CN110279673A - AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用 - Google Patents

AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用 Download PDF

Info

Publication number
CN110279673A
CN110279673A CN201910540889.5A CN201910540889A CN110279673A CN 110279673 A CN110279673 A CN 110279673A CN 201910540889 A CN201910540889 A CN 201910540889A CN 110279673 A CN110279673 A CN 110279673A
Authority
CN
China
Prior art keywords
aunp
poly
mouse
group
tmz
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN201910540889.5A
Other languages
English (en)
Other versions
CN110279673B (zh
Inventor
杜彬
殷培迪
李惠峰
曹广旭
陈嘉玲
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai First Maternity and Infant Hospital
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Individual filed Critical Individual
Priority to CN201910540889.5A priority Critical patent/CN110279673B/zh
Publication of CN110279673A publication Critical patent/CN110279673A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN110279673B publication Critical patent/CN110279673B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/4164—1,3-Diazoles
    • A61K31/4188—1,3-Diazoles condensed with other heterocyclic ring systems, e.g. biotin, sorbinil
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/70—Carbohydrates; Sugars; Derivatives thereof
    • A61K31/7088—Compounds having three or more nucleosides or nucleotides
    • A61K31/713—Double-stranded nucleic acids or oligonucleotides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/5115—Inorganic compounds
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K9/00—Medicinal preparations characterised by special physical form
    • A61K9/48—Preparations in capsules, e.g. of gelatin, of chocolate
    • A61K9/50—Microcapsules having a gas, liquid or semi-solid filling; Solid microparticles or pellets surrounded by a distinct coating layer, e.g. coated microspheres, coated drug crystals
    • A61K9/51—Nanocapsules; Nanoparticles
    • A61K9/5107—Excipients; Inactive ingredients
    • A61K9/513—Organic macromolecular compounds; Dendrimers
    • A61K9/5146—Organic macromolecular compounds; Dendrimers obtained otherwise than by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. polyethylene glycol, polyamines, polyanhydrides
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Optics & Photonics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)

Abstract

本发明公开了AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用，其制备过程包括：把poly(I:C)原液与AuNP@PP溶液混匀，静置，超声，得到AuNP@PP/poly(I:C)溶液。AuNP@PP/poly(I:C)能用于制备治疗抗胶质瘤的药物，配合TMZ进行治疗能获得更佳的治疗效果。

