CN114276390B - 一种用于抗肿瘤药物递送的二硫代氨基甲酸酯衍生物纳米药物及其制备方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用于抗肿瘤药物递送的二硫代氨基甲酸酯衍生物纳米药物及其制备方法与应用。本发明通过将氨基糖与脂肪酸混合，加入偶联催化剂活化反应基团使两者发生酯化反应生成脂肪酸酰化氨基糖，再利用脂肪酸上的卤素基团或双键与二乙基二硫代氨基甲酸钠的巯基发生反应，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物。本发明合成的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物可用于包合疏水性抗肿瘤药物，或利用糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物自身与铜离子生成络合物，降低了细胞毒性，改善了抗肿瘤药物的副作用，在治疗癌症和抗肿瘤药物传递研究方面显示出良好的应用前景。

Description

一种用于抗肿瘤药物递送的二硫代氨基甲酸酯衍生物纳米药 物及其制备方法与应用

技术领域

本发明属于生物医学工程材料领域，特别涉及一种用于抗肿瘤药物递送的二硫代氨基甲酸酯衍生物纳米药物及其制备方法与应用。

背景技术

肺癌是世界上发病率最高、死亡率最高的癌症之一，预后效果较差。近年来靶向药物治疗已在临床上有着越来越重要的作用，但目前的临床治疗过程中，肿瘤几乎肯定会产生耐药性，降低靶向药物的疗效。此外，由于血管外渗差、血液循环短以及器官非特异性积聚等因素，临床中如何克服癌症生理屏障，有效地递送靶向治疗药物至肿瘤病灶仍然具有挑战性。

我们的目标是合成一系列含有不同长度脂肪链的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，这些衍生物可以原位自组装成具有低多分散指数的纳米粒子(NPs)，高效地包裹临床批准的靶向药物Ceritinib。在肿瘤微环境中，糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物可被谷胱甘肽分解形成铜络合物，提供了一种替代的靶向基因非依赖性肿瘤抑制途径，解决了药物抗性问题。同时，二硫代氨基甲酸酯残留物主要通过肾清除作用排出，从而将全身毒性降至最低，并改善了Ceritinib的副作用。综上所述，这种基于二硫代氨基甲酸的纳米胶束在检测和治疗肺部非小细胞肺癌方面具有良好的前途。

发明内容

本发明的首要目的在于克服现有技术的缺点与不足，提供一种糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物。

本发明的另一目的在于提供所述糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物在抗肿瘤药物递送方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：

一种糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，为将氨基糖与脂肪酸混合，加入偶联催化剂活化反应基团使两者发生酯化反应生成脂肪酸酰化氨基糖，再利用脂肪酸上的卤素基团或双键与二乙基二硫代氨基甲酸钠的巯基发生反应，合成得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物。

所述的氨基糖为氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖、氨基半乳糖和壳聚糖中的至少一种；优选为氨基葡萄糖盐酸盐。

所述的脂肪酸优选为6-溴己酸、十一烯酸和油酸中的至少一种。

所述的偶联催化剂为酰化催化剂；优选为1-羟基苯并三唑和苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HOBT/HBTU)，或1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐和N-羟基琥珀酰亚胺(EDC/NHS)，或二环己基碳二亚胺和4-二甲氨基吡啶(DCC/DMAP)，或三乙胺和N-羟基琥珀酰亚胺(三乙胺/NHS)。

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物优选为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC、D11SC和D18SC中的至少一种；其中，

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC通过如下方法合成得到：

(1)将氨基葡萄糖盐酸盐水溶液和6-溴己酸的乙醇溶液混合搅拌均匀，然后加入三乙胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBT)，在保护性气体氛围下进行反应，待反应结束后旋蒸除去乙醇，再用二氯甲烷萃取，取水相，冷冻干燥，得到6-溴己酰化氨基葡萄糖；

(2)将6-溴己酰化氨基葡萄糖和二乙基二硫代氨基甲酸钠加入水中搅拌溶解，然后加入三乙胺并升温至50±5℃进行反应，待反应结束后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC；

