WO2023113243A1 - 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도 - Google Patents

변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
WO2023113243A1
WO2023113243A1 PCT/KR2022/017440 KR2022017440W WO2023113243A1 WO 2023113243 A1 WO2023113243 A1 WO 2023113243A1 KR 2022017440 W KR2022017440 W KR 2022017440W WO 2023113243 A1 WO2023113243 A1 WO 2023113243A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
Prior art keywords
formula
modified oligonucleotide
seq
group
drug
Prior art date
Application number
PCT/KR2022/017440
Other languages
English (en)
French (fr)
Inventor
이중환
이종욱
Original Assignee
인터올리고 주식회사
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 인터올리고 주식회사 filed Critical 인터올리고 주식회사
Priority claimed from KR1020220147564A external-priority patent/KR20230092732A/ko
Publication of WO2023113243A1 publication Critical patent/WO2023113243A1/ko

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/54—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic compound
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Definitions

  • the present invention relates to modified oligonucleotide-drug conjugates and uses thereof.
  • anticancer drugs have been developed and developed into drugs through clinical trials, but continuous research is needed to more selectively and effectively deliver substances with therapeutic effects, such as targeted anticancer drugs, to the desired site of onset.
  • anticancer drugs have a low therapeutic index and therapeutic window due to non-tumor specific systemic toxicity and cytotoxicity, and resistance to anticancer drugs may develop during long-term treatment.
  • an oligonucleotide rich in guanosine may have a special structure through an intramolecular bond or an intermolecular bond in addition to the triple hydrogen bond between guanine and cytosine.
  • guanine and cytosine instead of forming a double helix structure through the hydrogen bonding of adenine and thymine, guanine and cytosine, four guanines are located on one plane to form a Hoogsteen hydrogen bond, resulting in a quadrangular planar guanine tetrad (G-tetrad). and two or more guanine tetrads are stacked to form a quadruple helix G-quadruplex. Oligonucleotides constituting such a G-quadroplex are known to have excellent cell permeability because they form a stable structure due to their structural characteristics.
  • oligonucleotides forming G-quadroplex must induce apoptosis mainly due to cell growth inhibitory effect, so continuous treatment is required for a certain period of time or more through intravenous fluid injection for 4 to 7 days. . Therefore, there is a problem in that more than necessary drugs must be administered for a long time. Accordingly, a number of studies are being conducted to develop materials containing new modified nucleic acids that are stable in the body, exhibit high cell permeability, and exhibit excellent drug efficacy.
  • the present invention aims to provide modified oligonucleotide-drug conjugates.
  • An object of the present invention is to provide a pharmaceutical composition for treating or preventing cancer comprising a modified oligonucleotide-drug conjugate.
  • X 1 to X 3 and X 7 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • Y 1 is deoxyguanosine (dG) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • X 4 to X 6 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below, wherein at least one of X 4 to X 6 is deoxy uridine (dU);
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T) and Y 1 is deoxyguanosine (dG), a and d are not 0 at the same time ;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, Except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • the modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 is 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorouridine, 5-fluorodeoxycytidine, 5-fluorocytidine , 5-iododeoxyuridine, 5-iodouridine, 5-iododeoxycytidine, 5-iodocytidine, cytosine arabinoside, 2',2'-difluoro-2'- A modified oligonucleotide-drug conjugate selected from the group consisting of oxycytidine and bromovinyldeoxyuridine.
  • L 1 is 5'-thiol-modifier C6 , thiol-modifier C6 SS, dithiol serinol, PC amino-modifier, 5'-amino-modifier C3, 5'-amino-modifier C6, 5'-amino-modifier It is selected from the group consisting of C12, 5'-amino-modifier TEG, amino-modifier C2 dT, amino-modifier C6 dT, S-Bz-thiol-modifier C6-dT, phosphodiester bond, and nucleotide to undergo deprotection.
  • L 2 is maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl (MC-Val-Cit-PAB), succinimidyl 4-( N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate SMCC, succinic acid, hydrazone, peptide, disulfide, thioether, valine-citrulline, N -maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate (MCC), maleimidocaproyl, mercaptoa Cetamidocaproyl, N -succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate (SPP), N -succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate (SPDB), phosphide A modified oligonucleotide-drug conjugate selected from the group consisting of a phodiester bond and a nucle
  • modified oligonucleotide-drug conjugate according to 1 above wherein the modified oligonucleotide consists of a sequence selected from SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10.
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the modified oligonucleotide-drug conjugate of any one of claims 1 to 5.
  • cancer is leukemia, lymphoma, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, ovarian cancer, cervical carcinoma, glioma cancer, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, gastric adenocarcinoma, uterine cancer, bladder cancer, thyroid cancer,
  • a pharmaceutical composition for the prevention or treatment of cancer selected from the group consisting of ovarian cancer, melanoma and cervical cancer.
  • X 1 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T), a and d are not 0 at the same time;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, the above except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl).
  • the modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 is 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorouridine, 5-fluorodeoxycytidine, 5-fluorocytidine , 5-iododeoxyuridine, 5-iodouridine, 5-iododeoxycytidine, 5-iodocytidine, cytosine arabinoside, 2',2'-difluoro-2'- A modified oligonucleotide-drug conjugate selected from the group consisting of oxycytidine and bromovinyldeoxyuridine.
  • paclitaxel monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, monomethyl auristatin D (MMAD), cytarabine, gemsy Tabine
  • maytansine DM1 (mertansine), DM4, calicheamicin and its derivatives, doxorubicin, duocarmycin and its derivatives, pyrrolobenzodiazepine (PBD), SN-38, ⁇ -amantine, tubulus Tubulysin analog, cyclophosphamide, mecholrethamine, uramustine, melphalan, chlorambucil, ifosfamide, bendamustine, carmustine, lomustine, streptozocin, busulfan, dacarbazine, temozolomide, thiotepa , altretamine, duocarmycin, cisplatin, carboplatin, nedaplatin, oxaliplatin, gemsy Tabine, maytans
  • L 1 is 5'-thiol-modifier C6 , thiol-modifier C6 SS, dithiol serinol, PC amino-modifier, 5'-amino-modifier C3, 5'-amino-modifier C6, 5'-amino-modifier It is selected from the group consisting of C12, 5'-amino-modifier TEG, amino-modifier C2 dT, amino-modifier C6 dT, S-Bz-thiol-modifier C6-dT, phosphodiester bond, and nucleotide to undergo deprotection.
  • L 2 is maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl (MC-Val-Cit-PAB), succinimidyl 4-( N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate SMCC, succinic acid, hydrazone, peptide, disulfide, thioether, valine-citrulline, N -maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate (MCC), maleimidocaproyl, mercaptoa Cetamidocaproyl, N -succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate (SPP), N -succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate (SPDB), phosphide A modified oligonucleotide-drug conjugate selected from the group consisting of a phodiester bond and a nucle
  • a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the modified oligonucleotide-drug conjugate of any one of 8 to 12 above.
  • the 'modified oligonucleotide-drug conjugate' of the present invention includes an oligonucleotide containing a modified nucleic acid (hereinafter referred to as 'modified oligonucleotide') and a drug conjugated thereto, thereby exhibiting high stability in the body and excellent anticancer effects. .
  • the 'modified oligonucleotide-drug conjugate' of the present invention may exhibit superior anticancer effects than when the 'modified oligonucleotide' is used alone or the 'drug' is administered alone.
  • the 'modified oligonucleotide-drug conjugate' of the present invention has a higher half-life in the body than the 'modified oligonucleotide' in the same amount as the modified oligonucleotide contained in the conjugate.
  • the 'modified oligonucleotide-drug conjugate' of the present invention has lower toxicity than the 'drug' of the same amount as the drug contained in the conjugate.
  • the 'oligonucleotide variant-drug conjugate' of the present invention can exhibit superior anticancer effects compared to the 'oligonucleotide-drug conjugate' in which only a drug is conjugated to an oligonucleotide that does not contain a modified nucleic acid.
  • FIG. 1 to 5 show the results of evaluating the effectiveness of the modified oligonucleotide-drug conjugate in a pancreatic cancer orthotopic animal model through IVIS imaging (FIG. 1: untreated, FIG. 2: gemcitabine-loaded collagen patch-treated group, FIG. 3 : IO101L loading collagen patch treatment group, Figure 4: IO176 loading collagen patch treatment group, Figure 5: IO142 loading collagen patch treatment group)
  • FIG. 6 shows the result of confirming the change in body weight of an orthotopic pancreatic cancer animal model treated with a modified oligonucleotide-drug conjugate loaded collagen patch.
  • FIG. 7a to 7e show the results of confirming the size of organs and tumors in an orthotopic pancreatic cancer animal model treated with a modified oligonucleotide-drug conjugate loaded collagen patch (FIG. 7a: untreated, FIG. 7b: gemcitabine-loaded collagen patch treatment) Group, FIG. 7c: IO101L-loaded collagen patch treatment group, FIG. 7d: IO176-loaded collagen patch treatment group, FIG. 7e: IO142-loaded collagen patch treatment group)
  • 8a and 8b show the results of confirming the weights of organs and tumors in an orthotopic pancreatic cancer animal model treated with a modified oligonucleotide-drug conjugate loaded collagen patch.
  • FIG. 9 is a graph showing the concentration of MMAE in plasma after administration of a modified oligonucleotide-drug conjugate (IO176) and MMAE according to an embodiment.
  • a small graph included in the graph in FIG. 9 shows the concentration of MMAE in plasma from just before drug administration (0 min) to 120 min.
  • FIG. 10 is a graph showing plasma concentrations of a modified oligonucleotide-drug conjugate (IO176) and gemcitabine and its metabolite (dFdU) according to an embodiment.
  • IO176 modified oligonucleotide-drug conjugate
  • dFdU gemcitabine and its metabolite
  • 11 is a reaction scheme showing a process of conjugating a modified oligonucleotide in which an internal nucleotide, not a terminal, with a modified nucleic acid is substituted with MMAE.
  • 12 is a reaction scheme showing the process of conjugating a modified oligonucleotide in which an internal nucleotide, not a terminal, is substituted with a modified nucleic acid and paclitaxel.
  • 13 is a reaction scheme showing the process of conjugating DM1 with a modified oligonucleotide in which an internal nucleotide, not a terminal, is substituted with a modified nucleic acid.
  • FIG. 14 is a reaction scheme showing a process of conjugating a modified oligonucleotide to which a modified nucleic acid is added to either the 5' end or the 3' end and MMAE.
  • 15 is a reaction scheme showing a process of conjugating a modified oligonucleotide to which a modified nucleic acid is added to either the 5' end or the 3' end and paclitaxel.
  • 16 is a reaction scheme showing a process of conjugating a modified oligonucleotide to which a modified nucleic acid is added to either the 5' end or the 3' end and DM1.
  • Example 18 shows a reaction scheme for preparing Example 8.
  • the present invention is a modified oligonucleotide comprising at least one modified nucleic acid; And it provides a modified oligonucleotide-drug conjugate comprising a drug conjugated to the modified oligonucleotide.
  • a modified oligonucleotide may include at least one modified nucleic acid.
  • the modified oligonucleotide may include a modified nucleic acid and form a G-quadruplex structure.
  • Guanosine (G) which contributes to the G-quadroplex structure of oligonucleotides, is composed of 2'-deoxy-guanosine, guanosine, and 2'-O-methyl-guanosine (2-deoxy-guanosine).
  • One of '-O-methyl-guanosine), 2'-fluoro-guanosine (2'-F-guanosine), LNA (Locked Nucleic Acid)-guanosine, D-deoxyguanosine and D-guanosine may be selected from two or more kinds, and it may be synthesized so that a modified nucleic acid having a therapeutic effect may be included therein.
  • Modified oligonucleotides can be prepared so that the above-described modified nucleic acids can be included in guanosine-rich oligonucleotides through stationary phase synthesis using a DNA synthesizer.
  • Modified oligonucleotides can be prepared by introducing a modified nucleic acid by substituting a predetermined nucleotide in a known oligonucleotide sequence with a modified nucleic acid or by adding a modified nucleic acid to at least one of the 3' or 5' ends of a known oligonucleotide sequence.
  • the modified oligonucleotide may be an aptamer having binding force or specificity to a target protein.
  • sequence of the modified oligonucleotide and the position of the modified nucleic acid may affect the binding ability or specificity to the target protein, and therefore, the sequence and position of the modified nucleic acid should be appropriately selected in consideration of the binding force or specificity to the target protein.
  • the usefulness of the modified oligonucleotide-drug conjugate of the present invention may be determined according to the physiological activity displayed according to factors such as binding ability or specificity to a target protein.
  • the modified nucleic acid may have a therapeutic effect, and may be, for example, sugar or base-modified guanosine, thymidine, cytidine, or uridine, but is not limited thereto.
  • the modified nucleic acid may be a pyrimidine series. Specifically, the modified nucleic acid may be derived from uridine or cytidine.
  • the modified nucleic acid may be selected from compounds represented by Formula 3 or Formula 4 below:
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, the above except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • R 1 may be hydrogen, a halogen or a hydroxyl group, and may specifically be hydrogen.
  • R 2 may be hydrogen, a halogen or a hydroxyl group, and may specifically be hydrogen.
  • R 3 may be hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group, specifically, a halogen, a C1-C6 It may be a haloalkyl group or a C2-C6 haloalkenyl group.
  • Chemical Formula 3 may be 5-fluorodeoxyuridine.
  • R 1 may be hydrogen, a halogen or a hydroxy group, specifically hydrogen or a halogen (eg, fluoro, chloro, bromo, or iodo).
  • R 2 may be hydrogen, a halogen or a hydroxy group, specifically hydrogen or a halogen (eg, fluoro, chloro, bromo, or iodo).
  • a halogen eg, fluoro, chloro, bromo, or iodo
  • R 3 may be hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group, specifically hydrogen or a C1-C6 alkyl group.
  • R 1 and R 2 are halogen, and R 3 may be hydrogen or a C1 to C3 alkyl group. According to one embodiment, Formula 4 may be gemcitabine.
  • the modified nucleic acid may be included in the modified oligonucleotide in a form in which a phosphate group is bound to the compound represented by Formula 3 or Formula 4 above. Specifically, it may be incorporated into modified oligonucleotides in the form of phosphoramidites. Nucleotide phosphoramidites are purchased from Glen Research, Berry and Associates, Okeanos Tech, Chemgene, Proligo, etc., or by known methods ( Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Fritz Eckstein et al. 1991, IRL Press: Oxford).
  • Modified nucleic acids include 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorouridine, 5-fluorodeoxycytidine, 5-fluorocytidine, 5-iododeoxyuridine, 5-iodouridine, Selected from the group consisting of 5-iododeoxycytidine, 5-iodocytidine, cytosine arabinoside, 2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine and bromovinyldeoxyuridine It can be.
  • the modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 is 5-fluorodeoxyuridine, 5-fluorouridine, 5-fluorodeoxycytidine, 5-fluorocytidine, or 5-iododeoxyuridine.
  • 5-iodouridine 5-iododeoxycytidine, 5-iodocytidine, cytosine arabinoside, 2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine and bromovinylde It may be selected from the group consisting of oxyuridines.
  • the 2',2'-difluoro-2'-deoxycytidine may be gemcitabine.
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence represented by Formula 1 below:
  • Formula 1 is shown in the 5' to 3' direction from the left.
  • G represented in Formula 1 may be deoxyguanosine (dG).
  • X 1 to X 3 and X 7 to X 9 may each independently be thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 above.
  • Y 1 may be deoxyguanosine (dG) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 described above.
  • X 4 to X 6 may each independently be thymidine (T), deoxyuridine (dU), or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 above.
  • At least one of X 4 to X 6 may be deoxyuridine (dU).
  • M 1 and M 2 may each independently be a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4.
  • N 1 and N 2 may each independently be thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG).
  • a and d may each independently be an integer of 0 to 10.
  • the modified oligonucleotide represented by Chemical Formula 1 includes at least one modified nucleic acid represented by Chemical Formula 3 or Chemical Formula 4 described above.
  • b and c may each independently be an integer of 0 to 10.
  • a drug may be conjugated to deoxyuridine (dU) of the modified oligonucleotide represented by Formula 1.
  • modified oligonucleotide of the present invention may be represented by Formula 1 below:
  • X 1 to X 3 and X 7 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • Y 1 is deoxyguanosine (dG) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • X 4 to X 6 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below, wherein at least one of X 4 to X 6 is deoxy uridine (dU);
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T) and Y 1 is deoxyguanosine (dG), a and d are not 0 at the same time ;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, Except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence selected from SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10.