Description

AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药 物中的应用
技术领域
本发明涉及一种药物的技术领域，尤其涉及治疗胶质瘤的医药领域。
背景技术
胶质母细胞瘤(Glioblastoma,GBM)原发于颅内，是颅内最常见、恶性程度最高的肿瘤。在最近几年的临床报道中，胶质母细胞瘤的发病率呈逐年升高的趋势，胶质母细胞瘤患者治疗效果不好，预后差，生存时间短。据美国脑肿瘤注册中心(CBTRUS)统计，在所有中枢神经系统肿瘤中，胶质瘤约占27％，占恶性肿瘤的80％；而胶质母细胞瘤在原发性恶性中枢神经系统肿瘤中发病率最高，约占46.1％，年发生率约3.2/105，患者中位生存期仅为14.6-17个月。
胶质母细胞瘤的治疗主要为手术切除肿瘤，辅以放疗、化疗等综合治疗方法，但由于肿瘤发生于颅内，即便瘤体体积不大，也会引发病人严重的临床症状，手术治疗的目的是缓解临床症状，延长患者生存期。而高级别的恶性胶质瘤，其肿瘤为浸润性生长，单纯的手术治疗无法完全清除肿瘤，往往存在极高的复发可能。必须利用化疗进一步杀灭实体肿瘤的残存细胞，有助于提高患者的无进展生存期与总生存期。目前临床上的一线化疗药物为替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)，TMZ是甲基化药物，亦被认为是二代烷化剂。其治疗胶质瘤的机制是可以破坏肿瘤细胞的DNA双链，使细胞周期阻滞，最终杀死肿瘤细胞。该药物具有良好的穿透血脑屏障的能力，能在颅内达到有效药物浓度。但有最新研究表明，肿瘤通过改变自身的代谢状况来适应TMZ造成的细胞损伤或激活DNA修复途径来抑制TMZ的药效。因此，如果期望获得更好的TMZ的疗效，需要联合其它药物来抑制肿瘤产生的耐药性。另一方面，大脑作为人体最重要的器官之一，在生理结构上处于一个被多重保护的位置。坚硬的颅骨保护脑组织不直接承受外力的打击，而血脑屏障(Blood brain barrier,BBB)将脑组织与血液分隔开，致密的毛细血管内皮和紧密连接的细胞使脑组织免受血液中的细菌、毒素等有害成分侵害。在此作用下，普通的药物也会因为被血脑屏障阻挡而难以进入颅内，在肿瘤细胞周围达到有效的药物浓度。因此，如何突破血脑屏障的阻碍，使药物进入颅内发挥作用，也是值得深入探讨的问题之一。
聚肌胞甘酸(英文名polyinosinic/polycytosinic acid，poly(I:C))，是人工合成的分子量为1000的双链RNA，拥有较强的RNA酶抗性以及稳定性。该RNA能够模拟病毒的核酸，激活细胞内外的RLR和TLR，产生大量I型干扰素，诱导肿瘤产生免疫性细胞死亡并增强免疫细胞的杀伤力，是一种理想的免疫佐剂。肿瘤细胞的表面及胞浆内均有TLR，且胞浆内受体的数量远高于细胞表面。poly(I:C)通过与肿瘤细胞TLR3结合，诱导分泌大量细胞因子IFN-β,进而激活免疫反应，并为进一步T细胞的启动做准备。这便意味着，要让poly(I:C)发挥最佳的杀伤肿瘤的效果，就需要使其进入肿瘤细胞内，与大量的TLR3结合。
因此寻找一种载体，将poly(I:C)送入脑组织肿瘤细胞内，与TMZ协同以达到治疗颅内原位胶质瘤的目的是对医学进步有较大贡献的。
发明内容
本发明的目的在于提供AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
为了达到上述目的本发明采用如下技术方案：
一种化合物，其结构式表示为AuNP@PP/poly(I:C)。
所述化合物的制备方法，包括如下步骤：把poly(I:C)原液与AuNP@PP溶液混匀，静置，超声，得到AuNP@PP/poly(I:C)溶液。
进一步地，详细操作如下：将1ml poly(I:C)原液，浓度为1mg/ml，装于若干1.5mlEP管内，按照比例加入0.05mg/ml AuNP@PP溶液，混合摇匀，室温静置15min后，超声1s，使AuNP@PP/poly(I:C)沉淀重新分散至溶液中，得到均一稳定的AuNP@PP/poly(I:C)溶液。
进一步地，AuNP@PP中AuNP的粒径是13nm。
进一步地，AuNP@PP与poly(I:C)混合比例是wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05。
AuNP@PP/poly(I:C)在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
AuNP@PP/poly(I:C)和TMZ组合使用。组合可以是通过同时的、续贯的、或分别的给药方式，从而提高治疗指数或起到药物的正向协同作用。
本发明的优点在于提供一种可应用于制备治疗胶质瘤药物的化合物，该化合物与TMZ配合用药能够促进相关免疫反应达到更佳的胶质瘤治疗效果。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本申请的一部分，并不构成对本发明的不当限定，在附图中：
图1、透射电镜显示13nmAuNP与30nmAuNP的形态特征实验图；
图2、13nm和30nmAuNP溶液隔天连续鼻饲给药八天后测定小鼠颅内金质量分数的实验图；
图3、腹腔注射或鼻饲给药后4小时处死小鼠，并对比颅内脑内金的质量分数的实验图；
图4、连续隔天腹腔注射或鼻饲给药8天后处死小鼠，并对比颅内脑内金的质量分数的实验图；
图5、连续隔天腹腔注射或鼻饲给药相同总纳米金，8天后处死小鼠，并对比颅内脑内金的质量分数的实验图；
