JP2022505329A - 治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物 - Google Patents

治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物 Download PDF

Info

Publication number
JP2022505329A
JP2022505329A JP2021521302A JP2021521302A JP2022505329A JP 2022505329 A JP2022505329 A JP 2022505329A JP 2021521302 A JP2021521302 A JP 2021521302A JP 2021521302 A JP2021521302 A JP 2021521302A JP 2022505329 A JP2022505329 A JP 2022505329A
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
cancer
atelocollagen
tgg
gemcitabine
oligonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
JP2021521302A
Other languages
English (en)
Other versions
JP7433662B2 (ja
Inventor
ユング・フワ－ン リー，
ジョング・ウック リー，
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Interoligo Corp
Original Assignee
Interoligo Corp
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Interoligo Corp filed Critical Interoligo Corp
Priority claimed from KR1020190130669A external-priority patent/KR102280330B1/ko
Publication of JP2022505329A publication Critical patent/JP2022505329A/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP7433662B2 publication Critical patent/JP7433662B2/ja
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/115—Aptamers, i.e. nucleic acids binding a target molecule specifically and with high affinity without hybridising therewith ; Nucleic acids binding to non-nucleic acids, e.g. aptamers
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/0012—Galenical forms characterised by the site of application
    • A61K9/0019—Injectable compositions; Intramuscular, intravenous, arterial, subcutaneous administration; Compositions to be administered through the skin in an invasive manner
    • A61K9/0024—Solid, semi-solid or solidifying implants, which are implanted or injected in body tissue
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07H—SUGARS; DERIVATIVES THEREOF; NUCLEOSIDES; NUCLEOTIDES; NUCLEIC ACIDS
    • C07H21/00—Compounds containing two or more mononucleotide units having separate phosphate or polyphosphate groups linked by saccharide radicals of nucleoside groups, e.g. nucleic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11—DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113—Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
    • A61K47/42—Proteins; Polypeptides; Degradation products thereof; Derivatives thereof, e.g. albumin, gelatin or zein
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/70—Web, sheet or filament bases ; Films; Fibres of the matrix type containing drug
    • A61K9/7023—Transdermal patches and similar drug-containing composite devices, e.g. cataplasms
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/13—Decoys
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/10—Type of nucleic acid
    • C12N2310/16—Aptamers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/32—Chemical structure of the sugar
    • C12N2310/322—2'-R Modification
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00—Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30—Chemical structure
    • C12N2310/33—Chemical structure of the base
    • C12N2310/335—Modified T or U

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Dermatology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Neurosurgery (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Figure 2022505329000001
本発明は、オリゴヌクレオチド変形体に関し、より詳細には、下記化学式１の構造を有するオリゴヌクレオチド変形体またはその薬学的に許容可能な塩を含む薬学組成物は、体内安定性が高く、優れた抗癌効果を示すことができる。
Figure 2022505329000097
（式中、Ｎ及びＭは、独立して５－位または２’－位にハロゲンまたはヒドロキシが結合されたデオキシウリジン（deoxyuridine、dU）、デオキシシチジン（deoxycytidine、dC）、ウリジン（uridine、U）またはシチジン（cytidine、C）であり、ｘ及びｙは、独立して０～１０の整数であり（但し、ｘとｙが同時に０である場合は除く。）、ｎは１～１０の整数であり、ｍは１～１０の整数である。）
【選択図】図１

