JP2003506056A - 腫瘍抑制遺伝子ａｎｘ７のノックアウトマウス - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 腫瘍抑制遺伝子、アネキシンVIIの非機能性対立遺伝子を含有するノックアウトトランスジェニックマウス。本マウスを、アネキシン腫瘍抑制疾患から生じる腫瘍の治療に有用な可能性のある治療薬をスクリーニングするためのモデルとして利用する。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、1999年8月5日に出願した米国仮特許出願第60/147,255号に基づく優
先権を主張する。

【０００２】発明の分野 本発明は腫瘍感受性非ヒト動物に関わる。本発明はさらに、そのような動物を
抗癌剤および治療法の開発に利用することに関する。

【０００３】背景 癌は無制御の細胞成長がもたらす一連の疾患であり、米国だけで1年当たり300
,000人以上に対して難治性の苦痛と死の原因となっている。癌遺伝子と腫瘍抑制
遺伝子は、癌細胞成長を促進するかまたは遅延させる遺伝子作用スペクトルの反
対の両端に位置する。癌の発生は癌遺伝子の活性化および成長抑制遺伝子の同時
不活性化に依ると考えられる（Park,M.,「癌遺伝子（Oncogenes）」,「ヒト癌の
遺伝子的基礎（The Genetic Basis of Human Cancer）」（B.Vogelsteinら.編）
pp.205-228(1998)）。癌遺伝子は、突然変異した優性な形態の細胞の癌原遺伝子
（proto-oncogene）であって細胞増殖を刺激するが、腫瘍抑制遺伝子は劣性であ
って通常、細胞増殖を阻害する（Cooper,1995）。腫瘍抑制の消失または不活性
化は無調節な癌細胞成長の原因の1つであると広く考えられている。癌遺伝子の
発見と同定は比較的簡単に行われてきたが、腫瘍抑制遺伝子の同定は決してそう
でなかった（Fearon,「ヒト癌の遺伝子的基礎（The Genetic Basis of Human Ca
ncer）」(B.Vogelsteinら,編)pp.229-236(1998)）。

【０００４】 癌遺伝子と腫瘍抑制遺伝子は共に基本的な際立った特性を有する。これまで同
定された癌遺伝子は体細胞にだけ生じ、従って、その影響を宿主動物の生殖系に
伝えることはできない。対照的に、腫瘍抑制遺伝子の突然変異は生殖系細胞に確
認することができ、従って動物の子孫に伝えられ得る。そのような腫瘍抑制遺伝
子は1ダース程度同定されており、その機構の知識は治療上有効な洞察をもたら
すであろうという希望がある。

【０００５】 腫瘍抑制遺伝子作用は、腫瘍抑制対立遺伝子の両方の突然変異もしくは欠損、
または腫瘍抑制タンパク質発現の絶対レベルの低下に依存する。その自然の状態
において、腫瘍抑制遺伝子は細胞増殖を抑制するように作用する。そのような遺
伝子が損傷すると、この抑制が消失してそれによる腫瘍形成が起こる。ヌードソ
ン（Knudson）の「二突然変異仮説（two-mutation hypothesis）」はよく研究さ
れた腫瘍抑制遺伝子作用の統計モデルであり、網膜芽細胞腫の疫学的分析に基づ
く（Knudson,A.G.,Proc. Nat. Acad. Sci. USA 68:820-823(1971)）。本モデル
によると、宿主は腫瘍抑制遺伝子についてヘテロ接合性であって、残る1つの機
能性対立遺伝子も突然変異してヌル接合体状態（nullzygous state）を生じると
きに癌が発生する。もう一つのモデルは「ハプロ不足仮説（haplo-insufficient
hypothesis）」であり、ここでは腫瘍細胞が異常に低レベルの野生型腫瘍抑制
遺伝子産物を産生する。このように、これらの両モデルにおいては、細胞成長の
調節解除に腫瘍抑制遺伝子の不活性化が介在しうる（Weinberg,R.A.,Scientific
Amer,Sept.1988,pp44-51）。

【０００６】 腫瘍抑制遺伝子は主に細胞周期に作用して細胞増殖を制御することが知られて
いる。よく研究された例としては、Rb（Weinberg,R.A.,Cell 81:323-330(1996)
）、p53（Greenblatt,M.S.ら,Cancer Res. 54:4855-4878,(1994)；Williams,B.O
.ら,Cold Spring Harbor Symp. Quant Biol. 59:449,(1994))；Levine,A.J.,Cel
l 88:323-331(1997)）、およびp16（Cairns,P.,ら,Nat. Genetics 11:210-212,(
1995))；Okamoto,A.,ら,Cancer Research,55:1448-1451,(1995)）が挙げられる
。細胞周期に作用する腫瘍抑制遺伝子の他の例はp27^KIP1遺伝子であって、単にp
27としても知られ、サイクリン依存性キナーゼを生理学的に阻害し、それによっ
て細胞増殖をブロックする（Fero,M.L.,ら,Nature 396:177-180(1998)）。

【０００７】 腫瘍抑制遺伝子が細胞周期にどのようにして影響を与えるかを理解するには、
細胞周期進行が、活性化サイクリンサブユニットおよび触媒Cdkサブユニットか
らなる特定のサイクリン依存性キナーゼにより調節されることを理解しなければ
ならない（Polyak,K.,ら,Cell 78:59-66(1994)）；Hartwell,L.,Cell 71:543-54
6,(1992)）；Nurse,P.,Nature 344:503-508,(1990)）。哺乳類細胞中のそれぞれ
のサイクリンおよびCdkの機能は、細胞周期の様々な期に対応する。例えば、G1
期の間、サイクリンD-Cdk4/6およびサイクリンE-Cdk2が触媒活性を有し、細胞周
期進行の速度を律する。成長因子はD型サイクリンの合成を誘導してG1期を開始
させる。次いでD型サイクリンはCdk4/Cdk6と会合し、次いで活性CdkはRbを過剰
リン酸化し、細胞を駆動して制限点（restriction point）を通過させる（Buchk
ovich,K.ら,Cell 58:1097-1105(1989)；Weinberg,R.A.,Cell 81:323-330(1996)
を参照）。腫瘍抑制遺伝子は両方のこれらの型のサブユニットの機能に影響を与
えることがわかっている。

【０００８】 細胞周期に加えて、腫瘍抑制遺伝子はまた、転写因子として作用することによ
りおよび／またはゲノムの完全性維持に関わる特定の下流DNA修復ターゲットを
調節することにより、細胞分化を制御することができる。このクラスの腫瘍抑制
遺伝子においては、腫瘍抑制遺伝子p53の不活性化が悪性となる体細胞突然変異
をもたらす最も普通のものである（Nigro,J. M.,ら,Nature 342:705-708(1989)
；cf. NguyenおよびJameson,1998によるレビュー）。特に注意すべきは、p53は
しばしば肺癌（Takahashi,R.,ら,Science 246:491-494(1989)）および膀胱癌（S
idransky,D.,ら,Science 252:706-709(1991)）において突然変異のターゲットで
ある。p53に対する生殖系突然変異は家族性癌、リー-フラウメニ（Li-Fraumeni
）症候群の基因となる（Srivastava,S.,ら,Nature 348:747-749(1990)）。DNA修
復のレベルで、p53は次の様に作用する：DNAが損傷すると、生じたシグナルはp5
3の安定化を生じさせ、順にp21の転写調節解除を生じさせ、G1における細胞周期
停止をもたらす（Hunter,T.,Cell 75:839-841(1993)）。

【０００９】 最後に、腫瘍抑制遺伝子はまた、アポトーシス細胞死の制御に影響を与える（
Graeber,T.G.,ら,Nature 379:88(1996)）。再び、p53がこのプロセスでも重要な
役割を演じる（Basu,A.,ら,Mol. Hum. Reprod. 4:1099-1109(1998)）。この簡単
な概要から得られる明白なメッセージは、個々の腫瘍抑制遺伝子は一つの見方か
らだけで判断できないことである。

【００１０】 これらの腫瘍抑制遺伝子を研究するためには、モデルシステムを開発しなけれ
ばならない。最近の組換えDNAと遺伝子技術の進歩により、新しい腫瘍抑制遺伝
子を発見しかつ評価することが可能である。利用しうる重要なモデルシステムの
一つはトランスジェニック動物である。そのような動物は遺伝子工学的に操作さ
れ、通常または天然では無改変の動物に存在しない遺伝子配列を含有する。この
技術は天然に存在する遺伝子配列の発現の改変を示す動物を作製するためにも利
用されている。