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence represented by Formula 2 below:
  • Formula 2 is shown in the 5' to 3' direction from the left.
  • G shown in Formula 2 may be deoxyguanosine (dG).
  • X 1 to X 9 may each independently be thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4.
  • M 1 and M 2 may each independently be a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below.
  • N 1 and N 2 may each independently be thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG).
  • a and d may each independently be an integer of 0 to 10.
  • b and c may each independently be an integer of 0 to 10.
  • a drug may be conjugated to at least one of the 5' end or the 3' end of the modified oligonucleotide represented by Formula 1.
  • modified oligonucleotide of the present invention may be represented by Formula 2 below:
  • X 1 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T), a and d are not 0 at the same time;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence selected from SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12.
  • Any drug having a structure capable of being conjugated to a modified oligonucleotide is sufficient, and the specific type is not limited.
  • the drug may have a functional group that can be directly conjugated to the modified oligonucleotide or a functional group that can be conjugated to a linker (eg, hydroxy group, carboxy group, or amino group), but is not limited thereto.
  • a linker eg, hydroxy group, carboxy group, or amino group
  • the drugs are paclitaxel, monomethyl auristatin E, monomethyl auristatin F, monomethyl auristatin D (MMAD), cytarabine, gemcitabine, maytan Cine, DM1 (mertansine), DM4, calicheamicin and its derivatives, doxorubicin, duocarmycin and its derivatives, pyrrolobenzodiazepine (PBD), SN-38, ⁇ -amantine, tubulysin analogues analog), cyclophosphamide, mecholrethamine, uramustine, melphalan, chlorambucil, ifosfamide, bendamustine ( bendamustine, carmustine, lomustine, streptozocin, busulfan, dacarbazine, temozolomide, thiotepa, altretamine (altretamine), duocarmycin, cisplatin, carboplatin, nedaplatin, o
  • a drug may be conjugated directly or indirectly to the modified oligonucleotide.
  • the drug may be conjugated directly to the modified oligonucleotide or via a linker.
  • the drug may be conjugated to at least one base contained within the modified oligonucleotide.
  • the drug may be conjugated to uridine or deoxyuridine (dU) contained inside the modified oligonucleotide, but is not limited thereto.
  • the drug may be conjugated to a base located at the end of the modified oligonucleotide. Specifically, the drug may be conjugated to at least one of the 5' or 3' ends of the modified oligonucleotide.
  • modified oligonucleotide Since the modified oligonucleotide has been described above, a detailed description thereof will be omitted.
  • the modified oligonucleotide and drug may be linked by a linker (L).
  • the linker (L) is sufficient as long as it can link the modified oligonucleotide and the drug, and the specific type is not limited.
  • the linker (L) may be a combination of L 1 and L 2 .
  • L 1 and L 2 may each independently be conjugated to a modified oligonucleotide and a drug.
  • L 1 and L 2 may each independently be conjugated to a modified oligonucleotide and a drug, and a modified oligonucleotide and a drug may be conjugated through a reaction between L 1 and L 2 .
  • L 1 may be linked to a modified oligonucleotide, and L 2 may be linked to a drug.
  • L 1 may be linked to a nucleotide (eg, dU) included inside the modified oligonucleotide, and L 2 may be linked to a drug.
  • L 1 may be linked to at least one of the 5' or 3' end of the modified oligonucleotide, and L 2 may be linked to a drug.
  • L 1 includes a functional group capable of bonding with L 2 through a chemical reaction, and the type is not limited. It is sufficient that L 2 includes a functional group capable of bonding with L 1 through a chemical reaction, and the type is not limited.
  • L 1 may include a -SH functional group and L 2 may include a maleimide functional group.
  • L 1 may include a -NH 2 functional group, and L 2 may include a -COOH functional group.
  • L 1 is 5'-thiol-modifier C6 , thiol-modifier C6 SS, dithiol serinol, PC amino-modifier, 5'-amino-modifier C3, 5'-amino-modifier C6, 5'-amino-modifier C12, 5'-amino-modifier TEG, amino-modifier C2 dT, amino-modifier C6 dT, S-Bz-thiol-modifier C6-dT, phosphodiester linkages, and nucleotides; Not limited.
  • L 1 is the aforementioned Examples may be deprotected forms, such as acrylamide-C2-NH 2 , C12-NH 2 , C3-NH 2 , acrylamide-C6-propanamide- It may be SH, acrylamide-C6-NH 2 , C6-NH 2 , or C6-SH, but is not limited thereto.
  • L 2 is maleimidocaproyl-valine-citrulline-p-aminobenzoyloxycarbonyl (MC-Val-Cit-PAB), succinimidyl 4-( N -maleimidomethyl) cyclohexane-1-carboxylate (SMCC), succinic acid, hydrazone, peptide, disulfide, thioether, valine-citrulline, N -maleimidomethylcyclohexane-1-carboxylate (MCC), maleimidocaproyl, mercaptoacet Amidocaproyl, N -succinimidyl 4-(2-pyridyldithio) pentanoate (SPP), N -succinimidyl 4-(2-pyridylthio) pentanoate (SPDB), phosphodi It may be selected from the group consisting of ester bonds and nucleotides, but is not limited thereto.
  • SMCC N -
  • Some examples of methods for conjugating a modified oligonucleotide and a drug using a linker (L) are as follows.
  • preparing a modified oligonucleotide in which a predetermined nucleotide is substituted with a modified nucleic acid based on a known oligonucleotide eg, an aptamer having the sequence of Comparative Example 1
  • binding L 1 to one end of the modified oligonucleotide eg, an aptamer having the sequence of Comparative Example 1
  • a modified oligonucleotide-drug complex may be prepared by a method comprising reacting a modified oligonucleotide to which L 1 is linked and a drug to which L 2 is linked (see FIGS. 11 to 13 ).
  • a modified oligonucleotide by adding at least one modified nucleic acid to at least one end of both ends (5' end or 3' end) of a known oligonucleotide (eg, an aptamer having the sequence of Comparative Example 1). Preparing; binding L 1 to one end of the modified oligonucleotide;
  • a modified oligonucleotide-drug complex can be prepared by a method comprising reacting a modified oligonucleotide to which L 1 is linked and a drug to which L 2 is linked (see FIGS. 14 to 16 ).
  • the linker (L) is -[acrylamide-C6-NH-(CO)-(CH 2 ) 2 -(CO)O]-, -[C6-NH-(CO)-(CH 2 ) 2- (CO)O]-, -[C6-S-MC-Val-Cit-PAB]-,
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of the present invention comprises a modified oligonucleotide represented by Formula 1 below; And a drug conjugated to deoxyuridine (dU) included in the modified oligonucleotide; may include:
  • X 1 to X 3 and X 7 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • Y 1 is deoxyguanosine (dG) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • X 4 to X 6 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below, wherein at least one of X 4 to X 6 is deoxyuridine.
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T) and Y 1 is deoxyguanosine (dG), a and d are not 0 at the same time ;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, Except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • the drug and the deoxyuridine (dU) may be linked by a linker (L).
  • the linker may be a combination of the aforementioned L 1 and L 2 .
  • the L 1 and L 2 may each independently bind to deoxyuridine (dU) and the drug in the modified oligonucleotide.
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence selected from SEQ ID NO: 4 to SEQ ID NO: 10.
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of the present invention comprises a modified oligonucleotide represented by Formula 2; And a drug conjugated to at least one of the 5' end or the 3' end of the modified oligonucleotide;
  • X 1 to X 9 are each independently thymidine (T) or a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • M 1 and M 2 are each independently a modified nucleic acid represented by Formula 3 or Formula 4 below;
  • N 1 and N 2 are each independently thymidine (T), deoxyuridine (dU), deoxycytidine (dC), or deoxyguanosine (dG);
  • a and d are each independently an integer of 0 to 10, and when X 1 to X 9 are both thymidine (T), a and d are not 0 at the same time;
  • b and c are each independently an integer from 0 to 10
  • R 1 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 2 is hydrogen, halogen or a hydroxy group
  • R 3 is hydrogen, halogen, a C1-C6 alkyl group, a C1-C6 haloalkyl group, a C2-C6 alkenyl group, or a C2-C6 haloalkenyl group (wherein R 1 is hydrogen or a hydroxy group, except when R 2 is hydrogen and R 3 is hydrogen or methyl)).
  • At least one of the 5' end or the 3' end of the drug and the modified oligonucleotide may be connected by a linker (L).
  • the linker may be a combination of the aforementioned L 1 and L 2 .
  • L 1 and L 2 are each independently at least one of the 5' end or the 3' end of the modified oligonucleotide; and to the drug.
  • the modified oligonucleotide may consist of a sequence selected from SEQ ID NO: 11 or SEQ ID NO: 12.
  • the present invention provides a pharmaceutical composition for preventing or treating cancer comprising the modified oligonucleotide-drug conjugate described above.
  • Cancers include leukemia, lymphoma, breast cancer, liver cancer, stomach cancer, ovarian cancer, cervical carcinoma, glioma cancer, colorectal cancer, lung cancer, pancreatic cancer, prostate cancer, liver cancer, gastric adenocarcinoma, uterine cancer, bladder cancer, thyroid cancer, ovarian cancer, melanoma, and cervical cancer. It may be selected from the group consisting of, but is not limited thereto.
  • the present invention may provide a method for preventing or treating cancer comprising administering the above-described modified oligonucleotide-drug conjugate to a subject.
  • the subject may be a mammal, including humans, such as humans, cows, horses, dogs, rabbits, cats, goats, and mice, but is not limited thereto.
  • the present inventors synthesized a modified oligonucleotide-drug conjugate by successfully conjugating a drug to a guanosine-rich oligonucleotide variant containing a modified nucleic acid, and the synthesized modified oligonucleotide-drug conjugate is non-toxic, stable, and has excellent cancer treatment effects It was confirmed that
  • Example 2 GGTGGTGGTGG U T M TGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 5) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 5 (12th nucleotide of SEQ ID NO: 5) 9358. 4082 9353. 7969 Example 3 GGTGGTGGTGGT UM TGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 6) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 6 (13th nucleotide of SEQ ID NO: 6) 9358. 4082 9353.
  • Example 4 GGTGGTGGTGGT U G M GGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 7) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 7 (13th nucleotide of SEQ ID NO: 7) 9383. 4209 9377. 8047
  • Example 5 GGTGGTGGTGG MU G M GGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 8) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 8 (13th nucleotide of SEQ ID NO: 8) 9404. 3937 9398.
  • Example 6 GGTGGTGGTGGT U GTGGTGGTGG M GG (SEQ ID NO: 9) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 9 (13th nucleotide of SEQ ID NO: 9) 9383. 4209 9379. 8047
  • Example 7 GGTGGTGGTGGTTG U GGTGGTGG M GG (SEQ ID NO: 10) Paclitaxel/conjugated to U of SEQ ID NO: 10 (15th nucleotide of SEQ ID NO: 10) 9383. 4209 9377.
  • Example 8 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG MM (SEQ ID NO: 11) Conjugation to the 5'-end (i.e., nucleotide 1) of paclitaxel/SEQ ID NO: 11 10341. 9177 10336. 2988 Comparative Example 4 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 1) Conjugation to the 5'-end of MMAE/SEQ ID NO: 1 (i.e., nucleotide 1) 9788. 1292 9782.
  • Example 10 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG MM (SEQ ID NO: 11) conjugated to the 5'-end (i.e., nucleotide 1) of DM1/SEQ ID NO: 11 10059. 2852 10053. 0713 Comparative Example 6 GGTGGTGGTGGT U GTGGTGGTTGGTGG (SEQ ID NO: 3) DM1/ conjugated to U of SEQ ID NO: 3 (13th nucleotide of SEQ ID NO: 3) 9384. 0088 9378.
  • Comparative Example 1 [: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 1)] was prepared by a general DNA synthesis method.
  • oligonucleotides were synthesized using Mermade 12 or Mermade 48 (Bio Automation, USA).
  • the 4-step process of [Deblocking -> Coupling -> Capping -> Oxidation] is sequentially performed from the 3' end to the 5' end by one nucleotide (1 mer) in one cycle was synthesized with Specifically, the four-step process of [Deblocking -> Coupling -> Capping -> Oxidation] is as follows.
  • TCA Deblock is added to remove the 4,4-dimethoxytriyl (DMT) of the nucleotide supported on the Controlled Pore Glass (CPG) to create a 5'-hydroxyl group so that the next nucleotide can be bound did
  • Cap A and Cap B were added to inactivate the 5'-hydroxyl group of the (n-1) nucleotide that did not participate in the reaction.
  • Oxidation An oxidizer was added to oxidize the phosphate bond between nucleotides.
  • the synthesized oligonucleotide was transferred to a solution (ammonia water, 55 °C) to separate the CPG support and the protecting group.
  • Comparative Example 2 oligonucleotide-drug conjugate in which paclitaxel was conjugated to U of GGTGGTGGTGGTTG U GGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 2)] was prepared in two steps: a general DNA synthesis method and drug conjugation (see FIG. 17).
  • a nucleotide-drug conjugate was synthesized.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 2 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is linked to U of SEQ ID NO: 2). part, and succinic acid is the part connected to paclitaxel).
  • paclitaxel-succinic acid was dissolved in DMSO and EDC (-(3-Dimethylaminopropyl) -N′- ethylcarbodiimide hydrochloride) and Sulfo-NHS ( N -hydroxysulfosuccinimide) dissolved in ultra-pure water were added to room temperature (RT; Room temperature). Reacted for 1 hour.
  • EDC -(3-Dimethylaminopropyl) -N′- ethylcarbodiimide hydrochloride
  • Sulfo-NHS N -hydroxysulfosuccinimide
  • Comparative Example 2 oligonucleotide-drug conjugate
  • a Waters Prep150 Waters, USA
  • a Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System Waters, USA
  • mass spectrometry of the purified nucleic acid ligands was performed with a Waters Xevo G2-XS Q-TOF System (Waters, USA).
  • Comparative Example 3 oligonucleotide-drug conjugate in which paclitaxel was conjugated to U of GGTGGTGGTGGT U GTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 3)] was prepared.
  • the oligonucleotide-drug conjugate of Comparative Example 3 was synthesized using the same method as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 14 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 3 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is linked to U of SEQ ID NO: 3). part, and succinic acid is the part connected to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 1 was prepared using the same method as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 15 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 4 and paclitaxel is “-acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is connected to U of SEQ ID NO: 4). part, and succinic acid is the part connected to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 2 was prepared using the same sequence as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 17 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 5 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is connected to U of SEQ ID NO: 5). part, and succinic acid is the part connected to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 3] was prepared using the same method as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 18 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 6 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid-” (acrylamide is connected to U of SEQ ID NO: 6). part, and succinic acid is the part connected to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 4 was prepared using the same sequence as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 19 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 7 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is It is the part that connects, and succinic acid is the part that connects with paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 5 was prepared using the same method as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 20 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of the sequence of SEQ ID NO: 8 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid-” (Acrylicamide is the part linked to U of SEQ ID NO: 8, and succinic acid is the part linked to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 6 was prepared using the same method as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 21 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 9 and paclitaxel is “ -acrylamide-C6-NH-succinic acid- ” (acrylamide is part that connects, succinic acid is the part that connects to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 7 was prepared in the same manner as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 22 instead of the sequence of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting U and paclitaxel in the sequence of SEQ ID NO: 10 is “ -acrylamide-C6-NH- succinic acid- ” ( Acrylicamide is It is a part connected to U of SEQ ID NO: 10, and succinic acid is a part connected to paclitaxel).
  • the modified oligonucleotide-drug conjugate of Example 8 was prepared using the same sequence as the drug conjugation method of Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 23 instead of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) of the 5' end of the sequence of SEQ ID NO: 11 and paclitaxel is " -C6-NH-succinic acid- " (C6 is a part connected to the 5' end of SEQ ID NO: 11, and succinic acid is a part connected to paclitaxel).
  • Comparative Example 4 oligonucleotide-drug conjugate in which MMAE was conjugated to the 5' end (i.e., nucleotide 1) of GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 1)] was prepared in two steps: a general DNA synthesis method and drug conjugation.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) of the 5' end of SEQ ID NO: 1 and MMAE is “ -C6-S-MC-Val-Cit-PAB- ” ( C6 is a part linked to the 5' end of SEQ ID NO: 1, and PAB is a part linked to MMAE).
  • Comparative Example 4 Purification and analysis of Comparative Example 4 were performed using a reverse phase C18 column on a Waters Prep150 (Waters, USA) and a Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System (Waters, USA). In addition, mass spectrometry of the purified nucleic acid ligands was performed with a Waters Xevo G2-XS Q-TOF System (Waters, USA).
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) of the 5' end of SEQ ID NO: 11 and MMAE is “ -C6-S-MC-Val-Cit-PAB- ” (C6 is a part connected to the 5' end of SEQ ID NO: 11, PAB is the part that connects with MMAE).