Description

本発明は、治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物に関する。
１９８０年代以降、オリゴヌクレオチドを治療薬として開発するための研究が盛んになった。グアノシンが豊富なオリゴヌクレオチドは、広範な癌細胞に対して細胞成長阻害効果を有することが知られている。このオリゴヌクレオチドは、分子内結合または分子間結合によって４本の構造を持つことができる。一般的なアデノシンとチアミン、グアノシンとシチジンの水素結合により二重らせん構造を形成する代わりに、４つのグアノシンが１つの平面に位置してフーグステン（hoogsten）型の水素結合を結成してＧ－クアドラプレックス（Quadruplex）を形成する。このＧ－クアドラプレックスをなすオリゴヌクレオチドは、その構造的な特徴によって安定な構造をなしており、比較的高い血液安定性および細胞透過度を有することが知られている。このような様々な機能を持つオリゴヌクレオチドに治療用の変形核酸を導入し、Ｇ－クアドラプレックスをより安定化させて抗癌効果を増大させるために様々な研究開発が進められている。
本発明は、治療効能を有する核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物を提供することを目的とする。
本発明は、体内安定性および抗癌効果に優れた薬学組成物を提供することを目的とする。
１．下記化学式１の構造を有するオリゴヌクレオチド変形体。
Figure 2022505329000002
 （式中、Ｎ及びＭは、独立して５－位または２’－位にハロゲンまたはヒドロキシが結合されたデオキシウリジン（deoxyuridine、dU）、デオキシシチジン（deoxycytidine、dC）、ウリジン（uridine、U）またはシチジン（cytidine、C）であり、ｘ及びｙは、独立して０～１０の整数であり（但し、ｘとｙが同時に０である場合は除く。）、ｎは１～１０の整数であり、ｍは１～１０の整数である。）
２．前記項目１において、前記Ｎ及び前記Ｍは、独立して５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロデオキシシチジン、カペシタビン及びブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択されるものである、オリゴヌクレオチド変形体。
３．前記項目１において、前記化学式１の構造は、下記の化学式２～化学式３４のいずれか１つである、オリゴヌクレオチド変形体。
Figure 2022505329000003
Figure 2022505329000004
Figure 2022505329000005
Figure 2022505329000006
Figure 2022505329000007
Figure 2022505329000008
Figure 2022505329000009
Figure 2022505329000010
Figure 2022505329000011
Figure 2022505329000012
Figure 2022505329000013
Figure 2022505329000014
Figure 2022505329000015
Figure 2022505329000016
Figure 2022505329000017
Figure 2022505329000018
Figure 2022505329000019
Figure 2022505329000020
Figure 2022505329000021
Figure 2022505329000022
Figure 2022505329000023
Figure 2022505329000024
Figure 2022505329000025
Figure 2022505329000026
Figure 2022505329000027
Figure 2022505329000028
Figure 2022505329000029
Figure 2022505329000030
Figure 2022505329000031
Figure 2022505329000032
Figure 2022505329000033
Figure 2022505329000034
Figure 2022505329000035
４．前記項目１において、前記ｎは１～５の整数であり、前記ｍは１～５の整数である、オリゴヌクレオチド変形体。
５．前記項目１において、前記ｘ及び前記ｙは、独立して０～５の整数である（但し、前記ｘと前記ｙが同時に０である場合は除く。）、オリゴヌクレオチド変形体。
６．前記項目１～５のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド変形体またはその薬学的に許容可能な塩を含む癌の予防または治療用薬学組成物。
７．前記項目６において、前記癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌腫、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、および子宮頸部癌からなる群より選択される、癌の予防または治療用薬学組成物。
８．前記項目６において、アテロコラーゲン分散液剤形である、癌の予防または治療用薬学組成物。
９．前記項目８において、前記アテロコラーゲン分散液は、ＰＢＳ溶液１００ｍｌに対してアテロコラーゲンが０．５～５．５ｇ含まれたものである、癌の予防または治療用薬学組成物。
１０．前記項目６において、前記組成物は、ゾル－ゲル型またはパッチ型である、癌の予防または治療用薬学組成物。
１１．前記項目８において、前記アテロコラーゲンは、ａ）コラーゲン含有動物組織をアルカラーゼとカタラーゼ、ペプシン（Pepsin）及びパパイン（papain）のうちの少なくとも一つを処理して抽出するステップと、ｂ）抽出された物質を１次ろ過し、得られたろ液に中性塩を添加して塩析し、２次ろ過するステップと、ｃ）前記２次ろ過により得られたコラーゲン塩析物を溶解して脂肪を吸着し、３次ろ過するステップと、ｄ）前記３次ろ過工程で得られたろ液を凍結乾燥して凍結乾燥粉末を回収するステップと、ｅ）前記凍結乾燥粉末を希塩酸（dil－HCl）、希酢酸（acetic acid）またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液に溶解し、濃縮してアテロコラーゲン溶液を製造し、製造されたアテロコラーゲン溶液をポリマービーズが充填されたカラムにカラムベッドボリュームの５～２０％の体積で注入し、希塩酸、希酢酸またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液で展開してアテロコラーゲンを回収するステップとを経て製造されたものである、癌の予防または治療用薬学組成物。
本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、癌細胞の表面、細胞質または核に存在するヌクレオリン（Nucleolin）を効果的にターゲティングすることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、癌細胞の成長を阻害したり、癌細胞を死滅させることができる。
本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、特定の配列のオリゴヌクレオチドに変形核酸（Ｎ）を結合することにより、変形核酸の体内酵素による分解速度を減少させることができる。
図１は、血漿中のゲムシタビン（dFdC）及びゲムシタビンの非活性代謝物である２，２’－ジフルオロデオキシウリジン（difluorodeoxyuridine、dFdU）の濃度を確認するためのｄＦｄＣ検量線（Calibration curve）及びｄＦｄＵ検量線を示す。 図２は、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）の膵臓癌細胞株に対する試験管内の抗癌効能の評価結果を示す。 図３は、ＩＯ１０１処理による膵臓癌細胞株ＢＸＰＣの死滅を確認した結果を示す。 図４は、ＩＯ１０１処理による膵臓癌細胞株ｍｉａ－ｐａｃａ－２の死滅を確認した結果を示す。 図５は、ＩＯ１０１処理による膵臓癌細胞株Ｐａｎｃ－１の死滅を確認した結果を示す。 図６は、ＩＯ１０１処理による膵臓癌細胞株Ｃａｐａｎ－１の死滅を確認した結果を示す。 図７は、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）の膵臓癌細胞株に対する試験管内の抗癌効能の評価結果を示す。 図８は、ラットにゲムシタビン（●、ｎ＝４）またはＩＯ１０１Ｌ（○、ｎ＝４）を投与した後のゲムシタビンの血漿中濃度の変化を示す。 図９は、ラットにゲムシタビン（●、ｎ＝４）またはＩＯ１０１Ｌ（○、ｎ＝４）を投与した後のｄＦｄＵの血漿中濃度を示す。 図１０は、ゾル－ゲル型のＩＯ１０１－０．５ｍｇ／ＡＣ（アテロコラーゲン）、ＩＯ１０１－１．０ｍｇ／ＡＣ、ＩＯ１０１－１．５ｍｇ／ＡＣ及びＩＯ１０１－２．０ｍｇ／ＡＣを皮下膵臓癌のマウスに注入して３０日経過した後の腫瘍サイズを確認した結果を示す。 図１１は、ゾル－ゲル型のＩＯ１０１－１．０ｍｇ／ＡＣ及びＩＯ１０１－２．０ｍｇ／ＡＣを皮下膵臓癌のマウスに注入して３０日間の腫瘍サイズの相対的変化量を示す。 図１２は、ＩＯ１０１の容量を２ｍｇに固定し、アテロコラーゲンの濃度を変化させて抗癌治療効果を確認した結果を示す。 図１３は、ＩＯ１０１／ＡＣディスクの移植後の膵臓癌のマウスの腫瘍サイズの変化を示すグラフである。 図１４は、ＩＯ１０１／ＡＣディスクの移植後の膵臓癌のマウスの腫瘍サイズを示す。 図１５は、ＩＯ１０１／ＡＣディスクの移植後の時間帯別の膵臓癌腫瘍サイズを測定した結果を示す。 図１６は、ＩＯ１０１／ＡＣディスク及びＧｅｍ／ＡＣディスクの移植前後の腫瘍サイズを比較したグラフである。 図１７は、ＩＯ１０１／ＡＣディスク及びＧｅｍ／ＡＣディスクの膵臓癌腫瘍抑制及び腹腔内転移を観察して比較した結果を示す。 図１８は、ＩＯ１０１／ＡＣ及びＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスクの移植後の膵臓癌の腹腔内転移の抑制効果を示す。 図１９は、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスクの移植後のマウスの生存率の変化を示す。 図２０は、膵臓癌のｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｍｏｕｓｅモデルで残存腫瘍を除去した後、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣゾル－ゲル型の注入またはディスクの挿入後の腫瘍抑制効果または転移抑制効果を示す。 図２１は、Ｃａｐａｎ－１膵臓癌のマウスモデルの作製過程を示す。 図２２は、Ｃａｐａｎ－１膵臓癌のマウスモデルにＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスクを移植して１ヶ月後の腹腔内転移の抑制効果を示す。 図２３は、Ｃａｐａｎ－１膵臓癌のマウスモデルにアテロコラーゲン・ディスク（atelocollagen disk）（対照群）を移植して１ヶ月後、腹腔内肝、横隔膜及び腎臓などの転移が発生した結果を示す。 図２４は、患者由来の膵臓癌細胞を用いたＰＤＸ（Patient－derived xenograft）膵臓癌のマウスモデルと原発腫瘍の組織学的特徴が類似していることを示す。 図２５は、ＰＤＸマウスモデルに対照群（No treatment）、Ｇｅｍ－ＩＰ、ＩＯ１０１－ＩＰ、ＩＯ１０１／ＡＣディスク（２．０ｍｇ／３．０％）、ＩＯ１０１－Ｃｏｎ／ＡＣディスク（２．０ｍｇ／３．０％）及びＧｅｍ／アテロコラーゲン・ディスク（０．１２ｍｇ／３．０％）を移植後の腫瘍抑制効果を示す。 図２６は、膵臓癌腫瘍におけるＴＵＮＥＬ ｓｔａｉｎｉｎｇによる細胞死滅の分析結果を示す。 図２７は、ＰＤＸモデルにおいてＩＯ１０１／ＡＣディスクを移植後、他の臓器での副作用がないことを示す結果である。 図２８は、ＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＭＤ－ＭＢＡ２３１（乳癌）、Ｕｕｈ－７（肝癌）、ＨＴ２９（大腸癌）及びＭｖ４－１１（ＡＭＬ）に対する細胞増殖抑制効能の結果を示す。 図２９は、ＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＭＤ－ＭＢＡ２３１（乳癌）、Ｕｕｈ－７（肝癌）、ＨＴ２９（大腸癌）及びＭｖ４－１１（ＡＭＬ）に対する細胞増殖抑制効能の結果を示す。
本発明は、オリゴヌクレオチドと変形核酸が連結されたオリゴヌクレオチド変形体を提供する。
本発明のオリゴヌクレオチドは、［ＴＧＧ］ｍ［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］ｎ配列である。
ｎは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の整数であってもよい。また、ｎは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。
ｍは、１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の整数であってもよい。また、ｍは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。
本発明のオリゴヌクレオチドは、下記表１に示す配列のいずれかであってもよいが、これらに限定されるものではない。
Figure 2022505329000036
本発明のオリゴヌクレオチドは、グアノシンが豊富で、Ｇ－クアドラプレックス（G－quardruplex）構造を形成することができ、ヌクレオリンに特異的なアプタマーである。
用語「ヌクレオリン」は、形質転換細胞で高いレベルで発現されるタンパク質であり、ほとんどの腫瘍細胞は、細胞質及び核でヌクレオリンを発現するだけでなく、細胞の表面にヌクレオリンを露出することが知られている。ヌクレオリンは細胞で様々な機能を果たし、リボソームの生成、細胞成長およびＤＮＡ複製に関与することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドは、癌細胞に対してより選択的に結合することができ、細胞内で様々な機序により癌細胞の成長を阻害することができる。
本発明のオリゴヌクレオチドに一つ以上の変形核酸を結合して変形核酸を安定化させたり、体内で変形核酸の非活性化を防止することができる。
さらに、オリゴヌクレオチドに一つ以上の変形核酸を結合すると、オリゴヌクレオチド自体の細胞成長阻害効果だけでなく、変形核酸の細胞成長阻害効果も示され、より向上した抗癌効果を得ることができる。
用語「変形核酸」は、化学的に変形されたヌクレオシド又はヌクレオチドであり得る。
変形核酸は、５－位または２’－位に少なくとも一つのハロゲンまたはヒドロキシが 結合されたデオキシウリジン（deoxyuridine、dU）、デオキシシチジン（deoxycytidine、dC）、ウリジン（uridine、U）またはシチジン（cytidine、C）であってもよい。例えば、変形核酸は、５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロデオキシシチジン、カペシタビン及びブロモビニルデオキシウリジン又はそれらの誘導体からなる群より選択されるものであってもよい。
変形核酸は、オリゴヌクレオチドの５’方向または３’方向のうちの少なくとも一つに連結することができ、好ましくは、オリゴヌクレオチドの５’方向に連結される。
変形核酸は、リンカーによってオリゴヌクレオチドの５’方向または３’方向の少なくとも一つに連結することができる。
リンカーは、［－（ＣＨ２）a－］、［－（ＣＨ２ＣＨ２Ｏ）b－］、［ｂｕｔｙｌｒａｍｉｄｏｍｅｔｈｙｌ－１－（２－ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ）－ｅｔｈｙｌ］－２－ｃｙａｎｏｅｔｈｙｌ－］、［１’，２’－ｄｉｄｅｏｘｙｒｉｂｏｓｅ－］または（ＰＥＧ）ｙであってもよい。ここで、ａは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。ｂは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。ｙは１～２０、２～１９、３～１８、４～１７、５～１６、６～１５、７～１４、８～１３、９～１２または１０～１１の整数であってもよい。
変形核酸がオリゴヌクレオチドの３’方向に連結される場合、変形核酸の３’方向にｉｄＴ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたは２’ＯＭｅＮｕをさらに結合させることができる。
変形核酸の３’方向にｉｄＴ、ＬＮＡ、ＰＥＧまたは２’ＯＭｅＮｕをさらに結合させることにより、ヌクレアーゼの攻撃からオリゴヌクレオチド変形体の３’末端を保護することができる。これにより、オリゴヌクレオチド変形体の体内での分解（degradation）速度を減少させ、変形核酸がより長期間オリゴヌクレオチドに結合されているようにして変形核酸の抗癌効能を増加させることができる。
具体的には、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、化学式１の構造を有する化合物であってもよい。
Figure 2022505329000037
化学式１中、Ｎ及びＭは変形核酸であり、ＮとＭは同一または異なる種類の変形核酸であってもよい。変形核酸に関する内容は、前述の通りである。
化学式１中、ｘ及びｙは、独立して０～１０であってもよく、ｘとｙが同時に０である場合は除く。
例えば、化学式１中、ｘは０～１０、１～９、２～８、３～７、４～６の整数であってもよく、ｙは０～１０、１～９、２～８、３～７、４～６の整数であってもよい。但し、ｘとｙが同時に０である場合は除く。
化学式１中、ｎは１～１０の整数であり、ｍは１～１０の整数であってもよい。
化学式１中、ｎは１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の整数であってもよい。また、化学式１中、ｎは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。
化学式１中、ｍは１～１０、１～９、１～８、１～７、１～６、１～５、１～４、１～３または１～２の整数であってもよい。他の例としては、化学式１中、ｍは１～１０、２～９、３～８、４～７、５～６の整数であってもよい。
例えば、化学式１の構造を有するオリゴヌクレオチド変形体は、下記表２に示す化学式の構造を有する化合物であってもよい。
Figure 2022505329000038
Figure 2022505329000039