图6、不同w/w比例的AuNP@PP/poly(I:C)结合时，上清液中Poly(I:C)的浓度曲线；
图7、在不同w/w比例的AuNP@PP/poly(I:C)结合情况下，上清液凝胶电泳实验图；
图8、各个纳米体系透射电镜图；
图9、各个纳米体系紫外吸收图；
图10、各个纳米体系水合半径图；
图11、各个纳米体系Zeta电位图；
图12、AuNP@PP转染核酸进入肿瘤细胞于荧光显微镜作用下在明视野或GFP视野中的实验图；
图13、TMZ与AuNP@PP/poly(I:C)对胶质瘤GL261细胞增殖的影响实验图；
A表示AuNP@PP孵育的GL261的细胞抑制测定图；
B表示AuNP@PP/poly(I:C)孵育的GL261的细胞抑制测定图；
图14、在GL261细胞中，AuNP@PP/poly(I:C)药物组合提高TMZ诱导的细胞增殖抑制作用测定图；
图15、体外诱导肿瘤细胞凋亡与免疫反应实验中，qRT-PCR实验测定肿瘤细胞中免疫相关基因表达水平实验图；
图16、体外诱导肿瘤细胞凋亡与免疫反应实验中，上清液中HMGB1与IFNB1的浓度实验图；
图17、不同给药组小鼠生存曲线；
图18、不同给药组小鼠体重变化曲线；
图19、小鼠颅内种瘤MRI影像；
图20、小鼠肿瘤最大截面积统计图；
图21、小鼠颅内肿瘤免疫相关基因表达情况统计图。
具体实施方式
下面将结合附图以及具体实施例来详细说明本发明，在此以本发明的示意性实施例及说明用来解释本发明，但并不作为对本发明的限定。
需要说明的是：
PEI-PEG修饰的AuNP表示为AuNP@PP；
聚肌胞苷酸表示为poly(I:C)；
PEI-PEG修饰的AuNP和聚肌胞苷酸结合而成的化合物表示为AuNP@PP/poly(I:C)。
实施例1：
低粒径的AuNP具有毒性低、生物亲和度高等优点，被作为药物载体而广泛应用。13nm与30nm粒径AuNP是最常用的两种低粒径纳米金颗粒，如图1所示，于暨南大学分析测试中心行透射电镜,镜下纳米颗粒呈球形，形态规整，分布均一。
为了验证它们哪一种具有更强的进入颅内的能力，我们用两种纳米金溶液鼻饲或腹腔注射小鼠，并测定对比小鼠颅内金的质量分数。操作过程大致如下：
(1)小鼠给药方法
动物实验选取5～6周龄C57BL/6雌性小鼠，分为4h给药组、8天给药组两类实验组，每类实验组分为13nm组、30nm组两小类实验组，分别采用13nm与30nm两种不同粒径的AuNP溶液通过腹腔注射(IP)或鼻饲(IN)对上述对应的实验组进行给药。
鼻饲给药的方法为：捉拿固定小鼠，使小鼠鼻腔朝上，使用10μl移液枪对小鼠进行滴鼻，左右两鼻腔各滴鼻5μl。
给药4h后收集对应组别小鼠脑组织，其余小鼠隔天给药，连续给药八天，于第九天处死取材。
(2)小鼠脑组织消解方法
①将脑组织分为大脑、小脑、嗅球三部分，分装于组织冻存管中，在真空绝热瓶中液氮速冻，后保存于-80℃冰箱备用；
②取组织放入小烧杯中，记录组织重量，倒入没过组织的足量浓硝酸，于数字电热板上150℃持续加热直至瓶内液体几乎蒸干，此时组织已经完全消解并沉淀于瓶底；
③以浓盐酸与浓硝酸3:1比例配制王水，在小烧杯中加入2ml王水，使金原子被王水充分溶解于溶液中，继续加热，当液体颜色由棕黄色逐渐变为无色时停止加热；
④将剩余液体(步骤③制得的液体)转移至15ml离心管中，并将小烧杯用2％稀硝酸涮洗三次转移至离心管，定容；
⑤将15ml离心管内液体上机行电感耦合等离子体质谱分析(ICP-MS)，测定Au离子浓度。本实验ICP-MS实验委托暨南大学分析测试中心进行；
⑥整理统计Au离子浓度数据，计算小鼠脑组织各个部位中金的质量分数。
如图2所示，8天给药组中，鼻饲13nmAuNP的小鼠在颅内各个部位中金的质量分数均高于鼻饲30nmAuNP的小鼠，其中嗅球部位的金质量分数差异有统计学意义(n＝6,p<0.05)，13nm组大脑与小脑中金质量分数均大于30nm组，但差异无统计学意义(n＝6,p>0.05)。结果表明在常用低粒径的AuNP中，与30nm AuNP相比，13nmAuNP通过鼻-脑通道入脑更多，更适合作为药物载体，因此在后续实验中均使用13nmAuNP。
实施例2：
大脑是所有生物体最重要的器官，为了保护大脑不受有害物质侵害，血脑屏障(BBB)能有效隔绝大脑与血液中的毒素与细菌等有害成分，但同时也令药物无法在颅内达到有效浓度。为了验证如何给药能使AuNP更高效进入脑内，我们分别通过鼻饲和腹腔注射对小鼠给药：
动物实验同样是选取5～6周龄C57BL/6雌性小鼠，分为4h给药组、8天(8d)给药组两类实验组，每类实验组分为鼻饲组、腹腔注射组两小类实验组，通过腹腔注射(IP)或鼻饲(IN)对上述对应的实验组进行给药。
如图3所示，其中4h鼻饲组给药量仅为4h腹腔注射组给药量的十分之一，但4h鼻饲组颅内各个部位金质量分数均远高于4h腹腔注射组(n＝6,*p<0.05,**p<0.01,****p<0.0001)，说明鼻饲给药AuNP在短时间内便可以大量被脑组织吸收，效果好于腹腔注射；如图4所示，8d鼻饲组颅内金质量分数与给药总量十倍的8d腹腔注射组相当(n＝6,p>0.05；)；如果减少腹腔注射的纳米金浓度，保持给药总量与鼻饲一致，如图5所示，则腹腔注射组无法检测到颅内的金(n＝6,*p<0.05)，表明在持续连续给药数天的情况下，鼻饲也具有使AuNP高效入脑的优势，因此本技术方案将鼻饲定为接下来实验的给药方式。
实施例3：
本实验中的13nmAuNP、30nmAuNP溶液与PEI-PEG修饰的纳米金(AuNP@PP)均购买自中国西安瑞喜生物科技有限公司。
(1)PEI-PEG修饰的纳米金-核酸结合离心