【００１１】 残るのは、新しい腫瘍抑制遺伝子を発見するための、さらなるトランスジェニ
ック動物およびそのような動物を作出する方法の必要性である。

【００１２】発明の概要 本発明は染色体性に組み込まれたトランスジーンを含んでなる体細胞および生
殖系細胞を有するトランスジェニックノックアウト哺乳類を提供する。ゲノムの
腫瘍抑制アネキシン遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子がトランスジーンによ
って破壊され、腫瘍抑制アネキシン遺伝子の発現が阻害されている。内因性腫瘍
抑制アネキシン遺伝子のこの阻害により、野生型哺乳類と比較して腫瘍形成に対
する感受性が増加している。トランスジェニック哺乳類はこの破壊に対してヘテ
ロ接合体であってもよい。好ましくは、ゲノムの腫瘍抑制アネキシン遺伝子はア
ネキシンVIIである。好ましいトランスジェニック哺乳類はトランスジェニック
げっ歯類であり、さらに好ましいトランスジェニック哺乳類はマウスである。

【００１３】 本発明の方法の他の実施形態はトランスジェニック胚性幹細胞の作出である。
本方法は： (a) (i)内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分を有する組換え領域お
よび (ii)細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可能なシグナルを提供
するマーカー配列を含有するトランスジーン構築物を構築し； (b)そのトランスジーンを哺乳類の胚性幹細胞中に導入し；ならびに (c)トランスジーン構築物と腫瘍抑制アネキシン遺伝子の間の正しくターゲッテ
ィングされた相同的組換えを有する胚性幹細胞を選択するステップに関わる。

【００１４】 本発明の他の実施形態は機能的に破壊された内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子
を有するトランスジェニック哺乳類を作出する方法を含んでなる。本方法は： (a) (i)内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分を有する組換え領域お
よび (ii)細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可能なシグナルを提供
するマーカー配列を含有するトランスジーン構築物を構築し； (b)トランスジーンを哺乳類の胚性幹細胞中に導入し； (c)トランスジーン構築物と腫瘍抑制アネキシン遺伝子の間の正しくターゲッテ
ィングされた相同的組換えを有する胚性幹細胞を選択し； (d)ステップ(c)の細胞を胚盤胞中に導入しかつ得られたキメラ胚盤胞を雌哺乳類
中に着床させ；および (e)正しくターゲッティングされた組換えを含んでなる内因性腫瘍抑制アネキシ
ン遺伝子対立遺伝子を担持する子孫を選択するステップに関わる。

【００１５】 本方法にとって好ましいトランスジェニック哺乳類はトランスジェニックげっ
歯類であり、そしてさらに好ましいトランスジェニック哺乳類はトランスジェニ
ックマウスである。最も好ましいトランスジェニック幹細胞はトランスジェニッ
クマウス幹細胞である。最も好ましい腫瘍抑制アネキシン遺伝子はアネキシンVI
I遺伝子である。

【００１６】 本発明の他の実施形態は、試験薬剤の潜在的発癌性を評価する方法であって、
破壊された腫瘍抑制アネキシン遺伝子を含有するトランスジェニック哺乳類を試
験薬剤と接触させ、そして処理したトランスジェニック哺乳類のサンプル中の形
質転換した細胞数を無処理のトランスジェニック哺乳類由来のサンプル中の形質
転換した細胞数と比較する前記方法である。あるいは、対照薬剤で処理したトラ
ンスジェニック哺乳類のサンプル中の形質転換した細胞数と比較してもよい。処
理したトランスジェニック哺乳類中の形質転換細胞数の、処理の非存在または対
照薬剤の存在のもとでの形質転換細胞数に対する差が、試験薬の潜在的発癌性を
示す。

【００１７】 他の実施形態は、内因性野生型アネキシンタンパク質を欠如する哺乳類癌細胞
を治療する方法であって、野生型アネキシン腫瘍抑制遺伝子を哺乳類癌細胞中に
導入することにより、これらの哺乳類癌細胞の異常増殖の表現型が発現したアネ
キシンタンパク質によって抑制される前記方法である。好ましくは、哺乳類癌細
胞は、野生型アネキシン腫瘍抑制遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子を欠如す
る。好ましくは哺乳類癌細胞は、骨肉腫細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、白血病
細胞、軟組織肉腫細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、または前立腺癌細胞である。さ
らに好ましくは、哺乳類癌細胞は突然変異アネキシン腫瘍抑制遺伝子を有する。

【００１８】 他の実施形態は、哺乳類中の異常増殖細胞により特徴づけられる新生物を有す
る患者を治療する方法であって、アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物の細胞成長阻害
活性を有するタンパク質を発現するDNAセグメントを含む組換え複製欠陥ウイル
スの有効用量を投与する前記方法を含んでなる。ある実施形態においては、患者
は機能性アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物を実質的に欠如する細胞を含む新生物を
有する。他の好ましい実施形態においては、新生物は機能性アネキシンVII遺伝
子産物を実質的に欠如する細胞を含む。好ましくは、複製欠陥ウイルスは、レト
ロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、乳
頭腫ウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から選択される。最も好ま
しいウイルスは、組換え複製欠陥アデノウイルス発現ベクターである。

【００１９】 他の実施形態は、機能性アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物の欠如で特徴づけられ
る新生物疾患の治療のための組成物を含んでなる。治療は組換え複製欠陥アデノ
ウイルスの治療上有効用量を製薬上送達可能な形態で投与することを含んでなる
。

【００２０】 他の実施形態は哺乳類の異常増殖細胞により特徴づけられる疾患を治療する方
法であって、 (a)アネキシンタンパク質をコードする発現ベクターを哺乳類に投与し、 (b)発現ベクターを異常増殖細胞中に挿入し、および (c)異常増殖細胞においてこれらの細胞の増殖を抑制するのに有効な量の腫瘍抑
制アネキシン遺伝子を発現させることを特徴とする前記方法を含んでなる。

【００２１】 他の実施形態は、内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分を有す
る組換え領域、ならびに細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可
能なシグナルを与えるマーカー配列を含有するDNA構築物である。好ましい構築
物は以下に記載のKSBX.pPNTである。

【００２２】 他の実施形態は、上記のDNA構築物を含有する細胞を含んでなる。さらに好ま
しくは、細胞は腫瘍細胞であり、最も好ましくは、細胞は内因性野生型アネキシ
ンタンパク質を欠如する哺乳類癌細胞である。他の好ましい実施形態においては
、構築物はKSBX.pPNTである。

【００２３】 他の実施形態は、標準のハイブリダイゼーション条件下でアネキシン配列とハ
イブリダイズしかつアネキシンタンパク質の細胞成長阻害活性を有するタンパク
質をコードする単離されたポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクターであ
る。好ましくは、発現ベクターは、レトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘル
ペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群から
選択される。さらに好ましくは、発現ベクターは組換え複製欠陥アデノウイルス
であり、ポリヌクレオチド配列はアネキシンVII遺伝子に対応する。

【００２４】 他の実施形態は、上記の発現ベクターにより形質転換した細胞を含んでなる。

【００２５】 他の実施形態は、ヒトまたは動物の腫瘍抑制アネキシンVII遺伝子のエキソン
中の多形性または突然変異を同定する方法を含んでなる。本方法は、 (a)増幅条件下で、ヒトまたは動物の腫瘍抑制アネキシン遺伝子のエキソンを含
んでなるゲノムDNAのサンプルを、 (i)プロモーター領域もしくはエキソン上流のイントロンとハイブリダイズする
第1プライマー、および (ii)3'非コード領域もしくはエキソン下流のイントロンとハイブリダイズする第
2プライマー:を含んでなるプライマー対を用いてインキュベートして、プライマ
ー対の少なくとも1つのプライマーをイントロンとハイブリダイズさせ； (b)増幅産物を作製し； (c)エキソンの増幅産物のヌクレオチド配列を決定し；および (d)ステップ(b)にて得たエキソンの配列を対応する野生型エキソンの配列と比較
することに関わる。

【００２６】 多形性または突然変異は、これらの2つの配列間の差として同定する。好まし
くは、エキソンは、エキソン4、エキソン5、エキソン6、エキソン7、およびエキ
ソン8からなる群から選択する。

【００２７】 他の実施形態は製薬製剤であって、標準ハイブリダイゼーション条件下でアネ
キシン配列とハイブリダイズする単離されたポリヌクレオチド配列を含んでなる
発現ベクター、および生理学上許容される希釈剤を含んでなる前記製剤である。