Figure 2022505329000040
一実施形態によると、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、配列番号１０のオリゴヌクレオチドの５’方向および３’方向のうちの少なくとも一つにゲムシタビン（２’，２’－ジフルオロデオキシシチジンと併用して使用可能）が連結されたものであってもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、配列番号１０のオリゴヌクレオチド５’方向に１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下のゲムシタビンが結合されたものであってもよい。
他の実施形態によると、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、配列番号１１のオリゴヌクレオチドの５’方向または３’方向のうちの少なくとも一つにゲムシタビンが連結されたものであってもよい。例えば、本発明のオリゴヌクレオチド変形体は、配列番号１１のオリゴヌクレオチド５’方向に１０個以下、９個以下、８個以下、７個以下、６個以下、５個以下、４個以下、３個以下または２個以下のゲムシタビンが結合されたものであってもよい。
オリゴヌクレオチドと変形核酸を連結する１つの方法は、前述したオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のうちの少なくとも１つに、前述した変形核酸を結合するステップを含むことができる。
オリゴヌクレオチドと変形核酸を連結する他の方法は、前述したオリゴヌクレオチドの５’末端および３’末端のうちの少なくとも１つに化学的な合成によってリンカーを連結した後、連結されたリンカーに前述の変形核酸を結合するステップを含むことができる。
オリゴヌクレオチド変形体を作製するために変形核酸を結合するステップは、固相反応器を用いるものであってもよい。
また、本発明は、前述したオリゴヌクレオチド変形体またはその薬学的に許容可能な塩を含む癌の予防または治療用薬学組成物を提供する。
オリゴヌクレオチド変形体は、前述の通りである。
前記癌は、固形癌及び白血病のようなヌクレオリン関連の癌であってもよい。例えば、前記癌は、白血病、リンパ腫、骨髄増殖性疾患、固形癌（carcinomas of solid tissue）、肉腫、黒色腫、腺腫、低酸素癌（hypoxic tumors）、口の扁平上皮癌、喉の扁平上皮癌、喉頭の扁平上皮癌、肺の扁平上皮癌、子宮癌、膀胱癌、造血癌（hematopoietic cancers）、頭頸部癌、神経系癌および乳頭腫からなる群より選択できるが、これらに限定されない。また、前記ヌクレオリン関連の癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌（ovarian carcinoma）、子宮頸部癌腫（cervical carcinoma）、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌（uterine cancer）、膀胱癌（bladder cancer）、甲状腺癌、卵巣癌（ovary cancer）、黒色腫および子宮頸部癌（cervical cancer）からなる群より選択できるが、これらに限定されない。
癌の予防または治療用薬学組成物に含まれるオリゴヌクレオチド変形体またはその薬学的に許容可能な塩の含有量は、癌の予防または治療に効果を示すことができる含有量であり、対象の状態及び／又は疾患の重症度により適宜調節することができる。
アテロコラーゲン分散液は、ＰＢＳ溶液１００ｍｌに対してアテロコラーゲンが０．５～５．５ｇ、１～４．５ｇ、２～３．５ｇ含まれたものであってもよい。アテロコラーゲン分散液のアテロコラーゲン濃度は、０．５～５．５％、１～４．５％、２～３．５％であってもよい。
本発明の薬学組成物に含まれたアテロコラーゲンの濃度によって、薬物の持続時間または治療効果に差が出ることがあるため、アテロコラーゲンは組成物に適正濃度で含まれなければならない。
本発明の薬学組成物に含まれたアテロコラーゲンは、組成物に含まれたオリゴヌクレオチド変形体を包んでいる形で存在することができる。
本発明のアテロコラーゲンは、下記ステップを含んで製造されたものであってもよい：ａ）新鮮な豚皮を酢酸に膨潤させた後に脂肪層を除去し、真皮部分を破砕して酢酸に浮遊させ、アルカラーゼとカタラーゼ（alcalase＋catalase）、ペプシン（Pepsin）及びパパイン（papain）のうちの少なくとも一つを加えて抽出するステップと、ｂ）抽出された物質を１次ろ過した後、ろ液に中性塩を加えて塩析し、２次ろ過するステップと、ｃ）２次ろ過によって得られた残留物を溶解し、発煙シリカを用いて脂肪を吸着し、３次ろ過するステップと、ｄ）３次ろ過によって得られたろ液を凍結乾燥して高純度のアテロコラーゲンを得るステップ。
本発明のアテロコラーゲンは、下記ステップを含んで製造されたものであってもよい：a）コラーゲン含有動物組織をアルカラーゼとカタラーゼ、ペプシン及びパパインのうちの少なくとも一つを処理して抽出するステップと、ｂ）抽出された物質を１次ろ過するステップと、ｃ）前記１次ろ過によって得られたろ液に中性塩を加えて塩析し、２次ろ過するステップと、ｄ）前記２次ろ過によって得られたコラーゲン塩析物を溶解し、脂肪を吸着し、３次ろ過するステップと、ｅ）前記３次ろ過によって得られたろ液を凍結乾燥して凍結乾燥粉末を回収するステップと、ｆ）前記凍結乾燥粉末を希塩酸、希酢酸またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液に溶解し、濃縮してアテロコラーゲン溶液を製造し、製造されたアテロコラーゲン溶液をポリマービーズが充填されたカラムに注入し、希塩酸、希酢酸またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液で展開してアテロコラーゲンを分子量別に回収するステップ。
アテロコラーゲンの製造方法で使用される中性塩は、塩化ナトリウム溶液であってもよい。
アテロコラーゲンの製造方法において、凍結乾燥粉末は、１０ｍＭの濃度の希酢酸または１０ｍＭの濃度のリン酸塩緩衝溶液に溶解され得る。
アテロコラーゲンの製造方法において、凍結乾燥粉末は、ＭＷＣＯ １００Ｋ ｄａｌｔｏｎｓで濃縮することができる。
アテロコラーゲンの製造方法において、アテロコラーゲン溶液を注入するポリマービーズは、セファデックスＧ－２００セファクリルであってもよい。
アテロコラーゲンの製造方法において、ポリマービーズが充填されたカラムに注入されるアテロコラーゲン溶液の体積は、カラムベッドボリュームの５～２０％であってもよい。
アテロコラーゲンの製造方法において、アテロコラーゲン溶液をポリマービーズが充填されたカラムに注入し、１０ｍＭ濃度の希酢酸または１０ｍＭ濃度のリン酸塩緩衝液で展開してアテロコラーゲンを回収することができる。
本発明の薬学組成物は、様々な剤形で用いることができる。
例えば、粉末、顆粒、錠剤、エマルジョン、シロップ、エアロゾル、軟質または硬質のゼラチンカプセル、滅菌注射液、滅菌粉末、ゾル－ゲル型、スキャフォールド型またはパッチ型（disk型）であってもよいが、これらに限定されない。本発明の薬学組成物は、アテロコラーゲン分散液剤形であってもよい。
本発明の薬学組成物は、異常増殖する細胞の治療及び／又は抑制が必要な個体に投与することができる。
薬学組成物は、個々の治療薬として投与しても、他の治療薬と併用投与してもよい。他の治療薬と併用投与する場合には、順次または同時投与することができ、単一または多重投与することができる。本発明の薬学組成物の投与時は、副作用なしに最小限の量で最大の効果が得られる量を投与することが重要であり、これは当業者によって容易に決定され得る。
投与は、経口または非経口投与であってもよく、例えば、静脈注射、皮下注射または筋肉内注射であってもよいが、これらに限定されない。
投与対象の個体は、哺乳類、例えば霊長類、マウス、ラット（rat）、ハムスター、ウサギ、ウマ、ウシ、イヌまたはネコであってもよいが、これらに限定されない。
さらに、本発明は、前述した癌の予防または治療用薬学組成物の製造方法を提供する。
本発明の薬学組成物の製造方法は、前述のオリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液を製造するステップ；を含む。
オリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液は、オリゴヌクレオチド変形体をＰＢＳと混合して製造することができる。
本発明の薬学組成物の製造方法は、前述のオリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液をアテロコラーゲン分散液と混合するステップ；をさらに含むことができる。
オリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液は、オリゴヌクレオチド変形体をＰＢＳと混合して製造したものであってもよい。
アテロコラーゲン分散液は、アテロコラーゲンをＮａＯＡｃ／ＨＡｃ（acetic acid）バッファ溶液に添加して製造したものであってもよい。
アテロコラーゲン分散液は、バッファ溶液１００ｍｌ当たりアテロコラーゲンを０．５～５．５ｇ、１～４．５ｇ、２～３．５ｇ添加して製造したものであってもよい。
バッファ溶液の条件は、０．３ＭのＮａＯＡＣ及び４５％ＨＡＣであってもよい。
バッファ溶液に添加されるアテロコラーゲンは、凍結乾燥されたアテロコラーゲンであってもよい。
オリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液をアテロコラーゲン分散液と混合するステップは、アテロコラーゲン分散液４００ｕＬ当たり、オリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液を０．１～３ｍｇ混合するものであってもよい。
例えば、アテロコラーゲン分散液４００ｕＬ当たり、オリゴヌクレオチド変形体が分散された分散液を０．１～３ｍｇ、０．５～２．５ｍｇ、１～２ｍｇ混合するものであってもよい。
以下、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、これらの実施例は本発明を例示するものに過ぎず、本発明を制限するものではない。
実施例１．オリゴヌクレオチド変形体の作製
実施例１－１．ゲムシタビン含有オリゴヌクレオチドの合成
２８種のオリゴヌクレオチドを設計して作製した。作製された各々のオリゴヌクレオチドにゲムシタビンを結合し、オリゴヌクレオチド変形体を作製した。設計された２８種のオリゴヌクレオチド配列、及びオリゴヌクレオチドに変形核酸が結合した２８種のオリゴヌクレオチド変形体を下記表３に示す。以下、ゲムシタビンは、Ｇｅｍと表記することもある。
Figure 2022505329000041
Figure 2022505329000042
「ゲムシタビン含有オリゴヌクレオチド」（オリゴヌクレオチド変形体）を固相ホスホロアミダイト法（solid phase phosphoramidite chemistry）によりマーメイド１２ ＤＮＡシンセサイザー（Mermade 12 DNA synthesizer、BioAutomation Manufacturing、Irging、TX、）を用いて合成した。バイオタージ（Biotage）ＭＰＬＣ、Ｃ１８カートリッジ（Cartrige）を用いて脱塩（desalting）を行った。化合物をＤ．Ｗ．に溶かし、Ｗａｔｅｒｓ Ａｃｑｕｉｔｙ ＵＰＬＣ Ｈ－Ｃｌａｓｓを用いて、Ｘｂｒｉｄｇｅ Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ ＢＥＨ Ｃ１８ １３０Ａ、１．７ｕｍ、２．１×５０ｍｍ ｃｏｌｕｍｎ、Ｃｏｌｕｍｎ ｏｖｅｎ ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ ５０℃、ｍｏｂｉｌｅ ｐｈａｓｅ Ａ ｓｏｌｖｅｎｔ（０．１Ｍ ＴＥＡＡ）、Ｂ ｓｏｌｖｅｎｔ（１００ ＡＣＮ）、Ｆｌｏｗ ０．３ｍＬ／ｍｉｎで分離／精製した。Ｗａｔｅｒｓ Ｇ２－ＸＳ Ｑ－ＴＯＦ質量分析計（Mass Spectrometer）により分子量を同定した。すべてのオリゴヌクレオチドの合成は、自主的に行った。
１－２．他の種類のオリゴヌクレオチド変形体の合成
前記「１－１．」に記載された方法と同様の方法で（（Ｎ）ｘ－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５、（［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５－（Ｎ）ｘ）および（（Ｎ）ｘ－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５－（Ｎ）ｙ）を合成した（下記表４参照）。
Figure 2022505329000043
Figure 2022505329000044
Figure 2022505329000045
Figure 2022505329000046
実施例２．オリゴヌクレオチド変形体の試験管内（in vitro）の安定性の確認
ゲムシタビン（2,2’-difluorodeoxycytidine、dFdC）は、血漿中でシチジンデアミナーゼ（cytidine deaminase）によって非活性代謝物である２，２’－ジフルオロデオキシウリジン（difluorodeoxyuridine、dFdU）に変形され、この場合には体内の抗癌効能が低下する。ゲムシタビンをオリゴヌクレオチドに結合させた場合のシチジンデアミナーゼによるゲムシタビンの体内分解抑制効果を確認するために、血漿中のｄＦｄＣ及びｄＦｄＵの濃度を確認した。
２－１．血漿中のｄＦｄＣ及びｄＦｄＵの濃度を確認するためのｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅｍ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）の分析
マウスの血漿中のｄＦｄＣ、ｄＦｄＵ及びゲムシタビンの活性代謝物であるゲムシタビン三リン酸塩（triphosphate）（ｄＦｄＣＴＰ）の濃度を確認するために、ｌｉｑｕｉｄ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ－ｔａｎｄｅ ｍａｓｓ ｓｐｅｃｔｒｏｍｅｔｒｙ（ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ）分析法を変形してマウスの血漿および組織の分析法を確立した。確立されたＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析法により得られたクロマトグラムから内部標準物質のピーク面積に対するｄＦｄＣ、ｄＦｄＵ及びｄＦｄＣＴＰのピーク面積比を求め、予め作成した検量線からマウスの血漿中濃度及び組織内濃度を計算した。
２－１－１．テトラヒドロウリジン（Tetrahydrouridine、THU）処理された血液の製造
マウスの血液１ｍＬを採血してテトラヒドロウリジン（ＴＨＵ）１０ｍｇ／ｍＬ（in DW）１０ｕＬが入っている１．５ｍＬのエッペンドルフチューブ（eppendorf tube）に入れた。遠心分離器を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃の条件下で２分間遠心分離した後、血漿のみを取って他のバイアルに移し、－８０℃で保存した。血漿５０ｕＬを１．５ｍＬのアンバーエッペンドルフチューブ（amber eppendorf tube）に移した後、内部標準物質（meltform 1.29ug／mL in ACN）１５０ｕＬを入れて１０分間ボルテックス（vortex）した。遠心分離器を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃の条件下で２０分間遠心分離した。遠心分離したチューブで試料１５０ｕＬを他の１．５ｍＬのアンバーエッペンドルフチューブに移した。ＧｅｎｅＶａｃ ＥＺ－２ ａｕｔｏｍａｔｅｄ ｅｖａｐｏｒａｔｉｏｎ ｓｙｓｔｅｍ（GeneVac Ltd、Ipswich、UK）を用いて有機溶媒を乾燥した（GeneVac HPLC mode、max temperature 35℃、1hr）。有機溶媒を乾燥した１．５ｍＬのアンバーエッペンドルフチューブに１２５ｕＬのＤＷを入れて再構成（reconstitution）した。５分間ボルテックスした後、遠心分離器を用いて１４，０００ｒｐｍ、４℃の条件下で５分間遠心分離した。遠心分離された溶液の上清液をＰＴＦＥ（hydrophilic）０．２ｕｍのシリンジフィルター（syringe filter、Toyo Toshi、Japan）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ用バイアル（vial）に１００ｕＬずつ入れた。５ｕＬをＬＣ－ＭＳ／ＭＳに注入した。
２－１－２．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析条件
質量分析計（Mass spectrometry）としては、ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ ５５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎ ｍｏｄｅ（Sciex、Framingham、MA、USA）を用いた。定量化（Quantitation）の条件は、下記表５に示す。
Figure 2022505329000047
クロマトグラフィー（Chromatography）には、Ａｇｉｌｅｎｔ １２００ ｓｅｒｉｅｓ ｓｅｐａｒａｔｉｏｎ ｍｏｄｕｌｅ（Agilent Technologies、Waldbronn、Germany）を用いた。カラムは、Ｈｙｐｅｒｓｉｌ ｇｏｌｄ Ｃ１８、１．９ｕｍ、１００×２．１ｍｍ２（ThermoScientific、Matriks、Oslo、Norway）を用いた。注入体積（Injection volume）は５ｕＬ、移動相（Mobile phase）はｇｒａｄｉｅｎｔ ｅｌｕｅｎｔ ｓｙｓｔｅｍ［Ａ：１００％ＡＣＮ、Ｂ：０．１％ｆｏｒｍｉｃ ａｃｉｄ ｉｎ ＤＷ］、合計ランニングタイム（Total run time）は２０分とした。校正レンジ（Calibration range）は２０ｎｇ／ｍＬ～５，０００ｎｇ／ｍＬとした。クロマトグラフィーの条件を下記表６に示す。
Figure 2022505329000048
図１は、ｄＦｄＣの検量線（Calibration curve）及びｄＦｄＵの検量線を示す。図１（ａ）中のｘはゲムシタビンの濃度、ｙはＨＰＬＣでの面積であり、図１（ｂ）中のｘはｄＦｄＵの濃度、ｙはＨＰＬＣでの面積である。
