。しかし、Hb（FeII）NOのイン・ビボレベルは、一般的には低すぎ て（EPRで）検出することができず、SNO-HbはEPRサイレントである（すなわち常 磁性でない）。したがって、光分解-化学発光法は、重要な技術的進歩を意味す る。というのは、これが、正常な生理学的条件でHbに対するNO結合を定量的かつ 機能的に評価することができる最初の方法論だからである。 方法 麻酔したスプレーグ・ドーリーラットの左心室（動脈血）および頚静脈（静脈 血）から血液を得た。同等の静脈値は下大静脈由来の血液中にも得られた。赤血 球細胞を800gで遠心分離することによって単離し、４℃のリン酸緩衝食塩水中で ３回洗浄し、0.5mM EDTAを含む脱イオン水４倍量を添加することにより溶解し、 Penefskyの方法に従って４℃で、G-25カラムにすばやく通して脱塩した。24匹の ラットで、Hb試料を２等分した後、それらを、Bradfordの方法で測定したタンパ ク質濃度に対して10倍過剰量のHgCl2で処理し、もしくは処理しなかった。SNO-H bとHb（FeII）NOの測定は、光分解−化学発光法によって行った。さらに12匹の ラットで、HgCl2処理後に亜硝酸塩をアッセイすることにより、SNO-Hbの存在を さらに確認した。具体的に述べると、試料（HgCl2を含むものと含まないもの） を４℃で１時間、Amicon-3（セントリコンフィルター、分子量カットオフ3,000 ）に通して分離し、低分子量画分を0.5N HCl中の１μMグルタチオンを含む気密 シ リンジに集めた。これらの条件下で、存在する亜硝酸塩はすべて、Ｓ−ニトロソ グルタチオンに変換され、それを光分解-化学発光法で測定した（検出限界約1nM ）。SNO-Hbはすべての動脈試料中に存在し、この方法で決定されたレベル（286 ±33nM）は実質上同一で、表２に示すレベルと統計学的に相違しなかった。静脈 血では、SNO-Hbが検出不能（0.00±25nM）で、そのレベルは上記のレベルと統計 学的に相違しなかった。Ｓ−ニトロソヘモグロビンのアッセイ法 高感度な光分解-化学発光法を使用した。多少類似するアッセイ法が、生体系 中のRSNO種（Ｓ−ニトロソチオール種）を測定するために使用されている（Gast on，B.ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 90:10957-10961(1993)；Stamler，J.S ．ら，Proc．Natl．Acad．Sci．USA 89:7675-7677(1992)）。この方法では、NO をチオールから光分解的に遊離させ、それをオゾンとの反応により化学発光分光 計で検出する。これと同じ操作原理は、ニトロシル-金属化合物からのNOの切断 （および測定）にも使用できる（Antonini，E.およびBrunori，M．Hemoglobin a nd Myoglobin in Their Reactions with Ligands，American Elsevier Publishi ng社，ニューヨーク，(1971)の29〜31頁）。光分解セル内の流速を調節すること により、Hb（FeII）NOのNOリガンドの完全な光分解を達成することができる。SN 0-Hb、Hb（FeII）NOおよびＳ−ニトロソグルタチオンの合成調製品から作成した 標準曲線は、直線（Ｒ＞0.99）で、実質上重ね合せることができ、約1nMの感度 限界を示した。２つの分析基準、すなわち１）SNO-Hbからの信号は、10倍過剰の HgCl2で試料を予備処理することによって除去されたが、Hb（FeII）NOは、水銀 試験に対して耐性であったこと、および２）HgCl2によるSNO-Hbの処理は（一般 的なグリース反応により）定量的な収量で亜硝酸塩を生じるが、Hb（FeII）NOを 同様に処理しても亜硝酸塩は生じないことによって、SNO-HbとHb（FeII）NOが確 実に識別されることを発見した。UV/VIS分光法により、NOが過剰のHgCl2の存在 下にヘムに結合したままであることが確認された。実施例９：Ｓ−ニトロソヘモグロビンによる血小板凝集の阻害 ヒトHbA0の調製方法は、実施例１の「方法」の段落に記載したものである。SN O-Hb（FeII）O2の製造方法は、実施例2Aに記載したものである。SNO-Hb（FeIII ）O2の製造方法は、実施例１に記載したものである（実施例１のＢ、Ｃ部分およ び「方法」参照）。SNO-ヘモグロビンの定量は、Savilleの方法（Saville，B.， Analyst，83:670-672（1958））および実施例８の「Ｓ−ニトロソヘモグロビン のアッセイ法」に記載されたアッセイにしたがって実施例１のようにした。 少なくとも10日間3.4nMのクエン酸ナトリウムで抗凝固された静脈血を、アセ チルサリチル酸またはいかなる他の血小板活性剤を消費していないボランティア から得た。血小板に富む血漿を150×ｇで25℃で10分間遠心分離して調製し、回 集後２時間以内に用いた。血小板数をクールターカウンター（モデルZM）で測定 しすると、1.5〜３×108/mlであった。 血小板に富む血漿の凝固を、標準的な比濁計技術で測定したところ、結果が出 血時間と相関していることが示された。血小板のアリコート(0.3ml)を37℃でイ ンキュベートし、PAP-4攪拌機（Biodata，Hatsboro，PA）中で1000rpmで攪拌し た。ヘモグロビンを、血小板と10分間プレインキュベートし、５μM ADPで凝集 を誘導した。凝集を、光透過率の最大速度および変化の程度を測定することによ って定量し、ヘモグロビンの非存在下で行った対照凝集と比較した正規化値とし て表現した。 凝集アッセイの結果を図7A、7Bおよび7Cに示す。標準偏差を縦棒で示す。SNO- Hb（FeII）O2は、試験した高濃度での血小板凝集のいくらかの阻害を起こした。 また、SNO-Hb(FeIII)は、１μMおよびそれ以上の濃度で存在すると、SNO-Hb（Fe II）O2よりもはるかに大きな程度まで、血小板凝集を阻害する。実施例10：cGMPに対するSNO-Hbの効果 血小板に富む血漿(PRP)をヘモグロビン、SNO-オキシHb、またはSNO-メトHbの いずれかと５分間インキュベートし、その後0.5mlの氷冷トリクロロ酢酸を10％ になるまで添加して、アッセイを終了した。上清のエーテル抽出を行って、トリ クロロ酢酸を除去し、無水酢酸での試料のアセチル化を用いてアッセイの感度を 増加させた。サイクリックGMPの測定をラジオイムノアッセイによって行った（S tamler，J．S.ら、Circ．Res．65:789-795(1989)）。 結果を図８に示す。試験したHbの全濃度について(１、10および100μM)、SNO- Hb(FeIII)について測定したcGMPの濃度は、天然Hbのものより小さかった。実施例11：Hbのポリニトロソ化 Ａ． HbA0（オキシ）を、Ｓ−ニトロソグルタチオン／HbA0の比が6.25でＳ−ニ トロソグルタチオンと、pH7.4で25℃で240分間インキュベートし、セファデック スG-25カラムで脱塩した。亜ジチオン酸塩存在下（スペクトルB、図9A）および 非存在下（スペクトルA、図9A）でスペクトル測定を行った。スペクトルにおけ るシフトは、四量体あたり２個のSNO基であることを示す。 Ｂ． HbA0を、タンパク質に対して100倍過剰量のＳ−ニトロソグルタチオンと 、pH9.2で240分間インキュベートした後、G-25カラムで脱塩した。次に、一部を 亜ジチオン酸塩で処理した。図9Bのスペクトルは、Hbが複数の部位でニトロソ化 されていることを示す。 Ｃ． HbA0を、四量体に対して100倍過剰量のＳ−ニトロソシステインと、pH7.4 で25℃で５〜20分間インキュベートした。種々の時間の処理後、タンパク質をG- 25カラムで脱塩し、亜ジチオン酸塩で処理した。スペクトルは、時間とともにHb のポリニトロソ化が進むことを示している（図9CのスペクトルA〜F）。100 倍過剰量のＳ−ニトロソシステインとの処理の５分後、四量体あたり0.09個のNO 基が付加されていた（図9CのスペクトルA）；20分後、少なくとも４個のNO基が 付加されていた（図9CのスペクトルF）。中間点で、四量体あたり0.4個のNO基( 図9CのスペクトルB)、1.58個のNO基(図9CのスペクトルC)、2.75個のNO基(図9Cの スペクトルD)、2.82個のNO基(図9CのスペクトルE)が付加されていた。 Ｄ． ラットHbを、四量体に対して100倍過剰量のＳ−ニトロソグルタチオンと 、pH7.4で３時間インキュベートした。次に、タンパク質をG-25カラムを通して 脱塩した。脱塩したタンパク質の一部を亜ジチオン酸塩で処理した（図9Dのスペ クトルB；スペクトルAのタンパク質を亜ジチオン酸塩で未処理にしておいた。 ）。図9DのスペクトルBは、RNO/Hbの比が６であることを示す。 Ｅ． 時間でHbA0をのニトロソ化の程度をトラッキングしたタイムコース実験を 行った（図9E）。HbA0の処理を、10倍過剰量のＳ−ニトロソシステインとpH7.4 で25℃で、または同じ条件下で100倍過剰量のＳ−ニトロソシステインと行った 。SNOおよびNOの分析をSavilleの方法およびJia，L．ら，Nature 380:221-226（ 1996）によって行った。これらの条件下で、ヘムは、極度に酸化された；速度は 時間に依存した。 10倍過剰量のＳ−ニトロソシステインでの処理は、HbA0の２つの反応性システ イン残基のチオール基のみをニトロシル化する。イノシトール６リン酸は、アロ ステリック平衡をＴ構造（通常デオキシ型）側にシフトさせることが知られてい る。100倍過剰量のＳ−ニトロソシステインでの処理は、さらなる基をニトロソ 化する；つまり、産物は、四量体あたり２個以上のNO基を有する。実施例12：血液流におけるSNO-Hb（FeII）O2の効果 SNO-Hb（FeII）O2は、SNO/Hbの比が２であり、Ｓ−ニトロソチオールとの反応 によって（HbA0から）調製される。２１％の酸素を呼吸するラットを、図１０( 白丸、SNO-Hb（100nmol/kg）；黒丸、SNO-Hb(1000nmol/kg)；黒四角、非修飾Hb( 1000nmol/kg))に示すようにHbA0から調製したHbで注射した。各実験あたり３匹 のラットを用いた。血液流をH2クリアランス法を用いて脳において測定した；微 小電極を脳の定位に置いた。付随したPO2測定は、組織PO2が20であることを示し た。したがって、SNO-Hbは、正常の生理条件下での脳への血液流を改善し、一方 、天然Hbは、血液流を減少させた。NO基放出は、局所組織酸素低下によって促進 された。