【００２８】詳細な説明 本発明の実施は、断りのない限り、当業界の技術の範囲内にある細胞生物学、
細胞培養、分子生物学、トランスジェニック生物学、微生物学、組換えDNA、お
よび免疫学の通常の技術を利用する。そのような技術は、文献に全て説明されて
いる。例えば、「分子クローニング実験マニュアル（Molecular Cloning A Labo
ratory Manual）」,第2版,Sambrook, FritschおよびManiatis編(Cold Spring Ha
rbor Laboratory Press:1989)；「DNAクローニング（DNA Cloning）」,Volumes
IおよびII(D.N.Glover編,1985)；「オリゴヌクレオチド合成（Oligonucleotide
Synthesis）」(M.J.Gait編,1984)；Mullisら,米国特許第4,683,195号；「核酸ハ
イブリダイゼーション（Nucleic Aci Hybridization）」（B.D.Hames & S.J.Hig
gins編,1984)；「転写および翻訳（Transcription And Translation）」(B.D.Ha
mes& S.J.Higgins編,1984)；「動物細胞の培養（Culture Of Animal Cells）」(
R.I.Freshney, Alan R. Liss,Inc.,1987)；「固定化細胞と酵素（Immobilized C
ells And Enzymes）」(IRL Press,1986)；B.Perbal,「分子クローニングへの実
用的手引き（A Practical Guide To Molecular Cloning）」(1984)；シリーズ,
「（酵素学の方法（Methods In ENZYMOLOGY）」(J.AbelsonおよびM.Simon,主編
者,Academic Press,Inc,New York),特にVols.154および155 (Wuら編)およびVol.
185,「遺伝子発現技術（Gene Expression Technology）」(D. Goeddel,編)；「
哺乳類細胞用の遺伝子導入ベクター（Gene Transfer Vectors For Mammalian Ce
lls）」(J.H.MillerおよびM.P.Calos編,1987,Cold Spring Harbor Laboratory)
；「細胞および分子生物学における免疫化学的方法（Immunochemical Methods I
n Cell And Molecular Biology）」(MayerおよびWalker,編,Academic Press,Lon
don,1987)；「実験免疫学のハンドブック（Handbook Of Experimental Immunolo
gy）」,Volumes I-IV (D.M.WeirおよびC.C.Blackwell,編,1986)；および「マウ
ス胚の操作（Manipulating the Mouse Embryo）」,(Cold Spring Harbor Labora
tory Press,Cold Spring Harbor,N.Y.,1986)を参照。

【００２９】I. 定義 周知のごとく、ヒトおよび動物（特に、げっ歯類（すなわち、マウス、ラット
、ハムスターなど）、ウサギ、ヒツジ、ヤギ、魚類、ブタ、ウシおよび非ヒト霊
長類）の細胞は「二倍体」細胞であり、従って当然それらのゲノムのそれぞれお
よび全ての遺伝子の2コピー（「対立遺伝子」）を含有する。細胞の「ゲノム」
は、その遺伝性DNA（染色体または非染色体（すなわち、エピソーム、ウイルス
など）のいずれか）の全てからなる。遺伝子の2つの対立遺伝子の1つは動物また
は細胞の母親から与えられ、他のセットはその父親から与えられる。ヒトおよび
動物細胞の二倍体性質は、Lewin,B.(「遺伝子（Genes）」V,Oxford Univ. Press
,New York(1994))、およびその他の類似報文に記載されている。

【００３０】 細胞が、ある遺伝子について2つの同一なまたは実質的に類似した対立遺伝子
を有するとき、それを「ホモ接合性（homozygous）」と呼ぶ。対照的に、細胞が
2つの実質的に異なる対立遺伝子を有するときは、その遺伝子について「ヘテロ
接合性（heterozygous）」と呼ぶ。もし両方の対立遺伝子が非機能性であれば、
その細胞を「ヌル接合性（nullizygous）」と呼ぶ。

【００３１】 対立遺伝子は細胞内で働いている自然のプロセスによって発現する能力を有し
うる。対立遺伝子が発現すると遺伝子産物が産生する。本明細書で使用される用
語「対立遺伝子」は、ある特定の遺伝子を発現に作用する任意のヌクレオチド配
列を意味することを意図する。本用語は従って、遺伝子の任意のエンハンサー、
プロモーター、プロセシング、介在、コードもしくは終結配列もしくは領域、ま
たは遺伝子産物もしくはそのmRNAを安定化する任意の配列、などを意図する。

【００３２】 遺伝子の対立遺伝子は、もし(1)細胞または動物中に発現されなければ、(2)対
立遺伝子の発現が遺伝子の正常の対立遺伝子の発現に対して改変されれば、また
は(3)対立遺伝子が遺伝子産物を発現するが、その産物がその遺伝子の正常の対
立遺伝子の遺伝子産物と比較して、改変された構造、活性、または特性を有する
ならば、「突然変異した」といわれる。

【００３３】 従って、本明細書で使用される用語「突然変異」または「突然変異した」は、
対立遺伝子の任意のヌクレオチド配列または領域の「正常な」または「野生型」
ヌクレオチド配列における改変を意味することを意図する。本明細書で使用され
る用語「正常な」または「野生型」は、同義であって、自然界において典型的に
見出される任意のヌクレオチド配列を意味することを意図する。従って、用語「
突然変異した」および「正常な」は互いに相対的に定義される。すなわち、細胞
がある遺伝子においてヌクレオチド配列の異なる2つの染色体性の対立遺伝子を
有する場合、これらの対立遺伝子の少なくとも1つが本明細書で使用される用語
の「突然変異体」対立遺伝子である。これらの定義に基づくと、「内因性腫瘍抑
制遺伝子」は、細胞に通常存在する「野生型」腫瘍抑制遺伝子であり、そして「
突然変異アネキシン腫瘍抑制遺伝子」は野生型遺伝子とヌクレオチド配列が異な
る遺伝子を示す。

【００３４】 突然変異は3つの効果のうちの1つを有しうる。1つの効果として、突然変異は
対立遺伝子の発現を検出可能に改変しうる。これは、対立遺伝子が転写、プロセ
シングまたは翻訳される程度に影響を与えるようなヌクレオチド配列の変化のい
ずれかを意味する。そのような改変は、例えば、(1)エンハンサー、(2)プロモー
ター、(3)対立遺伝子のコード領域もしくは終結領域、(4)遺伝子産物もしくはそ
のmRNAを安定化する突然変異、などの改変でありうる。

【００３５】 第2の効果として、突然変異は対立遺伝子の活性を検出可能に改変しうる。こ
れは、発現した遺伝子産物が、その遺伝子産物のある機能に介在する能力を改変
するようなヌクレオチド配列の任意の改変を意味する。このような突然変異には
、発現した産物の１以上の機能を低下するか不活性化する変化が含まれる。重要
なのは、そのような改変には、遺伝子産物のいずれかの機能（例えば、触媒また
は結合活性）にその遺伝子産物が介在する能力を増加させるような変化も含まれ
ることである。

【００３６】 第3の効果としては、突然変異は対立遺伝子の機能を検出可能に改変しうる。
これは、結合分子（結合タンパク質など）が対立遺伝子と特異的に結合する能力
を改変するヌクレオチド配列の任意の変化を意味する。

【００３７】 腫瘍抑制アネキシン遺伝子にこれらの効果を起こす突然変異は、配列決定、腫
瘍形成能、腫瘍形成能に対する反発性（resilience）、結合活性などによって容
易に同定できる（例えば、本明細書に全てを参照により組み入れられるEliyahu
ら,Nature 312:646-649(1984)；Finlayら,Molec. Cell. Biol. 8:531-539(1988)
；Nigro,J. M.ら,Nature 342:705-708(1989)を参照）。

【００３８】 ある対立遺伝子が、細胞がその祖先から遺伝したかもしくは動物がその親から
遺伝した遺伝子の2つの対立遺伝子の1つであるか、またはそれで置き換わる場合
、対立遺伝子は「染色体性」と称される。ある対立遺伝子は、それが細胞内に存
在する特定遺伝子の対立遺伝子の全コピー数を増加する場合、本明細書で使用さ
れる用語の「染色体性」ではない。

【００３９】 本発明に従って作製しうる細胞には、「生殖系」細胞と「体」細胞の両方が含
まれる。「生殖系」細胞は精子細胞もしくは卵細胞、またはいずれかの前駆体も
しくは祖先であり；そのような細胞は子孫動物の形成時にそれらのゲノム（改変
した腫瘍抑制対立遺伝子を含む）を伝達する潜在能力を有する。「体」細胞は生
殖系細胞でない細胞である。

【００４０】 本明細書で使用される用語「トランスジーン」は、それを導入するトランスジ
ェニック動物もしくは細胞にとって部分的または完全に非相同的な、すなわち外
来である核酸配列か、または、それを導入するトランスジェニック動物もしくは
細胞の内因性遺伝子に対して相同的であるが、挿入される細胞のゲノムを改変す
る（例えば、天然の遺伝子と異なる位置に挿入されるかまたその挿入がノックア
ウトをもたらす）方法で動物のゲノム中に挿入されるように設計されたかまたは
挿入された核酸配列を意味する。トランスジーンは、選択された核酸の最適な発
現に必要でありうる1以上の転写調節配列およびイントロンなどのその他の核酸
に、機能的に連結されていてもよい。本発明における典型的なトランスジーンは
、たとえばアネキシンポリペプチド、好ましくはANX7ポリペプチドをコードする
。他の典型的なトランスジーンは、アネキシン遺伝子、好ましくはanx7遺伝子の
ゲノム配列との相同的組換えにより１以上のゲノムアネキシン遺伝子を破壊する
ことに関与する。