将poly(I:C)原液(聚肌胞苷酸原液)，浓度为1mg/ml分装于若干1.5ml EP管内，每管100μl，按照不同的核酸、PEI-PEG修饰的纳米金质量比分别加入AuNP@PP溶液，最后用DEPC水将每支EP管定容至300μl。颠倒混匀，室温静置15min后，于高速低温离心机内4℃，10000rmp，离心10min。取每支EP管内上清液，于紫外分光光度仪测其260nm波长处吸光度。
(2)核酸电泳实验
①清洗配胶板、底座、梳子，晾干；
②将50xTAE缓冲液稀释至1xTAE，用洁净量筒称取25ml，倒入干燥洁净的锥形瓶中；
③电子天平称取0.25g琼脂糖粉末，倒入锥形瓶中，加入核酸染料混匀；
④锥形瓶盖上盖子，于微波炉里中高火加热1min，倒入模具，插上梳子，放置于水平面，室温自然冷却至凝固；
⑤待琼脂糖凝胶凝固后，拔出梳子，放入电泳槽中，倒入1xTAE电泳缓冲液150ml(没过凝胶平面)；
⑥将上述EP管内上清液与loadingbuffer(上样缓冲液)混匀后上样；
⑦接电源，常规约140V,20min；
⑧待电泳结束后，取出凝胶，置于凝胶成像系统的UVP紫外灯下观察结果并拍照保存。
为验证AuNP@PP与poly(I:C)确实稳定结合成AuNP@PP/poly(I:C)，并确定使全部poly(I:C)结合在AuNP@PP上的药物配比，我们发现按照不同的AuNP@PP、poly(I:C)质量比结合离心后，如图6所示，上清液中poly(I:C)浓度随加入的AuNP@PP增多而降低，表明AuNP@PP确实与poly(I:C)稳定结合，并且通过离心可以将与AuNP@PP结合上的poly(I:C)沉淀。当wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05时，上清液中poly(I:C)浓度降为0，说明在该配比下，所有的poly(I:C)均与AuNP@PP结合，再增加AuNP@PP的量也不能提高负载poly(I:C)的效果。如图7所示，琼脂凝胶电泳实验结果中，由于poly(I:C)为1.5-8kb的高分子量核酸，没有固定的分子量大小，因此凝胶中没有固定位置的发亮条带，而是存在全泳道的均一发光。随着AuNP@PP、poly(I:C)质量比逐渐增大，泳道中的发光强度逐渐降低直至完全消失，与图6共同证明了上清中poly(I:C)减少，AuNP@PP与poly(I:C)结合的事实，故将wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05定为AuNP@PP与poly(I:C)的最佳结合配比，沿用于本技术方案后续的相关实验。
实施例4：
为了进一步观察不同纳米金各体系中的理化稳定性，我们对各个纳米体系进行了表征。如图8所示，AuNP、AuNP@PP与AuNP@PP/poly(I:C)的TEM(透射电子镜)结果可以看出三者的外观大体呈纳米微球状，粒径约在10-20nm之间，均比湿态的粒径小，这是由于粒子失水收缩所造成的；如图9所示，AuNP、AuNP@PP与AuNP@PP/poly(I:C)溶液的紫外-可见光吸收谱图结果中可以看到纯AuNP溶液在约520nm处出现特征吸收，AuNP@PP溶液也在该位置出现特征吸收，说明了在AuNP上修饰PEG-PEI后对AuNP的粒径几乎没有影响，而AuNP@PP/poly(I:C)溶液在约260nm和520nm处都出现了特征吸收，证明PEI成功包裹了核酸；插入图9中AuNP、AuNP@PP与AuNP@PP/poly(I:C)溶液样品均为透亮的酒红色，符合纳米金溶液的典型特征；如图10-11所示，AuNP@PP/poly(I:C)溶液的粒径与表面电位测试结果表明AuNP、AuNP@PP与AuNP@PP/poly(I:C)的粒径分别是15nm、24nm和24nm；而三者的表面电位值分别为-18.6mV、+7.6mV和-10.2mV，结合核酸后，AuNP@PP电位由正变负，也可以进一步说明AuNP@PP/poly(I:C)纳米粒子的成功制备。同时，较小的粒径及近中性的表面电位有利于纳米粒子在体内的长循环作用。对比AuNP、AuNP@PP与AuNP@PP/poly(I:C)三者的TEM、UV、DLS、Zeta结果表明，最佳配比下的AuNP@PP/poly(I:C)纳米粒子具有适于在体内递送核酸的较好的理化性质。
实施例5：
为了确定AuNP@PP能使核酸转染进入细胞内，我们将AuNP@PP与带有FAM核酸(带有FAM的聚肌胞苷酸)结合后孵育GL261细胞24h，更换培养基，清除六孔板中残留荧光蛋白后，倒置荧光显微镜GFP荧光滤片下细胞内可见明显绿色荧光，而对照组未观察到绿色荧光，如图12所示，比例尺250μm，表明AuNP@PP可以使核酸进入肿瘤细胞的胞浆与胞核内，提高核酸的转染能力。并且在明场中可见细胞状态良好，没有明显的细胞死亡，说明AuNP@PP对细胞的毒性较低，符合作为药物载体的特质。
实施例6：
TMZ是胶质瘤的临床一线用药，但往往肿瘤细胞对TMZ存在耐药性，为了明确AuNP@PP/poly(I:C)与肿瘤细胞对TMZ敏感性的关系，我们进行了CCK8细胞毒性实验。如图13的A所示，经计算，AuNP@PP对GL261细胞IC50值为2.5μg/ml，该浓度远高于后续实验中所使用的AuNP@PP浓度，因此可以忽略后续试验中AuNP@PP载体本身对细胞的毒性影响。为了排除联合给药时AuNP@PP/poly(I:C)自身对肿瘤细胞的毒性作用，单独给药AuNP@PP/poly(I:C)行CCK8细胞毒性实验，如图13的B所示，其对GL261细胞IC50值为10μg/ml；因此在联合给药时，选取AuNP@PP/poly(I:C)单独对细胞毒性不明显的2μg/ml作为底物，与不同浓度的TMZ共同孵育细胞48h，如图14所示，与对照组仅给药TMZ对比，TMZ对GL261细胞IC50值由549μM下降至380μM，表明在体外联合TMZ与AuNP@PP/poly(I:C)可以提高GL261细胞对TMZ的敏感性，使更多肿瘤细胞被药物杀死。