  • Comparative Example 5 oligonucleotide-drug conjugate in which DM1 was conjugated to the 5' end (i.e., nucleotide 1) of GGTGGTGGTGGTTGGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 1)] was prepared in two steps: a general DNA synthesis method and drug conjugation.
  • Comparative Example by conjugating the sequence of SEQ ID NO: 28 with Mertansin (DM1)-succinimidyl-4-( N -maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate (SMCC) (: DM1-SMCC 99%, MedKoo Biosciences, Cat# 407202) 5 was prepared.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) at the 5' end of SEQ ID NO: 1 and DM1 is “ -C6-NH-SMCC- ” (C6 is It is a part connected to the 5' end, and SMCC is a part connected to MMAE).
  • Example 10 was prepared by conjugating DM1-SMCC with the sequence of SEQ ID NO: 29 instead of the sequence of SEQ ID NO: 28 in the same manner as the drug conjugation method of Comparative Example 5.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) of the 5' end of SEQ ID NO: 11 and DM1 is “ -C6-NH-SMCC- ” (C6 is SEQ ID NO: 11 is a part connected to the 5' end of and SMCC is a part connected to DM1).
  • Comparative Example 6 oligonucleotide-drug conjugate in which DM1 was conjugated to U of GGTGGTGGTGGT U GTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 3)] was prepared.
  • Comparative Example 6 was prepared by conjugating DM1-SMCC with the sequence of SEQ ID NO: 30 instead of the sequence of SEQ ID NO: 28 in the same manner as the drug conjugation method of Comparative Example 5.
  • the linker (L) connecting U of SEQ ID NO: 3 and DM1 is “ -acrylamide-C6-NH-SMCC- ” (acrylamide is the part connected to U of SEQ ID NO: 3, , SMCC is the part connected to DM1).
  • Example 11 was prepared by conjugating DM1-SMCC with the sequence of SEQ ID NO: 31 instead of the sequence of SEQ ID NO: 28 in the same manner as the drug conjugation method of Comparative Example 5.
  • the linker (L) connecting U of 9 and DM1 is “ -acrylamide-C6-NH-SMCC -” (acrylamide is the part connected to U of SEQ ID NO: 8, SMCC is the part connected to DM1).
  • Comparative Example 7 an oligonucleotide-drug conjugate in which paclitaxel was conjugated to the 5' end of GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (SEQ ID NO: 1)] was prepared.
  • Comparative Example 7 was prepared using the same drug conjugation method as in Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 32 instead of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) of the 5' end of the sequence of SEQ ID NO: 1 and paclitaxel is “ -C6-NH-succinic acid- ” (C6 is the sequence It is a part connected to the 5' end of number 1, and succinic acid is a part connected to paclitaxel).
  • Example 12 was prepared using the same drug conjugation method as in Comparative Example 2, but using the sequence of SEQ ID NO: 33 instead of SEQ ID NO: 13.
  • the linker (L) connecting the first nucleotide (G) at the 5' end of the sequence of SEQ ID NO: 12 and paclitaxel is “ -C6-NH-succinic acid- ” (C6 is It is a part connected to the 5' end of SEQ ID NO: 12, and succinic acid is a part connected to paclitaxel).
  • pancreatic cancer cell line (BxPC-3) was treated with the above-described Examples and Comparative Examples at concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500, and 1000 uM, and the specific IC50 measurement method and measurement results are as follows.
  • All cell lines were cultured in a 37°C, 5% CO 2 incubator.
  • the BxPC-3 pancreatic cancer cell line was cultured in ATCC modified RPMI-1640 (Thermo Scientific, USA) containing 10% FBS and 1% antibiotics. The medium was replaced once every 2-3 days, and the cells were subcultured at the point of filling about 70-90% of the culture dish.
  • 0.05% Trypsin-EDTA was added and cultured at 37° C. for 2 minutes, and then trypsin was inactivated by adding fresh medium. After the cells were separated from trypsin and medium using a centrifuge, fresh medium was added and subcultured at a ratio of 1:4. All cells were periodically checked for mycoplasma contamination using a kit (Intron, Korea), and in vitro efficacy evaluation experiments were conducted using only cells in which contamination was not detected.
  • the cells cultured by the above method were dispensed 2 x 10 4 each in each well of a 96-well culture vessel and cultured for 24 hours.
  • the medium of the cells attached to the culture dish was replaced with ATCC modified RPMI-1640 medium containing 5% FBS, and samples of the above-described modified oligonucleotide-drug conjugates (Examples 1-7 and 9-12 and Comparative Example 1- 7 respectively) at concentrations of 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500, and 1000 uM. After 72 hours, 10ul of WST reagent was added to each well and reacted for 2 hours.
  • the IC 50 of Comparative Example 1, which is a control aptamer is 89.9 ⁇ M.
  • the examples of modified oligonucleotide-drug conjugates showed IC 50 values several to several tens of times lower than those of Comparative Example 1, which is a control aptamer.
  • modified oligonucleotide-drug conjugate of the present invention can exhibit superior anticancer effects compared to the control aptamer.
  • Example 5 (IO142) and Example 9 (IO176) having excellent IC50 measurement results were selected and animal experiments were performed.
  • the sample to be tested (gemcitabine, IO101L (SEQ ID NO: 16), modified oligonucleotide-drug conjugate (Example 5 and Example 9) was added to high-purity collagen, respectively, and then multi-mixer (SLRM-3, MYLAB) The mixture was uniformly mixed for 1 hour at 4° C. After that, a certain amount of the collagen-drug mixture was dispensed into a cylindrical silicone mold having a diameter of 1 cm. The cylindrical silicone mold into which the collagen-drug mixture was dispensed was kept at -20° C. After the primary freezing was completed, the mixture was separated from the cylindrical silicone mold, transferred to a sterilized dish or plate, and then secondary frozen at -80 ° C for more than 2 hours.
  • SLRM-3 multi-mixer
  • the mixture was put in a freeze dryer and freeze-dried for 16 hours or more.
  • the freeze-dried mixture was pressed into a patch shape using an acrylic plate, and then sealed in an aluminum pouch.
  • the packaged patch-type collagen drug delivery system was 4 Stored refrigerated at °C.
  • the patch-type collagen drug delivery system prepared by the above-described method is expressed as a patch or a drug-loaded collagen patch.
  • the frozen cancer cell line (BxPC-3-Luc) (Asan Life Science Research Institute) was thawed, and then 10% fetal bovine serum (Biowest, Cat#. S1480 ) and 1% antibiotics ( gibco, Cat#. 15240062) was cultured in RPMI1640 medium (Biowest, Cat#. L0498-100). The thawed cells were cultured for 1 week, and it was confirmed that there was no problem in morphology, viability, and doubling time.
  • Cancer cells having a survival rate of 95% or more were prepared for transplantation into mice.
  • Cells were harvested using trypsin, and turbid in RPMI 1640 media to prepare for transplantation at 5 X 10 5 cells/25 ⁇ l/mouse.
  • a 1-week-stabilized 6-week-old BALB/c-nude male mouse purchased by Jabaio, Korea was intraperitoneally anesthetized, the abdomen was incised, and the pancreas was taken out and 5 X 10 5 cells/25 ⁇ l of cells were transplanted. After 2 weeks, tumor formation was confirmed by luciferase imaging. Then, as shown in Table 4 below, mice were grouped into groups of 5 each.
  • the patch-type collagen drug delivery system prepared in the stomach (1) was inserted into the tumor site of each group of mice (Intra-Abdominal cavity insertion using surgery). All animal experiments included in this study were conducted in accordance with the animal experimentation protocol [2022-14-058] approved by the Animal Experimentation Ethics Committee (IACUC) of the Asan Institute for Life Sciences.
  • IVIS imaging equipment Xenogen IVIS spectrum system; Caliper Life Science, Inc., Hopkinton, MA
  • Luciferin was intraperitoneally injected at a concentration of 150 mg/kg per mouse, and after reacting for 7 minutes, IVIS (in vivo imaging system) was taken.
  • IVIS imaging was performed on the 28th day after the patch-type collagen drug delivery system was inserted, and after weight measurement was completed, the mouse was sacrificed, and important organs (heart, lung, spleen, kidney, liver), pancreas, and tumor were removed, and organ weights were measured and photographs were taken. was filmed.
  • IVIS (in vivo imaging system) imaging was performed the day after insertion.
  • the weight of the mouse was measured three times a week for 4 weeks, and the change in the ratio of the weight of the mouse compared to the day 0 was observed by dividing the weight on day 0 from the measurement results by day. It was confirmed that all mouse groups (Groups 2 to 5) into which the patch-type collagen drug delivery system was inserted lost weight for 2 to 6 days after the test material was inserted, and then gradually recovered (see FIG. 6).
  • mice On the 28th day after the patch-type collagen drug delivery system was inserted, the mice were sacrificed, and major organs (heart, lung, spleen, kidney, liver), pancreas, and tumor were removed, photographed, and organ weights were measured.
  • mice were not killed and excellent tumor suppression effect was confirmed.
  • the administered drug-loaded collagen patch was not observed, so it is considered that all of them were melted and absorbed.
  • Example 9 40 mg/kg of Example 9 (IO176) in rats, 4 mg of MMAE (MedChemExpress, Cat#. HY-15162) in the same amount as Monomethyl auristatin E (hereinafter referred to as MMAE) contained in Example 9 /kg, and gemcitabine (Gemcitabine) included in Example 9 and the same amount of gemcitabine (BetaPharma (shanghai) Co., Ltd, Cat#. 86-39157) 2 mg / kg, respectively, after jugular vein administration, i) The pharmacokinetic coefficients of MMAE and ii) gemcitabine and dFdU, an inactive metabolite of gemcitabine, were calculated and compared.
  • MMAE Monomethyl auristatin E
  • Rats were acclimatized for 1 week in the Sacred Heart Correction Animal Room at The Democratic University of Korea, and then pharmacokinetic experiments were conducted. Rats were induced anesthesia with isoflurane, an inhalational anesthetic, and PE50 (polyethylene tubing, Clay Adams, Becton Dickinson, NJ, USA) was inserted into the carotid artery (for blood collection) and jugular vein (for drug administration) and sutured. It was sutured and the end was fixed behind the neck.
  • PE50 polyethylene tubing
  • ether was used to maintain anesthesia, and about 0.5 mL of physiological saline containing heparin (20 units/mL) was injected to prevent blood clotting in the cannula.
  • Example 9 MMAE and gemcitabine were all dissolved in physiological saline at 2 mL per kg of body weight and administered to the jugular vein at doses of 40 mg/kg, 4 mg/kg, and 2 mg/kg, respectively.
  • tetrahydrouridine hereinafter referred to as THU
  • a cytidine deaminase inhibitor was added at a concentration of 10 mg/mL.
  • a light-shielded Eppendorf tube was prepared in advance with 2 ⁇ L of the solution dissolved in distilled water.
  • Carotid artery immediately before (0 min), 1, 5, 10, 15, 30 min, 1 hour, 2 hours, 4 hours, 6 hours, 8 hours, 10 hours, 20 hours, 24 hours, and 30 hours after each drug administration in the three groups.
  • 0.2 mL of blood was collected into light-shielded Eppendorf tubes previously stored frozen.
  • plasma stored in an ice-bath was immediately centrifuged at 4°C, and 100 ⁇ L of the plasma was dispensed into a light-shielded Eppendorf tube.
  • the aliquoted plasma was immediately stored in an ice-bath and stored at -80°C until LC-MS/MS analysis.
  • rats were euthanized in a CO 2 gas chamber.
  • LC-MS/MS liquid chromatography-tandem mass spectrometry
  • Tandem mass spectrometer triple quadrouple type
  • Ion source Electrospray ionization (positive ion mode)
  • Nebulizing gas Nitrogen
  • Collision gas Nitrogen
  • the MMME standard was dissolved in acetonitrile to prepare a stock solution of 1 mg/mL and stored frozen, and the stock solution was diluted with acetonitrile to obtain a working solution to each concentration of 0.250, 0.500, 2.50, 5.00, 12.5, and 50.0 ⁇ g/mL. made and stored in the refrigerator.
  • Verapamil an internal standard (IS)
  • the working solution of MMAE was added to rat plasma containing THU to prepare standard plasma samples such that the plasma concentrations of MMAE were 10, 20, 100, 200, 500, and 2000 ng/mL, respectively.
  • an analysis suitability sample (MMAE lower limit of quantification: LLoQ, 10 ng/mL, low concentration: LoQC, 25 ng/mL, medium concentration: MiQC, 250 ng/mL, high concentration: HiQC, 1500 ng/mL) were assayed in duplicate. It was confirmed that at least 67% (eg, 4 out of 6) of the 6 conformity samples were within ⁇ 15% of the theoretical value, and that at the same concentration, more than 50% were within ⁇ 15% of the theoretical value.
  • the peak area ratio of MMAE to the peak area of the internal standard was obtained from the obtained chromatogram, and the concentration of MMAE in plasma was calculated from a previously prepared calibration curve.
  • Tandem mass spectrometer triple quadrouple type
  • Ion source Electrospray ionization (positive ion mode)
  • Nebulizing gas Nitrogen
  • Collision gas Nitrogen
  • Each standard of gemcitabine and dFdU was dissolved in distilled water to prepare 400 ⁇ g/mL and 700 ⁇ g/mL stock solutions and stored frozen.
  • a working solution was prepared to be ⁇ g/mL and stored in a refrigerator.
  • 5'-Deoxy-5-fluorocytidine, an internal standard (IS) was dissolved in acetonitrile to prepare a 50 ng/mL working solution.
  • the working solutions of gemcitabine and dFdU were added to THU-containing rat plasma, and standard plasma samples were prepared so that the plasma concentrations of gemcitabine and dFdU were 10, 20, 40, 100, 500, and 2000 ng/mL, respectively.
  • 150 ⁇ L of internal standard 5'-Deoxy-5-fluorocytidine (50 ng/mL) dissolved in acetonitrile was added to 20 ⁇ L of rat plasma, and vortexed for 10 minutes, followed by centrifugation at 14,000 rpm at 4° C. for 5 minutes. Thereafter, 150 ⁇ L of the supernatant was transferred to another Eppendorf tube, and the organic solvent was dried under a nitrogen stream. 100 ⁇ L of tertiary distilled water was added to the dried Eppendorf tube and dissolved again. After vortexing for 10 minutes and centrifuging at -4°C at 14,000 rpm for 5 minutes, 90 ⁇ L of the supernatant is taken.
  • the analysis suitability sample (gemcitabine and dFdU, respectively, lower limit of quantification: LLoQ, 10 ng/mL, low concentration: LoQC, 30 ng/mL, medium concentration: MiQC, 300 ng/mL, high concentration: HiQC, 900 ng/mL) were analyzed in duplicate. It was confirmed that at least 67% (eg, 4 out of 6) of the 6 conformity samples were within ⁇ 15% of the theoretical value, and that at the same concentration, more than 50% were within ⁇ 15% of the theoretical value.
  • the pharmacokinetic parameters of MMAE, gemcitabine and dFdU were analyzed by non-compartment analysis using the Phoenix WinnonlinTM (6.4 version, Certara) program.
  • the area under the plasma concentration-time curve (AUCt) was obtained by the log-linear trapezoidal formula from the plasma concentration-time curves up to the final quantification point after drug administration.
  • the area under the plasma concentration-time curve (AUCinf) to infinite time was obtained using the following [Equation 1].
  • the terminal elimination rate constant ( ⁇ Z) and half-life (t1/2) were obtained from the slope of the elimination phase of the plasma concentration trend.
  • AUCinf AUCt + Ct/ ⁇ Z (Ct: final quantitative concentration, ⁇ Z: terminal elimination rate constant)
  • Example 9 40 mg/kg intravenous administration and the same amount of MMAE alone 4 mg/kg intravenously administered to rats, i) the plasma concentration of MMAE is shown in FIG. 9, ii) the pharmacokinetic coefficient of MMAE is shown below [ Table 9 ] summarized.
  • MMAE 4 mg/kg When MMAE 4 mg/kg was administered intravenously, all 7 rats tested died between 480 and 600 minutes after administration. However, in the 40 mg/kg intravenous administration group of Example 9 (IO176), the plasma concentration of MMAE at 1 minute after administration was 605 ⁇ 165 ng/mL, which was about 605 ⁇ 165 ng/mL, which was approximately lower than that of the MMAE 4 mg/kg intravenous administration group (29640 ⁇ 7190 ng/mL). It was detected 50 times lower, and the plasma concentration of MMAE increased slowly from 60 to 120 minutes after administration and increased until 1800 minutes, the last time of blood collection, and all the rats tested were alive without dying (see FIG. 9).
  • Example 9 can show a statistically significantly lower plasma MMAE concentration, which reduces the cytotoxicity of MMAE, which was tested. It is predicted that no dead individuals appeared in rats.
  • Example 9 When 40 mg/kg intravenous administration and the same amount of gemcitabine alone 2 mg/kg intravenously, i) plasma concentrations of gemcitabine and its metabolite dFdU are shown in FIG. 10, ii) gemcitabine and its metabolite The pharmacokinetic coefficients of the body dFdU are summarized in [Table 10] below.
  • the analysis results for Gemcitabine are as follows (see Table 10 below).
  • the group administered with Example 9 (IO176) showed a statistically significantly higher gemcitabine plasma concentration than the group administered with the same amount of gemcitabine alone intravenously (Fig. 10 left figure).
  • the AUCt values of gemcitabine were calculated to be 610 ⁇ 52.2 ⁇ g min/mL and 438 ⁇ 124 ⁇ g min/mL, respectively, about 1.39 times higher.
  • the plasma half-life (t1/2) of gemcitabine was statistically significantly increased in the Example 9 (IO176) administration group. Through this, it was predicted that the initial release rate of gemcitabine was high in the group administered with IO176 (Example 9), so that the plasma concentration of gemcitabine remained high, but the plasma half-life was increased due to continuous release.
  • dFdU an inactive metabolite of Gemcitabine
  • the plasma concentration tended to be slightly higher, but the AUCt values were 111 ⁇ 22.3 ⁇ g min/mL and 79.8 ⁇ 44.2 ⁇ g min/mL, respectively, showing no statistical significance.
  • Cmax (peak plasma concentration) of dFdU showed a statistically significantly higher value in the Example 9 (IO176) administration group.
  • the metabolic conversion rates of inactive metabolites (AUCt, dFdU/AUCt, gemcitabine) in both groups were 0.182 ⁇ 0.0263 and 0.170 ⁇ 0.0621, respectively, showing no statistical significance. From this, it can be seen that gemcitabine released into plasma from Example 9 (IO176) does not affect the conversion rate of the inactive substitute.
  • AUCt is the area under the curve from 0 minutes to the last blood collection time
  • t1/2 is terminal half-life (plasma loss half-life)
  • CL is total body clearance
  • Vdss is the volume of distribution in the body
  • MRT is the drug in the body
  • Tmax is the median (ranges)
  • the metabolic conversion ratio value is a value calculated by dividing the dFdU AUCt value by the gemcitabine AUCt value.