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D11SC和D18SC通过如下方法合成得到：

(3)将脂肪酸和N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)加入到乙醇中，搅拌溶解，得到溶液I；将1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于水中，得到溶液II；将溶液I和溶液II混合均匀，然后加入三乙胺进行反应，待反应结束后旋蒸除去乙醇，再用二氯甲烷萃取，取水相，冷冻干燥，得到酰化氨基葡萄糖(又称为脂肪化氨基葡萄糖)；其中，脂肪酸为十一烯酸或油酸；

(4)将二乙基二硫代氨基甲酸钠与3-氯-1-丙硫醇加入到丙酮中，升温至50±5℃进行回流反应，待反应结束后过滤除去不溶的盐，旋蒸得到3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯；

(5)将酰化氨基葡萄糖与3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯加入到丙酮中搅拌溶解，然后加入2,2-二羟甲基丙酸(DMAP)，在紫外条件下进行反应，待反应结束后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D11SC或D18SC。

步骤(1)中所述的氨基葡萄糖盐酸盐、6-溴己酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和1-羟基苯并三唑(HOBT)的摩尔比为1：(1～2)：(1～1.5)：(1～1.5)；优选为1:1.5:1.1:1.1。

步骤(1)中所述的氨基葡萄糖盐酸盐水溶液的浓度为0.005～0.15g/mL；优选为0.14g/mL。

步骤(1)中所述的6-溴己酸的乙醇溶液的浓度为0.01～0.3g/mL；优选为0.3g/mL。

步骤(1)、(2)和(3)中所述的水优选为蒸馏水。

步骤(1)、(2)和(3)中所述的三乙胺的用量为按其在反应体系的终浓度为体积百分比1％～5％添加计算；优选为按其在反应体系的终浓度为体积百分比2％添加计算。

步骤(1)中所述的保护性气体优选为氮气。

步骤(1)和(3)中所述的反应的时间为48h以上。

步骤(1)和(3)中所述的二氯甲烷萃取的次数优选为三次以上。

步骤(2)中所述的6-溴己酰化氨基葡萄糖和二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1：(1～2)；优选为1:1.25。

步骤(2)中所述的水的用量为每100毫升水配比6～8mmol 6-溴己酰化氨基葡萄糖计算。

步骤(2)中所述的反应的时间为24h以上。

步骤(3)中所述的氨基葡萄糖盐酸盐和脂肪酸的摩尔比为1：(1～2)；优选为1：1。

步骤(3)中所述的乙醇的用量为每10毫升乙醇配比1～2克脂肪酸计算；优选为按每10毫升乙醇配比1.7克脂肪酸计算。

步骤(3)中所述的搅拌的时间为4h以上。

步骤(3)中所述的水的用量为每10毫升水配比0.5～5克氨基葡萄糖盐酸盐计算；优选为按每10毫升水配比2.7克氨基葡萄糖盐酸盐计算。

步骤(4)中所述的3-氯-1-丙硫醇与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1：(1～2)；优选为1：1。

步骤(4)中所述的丙酮的用量为每100毫升丙酮配比1～5克3-氯-1-丙硫醇计算；优选为按每100毫升丙酮配比3.3克3-氯-1-丙硫醇计算。

步骤(4)中所述的回流反应的时间为15h以上。

步骤(5)中所述的酰化氨基葡萄糖和3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯的摩尔比为1：(1～2)；优选为1:1.5。

步骤(5)中所述的酰化氨基葡萄糖与2,2-二羟甲基丙酸(DMAP)的质量比为100：(0.1～5)；优选为100：1。

步骤(5)中所述的丙酮的用量为每100毫升丙酮配比1～5克酰化氨基葡萄糖计算。

步骤(5)中所述的反应的条件为：50～400W紫外条件下反应2～4h；优选为：320W紫外条件下反应4h。

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物的合成方法，在步骤(2)和(5)之后还包括将获得的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物进一步纯化的步骤，具体为：将糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶于甲醇，使用sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，以甲醇为洗脱液，最后旋蒸得到纯化后的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物。

所述的甲醇的用量为按每100毫升蒸馏水配比1～10克糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物计算；优选为按每100毫升蒸馏水配比10克糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物计算。