２－１－３．ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析の結果
２－１－１及び２－１－２に従って各試料を処理し、（Ｇｅｍ）ｘ－［ＴＧＧ］ｍ［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］ｎの化合物の種類によるラット血漿中のｄＦｄＣ／ｄＦｄＵの比率を測定し、下記表７に示す（Ｇｅｍ＝ゲムシタビン）。
Figure 2022505329000049
Figure 2022505329000050
前記表７に示すｄＦｄＣ／ｄＦｄＵの比率が高い化合物のいくつか（化合物１０（以下、ＩＯ１０１ともいう。）及び化合物１１（以下、ＩＯ１０１Ｌともいう。））を選択して、オリゴヌクレオチド変形体の効果を確認するために追加実験を行った。また、ＩＯ１０１及びＩＯ１０１Ｌの効果と比較するために、他の配列のオリゴヌクレオチド変形体［（Ｇｅｍ）２－［ＴＣＣ］４［ＴＴＧ］［ＴＣＣ］４；ＩＯ１０１－Ｃｏｎ（ＣＲＯ）、（Ｇｅｍ）２－ＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＴＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧＴＧＧ；ＩＯ１００及び（Ｇｅｍ）２－ＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＴＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣＴＣＣ；ＩＯ１００－Ｃｏｎ（（Ｇｅｍ）２－ＣＲＯ））とオリゴヌクレオチドに結合されていないゲムシタビンを用いて実験を行った。
実施例３．オリゴヌクレオチド変形体の癌細胞株に対する試験管内（in vitro）の効能の評価
３－１．ＩＯ１０１の膵臓癌細胞株に対する抗癌効果の確認
膵臓癌細胞株としてＢｘＰＣ３、ＰＡＮＣ－１、Ｍｉａｐａｃａ－２、Ｃａｐａｎ－１をそれぞれ培養した。数回の継代培養後に細胞が安定したとき、薬物の効果を検証するために９６ウェルプレートに１×１０３個の細胞を播種（seeding）した。翌日、ＩＯ１０１、ＩＯ１００、ＩＯ１００－Ｃｏｎ、ＩＯ１０１－Ｃｏｎ及びＧｅｍを最高濃度１００ｕＭで１／１０ずつ希釈して１００ｎＭまで４つのポイントの濃度で準備し、細胞が播種（seeding）された９６ウェルプレートに処理した。４８時間が経過した後、ＷＳＴ－１溶液を１０ｕｌずつウェルに添加し、３７℃の培養器で１時間培養した。その後、サンプルをマイクロプレートリーダー（micro plate reader、VERSA Max）で４４０ｎｍの値を測定した。測定が完了した数値を計算して、処理濃度別の細胞生存率のグラフを作成した。
４種の膵臓癌細胞株のすべてにおいて、ＩＯ１００、ＩＯ１００－Ｃｏｎ、ＩＯ１０１－Ｃｏｎ及びＧｅｍと比較して、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）が薬物濃度に比例して膵臓癌細胞の成長を効果的に阻害することが観察された（図２参照）。
４種の膵臓癌細胞株に対して１×１０４cells／wellで播種（seeding）し、ＩＯ１０１を処理した後、４８時間以内にレッドプローブ（Red probe）を標識して画像化し、癌細胞の死滅を観察した。図３～６は、ＩＯ１０１の処理による４種の膵臓癌細胞の死滅を確認した結果を示す。インテンシティー（Intensity）の値は、ｄｅａｔｈ ｃｅｌｌ ｉｎｄｅｘであり、倍率変化（fold change）で表記した。
３－２．ＩＯ１０１Ｌの膵臓癌細胞株に対する抗癌効果の確認
前記「３－１．」の効能評価方法と同様の方法で（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）の膵臓癌細胞株で細胞生存力測定（cell viability assay）を用いて効能を検証した。４種の膵臓癌細胞株のすべてにおいて、対照群と比較してＩＯ１０１Ｌが膵臓癌細胞の成長を効果的に阻害した（図７参照）。
実施例４．オリゴヌクレオチド変形体の生体内（in vivo）の安定性の確認
ラットにゲムシタビンを静脈注射（８ｍｇ／ｋｇ）またはオリゴヌクレオチドにゲムシタビンが結合された新しい製剤である（Ｇｅｍ）ｘ－［ＴＧＧ］ｍ［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］ｎを静脈注射（１６０ｍｇ／ｋｇ、ゲムシタビン基準で８ｍｇ／ｋｇ）して、ゲムシタビン及びその代謝物である２’，２－ジフルオロデオキシウリジン（ｄＦｄＵ）シアニジン－３－グルコシドの薬物動態の変化を比較した。
４－１．ラットへのオリゴヌクレオチド変形体またはゲムシタビンの静脈注射
Ｓｐｒａｇｕｅ－Ｄａｗｌｅｙ雄性ラットを吸入麻酔薬であるイソフルラン（isoflurane）で誘導麻酔し、ＰＥ（polyethylene）チューブ（Clay Adams、Becton Dickinson、NJ、USA）を用いて頸動脈（血液採取用）に挿入して縫合糸で縫合し、その先端を首の後に固定した。手術中にエーテルを用いて麻酔を維持し、ヘパリンが（２０ｕｎｉｔｓ／ｍＬ）含有された生理食塩水を約０．５ｍＬ注入して、カニューレ（cannula）に血液が凝固することを防止した。手術が終わった後、ラットをそれぞれ代謝ケージ（metabolic cage）に入れて麻酔から完全に回復させた後（４～５時間）、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（Ｎ＝４）及びゲムシタビン投与群（Ｎ＝４）に分けて投与した。ゲムシタビン及び（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５を投与容量（８ｍｇ／ｋｇ及び１６０ｍｇ／ｋｇ）に合わせて電子スケール（CP224S、Sartorius、GER）で秤量した後、０．９％滅菌生理食塩水に溶解して調製した。１及び２ｍｌ／ｋｇの薬物を尾静脈に投与した。（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５及びゲムシタビンの投与直前（０分）、投与後１、５、１５、３０、４５、６０、１２０、３６０、７２０分に頸静脈からそれぞれ血液を０．３ｍＬ採取した。血液中のゲムシタビンがシチジンデアミナーゼ（cytidine deaminase）によって代謝物に変化することを防止するために、血液１ｍＬ当たりシチジンデアミナーゼ阻害剤であるテトラヒドロウリジン（teterahydrouridine、ＴＨＵ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度で溶かした蒸留水１０μＬを予め入れたエッペンドルフチューブに入れてすぐに遠心分離した後、血漿を保存した。ゲムシタビンは、光によって分解され得ることが知られているので、すべての血漿試料は、茶色のエッペンドルフチューブにそれぞれ５０μＬずつ入れて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳ分析時まで－８０℃で保存した。
４－２．ゲムシタビン及びその代謝物であるｄＦｄＵの血漿中濃度の分析
試料処理とゲムシタビン及びｄＦｄＵの血漿中濃度の分析は、既に確立したアセトニトリル（acetonitrile）を用いた血漿タンパク質沈殿法で前処理した後、分析機器アジレント１２００シリーズ（Agilent Technologies）、ＡＢ ＳＣＩＥＸ ＱＴＲＡＰ ５５００、Ｅｌｅｃｔｒｏｓｐｒａｙ ｉｏｎ ｍｏｄｅ（Sciex、Framingham、MA、USA）を用いて、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳを行った。すべての分析は、チューブを遮蔽（shielding)して行った。定量化（Quantitation）の条件はＳＲＭ（selected reaction monitoring）モード（前記表５参照）、固定相の条件はＨｙｐｅｒｓｉｌ ｇｏｌｄ Ｃ１８、１．９μｍ、１００×２．１ｍｍ２（Thermo Scientific、Matriks、Oslo、Norway）、移動相の条件はそれぞれ０．１％ギ酸（formic acid）含有した蒸留水（Ａ）とアセトニトリル（Ｂ）で行った（前記表６参照）。
４－３．血漿検量線の作成
ゲムシタビン及びｄＦｄＵをそれぞれ蒸留水に溶かし、１ｍｇ／ｍＬの貯蔵溶液を製造して冷凍保管した。３次蒸留水で希釈してゲムシタビンの濃度が２００、４００、８００、２０００、１００００、２００００、１０００００ｎｇ／ｍＬ及びｄＦｄＵの濃度が２００、４００、８００、２０００、１００００、２００００、５００００ｎｇ／ｍＬになるように作業溶液を作成して冷蔵庫に保管した。内部標準物質（ＩＳ）であるメトホルミン（metformin）は、アセトニトリルに溶かして６４５ｎｇ／ｍＬの作業溶液を製造した。ゲムシタビンとｄＦｄＵの作業溶液をラットの空血漿に添加し、ゲムシタビンとｄＦｄＵの血漿中濃度がそれぞれ１０、２０、４０、１００、５００、１０００、５０００ｎｇ／ｍＬ及び１０、２０、４０、１００、５００、１０００、２５００ｎｇ／ｍＬになるように標準血漿試料をそれぞれ作成した。
４－４．血漿試料の処理方法
５０μＬの血漿に内部標準物質メトホルミン（６４５ｎｇ／ｍＬ in acetonitrile）１５０μＬを入れ、１０分間ボルテックス（vortex）した後、１５，０００ｒｐｍで－４℃で２０分間遠心分離した。その後、上清液１５０μＬを取って他のエッペンドルフチューブに移した後、窒素気流下で有機溶媒を乾燥した。乾燥したエッペンドルフチューブに３次蒸留水１２５μＬを入れて再溶解した。その後、５分間ボルテックス（vortex）し、１５，０００ｒｐｍで－４℃で５分間遠心分離した後、上清液１００μＬを取ってＬＣ－ＭＳ／ＭＳバイアル（vial）に移した後、５μＬを注入してＬＣ－ＭＳ／ＭＳで分析した。
４－５．分析適合性の判定
分析過程の適合性を判断するために、試料処理中に分析試料バッチごとに検量線作成用試料を分析した後、分析適合性試料（ゲムシタビン及びｄＦｄＵのそれぞれの最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、３０ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、９００ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、４０００ｎｇ／ｍＬ及び最低定量限界：ＬＬｏＱ、１０ｎｇ／ｍＬ、低濃度：ＬｏＱＣ、３０ｎｇ／ｍＬ、中濃度：ＭｉＱＣ、９００ｎｇ／ｍＬ、高濃度：ＨｉＱＣ、２０００ｎｇ／ｍＬ）を２回ずつ分析した。６個の適合性試料のうち、少なくとも６７％（例えば、６個中４個）の試料が理論値の±１５％以内でなければならず、同じ濃度で５０％以上の試料が理論値の±１５％以内であるかを確認した。
４－６．薬物動態パラメータの計算方法及び統計処理
ゲムシタビンの薬物動態パラメータは、Ｗｉｎｎｏｎｌｉｎ Ｐｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌ（Pharsight、Mountain View、CA、USA）プログラムを用いて求めた。血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｔ）の値は、薬物投与してから最終定量時点までの血漿濃度－時間曲線からｌｏｇ－ｌｉｎｅａｒ台形公式（血漿濃度が増加する区間では、linear－台形公式を用いる一方、血漿濃度が減少する区間では、濃度値をログ変換して台形公式を用いる。）を用いた。経口投与後、血漿濃度－時間曲線から最高血漿濃度（Ｃｍａｘ）及び最高血漿濃度に到達する時間（Ｔｍａｘ）を求めた。無限時間までの血漿濃度－時間曲線下面積（ＡＵＣｉｎｆ）の値は、下記式を用いて求めた。末端消失速度定数（γＺ）及び半減期（ｔ１／２）は、血漿濃度推移の消失相の傾きから求めた。
ＡＵＣｉｎｆ＝ＡＵＣｔ＋Ｃｔ／γＺ（Ｃｔ：最終定量濃度、γＺ：末端消失速度定数）
両群の薬物動態パラメータの比較は、ＳＰＳＳ（version 19、Chicago、IL、USA）を用いて、独立標本ｔ－検定により行った。
４－７．ゲムシタビン及びｄＦｄＵの体内薬物動態特性の比較
ラットにゲムシタビンを静脈注射（８ｍｇ／ｋｇ）または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５を静脈注射したとき（１６０ｍｇ／ｋｇ、ゲムシタビンとして８ｍｇ／ｋｇ）のゲムシタビンの血漿中濃度を図８に、ｄＦｄＵの血漿中濃度を図９に示す。また、ゲムシタビンを静脈注射または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５を静脈注射したときのゲムシタビン及びｄＦｄＵの薬物動態パラメータの値を下記表８に平均値±標準偏差で示す。下記表８において、ＡＵＣｔは０分から最後の採血時間までの曲線下面積、ｔ１／２はｔｅｒｍｉｎａｌ ｈａｌｆ－ｌｉｆｅ（血漿消失半減期）、ＣＬはｔｏｔａｌ ｂｏｄｙ ｃｌｅａｒａｎｃｅ、Ｖｄｓｓは体内分布容積、ＭＲＴは薬物が体内に滞留する平均時間（mean residence time）、ｔｍａｘはｍｅｄｉａｎ（ranges）であり、Ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏの値は、ｄＦｄＵ ＡＵＣｔの値をゲムシタビンＡＵＣｔの値で割って計算した値である。
Figure 2022505329000051
実験の結果、ゲムシタビン投与群の場合は、薬物の静脈注射後、一般的な薬物動態のように薬物投与直後に最高血漿濃度に達したが、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群の場合は、静脈注射して５～３０分の間にＣｍａｘに達した。（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５を静脈注射した後の血漿ゲムシタビンの濃度は、生体内の核酸分解酵素によってオリゴヌクレオチドである［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５からゲムシタビンが遊離された濃度を意味する。予備実験の結果、血漿試料処理（アセトニトリルまたはメタノールなどの有機溶媒）過程で（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５からゲムシタビンに遊離されないことを確認した。また、ゲムシタビンは、血漿タンパク結合率が非常に低い薬物であるため、ラットに（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５を静脈注射した後に血漿で測定されたゲムシタビンの濃度は、生体内核酸分解酵素によるゲムシタビンの遊離濃度を示す。（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群は、ゲムシタビン投与群に比べて１２０分までゲムシタビンの血漿濃度が非常に低かった。ゲムシタビンを静脈注射して１２０分以後（３６０分、７２０分）には、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群において、ゲムシタビンの濃度がゲムシタビン投与群に比べて高かった（図８参照） 。これは、体内で核酸分解酵素によって［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５からゲムシタビンへと代謝され、血漿にゆっくり遊離されることを意味する。その結果、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群では、ゲムシタビンの血漿消失半減期（ｔ１／２）が統計的に有意に約２倍増加した（１７７±２８．５分 ｖｅｒｓｕｓ ３６０±５４．８分；前記表８参照）。また、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群では、薬物と体内組織との親和度を意味するゲムシタビンのＶｄｓｓ（体内分布容積）の値が２倍以上大幅に増加したことが分かった（１１５０±２２３ｍＬ／ｋｇ ｖｅｒｓｕｓ ２６７０±１３９ｍＬ／ｋｇ；前記表７参照）。すなわち、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群は、ゲムシタビン投与群に比べてゲムシタビンの体内組織内親和度が増加し、組織に多く分布することを予測できる。両群において、ゲムシタビンのＡＵＣｔとＡＵＣｉｎｆの値は類似しており、統計的な有意性を示さなかった。（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群の場合は、ゲムシタビンの非活性代謝物であるｄＦｄＵの血漿濃度が、投与後３６０分までゲムシタビン投与群に比べて低く検出された（図９参照）。血漿で測定されたｄＦｄＵの濃度は、［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５に結合されたゲムシタビンがｄＦｄＵへと代謝されないので、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５の静脈注射後、生体内の核酸分解酵素によって［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５から遊離されたゲムシタビンが血漿のシチジンデアミナーゼによって生成されたｄＦｄＵの濃度を意味する。しかし、３６０分後は（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群でより高いｄＦｄＵの血漿濃度が示されたが、相対的に短い採血時間の限界があり、これ以上の確認はできなかった。ｄＦｄＵのＣｍａｘの値は、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５投与群で減少する傾向があったが（３６４±５２．３ｎｇ／ｍＬ ｖｓ ４７７±８７．９ｎｇ／ｍＬ）、両群間の統計的有意性は示さなかった（前記表８参照）。両群でシチジンデアミナーゼによるｄＦｄＵの生成比率を比較するために、ｍｅｔａｂｏｌｉｃ ｃｏｎｖｅｒｓｉｏｎ ｒａｔｉｏをｄＦｄＵ ＡＵＣｔの値をゲムシタビンＡＵＣｔの値で割って計算したところ、両群の値が類似しており（０．１９０±０．０１９ ｖｓ ０．１８１±０．０１２４）、統計的な有意性を示さなかった。これは（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５の場合には、生体内で［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５に結合されたゲムシタビンがゆっくり血漿に遊離され、各組織に多く分布するが、血漿および各組織に存在するシチジンデアミナーゼによってｄＦｄＵの生成に影響を与えないと予測される。
下記表９は、ゲムシタビン及び（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５の投与後の経時によるゲムシタビンの血中濃度を示す。