Abstract

본 발명은 적어도 하나의 변형핵산을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 약물을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에 관한 것으로, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체는 체내에서 높은 안정성을 나타내며 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.

Description

변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도
본 발명은 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도에 관한 것이다.
현재 항암제를 비롯한 수많은 치료제들이 개발되고 임상을 거쳐 약으로 개발되어 왔으나, 표적 항암제처럼 치료효과가 있는 물질을 원하는 발병 부위까지 보다 선택적이고 효과적으로 전달하기 위해 계속적인 연구가 필요한 실정이다. 구체적으로 항암제는 비-종양특이적인 전신독성(systemic toxicity)과 세포독성(cytotoxicity) 때문에 치료유효량(therapeutic index)과 치료범위(therapeutic window)가 낮고, 오랜 기간 치료시 항암제에 대한 내성이 생길 수 있는 단점이 있다. 이에 약물을 암세포에만 정확하게 전달하여 사멸시키는 향상된 새로운 치료법이 절실히 요구되고 있다.
한편, 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드는 구아닌과 시토신의 삼중 수소결합 외에도 분자내 결합 또는 분자간 결합을 통하여 특별한 구조를 가질 수 있다. 일반적인 아데닌과 티민, 구아닌과 시토신의 수소결합을 통한 이중나선구조를 형성하는 대신 4개의 구아닌이 한 평면에 위치하여 후그스틴(Hoogsteen) 수소결합을 이루어서 사각 평면 구조의 구아닌 테트라드(G-tetrad)를 형성하고 2개 이상의 구아닌 테트라드가 겹겹이 쌓여 사중나선 구조의 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex)를 형성한다. 이러한 G-쿼드로플렉스를 이루는 올리고뉴클레오티드는 그의 구조적인 특징으로 인하여 안정한 구조를 이루고 있어 우수한 세포투과도를 가지는 것으로 알려져 있다.
그러나 G-쿼드로플렉스를 형성하는 올리고뉴클레오티드는 주로 세포성장 저해 효과로 인한 세포사멸을 유도해야 하므로 세포사멸율이 비교적 높지 않아 4일에서 7일 정도 수액 주사를 통하여 일정시간 이상 지속적인 처리가 필요하다. 따라서, 필요 이상의 약물을 장시간 투여해야 하는 문제점이 있다. 이에 체내에서 안정하고 높은 세포 투과성을 나타내며 우수한 약효를 나타내는 새로운 변형핵산을 포함하는 물질을 개발하기 위한 다수의 연구가 수행되고 있다.
본 발명은 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제공하는 것을 목적으로 한다.
본 발명은 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 치료 또는 예방용 약학 조성물을 제공하는 것을 목적으로 한다.
1. 하기 화학식 1로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 포함된 디옥시우리딘(dU)에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체:
[화학식 1]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5Y1X6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 1에서,
X1 내지 X3 및 X7 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
Y1은 디옥시구아노신(dG), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
X4 내지 X6 은 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이되, 상기 X4 내지 X6 중 적어도 하나는 디옥시우리딘(dU)이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9 가 모두 티미딘(T)이고 상기 Y1 이 디옥시구아노신(dG)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000001
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000002
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고, 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
2. 위 1에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
3. 위 1에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E, MMAE), 모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 모노메틸 오리스타틴 D(monomethyl auristatin D), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(Tubulysin analog), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), 오리스타틴 E(auristatin E), 오리스타틴(auristatin F) 및 네모루비신(nemorubicin)로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
4. 위 1에 있어서, 상기 약물과 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 포함된 디옥시우리딘(dU)은 L1과 L2가 결합된 링커(L)로 컨쥬게이션되고;
상기 L1은 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택되어 탈보호과정을 통해 얻어진, 아크릴아마이드(acrylamide)-C2-NH2, C12-NH2, C3-NH2, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-프로파나마이드(propanamide)-SH, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-NH2, C6-NH2, C6-SH 그룹으로부터 선택되며,
상기 L2는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), 숙신산(succinic acid), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 것인, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
5. 위 1에 있어서, 상기 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 10에서 선택된 서열로 이루어지는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
7. 위 6에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 유방암, 간암, 위암, 난소암, 자궁경부암종, 신경교종암, 대장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 간암, 위선암, 자궁암, 방광암, 갑상선암, 난소암, 흑색종 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
8. 하기 화학식 2로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체:
[화학식 2]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5GX6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 2에서,
X1 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이며;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9가 모두 티미딘(T)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000003
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000004
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함).
9. 위 8에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
10. 위 8에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 모노메틸 오리스타틴 D(MMAD), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(Tubulysin analog), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), 오리스타틴 E(auristatin E), 오리스타틴 F(auristatin F) 및 네모루비신(nemorubicin)로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
11. 위 8에 있어서, 상기 약물과 상기 화학식 2로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나는 L1과 L2가 결합된 링커(L)로 컨쥬게이션되고;
상기 L1은 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택되어 탈보호과정을 통해 얻어진, 아크릴아마이드(acrylamide)-C2-NH2, C12-NH2, C3-NH2, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-프로파나마이드(propanamide)-SH, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-NH2, C6-NH2, C6-SH 그룹으로부터 선택되며,
상기 L2는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), 숙신산(succinic acid), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택된 것인, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
12. 위 8에 있어서, 상기 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 서열번호 12에서 선택된 서열로 이루어지는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
13. 위 8 내지 12 중 어느 한 항의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
본 발명의 '변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체'는 변형핵산을 포함하는 올리고뉴클레오티드(이하, '변형 올리고뉴클레오티드')와 이에 컨쥬게이션된 약물을 포함함으로써 체내에서 높은 안정성을 나타내며 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 '변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체'는 '변형 올리고뉴클레오티드'를 단독으로 사용하거나 '약물'을 단독으로 투여할 때보다 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
본 발명의 '변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체'는 접합체에 포함된 변형 올리고뉴클레오티드와 동량의 '변형 올리고뉴클레오티드'에 비해 체내에서의 반감기가 높다. 본 발명의 '변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체'는 접합체에 포함된 약물과 동량의 '약물'에 비해 비해 독성이 낮다.
본 발명의 '올리고뉴클레오티드 변형체-약물 접합체'는 변형핵산이 포함되지 않은 올리고뉴클레오티드에 약물만 컨쥬게이션된 '올리고뉴클레오티드-약물접합체'에 비해 우수한 항암 효과를 나타낼 수 있다.
도 1 내지 도 5는 IVIS imaging을 통해 췌장암 동소이식 동물 모델에서의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 유효성을 평가한 결과를 나타낸다 (도 1: 미처리, 도 2: 젬시타빈 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 3: IO101L 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 4: IO176 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 5: IO142 로딩 콜라겐 패치 처리군)
도 6은 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 담지된 콜라겐 패치가 처리된 췌장암 동소이식 동물 모델의 체중 변화를 확인한 결과를 나타낸다.
도 7a 내지 7e는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 담지된 콜라겐 패치가 처리된 췌장암 동소이식 동물 모델에서의 장기 및 종양의 크기를 확인한 결과를 나타낸다 (도 7a: 미처리, 도 7b: 젬시타빈 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 7c: IO101L 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 7d: IO176 로딩 콜라겐 패치 처리군, 도 7e: IO142 로딩 콜라겐 패치 처리군)
도 8a 및 도 8b는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 담지된 콜라겐 패치가 처리된 췌장암 동소이식 동물 모델에서의 장기 및 종양의 무게를 확인한 결과를 나타낸다.
도 9는 일 실시예에 따른 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체(IO176)와 MMAE 투여 후 혈장 내 MMAE 농도를 나타낸 그래프이다. 도 9에서 그래프 안에 포함된 작은 그래프는 약물 투여 직전(0 분)부터 120분 까지의 혈장 내 MMAE의 농도를 나타낸 것이다.
도 10은 일 실시예에 따른 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체(IO176)와 젬시타빈 및 그 대사체(dFdU)의 혈장 중 농도를 나타낸 그래프이다.
도 11은 말단이 아닌 내부의 뉴클레오티드가 변형핵산으로 치환된 변형 올리고뉴클레오티드와 MMAE를 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 12는 말단이 아닌 내부의 뉴클레오티드가 변형핵산으로 치환된 변형 올리고뉴클레오티드와 paclitaxel을 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 13은 말단이 아닌 내부의 뉴클레오티드가 변형핵산으로 치환된 변형 올리고뉴클레오티드와 DM1을 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 14은 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나에 변형핵산이 부가된 변형 올리고뉴클레오티드와 MMAE를 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 15는 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나에 변형핵산이 부가된 변형 올리고뉴클레오티드와 paclitaxel을 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 16은 5' 말단 또는 3' 말단 중 하나에 변형핵산이 부가된 변형 올리고뉴클레오티드와 DM1을 컨쥬게이션시키는 과정을 나타낸 반응식이다.
도 17은 비교예 2를 제조하기 위한 반응식을 나타낸 것이다.
도 18은 실시예 8 를 제조하기 위한 반응식을 나타낸 것이다.
도 19 내지 도 27은 몇몇 실시예와 비교예의 IC50 평가 결과 및 그래프를 나타낸 것이다.
이하 본 발명을 더욱 상세하게 설명한다.
본 발명은 적어도 하나의 변형핵산을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션된 약물을 포함하는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제공한다.
변형 올리고뉴클레오티드
변형 올리고뉴클레오티드는 적어도 하나의 변형핵산을 포함할 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드는 변형핵산을 포함하고 G-쿼드로플렉스(G-quadruplex) 구조를 형성하는 것일 수 있다.
올리고뉴클레오티드의 G-쿼드로플렉스 구조에 기여하는 구아노신(G)은 2'-데옥시구아노신(2-deoxy-guanosine), 구아노신(guanosine), 2'-오-메틸-구아노신(2'-O-methyl-guanosine), 2'-플루오로-구아노신(2'-F-guanosine), LNA(Locked Nucleic Acid)-구아노신, D-데옥시구아노신 및 D-구아노신 중에서 1종 또는 2종 이상 선택된 것일 수 있으며, 여기에 치료적 효과를 가지는 변형핵산이 포함될 수 있도록 합성할 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드는 DNA 합성기를 이용한 고정상 합성법을 통하여 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드에 전술한 변형핵산이 포함될 수 있도록 제조될 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드는 공지의 올리고뉴클레오티드 서열에서 소정의 뉴클레오티드를 변형핵산으로 치환하거나, 또는 공지의 올리고뉴클레오티드 서열의 3' 또는 5' 말단 중 적어도 하나에 변형핵산을 부가하여 도입함으로써 제조될 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드는 표적 단백질에 결합력 또는 특이성을 갖는 압타머일 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드의 서열 및 변형핵산의 위치는 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등에 영향을 미칠 수 있고, 따라서 서열 및 변형핵산의 위치는 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등을 고려하여 적절히 선택되어야 한다.
본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 유용성은 표적 단백질에 대한 결합력 또는 특이성 등의 요인에 따라 나타나는 생리 활성 효과에 따라 결정될 수 있다.
변형핵산은 치료효능을 가지는 것일 수 있고, 예컨대 당(sugar)이나 염기(base)가 변형된 구아노신, 티미딘, 시티딘 또는 우리딘일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 변형핵산은 피리미딘계열일 수 있다. 구체적으로 변형핵산은 우리딘 또는 시티딘 유래일 수 있다.
변형핵산은 아래 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 화합물로부터 선택될 수 있다:
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000005
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000006
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고,
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고,
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기, 상기 R2가 수소이고 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
화학식 3에서 R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기일 수 있고, 구체적으로 수소일 수 있다.
화학식 3에서 R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기일 수 있고, 구체적으로 수소일 수 있다.
화학식 3에서 R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기일 수 있고, 구체적으로는 할로겐, C1-C6의 할로알킬기, 또는 C2-C6의 할로알케닐기일 수 있다. 일 실시예에 따르면 화학식 3은 5-플루오로데옥시우리딘일 수 있다.
화학식 4에서 R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기일 수 있고, 구체적으로 수소 또는 할로겐(예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 아이오도)일 수 있다.
화학식 4에서 R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기일 수 있고, 구체적으로 수소 또는 할로겐(예컨대, 플루오로, 클로로, 브로모, 또는 아이오도)일 수 있다.
화학식 4에서 R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기일 수 있고, 구체적으로 수소 또는 C1-C6의 알킬기일 수 있다.
화학식 4에서 R1 및 R2는 할로겐이고, R3은 수소 또는 C1 내지 C3의 알킬기일 수 있다. 일 실시예에 따르면 화학식 4는 젬시타빈일 수 있다.
변형핵산은 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 화합물에 인산기가 결합된 형태로 변형 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 구체적으로, 포스포라미다이트 형태로 변형 올리고뉴클레오티드에 포함될 수 있다. 뉴클레오티드 포스포라미다이트는 글렌리서치(Glen Research)사, 베리(Berry and Associates)사, 오키노스(Okeanos Tech)사, 켐젠(Chemgene)사, 프롤리고(Proligo)사 등에서 구입하거나, 공지의 방법(Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach, Fritz Eckstein et al. 1991, IRL Press: Oxford)으로 제조할 수 있다.
변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다. 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘은 젬시타빈일 수 있다.
예를 들어, 변형 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 1로 표시되는 서열로 이루어지는 것일 수 있다:
[화학식 1]
(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5Y1X6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d.
상기 화학식 1은 왼쪽부터 5'에서 3' 방향으로 표시된 것이다.
본 명세서에서 화학식 1에 표시된 G는 디옥시구아노신(dG)일 수 있다.
상기 화학식 1에서 X1 내지 X3 및 X7 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘 (T), 또는 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 1에서 Y1은 디옥시구아노신 (dG), 또는 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 1에서 X4 내지 X6 은 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 또는 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 1에서 X4 내지 X6 중 적어도 하나는 디옥시우리딘(dU)일 수 있다.
상기 화학식 1에서 M1 및 M2는 각각 독립적으로 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 1에서 N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)일 수 있다.
상기 화학식 1에서 a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
상기 화학식 1에서 상기 상기 X1 내지 X9 가 모두 티미딘(T)이고 상기 Y1 이 디옥시구아노신(dG)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아닐 수 있다. 즉, 화학식 1로 표현되는 변형 올리고뉴클레오티드는 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산을 적어도 하나 포함하는 것이다.
상기 화학식 1에서 b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
상기 화학식 1로 이루어지는 변형 올리고뉴클레오티드의 디옥시우리딘(dU)에 약물이 컨쥬게이션될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 1로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 1]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5Y1X6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 1에서,
X1 내지 X3 및 X7 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
Y1은 디옥시구아노신(dG), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
X4 내지 X6 은 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이되, 상기 X4 내지 X6 중 적어도 하나는 디옥시우리딘(dU)이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9 가 모두 티미딘(T)이고 상기 Y1 이 디옥시구아노신(dG)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000007
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000008
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고, 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
몇몇 실시예에 따르면, 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 10에서 선택된 서열로 이루어진 것일 수 있다.
다른 예를 들어, 변형 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 2로 표시되는 서열로 이루어지는 것일 수 있다:
[화학식 2]
(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5GX6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d.
상기 화학식 2는 왼쪽부터 5' 에서 3' 방향으로 표시된 것이다.
본 명세서에서 화학식 2에 표시된 G는 디옥시구아노신(dG)일 수 있다.