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物在制备药物载体或抗肿瘤药物中的应用。

一种抗肿瘤纳米药物，包括上述糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物。

所述的抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物；优选为色瑞替尼(Ceritinib)。

所述的抗肿瘤药物的给药方式包含静脉注射、腹腔注射、皮下注射、口服给药或肺部注射；优选为肺部注射。

所述的抗肿瘤纳米药物的制备方法，包括如下步骤：将上述糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物加入到水中，超声处理后在5～35℃条件下搅拌混合均匀，透析、过滤，冷冻干燥，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物的复合物，即所述的抗肿瘤纳米药物。

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物的摩尔比为1：(0.05～0.1)；优选为1：0.1。

所述的抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物；优选为色瑞替尼(Ceritinib)。

所述的超声处理的时间为30～60分钟。

所述的搅拌的时间为12～24小时。

所述的透析所用的透析液为水；优选为蒸馏水。

所述的透析为采用截留分子量为3000～14000的透析袋进行透析；优选为采用截留分子量为8000～14000的透析袋透析6～12小时。

一种抗肿瘤靶向纳米药物复合物，包含上述糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和葡萄糖酸铜。

所述的抗肿瘤靶向纳米药物复合物的给药方式包含静脉注射、腹腔注射、皮下注射、口服给药或肺部注射；优选为肺部注射。

所述的抗肿瘤靶向纳米药物复合物的制备方法，包括如下步骤：将上述糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶解于水中，然后加入葡萄糖酸铜，搅拌混合均匀，形成稳定的抗肿瘤靶向纳米药物复合物。

所述的搅拌的条件为：室温下搅拌2h以上。

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和葡萄糖酸铜的摩尔比为2：1。

所述的水的用量为按每毫升水加入5～10克糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物计算；优选为按每毫升水加入5克糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物计算。

本发明相对于现有技术具有如下的优点及效果：

(1)本发明提供了一种可用于传递抗肿瘤药物的纳米药物糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，为通过将氨基葡萄糖偶联一段脂肪烯酸，与含巯基的二硫代氨基甲酸改性物进行点击反应，合成糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，即本发明采用点击化学反应来制备糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，不仅反应条件温和、易于操作，而且高效(产率为30％～80％)、具有选择性，有望在生物医学领域发挥其潜在的应用价值。

(2)本发明中将糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物包合疏水性抗肿瘤药物，即利用疏水内核对疏水性抗肿瘤药物进行物理包埋，还可以同时利用糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物自身与铜离子生成络合物，提供了一种替代靶向药物通路的肿瘤抑制途径，解决了药物抗性问题，在肿瘤微环境中，糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物可被分解形成铜络合物杀伤肿瘤组织，同时释放包埋的药物进一步杀伤肿瘤组织，可实现两种不同机制的抗肿瘤应用。

(3)本发明选用可生物降解的氨基葡萄糖作为主要原材料，有利于降低产物细胞毒性，而二硫代氨基甲酸残留物主要通过肾清除作用排出，从而将全身毒性降至最低，改善了药物副作用。

(4)本发明将二硫代氨基甲酸作为疏水链连接到脂肪化的氨基葡萄糖上，一方面改善了二硫代氨基甲酸酯的水溶性，另一方面其含有疏水内核还赋予糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物包合疏水性抗肿瘤药物能力。

(5)本发明中的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物生物相容性好，既可以提供一种替代的ALK非依赖性肿瘤抑制途径，解决了ALKi抗性问题，又含有可负载疏水性抗肿瘤药物的疏水内核，在治疗癌症和抗肿瘤药物传递研究方面显示出良好的应用前景。

附图说明

图1为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物的傅立叶变换红外光谱图。

图2为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物的体外药物释放曲线图。

图3为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Ceritinib复合物平均粒径图；其中，a为复合物D6SC/Ceritinib；b为复合物D11SC/Ceritinib；c为复合物D18SC/Ceritinib。

图4为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Ceritinib复合物的透射电镜照片图；其中，a为复合物D6SC/Ceritinib；b为复合物D11SC/Ceritinib；c为复合物D18SC/Ceritinib。