实施例7：
为进一步明确AuNP@PP对poly(I:C)在肿瘤细胞内的转染效果的影响，并阐明AuNP@PP/poly(I:C)与肿瘤免疫的关系，我们用20μg/ml的游离poly(I:C),20μg/mlAuNP@PP/poly(I:C)与1mM TMZ分别处理GL261、CT-2A，并对其免疫相关基因、蛋白等进行了分析。如图15所示，qRT-PCR结果显示，在免疫反应相关基因中，IFNB1与CXCL10的表达在仅给予游离poly(I:C)时也会较对照组提高(p<0.0001)，但在给予AuNP@PP/poly(I:C)组中IFNB1、MX1、CXCL10的表达均高于游离poly(I:C)组(p<0.001)，表明AuNP@PP确实具有将poly(I:C)转染进入细胞内进而诱发免疫反应的能力。与对照相比，单独用药TMZ不能提高免疫相关基因的表达(p>0.05)，而AuNP@PP/poly(I:C)与对照组相比IFNB1、MX1、CXCL10的表达都明显提高(p<0.0001)；上清行ELISA实验检测免疫原性细胞死亡相关因子HMGB1与IFNB1的表达，如图16所示，结果表明，AuNP@PP/poly(I:C)用药组，相比于对照组、游离poly(I:C)组或单独TMZ给药组，这两种因子的表达都明显升高(p<0.05)，说明AuNP@PP与poly(I:C)结合可以增强poly(I:C)进入肿瘤细胞的效率进而促进肿瘤免疫原性细胞死亡。综合以上细胞实验结果可以说明，AuNP@PP结合poly(I:C)能够大大提高肿瘤细胞中免疫相关基因的表达，并诱导免疫原性细胞死亡的发生，为进一步在体内引发更强有力的免疫反应提供实验基础。
实施例8：
(1)小鼠颅内第四脑室原位胶质瘤模型建立
①GL261细胞从培养皿中消化后，PBS洗两次，每次1000rmp离心10min，最终用不含有血清的DMEM HG培养基重悬并计数，使细胞悬液的浓度为4.2×107个/ml。
②使用生理盐水与药粉配制1％浓度的戊巴比妥钠溶液，保存于4℃备用。
③按照每克体重6μl戊巴比妥钠溶液对小鼠进行麻醉，使用剃毛器对其头皮进行剃毛备皮。
④切开头皮，于小鼠颅骨冠状缝背侧2mm、矢状缝右侧3mm处用1ml注射器针头钻洞并深入颅骨3mm(套上提前做好的模具)，后用Hamilton精密进样针同样进针3mm，在1min内缓慢推入3μl准备好的细胞悬液。
⑤缝合头皮，于小鼠背部注射1ml生理盐水补液，放于37℃电热板上等待小鼠苏醒。
(2)小鼠给药方法
①将AuNP@PP原液与poly(I:C)原液按wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05混合，颠倒混匀，室温静置15min；之后4℃，10000rmp，离心10min；在冰上超声，每次2s，重复三次重悬，配制5mg/ml AuNP@PP/poly(I:C)浓缩液；以橄榄油为溶剂，配制3mg/ml TMZ的橄榄油悬浊液。
②AuNP@PP/poly(I:C)浓缩液滴鼻，每个鼻腔5μl；TMZ的橄榄油悬浊液灌胃，300μl/mouse。从肿瘤种植后第13天开始给药，连续给药五天。
(3)生存曲线绘制
第一批次60只小鼠在给药后每日观察小鼠生存状态，并隔日称量体重。当小鼠体重低于种瘤当日体重2/3或出现明显的神经精神症状时处死小鼠并记录，在所有小鼠全部死亡后绘制生存曲线。
(4)小鼠活体MRI颅内成像
第二批次分别于种瘤第13天、21天、28天麻醉相应组别小鼠，上机行颅内活体MRI成像。本实验在华侨医院影像科进行。收集图像数据，并用RadiAnt DICOM Ciewer系统对图片进行处理，获得颅内胶质瘤最大横截面面积数据。
(5)小鼠组织取材
MRI成像结束后处死小鼠，收集心、肝、脾、肺、肾于多聚甲醛中固定，后脱水包埋备用。胶质瘤部分于多聚甲醛中固定，部分放于组织冻存管液氮速冻，后保存于-80℃冰箱中保存，以备提取RNA。
有了一定的体外实验基础后，为了探究在不同药物影响下生物体内免疫反应的发生情况，我们在小鼠颅内种植GL261细胞，创建了小鼠颅内胶质瘤模型。把模型小鼠分为对照(UT)组、AuNP@PP/poly(I:C)滴鼻给药组、TMZ灌胃给药组、AuNP@PP/poly(I:C)滴鼻与TMZ灌胃给药组。对照组不给药，AuNP@PP/poly(I:C)滴鼻给药组仅滴鼻AuNP@PP/poly(I:C)，TMZ灌胃给药组仅灌胃TMZ，AuNP@PP/poly(I:C)滴鼻与TMZ灌胃给药组是AuNP@PP/poly(I:C)滴鼻和TMZ灌胃同时给药。使用上述不同的给药方式处理对应组别小鼠，每天观察、记录小鼠生存情况并绘制生存曲线与小鼠体重变化百分比，如图17-18所示；采用log-ranktest分析不同给药方式下小鼠总体生存率的差异，UT组与单独给药AuNP@PP/poly(I:C)相比较，小鼠生存期没有统计学差异(p＝0.36)，结合小鼠体重在给药前后无明显变化，表明单独给药AuNP@PP/poly(I:C)无法直接杀灭肿瘤，提高小鼠预后，但也证明AuNP@PP/poly(I:C)对小鼠没有毒性；单独给药TMZ组与TMZ、AuNP@PP/poly(I:C)联合给药组可见小鼠在给药后体重呈下降后再上升的趋势，说明TMZ对小鼠存在一定毒性；但两组小鼠生存期均明显提高(p<0.0001)，使用log-rank test分析对比TMZ、AuNP@PP/poly(I:C)联合用药组与单独TMZ组小鼠生存期，p＝0.012，存在统计学差异，证明联合鼻饲AuNP@PP/poly(I:C)可以增加TMZ对颅内胶质瘤的治疗效果，延长小鼠的生存期。