実施例13：ウサギ大動脈の張力におけるSNO-Hb（FeII）O2、SNO-Hb(FeIII)およ び(NO)x-Hb(FeIII)の効果 ヘモグロビンを、Hb四量体に対して1:1、10:1または100:1いずれかのＳ−ニト ロソシステインで１時間処理し、実施例４のように進めた。1:1および10:1過剰 で行った反応の産物を、Savilleアッセイおよび標準的な分光光学的方法によっ てアッセイした。1:1の比で行った反応の産物は、SNO-Hb(Fe)O2であり、SNO-Hb( FeIII)は、CYSNO/四量体が10:1過剰での反応ののちにみられた。 大動脈環バイオアッセイを、実施例４に記載のように行った。CYSNO/Hb四量体 が100:1の比を用いた反応の産物は、ヘムに付着したNOならびに２個のSNOを含ん でいた。100:1のCYSNO/Hb産物の能力は、SNO-Hb（FeIII）のものよりはるかに優 れており、ポリニトロシル化を示している（図11参照）。実施例14：部分的にニトロシル化されたヘモグロビンに対する酸素化の効果 部分的にニトロシル化されたHbに対する酸素化の効果を、部分的にニトロシル 化されたHbに空気を添加した時のソーレー領域のスペクトル変化を追跡すること によって調べた。ヘモグロビンＡ(17μM)を、100mMリン酸塩(pH7.4)中の1ml溶液 にアルゴンを45分間吹き込むことによって脱酸素化した。一酸化窒素を、窒 素下に保存した2mM溶液0.5μlを注入することによって添加した。最終的なヘム ：NO比は68：１だった。次いで、室内の空気50μlを逐次注入することによって その溶液を徐々に曝気した。図12は、初期の空気添加が真の等吸収点をもたらさ ず、少なくとも３つの吸収性種の濃度変化を示すことを表している。その後の空 気添加によって、ニトロシルヘムの喪失を伴うデオキシヘモグロビンのオキシヘ モグロビンへの変換を示す真の等吸収点がもたらされた。これらの結果は、ニト ロシル化Hbが安定な最終生成物ではないことを示している。実施例15：ニトロシルヘモグロビンのSNO-ヘモグロビンへの変換 一酸化窒素は酸素化時にヘム鉄からチオール残基に転移されてニトロソチオー ルを生成するという仮説を検証した。ヘモグロビンＡ(400μM)を、100mMリン酸 塩(pH7.4)中の1ml溶液にアルゴンを45分間吹き込むことによって脱酸素化した。 様々なNO/Hb比を達成するため、一酸化窒素を、窒素下に保存された適当量の2mM 溶液を注入することによって添加した。次にその溶液を開口した容器中で激しく ボルテックスすることにより、空気にばく露した。次に試料をSavilleアッセイ とUV光分解後の化学発光によって分析した。データを平均±標準誤差（ｎ＞３） として表す。図13は、S-ニトロソチオールがこの方法で形成されることと、ヘム 対一酸化窒素の比率が高い場合にこの反応の効率が最大になることを示している 。量は、極めて高いNO/Hb比（すなわち＞２：１）で最高である。生理的条件で はヘム対NOの比が高いため、この結果は肺に入るニトロシルHbがSNO-Hbに変換さ れることを含意している。実施例16：ヘム：NO比に依存する効果 β鎖のヘムに対する一酸化窒素の結合は本質的に不安定であり、一酸化窒素濃 度が高いほどSNO-Hbの収率が低くなる理由は、この不安定性の結果として結合型 一酸化窒素が失われることだと考えた。ヘモグロビンＡ(17.5μM)を、100mMリ ン酸塩(pH7.4)中の1ml溶液にアルゴンを45分間吹き込むことによって脱酸素化し た。一酸化窒素を、窒素下に保存された適当量の2mM溶液を逐次注入することに よって添加した。図14Ａ：一酸化窒素ヘモグロビン混合物と出発デオキシヘモグ ロビンスペクトルとの示差スペクトルを示す。図14Ｂ：溶液に添加した一酸化窒 素の濃度に対してプロットした示差スペクトルのピーク波長。これらのデータは 、少量の一酸化窒素の添加（ヘム：NO比が約70：１）で、主としてニトロシルヘ モグロビンと、多少の酸化型ヘモグロビンが生成することを示している。しかし 、10μM程度の一酸化窒素添加で、酸化型ヘモグロビンの形成が起こる。この時 点でヘム：NO比は約７：１である。一酸化窒素のさらなる添加によって一酸化窒 素の濃度を上昇させるにつれて、形成される主要種はニトロシルヘモグロビンに なる（１：１のヘム：NO比）。図14Ａと14Ｂの結果は、嫌気的条件下でHbに添加 する一酸化窒素の量を増やしていくと、まずニトロシルヘモグロビンが生成し、 次いで酸化型Hb（メトHb）の生成が起こることを示している。極めて高い一酸化 窒素レベルでは、一酸化窒素がまずメトHbをデオキシHbに還元（亜硝酸塩が生成 ）してからNOを結合するので、ニトロシル−ヘモグロビンが再び現れる。これは Ｔ構造HbのＲ構造へのコンフォメーション変化を引き起こして、βヘム−一酸化 窒素結合を安定化する。約10：１のヘム対一酸化窒素比での酸化型Hbの出現は、 ヘム/NO結合の崩壊による酸化型Hbと一酸化窒素陰イオン（ニトロシル）の生成 を示している。一酸化窒素陰イオンの存在は、ガスクロマトグラフィー質量分析 法による気相でのN2Oの検出と、NH2OHの生成によって確認された。実施例17：ニトロシル−デオキシHbの酸素化時の効果 100mMリン酸塩(pH7.4)中の1ml溶液にアルゴンを45分間吹き込むことにより、 ヘモグロビンＡ(20.0μM)を脱酸素化した。図15Ａと図15Ｂの両方では、最低か ら最高に向かうスペクトルが、逐次的な空気の添加を示す。これらは純粋なデオ キシHbスペクトルがゼロ吸光度に現れる示差スペクトルである。419nmのピー クはニトロシルヘモグロビンに由来するものであり、酸化型ヘモグロビンは405n mで吸収する。 図15Ａに示す実験では、室内の空気10μlをハミルトンシリンジで逐次添加す ることにより、ヘモグロビンを徐々に酸素化した。スペクトルは初期デオキシヘ モグロビンスペクトルからの示差スペクトルとして表されている。図15Ｂに示す 実験では、窒素下に保存した2mM溶液0.5μlの注入によって一酸化窒素(１μM)を 添加した。最終的なヘム：NO比は80：１だった。室内の空気10μlを逐次添加す ることにより、その溶液を徐々に酸素化した。スペクトルは初期デオキシヘモグ ロビンスペクトルからの示差スペクトルとして表されている。これらのデータは 、酸化型ヘモグロビンの多少の形成を伴うニトロシルヘモグロビンピークの初期 形成と、そのピークが約30μlの空気の添加後に消失することを示している。こ れらの結果が、低い一酸化窒素対デオキシHb比の添加時に少量のニトロシルHbが 形成されることと、このニトロシルHbが酸素化時に失われることを示している。実施例18：ニトロシル−ヘムの不安定化に関するβ93Cysの役割 組換えヘモグロビンをメリーランド大学医学部のClara Fonticelliから入手し た。β93AlaはヒトヘモグロビンＡ内の単一アミノ酸置換に相当し、一方、β93C ysは野生型対照に相当する。β93位に野生型システイン(β93Cys)か突然変異型 アラニン(β93Ala)を含む組換えヘモグロビン(5μM)を、図15Ａおよび15Ｂのよ うに脱酸素化した。窒素下に保存した2mM溶液0.5μlを注入することにより、一 酸化窒素(１μM)を添加した。最終的なヘム：NO比は20：１だった。室内の空気1 0μlを逐次添加することにより、その溶液を徐々に酸素化した。初期デオキシヘ モグロビンスペクトルに対する示差スペクトルの418nmでの吸収を図16に示す。 これらのデータは、突然変異体内では室内の空気を添加しても失われないニトロ シル付加物が形成されたことを示している。しかし、野生型内に形成さ れたニトロシル付加物は、10μlを超える室内の空気の添加後に失われた。これ は、β93位にチオール残基を持たない突然変異型Hbでは、このニトロシル（FeII ）ヘムからNOが失われないことを示している。したがって、Ｒ構造内のヘムに極 めて近接しているこのチオールは、ヘム一酸化窒素結合を不安定化することにと って極めて重要である。実施例19：O2によって駆動されるニトロシル-HbからのSNO-Hb ヘモグロビンＡ(400μM)を100mMリン酸塩(pH7.4)中の1ml溶液において調整し た。一酸化窒素を、窒素下に保存した適当量の2mM溶液を注入することによって 添加した。その溶液を開口した容器中で激しくボルテックスした。次に試料をSa villeアッセイとUV光分解後の化学発光によって分析した。図17の結果は、S-ニ トロソチオールHbはオキシHbから形成されうるが、この形成の効率はヘム対一酸 化窒素の比に決定的に依存することを示している。実施例20：タンパク質濃度に依存する酸化型Hbの形成 ヘモグロビンＡを、50mlの100mMリン酸緩衝液(pH7.4)中に、図18Ａと図18Ｂに 異なる記号で示した濃度まで希釈した。一酸化窒素を、窒素下に保存した適当量 の2mM溶液を逐次注入することによって添加した。各注入後に、415nmと405nmで の吸光度を測定した。これら２つの吸光度の比を使って、酸化型ヘモグロビンの 含有百分率（図18Ａ）と、酸化型ヘモグロビンの絶対収量（図18Ｂ）を計算した 。◆は1.26μMヘモグロビンを、■は5.6μMヘモグロビンを、▲は7.0μ 、そして●は18.3μMヘモグロビンを表す。これらのデータは、添加された一酸 化窒素のごく一部だけが酸化型ヘモグロビンの形成をもたらすことを示している （＜10％）。さらに、酸化型ヘモグロビンを形成させるというこの傾向は、タン パク質濃度がより高くなると減少する。実施例21：メトHb形成の程度に対するイオン強度とNO：Hb比の効果 我々は、結合した酸素と遠位ヒスチジンの間の水素結合の程度が一酸化窒素に よるヘモグロビンの酸化の程度を決定する上で極めて重要であると提案した。し たがって、我々は、一酸化窒素によるヘモグロビンの酸化の程度を種々の緩衝液 中で調べた。300μMのヘモグロビンＡ（約95％オキシHb）を含むリン酸緩衝液5m lを15mlバイアルに入れた。一酸化窒素を窒素下に保存した2mMの保存溶液から添 加した。一酸化窒素添加の直後に630nmでの吸光度を測定し、630nmでのメトHbの 吸光係数を4.4として酸化型（メトHb）の濃度をプロットした。実験は1M、100mM および10mMリン酸ナトリウム緩衝液(pH7.4)で行った。図19のデータは1Mリン酸 塩でより多くの酸化型ヘモグロビンが形成することを示しており、これは、鉄結 合型酸素と遠位ヒスチジンの間の水素結合のリン酸塩不安定化によって予測され るように、有効基質濃度が高いことを示す。添加した一酸化窒素濃度が最も低い 場合は、すべての条件でS-ニトロソチオールが形成された(約５μM)。30μM以上 の濃度での一酸化窒素の添加は、亜硝酸塩の追加的な形成をもたらした。