【００４１】 本発明のトランスジェニック動物は全てその複数の細胞内に本発明のトランス
ジーンを含有し、そのトランスジーンが細胞成長の調節、死および／または分化
に関して「宿主細胞」の表現型を改変する。1以上の本明細書に記載のトランス
ジーン構築物を利用して、本発明のトランスジェニック生物を作製することが可
能であるので、外因性遺伝子材料を一般的に参照することによってトランスジェ
ニック生物作製の一般的な説明を行う。当業者であれば、以下に説明した方法と
材料を使って特定のトランスジーン配列を生物中に組み込むために、この一般的
な説明を適用することができる。

【００４２】 典型的な実施形態においては、本発明の「トランスジェニック非ヒト動物」は
、トランスジーンを非ヒト動物の生殖系中に導入することによって作製する。様
々な発生段階の胚性標的細胞を用いてトランスジーンを導入することができる。
胚性標的細胞の発生段階によって、用いる方法は異なる。本発明を実施するため
に用いる任意の動物の特定系列を、全体的な健康、良好な胚収率、胚の良好な前
核可視度、および良好な生殖適合性について選択する。さらに、ハプロタイプが
重要な因子である。例えば、トランスジェニックマウスを作製するときに、C57B
L/6またはFVB系がしばしば使用される（Jackson Laboratory,Bar Harbor,Me.）
。本発明を実施するために使用する系は、それ自身トランスジェニックであって
もよく、および／またはノックアウトであってもよい（すなわち、部分的または
完全に抑制された1以上の遺伝子を有する動物から得てもよい）。

【００４３】 トランスジーン構築物は、一次胚中に導入することができる。接合体はマイク
ロインジェクションのための最良の標的である。接合体を遺伝子導入の標的とし
て使用すると、ほとんどの事例において、注入したDNAが最初の分裂前に宿主遺
伝子中に組み込まれうるという大きな利点がある（Brinsterら(1985)PNAS 82:44
38-4442）。その結果、トランスジェニック動物の全細胞が、組み込まれたトラ
ンスジーンを有しうる。生殖細胞の50％はそのトランスジーンを担持しうるので
、これはまた全般的に、創始者の子孫へのトランスジーンの効率的な伝達にも反
映される。

【００４４】 通常、受精胚は適当な培地中で前核が現れるまでインキュベートする。ほぼこ
の時点で、トランスジーンを含んでなるヌクレオチド配列を以下に記載のように
して雌性または雄性前核中に導入する。マウスなどの種では、雄性前核が好まし
い。外因性遺伝子材料を接合体の雄性DNA補体に加えるのは、それが卵核もしく
は接合体雌性前核によるプロセシングを受ける前であることが最も好ましい。卵
核もしくは雌性前核は雄性DNA補体に影響を与える分子を放出するが、この影響
は恐らく雄性DNAのプロタミンをヒストンと置換えて、雌性と雄性DNA補体の結合
による二倍体接合体の形成を容易にすることによると考えられる。

【００４５】 従って、外因性遺伝子材料は、雌性前核により影響を受ける前に、雄性のDNA
補体またはいずれか他のDNA補体に加えるべきである。例えば、雄性前核形成後
すぐに、すなわち、雄性および雌性前核が十分分離されてかつ両方が細胞膜に近
接して位置するときに、外因性遺伝子材料を初期雄性前核に加える。あるいは、
精子の核が非凝縮（decondensation）へ誘導された後に外因性遺伝子材料をこれ
に加えてもよい。次いで外因性遺伝子材料を含有する精子を卵子に加えてもよく
、または非凝縮精子を卵子に加えてその後すぐにトランスジーン構築物を加えて
もよい。

【００４６】 外因性遺伝子材料の核遺伝子材料中への添加を可能にするいずれの技術でも、
その技術が細胞、核膜、または他に存在する細胞構築物もしくは遺伝子構造物を
破壊しない限り、利用することができる。トランスジーンヌクレオチド配列の胚
への導入は、当業界で周知の手段、例えばマイクロインジェクション、エレクト
ロポレーション、またはリポフェクションなどの任意の方法により達成できる。
好ましくはマイクロインジェクションによって外因性遺伝子材料を核遺伝子材料
中に挿入する。細胞および細胞構造物のマイクロインジェクションは当業界では
周知でありかつ利用されている。マウスでは、雄性前核は、直径が約20マイクロ
メートルのサイズに達し、1〜2plのDNA溶液の再現性ある注入が可能である。ト
ランスジーンヌクレオチド配列を胚中に導入した後、胚を様々な時間にわたって
、in vitroでインキュベートしてもよく、または代理宿主中に再着床させてもよ
く、またはその双方を行ってもよい。成熟までのin vitroインキュベーションは
本発明の範囲に含まれる。通常の方法の一つでは、胚をin vitroで、種によって
変わるがほぼ1〜7日間インキュベートし、次いでそれらを代理宿主中に再着床さ
せる。

【００４７】 接合体に加えるトランスジーン構築物のコピー数は、加える外因性遺伝子材料
の全体量に依存し、遺伝的形質転換が起こり得る量となる。理論的には１コピー
のみが必要である；しかし、一般的には、１コピーが機能することを保証するた
めに、多数のコピー、例えばトランスジーン構築物の1,000〜20,000コピーを利
用する。本発明については、外因性DNA配列の表現型発現を増強するために、挿
入した外因性DNA配列それぞれの1以上の機能性コピーを有することがしばしば有
利である。

【００４８】 代理宿主のトランスジェニック子孫は、適当な方法により、トランスジーンの
存在および／または発現についてスクリーニングすることができる。スクリーニ
ングはしばしば、トランスジーンの少なくとも一部分と相補的であるプローブを
使い、サザンブロットまたはノーザンブロット分析により実施される。トランス
ジーンがコードするタンパク質に対する抗体を利用するウェスタンブロット分析
を、トランスジーン産物の存在をスクリーニングするための代替のまたは追加の
方法として用いてもよい。典型的には、DNAを尾組織から調製し、トランスジー
ンについてサザン分析またはPCRにより分析する。あるいは、最高レベルでトラ
ンスジーンを発現すると考えられる組織または細胞を、サザン分析またはPCRを
用いてトランスジーンの存在および発現について試験するが、いずれの組織また
は細胞型をこの分析に使ってもよい。

【００４９】 トランスジーンの存在を評価する代替のまたは追加の方法としては、限定され
るものでないが、酵素および／または免疫学的アッセイなどの好適な生化学アッ
セイ、特定のマーカーまたは酵素活性に対する組織学的染色、フローサイトメト
リー分析、などが挙げられる。血液分析も、血中のトランスジーン産物の存在を
検出するのに、ならびに様々な種類の血球および他の血液成分のレベルに対する
トランスジーンの影響を評価するのに有用である。

【００５０】 トランスジェニック動物の子孫は、トランスジェニック動物を適当なパートナ
ーと交配することにより、またはトランスジェニック動物から得た卵子および／
もしくは精子のin vitro受精により得ることができる。パートナーとの交配を行
う場合、パートナーはトランスジェニックおよび／またはノックアウトであって
もよいしまたはそうでなくてもよい；パートナーがトランスジェニックである場
合、同じかまたは異なるトランスジーンまたはそれらの両方を含有してもよい。
あるいは、パートナーは親系列であってもよい。in vitro受精を利用する場合、
受精胚を代理宿主に着床させてもまたはin vitroでインキュベートしてもよく、
または両方を行ってもよい。いずれかの方法を使って、その子孫をトランスジー
ンの存在について上記の方法または他の適当な方法を使って評価することができ
る。

【００５１】 本発明によって作製したトランスジェニック動物は外因性遺伝子材料を含有す
る。上に説明したように、ある特定の実施形態においては、外因性遺伝子材料は
ANX7タンパク質の産生をもたらすDNA配列（アゴニストまたはアンタゴニスト）
であり、その配列は転写調節エレメント、例えばプロモーターと結合しており、
好ましくは特定の細胞種においてトランスジーン産物の発現を可能にする。