实施例9：
为了明确药物对小鼠颅内肿瘤大小的影响，我们于小鼠种瘤后第七天开始按实施例8的方法进行实验分组，分别对应给药，连续给药五天，分别于第13天、21天、28天行MRI并处死小鼠，如图17-18所示，可以看出不同实验组种瘤后不同的生存率和体重变化；如图19所示，MRI影像可见颅内肿瘤阴影，用红色画笔圈出标出。取材可见部分肿瘤突出脑组织表面，向外扩张生长；部分肿瘤在脑内呈浸润性生长；也有部分脑组织未见肿瘤。使用RadiAntDICOM Ciewer系统对MRI图片进行处理，截取最大肿瘤面积作为衡量肿瘤大小的指标，将数据进行整理统计，如图20所示，绘制各组别颅内肿瘤大小对比图。各组别间小鼠肿瘤大小采用Student t test进行检验，第13天的单独用药poly(I:C)组的肿瘤比对照组肿瘤小，说明在肿瘤早期的第13天时，单独给药poly(I:C)虽然不能治愈胶质瘤延长小鼠生存期，但可以少量降低肿瘤的大小；而由于给药TMZ后第13天颅内肿瘤均较小甚至未发现肿瘤，单独用药TMZ组与联合用药组的肿瘤大小没有出现差异；第21天与28天的联合用药组的肿瘤均小于单独用药TMZ组，说明在此时期，联合用药起到了比单独用药TMZ更好的效果，杀灭肿瘤细胞，使瘤体变小。
实施例10：
为了阐明鼻饲AuNP@PP/poly(I:C)治疗小鼠颅内胶质瘤的机制，收集各个时间点小鼠颅内肿瘤并提取RNA，行qRT-PCR实验，并将数据整理，如图21所示，绘制基因表达水平-时间关系图。在13、21、28天，AuNP@PP/poly(I:C)与TMZ联合给药组的小鼠肿瘤中免疫相关基因的表达均比单独给药TMZ组高(p<0.05)，第13天、21天的上游基因IFNB1差异尤为明显(p<0.0001)。下游免疫反应，代表T细胞激活的基因CD8a则在13天时两组小鼠内仅有一只联合给药鼠肿瘤有高表达；而在21天与28天时两组小鼠肿瘤均有表达，且联合用药组更高(p<0.05)。从13天到28天，免疫相关基因表达整体呈下降趋势，表明小鼠颅内的免疫反应在给药结束后逐渐下降至正常水平，但联合给药组小鼠可以更长时间维持颅内的较高水平的免疫反应。以上结果说明，TMZ杀灭胶质瘤的机制可能与诱导肿瘤细胞产生免疫反应相关；鼻饲AuNP@PP/poly(I:C)联合TMZ治疗小鼠颅内胶质瘤能大大提高免疫反应的强度，使小鼠肿瘤体积减小、生存期延长，证明了联合用药治疗颅内胶质瘤的机制与肿瘤免疫相关。
实验结果
1.给予小鼠鼻饲AuNP能使AuNP大量进入脑组织，效率约为腹腔注射的10倍，并且13nm AuNP相较于30nm AuNP更容易进入脑组织。
2.PEI-PEG修饰的AuNP(AuNP@PP)能与poly(I:C)稳定结合，wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05时，poly(I:C)可以完全与AuNP@PP连接。
3.AuNP@PP能大大提高核酸进入细胞胞浆内的能力；TMZ对GL261细胞72h慢毒性实验IC50＝549μM，以单独用药对GL261细胞无毒性的AuNP@PP/poly(I:C)浓度为底物，使其IC50下降至380μM，证明了AuNP@PP/poly(I:C)在体外可以提高GL261细胞对TMZ的敏感性。
4.使用AuNP@PP/poly(I:C)与TMZ处理细胞，qRT-PCR结果显示AuNP@PP/poly(I:C)提高了I型干扰素相关基因IFNB1、MX1、CXCL10在肿瘤细胞内的表达；ELISA结果显示联合用药组产生了免疫原性细胞死亡。
5.AuNP@PP/poly(I:C)联合TMZ给药治疗小鼠颅内原位胶质瘤较单独给药TMZ能延长小鼠生存期(Log-rank，P＝0.012)。通过在种瘤后第13天、21天及28天行MRI获得小鼠颅内种瘤MRI图像并测量最大截面面积，以代表肿瘤的大小，联合给药组较TMZ单独给药组小鼠肿瘤更小(p<0.05)。在上述三个时间点处死各组小鼠，取得肿瘤组织匀浆后行qRT-PCR实验，联合用药组肿瘤在各个时间点均具有更多的免疫相关基因表达。
以上实验结果表明
1.AuNP@PP能结合poly(I:C)通过鼻饲入脑，并穿过细胞膜进入肿瘤细胞内，准确的来说，AuNP@PP中的PP是指PEI-PEG，它们是作为将药物核酸poly(I:C)与AuNP(纳米金)连接起来的辅助基团，真正起到转染等作用的物质是AuNP，但实际上也是作为一个整体，也就是AuNP@PP来发挥作用的；
2.AuNP@PP/poly(I:C)联合TMZ可通过诱导肿瘤细胞产生免疫原性细胞死亡进而治疗小鼠颅内原发胶质瘤，延长小鼠生存期。
以上对本发明实施例所提供的技术方案进行了详细介绍，本文中应用了具体个例对本发明实施例的原理以及实施方式进行了阐述，以上实施例的说明只适用于帮助理解本发明实施例的原理；同时，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例，在具体实施方式以及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims (7)