图5为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物的细胞摄取图。

图6为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物对内吞抑制剂影响图。

图7为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物与巨胞饮内吞标记物FITC-Dextran激光共聚焦照片图。

图8为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与Ceritinib和铜离子的复合物抑制肿瘤细胞增殖MTT图。

图9为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与Ceritinib和铜离子的复合物抑制肿瘤细胞侵袭图。

图10为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与Ceritinib和铜离子的复合物抑制肿瘤细胞迁移图。

图11为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与Ceritinib和铜离子的复合物抑制肿瘤细胞划痕修复照片图。

图12为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与Ceritinib和铜离子的复合物抑制肿瘤细胞成球能力照片图。

图13为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物及其与铜离子的复合物的蛋白免疫印迹图。

图14为尾静脉注射二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物后不同肺癌小鼠模型的器官荧光照片图；其中，a和b为原位种植的肺癌小鼠模型；c和d为尾静脉注射种植的肺癌小鼠模型。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。下列实施例中未注明具体实验条件的试验方法，通常按照常规实验条件或按照制造厂所建议的实验条件。除非特别说明，本发明所用试剂和原材料均可通过市售获得。

本发明中所述的室温为5～35℃；优选为25～30℃。

实施例1

(1)2.156g氨基葡萄糖盐酸盐溶解于15mL蒸馏水中，另取2.925g 6-溴己酸溶于10mL乙醇中，将两种溶液混合后剧烈搅拌，并加入0.8mL三乙胺，然后在体系充分共混后加入3.79g苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐(HBTU)和1.35g 1-羟基苯并三唑(HOBT)，在氮气保护下室温反应48h，待反应结束后，将体系旋蒸除去乙醇，用二氯甲烷萃取三遍，取水相，冷冻干燥，得到6-溴己酰化氨基葡萄糖，产率84％。

(2)将8mmol的6-溴己酰化氨基葡萄糖与10mmol的二乙基二硫代氨基甲酸钠(本实验所用二乙基二硫代氨基甲酸钠为通过将三水合二乙基二硫代氨基甲酸钠研磨成细粉，再冻干12～24小时所得；下同)加入到50mL蒸馏水中搅拌溶解，加1mL三乙胺并升温至50℃反应24h，待反应结束后将体系旋蒸得到粗产物，产率70％，总产率59％。

(3)将粗产物溶于甲醇(浓度约为1g/mL)，使用sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液为甲醇，最后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC。傅立叶变换红外光谱图如图1所示。

实施例2

(1)将2.9mL十一烯酸与1.65g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于15mL乙醇中，室温搅拌4h；将2.70g氨基葡萄糖盐酸盐与2.85g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于10mL蒸馏水中，充分溶解后将两种溶液混合并剧烈搅拌，加入1～3滴三乙胺，室温下反应48h，待反应结束后，将体系旋蒸除去乙醇，用二氯甲烷萃取三遍，取水相，冷冻干燥，得到十一烯酰化氨基葡萄糖，产率80％。

(2)将15mmol二乙基二硫代氨基甲酸钠与15mmol 3-氯-1-丙硫醇混合于50mL丙酮中，升温至50℃并回流反应15h，再过滤除去不溶的盐，旋蒸得到黄色油状物3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯，产率55％。

(3)将3.4g(6mmol)的十一烯酰化氨基葡萄糖与9mmol的3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯加入到30mL丙酮中搅拌溶解，加1％(w/w)的2,2-二羟甲基丙酸(DMAP)，320W紫外反应4h，待反应结束后将体系旋蒸得到粗产物，产率95％，总产率42％。

(4)将粗产物溶于甲醇(浓度约为1g/mL)，使用sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液为甲醇，最后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D11SC。

实施例3

(1)将4.4mL油酸与1.65g N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶于15mL乙醇中，室温搅拌4h；将2.70g氨基葡萄糖盐酸盐与2.85g 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC·HCl)溶于10mL蒸馏水中，充分溶解后将两种溶液混合并剧烈搅拌，加入适量(1～3滴)三乙胺，室温下反应48h，待反应结束后，将体系旋蒸除去乙醇，用二氯甲烷萃取三遍，取水相，冷冻干燥得到油酸酰化氨基葡萄糖，产率80％。