緩衝液 内に200mMホウ酸塩が存在すると、酸化型ヘモグロビンと亜硝酸塩の形成が低減 し、一方、200mMの塩化物が存在すると、酸化型ヘモグロビンと亜硝酸塩の形成 が増加された。10mMリン酸緩衝液中のヘモグロビンに１：30（NO：ヘモグロビン Ａ）未満の比率で一酸化窒素を添加すると、酸化型ヘモグロビンが生成すること なくS-ニトロソチオールが形成された。S-ニトロソチオール形成は10mMリン酸塩 、200mMホウ酸塩、pH7.4中のヘモグロビンに一酸化窒素を添加することによって 最適化された。したがって酸化とニトロソチオール形成の間の平衡は、一酸化窒 素対ヘモグロビンの比と緩衝液環境に依存する。実施例22：S-ニトロソヘモグロビンの酸素依存的血管作用性：Ｒ構造での血管の 収縮とＴ構造での拡張 このバイオアッセイ系の詳細は公表されている（Osborne，J.A．ら，J．Clin ．Invest．83:465-473（1989））。簡単に述べると、体重３〜４kgのメスのニュ ージーランドホワイトウサギをペントバルビタールナトリウム(30mg/kg)で麻酔 した。下行胸部大動脈を摘出し、その血管から付着組織を取り除き、管腔内に挿 入した綿付きアプリケーターで穏やかにこすることによって内皮を除去した。そ の血管を5mmの環に切断し、トランスデューサー（モデルT03C、Grass Instrumen ts社、マサチューセッツ州クインシー）に接続されたスターラップに取りつける ことにより、等尺性張力の変化を記録した。血管環を37℃で7mlの酸素化クレブ ス緩衝液(pH7.5)に懸濁し、１μMノルエピネフリンで持続的収縮を誘導した。 酸素濃度の全域にわたって等価なベースライン張力が得られるように最善の試 みを行った;すなわち低酸素血管を過剰のフェニレフリンで収縮させた。酸素分 圧はO2微小電極（モデル733ミニ；Diamond General社、ミシガン州）を使って連 続的に測定した（Young，W.，Stroke，11:552-564(1980);Heiss，W.D.およびTra upett，H.，Stroke，12:161-167(1981);Dewhirst，M.W.ら，Cancer Res.，54:33 33-3336(1994);Kerger，H．ら，Am．J．Physiol.，268:H802-H810(1995)）。１ ％未満のO2は６〜７トルに相当する。低酸素血管は張力を維持するために過剰の フェニレフリンで収縮させた。SNO-Hb［FeII］O2（SNO-オキシHb）調製物は実施 例27のように合成し、定量した。GSNOは、Methods In Nitric Oxide Research（ M．FeelischおよびJ.S．Stamler編）、John Wiley & Sons社、1996の521〜539頁 、Stamler，J.S．およびFeelisch,M．著「Preparation and Detection of S-Nit rosothiols（S-ニトロソチオール類の調製と検出）」に記述されているように調 製し、アッセイした。 ヘモグロビンは、95％O2でも21％O2（室内の空気）でも主としてＲ（オキシ） 構造である（M.F．Perutz、Molecular Basis of Blood Diseases，G．Stammatay anopoulos編（W.B．Saunders社、フィラデルフィア、1987）の127〜178頁； Voet，D.およびVoet，J.G．（John Wiley and Sons社、ニューヨーク、1995）21 5〜235頁）。HbとSNO-Hbは共に、この範囲のO2濃度で血管を収縮させる。すなわ ち、それらのヘムは内皮からのNOを封鎖する。バイオアッセイにおけるこれらヘ ムタンパク質の機能的効果は容易には識別されない（図20Ａ）。SNO-Hbの濃度− 効果応答は、95％O2における（すなわちＲ構造の）天然Hbのものと実質上同一で ある（ANOVAによれば曲線は相違しない：各データポイントにつきｎ＝12）。50 μM SNO-オキシHb／オキシHb（すなわち、応答がプラトーに達する用量）まで同 等な収縮効果が見られた。同様の濃度−効果応答が21％O2で観察され、この条件 下でHb/SNO-Hbは約99％飽和である。 これに対し、Ｔ構造を促進する低酸素（＜１％O2[約6mmHg]、組織PO2をシミュ レートしたもの）（M.F．Perutz、Molecular Basis of Blood Diseases，G．Sta mmatayanopoulos編（W.B．Saunders社、フィラデルフィア、1987）の127〜178頁 ；Voet，D.およびVoet，J.G．（John Wiley & Sons社、ニューヨーク、1995）の 215〜235頁）では、Hbの活性とSNO-Hbの活性に差異が生じる；すなわち、HbがＴ 構造で血管を強く収縮させるのに対し、SNO-Hbは収縮させない（図20Ｂ）。SNO- HbとHbの濃度−効果応答は、１％未満のO2（約６トル）では（すなわちＴ構造で は）有意に異なる。天然デオキシHbは強力な収縮剤であるが、SNO-デオキシHbは ベースライン張力に適度な影響を及ぼす。（ほとんどの実験で、SNO-Hbは低用量 でわずかな収縮を引き起こし、最高用量では弛緩を開始した；一部の実験では（ 図21Ｃ参照）、用量依存的弛緩を引き起こした）。各データポイントにつきｎ＝ 13；ANOVAにより*P＜0.05；***P＜0.001。 SNO-Hb弛緩はグルタチオンによりS-ニトロソグルタチオン（GSNO）の形成を介 して増進される（図20Ｃ）。Ｔ構造ではSNO-HbからのNO基転移が促進されるので 、グルタチオンによるSNO-Hb血管張力の低下の強化はPO2と反比例する（図20Ｃ ）。具体的に述べると、SNO-Hbによるグルタチオンのニトロソ基転移（これによ って血管拡張剤GSNOが生成する）は、Ｔ構造（＜１％O2）で促進される。バイオ アッセイ槽に10μMグルタチオンを添加すると、SNO-Hbの血管張力低下応答が強 化される。この強化は低酸素条件で最大になる；すなわち、１％未満のO2に関す る曲線は、ANOVAで互いに相違しない95％および21％O2曲線（各データポイント につきｎ＝６）の両方と、統計的有意差を示す(Ｐ＜0.001)。高濃度のグルタチ オン(100μM〜1mM)はSNO-Hb弛緩をさらに強化して、その応答は図20ＤでGSNOの 存在下に見られるものと実質上同一になる。10μMでグルタチオンは天然Hb収縮 に対して影響を及ぼさない。 これに対し、S-ニトロソグルタチオンの血管張力低下効果は、PO2とはほとん ど無関係であり（図20Ｄ）、スーパーオキシドジスムターゼによって修飾されな い（データを示さず）。S-ニトロソグルタチオン（GSNO）の濃度一効果応答は、 生理的範囲のPO2とはほとんど無関係である（各データポイントにつきｎ＝６） 。結果は、O2/O2−不活化に対するGSNOの既知の耐性と合致する（Gaston，B.ら ，Proc．Natl．Acad．Sci．USA，90:10957-10961(1993)）。したがって、Ｔ構造 ではSNOによる弛緩がヘムでのNO補集によって引き起こされる収縮を圧倒し、他 方、Ｒ構造ではその反対になる。実施例23：赤血球内S-ニトロソヘモグロビン(SNO-RBC)の生物活性 赤血球の収縮効果は、低PO2（すなわちＴ構造を促進する条件下）で細胞内SNO -Hbによって逆になるが、高PO2では逆にならない。SNO-RBCの低用量および高用 量効果をそれぞれ図21Ａと図21Ｂに示す。 血管環の調製とバイオアッセイの方法を実施例22に記述する。SNO-オキシHbを 実施例27に記述するように合成し、定量した。SNO-Hbを含む赤血球(SNO-RBC)を ヘモグロビンに対して10倍過剰のS-ニトロソシステインで５〜10分間処理するこ とによって合成した。この条件下では赤血球は明るい赤色で、SNO-オキシHbを含 有する;これらの実験ではメトHbは検出できなかった。 SNO-Hbを含有する赤血球(SNO-RBC)は血管環バイオアッセイにおいて無細胞SN O-Hbと同様に機能する。具体的には、低濃度のSNO-RBC（約0.1μM SNO-Hb）は95 ％O2で適度な収縮効果を誘発したが、低酸素下ではこれを誘発しなかった（図21 Ａ）。95％O2では、SNO-RBC（約0.1μM SNO-Hb［FeII］O2）も天然RBCも共に適 度な収縮効果をもたらし、それらは容易には識別されなかった。RBCによる収縮 は、低酸素条件下（＜１％O2）ではより大きくなる傾向があったが、SNO-RBCの 場合は逆であった（わずかな弛緩効果がみられた）。SNO-RBCのこれらのO2依存 的応答は、無細胞調製物のものとよく似ている。溶血はわずかで、観察された効 果の説明にはなりえなかった。 高濃度では、グルタチオン存在下での無細胞SNO-Hbとよく似て、SNO-RBCは95 ％O2でわずかな一過性の弛緩をもたらし、低酸素下ではより大きい持続性の弛緩 をもたらした（図21Ｂ）。例えば、SNO-RBC（約１μM SNO-Hb［FeII］O2）は、9 5％O2で14.5±0.7分間持続する32.5±1.2％の弛緩を引き起こしたのに対し、１ ％未満のO2では23±分持続する61±10％の弛緩を引き起こした（ｎ＝３〜４；Ｐ ＜0.05）。対照的に、SNO-Hbを含まない赤血球は、低酸素によって強化されるわ ずかな収縮（無細胞Hbの場合より小さいもの）をもたらした（95％O2での13±2. 0％に対し、１％未満のO2では25±５％；Ｐ＜0.05）。これらの実験における溶 血はわずかで、SNO-RBCによる弛緩の程度を説明できるものではなかった。 95％O2で、SNO-RBC（約１μM SNO-Hb［FeII］O2）が動脈環の弛緩をもたらし たのに対し、天然RBCはわずかな収縮をもたらした。どちらの効果も低PO2ではよ り顕著になった。すなわち、赤血球内SNO-HbとHbの弛緩および収縮は、それぞれ 95％O2より１％未満のO2のほうが大きく、また寿命が長かった。SNO-RBCのO2依 存的応答は、グルタチオン存在下での無細胞SNO-Hbのそれによく似ていた。これ らの実験における溶血はわずかで、SNO-RBCによる弛緩の程度の説明にはなりえ なかった。 低酸素に対する体動脈の正常な応答は、拡張であり、高PO2に対する正常な反 応は収縮である。SNO-HbとHbの存在下でのPO2の変化に対する血管環の応答を試 験した（図21Ｃ）。低酸素条件（６〜７トル）下に血管環をフェニレフリンで収 縮させた後、１μMのHbかSNO-Hbのいずれかにばく露した。Hbは血管張力の漸進 的増加をもたらし、一方SNO-Hbは弛緩を引き起こした。95％O2の導入はどちらの 場合も迅速な収縮をもたらした。