【００５２】 レトロウイルス感染を利用してトランスジーンを非ヒト動物中に導入すること
もできる。発生中の非ヒト胚はin vitroで胚盤胞段階まで培養できる。この期間
に、割球をレトロウイルス感染の標的とすることができる（Jaenich,R.(1976)PN
AS 73:1260-1264）。割球を効率的に感染させるには、酵素処理をして透明帯を
除去する（「マウス胚の遺伝子操作（Manipulating the Mouse Embryo）」,Hoga
n編,(Cold Spring Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,1986)。トラ
ンスジーンを導入するために使うウイルスベクター系は典型的にはトランスジー
ンを担持する複製欠陥レトロウイルスである（Jahnerら,(1985) PNAS 82:6927-6
931；Van der Puttenら,(1985) PNAS 82:6148-6152）。割球をウイルス産生細胞
の単層上で培養することによって、感染は容易かつ効率的に行われる（Van der
Putten,前掲；Stewartら,(1987) EMBO J. 6:383-388）。あるいは、感染をそれ
より後の段階で実施してもよい。ウイルスまたはウイルス産生細胞を胞胚腔中に
注入してもよい（Jahnerら,(1982),Nature 298:623-628）。組込みがトランスジ
ェニック非ヒト動物を形成した細胞のサブセット中にだけ起こるので、ほとんど
の創始者は、トランスジーンについてモザイクとなる。さらに、創始者はゲノム
の異なる位置にトランスジーンの様々なレトロウイルス性の挿入を含み、一般的
に子孫において隔離することになる。さらに、妊娠中期胚の子宮内レトロウイル
ス感染によって、トランスジーンを生殖系中に導入することもできる（Jahnerら
,(1982)前掲）。

【００５３】 トランスジーン導入のための第三のタイプの標的細胞は胚性幹細胞（ES）であ
り、これは本発明の好ましい方法である。ES細胞はin vitroで培養した着床前胚
から得られ、胚と融合している（Evansら,(1981),Nature 292:154-156；Bradley
ら,(1984),Nature 309:255-258；Gosslerら,(1986) PNAS 83:9065-9069；および
Robertsonら,(1986),Nature 322:445-448）。トランスジーンは、DNAトランスフ
ェクションにより、またはレトロウイルスが介在する形質導入により、ES細胞中
に効率よく導入することができる。このような形質転換したES細胞は、その後、
非ヒト動物由来の胚盤胞と組み合わせることができる。ES細胞は、その後、胚を
定着させ、得られるキメラ動物の生殖系に寄与する。レビューはJaenisch, R. (
1988) Science 240:1468-1474を参照。

【００５４】II. 発明 上記の方法のいずれを用いても、本発明は、腫瘍抑制遺伝子の少なくとも1つ
の突然変異染色体対立遺伝子を含有している非ヒトトランスジェニックおよびキ
メラの動物および細胞の生産に関する。本発明は、任意のアネキシン腫瘍抑制遺
伝子を対象としたそのような細胞および非ヒト動物の形成を包含する。アネキシ
ンVII腫瘍抑制遺伝子に関連させて本発明について以下で具体的に説明するが、
この例により本発明の範囲を限定しようとするものではない。この遺伝子を操作
してそのような突然変異対立遺伝子を有する非ヒトトランスジェニック動物を産
生する能力について、特定の破壊対立遺伝子に関連させて具体的に説明する。し
かしながら、本発明および本明細書に開示されている方法を用いてanx7遺伝子に
任意の可能な突然変異を誘発することができることを理解しなければならない。
特に、本発明には、以下で説明する致死的ヌル接合状態の原因となるanx7遺伝子
の特定の突然変異を有する動物細胞および非ヒトトランスジェニックまたはキメ
ラ動物の生産が含まれる。

【００５５】 ヌル接合anx7(-/-)トランスジェニックマウス突然変異体は、初期胚形成中、
致死表現型を有する。しかしながら、ヘテロ接合anx7(+/-)トランスジェニック
マウスは、性的二形性巨人症、汎発性臓器巨大症、巣状過形成症および異形成症
の表現型を呈するとともに、異種の自然発生腫瘍の発生率の増加を示す。異形成
症と腫瘍の発生率の増加との組み合わせにより、anx7遺伝子が腫瘍抑制遺伝子で
ありうることが最初に示唆された。腫瘍抑制活性に関する予備的直接的試験とし
て、野生型ヒトanx7遺伝子を、2つのヒト前立腺腫瘍細胞系、乳癌細胞系、およ
び骨肉腫細胞系にトランスフェクトした。このanx7遺伝子を用いる実験では、野
生型p53遺伝子を有する正の対照の場合と同じように、系統的に腫瘍細胞増殖停
止が起こった。したがって、anx7は腫瘍抑制遺伝子であることが結論づけられた
。両方のanx7対立遺伝子の消失(突然変異または欠失のいずれかによる)は、胚の
致死事象であることが判明した。

【００５６】III. アネキシン遺伝子、特に、アネキシンVII遺伝子(anx7) 本発明は、非ヒト動物または動物細胞のアネキシン遺伝子、好ましくはanx7遺
伝子の2つの天然に存在するコピーのうちの1つが、突然変異(たとえば、天然に
存在するアネキシン遺伝子配列の欠失、挿入、または置換)によって機能しなく
なった非ヒト動物または動物(ヒトを含む)細胞に関する。

【００５７】A. アネキシンの一般的性質 アネキシンは、いずれもCa²⁺およびリン脂質を結合する能力を有する構造的に
関連したタンパク質のファミリーである。これらの遺伝子は、哺乳類から糸状菌
さらには植物までも含めた多くの生物で報告されてきた(Raynal and Pollard, B
BA 1197: 63-93 (1994))。Ca²⁺の存在下で、アネキシンは、非常に大きい親和力
で酸性リン脂質に結合する(アネキシンVのK_dはnM領域にある)。すべてのアネキ
シンのCa²⁺結合の類似性は、それらの共通した一次構造、ユニークなN末端ドメ
イン(「テール」)および保存されたC末端ドメイン(「コア」)に起因する。アネ
キシンVIは例外であるが、保存されたC末端ドメインは、常に、「エンドネキシ
ンフォールド」と呼ばれる相同性が増大した領域を含む約70アミノ酸の4リピー
ト(アネキシンVIでは8リピート)から構成されている。この保存された一次構造
により、すべてのアネキシンは、互いに高度の同一性を有している。哺乳類内で
は、アネキシンは、ファミリーの任意の他のメンバーと40%〜60%の同一性を有し
ている。(Hauptmann, R. et al. Eur. J. Biochem. 185:63-71 (1989))。

【００５８】B. アネキシンの分子生物学 アネキシンI、II、III、およびVIIに関して行ったゲノム分析から、これらの
アネキシン遺伝子の構成に著しい類似性が見いだされた。アネキシンI、II、お
よびIIIでは、エキソン-イントロン境界の位置が、コアドメイン中で非常によく
保存されている。しかしながら、anx7遺伝子のゲノム構造を他のアネキシンのも
のと比較したところ、コアドメイン中の10スプライス部位のうち5つだけが保存
されていることが分かった。これらの研究結果から、アネキシン遺伝子は共通の
祖先遺伝子に由来するが、前駆体は、一方では、アネキシンI、II、およびIIIに
向けて、他方では、anx7に向けて、その進化中に分岐的なリモデリングを経たこ
とが示唆される。アネキシン遺伝子のエキソン-イントロン構成とそれらの各タ
ンパク質の一次構造との間には明瞭な関係は存在しない。

【００５９】C. 腫瘍抑制遺伝子としてのアネキシン 最近、腫瘍抑制遺伝子の候補として、アネキシン遺伝子のファミリー、特に、
anx7遺伝子(別名、シネキシン)に関心が集まっている。anx7遺伝子に関する初期
の研究により、ほぼすべての細胞でそれが少量発現されること明らかにされた(C
reutz, E. C., et al., J. Biol. Chem. 254:553-558 (1978); ibid, 1979; Ray
nal and Pollard, BBA Biomembranes 1197:63-93 (1994))。実際に、anx7は、ヒ
ト(Shirvan, A., et al., Biochemistry 33:6888-6901 (1994))、マウス(Zhang-
Keck, Z-Y., et al., Biochem. J. 289:735-741 (1993), Zhang-Keck, Z-Y. , e
t al., Biochemical J. 301:835-845 (1994))、ツメガエル(Srivastava, S., et
al., Biochemical J. 316:729-736 (1996))、およびタマホコリカビ(Greenwood
, M., et al., Biochim Biophys Acta 1088(3):429-32 (1991); Doring, V., et
al., J. Biol. Chem. 266:17509-17515 (1991); Gierke, V., et al., J. Biol
. Chem. 226:1697-1700 (1991))などのさまざまな生物において、単一コピー遺
伝子として系統発生全体にわたって見いだされる。