(2)将15mmol二乙基二硫代氨基甲酸钠与15mmol 3-氯-1-丙硫醇混合于50mL丙酮中，升温至50℃并回流反应15h，再过滤除去不溶的盐，旋蒸得到黄色油状物3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯，产率55％。

(3)将4.0g(6mmol)的油酸酰化氨基葡萄糖与9mmol的3-巯基丙基二乙基氨基甲酸酯加入到30mL丙酮中搅拌溶解，加1％(w/v)的2,2-二羟甲基丙酸(DMAP)，320W紫外反应4h，待反应结束后将体系旋蒸得到粗产物，产率95％，总产率42％。

(4)将粗产物溶于甲醇(浓度约为1g/mL)，使用sephadex LH-20凝胶柱，洗脱液为甲醇，最后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D18SC。

实施例4

将实施例1、实施例2和实施例3所得糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶解于去离子水中配制成1mmol/L的水溶液，加入Cy5.5-COOH(麦克林)(终浓度为0.1mmol/L)，超声2s、间隔2s共30分钟后在室温下搅拌12小时。将样品用透析袋(透析液为蒸馏水，截留分子量为8000～14000，透析时间为6～12小时)透析，然后过滤，冷冻干燥，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Cy5.5复合物，将其命名为D6SC/Cy5.5，D11SC/Cy5.5，D18SC/Cy5.5。紫外分光法测试Cy5.5的浓度，测定波长为700nm，浓度(μmol/L)＝(吸收值-0.0036)/0.0986。在PBS缓冲液(pH＝7.4)中进行体外药物释放实验，得到Cy5.5释放曲线如图2所示。

实施例5

将实施例1、实施例2和实施例3所得糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶解于去离子水中配制成1mmol/L的水溶液，加入Ceritinib(色瑞替尼)(终浓度为0.1mmol/L)，超声2s、间隔2s共30分钟后在室温下搅拌12小时。将样品用透析袋透析(透析液为蒸馏水，截留分子量为8000～14000，透析时间为6～12小时)，然后过滤，冷冻干燥，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物/Ceritinib复合物(D6SC/Ceritinib、D11SC/Ceritinib、D18SC/Ceritinib)。

实施例6

将实施例5所得复合物D6SC/Ceritinib、D11SC/Ceritinib及D18SC/Ceritinib分别配制成浓度为0.1mg/mL的水溶液，利用动态光散射对其平均粒径进行分析，结果如图3所示。复合物的粒径变化逐渐稳定在70～90nm。

实施例7

将实施例5所得复合物D6SC/Ceritinib、D11SC/Ceritinib及D18SC/Ceritinib分别配制成浓度为0.1mg/mL的水溶液，然后取10μL滴在200目表面渡有炭膜的铜网上，滤纸吸干，磷钨酸溶液染色，滤纸吸干，采用JEM-2010HR型透射电子显微镜(Japan)观察。

结果如图4所示，复合物形成了紧密的球形结构，透射电镜照片粗略显示纳米粒子直径在50～100nm左右，因此，D6SC/Ceritinib、D11SC/Ceritinib及D18SC/Ceritinib均可以在一定条件下形成纳米尺寸的颗粒。

实施例8

将H3122细胞(ATCC细胞库)(1×10⁵个)在玻璃底培养皿中培养12小时。将实施例4所得复合物D6SC/Cy5.5，D11SC/Cy5.5，D18SC/Cy5.5(复合物终浓度为40μmol/L)分别在37℃与细胞在DMEM培养基中孵育1h。样品用多聚甲醛(4％)固定10min，DAPI染色，选用×40或×63物镜，使用共聚焦激光扫描显微镜成像(LSM 880,Zeiss)成像，三次重复。结果如图5所示：复合物可以有效且快速地被细胞摄取。