Figure 2022505329000052
下記表１０は、ゲムシタビン及び（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５の投与後の経時によるｄＦｄＵの血中濃度を示す。ＢＬＬｏＱは最低定量限界以下、ＮＤは非検出を意味する。
Figure 2022505329000053
実施例５．医療用アテロコラーゲンの製造
５－１．豚皮の準備ステップ
豚皮を水道水で３回洗浄し、１次精製水で３回洗浄した後、３ｋｇ（２０ｃｍ×２０ｃｍ）に分けて－２０℃の冷凍庫に保管した。冷凍豚皮を４℃で２時間静置して解凍した後、１．５ｃｍ×８ｃｍサイズに細かく切り、０．５Ｍ酢酸７．５Ｌを加えて一晩静置し、豚皮が膨潤することを確認した。
５－２．脂肪の除去ステップ
膨潤された豚皮を取り出して１．５ｃｍ×１．５ｃｍサイズに切った後、新しい０．５Ｍ酢酸７．５Ｌをさらに加えて数時間静置した後、ふるいを用いて真皮のみをろ過回収した。１０Ｌの精製水を用いて真皮を洗浄した。洗浄過程を計５回繰り返した。洗浄が終わった真皮にエタノール２０Ｌを加えた後、４℃で一晩撹拌した。一晩撹拌が終わったサンプルから真皮のみを回収してエタノール２０Ｌを加えた後、さらに４℃で１時間撹拌した。ふるいを用いて真皮をふるい分け、１時間程度静置してエタノールを除去した。脂肪が除去された真皮を適度な重量（５００ｇ）に小分けして、－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。
５－３．真皮の均質化及び粉砕
４℃で静置して解凍した３ｋｇの冷凍真皮に０．５Ｍ酢酸７．５Ｌを加えた後、３０分間静置した。ふるいを用いてろ過して酢酸を除去した後、真皮を２５０ｇずつ小分けした。２５０ｇの真皮と精製水２Ｌをミキサーに入れて２分間粉砕した後、さらに精製水２Ｌを加えて２分間粉砕した。粉砕した組織に０．７３Ｍ酢酸４Ｌを加えた。さらにホモジナイザー（Homogenizer）を用いて３分間組織を再粉砕した。粉砕過程を合計４回繰り返して１ｋｇの冷凍真皮を粉砕、混合した。これに０．７３Ｍ酢酸１８Ｌを加えて、最終的に酢酸の濃度が０．５Ｍになるように調整し、ｐＨが２．５～４程度であることを確認した。攪拌機を用いて３時間低速攪拌した。
５－４．ペプシン処理
撹拌が終わった真皮サンプルに真皮１ｋｇ当たりに１５×１０７ｕｎｉｔのペプシンを加え、撹拌機を用いて２４時間低速撹拌した。ペプシン処理が終わったサンプルに１０Ｍ ＮａＯＨを加え、攪拌し、ｐＨ８～９とし、さらに１０分間攪拌してペプシンを非活性化した。塩基処理によるペプシンの非活性化後、４Ｍ ＨＣｌを加え、攪拌し、ｐＨ３．４とし、さらに１０分間攪拌した。遠心分離器を用いてサンプルを７８００ｒｐｍ、４℃で１０分間遠心分離した後、上澄液の表面の脂肪を除去して残りの上澄液を収集保管した。
５－５．塩析及びアテロコラーゲン中間体の生産
真皮から製造された上澄液１Ｌに対して５Ｍ ＮａＣｌを１６３ｍｌの割合でゆっくりと加え、１５分間攪拌した後、４℃の条件下で一晩静置して塩析した。塩析後、上澄液を吸引除去した後、沈殿物を遠心分離（７８００ｒｐｍ、１０分、４℃）して上澄液を完全に除去した。沈殿物に３０Ｌのエタノールを加えて４℃の条件下で一晩撹拌して洗浄した。遠心分離（７８００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、さらに沈殿物に３０Ｌのエタノールを加え、４℃の条件下で６時間攪拌して２次洗浄した。遠心分離（７８００ｒｐｍ、１０分、４℃）後、沈殿物であるアテロコラーゲン中間体の重量を測定し、小分けして－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。
５－６．医療用アテロコラーゲンの生産
アテロコラーゲン中間体２００ｇに０．０２Ｍ尿素（Urea）２．８Ｌを加えた後、一晩攪拌した。Ｃｅｎｔｒａｍａｔｅ（Tangential Flow Filtration System）を用いて、アテロコラーゲンのダイアフィルトレーション（diafiltarion）を行い、回収された溶液を攪拌機で攪拌しながら０．５Ｍ ＮａＯＨを加えてｐＨ７とした。製造された中性のアテロコラーゲンをジップロック（登録商標）に薄くて平らに小分けして、－８０℃の超低温冷凍庫に保管した。凍結乾燥機の予備凍結（－４０℃）を少なくとも１時間以上行った後、超低温冷凍庫に保管されているアテロコラーゲンを凍結乾燥機に入れて凍結乾燥を行った。凍結乾燥が完了した医療用アテロコラーゲンは適当なサイズに切って真空包装した後、冷蔵保管した。
５－７．バッファ溶液を置換してｐＨ中性が確認されたアテロコラーゲン溶液の製造
５－７－１．凍結乾燥されたアテロコラーゲンを酢酸ナトリウムバッファー溶液（0.3M Sodium Acetate（NaOAC）、45%acetic acid）に溶かすステップ
０．３Ｍ ＮａＯＡＣ、４５％酢酸（acetic acid）バッファ溶液の製造のために、３次滅菌水５５ｍｌと９９％以上の純度の酢酸（acetic acid）溶液４５ｍｌにＣＨ３ＣＯ２Ｎａを２．４ｇ溶かす。その後、ｐＨメーター（pH meter）でｐＨが３．０になるように酢酸（Acetic acid）で滴定した。凍結乾燥アテロコラーゲン３ｇを０．３Ｍ ＮａＯＡＣ、４５％酢酸（acetic acid）溶液に溶かすために、滅菌鉗子とハサミで細かく切って準備した。スターラーバー（Stirring bar）で溶液を混ぜながら、細かく切ったアテロコラーゲンを少しずつ入れて完全に溶かした。
５－７－２．タンジェンシャルフローフィルタ（Tangential Flow Filter、TFF）システムを用いて透析ろ過してアテロコラーゲン溶液をＰＢＳで置換するステップ
準備されたＴＦＦシステムに３％アテロコラーゲン溶液を、図のようにポンプを用いて流しながら（ＴＦＦ １００Ｋで）コラーゲン溶液を透過し、ろ過（filtration）された酢酸ナトリウムバッファー溶液は廃棄物（waste）として移動廃棄し、残りの溶液は再びｒｅｓｅｒｖｏｉｒでｒｅｔｅｎｔａｔｅ管を介して移動するようにして準備した。１Ｘ ＰＢＳバッファ溶液をｒｅｓｅｒｖｏｉｒに添加して３．０％アテロコラーゲン溶液の水位を一定に維持しながら透析ろ過を続けた。最初に準備したアテルロコラーゲン－酢酸ナトリウムバッファー溶液の１０倍に相当する体積のＰＢＳ溶液を用いて透析ろ過を続けた。これにより、バッファ交換（buffer exchange）を行った。バッファ交換が完了すると、透過されて出てくる溶液のｐＨをモニタリングして中性ｐＨが検出されることを確認する方法により、バッファ交換の完成をチェックした。透析とろ過過程が終了した３％アテロコラーゲンを滅菌処理されたチューブに１０ｍｌずつ分取（aliquot）して移し、４℃の冷蔵庫に保管した。
実施例６．オリゴヌクレオチド変形体／アテロコラーゲン組成物の作製
６－１．アテロコラーゲン（Atecollagen、AC）分散液の調製
ＮａＯＡｃ／ＨＡｃ溶液（０．３Ｍ酢酸ナトリウム（Sodium Acetate）、４５％酢酸（acetic acid））に高純度の医療用アテロコラーゲンを０．５％、１．０％、１．５％、２．０％及び３．０％（バッファ１００ｍｌ当たりアテロコラーゲンをそれぞれ０．５ｇ、１．０ｇ、１．５ｇ、２．０ｇ及び３．０ｇ）入れて、ｐＨ３．０に維持し、攪拌して完全に溶かした。この溶液をＴＦＦ（Tangential Flow Filtration）を用いて透析ろ過し、アテロコラーゲン溶液を１０倍体積（volume）の１ＸＰＢＳ溶液でダイアフィルトレーション（dia－filtration）して、ＰＢＳ溶液の医療用アテロコラーゲン分散液を調製した。
６－２．ＩＯ１０１／アテロコラーゲン・ゾル－ゲル型及びＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン・ゾル－ゲル型の製造
（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）をＰＢＳに入れ、室温でミキサー（mixer）を用いて完全に溶かした後、アテロコラーゲン分散液（０．５％、１．０％、１．５％、２．０％、３．０％それぞれ）４００μｌ当たり、ＩＯ１０１またはＩＯ１０１ＬがＰＢＳに混合された溶液を０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ、２．０ｍｇ、４．０ｍｇ、８．０ｍｇ混合した。
室温でローテーターカフ（rotator cuff）装置を用いて３０分間混合して混合液を調製した。低い温度で液体状態（Sol）である（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）／ ＡＣ（ゾル－ゲル型）または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）／ＡＣ（ゾル－ゲル型）は、生体内の腫瘍に直接注入時３７℃で固化（Gel）され、（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）を包んでいたアテロコラーゲンが徐々に溶けて薬物が徐々に放出され、効果的な腫瘍治療薬として使用可能である。
６－３．ＩＯ１０１／アテロコラーゲン・ディスク及びＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン・ディスクの製造
先に製造した高濃度のコラーゲン分散液と（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４（ＩＯ１０１）または（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５（ＩＯ１０１Ｌ）をゾル－ゲル型の製造方法と同様の方法で混合液を調製した。
準備された混合液を直径１ｃｍの円筒状シリコンモールドに入れて拡散させて０．５ｍｍの均一な膜を形成した後、零下８０℃で凍結した。凍結が完了した試料を－７０℃に維持された凍結乾燥機で３０時間凍結乾燥して多孔性膜を製造した。以下では、前述の方法により製造された膜をディスク（disk）またはパッチ（patch）で表現する。
実施例７．オリゴヌクレオチド変形体／アテロコラーゲン組成物の血漿中安定性の評価
ラット血漿中のゲムシタビン、（Ｇｅｍ）ｘ－［ＴＧＧ］ｍ［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］ｎ及び医療用の高純度アテロコラーゲン剤形から放出されるゲムシタビン及びゲムシタビンの非活性代謝物であるｄＦｄＵの濃度を分析した。試料の処理、検量線の作成、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳの分析条件は、前述の通りである。
７－１．ラット血漿中の（ＩＯ１０１Ｌ）／アテロコラーゲン・ディスクの安定性の評価
ゲムシタビン／アテロコラーゲン・ディスクの血漿中安定性を評価するために、下記表１２に示すように５つの群に分けて実験を行った。
ラット血漿２ｍＬに血漿中濃度が６０μｇ／ｍｌになるようにグループ２、グループ３、グループ４、グループ５にゲムシタビン／アテロコラーゲン・ディスクを入れ、ＣＯ２インキュベータ（incubator）中で３７℃で２時間インキュベート（incubation）した。試料の処理は、以下のように行った。２時間後、血漿中のゲムシタビン／アテロコラーゲン・ディスクに付いているコラーゲンを除去するために、Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ－３Ｋにゲムシタビンが入っている血漿５００μＬを入れ、１５，０００ｒｐｍ、２０℃で３０分間遠心分離した。その後、上清液を取って、取った上清液を前記のような条件下でさらに遠心分離した後、濃縮液５μＬを取って、同じラット血漿を用いて１０倍希釈して血漿中濃度を測定した。Ｕｌｔｒａｃｅｌｌ－３Ｋの上端部に濃縮されているゲムシタビンの濃度と下端部にろ過された血漿中のゲムシタビンの濃度を測定し、２時間インキュベート（incubation）した後、ディスク（disk）から溶出されたゲムシタビンの濃度を測定した。前記試料の処理方法は、検量線の作成方法と同じ方法で行った後、ＬＣ－ＭＳ／ＭＳと同じＬＣ－ＭＳ／ＭＳ条件下で試料を分析した。
ラット血漿中のゲムシタビン（ｄＦｄＣ）とその代謝物であるｄＦｄＵを分析したところ、最低定量限界はそれぞれ１０ｎｇ／ｍＬの分析が可能であった。また、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）の分析時、ｄＦｄＵピークが示されるクロストーク（cross－talk）現象が発生して、ゲムシタビン（ｄＦｄＣ）とｄＦｄＵのリテンションタイム（retention time）が異なるように移動相にグラディエント（gradient）を与え、それぞれのピークに影響を与えないようにして測定した。これによるゲムシタビンとｄＦｄＵのリテンションタイム（retention time）は、それぞれ２．１分、４．２３分と測定された。標準血漿試料を分析したところ、試料はいずれも精度が±１５％以内と測定された。したがって、これを用いた試料の濃度は信頼することができる（下記表１１参照）。
Figure 2022505329000054
７－２．インビトロでの（ＩＯ１０１Ｌ）／アテロコラーゲン・ディスクの安定性の評価
ＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン・ディスク剤形のラット血漿中での安定性を評価するために、５つの群（グループ１～５）に分けて実験を行った（下記表１２参照）。アテロコラーゲンとの比較のために、通常のコラーゲン（ｓｋ社製）を用いた。
Figure 2022505329000055
ＣＯ２インキュベータ（incubator）で２時間培養した結果、ストック（stock）状態であるグループ１とは異なり、ゲムシタビン／アテロコラーゲン・ディスクのグループ２及び３では、ゲムシタビンの濃度が低く測定された。（Ｇｅｍ）２－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］５／アテロコラーゲン・ディスク剤形であるグループ４及び５では、コラーゲンのみが入っているグループ２及びグループ３と比べても濃度が低く測定された。予備実験の結果、ＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン・ディスク剤形は、ラット血漿中で放出される速度が安定的で遅いことが確認できた。また、アテロコラーゲンと結合した剤形は、ゲムシタビンがゲムシタビンの非活性代謝物である２’，２’－ジフルオロデオキシウリジン（difluorodeoxyuridine）へと代謝される比率が顕著に少ないことが分かった（下記表１３参照）。
Figure 2022505329000056
実施例８．オリゴヌクレオチド変形体／アテロコラーゲン組成物の抗癌効能の評価
８－１．皮下膵臓癌の動物モデルを用いたＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）の抗癌効能
膵臓癌細胞株を移植した皮下膵臓癌の動物モデルを用いて、ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）の膵臓癌治療効果を検証した。
８－１－１．ＩＯ１０１含有量による抗癌効能の評価
ゲムシタビン／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）と比較して、ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）の方が膵臓癌の抑制効果が優れることを確認した。様々な臨床状況に対応するために、局所注射治療が可能なゾル（Sol）型の薬物を使用した。注射後の腫瘍サイズの変化と組織学的変化を確認して治療効果を検証した。
つまり、膵臓癌細胞株であるＣａｐａｎ－１細胞を推奨培地（RPMI、10%FBX、1%AA）で培養した後、１×１０６個の細胞をヌードマウスに皮下注射した。キャリパー（calliper）で腫瘍サイズを測定し、直径０．５ｃｍに達したマウスを治療対象に選定した。統計分析のために、群当たり５匹以上のマウスを確保して効能評価を行った。ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）を用いて腫瘍に直接注射した後、腫瘍サイズを測定して効果を判定した。治療後３０日の終了時点で動物を犠牲にした後、腫瘍を摘出して効果を判定した。
アテロコラーゲン分散液４００ｕＬ当たりＩＯ１０１分散液０．５ｍｇ、１．０ｍｇ、１．５ｍｇ及び２．０ｍｇを混合してＩＯ１０１の容量を変化したＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）製剤（ＩＯ１０１－０．５ｍｇ／ＡＣ、ＩＯ１０１－１．０ｍｇ／ＡＣ、ＩＯ１０１－１．５ｍｇ／ＡＣおよびＩＯ１０１－２．０ｍｇ／ＡＣ）を皮下膵臓癌のマウスに注入した。３０日後に腫瘍を摘出してサイズを比較した。ＩＯ１０１－２ｍｇ／ＡＣ（ゾル－ゲル型）において、腫瘍が最も抑制されることを確認した（図１０及び１１を参照）。
８－１－２．アテロコラーゲンの濃度による抗癌効能の評価
ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）を皮下注射した後、動物の体重減少、毒性を評価して、アテロコラーゲン分散液４００ｕＬ当たりＩＯ１０１の容量を２ｍｇに固定した。アテロコラーゲン（ＡＣ）濃度によって、薬物の持続時間、治療効果などに差異が出ることがあるので、０．５％、１．０％、１．５％の濃度（バッファ１００ｍｌ当たりのｇ数）のアテロコラーゲンに対して比較実験を行った。１．５％の濃度（バッファ１００ｍｌ当たりのｇ数）のアテロコラーゲンにおいて、皮下膵臓癌のマウスの治療効果が最も高いことを確認した（図１２参照）。
８－２．ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ディスク）の皮下膵臓癌細胞株移植動物の生体内抗癌効能
膵臓癌細胞株（Pancreatic cancer cell line）であるＢＸＰＣ３をＢＡＬＢ／Ｃヌードマウスｓｕｂｃｕｔａｎｅｏｕｓ ２×１０６ずつ移植した。３日後、腫瘍の上にグループごとに各３匹ずつディスクを移植した。移植後３０日間、週に２回、マウスの腫瘍体積をキャリパー（calliper）を用いて（長軸×短軸）２×０．５で測定し、重量（weight）とともに週に２回測定した。インビボにおいて、他のグループに比べてＩＯ１０１／ＡＣディスクの方が膵臓癌がより抑制されることを確認することができた。ディスクの移植後、ＰＯＤ３０ Ｍｏｕｓｅ ｉｍａｇｅから腫瘍サイズを観察した。ＩＯ１０１／ＡＣディスクが他のグループに比べて腫瘍体積が小さいことを肉眼でも確認することができた。ＩＯ１０１／ＡＣディスクは、全般的に腫瘍体積が小さいことが確認され、ＩＯ１０１－２ｍｇ／１．５～３．０％ＡＣグループの腫瘍体積が最も小さかった（図１３及び１４を参照）。