【００６０】D. アネキシンVII ヒトでは、anx7遺伝子は、染色体10q21上に見いだされる。可能性のある他の
腫瘍抑制遺伝子は、anx7遺伝子のすぐ近くの染色体10q上に存在すると推定され
ている。具体例としては、10q21.1に存在する粘液様軟骨肉腫(Shen, W. P., et
al., CancerGenet. Cytogenet. 45:207-215 (1990)); 10q21.1に存在する散発性
非髄様甲状腺癌(Jenkins, R. B., et al., Cancer66: 1213-1220 (1990)); 10q2
1-23に存在する腎細胞癌(Morita, R., et al., Cancer Res. 51: 5817-5820 (19
91)); 10q21に存在する慢性骨髄性白血病(Shah, N. K., et al., Cancer Genet.
Cytogenet., 61;183-192 (1992)); 10q21-26に存在する神経膠腫(Oberstrass,
J., et al., Verh Dtsch. Ges. Pathol. 78:413-417, (1994)); 10pter-q11およ
び10q24-q26の2つの独立した領域に存在する神経膠芽細胞腫(Steck, P. A., eta
l., Genes Chromosomes Cancer 12:255-261 (1995)); 逆方向非ret重複の10q21
〜10q11に存在する結腸腺癌(Solic, N., et al., Int. J. Cancer 62:48-57, (1
995)); 10q21-10qterに存在する肺癌(Petersen, S., et al., Br. J . Cancer 7 7 :270-276 (1998)); 10qに存在する肝細胞癌(Piao, Z., et al., Int. J. Cance
r 75:29-33 (1996)); ならびに10q21および10q23-24の2つの独立した遺伝子座に
存在する前立腺癌(Lacombe, L., et al., Int. J. Cancer 69:110-113 (1996))
が挙げられる。最近、染色体10q24-25上の頻繁に欠失する遺伝子座にはPTEN腫瘍
抑制遺伝子が含まれていることが明らかにされた(Li J., et al., Science 275:
1943-1947(1997))。このことから、この領域に多数の候補腫瘍抑制遺伝子が存在
するという考えが支持される。最後にFord, S.らは、前立腺の腺癌細胞系LNCaP
において染色体10の長腕が再配列されることを実証した(Cancer Genet. Cytogen
et. 102:6-11 (1998))。

【００６１】 ANX7タンパク質の細胞内分布は膜に集中しており、より少量が核に存在する(C
ardenas, A. M., et al., Biochim. Biophys. Acta. 1:234,255-260 (1994); Ku
ijpers, G. A. J., et al., Cell Tissue Res. 269:323-330 (1992))。ANX7タン
パク質は、Ca²⁺依存性膜融合活性を有しており(Creutz, C.E., et al., J. Biol
. Chem. 253:2858-2866 (1978); Creutz, C.E., et al., J. Biol. Chem. 254:5
53-558 (1979))、その活性は、GTPによってさらに増強される(Caohuy, H., et a
l., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 93:10797-10802 (1996))。ANX7機能に及ぼ
すGTPの作用は、内因性Ca²⁺活性化GTPaseによって調節される。ANX7 GTPase活性
は、Al₂F₆およびマストパランのような従来のGタンパク質の重要なモジュレータ
ーの影響を受け易い(Caohuy, H., et al., Secretory Systems and Toxins (eds
., Linial, M., et al.) 2:439-449 (1998))。培養細胞を用いた研究では、ANX7
がGTPに結合して加水分解させることを実証することができる。また、ANX7タン
パク質は、GTPにより長い開いた状態で安定化させることのできるCa²⁺チャンネ
ルを膜中に形成する(Pollard, H.B., et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 8 5 :2974-2978 (1988))。

【００６２】 プロテインキナーゼCは、in vitroおよびin vivoの両方において、P/タンパク
質のモル比2:1でANX7をリン酸化する。このことは、細胞周期におけるANX7の機
能と直接関連している可能性がある。なぜなら、PKCの多くのアイソフォームが
、細胞内シグナリングの活性化(Nishizuka, Y. , Science 258:607-614 (1992))
、特に、有糸分裂の活性化(Kolch, W., et al., Nature 364:426-428 (1993); B
erra, E., et al., Cell 74:555-563 (1993); Cacace, A. , et al., Oncogene
8:2094-2104 (1993); Morrisson, D.K., et al., Proc. Nat. Acad. Sci. (USA
) 85:8855-8859 (1998))および腫瘍形成の活性化(Housey, G.M., et at., Cell,
52:343-354 (1988); Mischak, H., et al., J. Biol. Chem. 268:6090-6096 (1
993); Persons, D.A., et at., Cell 52:447-458 (1988))に直接関与しているか
らである。また、定量的ホスホ-ANX7付加物が、EGF(表皮増殖因子)受容体および
pp603^srcを用いてin vitroで調製された。さらに、in vivoにおいて表皮増殖因
子(EGF)および血小板由来増殖因子(PGDF)のようなチロシンキナーゼアクチベー
ターで処理された細胞は、内因性ANX7のリン酸化を助長する。これらの反応は、
現在までのところ、生物学的重要性が分かっていない。しかしながら、そのよう
な反応性と腫瘍抑制遺伝子活性との関連は、乳癌および卵巣癌感受性の遺伝子BR
CA1のスプライス変異体がホスホチロシンを含有しており細胞周期調節において
役割を担っているという報告から明らかである(Cui, J. Q. , et al., Oncol. R
ep. 5: 585-589 (1998); Wang, H. , et al., Oncogene 15: 143-157 (1997); Z
hang, H. T. , et al., Oncogene 14: 2863-2869 (1997))。

【００６３】IV. 突然変異アネキシン遺伝子産物と正常アネキシン遺伝子産物との相互作用 腫瘍形成のクローン的性質に関する研究の結果、腫瘍は単クローン的組成を有
しているので単一始原細胞のクローン増殖によって生じるとの提案がなされた(F
earson, E. R. et al., Science 247:193-197 (1987))。

【００６４】 腫瘍抑制遺伝子の作用機序について説明する最も単純なモデルは、悪性疾患が
2つの個別の遺伝的事象を必要とすることである(たとえば、欠失または突然変異
による細胞の機能性anx7対立遺伝子の両方の消失)。2つの天然anx7対立遺伝子の
うち一方だけを不活性化させると、動物は癌増殖をより受け易くなる。

【００６５】 腫瘍抑制遺伝子の生物学的意味を調べるために、トランスジェニック動物を使
用してもよい(Capecchi, M. R., Science 244:1288-1292 (1989))。Lavigueur、
A.らは、内因性の2つの野生型p53対立遺伝子に加えて1つの追加突然変異体p53遺
伝子を有するトランスジェニックマウスを構築した。マウスおよびその後代は、
追加のp53遺伝子を過剰発現した。マウスは、肺、骨、およびリンパの腫瘍発生
率が高いことが分かった(Lavigueur, A. et al., Molec. Cell. Biol. 9:3982-3
991 (1989))。

【００６６】 したがって、本発明は、ゲノムが1つの正常な機能性anx7対立遺伝子と1つの非
機能性(突然変異)anx7対立遺伝子とを有するトランスジェニック動物を提供する
。そのような動物を使用することにより、1つのanx7対立遺伝子の消失によって
生じる結果を検討することが可能であり、したがって、発癌および腫瘍形成の過
程を解明するうえでかなり役に立つであろう。そのような動物はまた、可能性の
ある発癌物質のスクリーニング、新規な抗新生物治療薬の開発、および遺伝子治
療にも有用であろう。

【００６７】V. 相同的組換え 本発明では、動物細胞、最も好ましくは胚幹(ES)細胞、の天然に存在するanx7
配列に特定の突然変異を導入するために、相同的組換え法を使用する。この場合
、非ヒト動物の突然変異ES細胞を好適な細胞培養培地で培養するかまたは好適な
レシピエントの子宮に導入して非ヒト動物を発生させることができる。このほか
、本発明の方法を用いて非ヒト動物の体細胞を改変することによりキメラ非ヒト
動物を生産することが可能である。

【００６８】 したがって、本発明を十分理解するために、相同的組換え法(Watson, J. D.,
In: Molecular Biology of the Gene, 3rd Ed., W. A. Benjamin, Inc., Menlo
Park, Calif. (1977))を理解することが望ましい。

【００６９】 簡潔に述べると、相同的組換えとは、同一または実質的に同等である配列(す
なわち、「相同的」)を有する2つの核酸分子を切断して、次に、それぞれ最初に
存在していた分子の1領域が別の最初に存在していた分子の領域に連結されるよ
うに2つの分子を連結させる、よく研究された天然の細胞過程である (Sedivy, J
. M., Bio-Technol. 6:1192-1196 (1988))。

【００７０】 このように、相同的組換えとは、細胞が一方のDNA分子から他方のDNA分子にDN
Aの「領域」を移すことのできる配列特異的過程である。本明細書中で使用する
場合、DNAの「領域」とは、一般的には、任意の核酸分子を意味するものとする
。領域は、単一の塩基から染色体の実質的断片まで、任意の長さであってよい。
2つのDNA分子間で相同的組換えを起こすために、分子は、互いに「相同領域」を
有していなければならない。そのような相同領域は、少なくとも2塩基対の長さ
であり、かつ実質的に同じ核酸配列を有していなければならない。