このようにPO2によってもたらされるSNO-Hbの 構造変化は、収縮または弛緩にすばやく移されるが、HbはＲ構造でもＴ構造でも 血管を収縮させる。したがって、Hbは生理的応答に抵抗し、SNO-Hbはそれを促進 する（図21Ｃ）。平滑筋に対するO2の直接的効果は、SNO-Hbと協調的に作用して 、血管張力を調節する。実施例24：S-ニトロソヘモグロビン（SNO/Hb）とニトロシルヘモグロビン(FeNO /Hb) の内生レベルに対するO2分圧の影響 O2によるSNO-Hbのアロステリック制御を、小動脈周囲の酸素勾配の摂動により 、イン・ビボで評価した。室内の空気（21％O2）を呼吸している動物では、毛細 血管前の抵抗血管(100〜10μm)が、HbのＴ構造を促進する10〜20トルと同じ低さ のPO2にさらされる（Duling，B.およびBerne，R.M.，Circulation Research，27 :669(1970);Popel，A.S.ら（誤植：Am．J．Physiol．26(3)，パート2）Am．J．P hysiol．256，H921(1989);Swain，D.P.およびPittman，R.N.，Am．J．Physiol． 256，H247-H255(1989);Buerk，D．ら，Microvasc．Res.，45:134-148(1993)）( ここで確認された)。吸気酸素濃度を100％に上げても、小動脈周囲のPO2は40mmH gと同じ高さにしかならない(Duling，B.およびBerne，R.M.，Circulation Resea rch，27:669(1970);Popel，A.S.ら（誤植：Am．J．Physiol．26(3)，パート2）A m．J．Physiol．256，H921(1989);Swain，D.P.およびPittman，R.N.，Am．J．Ph ysiol．256，H247-H255(1989);Buerk，D．ら，Microvasc．Res.，45:134-148(19 93));すなわち、100％O2を呼吸することでは、微小循環系中のHbのＲ構造を完全 には維持できない。小動脈周囲のO2勾配（PO2の動脈−小動脈差および動脈−静 脈差）の除去は、100％O2を呼吸しながら３気圧 の絶対圧(ATA)をかけることにより、高圧室内で達成される（Tibbles，P.M．お よびEdelsberg，J.S.，N.E.J.M.，334:1642-1648(1996)）。 成熟したオスのスプレーグドーリーラット（290〜350g）をペントバルビター ルナトリウム（50mg/kg腹腔内）で麻酔し、挿管し、小動物用人工呼吸器（Edco Scientific社、ノースカロライナ州チャペルヒル）を使って正常なPaCO2値（35 〜45mmHg；PaCO2＝体動脈血の二酸化炭素分圧）が維持される呼吸数と一回換気 量で人工呼吸を施した。薬物を注入するために、また体血圧を連続的にモニター するために、それぞれ大腿静脈と大腿動脈にカニューレを挿入した。血液のガス 分圧とpHを測定するために、動脈血のアリコート(200μl)を定期的に採血した（ Instrumentation Laboratory社、モデル1304血液ガス/pH分析器）。その血液は 、３体積の標準食塩水で、静脈注射により置き換えられた。吸気O2濃度は窒素で 埋め合わせた既混合ガスを使って変化させた。組織PO2は、左右海馬の両方(AP− 3.4mm、ML＋2.2mm)、尾状核被殻(caudate putamen nucleus)および黒質（下記座 標参照）に定位的に埋め込まれたポーラログラフ白金微小電極（外径50μm、ガ ス透過性の疎水性ナフィオン（Nafion）でコーティングされたもの）で連続的に 測定した（Young，W.，Stroke，11:552-564（1980）；Heiss，W.D．およびTraup ett，H.，Stroke，12:161-167（1981）；Dewhirst，M.W.ら，Cancer Res.，54:3 333-3336（1994）；Kerger，H.ら，Am．J．Physiol.，268:H802-H810(1995)）。 PO2電極には、尾に設置した遠隔Ag/AgCl基準電極に対して−0.65Vの極性を与え 、低インピーダンスnAメーターを使って電流を測定した。局所動脈PO2は吸気O2 濃度と気圧を変化させることによって調節した。 局所血流の測定用に、ポーラログラフ水素（H2）感応性微小電極を黒質(ブレ グマに対してAP−5.3mm、ML−2.4mm、深さ3.2mm)、尾状核被殻（CPN）(AP＋0.8m m、ML−2.5mm、深さ5.2mm)および頭頂皮質に定位的に埋め込んだ（Young，W.，S troke，11:552-564（1980）；Heiss，W.D．およびTraupett，H.，Stroke，12:16 1-167(1981)）。これらの微小電極は白金線から作られ、ナフィオンでコ ーティングされた先端(1mm)以外はエポキシで絶縁された。設置のために、電極 をマイクロマニピュレーターに取りつけ、ラットの頭部をKopf定位固定フレーム に固定した。H2感応性電極には尾の遠隔基準電極に対して＋400mVの極性を与え 、１分間の水素ガス（2.5％）吸入中と吸入後に、低インピーダンスnAメーター を使ってポーラログラフ電流を測定した。水素クリアランス曲線と酸素測定用の 電圧は共にPCWINDAQ（ソフトウェア、DI-200 AC、Dataq Instruments社、オハイ オ州アクロン）を使って作成した。脳血流は初期傾斜法を用いて計算した（Youn g，W.，Stroke，11:552-564(1980);Heiss，W.D.およびTraupett，H.，Stroke，1 2：161-167(1981)）。局所血流応答は薬物投与前の30分間と薬物投与後の30分間 モニターし、時刻０にヘモグロビンを与えた。 まず室内の空気（21％O2）にさらした後、高圧室で100％O2+3ATAにさらした５ 匹のラットの頸動脈（脳を灌流する動脈血）と上大静脈／右心房（心臓へ戻る静 脈）の留置カテーテルから血液を採取した。SNO-HbとニトロシルHb（Hb［Fe］NO ）のレベルを、脳を灌流する血液中のSNO-HbとニトロシルHb(Hb［Fe］NO；図９ のFeNO/Hb)の尺度として、これらの検体から決定した。 直ちに処理し分析するため、血液試料を氷上に移した。800gで10分間の遠心分 離の後、パックした赤血球を単離し、２倍体積過剰のPBS（pH7.4）で洗浄し、再 懸濁し、さらに遠心分離した後、PBSを除去した。次に、0.5mM EDTAを含む４倍 過剰の脱イオン水と共に10分間インキュベートすることによって溶血を果たした 後、室温でPBS中のG-25セファデックスクロマトグラフィースピンカラム（10〜3 0倍体積過剰）に通してすばやく脱塩することによりヘモグロビンを精製した。 総Hb濃度を可視分光光度法によって決定した。存在するHb種を（過剰のS-ニトロ ソシステインの存在下に亜ジオチン酸塩を添加することによって）Hb（FeII）NO に変換した後、それを418nmで135.4というミリモル吸光係数を用いて測定した。 ヘモグロビンの各試料を200μMに希釈し、一対にしたアリコートを等体積の 蒸留水か7.5倍モル過剰のHgCl2（これはチオール結合型NOを選択的に切断する） で処理した。より高濃度のHgCl2はHbを沈殿させる（A.F．Riggs，R.A．Wolbach ，J．Gen．Physiol．39：585，1956）。HgCl2濃度はタンパク質に対して４倍過 剰まで減らしても極めてよく似た結果を与える。６倍過剰のHgCl2濃度と１〜10 分間のインキュベーション時間も使用されている（各反応混合物について実験的 に決定）。ヘモグロビンの代わりに有機水銀剤が使用されている。これらは高濃 度でも沈殿を引き起こさないが、より緩慢に反応する。いずれの場合も水銀剤は チオールからNO基を選択的に切断し、ヘムでの結合を保つ。NOは、NOをチオール （SNO-Hb）またはヘム（Hb［FeII］NO）から光分解的に遊離させ、そのオゾンと の反応の化学発光性生成物を測定する光分解−化学発光法で測定した。標準曲線 はS-ニトロソグルタチオンを使って作成した。実施例８に関する実施例および方 法 の項の最初にある「アッセイ用の物質および方法」の「S-ニトロソヘモグロビ ンとニトロシル（FeII）−ヘモグロビンのアッセイ」を参照されたい。 静脈血（室内の空気）の平均O2飽和度は69％であり、動脈血（室内の空気）の は93％、静脈血（100％＋3ATA）のは93％、動脈血（100％＋3ATA）のは100％だ った（図22）。数値統計の比較は、高度に有意だった。例えば、SNO-Hb静脈100 ％O2＋3ATA対SNO-Hb静脈21％O2はP=0.004、ニトロシルHb静脈21％O2対動脈21％O2 はP=0.008だった。他方、SNO-HbとニトロシルHbは、（同じO2飽和度を持つ）静 脈100％＋3ATAと比較して動脈21％O2で相違せず、静脈および動脈100％O2＋3ATA 間でも相違は有意には達しなかった。すべての測定についてｎ＝５。 21％O2では、静脈血は主としてニトロシルHbを含有したが、動脈血は有意な量 のSNO-Hbを含有した（図22）。これに対し、100％O2＋3ATAでは、SNO-Hbが動脈 血でも静脈血でも優勢だった（図22）。高圧条件では組織は主として血漿に溶解 したO2によって酸素化される。HbによるO2の放出を生理的に回避することは、内 生SNO/ニトロシルHbバランスを変化させる。このデータは、SNO-HbがＲ構造で内 生的に生成するらしいのに対し、SNOがＴ構造で放出されることを示している（ 静脈21％O2（Ｔ状態）を動脈100％O2＋3ATA（Ｒ状態）と比較されたい）。 このイン・ビボでの構造−機能関係は、１）O2がHb S−ニトロシル化のアロス テリックエフェクターであること；２）Hbのヘムに対するNOの結合がＴ構造で有 利になること；（動脈−静脈(A-V)移行中に放出されるNOの一部はヘムで自己捕 捉されるようである）、および３）A-V O2勾配を除去することによってＲ構造で の内生SNO-Hbを維持すると、SNOのレベルが保たれること（静脈100％O2＋3ATAを 動脈21％O2と比較されたい）を示唆するイン・ビトロ薬理学および分子モデルの 両者と合致している。したがって、SNO-Hbは、SNOがA-V移行中に容易に放出され る条件下である21％O2での脳血流を改善するはずだが、動脈と静脈でＲ構造を維 持する過酸素条件下では脳血流を改善しないはずである。実施例25：局所脳血流に対するSNO-HbとHbのO2依存的効果 実施例24と同様に脳のいくつかの領域に定位的に設置したO2およびH2（血流） 感応性微小電極を使って、成熟したオスのスプレーグドーリーラットでSNO-Hbの 脳血管効果を測定した。 