８－３．ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ディスク）のｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ膵臓癌のマウスモデルでの膵臓癌治療効能
Ｂａｌｂ／ｃ－ヌード（雄性、６週齢、３０匹）を特定のベクター（vector）の置換によってルシフェラーゼ（luciferase）発現する５×１０５ ＢｘＰＣ３癌細胞株とｓａｌｉｎｅを用いて膵臓に注入した。膵臓癌のマウスモデルが構築される２週間の時点でルシフェラーゼ・イメージング（luciferase imaging）を行って腫瘍を確認した。自己蛍光を減らすために、画像撮影の１週間前に無蛍光飼料を提供した。ＩＯ１０１／ＡＣディスク及び比較薬物を腹腔内に挿入した。（Intra－Abdominal cavity insertion using surgery）モデルの構築直後、インビボＩＶＩＳスペクトル（spectrum）機器を用いて、ルシフェラーゼ・イメージングを行って腫瘍及び腫瘍サイズを測定した。ＩＶＩＳスペクトル機器を用いて、ルシフェラーゼ・イメージングを時間帯別（１６ｔｈ、１８ｔｈ、２１ｔｈ、２３ｔｈ、２５ｔｈ、２８ｔｈ、３１ｔｈ、３５ｔｈ ｄａｙ）に測定した。最後のインビボＩＶＩＳスペクトル・イメージングを行った後、動物を犠牲にして各臓器別（spleen、liver、heart、lung、kidney、pancreas include tumor）にエクスビボ（ex－vivo）を行った。摘出した腫瘍のサイズをキャリパー（calliper）で測定して比較した。実験動物にディスク薬物を挿入した直後からルシフェラーゼ・イメージングにより腫瘍サイズの変化を時間帯別に確認した。ＩＶＩＳスペクトルを用いて、ルシフェラーゼ・イメージングの変化を以下のようにして測定した（図１５参照）。実験動物を犠牲にした後、エクスビボで腫瘍の実質的なサイズを測定した。下記表１４に摘出した腫瘍の実質的なサイズの変化を示し、それを図１６にグラフで示す。
Figure 2022505329000057
また、ＡＣディスクのみを移植したグループでは、腫瘍サイズが他のグループに比べてより大きくなっており、ほとんど腹腔内転移癌に進行されることを確認した。肝、脾臓、腎臓で最も多い転移が確認され、腹腔内のすべての臓器への転移を確認した。Ｇｅｍ／ＡＣディスクを移植したグループも、腫瘍サイズはＡＣディスクのグループと大きな差異がなく、腹腔内転移されたことを確認した。ＩＯ１０１／ＡＣディスクにおいて腫瘍サイズの増加が抑制され、Ｇｅｍ／ＡＣディスク及びＡＣディスク移植材は、ほとんど腹腔内肝、横隔膜などに転移されたことを観察したが、ＩＯ１０１／ＡＣディスクでは腹腔内癌転移が観察されなかった（図１７参照）。
８－４．ＩＯ１０１／アテロコラーゲン（ディスク）及びＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン（ディスク）のｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ膵臓癌のマウスモデルでの膵臓癌転移抑制効能
Ｂａｌｂ／ｃ－ヌード（雄性、６週齢、３０匹）を特定のベクター（vector）の置換によってルシフェラーゼ（luciferase）発現する５×１０５ ＢｘＰＣ３癌細胞株とｓａｌｉｎｅを用いて膵臓に注入した。膵臓癌のマウスモデルが構築される２週間の時点でルシフェラーゼ・イメージング（luciferase imaging）を行って腫瘍を確認した。自己蛍光を減らすために、画像撮影の１週間前に無蛍光飼料を提供した。ＩＯ１０１／ＡＣディスクまたはＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスク及び比較薬物を腹腔内に挿入した。（Intra－Abdominal cavity insertion using surgery）モデルの構築直後、インビボＩＶＩＳスペクトル（spectrum）機器を用いて、ルシフェラーゼ・イメージングを行って腫瘍及び腫瘍サイズを測定した。ＩＶＩＳスペクトル機器を用いて、ルシフェラーゼ・イメージングを時間帯別（１６ｔｈ、１８ｔｈ、２１ｔｈ、２３ｔｈ、２５ｔｈ、２８ｔｈ、３１ｔｈ、３５ｔｈ ｄａｙ）に測定した。最後のインビボＩＶＩＳスペクトル・イメージングを行った後、動物を犠牲にして各臓器別（spleen、liver、heart、lung、kidney、pancreas include tumor）にエクスビボ（ex－vivo）を行った。各臓器に対する腹腔転移有無を観察した。ＡＣディスク移植材は、ほとんど腹腔内肝、腎臓、横隔膜などに転移されたことを観察したが、ＩＯ１０１／ＡＣディスク及びＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスクでは、腹腔内癌転移が観察されなかった（図１８参照）。
８－５．ＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン（ディスク）移植後の生存率の変化
膵臓癌同所移植マウスモデル（Orthotopic mouse model）において、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスク移植後の濃度別生存率を比較した。ＡＣディスクのみを移植した後は、３２日後に５匹中２匹が生存し、ＩＯ１０１Ｌ－２ｍｇ（４００μＬアテロコラーゲン分散液当たりＩＯ１０１Ｌを２ｍｇ混合）／ＡＣディスクを移植した後は、５匹中４匹が３２日まで生存した。ＩＯ１０１Ｌ－４ｍｇ（４００μＬアテロコラーゲン分散液当たりＩＯ１０１Ｌを４ｍｇ混合）／ＡＣディスク及びＩＯ１０１Ｌ－８ｍｇ（４００μＬアテロコラーゲン分散液当たりＩＯ１０１Ｌを８ｍｇ混合）／ＡＣディスクでは、６日目に５匹がすべて死亡した（図１９参照）。
８－６．ＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン（ゾル－ゲル型）及びＩＯ１０１Ｌ／アテロコラーゲン（ディスク）のｏｒｔｈｏｔｏｐｉｃ ｘｅｎｏｇｒａｆｔ膵臓癌のマウスモデルでの残存癌除去後の腫瘍抑制および転移抑制の効果
８－６－１．ＢｘＰＣ３膵臓癌移植マウスの実験
同所移植（Orthotopic）膵臓癌のマウスで外科的手術で腫瘍を除去した後、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣゾル－ゲル型またはＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスク薬物を挿入して、残りの腫瘍の抑制および腹腔内の他の臓器への転移が抑制されたかどうかを観察した。つまり、Ｂａｌｂ／ｃ－ヌード（雄性、６週齢、２１匹）を特定のベクター（vector）の置換によってルシフェラーゼ（luciferase）発現する５×１０５ ＢｘＰＣ３癌細胞株（２５ｕＬ）を準備し、腹腔麻酔したマウスの腹部を切開して膵臓（pancreas）を取り出し、準備しておいたＢＸＰＣ－３－Ｌｕｃ ｃｅｌｌを膵臓（pancreas）に注入した。膵臓癌のマウスモデルが構築される２週間の時点でルシフェラーゼ・イメージング（luciferase imaging）を行って腫瘍を確認した。使用される腫瘍細胞株（tumor cell line）は、ＢｘＰＣ３細胞で特定のベクターの置換によってルシフェラーゼを発現するＢｘＰＣ３－Ｌｕｃ ｃｅｌｌであり、ルシフェリン（luciferin）を用いて腫瘍を測定する。自己蛍光を減らすために、画像撮影の１週間前に無蛍光飼料を提供した。腹腔麻酔したマウスの腹部を切開して膵臓癌を除去した後、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣゾル－ゲル型、ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスク、Ｇｅｍ／アテロコラーゲン・ゾル－ゲルまたはＧｅｍ／アテロコラーゲン・ディスクを残りの腫瘍部位に移植した。（Intra－Abdominal cavity insertion using surgery）ルシフェラーゼ・イメージングを用いて腫瘍サイズおよび転移を確認し、それを図２０に示す。
８－６－２．Ｃａｐａｎ－１膵臓癌移植マウスの実験
膵臓癌同所移植（orthotopic）マウスモデルの作製のために、注文したマウスが届いたら、１週間の馴化期間を有する。馴化期間中ｃａｐａｎ－１細胞を１×１０６細胞／１００ｕｌ準備した。マウスの皮膚を２ｍｍ開腹し、脾臟（spleen）を見つけて反らし、膵臓に直接注射器で細胞を注入した。４週間後、腫瘍の直径が５～６ｍｍになっているかをＭＲＩで確認した。癌細胞の直径が５～６ｍｍになったことが確認されると、開腹して膵臓癌をできるだけ多く除去した。除去後、残存癌の上にＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスク、アテロコラーゲン・ディスク（対照群）を挿入して縫合した（図２１参照）。
１ヶ月経過後、腫瘍サイズをＭＲＩで確認した。映像撮影が終了したら、手術室内のＣＯ２チェンバー（chamber）を用いてマウスを安楽死させた。グループごとに腹腔内腫瘍転移があるかどうかを確認し、各腫瘍組織を得た後、１０％ホルマリン（formalin）に固定した。Ｈ＆Ｅ及びその抗体（antibody）を用いて免疫染色で組織病理を確認した。ＩＯ１０１Ｌ／ＡＣディスクを挿入した腹腔内では転移が全く起こらなかったが、アテロコラーゲン・ディスク（対照群）では、腹腔内脾臓、肝などへの転移が起きたことを確認した（図２２参照）。また、アテロコラーゲン・ディスク（対照群）では、１ヵ月経過後、腹腔内肝、横隔膜、腎臓などへの転移が観察された（図２３参照）。
８－７．患者由来の膵臓癌細胞を用いたＰＤＸ（Patient－derived xenograft）膵臓癌のマウスモデルでの抗癌効能
８－７－１．患者由来の膵臓癌細胞を用いたＰＤＸ膵臓癌のマウスモデルの構築
ＰＤＸモデルは、腹腔鏡下膵臓切除術を受けた６５歳の女性患者から切除された膵臓癌を用いて正常に確立した。病理学的検査の結果、サイズは３．２ｃｍであり、リンパ管浸潤が頻繁な膵管腺癌（pancreatic ductal adenocarcinoma）が発見された。検索された７つのリンパ節のうち、１つの転移性リンパ節が発見された（AJCC 8th T2N1M０、IIB）。Ｈ＆Ｅとｎｕｃｌｅｏｌｉｎｅ ｉｍｍｕｎｏｓｔａｔｉｎｇによるＰＤＸと元の原発腫瘍の組織学的特徴を比較したところ、全組織学的類似性は、原発腫瘍とＰＤＸ腫瘍との間で発見された（図２４参照）。
雄性肥満糖尿病／重症複合免疫不全マウス、ＮＯＤ／Ｓｈｉ－ｓｃｉｄ、ＩＬ－２ＲγＫＯマウス（NOG mice（登録商標）（Central Lab Animal Inc.、Saeronbio Inc、ソウル）及び雌性ｎｕ／ｎｕ無胸腺マウス（athymic mouse、Orientbio社）を病原菌のない条件下で、１２時間は光、１２時間は暗のサイクルで維持した。手術当時の患者の原発腫瘍から保管した新しい膵臓腫瘍の検体１０個（機関検査委員会No.4-2017-0594）を氷冷却ＲＰＭＩ培地でＰＤＴＸクリーンベンチ部署実験室動物資源のＰＤＸ ＳＯＰ（延世大学の生命医学研究所、ソウル）を冷たいＰＢＳで洗浄し、非壊死性断片を小さなピース（２×２×２ｍｍ）に切断して、血液または脂質部分を除去し、ペトリ皿にマトリゲル（matrigel）コーティングした。その後、Ｐｒｅｃｉｓｉｏｎ Ｔｒｏｃｈａｒ１０ゲージ（MP182、Innovative Research of America）を使用して、生後６週間のマウスの左右側面に単一のピースを移植した。５－０縫合糸で縫合（VCP490G、ETHICON）し、正常に吸収された腫瘍のサイズが１５００ｍｍに達すると、ドナーマウス（Ｆ１）の腫瘍と同じ腫瘍および残りの腫瘍を５％ジメチルスルフィド／９５％ウシ胎児血清を含有する冷凍バイアルに液状Ｎ２に保存してコホートマウス（Ｆ２）に移植した。皮下に育った腫瘍（１５００ｍｍ３）をＦ１マウスから切除し、コホートマウス（Ｆ２）にサブパッセージ処理した。触知（palpable）腫瘍に到達するために、同じ患者異種移植において約１５０～２００ｍｍ３の腫瘍が各区画で約５０日かかった。２人の患者で原発腫瘍（Ｆ０）とＦ１（通路１）とＦ２（通路２）の対をなしたサンプルを使用した。薬効検査で腫瘍が触れられるサイズ（平均サイズ＝２６６．５±５８．０ｍｍ３）に達すると、マウス（ｎ＝８～１３／ｎ＝４／患者）を５つのグループにランダムに分けた。グループ１（治療調節なし）；ＰＢＳに懸濁されたゲムシタビン（１００ｕｇ）を４週間一回マウスに腹腔内投与したグループ２；ＰＢＳに懸濁されたＩＯ１０１（１００ｕｇ）を腹腔内投与し、４週間マウスに１回投与したグループ３；グループ４、５及び６は、３種類のパッチで移植された。治療を受けていない対照マウスも比較のために含めた。
膵臓癌患者から得られた腫瘍組織をＮＳＧ（NOD／SCID／IL－2Rg KO）マウスに移植した後、正常に成長した動物モデルに多世代移植とｓｐｈｅｒｅ細胞化による個体拡大術を行い、治療効果の評価に利用可能なＰＤＸモデルを作成した。非操作状態で皮下注入手術時、手術後１週間、手術後２週間、手術後３週間、手術後４週間、手術後５週間、そして手術後６週間経過時の腫瘍サイズ、腫瘍マーカー（CA19－9、CFB）及び体重を確認した。アニマルＰＥＴ－ＣＴおよび組織学的検査を行い、生存を確認した。
８－７－２．ＩＯ１０１／ＡＣディスクの患者由来の膵臓癌細胞を用いたＰＤＸ膵臓癌のマウスモデルでの腫瘍抑制効果の評価
ＰＤＸマウスの皮膚を切開した後、対照群（No treatment）、Ｇｅｍ－ＩＰ（；ゾル－ゲル型）、ＩＯ１０１－ＩＰ（；ゾル－ゲル型）、ＩＯ１０１／ＡＣディスク（２．０ｍｇ／３．０％）、ＩＯ１０１－Ｃｏｎ／ＡＣ（２．０ｍｇ／３．０％）及びＧｅｍ／アテロコラーゲン・ディスク（０．１２ｍｇ／３．０％）を、皮膚と腫瘍との間の皮下無感覚解剖を実施して局部的に移植した。腫瘍サイズは、キャリパー（Mitutoyo、Absolute AOS Digmatic、Kawasaki、Japan）により毎週３回測定した。体積は前述の通りにして計算した。薬物処理された動物の腫瘍成長をビヒクル処理されたマウスと比較して腫瘍成長速度（腫瘍体積／初期の腫瘍体積）で示した。データの統計的有意性は、ＩＢＭ（登録商標）ＳＰＰＳ（登録商標）Ｓｔａｔｉｓｔｉｃｓ ｖｅｒｓｉｏｎ ２３で計算した。すべての結果は、平均±標準偏差で示し、マン・ホイットニー（Mann－Whitney）のＵは、異なるグループによって連続変数を比較するために適用した。０．０５未満のＰ値は、有意なものとみなされた（図２５参照）。
ディスクを移植して１ヶ月後にマウスを犠牲にして組織標本と血液を採取した。抽出された腫瘍は、均衡スケールに重量を量り、Ｎｉｋｏｎデジタルカメラ（日本）で記録した。血液学測定のために、血液サンプルは、ＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒ ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ｔｕｂｅ ＳＳＴ（BD、USA）を収集する血清から抗凝固剤および毒性テストのためにＫ２Ｅ（K2EDTA）が含まれたＢＤ Ｍｉｃｒｏｔａｉｎｅｒチューブから収集した。ＴＵＮＥＬ分析により、ＩＯ１０１／ＡＣディスクの抗癌効果を証明した。対照（Control）群では、腫瘍壊死や細胞死滅の過程が発見されなかった。Ｇｅｍ－ＩＰ群では、アポトーシス（apoptosis）の過程が確認され、移植された癌組織から腫瘍内ＴＵＮＮＥＬ陽性癌細胞が発見された。逆にＩＯ１０１／ＡＣディスク群も有意な細胞死滅過程を示したが、ＴＵＮＮＥＬ陽性癌細胞は、腫瘍表面の表面層を沿って発見された（図２６参照）。
８－７－３．患者由来の膵臓癌細胞を用いたＰＤＸ膵臓癌のマウスモデルでのＩＯ１０１ディスク移植後の他の臓器での副作用の評価
顕微鏡検査によっては、肝、肺、腎臓および脾臓組織での潜在的な毒性（炎症または壊死性の変化など）を示唆する証拠はないことが確認された（図２７参照）。血液検査によってもＩＯ１０１／ＡＣディスク群では、白血球減少症、貧血症及び好中球減少症が観察されなかった。これに対して、ゲムシタビンの全身効果と関連するＩＰ－ＧＥＭ群では、白血球減少症（ＷＢＣ）（３．２±２．９ vs ５．４±２．９、Ｐ＝０．０２８）、低ヘモグロビン値（ＨＢ）（１０．３±４．６ vs １８．５±１１．９、ｐ＝０．０１０）、好中球減少症（Neutrophil）（０．７６±０．７１ vs ２．６９±２．６６、ｐ＝０．０１０）が示された。下記表１５は、血液検査の結果を示す。
Figure 2022505329000058
 （１）Mann－Whitney U between Control and Patch I；２）Mann－Whitney U between IP－GEM and Patch I）
実施例９．オリゴヌクレオチド変形体のインビトロ効能のスクリーニング
（Ｎ）ｘ－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５、［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５－（Ｎ）ｘおよび（Ｎ）ｘ－［ＴＧＧ］４［ＴＴＧ］［ＴＧＧ］４／または５－（Ｎ）ｙ）のＢｘＰＣ３（膵臓癌）、ＭＤ－ＭＢＡ ２３１（乳癌）、Ｕｕｈ－７（肝癌）、ＨＴ２９（大腸癌）及びＭｖ４－１１（ＡＭＬ）細胞株に対する細胞増殖抑制効果を検証した。
膵臓癌細胞株ＢｘＰＣ３ ｃｅｌｌ（ATCC、IMDM＋10%PBS）に適正細胞濃度を決定する細胞テスト（cell test）によって定められた細胞数（cell number）である２．５～５．０×１０５個／ウェルを９６ウェルプレートに播種（seeding）した後、１日間培養した。各サンプルを９５℃で５分間加熱（heating）した後、常温にゆっくり温度を下げ、濃度別に各ウェルに直接処理した。処理されたＢｘＰＣ３ ｃｅｌｌは、５％ＣＯ２インキュベータ（incubator）で３日間培養した後、ＭＴＴアッセイ（assay）用試薬溶液（Cell Proliferation KitII、Roche）を２０ｕＬずつ処理し、時間別（１０分、３０分、６０分）にインキュベート（incubation）した後、ＥＬＩＳＡリーダー（reader）により４９０ｎｍにおける吸光度を測定した（図２８及び２９を参照）。
他の細胞株であるＭＤ－ＭＢＡ ２３１（乳癌）、Ｕｕｈ－７（肝癌）、ＨＴ２９（大腸癌）及びＭｖ４－１１（ＡＭＬ）に対する細胞増殖抑制効果も前述通りの方法により検証した。各細胞株に対する細胞生存率（cell viability）は、下記表１６に示す通りである。
Figure 2022505329000059
Figure 2022505329000060
Figure 2022505329000061
Figure 2022505329000062