【００７１】 組換えは、原核細胞および真核細胞の両方に天然に存在する酵素によって触媒
される。DNAの領域の移動は、多段階過程により生じると考えることも可能であ
る。

【００７２】 2つの関与分子のうちいずれかが環状分子である場合、組換え事象の結果とし
て、別の関与体に環状分子が組み込まれる。重要なこととして、特定の領域が相
同領域(同じであってもよいが、好ましくは異なっている)に隣接して存在する場
合、2つの組換え事象が生じて、2つのDNA分子間でDNAの領域の交換が起こる可能
性がある。組換えは、「相互」組換えであってよく、その場合には2つの組換えD
NA分子間でDNA領域の交換が起こる。このほか、「非相互」組換え(「遺伝子変換
」とも呼ばれる)であってもよく、両方の組換え核酸分子は同じヌクレオチド配
列を有することになる。2事象組換え交換で交換される領域のサイズまたは配列
に関して制限はない。

【００７３】 2つのDNA分子間の組換えの頻度は、導入されるDNAを組換えを刺激する因子で
処理することにより増強される可能性がある。そのような因子としては、たとえ
ば、トリメチルプソラレン、UV光などが挙げられる。

【００７４】VII. キメラ動物およびトランスジェニック動物の生産: 遺伝子ターゲッティン
グ法 規定の特異的遺伝的改変を有する動物を生産する1つの手法は、腫瘍細胞中お
よび二倍体ヒト繊維芽細胞と四倍体マウス赤白血病細胞との融合体中において、
導入されるマーカー遺伝子配列の組込み部位を制御するために、相同的組換えを
使用するものであった(Smithies, O. et al., Nature 317:230-234 (1985))。

【００７５】 この手法は、Thomas, K. R.、および共同研究者によってさらに開発された。
彼らは、トランスジェニック動物を生産するために、ES細胞のあらかじめ選択さ
れた所望の遺伝子配列を標的として突然変異を誘発するための「遺伝子ターゲッ
ティング」として知られる一般的な方法について報告した(Mansour, S. L. et a
l., Nature 336:348-352 (1988); Capecchi, M. R. , Trends Genet. 5:70-76 (
1989); Capecchi, M. R., Science 244:1288-1292 (1989); Capecchi, M. R. et
al., In: Current Communications in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (
ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), pp. 45
-52; Frohman, M. A. et al., Cell 56:145-147 (1989))。

【００７６】 現在では、マウスの任意の遺伝子を意図的に改変することが可能である(Capec
chi, M. R., Trends Genet. 5:70-76 (1989); Frohman, M. A. et al., Cell 56 :145-147 (1989))。遺伝子ターゲッティングでは、選択された遺伝子座のクロー
ン化DNA配列に所望の突然変異を導入するために標準的な組み換えDNA法が使用さ
れる。その後、その突然変異は、相同的組換えによって多能性胚由来幹(ES)細胞
のゲノムに移される。改変された幹細胞をマウス胚盤胞に微量注入して発生中の
マウス胚に組み込むことにより、最終的にキメラ動物を発生させる。ある場合に
は、キメラ動物の生殖系列細胞は、遺伝的改変ES細胞に由来し、繁殖を通して突
然変異遺伝子型を伝播することができる。

【００７７】 遺伝子ターゲッティングは、β₂-ミクログロブリン遺伝子座にnptll遺伝子が
挿入されたキメラマウスおよびトランスジェニックマウスを生産するために使用
された(Koller, B. H. et al., Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 86:8932-893
5 (1989); Zijistra, M. et al., Nature 342:435-438 (1989); Zijlstra, M. e
t al., Nature 344:742-746 (1989); DeChiaba et al., Nature 345:78-80 (199
0))。同様の実験では、nptll遺伝子の挿入により破壊されたc-abl遺伝子を有す
るキメラ動物およびトランスジェニック動物の生産が可能であった(Schwartzber
g, P. L. et al., Science 246:799-803 (1989))。この方法を使用してnptll遺
伝子を挿入することによりen-2遺伝子が破壊されたキメラマウスが生産された(J
oyner, A. L. et al., Nature 338:153-155 (1989))。

【００７８】 「遺伝子ターゲッティング」法を利用するためには、目的の遺伝子をあらかじ
めクローン化し、イントロン-エキソン境界を決定しておかなければならない。
この方法では、目的の特定の遺伝子の翻訳領域にマーカー遺伝子(すなわち、npt
ll遺伝子)が挿入されることになる。したがって、遺伝子ターゲッティング法を
使用すると、目的の遺伝子がかなり破壊されることになる。

【００７９】 重要なこととして、細胞の遺伝子を改変するために遺伝子ターゲッティングを
使用すると、その遺伝子の配列が顕著に改変された状態になる。遺伝子ターゲッ
ティングの効率は、多くの変数に依存し、構築物ごとに異なる。

【００８０】VIII. キメラ動物およびトランスジェニック動物の生産 本発明のキメラ動物細胞またはトランスジェニック動物細胞は、前駆体多能性
細胞、最も好ましくはES細胞、またはその等価物に、1つ以上のDNA分子を導入す
ることにより調製される(Robertson, E. J., In: Current Communications in M
olecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring Harbor Press, Cold
Spring Harbor, N. Y. (1989), pp. 39-44、この引用文献は、参照により本明細
書に組み入れられるものとする)。「前駆体」という用語は、多能性細胞が、本
発明の教示に従って調製されている所望の(「トランスフェクトされた」)多能性
細胞の前駆体であることを単に示すものとする。多能性の(前駆体のまたはトラ
ンスフェクトされた)細胞は、キメラ動物またはトランスジェニック動物を形成
するように、当技術分野で公知の方法によりin vivoで培養することが可能であ
る(Evans, M. J. et al., Nature 292:154-156 (1981))。

【００８１】 本発明に従って任意のES細胞を使用してよい。しかしながら、ES細胞の初代単
離株を使用することが好ましい。そのような単離株は、Current Communications
in Molecular Biology, Capecchi, M. R. (ed.), Cold Spring Harbor Press,
Cold Spring Harbor, N. Y. (1989), pp.39-44にRobertson, E. J.により開示さ
れたCCE細胞系のような胚から直接、またはCCE細胞系からES細胞をクローン単離
することにより(Schwartzberg, P. A. et al., Science 246: 799-803 (1989)、
この引用文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする)取得するこ
とが可能である。そのようなクローン単離は、E. J. Robertsonの方法に従って
行うことが可能である(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practi
cal Approach, (E. J . Robertson, Ed.), IRL Press, Oxford, 1987)。この引
用文献および方法は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。そのよ
うなクローン増殖の目的は、動物に分化する効率がより大きいES細胞を取得する
ことである。クローン的に選択されたES細胞は、トランスジェニック動物を生産
する効率が始原細胞系CCEの場合の約10倍である。本発明の組換え法の目的に対
しては、クローン選択は利点がない。

【００８２】 胚からクローン誘導されるES細胞系の例は、ES細胞系AB1(hprt⁺)またはAB2.1(
hprt^-)である。ES細胞は、好ましくは、E. J . Robertsonによって報告されたよ
うな間質細胞(たとえば、STO細胞(特に、SNC4 STO細胞)および／または一次胚繊
維芽細胞)上で培養される(Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Pra
ctical Approach, (E. J. Robertson, Ed., IRL Press, Oxford, 1987, pp 71-1
12)。この引用文献は、参照により本明細書に組み入れられるものとする。キメ
ラマウスの生産方法および分析方法は、Bradley, A. によって開示されている(T
eratocarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach, (E. J .
Robertson, Ed.), IRL Press, Oxford, 1987, pp 113-151)。この引用文献は、
参照により本明細書に組み入れられるものとする。間質(および／または繊維芽)
細胞は、異常ES細胞のクローン過剰増殖を排除する役割を果たす。最も好ましく
は、細胞は、白血球抑制因子(「lif」)(Gough, N. M. et al., Reprod. Fertil.
Dev. 1:281-288 (1989); Yamamori, Y. et al., Science 246:1412-1416 (1989
)、これらの引用文献はいずれも、参照により本明細書に組み入れられるものと
する)の存在下で培養される。lifをコードする遺伝子はクローン化されているの
で(Gough, N. M. et al., Reprod. Fertil. Dev. 1:281-288 (1989))、当技術分
野で公知の手段によってこの遺伝子で間質細胞をトランスフォームし、次に、培
地へlifを分泌するトランスフォームされた間質細胞上でES細胞を培養すること
が特に好ましい。

【００８３】 ES細胞系は、任意の種(たとえば、ニワトリなど)から誘導または単離すること
が可能であるが、齧歯動物(すなわち、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサ
ギ、ヒツジ、ヤギ、サカナ、ブタ、ウシ、霊長類およびヒトのような哺乳類から
誘導または単離された細胞が好ましい。