实施例9

使用内吞抑制剂EIPA(L593754；CAS：1154-25-2)、染料木素(Genistein)或盐酸氯丙嗪(Chlorpromazine)与H3122细胞孵育2h，再将实施例4中所得复合物D6SC/Cy5.5，D11SC/Cy5.5，D18SC/Cy5.5(复合物终浓度为40μmol/L)分别与2×10⁵个/孔细胞在DMEM中孵育1h，以不加入复合物为空白对照(control)，加入复合物但不加入内吞抑制剂为阳性对照组(NP)，只加入复合物并放入4℃培养作为阴性对照组(4℃)。流式细胞仪检测细胞中Cy5.5荧光强度，三次重复。结果如图6所示：复合物的内吞被EIPA明显抑制，其内吞途径极大依赖于巨胞饮内吞。

实施例10

将实施例4中所得复合物D11SC/Cy5.5(D11SC终浓度为50μmol/L)与葡聚糖-FITC(FITC-Dextran；70KD,Sigma-Aldrich)(终浓度为1mg/mL)一起加入到DMEM培养基中，与H3122细胞(1×10⁵个/孔)共孵育1h，共聚焦激光扫描显微镜成像，三次重复。结果如图7所示：复合物与葡聚糖-FITC共定位明显，同属于巨胞饮内吞。

实施例11

将实施例1、实施例2和实施例3所得糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物分别溶解于去离子水中配制成5mg/mL的水溶液，加入葡萄糖酸铜(糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物与葡萄糖酸铜物质的量比为2：1)，室温下搅拌12小时，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物与铜离子的复合物D6SC+Cu²⁺，D11SC+Cu²⁺，D18SC+Cu²⁺。

实施例12

将H3122细胞接种于96孔板(5000个/孔)(n＝3)中，在添加10％(v/v)胎牛血清(FBS)和1％(w/v)青霉素的DMEM培养基中培养，放于37℃并含5％(v/v)CO₂的增湿环境。用DMEM培养基稀释实施例1、实施例2、实施例3、实施例5和实施例11中所得产物的溶液(0.02、0.04、0.1、0.4、1、2、4和20μM)，然后加入每个孔中与细胞一起孵育，培养48小时后，向每个孔中加入MTT试剂，以双硫仑与铜离子的配位物(CuET)(10mmol/L二乙基二硫代氨基甲酸钠溶液与5mmol/L葡萄糖酸铜溶液按体积比1:1共混生成，然后用PBS缓冲液稀释为1mmol/L；其使用终浓度为50μmol/L)为对照。使用酶标仪(F200,Tecan)测量细胞相对活力，三次重复。

结果如图8所示：糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物与葡萄糖酸铜的复合物可以起到抑制H3122细胞的作用，其中D11SC+Cu²⁺复合物对肿瘤细胞的抑制效果最为明显(葡萄糖酸铜提供铜离子，铜离子与二硫代氨基甲酸酯改性物里的硫原子形成配位键，形成的产物与CuET相似的结构和功能)。

实施例13

侵袭实验使用的是24孔板中插入了涂有人工基底膜基质Transwell可穿透性细胞培养小室。每个孔的下层充满含10％(v/v)DMEM的培养基，而上层装有无血清培养基且以5×10⁴个/孔接种H3122细胞，其中H3122细胞分别使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例5和实施例11中所得产物进行预处理(糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物在各组的使用浓度为50μmol/L)。在侵袭实验结束时取出滤网，用甲醇固定并用苏木精染色。棉签擦去孔上层的细胞后，在40倍显微镜下观察穿过滤网后到达孔下层的细胞，以不加入任何产物为空白对照(Control)，三次重复。结果如图9所示：糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物负载Ceritinib显著抑制了细胞的侵袭能力。

实施例14

迁移实验使用的是24孔板中插入了Transwell可穿透性细胞培养小室。每个孔的下层充满含10％(v/v)DMEM的培养基，而上层装有无血清培养基且以5×10⁴个/孔接种H3122细胞，其中H3122细胞分别使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例5和实施例10中所得产物进行预处理(处理条件同实施例13)。在迁移实验结束时取出滤网，用甲醇固定并用苏木精染色。棉签擦去孔上层的细胞后，在40倍显微镜下观察穿过滤网后到达孔下层的细胞，以不加入任何产物为空白对照(Control)，三次重复。结果如图10所示，糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物负载Ceritinib显著抑制了细胞的迁移能力。