SNO-Hbは組織低酸素下では血流を増加させるのに対し、過酸素下では血流を減 少させる。対照的に、HbはPO2とは無関係に血流を減少させる。黒質（SN）、尾 状核被殻および頭頂皮質内の局所血流に対するSNO-Hb（●）とHb（■）（１μmo l/kgを３分間にわたって注入）の相対的な効果を３つの異なる条件について示す 。21％O2では、SNO-Hbが試験した脳の３領域すべての血流を改善したのに対し、 天然Hbは局所血流を減少させ、低酸素組織へのO2送達を逆説的に弱めた（図23Ａ 、23Ｂおよび23Ｃ；ANOVAによるとすべての曲線は互いに、またベースラインと 、著しく統計的に有意に異なる）。小動脈周囲のO2勾配が本質的に除去されてい る100％O2を呼吸しているラットでは、SNO-Hbに対する血流の増加が有意に弱め られた（すなわちSN増加だけが統計的に有意になった）が、Hbによる血流の減少 は維持された（図23Ｄ、23Ｅおよび23Ｆ；ANOVAではどの曲線も互いにＰ＜0.05 の水準で相違したままである）。100％O2＋3ATAでは、SNO-HbとHbの両方が同等 程度に脳血流を減少させる傾向を示した（図23Ｇ、23Ｈおよび23Ｉ；ANOVAでは 曲線は相違しなかった）。S-ニトロソグルタチオン（GSNO）は100％O2と100％O2 ＋3ATAで脳灌流を増加させ、防御的血管収縮を覆した。ベースライン血流は100 ％O2と比較して100％O2＋3ATA下では約10％まで減少した。全てのデータポイン トについてｎ＝７。組織／微小血管PO2の値は、21％O2で19〜37mmHg、100％O2で 68〜138mmHg、100％＋3ATAで365〜538mmHgの範囲に及んだ（デューク大学メディ カルセンター高圧室）。 頭頂皮質での局所血流に対するHbとSNO-Hbの効果は、図23Ｃ、23Ｉおよび23Ｆ に示す結果を比較することによって示すことができる。21％O2（組織／微小血管 PO2は19〜37mmHg）では、Hbが血流を減少させるのに対し、SNO-Hbは血流を増大 させる（図23Ｃ）。SNO-Hbに応答して起こる血流の増加は100％O2では有意に弱 められ(図23Ｆ；組織PO2は68〜138mmHg)、100％O2＋3ATAでは血流の減少に変換 される(図23Ｉ；組織PO2は365〜538mmHg)。これに対し、HbまたはGSNOに対する 応答は酸素依存的でなかった；PO2とは無関係にHbは血流を減少させ、GSNOはこ れを増加させた。したがって、SNO-Hbは抵抗小動脈中の生理的酸素勾配に応答し て血流を独特に調節する。 SNO-HbはそれがＲ（オキシ）構造であるときは天然Hb（正味のNOスカベンジャ ー）のように作用し、Ｔ（デオキシ）構造ではGSNO（正味のNO供与体）のように 作用する。これらの結果は、SNO-Hbはその血管作用性がPO2によってアロステリ ックに制御されるニトロソチオールであるという結論と一致する。実施例26：様々なO2濃度での無細胞および赤血球内SNO-Hb、HbおよびGSNOの血液 動態 ラットをペントバルビタールの腹腔内注射によって麻酔し、局所切開により大 腿動脈と大腿静脈にアクセスした。次に動脈にカニューレを挿入し、Gould製レ コーダーに取りつけたP23 XL圧力変換器（Viggo Spectramed社、カリフォルニア 州オックスナード）を用いて血圧を連続的にモニターした。大腿静脈は薬物およ びSNO-Hbを含む赤血球の注入(１分間にわたって1ml)に使用し、IBM PC（WINDAQ 200、Dataq Instruments社；オハイオ州アクロン）をデータ収集に使用した。 血圧が安定（約30分）してから、大腿静脈を通して１μmol/kgの薬物を１分間 かけて注入した。示した測定値（図24Ａ）は薬物の注入後10分の時点で得た。同 様の応答が３分と20分で見られた。SNO-HbがHbよりも有意に少ない血圧の上昇を もたらしたのに対し（Ｐ＜0.05）、GSNOは血圧を減少させた。SNO-Hbに対してＰ ＜0.05；ベースライン血圧に対して*P＜0.05、**P＜0.01）。各薬物につきｎ＝ ５〜６。 SNO-RBCの注入もGSNO様効果と一致して血圧を低下させた（図24Ｂ）。SNO-RBC は（無細胞SNO-Hbのものと似た）用量依存的な血圧降下効果をもたらした(ベー スラインに対して全てのポイントでＰ＜0.001)。SNO-RBCの血圧降下効果はNOシ ンターゼ阻害剤NG-モノメチル-L-アルギニン(L-NMMA；50mg/kg)の前投与によっ て強化された。各データポイントにつきｎ＝８。ANOVAで異なる曲線（Ｐ＜0.01 ）、L-NMMAに対して*P＜0.05。これらの実験における溶血の量はごくわずかだっ た。溶血液の注入は血圧に影響を及ぼさなかった。 NOシンターゼ阻害は、組織中のNOによってもたらされるミトコンドリア呼吸の 阻害を軽減することにより、組織O2消費を増加させる（King，C.E.ら，J．Appl ．Physiol.，76(3):1166-1171(1994);Shen，W．ら，Circulation，92:3505-3512 (1995);Kobzik，L．ら，Biochem．Biophys．Res．Comm.，211(2):375-381（1995 ））。次に、これは小動脈周囲のO2勾配を増加させるはずであり、それが強化の 一部の説明になるかもしれない。しかし、L-NMMAによって課せられる張力や血流 分布の変化などといった他の要因も十分に寄与しうる。血圧に対するSNO-Hbの効 果は、SNOが抵抗小動脈で放出されてヘム鉄で補集されるNOを補うこと と合致する。実施例27：S-ニトロソヘモグロビン類の合成 物質と方法 L-システイン塩酸塩、グルタチオン、スルファニルアミドおよびN-（1-ナフチ ル）エチレンジアミン(NED)はSigma Chemical社（ミズーリ州セントルイス）か ら購入した。硝酸ナトリウムとフェリシアン化カリウムはAldrich Chemical社（ ニュージャージー州フェアローン）から購入した。G-25セファデックス（ファイ ン）はPharmacia Biotech社（スウェーデン・ウプサラ）から購入した。精製（ 約99.00％）ヒトHbAo既に記述されているように調製し、−80℃で保存した(R.G ．Kilbourn，G．Joly，B．Cashon，J．DeAngelo，J．Bonaventura，Biochem．Bi ophys．Res．Comm．199:156，1994)。最終緩衝液は乳酸リンゲル液（pH7.4）と した。一酸化窒素溶液は、高純度KOH洗浄NOガスを厳密に脱気したリン酸緩衝食 塩水(PBS)または脱イオン水の溶液に吹き込むことにより、トノメーターで調製 した。EDTAはエチレンジアミンテトラ酢酸である。S- ニトロソ−オキシヘモグロビン（SNO-Hb［Fe（II）］O2）の合成 S-ニトロソオキシヘモグロビン（SNO-Hb［FeII］O2）の合成における第一の技 術的課題は、特定のチオールを選択的にニトロシル化し、ヘムの酸化を避けるこ とである。したがってSNO-Hb（FeII）O2の製造法は、他のS-ニトロソタンパク質 の合成について以前に記載されたものとは著しく異なる（J．S．Stamler，D.I． Simon，J.A．Osborne，M.E．Mullins，O．Jaraki，T．Michel，D.J．Singel，J ．Loscalzo．Proc．Natl．Acad．Sci．89:444，1992）。アルカリ性緩衝液ではS -ニトロシル化速度が加速され、ヘムの酸化速度は減速される。 ヘモグロビン(Hb)Aoを既に記載されているようにヒト赤血球から精製した(Kil bourn，R.G.ら，Biochem．Biophys．Res．Commun.，199:155-162(1994))。 HbAo(0.5〜1.0mM)を２％曝気ホウ酸塩、0.5mM EDTA(pH9.2)に対し４℃で12〜1 6時間透析した。オキシHb濃度は、577nmでの光学吸光度に基づいて（すなわちミ リモル吸光係数14.6を用いて）決定した。効果的な合成のために過剰量のニトロ シル化剤を使用するが、（Hb中の他のチオールとヘムに対する）Cys β93の選択 的修飾を確実にするための処置を講じる必要がある。 Hbを、下記のように、使用する直前に標準的方法の変法（例えばMethods In N itric Oxide Research，M．FeelischおよびJ.S．Stamler編，John Wiley & Sons 社，1996の521〜539頁、Stamler，J.S．およびFeelisch，M.著「Preparation an d Detection of S-Nitrosothiols（S-ニトロソチオール類の調製と検出）」を参 照されたい）により高濃度で合成した10倍モル過剰のS-ニトロソシステイン(Cys NO)と反応させた。0.5N HCl/0.5mM EDTAに溶解したL-システイン塩酸塩（1.1M） を、水に溶解した等容量の1M NaNO2（亜硝酸ナトリウム）と反応させてCysNOを 形成させ（システインと亜硝酸塩の比はSNO-Hb生成物および活性プロファイルに 影響を及ぼす）、そしてヘモグロビン溶液に添加する前に100〜200mM PBS（pH7. 4〜8.0、0.5mM EDTAを含む）に希釈することによって中和する。次に、PBS（pH8 .0）に希釈することによってCysNOの濃度を調節して、作業CysNO溶液（pH６〜７ ）を得た。オキシヘモグロビン(ホウ酸塩中、>100μM、pH9.1〜9.2)を、Hbに対 して10倍モル過剰のCysNOと共にインキュベートすることにより、S-ニトロシル 化した（比率は生成物に決定的な影響を及ぼす）。インキュベーション時間は、 所望する合成品によって（すなわち、所望のSNO/四量体比、所望のポリニトロソ 化または非ポリニトロソ化メトHb対オキシHb対ニトロシルHb比）によって決まる 。例えば、四量体あたり２個のSNOを持つSNO-オキシHbには、10分間が好ましい 。反応は、100mM PBS(pH7.4)，0.5mM EDTAと前もって平衡化しておいたファイン セファデックスG-25のカラム（ベッド体積は反応混合物の体積に対して10〜30倍 過剰にすべきである）に反応混合物をすばやく移すことによって停止させた。典 型的には150μlの混合物試料を12mm（内径）の4.5mlカラムに 加えた。次にそのカラムを800〜1200gで60秒間遠心分離し、精製SNO-オキシHbを 含有する流出液を1.5ml気密プラスチックバイアルに集め、つづいてそれを氷上 に保持して遮光した。 総Hb濃度は亜ジチオン酸塩と過剰のCysNOを逐次添加（これにより、存在するH b種はHb（FeII）NOに変換される）することによって決定した。