상기 화학식 2에서 X1 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘 (T), 또는 전술한 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 2에서 M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산일 수 있다.
상기 화학식 2에서 N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)일 수 있다.
상기 화학식 2에서 a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
상기 화학식 2에서 상기 X1 내지 X9가 모두 티미딘(T)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아닐 수 있다.
상기 화학식 2에서 b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수일 수 있다.
상기 화학식 1로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 약물이 컨쥬게이션될 수 있다.
구체적으로, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드는 하기 화학식 2로 표시되는 것일 수 있다:
[화학식 2]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5GX6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 2에서,
X1 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이며;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9가 모두 티미딘(T)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000009
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000010
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
몇몇 실시예에 따르면, 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 서열번호 12에서 선택된 서열로 이루어진 것일 수 있다.
약물
약물은 변형 올리고뉴클레오티드에 컨쥬게이션될 수 있는 구조를 갖는 것이면 충분하며, 구체적인 종류는 제한되지 않는다.
약물은 변형 올리고뉴클레오티드에 직접적으로 컨쥬게이션될 수 있는 작용기 또는 링커에 컨쥬게이션될 수 있는 작용기(예컨대, 하이드록시기, 카르복시기, 또는 아미노기)를 가지는 것일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
예를 들어, 약물은 파클리탁셀(paclitaxel), 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 모노메틸 오리스타틴 D(MMAD), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(tubulysin analog), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), 오리스타틴 E(auristatin E), 오리스타틴 F(auristatin F) 및 네모루비신(nemorubicin)으로 이루어진 군에서 선택될 수 있다.
약물은 변형 올리고뉴클레오티드에 직접 또는 간접적으로 컨쥬게이션될 수 있다. 예를 들어 약물은 변형 올리고뉴클레오티드에 직접 컨쥬게이션되거나, 링커를 통해 컨쥬게이션될 수 있다.
약물은 변형 올리고뉴클레오티드 내부에 포함된 적어도 하나의 염기에 컨쥬게이션될 수 있다. 구체적으로, 약물은 변형 올리고뉴클레오티드의 내부에 포함된 우리딘 또는 디옥시우리딘(dU)에 컨쥬게이션될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
약물은 변형 올리고뉴클레오티드의 말단에 위치하는 염기에 컨쥬게이션될 수 있다. 구체적으로, 약물은 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 컨쥬게이션될 수 있다.
변형 올리고뉴클레오티드에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
링커
변형 올리고뉴클레오티드와 약물은 링커(L)로 연결될 수 있다. 링커(L)는 변형 올리고뉴클레오티드와 약물을 연결시킬 수 있는 것이면 충분하며 구체적인 종류는 한정되지 않는다.
링커(L)는 L1과 L2가 결합된 것일 수 있다.
L1 및 L2는 각각 독립적으로 변형 올리고뉴클레오티드와 약물에 컨쥬게이션될 수 있다. L1과 L2는 각각 독립적으로 변형 올리고뉴클레오티드와 약물에 컨쥬게이션될 수 있고, L1과 L2의 반응을 통해 변형 올리고뉴클레오티드와 약물을 컨쥬게이션시킬 수 있다.
일 실시예에 따르면 L1은 변형 올리고뉴클레오티드와 연결될 수 있고, L2는 약물과 연결될 수 있다. 예를 들어, L1은 변형 올리고뉴클레오티드의 내부에 포함된 뉴클레오티드(예컨대 dU)와 연결될 수 있고, L2는 약물과 연결될 수 있다. 다른 예를 들어, L1은 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 연결될 수 있고, L2는 약물과 연결될 수 있다.
L1은 화학 반응을 통해 L2와 결합될 수 있는 작용기를 포함하는 것이면 충분하며, 그 종류는 제한되지 않는다. L2는 화학 반응을 통해 L1과 결합될 수 있는 작용기를 포함하는 것이면 충분하며, 그 종류는 제한되지 않는다.
예를 들어 L1은 -SH 작용기를 포함하고, L2는 말레이미드(maleimide) 작용기를 포함하는 것일 수 있다. 다른 예를 들어 L1은 -NH2 작용기를 포함하고, L2는 -COOH 작용기를 포함하는 것일 수 있다.
상기 L1은 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. L1은 전술한 예시들의 탈보호(deprotection)된 형태일 수 있고, 예컨대 아크릴아마이드(acrylamide)-C2-NH2, C12-NH2, C3-NH2, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-프로파나마이드(propanamide)-SH, 아크릴아마이드-C6-NH2, C6-NH2, 또는 C6-SH일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
L2는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), 숙신산(succinic acid), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
링커(L)를 이용해 변형 올리고뉴클레오티드와 약물을 컨쥬게이션시키는 방법의 몇몇 예시는 아래와 같다.
예를 들어, 공지의 올리고뉴클레오티드(예컨대 비교예 1의 서열을 갖는 압타머)를 기준으로 소정의 뉴클레오티드가 변형핵산으로 치환된 변형 올리고뉴클레오티드를 제조하는 단계; 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 일 말단에 L1을 결합시키는 단계;
약물에 L2를 결합시키는 단계; 및
L1이 결합된 변형 올리고뉴클레오티드와 L2가 결합된 약물을 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 변형 올리고뉴클레오티드-약물 복합체를 제조할 수 있다 (도 11 내지 13 참조).
다른 예를 들어, 공지의 올리고뉴클레오티드(예컨대 비교예 1의 서열을 갖는 압타머)의 양 말단(5' 말단 또는 3' 말단) 중 적어도 하나의 말단에 적어도 하나의 변형핵산을 부가하여 변형 올리고뉴클레오티드를 제조하는 단계; 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 일 말단에 L1을 결합시키는 단계;
약물에 L2를 결합시키는 단계; 및
L1이 결합된 변형 올리고뉴클레오티드와 L2가 결합된 약물을 반응시키는 단계를 포함하는 방법으로 변형 올리고뉴클레오티드-약물 복합체를 제조할 수 있다(도 14 내지 16 참조).
몇몇 실시예에 따르면, 링커(L)는 -[acrylamide-C6-NH-(CO)-(CH2)2-(CO)O]-, -[C6-NH-(CO)-(CH2)2-(CO)O]-, -[C6-S-MC-Val-Cit-PAB]-,
-[C6-NH-CO-A]-, -[acrylamide-C6-NH-CO-A]-, 또는 (상기 A는
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000011
임)일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체
몇몇 실시예에 따르면, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체는 하기 화학식 1로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 포함된 디옥시우리딘(dU)에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 1]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5Y1X6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 1에서,
X1 내지 X3 및 X7 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
Y1은 디옥시구아노신(dG), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
X4 내지 X6 은 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU)또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이되, 상기 X4 내지 X6 중 적어도 하나는 디옥시우리딘(dU)이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9 가 모두 티미딘(T)이고 상기 Y1 이 디옥시구아노신(dG)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000012
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000013
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고, 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
상기 약물과 상기 디옥시우리딘(dU)은 링커(L)로 연결될 수 있다. 링커는 전술한 L1 및 L2 가 결합된 것일 수 있다.
상기 L1 및 L2는 각각 독립적으로 상기 변형 올리고뉴클레오티드 내 디옥시우리딘(dU) 및 상기 약물에 결합될 수 있다.
구체적으로, 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 10에서 선택된 서열로 이루어진 것일 수 있다.
변형핵산, 약물, L1 및 L2 등에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
몇몇 실시예에 따르면, 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체는 화학식 2로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 것일 수 있다:
[화학식 2]
5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5GX6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
(상기 화학식 2에서,
X1 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이며;
N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9가 모두 티미딘(T)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
[화학식 3]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000014
[화학식 4]
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000015
(상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
상기 약물과 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나는 링커(L)로 연결될 수 있다. 링커는 전술한 L1 및 L2이 결합된 것일 수 있다.
상기 L1 및 L2는 각각 독립적으로 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나; 및 상기 약물에 결합될 수 있다.
구체적으로, 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 서열번호 12에서 선택된 서열로 이루어진 것일 수 있다.
변형핵산, 약물, L1 및 L2 등에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 용도
또한, 본 발명은 전술한 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물을 제공한다.
암은 백혈병, 림프종, 유방암, 간암, 위암, 난소암, 자궁경부암종, 신경교종암, 대장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 간암, 위선암, 자궁암, 방광암, 갑상선암, 난소암, 흑색종 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택될 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 본 발명은 전술한 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 개체에 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료방법을 제공할 수 있다.
개체는 인간을 포함하는 포유류일 수 있고, 예컨대 인간, 소, 말, 개, 토끼, 고양이, 염소 및 쥐일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 및 암에 대해서는 전술한 바 있어 구체적인 설명은 생략한다.
이하, 실시예를 들어 본 발명의 구성 및 효과를 보다 구체적으로 설명한다. 그러나 아래 실시예는 본 발명에 대한 이해를 돕기 위해 예시의 목적으로만 제공된 것일 뿐 본 발명의 범주 및 범위가 그에 의해 제한되는 것은 아니다.
본 발명자들은 변형핵산을 포함하는 구아노신이 풍부한 올리고뉴클레오티드 변형체에 약물을 성공적으로 컨쥬게이션시켜 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 합성하였고, 합성된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체가 독성이 없고 안정하며 우수한 암 치료 효과를 나타내는 것을 확인하였다.
1. 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 제조(ApDDC; Aptamer-Double Drug-Conjugate)
아래에 기재된 방법으로 표 1의 실시예(변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체) 및 비교예를 설계 및 제조하였다. 아래 표 1에서 M = Gemcitabine, N = 5-FdU(5-fluorodeoxyuridine)를 나타내고, G는 디옥시구아노신(dG), T는 티미딘(T), U는 디옥시우리딘(dU)이다. 즉, 본 발명의 설명에서 서열번호 1 내지 12와 이를 이용해 제조된 접합체인 서열번호 13 내지 33에 표시된 G는 디옥시구아노신(dG), T는 티미딘(T), U는 디옥시우리딘(dU)이다.
구분 실시예(변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체) 및 비교예 구성
올리고뉴클레오티드 또는 변형 올리고뉴클레오티드 서열
(5' -> 3') 		접합 약물 종류/ 접합 위치 MW(Cal.) MW(Obs.)
비교예1 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) - 8272.
2750		 8267.
3740
비교예2 GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGTGG (서열번호 2) 파클리탁셀/서열번호 2의 U에 접합(서열번호 2의 15번째 뉴클레오티드) 9362.
4482		 9356.
7390
비교예3 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG (서열번호 3) 파클리탁셀/서열번호 3의 U에 접합(서열번호 3의 13번째 뉴클레오티드) 9362.
4482		 9356.
8018
실시예1 GGTGGTGGTGGUMGTGGTGGTGGTGG (서열번호 4) 파클리탁셀/서열번호 4의 U에 접합(서열번호 4의 12번째 뉴클레오티드) 9383.
4209		 9377.
8057
실시예2 GGTGGTGGTGGUTMTGGTGGTGGTGG (서열번호 5) 파클리탁셀/서열번호 5의 U에 접합(서열번호 5의 12번째 뉴클레오티드) 9358.
4082		 9353.
7969
실시예3 GGTGGTGGTGGTUMTGGTGGTGGTGG (서열번호 6) 파클리탁셀/서열번호 6의 U에 접합(서열번호 6의 13번째 뉴클레오티드) 9358.
4082		 9353.
7949
실시예4 GGTGGTGGTGGTUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 7) 파클리탁셀/서열번호 7의 U에 접합(서열번호 7의 13번째 뉴클레오티드) 9383.
4209		 9377.
8047
실시예5 GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8) 파클리탁셀/서열번호 8의 U에 접합(서열번호 8의 13번째 뉴클레오티드) 9404.
3937		 9398.
8086
실시예6 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGMGG (서열번호 9) 파클리탁셀/서열번호 9의 U에 접합 (서열번호 9의 13번째 뉴클레오티드) 9383.
4209		 9379.
8047
실시예7 GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGMGG (서열번호 10) 파클리탁셀/서열번호 10의 U에 접합(서열번호 10의 15번째 뉴클레오티드) 9383.
4209		 9377.
8076
실시예8 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) 파클리탁셀/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 10341.
9177		 10336.
2988
비교예4 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) MMAE/서열번호 1의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 9788.
1292		 9782.
8164
실시예9 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) MMAE/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 10438.
4611		 10433.
7754
비교예5 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) DM1/서열번호 1의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 9408.
9532		 9403.
8105
실시예10 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) DM1/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 10059.
2852		 10053.
0713
비교예6 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG (서열번호 3) DM1/ 서열번호 3의 U에 접합 (서열번호 3의 13번째 뉴클레오티드) 9384.
0088		 9378.
8096
실시예11 GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8) DM1/ 서열번호 8의 U에 접합 (서열번호 8의 13번째 뉴클레오티드) 9425.
9543		 9402.
8115
비교예7 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) 파클리탁셀/서열번호 1의 5'에 접합 9387.
3926		 9382.
1602
실시예12 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGNN (서열번호 12) 파클리탁셀/서열번호 12의 5'에 접합 10003.
7099		 9997.
9199
(1) 비교예 1 제조
비교예 1[: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1)]은 일반적인 DNA 합성방법으로 제조하였다.
구체적으로 Mermade 12 또는 Mermade 48(바이오오토메이션, 미국)를 이용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하였다. [탈보호(Deblocking) -> 결합(Coupling) -> 불활성화(Capping) -> 산화(Oxidation)]의 4단계 공정을 한 사이클로 1 개의 뉴클레오티드(1 mer) 씩 3' 말단에서 5' 말단으로 순차적으로 합성하였다. 구체적으로, [탈보호(Deblocking) -> 결합(Coupling) -> 불활성화(Capping) -> 산화(Oxidation)]의 4단계 공정은 아래와 같다.
A. 탈보호: TCA Deblock을 투입하여 Controlled Pore Glass(CPG)에 지지되어 있는 뉴클레오티드의 4,4-디메톡시트리일기(DMT)를 제거함으로써 다음 뉴클레오티드가 결합될수 있도록 5’-히드록실기를 생성하였다.
B. 결합(Coupling): 뉴클레오티드 포스포아미다이트 와 ETT Activator를 투입하여 뉴클레오티드를 활성화 하고 CPG에 지지되어 있는 뉴클레오티드의 5’-히드록실기와 결합시켰다.
C. 불활성화(Capping): Cap A와 Cap B를 투입하여 반응에 참여하지 않은 (n-1)차 뉴클레오티드의 5’-히드록실기를 불활성화하였다.
D. 산화(Oxidation): 산화제(Oxidizer)를 투입하여 뉴클레오티드간 인산 결합을 산화시켰다.
합성된 올리고뉴클레오티드는 용액(암모니아수, 55 ℃)에 옮겨 CPG 지지체를 분리하고 보호기를 분리하였다.
탈보호된 올리고뉴클레오티드의 정제 및 분석은 Waters Prep150(Waters, 미국)과 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)에 역상 C18컬럼으로 수행하였다. 또한 정제된 핵산 리간드들의 질량 분석을 Waters Xevo G2-XS Q-TOF System(Waters, 미국)으로 수행하였다.
(2) 비교예 2 제조
비교예 2 [: GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGTGG(서열번호 2)의 U에 파클리탁셀이 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체] 는 일반적인 DNA 합성방법과 약물 컨쥬게이션의 두 단계로 제조하였다 (도 17 참조).
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000016
(L1=-acrylamide-C6-NH2) (서열번호 13)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
서열번호 13의 서열 [
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000017
(L1=-acrylamide-C6-NH2)(서열번호 13)]과 파클리탁셀-숙신산(paclitaxel-succinic acid, PTX-SA 98%, MedKoo Biosciences, Cat#620101)을 컨쥬케이션시켜 비교예 2의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 합성하였다. 비교예 2의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 2의 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다 (acrylamide는 서열번호 2의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
구체적으로 파클리탁셀-숙신산을 DMSO에 녹이고 EDC(-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride)와 ultra-pure water에 녹인 Sulfo-NHS (N-hydroxysulfosuccinimide)를 첨가하여 실온(RT; Room temperature)에서 1시간동안 반응시켰다. 상기 서열번호 13의 서열을 pH8.4 buffer에 녹이고 활성화된 파클리탁셀 혼합물을 넣었다. RT 에서 1시간 반응시키고 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)을 이용하여 반응 진행을 관찰하였다.
제조된 비교예 2(올리고뉴클레오티드-약물 접합체)의 서열의 정제 및 분석은 Waters Prep150(Waters, 미국)과 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)에 역상 C18컬럼으로 수행하였다. 또한 정제된 핵산 리간드들의 질량 분석을 Waters Xevo G2-XS Q-TOF System(Waters, 미국)으로 수행하였다.
(3) 비교예 3의 제조
비교예 3 [: GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG(서열번호 3)의 U에 파클리탁셀이 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000018
(L1=-acrylamide-C6-NH2)(서열번호 14)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13 서열 대신 서열번호 14의 서열을 사용하여, 비교예 3의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 합성하였다. 비교예 3의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 3의 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다 (acrylamide는 서열번호 3의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(4) 실시예 1의 제조
실시예 1 [: GGTGGTGGTGGUMGTGGTGGTGGTGG(서열번호 4)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000019
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 15)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13의 서열 대신 서열번호 15의 서열을 사용하여, 실시예 1의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다. 실시예 1의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 4 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다(acrylamide는 서열번호 4의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(5) 실시예 2의 제조
실시예 2 [: GGTGGTGGTGGUTMTGGTGGTGGTGG(서열번호 5)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 를 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000020