实施例15

使用实施例1、实施例2、实施例3、实施例5和实施例11中所得产物预处理H3122细胞(处理条件同实施例13)，并将等量细胞接种于划痕插件的两边。72h后在20倍显微镜下观察划痕宽度，以不加入任何产物为空白对照(Control)，三次重复。结果如图11所示：糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物负载Ceritinib显著抑制了细胞向划痕中间迁移的能力。

实施例16

在低黏附6孔板每个孔中接种100个H3122细胞，使用成球DMEM培养基，并使用实施例2所得产物D11SC、实施例5所得产物D11SC/Ceritinib以及实施例11中所得产物D11SC+Cu²⁺对细胞进行处理(处理条件同实施例13)。在10～14天后在20倍显微镜下观察细胞成球形态和个数，以不加入任何产物为空白对照(Control)，以加入色瑞替尼(终浓度为5μmol/L)为对照，，三次重复。结果如图12所示：结果显示糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物负载Ceritinib显著抑制了细胞的成球能力。

实施例17

分别使用实施例2得到的产物D11SC、实施例11得到的产物D11SC+Cu²⁺处理H3122细胞(处理条件同实施例13)(10cm培养皿为一组)，以不加入任何产物为空白对照(Control)，以加入双硫仑与铜离子的配位物(CuET)为阳性对照，再以1200rpm离心3min收集，并用1％(v/v)含Triton X-100裂解缓冲液(50mM Tris-HCl，pH 8.0，150mM NaCl)溶解。用BCA法测定细胞总蛋白浓度。每个样品(50μg蛋白)进行SDS-PAGE电泳，再转移到PVDF膜上。使用5％(w/v)的脱脂奶粉封闭2h后，将膜与一抗在4℃孵育过夜。用PBS洗涤三次(5分钟)，并在室温下与二抗体孵育1小时。用化学发光法在成像仪(Biorad)上观察信号。结果如图13所示：D11SC+Cu²⁺与CuET作用于相同的细胞凋亡通路。

实施例18

6只雌性Nu/Nu小鼠(年龄4～6周，体重18±2g，购自广东药康生物科技有限公司)，平均分为两组，一组采用肺部原位种植5×10⁵个/只H3122细胞得到原位肺肿瘤小鼠，另一组采用尾静脉注射1×10⁶个/只H3122细胞得到肺肿瘤小鼠。待肿瘤生长约7天后，使用实施例4得到的产物D11SC/Cy5.5采用肺部吸入的方式给药(50μL,500μmol/L D11SC,50μmol/LCy5.5-COOH)，并在给药后48h拍摄小鼠器官的离体图像。结果如图14所示：两种肺癌模型小鼠中药物的荧光信号(图14a和图14c)在肺部与肿瘤的生物发光位置基本吻合，说明药物富集到肿瘤部位，而两种模型小鼠的肾脏也都有强烈的药物富集，说明药物进入体内后很大可能经过肾排出体外，降低了药物的毒性。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，其特征在于，将氨基糖与脂肪酸混合，加入偶联催化剂活化反应基团使两者发生酯化反应生成脂肪酸酰化氨基糖，再利用脂肪酸上的卤素基团与二乙基二硫代氨基甲酸钠的二硫代羧基负离子发生反应，合成得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物；

所述的氨基糖为氨基葡萄糖盐酸盐、氨基葡萄糖、氨基半乳糖和壳聚糖中的至少一种；

所述的脂肪酸为6-溴己酸。

2.一种糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，其特征在于：所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物为糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC、D11SC和D18SC中的至少一种；其中，

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC通过如下方法合成得到：

（1）将氨基葡萄糖盐酸盐水溶液和6-溴己酸的乙醇溶液混合搅拌均匀，然后加入三乙胺、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和1-羟基苯并三唑，在保护性气体氛围下进行反应，待反应结束后旋蒸除去乙醇，再用二氯甲烷萃取，取水相，冷冻干燥，得到6-溴己酰化氨基葡萄糖；

（2）将6-溴己酰化氨基葡萄糖和二乙基二硫代氨基甲酸钠加入水中搅拌溶解，然后加入三乙胺并升温至50±5℃进行反应，待反应结束后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D6SC；