Claims (11)

  1. 下記化学式１の構造を有するオリゴヌクレオチド変形体。
    Figure 2022505329000063
     （式中、Ｎ及びＭは、独立して５－位または２’－位にハロゲンまたはヒドロキシが結合されたデオキシウリジン（deoxyuridine、dU）、デオキシシチジン（deoxycytidine、dC）、ウリジン（uridine、U）またはシチジン（cytidine、C）であり、ｘ及びｙは、独立して０～１０の整数であり（但し、ｘとｙが同時に０である場合は除く。）、ｎは１～１０の整数であり、ｍは１～１０の整数である。）
  2. 前記Ｎ及び前記Ｍは、独立して５－フルオロデオキシウリジン、５－フルオロウリジン、５－フルオロデオキシシチジン、５－フルオロシチジン、５－ヨードデオキシウリジン、５－ヨードウリジン、５－ヨードデオキシシチジン、５－ヨードシチジン、シトシンアラビノシド、２’，２’－ジフルオロデオキシシチジン、カペシタビン及びブロモビニルデオキシウリジンからなる群より選択されるものである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド変形体。
  3. 前記化学式１の構造は、下記の化学式２～化学式３４のいずれか１つである、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド変形体。
    Figure 2022505329000064
    Figure 2022505329000065
    Figure 2022505329000066
    Figure 2022505329000067
    Figure 2022505329000068
    Figure 2022505329000069
    Figure 2022505329000070
    Figure 2022505329000071
    Figure 2022505329000072
    Figure 2022505329000073
    Figure 2022505329000074
    Figure 2022505329000075
    Figure 2022505329000076
    Figure 2022505329000077
    Figure 2022505329000078
    Figure 2022505329000079
    Figure 2022505329000080
    Figure 2022505329000081
    Figure 2022505329000082
    Figure 2022505329000083
    Figure 2022505329000084
    Figure 2022505329000085
    Figure 2022505329000086
    Figure 2022505329000087
    Figure 2022505329000088
    Figure 2022505329000089
    Figure 2022505329000090
    Figure 2022505329000091
    Figure 2022505329000092
    Figure 2022505329000093
    Figure 2022505329000094
    Figure 2022505329000095
    Figure 2022505329000096
  4. 前記ｎは１～５の整数であり、前記ｍは１～５の整数である、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド変形体。
  5. 前記ｘ及び前記ｙは、独立して０～５の整数である（但し、前記ｘと前記ｙが同時に０である場合は除く。）、請求項１に記載のオリゴヌクレオチド変形体。
  6. 請求項１～５のいずれか一項に記載のオリゴヌクレオチド変形体またはその薬学的に許容可能な塩を含む癌の予防または治療用薬学組成物。
  7. 前記癌は、白血病、リンパ腫、乳癌、肝癌、胃癌、卵巣癌、子宮頸部癌腫、神経膠腫癌、大腸癌、肺癌、膵臓癌、前立腺癌、肝癌、胃腺癌、子宮癌、膀胱癌、甲状腺癌、卵巣癌、黒色腫、および子宮頸部癌からなる群より選択される、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
  8. アテロコラーゲン分散液剤形である、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
  9. 前記アテロコラーゲン分散液は、ＰＢＳ溶液１００ｍｌに対してアテロコラーゲンが０．５～５．５ｇ含まれたものである、請求項８に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
  10. 前記組成物は、ゾル－ゲル型またはパッチ型である、請求項６に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
  11. 前記アテロコラーゲンは、ａ）コラーゲン含有動物組織をアルカラーゼとカタラーゼ、ペプシン（Pepsin）及びパパイン（papain）のうちの少なくとも一つを処理して抽出するステップと、ｂ）抽出された物質を１次ろ過し、得られたろ液に中性塩を添加して塩析し、２次ろ過するステップと、ｃ）前記２次ろ過により得られたコラーゲン塩析物を溶解して脂肪を吸着し、３次ろ過するステップと、ｄ）前記３次ろ過工程で得られたろ液を凍結乾燥して凍結乾燥粉末を回収するステップと、ｅ）前記凍結乾燥粉末を希塩酸（dil－HCl）、希酢酸（acetic acid）またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液に溶解し、濃縮してアテロコラーゲン溶液を製造し、製造されたアテロコラーゲン溶液をポリマービーズが充填されたカラムにカラムベッドボリュームの５～２０％の体積で注入し、希塩酸、希酢酸またはｐＨ４～ｐＨ８のリン酸塩緩衝液で展開してアテロコラーゲンを回収するステップとを経て製造されたものである、請求項８に記載の癌の予防または治療用薬学組成物。
JP2021521302A 2018-10-19 2019-10-21 治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物 Active JP7433662B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US201862747807P 2018-10-19 2018-10-19
US62/747,807 2018-10-19
KR10-2019-0130669 2019-10-21
PCT/KR2019/013834 WO2020080912A1 (ko) 2018-10-19 2019-10-21 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물
KR1020190130669A KR102280330B1 (ko) 2018-10-19 2019-10-21 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물