Hb（FeII）NOの ミリモル吸光係数は418nmで135.4（ヘムに基づく）である。試料は毎日新しく調 製することが最善ではあるが、SNO-Hb（FeII）O2は極めて安定である。 SNO-HbのS-ニトロソチオール含量はSavilleの方法の変法によって決定した。 この方法により、Hg++（HgCl2に由来するか、4-（クロロメルクリ）ベンゼンス ルホナートなどの有機水銀剤に由来するもの；Hbに対し５〜10倍過剰）で置換さ れたNO同等物を、スルファニルアミドのジアゾ化とそれに続く発色団N-(1-ナフ チル)エチレンジアミン(NED)とのカップリングによってアッセイした。540nmで の光学密度の測定値から、標品S-ニトロソグルタチオン（GSNO）のものと対照し てSNO濃度を決定した。これらのアッセイは96ウェルマイクロプレートリーダー （Molecular Devices社、カリフォルニア州サニーヴェール）で行った。各試料 ウェルは５μlのSNO-Hb/95μl 0.5N HCl/100μlスルファニルアミド/100μl NED を含んだ。必要であればヘモグロビンの沈殿を防ぐためにトリトンX-100（0.03 〜0.1％）が使用されている。 CysNOをHbAと共にインキュベートすると、時間の経過と共に異なる合成生成物 （と異なる活性）が生じた。例えば10分間のインキュベーションでは、Hb調製品 が四量体あたり1.857±0.058個のSNO基を含有し、約12〜15％メトHbおよび１〜 ３％ニトロシル（FeII）−ヘモグロビンである。キャピラリー電気泳動分析によ り、３つのタンパク質ピークの混合物であることが明らかになった。次に嫌気条 件下（アルゴンガスで最低10分間脱気することによって達成）でメトHbを還元し た（PBS（pH8.0）に溶解した100倍過剰のNaCNBH3で13％から２％に低下）。これ より低いNaCNBH3濃度や好気条件下での試料の処理はメトHb濃度の低下に は有効でなく、ヘムを還元するための他の手段はSNO還元をもたらした。得られ た混合物を、100mM PBS(pH7.4)，0.5mM EDTAと前もって平衡化しておいたファイ ンセファデックスG-25（20〜30倍体積過剰）のカラムにすばやく加えた。最終的 なS-ニトロソチオール/Hb四量体比は、脱気してPBSのみで処理した試料で測定さ れるものと有意に相違しなかった：出発比と比較したSNO/Hb比の損失はSNO-デオ キシHbの予想される時間依存的崩壊と合致し、調製時間を考慮することによって 問題にならない損失まで低下させることができた。約１の平均SNO/Hb比を持つ試 料のNaCNBH3処理は、メトHb含量を5.6％から0.63％に減少させた。合成法の変法 SNO-オキシHb調製品または組成物に約２％未満のニトロシル（FeII）−ヘモグ ロビンとメトHbが混入していても、それらはSNO-オキシHbの生物活性を変化させ ず、O2結合測定（すなわちP50決定）が可能なようであるから、それらは許容で きる。生物活性は組成物中のSNO-メトHb（高および低スピン）とニトロシル（Fe II）−ヘモグロビンの割合を制御することによって、修正および変更できる。メ トHbのスピン状態はヘムリガンドによって制御でき、シアン−メトHbは低スピン であり、アクオ−メトHb（H2Oがリガンドとして結合）は高スピンである。所望 の割合のニトロシルヘモグロビンを調節できる（とりわけ実施例16を参照された い）。ヘムリガンドタンパク質を出発物質として使用することにより、高収率の SNO-メトHb、SNO-ニトロシル（FeII）−ヘモグロビンを形成させうる。カルボモ ノオキシHbは、嫌気条件下にCOでガス処理することによって製造できる。そして HbCOはSNO-カルボキシル-Hbを製造するための出発物質として使用できる。様々 な組み合わせのHb［FeNO］［FeCO］も出発物質として使用できる。S- ニトロソ−デオキシヘモグロビン（SNO-Hb［Fe（II）］）の合成 単離されたSNO-デオキシHbは、SNO-オキシHbについて記述した一般法を用いて 、嫌気環境（グローブボックス）で合成される。ヘモグロビン溶液と他の合成材 料をグローブボックス中で一晩平衡化させる。Hb溶液のUV−可視スペクトルは合 成を開始する前に純粋なデオキシHb（430nmのソーレー領域ピーク）のスペクト ルであるべきである。精製されたSNO-デオキシHb試料はグローブボックスから取 り出す前にトノメーターまたは密閉したキュベットに移す。単離されたSNO-デオ キシHbは著しく不安定であり、直ちに使用しなければならない。S- ニトロソ−メトヘモグロビン（SNO-メトHbまたはSNO-Hb［Fe(III)］と略記） の合成 オキシヘモグロビン(0.5〜1.0mM、0.5mM EDTAを含む150mMリン酸緩衝液中、pH 7.4)を（ヘモグロビン四量体に対して）10倍モル過剰のNaNO2またはフェリシア ン化カリウムK3Fe(CN)6と室温で10分間反応させることにより、単離されたメト ヘモグロビンを製造した。その反応混合物を、遠心分離によってファインG-25セ ファデックスのカラム（10倍体積過剰、0.5mM EDTAを含むPBS（pH7.4）と前もっ て平衡化しておいたもの）に通して脱塩した。次にメトヘモグロビンへの変換の 完全性を分光光度法で確認した。（Methods in Nitric Oxide Research，M．Fee lischおよびJ.S．Stamler編、1996、John Wiley and Sons社、イングランド・チ チェスター中のV.G．Kharitonov，J．Bonaventura，V.S．Sharma著「Interactio ns of nitric oxide with heme proteins using UV-vis spectroscopy（UV−可 視分光法を用いた一酸化窒素のヘムタンパク質との相互作用）」）。メトヘモグ ロビンを、CysNOと共にインキュベートすることによってS-ニトロシル化し、継 続時間は、SNO-Hb（FeII）O2の合成で記載したように、所望するS-ニトロシル化 の程度によって決定した。G-25セファデックスクロマトグラフィーカラム（反応 混合物に対し10〜30倍体積過剰）に反応混合物をすばやく移した後、急速な遠心 分離とプラスチックバイアルへの流出液の収集によって、反応を停止した。精製 されたSNO-メトHbは本質的に不安定であり、頻繁に再合成すべきである。生理的条件下での反応混合物中の部分的にニトロシル化されたデオキシHbとS-ニ トロソ−オキシヘモグロビンのNO/SNO含量の測定 単離されたSNO-Hb（FeII）O2とHb（FeII）NOを、比較的生理的なNO対Hb比で調 製した。SNO-Hb（FeII）O2を上述のように合成し、100μM Hb（FeII）O2/PBS pH 7.4/0.5mM EDTA中で１μMに希釈して、SNO-Hb（FeII）O2とHb（FeII）O2の比を １：100にした。嫌気条件下で100μM（最終）デオキシHb/PBS pH7.4/0.5mM EDTA に飽和NO溶液を加えることにより、Hb（FeII）NO（１μM NO：100μMデオキシHb ）を調製した。HgCl2(最終濃度600μM)の不在下（NO結合型）または存在下（Hg 後のNO）で光分解−化学発光法によりNOを測定した。図25のデータ（ｎ＝５）は 平均±SEMを表す。均等物 当業者は、本明細書に記載の発明の特定の態様に対する数多くの均等物が日常 的な実験を用いるだけで確認されることを理解し、またはそれを行うことができ るだろう。これらのそして他の全ての均等物は、下記請求の範囲に包含されるも のとする。
【手続補正書】特許法第１８４条の８第１項 【提出日】平成１１年２月２５日（１９９９．２．２５） 【補正内容】 条件によっては、NOと細胞および血清中に存在する他の成分との反応によって、 毒性の中間体と産物が、感染性生物の増殖を阻害するのに有効な組織内局所濃度 で生成しうる。したがって、NOまたはその生理活性型の有効濃度を投与する方法 は、ある種の医学的障害に有益であろうと考えることができる。 血小板活性化は、血液凝固および血栓症素因の本質的な要素である。また、血 小板の活性化は、局所的な血栓症が痛みを伴う発症の中枢であると考えられる鎌 状赤血球症などの血液異常において見られる。したがって、血小板凝集の阻害は 、心臓発作、鼓動およびショック（転移血管内凝集）において、ならびに末梢血 管疾患、心臓疾患、脳疾患、肺疾患およびアテローム性動脈硬化症のような慢性 状態において重要な治療目標である。研究者らは、前記疾患段階の全てにおける 酸素送達を促進するために人工ヘモグロビンを与える試みをなしている。しかし ながら、最近オルセン（Olsen）および共同研究者らによって指摘されたように 、非誘導ヘモグロビンの投与は、血管損傷部位での血小板活性化を導く（オルセ ン，Ｓ．Ｂ．(Olsen，S．B.)ら、Circulation 93:327-332（1996））。この主要 な問題は、専門家を、無細胞非誘導ヘモグロビンが血管疾患または凝固異常を有 する患者において血液凝固を生じるという重大な危険を提起すると結論する方向 に導いている（マーカス，Ａ．Ｊ．（Marcus，A．J.）およびＪ．Ｂ．ブローク マン(J．B．Broekman)、Circulation 93:208-209（1996））。新規な酸素キャリ アーの提供方法および／または血小板活性化の阻害方法は、血管疾患を有する患 者またはさもなければ血栓症の危険のある患者に利益があるであろう。 いくつかのＳ−ニトロシル化タンパク質が製造されており（ウシ血清アルブミ ン、カテプシンＢ、免疫グロブリン、リポタンパク質および組織プラスミノーゲ ン活性化因子）、それらの血管拡張効果および血小板凝集効果が観察されている （国際公開第９３／０９８０６号パンフレット：国際公開第９６／３０００６号 パンフレット）。ニトロソ−ヘモグロビンは、代用血液として提唱されている（ 国際公開第９６／３０００６号パンフレット）。 ジア(Jia，L.)ら(Nature 380:221-226，1996)は、ＳＮＯ−ヘモグロビンを製 造するためのヘモグロビンとＳ−ニトロソチオールとの反応、ならびにＳＮＯ− ヘモグロビンからのＮＯ基放出により媒介されるように、無細胞系溶液中および 赤血球内でのＳＮＯ−ヘモグロビンの生理学的効果を記載している。発明の概要 本発明は、ヘムの酸化を回避する方法におけるＨｂとＳ−ニトロソチオールと の反応による、ＳＮＯ−Ｈｂ（治療に使用するオキシ−、デオキシ−、またはメ ト−ヘモグロビン等を含むＳ−ニトロソヘモグロビン）の製造および単離方法に 関する。