1.一种化合物，其结构式表示为AuNP@PP/poly(I:C)。
2.如权利要求1所述化合物的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：把poly(I:C)原液与AuNP@PP溶液混匀，静置，超声，得到AuNP@PP/poly(I:C)溶液。
3.如权利要求2所述化合物的制备方法，其特征在于，详细操作如下：将1mlpoly(I:C)原液，浓度为1mg/ml，装于若干1.5mlEP管内，按照比例加入0.05mg/mlAuNP@PP溶液，混合摇匀，室温静置15min后，超声1s，使AuNP@PP/poly(I:C)沉淀重新分散至溶液中，得到均一稳定的AuNP@PP/poly(I:C)溶液。
4.如权利要求2或3所述化合物的制备方法，其特征在于，AuNP@PP中AuNP的粒径是13nm。
5.如权利要求2或3所述化合物的制备方法，其特征在于，AuNP@PP与poly(I:C)混合比例是wAuNP@PP/wpoly(I:C)＝0.05。
6.如权利要求1所述的化合物AuNP@PP/poly(I:C)在制备治疗胶质瘤药物中的应用。
7.如权利要求6所述的应用，所述的化合物AuNP@PP/poly(I:C)和TMZ组合使用。
CN201910540889.5A 2019-06-21 2019-06-21 AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用 Active CN110279673B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910540889.5A CN110279673B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201910540889.5A CN110279673B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN110279673A true CN110279673A (zh) 2019-09-27
CN110279673B CN110279673B (zh) 2022-11-25