Publications (2)

Publication Number Publication Date
JP2022505329A true JP2022505329A (ja) 2022-01-14
JP7433662B2 JP7433662B2 (ja) 2024-02-20

Family

ID=70284059

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2021521302A Active JP7433662B2 (ja) 2018-10-19 2019-10-21 治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物

Country Status (3)

Country Link
US (1) US20210388361A1 (ja)
JP (1) JP7433662B2 (ja)
WO (1) WO2020080912A1 (ja)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2023113243A1 (ko) * 2021-12-16 2023-06-22 인터올리고 주식회사 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도

Family Cites Families (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JO2778B1 (en) * 2007-10-16 2014-03-15 ايساي انك Certain vehicles, installations and methods
KR100998365B1 (ko) 2009-06-29 2010-12-06 압타바이오 주식회사 치료 효능이 있는 변형핵산 및 구아노신을 함유하는 올리고뉴클레오티드 변형체
KR102011336B1 (ko) * 2015-12-31 2019-08-16 인터올리고 주식회사 약물 전달 및 안정화를 위한 복합체 및 그 제조방법
KR102015524B1 (ko) * 2016-12-26 2019-08-29 인터올리고 주식회사 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도

Also Published As

Publication number Publication date
WO2020080912A1 (ko) 2020-04-23
US20210388361A1 (en) 2021-12-16
JP7433662B2 (ja) 2024-02-20

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Paulmurugan et al. Folate receptor–targeted polymeric micellar nanocarriers for delivery of orlistat as a repurposed drug against triple-negative breast cancer
Skubitz et al. Sarcoma
Zhao et al. Can nanomedicines kill cancer stem cells?
CN101674810B (zh) 针对癌细胞和癌相关成纤维细胞的靶向剂
Yu et al. Engineered drug-loaded cellular membrane nanovesicles for efficient treatment of postsurgical cancer recurrence and metastasis
JP6113850B2 (ja) がん性組織の治療およびがん性腫瘍の再発および転移を予防するための医薬組成物の調製のためのヘモグロビン系酸素運搬体の使用方法
CN105189614B (zh) 用硝基苯硼酸组合物稳定的纳米粒子
Kim et al. The safe and effective intraperitoneal chemotherapy with cathepsin B-specific doxorubicin prodrug nanoparticles in ovarian cancer with peritoneal carcinomatosis
CN105555272A (zh) 用于治疗flt3突变型增殖性疾病的crenolanib
Keller et al. Human malignant melanomas express receptors for luteinizing hormone releasing hormone allowing targeted therapy with cytotoxic luteinizing hormone releasing hormone analogue
Zhao et al. A new tandem peptide modified liposomal doxorubicin for tumor “ecological therapy”
KR102324242B1 (ko) 신규한 앱타머 및 이의 용도
JP2022505329A (ja) 治療効能を改善した核酸変形体及びそれを含む抗癌用薬学組成物
KR102280330B1 (ko) 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물
CN108178783B (zh) 肿瘤血管及m1型巨噬细胞靶向肽及其用途
Nagpal et al. Targeted therapies against breast cancer: Clinical perspectives, obstacles and new opportunities
Dodd et al. Tumor Subtype Determines Therapeutic Response to Chimeric Polypeptide Nanoparticle–based Chemotherapy in Pten-deleted Mouse Models of Sarcoma
Jo et al. Complete regression of metastatic de-differentiated liposarcoma with engineered mesenchymal stromal cells with dTRAIL and HSV-TK
TWI630910B (zh) 供靶向、造影及治療前列腺癌之胜肽共軛奈米粒子
US20150110877A1 (en) Cancer therapeutics
WO2020151727A1 (zh) 药物复合物及其制备方法和用途
Wang et al. Preparation and In Vitro Evaluation of Thermosensitive Liposomes Targeting Ovarian Cancer
CN112999211A (zh) 神经酰胺分子在制备用于抑制食管鳞状细胞癌转移的药物中的应用
JPH10101574A (ja) 増殖性臓器疾患治療・改善剤
CN114617969B (zh) 乐伐替尼和Aurora-A激酶抑制剂在制备抑制癌症的药物中的应用

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20211222

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20220909

A977 Report on retrieval

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007

Effective date: 20230803

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20230814

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20231114

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20240115

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20240131

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Ref document number: 7433662

Country of ref document: JP

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150