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 17)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13의 서열 대신 서열번호 17의 서열을 사용하여, 실시예 2의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 2의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 5의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다(acrylamide는 서열번호 5의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(6) 실시예 3의 제조
실시예 3 [: GGTGGTGGTGGTUMTGGTGGTGGTGG (서열번호 6)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000021
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 18)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13의 서열 대신 서열번호 18의 서열을 사용하여, 실시예 3의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체]를 제조하였다.
실시예 3의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 6 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다 (acrylamide는 서열번호 6의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid은 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(7) 실시예 4의 제조
실시예 4 [: GGTGGTGGTGGTUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 7)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 를 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000022
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine)(서열번호 19)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13의 서열 대신 서열번호 19의 서열을 사용하여, 실시예 4의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 4의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 7의 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다(acrylamide는 서열번호 7의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(8) 실시예 5의 제조
실시예 5 [: GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 를 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000023
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine)(서열번호 20)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13의 서열 대신 서열번호 20의 서열을 사용하여, 실시예 5의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 5의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 8의 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다 (acrylamide는 서열번호 8의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid은 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(9) 실시예 6의 제조
실시예 6 [: GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGMGG (서열번호 9)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000024
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine)(서열번호 21)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13 서열 대신 서열번호 21의 서열을 사용하여, 실시예 6의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 6의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 9의 서열의 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-succinic acid-”이다(acrylamide는 서열번호 9의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid은 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(10) 실시예 7의 제조
실시예 7 [: GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGMGG (서열번호 10)의 U에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000025
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 22)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되, 서열번호 13 서열 대신 서열번호 22의 서열을 사용하여, 실시예 7의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 7의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 10의 서열에서 U와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH- succinic acid-”이다 (acrylamide는 서열번호 10의 U와 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(11) 실시예 8의 제조
아래의 방법으로 실시예 8 [: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM(서열번호 11)의 5' 말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때, M=Gemcitabine] 을 제조하였다(도 18 참조).
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000026
(L1=-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 23)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13 대신 서열번호 23의 서열을 사용하여, 실시예 8의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다.
실시예 8의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 11의 서열의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-C6-NH-succinic acid-” 이다(C6는 서열번호 11의 5' 말단과 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(12) 비교예 4의 제조
비교예 4 [: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1)의 5' 말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 MMAE가 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체] 는 일반적인 DNA 합성방법과 약물 컨쥬게이션의 두 단계로 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000027
(Z=-C6-SS-C6-OH) (서열번호 24)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
서열번호 24의 Z를 Dithiothreitol(DTT)로 환원하여
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000028
(L1=-C6-SH)(서열번호 25)을 수득하였다. 서열번호 25의 L1과 MC(maleimide-caproic acid)-Val-Cit-PAB(para-aminobenzyl carbamate)-MMAE(Monomethyl auristatin E)(: VcMMAE 96%, MedKoo Biosciences, Cat#407406)를 컨쥬게이션시켜 비교예 4의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 제조하였다. 비교예 4의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 1의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 MMAE를 연결하는 링커(L)는 “-C6-S-MC-Val-Cit-PAB-”이다(C6는 서열번호 1의 5' 말단과 연결되는 부분이고, PAB는 MMAE와 연결되는 부분임).
구체적으로, pH8.5 buffer에 녹인 DTT를 서열번호 24의 서열[
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000029
(Z=-C6-SS-C6-OH)]에 넣고 RT에서 반응시킨후 남은 DTT를 제거하기 위해 4°C에서 원심분리를 진행하였다. 활성화된 서열번호 25[
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000030
(L1=-C6-SH)]을 pH6.0 buffer에 녹인 뒤 DMSO에 녹인 VcMMAE를 첨가하여 실온(RT)에서 1시간 반응시키고 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)을 이용하여 반응 진행을 관찰하였다.
제조된 비교예4의 정제 및 분석은 Waters Prep150(Waters, 미국)과 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)에 역상 C18컬럼으로 수행하였다. 또한 정제된 핵산 리간드들의 질량 분석을 Waters Xevo G2-XS Q-TOF System(Waters, 미국)으로 수행하였다.
(13) 실시예 9의 제조
실시예 9 [: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM(서열번호 11)의 5' 말단(즉, 첫번째 뉴클레오티드)에 MMAE가 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine]을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000031
(Z=-C6-SS-C6-OH, M=Gemcitabine)(서열번호 26)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 4의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일한 방법으로 제조하되, 서열번호 24의 서열 대신 서열번호 26의 서열을 DTT로 환원하여
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000032
(L1=-C6-SH, M=Gemcitabine)(서열번호 27)를 수득하고, 상기 서열번호 27의 L1와 VcMMAE를 컨쥬게이션시켜 실시예 9를 제조하였다.
실시예 9의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 11의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 MMAE를 연결하는 링커(L)는 “-C6-S-MC-Val-Cit-PAB-”이다(C6는 서열번호 11의 5' 말단과 연결되는 부분이고, PAB는 MMAE와 연결되는 부분임).
(14) 비교예 5의 제조
비교예 5 [: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1)의 5' 말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 DM1이 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체] 는 일반적인 DNA 합성방법과 약물 컨쥬게이션의 두 단계로 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오타이드티드 합성
비교예 1의 실험방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000033
(L1=-C6-NH2) (서열번호 28)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
서열번호 28의 서열과 Mertansin(DM1)-succinimidyl-4-(N-maleimidomethyl)-cyclohexane-1-carboxylate(SMCC)(: DM1-SMCC 99%, MedKoo Biosciences, Cat#407202)를 컨쥬게이션시켜 비교예 5를 제조하였다. 비교예 5의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 1의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 DM1을 연결하는 링커(L)는 “-C6-NH-SMCC-”이다(C6는 서열번호 1의 5' 말단과 연결되는 부분이고, SMCC는 MMAE와 연결되는 부분임).
구체적으로, 서열번호 28의 서열[
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000034
(L1=-C6-NH2)]을 pH8.5 buffer에 녹이고 DMSO에 녹인 DM1-SMCC를 넣었다. 상온에서 1시간 반응시키고 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)을 이용하여 반응 진행을 관찰하였다. 제조된 비교예 5의 정제 및 분석은 Waters Prep150(Waters, 미국)과 Waters ACQUITY UPLC H-Class PLUS Bio System(Waters, 미국)에 역상 C18컬럼으로 수행하였다. 또한 정제된 핵산 리간드들의 질량 분석을 Waters Xevo G2-XS Q-TOF System(Waters, 미국)으로 수행하였다.
(15) 실시예 10의 제조
실시예 10 [GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM(서열번호 11)의 5' 말단(즉, 첫번째 뉴클레오티드)에 DM1이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오타이드티드 합성
비교예 1의 실험방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000035
(L1=-C6-NH2, M=Gemcitabine) (서열번호 29)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 5의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일한 방법으로 제조하되 서열번호 28의 서열 대신 서열번호 29의 서열과 DM1-SMCC를 컨쥬게이션시켜 실시예 10을 제조하였다.
실시예 10의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 11의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 DM1을 연결하는 링커(L)는 “-C6-NH-SMCC-”이다 (C6는 서열번호 11의 5' 말단과 연결되는 부분이고, SMCC는 DM1과 연결되는 부분임).
(16) 비교예 6의 제조
비교예 6 [: GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG (서열번호 3)의 U에 DM1이 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오타이드티드 합성
비교예 1의 실험방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000036
(L1=-acrylamide-C6-NH2)(서열번호 30)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 5의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일한 방법으로 제조하되 서열번호 28의 서열 대신 서열번호 30의 서열과 DM1-SMCC를 컨쥬게이션시켜 비교예 6을 제조하였다. 비교예 6의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 3의 U와 DM1을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-SMCC-”이다(acrylamide는 서열번호 3의 U와 연결되는 부분이고, SMCC는 DM1과 연결되는 부분임).
(17) 실시예 11의 제조
실시예 11 [: GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8)의 U에 DM1이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 M=Gemcitabine]을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오타이드티드 합성
비교예 1의 실험방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000037
(L1=-acrylamide-C6-NH2, M=Gemcitabine)(서열번호 31)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 5의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일한 방법으로 제조하되 서열번호 28의 서열 대신 서열번호 31의 서열과 DM1-SMCC를 컨쥬게이션시켜 실시예 11을 제조하였다. 실시예 11의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 9의 U와 DM1을 연결하는 링커(L)는 “-acrylamide-C6-NH-SMCC-”이다 (acrylamide는 서열번호 8의 U와 연결되는 부분이고, SMCC는 DM1과 연결되는 부분임).
(18) 비교예 7의 제조
비교예 7[: GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1)의 5' 말단에 파클리탁셀이 접합된 올리고뉴클레오티드-약물 접합체]을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000038
(L1=-C6-NH2)(서열번호 32)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13 대신 서열번호 32의 서열을 사용하여 비교예 7을제조하였다.
비교예 7의 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 1의 서열의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-C6-NH-succinic acid-”이다 (C6는 서열번호 1의 5' 말단과 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
(19) 실시예 12의 제조
실시예 12 [GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGNN (서열번호 12)의 5' 말단에 파클리탁셀이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 이때 N=5-FdU] 을 제조하였다.
1) 올리고뉴클레오티드 합성
비교예 1과 동일한 방법으로
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000039
(L1=-C6-NH2, N=5-FdU) (서열번호 33)을 합성하였다.
2) 약물 컨쥬게이션
비교예 2의 약물 컨쥬게이션 방법과 동일하되 서열번호 13 대신 서열번호 33의 서열을 사용하여, 실시예 12를 제조하였다.
실시예 12의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체에서 서열번호 12의 서열의 5' 말단의 첫번째 뉴클레오티드(G)와 파클리탁셀을 연결하는 링커(L)는 “-C6-NH-succinic acid-”이다(C6는 서열번호 12의 5' 말단과 연결되는 부분이고, succinic acid는 paclitaxel과 연결되는 부분임).
2. 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 항암 효능 확인 - 시험관 내 시험( in vitro )
췌장암 세포주를 이용하여 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 in vitro 항암 효능을 검증하였다. 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500, 1000 uM 농도로 전술한 실시예 및 비교예를 췌장암 세포주(BxPC-3)에 처리하였으며, 구체적인 IC50 측정방법 및 측정결과는 아래와 같다.
(1) 세포 배양
모든 세포주는 37℃, 5% CO2 배양기에서 배양하였다. BxPC-3 췌장암 세포주는 ATCC modified RPMI-1640 (써모사이언티픽, 미국)에 10% FBS, 1%의 항생제를 넣은 배지를 이용하여 배양하였다. 배지는 2-3일에 한번씩 교체하였고, 세포가 배양 접시의 70-90% 정도를 채우는 시점에서 계대 배양하였다. 우선, PBS로 세포를 세척한 후, 0.05% Trypsin-EDTA를 첨가하여 37℃에서 2분간 배양 후 새로운 배지를 첨가하여 트립신을 불활성화하였다. 세포는 원심분리기를 이용하여 트립신 및 배지와 분리시킨 후, 새로운 배지를 첨가하여 1:4의 비율로 계대한 후 배양하였다. 모든 세포는 주기적으로 마이코플라즈마의 오염여부를 kit(인트론, 한국)를 이용하여 확인하였고, 오염이 검출되지 않은 세포만을 이용하여 in vitro 효능평가 실험을 진행하였다.
(2) 췌장암 세포 생장 저해 효과 확인
WST 시약 (동인 LS, 한국)을 이용하여, 약물 처리에 의한 췌장암 세포 성장 저해 효과 확인 및 IC50을 측정하였다. 세포내의 미토콘드리아 탈수소효소에 의해 WST에서 formazan이라는 오렌지 발색물질이 생성되며, 이는 살아있는 세포에만 유효하다. 구체적인 시험방법은 아래와 같다.
전술한 방법으로 배양된 세포를 96-well 배양 용기의 각 well에 2 x 104개씩 분주하고 24시간 동안 배양하였다. 배양용기에 부착된 세포의 배지를 5% FBS가 포함된 ATCC modified RPMI-1640 배지로 교체하고, 전술한 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 샘플(실시예 1-7 및 9-12 및 비교예 1-7 각각)을 0, 0.01, 0.1, 1, 10, 100, 500, 1000 uM 농도로 처리하였다. 72시간 후, 각 well에 WST 시약을 10ul씩 첨가하고 2시간 반응시켰다. Glomax plate 측정기 (프로메가, 미국)를 이용하여 450nm 흡광도로 생성된 formazan을 측정하였으며, 기기 내 프로토콜에 따라 IC50를 평가하였다. IC50 평가 결과 및 그래프를 아래 표 2와 도 19 내지 27에 나타내었다. (표 2에서 M = Gemcitabine, N = 5-FdU)
구분 실시예(변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체) 및 비교예 구성 IC50
(μM)
올리고뉴클레오티드 또는 변형 올리고뉴클레오티드 서열 (5'->3') 접합 약물 종류/ 접합 위치
비교예1 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) - 89.9
비교예2 GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGTGG (서열번호 2) 파클리탁셀/서열번호 2의 U에 접합(서열번호 2의 15번째 뉴클레오티드) 4.59
비교예3 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG (서열번호 3) 파클리탁셀/서열번호 3의 U에 접합(서열번호 3의 13번째 뉴클레오티드) 4.04
실시예1 GGTGGTGGTGGUMGTGGTGGTGGTGG (서열번호 4) 파클리탁셀/서열번호 4의 U에 접합(서열번호 4의 12번째 뉴클레오티드) 2.21
실시예2 GGTGGTGGTGGUTMTGGTGGTGGTGG (서열번호 5) 파클리탁셀/서열번호 5의 U에 접합(서열번호 5의 12번째 뉴클레오티드) 0.23
실시예3 GGTGGTGGTGGTUMTGGTGGTGGTGG (서열번호 6) 파클리탁셀/서열번호 6의 U에 접합(서열번호 6의 13번째 뉴클레오티드) 1.00
실시예4 GGTGGTGGTGGTUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 7) 파클리탁셀/서열번호 7의 U에 접합(서열번호 7의 13번째 뉴클레오티드) 1.61
실시예5(IO142) GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8) 파클리탁셀/서열번호 8의 U에 접합(서열번호 8의 13번째 뉴클레오티드) 0.1
실시예6 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGMGG (서열번호 9) 파클리탁셀/서열번호 9의 U에 접합 (서열번호 9의 13번째 뉴클레오티드) 0.14
실시예7 GGTGGTGGTGGTTGUGGTGGTGGMGG (서열번호 10) 파클리탁셀/서열번호 10의 U에 접합(서열번호 10의 15번째 뉴클레오티드) 0.11
실시예8 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) 파클리탁셀/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 5.97
비교예4 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) MMAE(Monomethyl auristatin E) /서열번호 1의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 1.39
실시예9(IO176) GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) MMAE/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 1.97
비교예5 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) DM1/서열번호 1의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 0.26
실시예10 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGMM (서열번호 11) DM1/서열번호 11의 5'-말단(즉, 1번 뉴클레오티드)에 접합 10.44
비교예6 GGTGGTGGTGGTUGTGGTGGTGGTGG (서열번호 3) DM1/ 서열번호 3의 U에 접합 (서열번호 3의 13번째 뉴클레오티드) 3.01
실시예11 GGTGGTGGTGGMUGMGGTGGTGGTGG (서열번호 8) DM1/ 서열번호 8의 U에 접합 (서열번호 8의 13번째 뉴클레오티드) 26.71