請求の範囲 １． ＮＯ：ヘムのモル比が約１：１００未満となるように水溶液中のデオキシ ヘモグロビンに溶解気体としてのＮＯを添加する工程を含む、安定なニトロシル ヘモグロビンの製造方法。 ２． オキシヘモグロビンと約１０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、ｐＨ７．４の少な くとも約９．４のｐＫを有する緩衝液との水溶液に溶解気体としてのＮＯを添加 する工程を含む、ＳＮＯ−オキシヘモグロビンの製造方法。 ３． ＮＯ：ヘモグロビンのモル比が約１：３０未満となるように水溶液中のオ キシヘモグロビンに溶解気体としてのＮＯを添加する工程を含む、ＳＮＯ−ヘモ グロビンの製造方法。 ４． 動物またはヒトにＣＯ誘導化ヘモグロビンを投与することを含む、動物ま たはヒトにおいて、組織にＣＯを送達する方法。 ５． 動物またはヒトにＣＯ誘導化ヘモグロビンおよびニトロソ化ヘモグロビン を投与することを含む、動物またはヒトの組織に生体系に存在するようにＮＯを 送達する方法。 ６． １以上の電子受容体に複合体化したニトロシルヘモグロビン。 ７． 電子受容体がスーパーオキシドジスムターゼ、安定なニトロオキシドラジ カルならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニン ジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌクレ オチド、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸の酸化型からなる群より 選ばれたものである請求項１２記載のニトロシルヘモグロビン。 ８． ニトロシルヘモグロビンおよび１以上の電子受容体を含有してなる組成物 。 ９． 一酸化窒素シンターゼに複合体化したヘモグロビン。 １０． 一酸化窒素シンターゼがニューロンの一酸化窒素シンターゼである請求 項１５記載のヘモグロビン。 １１． ヘモグロビンおよび一酸化窒素シンターゼを含有してなる組成物。 １２． 気体状のＮＯを含有する溶液中で脱酸素化赤血球をインキュベートする 工程を含む、ニトロシルヘモグロビンを含有する単離された赤血球の製造方法。 １３． 動物またはヒトにヘモグロビンα鎖を投与することを含む、動物または ヒトにおけるショックの治療方法。 １４． 動物またはヒトにヘモグロビンβ鎖を投与することを含む、動物または ヒトの組織に生体系に存在するようにＮＯを送達する方法。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 9/14 Ｇ０１Ｎ 21/78 Ｃ Ｇ０１Ｎ 21/78 33/49 Ｋ 33/49 Ａ６１Ｋ 37/14 (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，Ｌ Ｕ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＡＵ，ＣＡ，ＪＰ，Ｕ Ｓ (72)発明者 ゴー，アンドリュー，ジェイ. アメリカ合衆国 ペンシルバニア 18901 ドイルズタウン，ウィンドリッジ ドラ イブ 3541

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １． 動物またはヒトにニトロシル−ヘム含有ＮＯ供与体を投与することを含む 、動物またはヒトにおいて、疾患または医学的障害に冒された組織へのＮＯまた はその生物学的同等物の送達により改善可能な疾患または医学的障害を治療また は予防する方法。 ２． ニトロシル−ヘム含有ＮＯ供与体がニトロシルヘモグロビンである請求項 １記載の方法。 ３． 添加ＮＯ：ヘムの比が約１：１００未満または約０．７５を越えるように 水溶液中のデオキシヘモグロビンにＮＯを添加する工程を含む、安定なニトロシ ル−デオキシヘモグロビンの製造方法。 ４． オキシヘモグロビンと約１０ｍＭ〜２００ｍＭの濃度、ｐＨ７．４の少な くとも約９．４のｐＫを有する緩衝液との水溶液にＮＯを添加する工程を含む、 ＳＮＯ−オキシヘモグロビンの製造方法。 ５． ＮＯ：ヘモグロビンの比が約１：３０未満となるように水溶液中のオキシ ヘモグロビンにＮＯを添加する工程を含む、ニトロシル−オキシヘモグロビンの 製造方法。 ６． ＮＯ供与体に複合体化したヘモグロビン。 ７． ＮＯ供与体がジアゼニウムジオラート、ニトロプルシド、ニトログリセリ ンおよびニトロソチオールからなる群より選ばれたものである請求項６記載のヘ モグロビン。 ８． ヘモグロビンおよび１以上のＮＯ供与体を含有してなる組成物。 ９． 動物またはヒトにヘムを主体とする代用血液および吸入ＮＯを投与するこ とを含む、動物またはヒトにおいて、疾患または医学的障害に冒された組織への ＮＯまたはその生物学的同等物の送達により改善可能な疾患または医学的障害を 治療または予防する方法。 １０． 動物またはヒトにＣＯ誘導化ヘモグロビンを投与することを含む、動物 またはヒトにおいて、組織にＣＯを送達する方法。 １１． 動物またはヒトにＣＯ誘導化ヘモグロビンおよびニトロソ化ヘモグロビ ンを投与することを含む、動物またはヒトにおいて、疾患または医学的障害に冒 された組織へのＮＯまたはその生物学的同等物の送達により改善可能な疾患また は医学的障害を治療または予防する方法。 １２． １以上の電子受容体に複合体化したニトロシルヘモグロビン。 １３． 電子受容体がスーパーオキシドジスムターゼ、安定なニトロオキシドラ ジカルならびにニコチンアミドアデニンジヌクレオチド、ニコチンアミドアデニ ンジヌクレオチドリン酸、フラビンアデニンジヌクレオチド、フラビンモノヌク レオチド、アスコルビン酸およびデヒドロアスコルビン酸の酸化型からなる群よ り選ばれたものである請求項１２記載のニトロシルヘモグロビン。 １４． ニトロシルヘモグロビンおよび１以上の電子受容体を含有してなる組成 物。 １５． 一酸化窒素シンターゼに複合体化したヘモグロビン。 １６． 一酸化窒素シンターゼがニューロンの一酸化窒素シンターゼである請求 項１５記載のヘモグロビン。 １７． ヘモグロビンおよび一酸化窒素シンターゼを含有してなる組成物。 １８． ＮＯを含有する溶液中で脱酸素化赤血球をインキュベートする工程を含 む、ニトロシルヘモグロビンを含有する単離された赤血球の製造方法。 １９． ニトロシルヘモグロビンを含有してなる単離された赤血球。 ２０． 動物またはヒトにヘモグロビンα鎖を投与することを含む、動物または ヒトにおけるショックの治療方法。 ２１． 動物またはヒトにヘモグロビンβ鎖を投与することを含む、動物または ヒトにおいて、疾患または医学的障害に冒された組織へのＮＯまたはその生物学 的同等物の送達により改善可能な疾患または医学的障害を治療または予防する方 法。 ２２． 下記工程： ａ）血液試料の赤血球を溶解する工程； ｂ）溶解した赤血球の脱塩化タンパク質画分を調製する工程； ｃ）タンパク質画分を光分解に付し、それによりＳ−ニトロソヘモグロビンおよ びニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンから一酸化窒素を遊離させる工程； ならびに ｄ）一酸化窒素とオゾンとの化学反応により生成した化学発光シグナルを測定す ることによりタンパク質画分中の一酸化窒素を定量し、それにより血液中の Ｓ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビン中の ＮＯ同等物を測定する工程、 を含む、赤血球を含有する血液中のＳ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル （ＦｅII）−ヘモグロビン中のＮＯ同等物を測定する方法。 ２３． 下記工程： ａ）血液試料の赤血球を溶解する工程； ｂ）溶解した赤血球のタンパク質画分を調製する工程； ｃ）タンパク質画分を光分解に付し、それによりＳ−ニトロソヘモグロビンおよ びニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンから一酸化窒素を遊離させる工程； ならびに ｄ）一酸化窒素とオゾンとの化学反応により生成した化学発光シグナルを測定す ることによりタンパク質画分中の一酸化窒素[の量]を定量する工程、 を含む、疾患状態における一酸化窒素産生をアッセイする方法。 ２４． 下記工程： ａ）血液から洗浄した赤血球を単離する工程； ｂ）該赤血球を溶解し、それにより溶解液を得る工程； ｃ）該溶解液を脱塩する工程； ｄ）該溶解液を、溶解液中のタンパク質濃度よりも過剰の水銀イオンと接触させ るアリコートに分割し、別のアリコートを水銀イオンで未処理のままにし、 それにより水銀処理アリコートと未処理アリコートとを得る工程； ｅ）水銀処理アリコートおよび未処理アリコートを酸素に曝露する工程； ｆ）工程ｅ）のそれぞれのアリコートから、水銀処理低分子量画分および未処理 低分子量画分を単離する工程； ｇ）工程ｆ）の低分子量画分を酸性条件下で過剰の低分子量チオールと接触させ 、それにより各画分中でＳ−ニトロソチオールを生成する工程； ｈ）工程ｇ）の画分中のＳ−ニトロソチオールから遊離したＮＯを光分解−化学 発光により測定する工程；ならびに ｉ）工程ｈ）での測定における差からＳ−ニトロソヘモグロビン中のチオール結 合ＮＯの量を決定する工程、 を含む、赤血球のＳ−ニトロソヘモグロビン中のチオール結合ＮＯをアッセイす る方法。 ２５． 精製したヘモグロビン中のＮＯ同等物を光分解−化学発光により測定し 、それによりＳ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロ ビン中のＮＯ同等物を測定する工程を含む、精製したヘモグロビン中のＳ−ニト ロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビン中のＮＯ同等物を アッセイする方法。 ２６． 下記工程： ａ）血液から洗浄した赤血球を単離する工程； ｂ）該赤血球を溶解し、それにより溶解液を得る工程； ｃ）該溶解液を脱塩する工程；ならびに ｄ）工程ｃ）の溶解液中のＮＯ同等物を光分解−化学発光により測定し、それに より赤血球中のＳ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘ モグロビン中のＮＯ同等物を測定する工程、 を含む、赤血球中のＳ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘ モグロビン中のＮＯ同等物を測定する方法。 ２７． 