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D11SC和D18SC通过如下方法合成得到：

（3）将脂肪酸和N-羟基琥珀酰亚胺加入到乙醇中，搅拌溶解，得到溶液I；将氨基葡萄糖盐酸盐和1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐溶于水中，得到溶液II；将溶液I和溶液II混合均匀，然后加入三乙胺进行反应，待反应结束后旋蒸除去乙醇，再用二氯甲烷萃取，取水相，冷冻干燥，得到酰化氨基葡萄糖；其中，脂肪酸为十一烯酸或油酸；

（4）将二乙基二硫代氨基甲酸钠与3-氯-1-丙硫醇加入到丙酮中，升温至50±5℃进行回流反应，待反应结束后过滤除去不溶的盐，旋蒸得到3-巯基丙基二乙基二硫代氨基甲酸酯；

（5）将酰化氨基葡萄糖与3-巯基丙基二乙基二硫代氨基甲酸酯加入到丙酮中搅拌溶解，然后加入2,2-二羟甲基丙酸，在紫外条件下进行反应，待反应结束后旋蒸得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物D11SC或D18SC。

3.根据权利要求2所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，其特征在于：

步骤（1）中所述的氨基葡萄糖盐酸盐、6-溴己酸、苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸盐和1-羟基苯并三唑的摩尔比为1：1～2：1～1.5：1～1.5；

步骤（1）、（2）和（3）中所述的三乙胺的用量为按其在反应体系的终浓度为体积百分比1%～5%添加计算；

步骤（2）中所述的6-溴己酰化氨基葡萄糖和二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1：1～2；

步骤（3）中所述的氨基葡萄糖盐酸盐和脂肪酸的摩尔比为1：1～2；

步骤（4）中所述的3-氯-1-丙硫醇与二乙基二硫代氨基甲酸钠的摩尔比为1：1～2；

步骤（5）中所述的酰化氨基葡萄糖和3-巯基丙基二乙基二硫代氨基甲酸酯的摩尔比为1：1～2；

步骤（5）中所述的酰化氨基葡萄糖与2,2-二羟甲基丙酸的质量比为100：0.1～5。

4.根据权利要求2所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，其特征在于：在步骤（2）和（5）之后还包括将获得的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物进一步纯化的步骤；具体为：将糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶于甲醇，使用sephadex LH-20凝胶柱进行纯化，以甲醇为洗脱液，最后旋蒸得到纯化后的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物。

5.根据权利要求2所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物，其特征在于：

步骤（1）和（3）中所述的反应的时间为48 h以上；

步骤（2）中所述的反应的时间为24 h以上；

步骤（3）中所述的搅拌的时间为4 h以上；

步骤（4）中所述的回流反应的时间为15 h以上；

步骤（5）中所述的反应的条件为：50～400 W紫外条件下反应2～4 h。

6.权利要求1～5任一项所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物在制备药物载体中的应用。

7.一种抗肿瘤纳米药物，其特征在于：包括权利要求1～5任一项所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物。

8.根据权利要求7所述的抗肿瘤纳米药物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～5任一项所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物加入到水中，超声处理后在5～35℃条件下搅拌混合均匀，透析、过滤，冷冻干燥，得到糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物的复合物，即所述的抗肿瘤纳米药物；

所述的抗肿瘤药物为疏水性抗肿瘤药物；

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和抗肿瘤药物的摩尔比为1：0.05～0.1；

所述的透析为采用截留分子量为3000～14000的透析袋进行透析。

9.一种抗肿瘤靶向纳米药物复合物，其特征在于：包括权利要求1～5任一项所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和葡萄糖酸铜。

10.权利要求9所述的抗肿瘤靶向纳米药物复合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：将权利要求1～5任一项所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物溶解于水中，然后加入葡萄糖酸铜，搅拌混合均匀，形成稳定的抗肿瘤靶向纳米药物复合物；

所述的糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物和葡萄糖酸铜的摩尔比为2：1；

所述的水的用量为按每毫升水加入5～10克糖基化二硫代氨基甲酸酯改性物计算。

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