비교예7 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGG (서열번호 1) 파클리탁셀/서열번호 1의 5'에 접합 13.21
실시예12 GGTGGTGGTGGTTGTGGTGGTGGTGGNN (서열번호 12) 파클리탁셀/서열번호 12의 5'에 접합 13.21
대조 압타머(Control aptamer)인 비교예 1의 IC50는 89.9νM이다. 한편, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 실시예들은 대조 압타머(Control aptamer)인 비교예 1에 비해 수 내지 수십 배 낮은 IC50 값을 나타내었다.
또한, 비교예 1 서열의 일부 아미노산에 약물이 컨쥬게이션 되고 동시에 다른 아미노산이 변형핵산으로 치환되거나, 변형핵산을 더 포함하는 실시예 (e.g. 실시예 1 내지 12)는 변형핵산으로의 치환 없이 일부 아미노산에 약물만 컨쥬게이션된 비교예(비교예 2 내지 7)에 비해 적게는 2배 많게는 40배 정도로 낮은 IC50 값을 갖는 것을 확인하였다.
이를 통해 본 발명의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체가 대조 압타머 대비 우수한 항암효과를 나타낼 수 있다는 것을 의미한다.
3. 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 항암 효능 확인 - 동물 실험 ( in vivo )
IC50 측정 결과가 우수한 실시예 5(IO142) 및 실시예 9(IO176)를 선택하여 동물 실험을 수행하였다.
(1) 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체가 담지된 '패치형 콜라겐 약물 전달체'의 제조
동물 모델에 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 전달하기 위해, 고순도의 콜라겐(COLTRIX®Tendoregen, ㈜유바이오시스) 분산액(1.0%)과 시험 대상 샘플(e.g. 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, 젬시타빈 등)을 혼합하고 직경 1cm인 원형 실리콘 몰드에 부어 동결 건조하여 샘플이 콜라겐에 담지 된 “패치형 콜라겐 약물 전달체”를 제조하였다. 패치형 콜라겐 약물 전달체 1개 당 담지 된 샘플의 양은 아래 표 3와 같다. (표 3에서 서열번호 16은 5'-(Gem)(Gem)[TGG]4[TTG][TGG]5-3', 이때, Gem=젬시타빈이다.)
구분 콜라겐 패치에 담지되는 샘플 담지량(mg/patch)
비교실험예1 젬시타빈(Gemcitabine) 0.12
비교실험예2 IO101L(서열번호 16) 2.0
실험예1 실시예 9(서열번호 11의 5'-말단에 약물이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, IO176) 0.2
실험예2 실시예 5(서열번호 8의 U에 약물이 접합된 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체, IO142) 2.0
비교실험예3 - (샘플 무첨가, 콜라겐 단독) -
구체적으로 고순도의 콜라겐에 시험 대상 샘플(젬시타빈, IO101L(서열번호 16), 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체(실시예 5 및 실시예 9) 각각을 첨가한 후 multi-mixer(SLRM-3, MYLAB)를 이용하여 4℃에서 1시간 간 균일하게 혼합하였다. 그 후 콜라겐-약물 혼합물을 직경 1cm 원통형 실리콘 몰드에 일정량 분주하였다. 콜라겐-약물 혼합물이 분주된 원통형 실리콘 몰드를 -20℃에서 4 시간 이상 1차 동결하였다. 1차 동결이 완료된 혼합물을 원통형 실리콘 몰드에서 분리하여 멸균 디쉬나 멸균 플레이트에 옮긴 후, -80℃에서 2 시간 이상 2차 동결하였다. 동결 건조기의 콜드 트랩 온도가 -80℃가 되도록 예비 동결한 후, 동결 건조기에 혼합물을 넣어 16 시간 이상 동결건조 하였다. 동결 건조된 혼합물을 아크릴 플레이트를 이용하여 패치 형태로 압착한 후, 알루미늄 파우치에 넣어 밀봉하였다. 포장된 패치형 콜라겐 약물 전달체는 4℃에서 냉장 보관하였다.
이하에서는 전술한 방법으로 제조된 패치형 콜라겐 약물 전달체를 패치(patch) 또는 약물-로딩 콜라겐 패치로 표현하였다.
(2) 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체가 담지된 '패치형 콜라겐 약물 전달체'의 동물 모델에서의 안정성 및 유효성 평가
1) 췌장암 동소이식 동물모델(Pancreatic cancer orthotopic model) 구축 및 패치형 콜라겐 약물 전달체 이식
동결된 암세포주(BxPC-3-Luc)(아산생명과학연구원)를 해동하고, 그 후 37℃, 5% CO2 조건에서 10% fetal bovine serum(Biowest, Cat#. S1480)과 1% 항생제(gibco, Cat#. 15240062)가 공급된 RPMI1640 medium(Biowest, Cat#. L0498-100)에서 배양하였다. 해동한 세포를 1주일 동안 배양하여 형태, 생존율, 배가 시간(Doubling time)에 문제없는 것을 확인하였다.
마우스에 이식하기 위해 세포의 생존율이 95% 이상인 암세포를 준비하였다. 트립신을 사용하여 세포를 수확하고, RPMI 1640 media에 혼탁하여 5 X 105 cells/25 ㎕/mouse로 이식할 수 있도록 준비하였다. 1주 안정화된 6주령 BALB/c-nude 수컷 마우스(구입처: 자바이오, 한국)를 복강 마취하고, 배 부위를 절개한 후 췌장을 꺼내어 5 X 105 cells/25 ㎕의 세포를 이식하였다. 2주 후 루시퍼라아제 이미징(luciferase imaging)을 통해 종양 형성을 확인하였다. 그 후 아래 표 4와 같이 마우스를 5마리씩 그룹화하였다. 위(1)에서 제조된 패치형 콜라겐 약물 전달체를 각 그룹의 마우스의 종양 부위에 삽입(Intra-Abdominal cavity insertion using surgery) 하였다. 본 시험에 포함된 모든 동물실험은 아산생명과학연구원 동물실험윤리위원회 (IACUC)의 승인을 받은 동물실험 계획서 [2022-14-058]에 따라 수행되었다.
그룹 투여 물질 투여경로 투여빈도
그룹 1 미처리 - -
그룹 2 젬시타빈 0.12mg-로딩 콜라겐 패치 패치삽입 1회
그룹 3 IO101L 2.0mg-로딩 콜라겐 패치 패치삽입 1회
그룹 4 실시예 9(IO176) 0.2mg- 로딩 콜라겐 패치 패치삽입 1회
그룹 5 실시예 5(IO142) 2.0mg- 로딩 콜라겐 패치 패치삽입 1회
2) IVIS imaging을 이용한 유효성 평가
패치형 콜라겐 약물 전달체를 삽입(insertion)한 후 주 3회 간격으로 4 주간 IVIS imaging 장비(Xenogen IVIS spectrum system; Caliper Life Science, Inc., Hopkinton, MA)를 이용하여 종양의 크기 변화를 관찰하고 체중을 확인하였다. 마우스 한 마리 당 150mg/kg 농도로 루시페린을 복강내 주사하고 7분 반응시킨 후에 IVIS(in vivo imaging system) 촬영을 진행하였다. 패치형 콜라겐 약물 전달체를 삽입한 후 28일 차에 IVIS imaging을 진행하고 체중 측정 종료 후 마우스를 희생하여 중요 장기(심장, 폐, 비장, 신장, 간), 췌장 및 종양 적출하여 장기 무게를 측정하고 사진을 촬영하였다. 패치형 콜라겐 약물 전달체 삽입 당일 마우스가 회복할 기간이 필요하기 때문에, 삽입 다음날 IVIS(in vivo imaging system) 촬영을 진행하였다.
2-1) IVIS 전신 이미지 (IVIS whole body image)
약물 미처리 마우스 그룹(그룹 1)과 IO101L 2.0mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹3)의 경우, 폐사한 마우스가 존재하였으며, 시간이 지날 수록 점차 발광(Luminescence)이 증가하였다. 실시예 9(IO176) 0.2mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 4), 실시예 5(IO142) 2.0mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 5)의 경우 형광 변화가 감소하였다. 발광(Luminescence) 증가는 암의 증식을 의미하고, 발광의 감소는 종양 억제 효과가 나타나는 것을 의미한다 (도 1 내지 도 5 참조).
2-2) 체중 변화
패치형 콜라겐 약물 전달체를 삽입한 후, 주 3회 간격으로 4 주간 마우스 체중을 측정하였으며, 날짜 별 측정 결과에서 0일차 체중을 나눠 0일차에 대비 마우스 체중의 비율 변화를 관찰하였다. 패치형 콜라겐 약물 전달체를 삽입한 모든 마우스 그룹(그룹 2 내지 그룹 5)에서 시험물질 삽입 후 2~6일 간 체중이 감소하다 점차 체중이 회복되는 것을 확인하였다(도 6 참조).
2-3) 적출 장기 촬영 및 무게 측정
패치형 콜라겐 약물 전달체 삽입한 후 28일차에 마우스를 희생하여 주요 장기(심장, 폐, 비장, 신장, 간), 췌장 및 종양을 적출하여 사진 촬영하고 장기 무게를 측정하였다.
위 2-2)의 실험 결과처럼 실시예 9(IO176) 0.2mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 4)의 종양의 크기가 가장 작았으며, 전이된 종양이 관찰되지 않았다. 또한, 실시예 9(IO176) 0.2mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 4)의 종양 무게가 가장 낮았으며, 실시예 5(IO142) 2.0mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 5), IO101L 2.0mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 3)의 순서로 낮은 무게가 관찰되었다(도 7A 내지 도 7E, 및 도 8 참조).
IVIS 전신 이미지, 종양 크기 및 무게 측정 결과를 통해 실시예 9(IO176) 0.2mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 4) 및 실시예 5(IO142) 2.0mg-로딩 콜라겐 패치가 삽입된 마우스 그룹(그룹 5)에서는 마우스가 폐사되지 않고 우수한 종양 억제효과가 확인되었다. 더불어, 시험군 마우스들을 해부한 결과 투여한 약물 로딩 콜라겐 패치가 관찰되지 않았음으로 보아 모두 녹아 흡수된 것으로 사료된다.
4. 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체의 약동학 평가 - 랫드 이용
랫드에 실시예 9(IO176) 40 mg/kg, 실시예 9에 포함된 모노메틸 오리스타틴 E(Monomethyl auristatin E, 이하 MMAE로 표기)와 동량의 MMAE(MedChemExpress, Cat#. HY-15162) 4 mg/kg, 및 실시예 9에 포함된 젬시타빈(Gemcitabine)과 동량의 젬시타빈(BetaPharma(shanghai) Co.,Ltd, Cat#. 86-39157) 2 mg/kg를 각각 경정맥 투여한 후, i) MMAE의 약동학 계수와 ii) 젬시타빈 및 젬시타빈의 비활성 대사체인 dFdU의 약동학 계수를 산출하고 비교하였다.
구체적으로, Sprague-Dawley 웅성 랫드(8주령, 영바이오 구입)를 가톨릭대학교 성심교정 동물실에서 1주간 순화시킨 후, 약동학 실험을 진행하였다. 랫드를 흡입 마취제인 이소플루레인(isoflurane)으로 유도 마취시켰으며 PE50 (polyethylene tubing, Clay Adams, Becton Dickinson, NJ, USA)을 경동맥(혈액 채취용)과 경정맥(약물 투여용)에 삽입하여 봉합사로 봉합하고 그 끝부분을 목뒤로 고정하였다. 수술 중에는 에테르 (ether)를 이용하여 마취를 유지하였으며, 헤파린(20 units/mL)이 함유된 생리식염수를 약 0.5 mL를 주입하여 캐뉼라(cannula)에 혈액이 응고하는 것을 방지하였다. 수술이 끝난 뒤 랫드를 각각 대사 케이지(metabolic cage)에 넣고 마취제로부터 완전히 회복되게 한 후 (4-5 시간), 실시예 9(IO176) 단독 투여(n=6), MMAE 단독 투여(n=7), 및 gemcitabine 단독 투여(n=6) 세 군으로 나누어 각 시료(실시예 9, MMAE 단독, 젬시타빈 단독)를 투여하였다. 실시예 9, MMAE 및 gemcitabine를 모두 생리 식염수에 녹여 체중 kg 당 2 mL로 녹여서 각각 40 mg/kg, 4 mg/kg, 2 mg/kg 용량으로 경정맥에 투여하였다. 채혈 시 0.2 mL 혈액 내 gemcitabine이 시티딘탈아미노효소(cytidine deaminase)에 의해 대사체로 변하는 것을 방지하기 위해 시티딘탈아미노효소 저해제인 테트라하이드로우리딘(tetrahydrouridine, 이하 THU로 표기)를 10 mg/mL의 농도로 증류수에 녹인 용액 2 μL을 미리 넣은 차광 에펜도르프 튜브를 준비하였다. 세 군에서 각 약물 투여 직전 (0 분), 1, 5, 10, 15, 30분, 1시간, 2시간, 4시간 6시간, 8시간, 10시간, 20시간, 24시간 및 30시간에 경동맥을 통해서 미리 냉동 보관하였던 차광 에펜도르프 튜브에 각각 혈액 0.2 mL를 채취하였다. 채혈이 끝난 직후, ice-bath에 보관하였던 혈장을 4℃에서 즉시 원심분리 하여 혈장을 차광 에펜도르프 튜브에 100 μL을 분주하였다. 분주한 혈장을 즉시 ice-bath에 보관하고 LC-MS/MS 분석할 때까지 -80℃에 보관하였다. 경동맥 채혈 후 CO2 가스 챔버에서 랫드를 안락사시켰다.
(1) 혈장 중 농도 분석 방법
1) MMAE의 농도 분석 방법
시료를 단백질 침전법으로 전처리 한 후, 가톨릭대학교 약학대학 약물학/약물동태학 실험실에서 확립한 액체 크로마토그래피-직렬 질량 분석법(Liquid chromatography-tandem mass spectrometry, 이하 LC-MS/MS로 표기)을 이용하여 MMAE의 혈장 중 농도를 분석하였다. 모든 분석 과정은 차광조건에서 실시하였다.
① LC-MS/MS 조건
-분석기기: Agilent 1290 series HPLC, Qtrap 5500 LC-MS/MS
-검 출 기: Tandem mass spectrometer (triple quadrouple type)
Ion source: Electrospray ionization (positive ion mode)
Desolvation temperature: 500℃
Nebulizing gas: Nitrogen, Collision gas: Nitrogen
Quantitation: MRM (multiple reaction monitoring) mode
-고정상: Luna C18 (2.0 x 100 mm, 3 μm, Phenomenex, California, USA)
-고정상온도: 40℃
-이동상: 0.1% formic acid 함유한 증류수 (A)/0.1% formic acid 함유한 아세토니트릴 (B) (50:50, v/v) (아래 [표 5] 참조)
-유속: 0.3 mL/min
-Mass parameters: 아래 [표 6] 참조 (CE: Collision energy)
Time (min) Flow rate (mL/min) A (%) B (%)
0.00 0.3 50 50
2.00 0.3 50 50
분석물질 Parent ion
( m/z ) 		Product ion
( m/z ) 		Collision energy (eV) Retention time (분)
MMAE 1 (정량용) 718.456 685.5 39 0.712
MMAE 2 (정성용) 718.456 152.1 39 0.712
Verapamil(IS) 455.248 165.1 35 0.725
② 검량선 작성
MMME 표준품을 아세토니트릴에 녹여 1 mg/mL인 저장용액을 제조하여 냉동 보관하고, 저장용액을 아세토니트릴로 희석하여 각 농도 0.250, 0.500, 2.50, 5.00, 12.5, 50.0 μg/mL가 되도록 작업용액을 만들어 냉장고에 보관하였다. 내부표준물질 (Internal Standard, IS)인 베라파밀(verapamil)을 아세토니트릴에 녹여 200 ng/mL 인 작업용액을 제조하였다. MMAE의 작업용액을 THU가 포함된 랫드 공혈장에 첨가하여 MMAE의 혈장 중 농도가 각각 10, 20, 100, 200, 500, 2000 ng/mL가 되도록 표준 혈장 시료를 각각 만들었다.
③ 혈장 시료 처리 방법
25 μL의 랫드 혈장에 아세토니트릴에 녹인 내부표준물질인 베라파밀(200 ng/mL) 200 μL를 넣고 10 분간 볼텍스(vortex) 후 14,000 rpm으로 4℃에서 5 분간 원심분리 하였다. 그 후 상층액 190 μL를 취하여 0.2 μm 시린지 필터(Syringe filter)를 거쳐 LC-MS/MS 바이알에 옮겨 담은 후 2 μL를 주입하여 LC-MS/MS로 분석하였다.
④ 분석의 적합성 판정
분석 과정의 적합성을 판단하기 위해서 시료 처리 중에 매 분석 시료 배치마다 검량선 작성용 시료 분석 후 분석 적합성 시료 (MMAE 최저정량한계: LLoQ, 10 ng/mL, 저농도: LoQC, 25 ng/mL, 중농도: MiQC, 250 ng/mL, 고농도: HiQC, 1500 ng/mL)를 2 회씩 분석하였다. 적합성 시료 6 개 중 최소 67% (예: 6 개 중 4개)가 이론값의 ±15%이내이고, 동일농도에서 50%이상이 이론값의 ±15%이내인지 확인하였다.
⑤ 혈장 약물 농도 계산
수득한 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 MMAE의 피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 MMAE의 농도를 계산하였다.
2) 젬시타빈 및 dFdU의 농도 분석 방법
① LC-MS/MS 조건
-분석기기: Agilent 1290 series HPLC, Qtrap 5500 LC-MS/MS
-검 출 기: Tandem mass spectrometer (triple quadrouple type)
Ion source: Electrospray ionization (positive ion mode)
Desolvation temperature: 500℃
Nebulizing gas: Nitrogen, Collision gas: Nitrogen
Quantitation: MRM (multiple reaction monitoring) mode
-고정상: Hypersil gold C18 column (2.1 × 100 mm, 1.9 μm, Thermo
Fisher Scientific Inc., Boston, USA)
-고정상온도: 40℃
-이동상: 각각 0.1% formic acid 함유한 증류수 (A)와
아세토니트릴 (B) (95:5, v/v) (아래 [표 7] 참조)
-유속: 0.22 mL/min
-Mass parameters: 아래 [표 8] 참조 (CE: Collision energy)
Time (min) Flow rate (mL/min) A (%) B (%)
0.00 0.22 95 5
5.00 0.22 95 5
분석물질 Parent ion
( m/z ) 		Product ion
( m/z ) 		Collision energy (eV) Retention time (분)
Gemcitabine 264.311 112.0 15 1.90
dFdU 265.000 113.0 15 3.52
5'-Deoxy-5-fluorocytidine (IS) 246.100 130.4 20 3.15
② 검량선 작성
Gemcitabine 및 dFdU 각 표준품을 증류수에 녹여 400 μg/mL, 700 μg/mL인 저장용액을 제조하여 냉동 보관하였고, 저장용액을 3차 증류수로 희석하여 각 농도 0.200, 0.400, 0.800, 2.00, 10.0, 40.0 μg/mL가 되도록 작업용액을 만들어 냉장고에 보관하였다. 내부표준물질 (IS)인 5'-Deoxy-5-fluorocytidine은 아세토니트릴에 녹여 50 ng/mL 인 작업 용액을 제조하였다. Gemcitabine과 dFdU의 작업용액을 THU가 포함된 랫드의 공혈장에 첨가하여 gemcitabine와 dFdU의 혈장 중 농도가 각각 10, 20, 40, 100, 500, 2000 ng/mL가 되도록 표준 혈장 시료를 각각 만들었다.
③ 혈장 시료 처리 방법
20 μL의 랫드 혈장에 아세토니트릴에 녹인 내부표준물질 5'-Deoxy-5-fluorocytidine (50 ng/mL) 150 μL를 넣고 10 분간 볼텍스(vortex) 후 14,000 rpm으로 4℃에서 5 분간 원심분리 하였다. 그 후 상층액 150 μL를 취하여 다른 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 후 질소기류하에서 유기용매를 건조시켰다. 건조시킨 에펜도르프 튜브에 3차 증류수 100 μL를 넣어 재용해하였다. 그 후 10 분간 볼텍스(vortex)하고 14,000 rpm에서 -4℃에서 5 분간 원심분리한 후 상층액 90 μL를 취한다. 그 후 상층액 90 μL를 취하여 다른 에펜도르프 튜브에 옮겨 담은 후 14,000 rpm에서 -4℃에서 5 분간 원심분리하였다. 상층액 80 μL를 취하여 LC-MS/MS 바이알에 옮겨 담은 후 5 μL를 주입하여 LC-MS/MS로 분석하였다.
④ 분석의 적합성 판정
분석 과정의 적합성을 판단하기 위해서 시료 처리 중에 매 분석 시료 배치마다 검량선 작성용 시료 분석 후 분석 적합성 시료 (gemcitabine 및 dFdU 각각 최저정량한계: LLoQ, 10 ng/mL, 저농도: LoQC, 30 ng/mL, 중농도: MiQC, 300 ng/mL, 고농도: HiQC, 900 ng/mL)를 2 회씩 분석하였다. 적합성 시료 6 개 중 최소 67% (예: 6 개 중 4개)가 이론값의 ±15%이내이고, 동일농도에서 50%이상이 이론값의 ±15%이내인지 확인하였다.
⑤ 혈장 약물 농도 계산
수득한 크로마토그램으로부터 내부표준물질의 피크 면적에 대한 gemcitabine 및 dFdU 의 피크 면적비를 구하여 미리 작성한 검량선으로부터 혈장 중 gemcitabine 및 dFdU 의 농도를 계산하였다.
3) 약동학 파라미터 계산법 및 통계처리
MMAE, gemcitabine 및 dFdU의 약동학 파라미터는 Phoenix WinnonlinTM (6.4 version, Certara) 프로그램을 이용하여 non-compartment analysis에 의해 분석하였다. 혈장농도-시간 곡선 하 면적 (AUCt)값은 약물 투여 후 최종 정량시점까지의 혈장 농도-시간 곡선들로부터 log-linear 사다리꼴 공식에 의해 구하였다. 무한시간까지의 혈장 농도-시간 곡선 하 면적 (AUCinf)값은 아래의 [수학식 1]을 이용하여 구하였다. 말단소실속도상수 (γZ)와 반감기 (t1/2)는 혈장농도 추이의 소실상의 기울기로부터 구하였다.
[수학식 1]
AUCinf = AUCt + Ct/γZ (Ct: 최종정량농도, γZ: 말단소실속도상수)
각 두 군의 약동학 파라미터 비교를 위한 통계처리는 t-test로 실시하였다.
(2) 혈장 중 농도 분석 결과
1) MMAE의 농도 분석 결과
랫드에 실시예 9(IO176) 40 mg/kg 정맥 투여 및 동량의 MMAE 단독 4 mg/kg 정맥 투여 시, i) MMAE의 혈장 중 농도를 도 9에 나타내었고, ii) MMAE의 약동학 계수를 아래 [표 9]에 정리하였다.
MMAE 4 mg/kg를 정맥 투여 시 실험한 모든 랫드 7마리는 투약 후 480분~600분에 사망하였다. 그러나, 실시예 9(IO176) 40 mg/kg 정맥 투여군에서는 투여 후 1분째 MMAE의 혈장 내 농도가 605±165 ng/mL로 MMAE 4 mg/kg 단독 정맥 투여군(29640±7190 ng/mL)보다 약 50배 낮게 검출되었으며, 투여 후 MMAE의 혈장 내 농도가 60분~120분째부터 천천히 증가하여 채혈 마지막 시간인 1800분째까지 증가하였고 실험한 랫드 모두 죽지 않고 살아 있었다(도 9 참조). 투여 후 초기 시간인 120분째까지의 MMAE의 AUC값은 MMAE 4 mg/kg 단독 정맥 투여군의 경우 71.7±9.61 μg min/mL로, 실시예 9 (IO176) 40 mg/kg 정맥 투여군(7.39±1.05 μg min/mL) 보다 약 9.70배 높게 계산되었다. 그러나 채혈 마지막 시간인 1800분째까지의 AUC값은 오히려 실시예 9(IO176) 40 mg/kg 정맥 투여군이 약 1.55배 높게 나타났다(아래 표 9 참조).
실시예 9(IO176)에 컨쥬게이션된 MMAE가 혈장으로 방출되는 속도가 매우 느리기 때문에, 실시예 9 가 통계적으로 유의하게 낮은 혈장 MMAE농도를 나타낼 수 있고, 이로 인해 MMAE의 세포 독성이 감소되어 실험한 랫드에서 사망 개체가 나타나지 않았을 것으로 예측된다.
PK parameters M-A-G (n=6) MMAE (n=7) P
AUCt (μg min/mL) 198±51.4 128±16.1 0.0056
AUC0-120 (μg min/mL) 7.39±1.05 71.7±9.61 0.0000000005
2) 젬시타빈 및 dFdU의 농도 분석 결과
실시예 9(IO176) 40 mg/kg 정맥 투여 및 동량의 gemcitabine 단독 2 mg/kg 정맥 투여 시, i) gemcitabine 및 그 대사체 dFdU의 혈장 중 농도를 도 10에 나타내었고, ii) gemcitabine 및 그 대사체 dFdU의 약동학 계수를 아래 [표 10]에 정리하였다.
Gemcitabine에 대한 분석 결과는 아래와 같다(아래 표 10 참조). 실시예 9(IO176) 투여 군은 동량의 gemcitabine 단독 정맥 투여군보다 통계적으로 유의하게 높은 gemcitabine 혈장 농도를 나타내었다[도 10 왼쪽 그림]. 그 결과 gemcitabine의 AUCt 값이 각각 610±52.2 μg min/mL 및 438±124 μg min/mL로 약 1.39배 높게 계산되었다. 또한, 실시예 9(IO176) 투여 군에서 gemcitabine의 혈장 반감기(t1/2)가 통계적으로 유의하게 증가된 것을 확인하였다. 이를 통해 IO176 (실시예 9) 투여군에서 gemcitabine의 초기 방출 속도가 높아 gemcitabine의 혈장 농도가 높게 지속되나 지속적으로 방출되어 혈장 반감기가 증가되었을 것이라 예측하였다.
Gemcitabine의 비활성대사체인 dFdU에 대한 분석 결과는 아래와 같다 (아래 표 10 참조). 실시예 9(IO176) 투여 군에서 혈장 농도가 약간 높은 경향을 나타내었으나 AUCt 값은 각각 111±22.3 μg min/mL 및 79.8±44.2 μg min/mL로 통계적 유의성은 보이지 않았다. dFdU의 Cmax(최고 혈장 농도)은 실시예 9(IO176) 투여 군에서 통계적으로 유의하게 더 높은 값을 나타내었다. 그러나 두 군에서 비활성대사체 대사변환율 (AUCt, dFdU/ AUCt, gemcitabine)은 각각 0.182±0.0263 및 0.170±0.0621로 통계적인 유의성을 보이지 않았다. 이를 통해, 실시예 9(IO176)로부터 혈장으로 유리된 gemcitabine은 비활성 대새체 변환율에 영향을 주지 않음을 알 수 있다.
하기 표 10에서 AUCt은 0분부터 마지막 채혈시간까지의 곡선 하 면적, t1/2은 terminal half-life (혈장 소실 반감기), CL은 total body clearance, Vdss는 체내 분포 용적, MRT은 약물이 체내에 머무르는 평균시간 (mean residence time), Tmax는 median (ranges)이며, Metabolic conversion ratio값은 dFdU AUCt값을 젬시타빈 AUCt값으로 나누어 계산한 값이다.
Figure PCTKR2022017440-appb-img-000040
[이 발명을 지원한 국가연구개발사업]
[과제고유번호] 1425162626
[과제번호] S3004867
[부처명] 중소벤처기업부
[과제관리(전문)기관명] 중소기업기술정보진흥원
[연구사업명] 중소기업기술혁신개발
[연구과제명] 다약제 결합 압타머를 이용한 신규 항암제 개발기술
[기여율] 1/1
[과제수행기관명] 인터올리고 주식회사
[연구기간] 20200921 ~ 20220920