下記工程： ａ）赤血球からタンパク質画分を生成する工程； ｂ）該タンパク質画分を過剰のＨｇＣｌ2で処理した後、空気に曝露する工程； ならびに ｃ）工程ｂ）のタンパク質画分をニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンのＮＯリ ガンドの光分解に付した後、化学発光によりＮＯの検出を行ない、それによ りニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンに結合したＮＯを測定する工程、 を含む、赤血球中のニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンに結合したＮＯを測定 する方法。 ２８． 下記工程： ａ）血液から洗浄した赤血球を単離する工程； ｂ）該赤血球を溶解し、それにより溶解液を得る工程； ｃ）該溶解液を脱塩する工程； ｄ）工程ｃ）の溶解液のアリコートとタンパク質濃度より過剰の水銀イオンとを 接触させ、それにより水銀処理アリコートおよび未処理アリコートを得る工 程； ｅ）水銀処理アリコートおよび未処理アリコートを酸素に曝露する工程； ｆ）工程ｅ）の水銀処理アリコート中のＮＯ同等物および工程ｅ）の水銀未処理 アリコート中のＮＯ同等物を、光分解−化学発光により測定する工程； ならびに ｇ）工程ｆ）で測定したＮＯ同等物からＳ−ニトロソヘモグロビンの量を決定す る工程、 を含む、Ｓ−ニトロソヘモグロビンをアッセイする方法。 ２９． 下記工程： ａ）血液から洗浄した赤血球を単離する工程； ｂ）該赤血球を溶解し、それにより溶解液を得る工程； ｃ）該溶解液を脱塩する工程；ならびに ｄ）工程ｃ）の該溶解液由来のＮＯ同等物を光分解−化学発光により測定する工 程、 を含む、赤血球中のＳ−ニトロソヘモグロビンおよびニトロシル（ＦｅII）−ヘ モグロビンを測定する方法。 ３０． 下記工程： ａ）血液から洗浄した赤血球を単離する工程； ｂ）該赤血球を溶解し、それにより溶解液を得る工程； ｃ）該溶解液を脱塩する工程； ｄ）該溶解液のアリコートとタンパク質濃度より過剰の水銀イオンとを接触させ 、それにより水銀処理アリコートおよび未処理アリコートを得る工程； ｅ）水銀処理アリコートおよび未処理アリコートを酸素に曝露する工程； ｆ）工程ｅ）のアリコート中のＮＯ同等物を光分解−化学発光により測定し、そ れにより、１）Ｓ−ニトロソヘモグロビンの量および２）ニトロシル（Ｆｅ II）−ヘモグロビンおよびＳ−ニトロソヘモグビンを合わせた量をそれぞれ 得る工程；ならびに ｇ）２）から１）を引くことによりニトロシル（ＦｅII）−ヘモグロビンの量を 決定する工程、 を含む、ニトロシル（Ｆｅ）−ヘモグロビンをアッセイする方法。 ３１． 身体の部位由来の血液試料中のＳ−ニトロソヘモグロビン値およびニト ロシルヘモグロビン値を決定すること、ならびに前記値を用いて酸素送達を評価 することを含む、身体の部位への酸素送達を評価する方法。 ３２． 血液試料中の酸素値を決定すること、および前記値を用いて酸素送達を 評価することをさらに含む、請求項３１記載の方法。
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Cited By (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005527834A (ja) * 2002-05-29 2005-09-15 デューク・ユニバーシティー 血液ガス中の一酸化窒素の測定およびそれに基づく処置
JP2006503901A (ja) * 2002-10-25 2006-02-02 デューク・ユニバーシティー レセプターの脱感作の予防
JP2006514643A (ja) * 2002-12-12 2006-05-11 デューク・ユニバーシティー 鉄ニトロシル化ヘモグロビンの生成
JP2012508255A (ja) * 2008-11-07 2012-04-05 ユーエービー リサーチ ファウンデーション 内皮を模倣するナノマトリックス
JP2012526859A (ja) * 2010-05-27 2012-11-01 ビン・ロウ・ウォン 高温安定性酸素担体を含む医薬組成物の製造方法およびその使用
JP2014532764A (ja) * 2011-11-07 2014-12-08 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 赤血球の処理法

Families Citing this family (10)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US6916471B2 (en) 1995-09-15 2005-07-12 Duke University Red blood cells loaded with S-nitrosothiol and uses therefor
US6087087A (en) * 1997-07-03 2000-07-11 Takashi Yonetani Treatment of hemoglobin with nitric oxide
JP2000230000A (ja) * 1999-02-08 2000-08-22 Hokkaido Univ 一酸化窒素代謝物−ポリオキシアルキレン−ヘモグロビン結合体
CA2266174A1 (en) 1999-03-18 2000-09-18 Hemosol Inc. Hemoglobin-antioxidant conjugates
CA2680378C (en) * 1999-08-02 2013-09-24 Duke University Method for determining physiological effects of hemoglobin
US6314956B1 (en) * 1999-09-08 2001-11-13 Duke University Pulmonary delivery of NO group-containing compound in gas form to treat respiratory, cardiac and blood disorders
DE102004043279A1 (de) * 2004-09-08 2006-03-23 Theo Woike Verfahren und Vorrichtung zum biologischen, medizinischen und pharmazeutischen Gebrauch des Nitrosylmoleküls NO durch optische Anregung von metastabilen Zuständen in Nitrosylkomplexen
EP3444615B1 (en) * 2017-08-15 2021-09-08 Freiberg Instruments GmbH Methods and compositions for diagnostic evaluation and therapeutic correction of the no-haem signalling pathway(s) in animals and humans
CN111912802B (zh) * 2020-08-25 2023-05-26 潍坊市生态环境局寿光分局 一种分光光度法检测亚硝酸盐氮的方法
US20230050352A1 (en) * 2021-08-13 2023-02-16 University Hospitals Cleveland Medical Center Non-invasive measurement of endogenous s-nitrosothiols

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
AU3071592A (en) * 1991-11-14 1993-06-15 Brigham And Women's Hospital Nitrosylation of protein sh groups and amino acid residues as a therapeutic modality
TW381022B (en) * 1993-08-16 2000-02-01 Hsia Jen Chang Compositions and methods utilizing nitroxides to avoid oxygen toxicity, particularly in stabilized, polymerized, conjugated, or encapsulated hemoglobin used as a red cell substitute
AU5368296A (en) * 1995-03-24 1996-10-16 Brigham And Women's Hospital Nitrosylated blood substitutes
US6197745B1 (en) * 1995-09-15 2001-03-06 Duke University Methods for producing nitrosated hemoglobins and therapeutic uses therefor

Cited By (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2005527834A (ja) * 2002-05-29 2005-09-15 デューク・ユニバーシティー 血液ガス中の一酸化窒素の測定およびそれに基づく処置
JP2006503901A (ja) * 2002-10-25 2006-02-02 デューク・ユニバーシティー レセプターの脱感作の予防
JP4705783B2 (ja) * 2002-10-25 2011-06-22 デューク ユニバーシティ レセプターの脱感作の予防
JP2006514643A (ja) * 2002-12-12 2006-05-11 デューク・ユニバーシティー 鉄ニトロシル化ヘモグロビンの生成
JP2012508255A (ja) * 2008-11-07 2012-04-05 ユーエービー リサーチ ファウンデーション 内皮を模倣するナノマトリックス
JP2012526859A (ja) * 2010-05-27 2012-11-01 ビン・ロウ・ウォン 高温安定性酸素担体を含む医薬組成物の製造方法およびその使用
JP2014532764A (ja) * 2011-11-07 2014-12-08 ザ ジェネラル ホスピタル コーポレイション 赤血球の処理法

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Publication number Publication date
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