Family

ID=68005161

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201910540889.5A Active CN110279673B (zh) 2019-06-21 2019-06-21 AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN110279673B (zh)

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113720823A (zh) * 2021-05-17 2021-11-30 丹望医疗科技(上海)有限公司 检测类器官最大截面积的方法及其应用

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107550885A (zh) * 2017-07-31 2018-01-09 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种包含模式识别受体中tlr3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用
CN107693789A (zh) * 2017-07-31 2018-02-16 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种包含细胞靶向抗体及Poly(I：C)的化合物及其制备方法和应用

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107550885A (zh) * 2017-07-31 2018-01-09 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种包含模式识别受体中tlr3配体的纳米颗粒载体及其制备方法和应用
CN107693789A (zh) * 2017-07-31 2018-02-16 华中科技大学同济医学院附属协和医院 一种包含细胞靶向抗体及Poly(I：C)的化合物及其制备方法和应用

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
DAVID SCHAFFERT ET AL.: ""Poly(I:C)-Mediated Tumor Growth Suppression in EGF-Receptor Overexpressing Tumors Using EGF-Polyethylene Glycol-Linear Polyethylenimine as Carrier"", 《PHARM RES》 *
HAN X ET AL.: ""Reversal of pancreatic desmoplasia by re-educating stellate cells with a tumour microenvironment-activated nanosystem"", 《NATURE COMMUNICATIONS》 *
张镇西主编: "《生物医学光子学：诊断、治疗与监测》", 31 August 2017, 西安交通大学出版社 *
邓双林: ""Poly（I:C）和Poly（dA:dT）诱导胶质瘤细胞SNB19分泌IFN-β的作用与机制研究"", 《中国博士学位论文全文数据库 医药卫生科技辑》 *

Cited By (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113720823A (zh) * 2021-05-17 2021-11-30 丹望医疗科技(上海)有限公司 检测类器官最大截面积的方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN110279673B (zh) 2022-11-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Zhang et al. Hydrogen gas improves photothermal therapy of tumor and restrains the relapse of distant dormant tumor
Hu et al. The potentiated checkpoint blockade immunotherapy by ROS-responsive nanocarrier-mediated cascade chemo-photodynamic therapy
CN104013599B (zh) 一种肿瘤特异性靶向给药的药物载体及其应用
Zheng et al. Her2-targeted multifunctional nano-theranostic platform mediates tumor microenvironment remodeling and immune activation for breast cancer treatment
CN108136023A (zh) 血小板膜包覆的药物递送系统
WO2016192451A1 (zh) 一种溶瘤病毒制剂及其制备方法
CN107375935B (zh) 一种温度敏感型水凝胶纳米药物输送系统
Yang et al. 20 (s)-ginsenoside Rg3-loaded magnetic human serum albumin nanospheres applied to HeLa cervical cancer cells in vitro
CN113304123A (zh) 共载jtc801和dna甲基化转移酶抑制剂的仿生纳米药物及制备方法与应用
Qiu et al. Graphene oxide-based nanocomposite enabled highly efficient targeted synergistic therapy for colorectal cancer
CN110408047A (zh) 纳米配位聚合物及其制备方法和应用
Wang et al. Novel bone tumor cell targeting nanosystem for chemo-photothermal therapy of malignant bone tumors
Zhang et al. Precise RNA Editing: Cascade Self‐Uncloaking Dual‐Prodrug Nanoassemblies Based on CRISPR/Cas13a for Pleiotropic Immunotherapy of PD‐L1‐Resistant Colorectal Cancer
Wang et al. B16 membrane-coated vesicles for combined photodynamic therapy and immunotherapy shift immune microenvironment of melanoma
Sui et al. Sialic acid-mediated photochemotherapy enhances infiltration of CD8+ T cells from tumor-draining lymph nodes into tumors of immunosenescent mice
CN110279673A (zh) AuNP@PP/poly(I:C)及其制备方法与其在制备治疗胶质瘤药物中的应用
Wang et al. The Remarkable Anti-Breast Cancer Efficacy and Anti-Metastasis by Multifunctional Nanoparticles Co-Loading Squamocin, R848 and IR 780
Zhang et al. Size-optimized nuclear-targeting phototherapy enhances the type I interferon response for “cold” tumor immunotherapy
Ying et al. Hypoxia response element-directed expression of aFGF in neural stem cells promotes the recovery of spinal cord injury and attenuates SCI-induced apoptosis
Yang et al. Preclinical pharmacokinetics, biodistribution, and acute toxicity evaluation of caerin 1.9 peptide in Sprague Dawley rats
CN114191539B (zh) 一种复合共载送小分子核酸和活性蛋白的外泌体纳米粒子及其制备方法和应用
Hu et al. A multifunctional AIE nanoprobe as a drug delivery bioimaging and cancer treatment system
He et al. Multifunctional PVCL nanogels enable magnetic resonance imaging and immunostimulated radiotherapy of orthotopic glioblastoma
Yan et al. Inhalable metal–organic framework-mediated cuproptosis combined with PD-L1 checkpoint blockade for lung metastasis synergistic immunotherapy
Guo et al. Turning tumor cells into microvesicles as personalized cancer vaccines for cancer prevention and treatment

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20230720

Address after: No.536 Changle Road, Jing'an District, Shanghai 200040

Patentee after: SHANGHAI FIRST MATERNITY AND INFANT Hospital

Address before: 510000 West 601 Huangpu Avenue, Tianhe District, Guangzhou City, Guangdong Province

Patentee before: Du Bin

TR01 Transfer of patent right