Claims (13)

  1. 하기 화학식 1로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 포함된 디옥시우리딘(dU)에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체:
    [화학식 1]
    5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5Y1X6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
    (상기 화학식 1에서,
    X1 내지 X3 및 X7 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
    Y1은 디옥시구아노신(dG), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
    X4 내지 X6 은 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU)또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이되, 상기 X4 내지 X6 중 적어도 하나는 디옥시우리딘(dU)이고;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
    N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
    a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9 가 모두 티미딘(T)이고 상기 Y1 이 디옥시구아노신(dG)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
    b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022017440-appb-img-000041
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2022017440-appb-img-000042
    (상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
    R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
    R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
    R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고, 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
  2. 청구항 1에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  3. 청구항 1에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 모노메틸 오리스타틴 D(MMAD), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(Tubulysin analog), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), 오리스타틴 E(auristatin E), 오리스타틴 F(auristatin F) 및 네모루비신(Nemorubicin)로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  4. 청구항1에 있어서, 상기 약물과 상기 변형 올리고뉴클레오티드에 포함된 디옥시우리딘(dU)은 L1과 L2가 결합된 링커(L)로 컨쥬게이션되고;
    상기 L1은 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택되어 탈보호과정을 통해 얻어진, 아크릴아마이드(acrylamide)-C2-NH2, C12-NH2, C3-NH2, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-프로파나마이드(propanamide)-SH, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-NH2, C6-NH2, C6-SH 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-NH2, C6-NH2, C6-SH 그룹으로부터 선택되며,
    상기 L2는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), 숙신산(succinic acid), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택된 것인, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  5. 청구항 1에 있어서, 상기 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 4 내지 서열번호 10에서 선택된 서열로 이루어지는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  6. 청구항 1 내지 5 중 어느 한 항의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  7. 청구항 6에 있어서, 상기 암은 백혈병, 림프종, 유방암, 간암, 위암, 난소암, 자궁경부암종, 신경교종암, 대장암, 폐암, 췌장암, 전립선암, 간암, 위선암, 자궁암, 방광암, 갑상선암, 난소암, 흑색종 및 자궁경부암으로 이루어진 군으로부터 선택되는, 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
  8. 하기 화학식 2로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드; 및 상기 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나에 컨쥬게이션된 약물;을 포함하는 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체:
    [화학식 2]
    5'-(M1)a-(N1)b-GGX1GGX2GGX3GGX4X5GX6GGX7GGX8GGX9GG-(N2)c-(M2)d-3'
    (상기 화학식 2에서,
    X1 내지 X9는 각각 독립적으로 티미딘(T), 또는 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이고;
    M1 및 M2는 각각 독립적으로 하기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산이며;
    N1 및 N2는 각각 독립적으로 티미딘(T), 디옥시우리딘(dU), 디옥시시티딘(dC), 또는 디옥시구아노신(dG)이며;
    a 및 d는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수이되, 상기 X1 내지 X9가 모두 티미딘(T)인 경우 상기 a 및 d는 동시에 0이 아니고;
    b 및 c는 각각 독립적으로 0 내지 10의 정수임),
    [화학식 3]
    Figure PCTKR2022017440-appb-img-000043
    [화학식 4]
    Figure PCTKR2022017440-appb-img-000044
    (상기 화학식 3 또는 화학식 4에서,
    R1은 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
    R2는 수소, 할로겐 또는 하이드록시기이고;
    R3은 수소, 할로겐, C1-C6의 알킬기, C1-C6의 할로알킬기, C2-C6의 알케닐기 또는 C2-C6의 할로알케닐기임 (이 때, 상기 R1이 수소 또는 하이드록시기이고, 상기 R2가 수소이고 상기 R3가 수소 또는 메틸인 경우는 제외함)).
  9. 청구항 8에 있어서, 상기 화학식 3 또는 화학식 4로 표시되는 변형핵산은 5-플루오로데옥시우리딘, 5-플루오로우리딘, 5-플루오로데옥시시티딘, 5-플루오로시티딘, 5-아이오도데옥시우리딘, 5-아이오도우리딘, 5-아이오도데옥시시티딘, 5-아이오도시티딘, 시토신 아라비노사이드, 2′,2′-다이플루오로-2'-데옥시시티딘 및 브로모비닐데옥시우리딘으로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  10. 청구항 8에 있어서, 상기 약물은 파클리탁셀, 모노메틸 오리스타틴 E(monomethyl auristatin E), 모노메틸 오리스타틴 F(monomethyl auristatin F), 모노메틸 오리스타틴 D(MMAD), 시타라빈, 젬시타빈, 메이탄시네, DM1(mertansine, 메르탄신), DM4, 칼리키아미신 및 그 유도체, 독소루비신, 듀오카르마이신 및 그 유도체, 피롤로벤조디아제핀(PBD), SN-38, α-아만틴, 투불루신 유사체(Tubulysin analog), 사이클로포스파아마이드(cyclophosphamide), 메클로레타민(mecholrethamine), 우라무스틴(uramustine), 멜파란(melphalan), 클로라부실(chlorambucil), 이포스파미드(ifosfamide), 벤다무스틴(bendamustine), 카르무스틴(carmustine), 로무스틴(lomustine), 스트렙토조신(streptozocin), 부설판(busulfan), 다카바진(dacarbazine), 테모졸로마이드(temozolomide), 티오테파(thiotepa), 알트레타민(altretamine), 듀오카르마이신(duocarmycin), 시스플라틴(cisplatin), 카르보플라틴(carboplatin), 네다플라틴(nedaplatin), 옥사리플라틴(oxaliplatin), 사트라플라틴(satraplatin), 트리플라틴 트라나이트레이트(triplatin tetranitrate), 5-플루오로우라실(5-fluorouracil), 6-머캅토퓨린(6-mercaptopurine), 카페시타빈(capecitabine), 클라드리빈(cladribine), 클로파라빈(clofarabine), 시스타르빈(cystarbine), 플록스유리딘(floxuridine), 플루다라빈(fludarabine), 젬시타빈(gemcitabine), 하이드록시우레아(hydroxyurea), 메토트렉세이트(methotrexate), 페메트렉세드(pemetrexed), 펜토스타틴(pentostatin), 티오구아닌(thioguanine), 캠토테신(camptothecin), 토포테칸(topotecan), 이리노테칸(irinotecan), 에토포사이드(etoposide), 테니포시드(teniposide), 미토산트론(mitoxantrone), 파클리탁셀(paclitaxel), 도세탁셀(docetaxel), 이자베필론(izabepilone), 빈블라스틴(vinblastine), 빈크리스틴(vincristine), 빈데신(vindesine), 비노렐빈(vinorelbine), 에스트라머스틴(estramustine), 메이탄신(maytansine), 오리스타틴 E(auristatin E), 오리스타틴 F(auristatin F) 및 네모루비신(Nemorubicin)로 이루어진 군에서 선택되는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  11. 청구항 8에 있어서, 상기 약물과 상기 화학식 2로 표시되는 변형 올리고뉴클레오티드의 5' 말단 또는 3' 말단 중 적어도 하나는 L1과 L2가 결합된 링커(L)로 컨쥬게이션되고;
    상기 L1은 5'-티올-개질제 C6, 티올-개질제 C6 S-S, 디티올 세리놀, PC 아미노-개질제, 5'-아미노-개질제 C3, 5'-아미노-개질제 C6, 5'-아미노-개질제 C12, 5'-아미노-개질제 TEG, 아미노-개질제 C2 dT, 아미노-개질제 C6 dT, S-Bz- 티올-개질제 C6-dT, 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드 로 이루어지는 군에서 선택되어 탈보호과정을 통해 얻어진, 아크릴아마이드(acrylamide)-C2-NH2, C12-NH2, C3-NH2, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-프로파나마이드(propanamide)-SH, 아크릴아마이드(acrylamide)-C6-NH2, C6-NH2, C6-SH 그룹으로부터 선택되며,
    상기 L2는 말레이미도카프로일-발린-시트룰린-p-아미노벤조일옥시카르보닐(MC-Val-Cit-PAB), 숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸) 시클로헥산-1-카르복실래이트(SMCC), 숙신산(succinic acid), 히드라존, 펩티드, 디설파이드, 티오에테르, 발린-시트룰린, N-말레이미도메틸시클로헥산-1-카르복실래이트 (MCC), 말레이미도카프로일, 머캅토아세트아미도카프로일, N-숙신이미딜 4-(2-피리딜디티오) 펜타노에이트(SPP), N-숙신이미딜 4-(2-피리딜티오) 펜타노에이트(SPDB), 포스포디에스테르 결합, 및 뉴클레오타이드로 이루어지는 군에서 선택된 것인, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  12. 청구항 8에 있어서, 상기 변형 올리고뉴클레오티드는 서열번호 11 또는 서열번호 12에서 선택된 서열로 이루어지는, 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체.
  13. 청구항 8 내지 12 중 어느 한 항의 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체를 포함하는 암의 예방 또는 치료용 약학 조성물.
PCT/KR2022/017440 2021-12-16 2022-11-08 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도 WO2023113243A1 (ko)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US202163290155P 2021-12-16 2021-12-16
US63/290,155 2021-12-16
KR1020220147564A KR20230092732A (ko) 2021-12-16 2022-11-08 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도
KR10-2022-0147564 2022-11-08

Publications (1)

Publication Number Publication Date
WO2023113243A1 true WO2023113243A1 (ko) 2023-06-22

Family

ID=86772979

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
PCT/KR2022/017440 WO2023113243A1 (ko) 2021-12-16 2022-11-08 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도

Country Status (1)

Country Link
WO (1) WO2023113243A1 (ko)

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018048815A1 (en) * 2016-09-06 2018-03-15 Nantibodyfc, Llc Methods of treating triple-negative breast cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
KR20180075133A (ko) * 2016-12-26 2018-07-04 이중환 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도
WO2020080912A1 (ko) * 2018-10-19 2020-04-23 인터올리고 주식회사 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2018048815A1 (en) * 2016-09-06 2018-03-15 Nantibodyfc, Llc Methods of treating triple-negative breast cancer using compositions of antibodies and carrier proteins
KR20180075133A (ko) * 2016-12-26 2018-07-04 이중환 압타머-약물 콘쥬게이트 및 그 용도
WO2020080912A1 (ko) * 2018-10-19 2020-04-23 인터올리고 주식회사 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
JORGE A. F., AVIÑÓ A., PAIS A. A. C. C., ERITJA R., FÀBREGA C.: "DNA-based nanoscaffolds as vehicles for 5-fluoro-2′-deoxyuridine oligomers in colorectal cancer therapy", NANOSCALE, ROYAL SOCIETY OF CHEMISTRY, UNITED KINGDOM, vol. 10, no. 15, 1 January 2018 (2018-01-01), United Kingdom , pages 7238 - 7249, XP093072179, ISSN: 2040-3364, DOI: 10.1039/C7NR08442K *
LOPES-NUNES JÉSSICA, OLIVEIRA PAULA, CRUZ CARLA: "G-Quadruplex-Based Drug Delivery Systems for Cancer Therapy", PHARMACEUTICALS, vol. 14, no. 7, 13 July 2021 (2021-07-13), pages 671, XP093072178, DOI: 10.3390/ph14070671 *

Similar Documents

Publication Publication Date Title
WO2017116205A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체의 지속형 결합체
WO2021162451A1 (ko) 담즙산 또는 이의 유도체, 바이구아나이드 계열 화합물 및 항바이러스제 중 2종 이상을 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2021246797A1 (ko) 항바이러스제 및 항우울제를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2018147641A1 (ko) 비펩티드성 중합체 링커 화합물, 그 링커 화합물을 포함하는 결합체, 및 이들의 제조방법
WO2019066586A1 (ko) 글루카곤 유사 펩타이드-2(glp-2) 유도체의 지속형 결합체
WO2020222461A1 (ko) 면역항암 보조제
WO2020153774A1 (ko) 항체-페이로드 컨쥬게이트 제조용 화합물, 이의 용도
WO2023113243A1 (ko) 변형 올리고뉴클레오티드-약물 접합체 및 이의 용도
WO2021201654A1 (ko) Glp-2 유도체 또는 이의 지속형 결합체를 포함하는 방사선요법, 화학요법, 또는 이들의 조합으로 유발된 점막염의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2019172605A1 (ko) 선택적으로 기능화된 타이로신을 가지는 생체 물질의 제조방법, 선택적으로 기능화된 타이로신을 가지는 생체 물질 및 이를 유효성분으로 함유하는 약학적 조성물
WO2022211508A1 (ko) 인간 cldn18.2에 대한 항체를 포함하는 항체 약물 접합체 및 이의 용도
WO2020080912A1 (ko) 치료 효능을 개선한 핵산 변형체 및 이를 포함하는 항암용 약학 조성물
WO2021194228A1 (ko) 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2022015115A1 (ko) 3중 작용성 지속형 결합체 또는 3중 작용제를 포함하는 조합물의 치료학적 용도
WO2021215801A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 또는 이의 결합체를 포함하는 고지혈증 예방 또는 치료용 약학적 조성물 및 예방 또는 치료 방법
WO2021066573A1 (ko) 신규 화합물 및 이의 자가면역질환 치료 용도
WO2020263063A1 (ko) 글루카곤, glp-1 및 gip 수용체 모두에 활성을 갖는 삼중 활성체 또는 이의 결합체의 간 질환에 대한 치료적 용도
WO2021100897A1 (ko) 바이구아나이드 계열, 및 페로센 또는 페로센 유도체를 유효성분으로 함유하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
WO2017010790A1 (ko) 나노입자-유리체 기반 단백질 복합체를 유효성분으로 포함하는 혈관신생억제용 조성물 및 이의 용도
WO2023163536A1 (ko) 신규 항체 약물 접합체
WO2024025396A1 (ko) 신규 오리스타틴 전구약물
WO2023068894A1 (ko) 자연살해 세포의 면역 항암기능 증진을 위한 표면 개질용 고분자 화합물
WO2019132610A1 (ko) Baf57 재조합 융합 단백질 및 이의 용도
WO2023140691A1 (ko) 5-아자-4'-티오-2'-데옥시사이티딘을 함유하는 경구용 제형 및 이의 제조방법
WO2021235913A1 (ko) Glp-2의 지속형 결합체의 액상 제제

Legal Events

Date Code Title Description
121 Ep: the epo has been informed by wipo that ep was designated in this application

Ref document number: 22907714

Country of ref document: EP

Kind code of ref document: A1