【００８４】IX. 発明の使用 本発明は、細胞のゲノムの2つのアネキシン遺伝子対立遺伝子のうちの1つに所
望の遺伝子配列を含むヒトまたは動物の細胞を提供する。第1の実施形態では、
本発明はまた、そのような配列を有する細胞を含んでなる非ヒトのキメラ動物ま
たはトランスジェニック動物を生産するための手段を提供する。記載の方法を適
用することにより生産しうる動物としては、ニワトリ、非ヒト哺乳動物(特に、
齧歯動物(すなわち、マウス、ラット、ハムスターなど)、ウサギ、ヒツジ、ヤギ
、サカナ、ブタ、ウシおよび非ヒト霊長類)が挙げられる。

【００８５】 本発明の細胞および非ヒト動物は、診断的有用性と治療的有用性の両方を備え
ている。

【００８６】 A. 診断的有用性 本発明により、anx7遺伝子の単一の機能性対立遺伝子を含有している細胞、ま
たはトランスジェニックもしくはキメラの非ヒト動物が提供されるので、そして
そのような細胞は機能性対立遺伝子から非機能性対立遺伝子への突然変異によっ
て腫瘍細胞になるので、本発明は、腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰せられ
る動物細胞の特性に影響を及ぼしうる薬剤を同定するために使用することができ
る。動物細胞の特性は、その特性が腫瘍抑制遺伝子の不在または発現の不足によ
り改変される場合、「腫瘍抑制遺伝子の存在または発現に帰せられる」と言及さ
れる。そのような特性としては、たとえば、腫瘍形成、腫瘍形成に対する回復力
、腫瘍などの範囲、分布、発生率、位置、等級などが挙げられる。

【００８７】 1実施形態では、そのような薬剤により、細胞または動物の腫瘍形成(または新
生物形成)の可能性を減少させることができる。そのような薬剤については、本
発明の治療的可能性に関連させて以下で説明する。

【００８８】 第2の実施形態では、そのような薬剤により、細胞または動物の腫瘍形成(また
は新生物形成)の可能性を増加させることができる。したがって、本発明の細胞
および非ヒト動物は、腫瘍形成活性に関して可能性のあるまたは疑わしい発癌物
質を試験するのに有用である。それらは、たとえば、環境に存在する可能性のあ
る薬剤(空気、水あるいは土壌中の環境汚染物質など)、または化学薬剤、放射性
同位体などへの環境暴露から生じる薬剤、の腫瘍形成作用を同定および評価する
ために使用することが可能である。また、それらは、発癌に及ぼす食事の影響に
関する研究を促進するために使用することも可能である。可能性のあるまたは存
在する食品添加物、化学廃棄物、化学処理副生物、水源、提案されたまたは現在
使用されている医薬品、化粧品などが、腫瘍形成活性を有しているかを調べるた
めに、それらを使用してもよい。さらに、種々のエネルギー形態(UV線、X線、電
離線、元素同位体のガンマ線など)の腫瘍形成の可能性を調べるために、それら
を使用してもよい。

【００８９】 突然変異事象が起こる頻度は、突然変異誘発性化学薬剤の濃度または突然変異
誘発性放射線の強度に依存する。この場合、1つの細胞が2つの突然変異事象を受
ける頻度は、1つの突然変異事象が起こる頻度の2乗であるので、本発明の細胞お
よび非ヒト動物を用いれば、天然の細胞または動物において新生物性変化を引き
起こすのに必要な濃度よりもかなり低い濃度で新生物性(突然変異誘発性)薬剤を
同定することができるはずである。なぜなら、腫瘍抑制遺伝子anx7の1つの対立
遺伝子が、本発明のトランスジェニックマウスでは既に突然変異を受けているか
らである。

【００９０】 特に好ましい細胞の1つは、天然のanx7対立遺伝子の一方が機能性ヒトanx7対
立遺伝子で置換されかつ天然のanx7対立遺伝子の他方が非機能形態に突然変異体
されている非ヒト細胞である。このほか、2つの天然のanx7対立遺伝子がヒトanx
7遺伝子の機能性および非機能性対立遺伝子で置換されている非ヒト細胞を利用
することも可能である。

【００９１】 そのような細胞は、上記の方法に従って、ヒトanx7対立遺伝子を有している細
胞において薬剤の新生物形成の可能性を評価するために使用することが可能であ
る。より好ましくは、天然の機能性anx7対立遺伝子をまったく有していないが、
機能性ヒトanx7対立遺伝子を1つだけ有している非ヒト動物を生産するために、
そのような細胞を使用する。そのような非ヒト動物を用いることにより、ヒトan
x7遺伝子産物を発現する非ヒト動物において薬剤の腫瘍形成性を評価することが
できる。

【００９２】 1. in vitroアッセイ 1実施形態では、in vitro細胞培養で本発明の細胞を利用して、腫瘍形成の可
能性の測定対象となる所定量の薬剤の存在下でそのような細胞をインキュベート
することが可能である。したがって、この実施形態には、腫瘍形成活性のin vit
roアッセイが含まれる。

【００９３】 多くの発癌性薬剤はその腫瘍形成作用を直接媒介する可能性があるが、これら
の薬剤の中には、代謝されるまで、または1つ以上の「共発癌性」薬剤と一緒に
感受性細胞に提示されるまで、腫瘍形成の可能性を示さないものが存在するであ
ろう。本発明を用いると、そのような「潜在的」発癌性薬剤および「共発癌性」
薬剤の同定が可能になる。本発明のこの実施形態によれば、「潜在的」発癌物質
の存在は、候補薬剤へ細胞または動物を単に暴露し続けることによって同定する
ことができる。このほか、本発明の細胞は、「馴化」培地(すなわち、本発明の
細胞の培養に使用する前に他の細胞を培養するために使用された候補薬剤を含む
培地)中でインキュベートすることができる。

【００９４】 本発明を用いると、第2の薬剤の存在下で新生物形成作用を引き起こす能力の
ある共発癌性薬剤の同定が可能になる。そのような薬剤は、同時に2つ以上の候
補薬剤の存在下で本発明の細胞を培養し、次に、新形成に関してアッセイするこ
とによって同定することができる。細胞が新生物性状態に変換されれば、アッセ
イされた薬剤の腫瘍形成(または新生物形成)活性が実証される。そのような新生
物性状態は、細胞形態の変化によって、接触阻止の消失によって、軟寒天中での
増殖能力の獲得によって、または最も好ましくは腫瘍抗原の発現の開始によって
証拠づけることが可能である。

【００９５】 腫瘍抗原は容易に検出しうるので、新生物形成活性を検出する手段として腫瘍
抗原を使用することが好ましい。当技術分野でよく知られているように、抗体ま
たは抗体の断片を用いて、細胞表面上の腫瘍抗原の存在を定量的にまたは定性的
に検出することが可能である。任意の細胞タイプ(すなわち、肺、腎臓、結腸な
ど)を利用して本発明のanx7突然変異細胞を生成しうるので、薬剤が組織特異的
腫瘍形成の可能性を有するかを決定することが可能である。この目標を達成する
ために、さまざまな組織タイプのいずれかに由来するanx7突然変異細胞の存在下
で候補薬剤がインキュベートされるであろう。腫瘍は腫瘍特異性抗原を有してい
るので、そしてそのような抗原に結合しうる抗体が単離されているので、そのよ
うな抗体を使用することにより、anx7突然変異細胞によって発現されうる任意の
腫瘍抗原を特性付けることが可能である。そのような検出は、さまざまなイムノ
アッセイのいずれかを用いて行うことが可能である。たとえば、抗体または抗体
の断片を放射能標識することによって、ラジオイムノアッセイを使用して抗原を
検出することが可能である。

【００９６】 ラジオイムノアッセイ(RIA)についての良い解説は、参照により本明細書に組
み入れる「分子生物学における実験技術と生化学」(Laboratory Techniques and
Biochemistry in Molecular Biology)、Work, T.S.ら、North Holland Publish
ing Company, NY (1978)、特に、Chard, T.による「ラジオイムノアッセイおよ
び関連技術入門」(An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techni
ques )と題する章に見いだすことができる。好適な放射性同位体標識としては、
たとえば、³H、¹¹¹In、¹²⁵I、¹³¹I、³²P、³⁵S、¹⁴C、⁵¹Cr、⁵⁷To、⁵⁸Co、⁵⁹Fe、 ⁷⁵ Se、¹⁵²Eu、⁹⁰Y、⁶⁷Cu、²¹⁷Ci、²¹¹At、²¹²Pb、⁴⁷Sc、¹⁰⁹Pdなどが挙げられる
。

【００９７】 このほか、酵素標識、非放射性同位体標識、蛍光標識、化学発光標識、または
他の好適な標識は利用することができる。好適な酵素標識としては、たとえば、
リンゴ酸デヒドロゲナーゼ、ブドウ球菌ヌクレアーゼ、Δ-5-ステロイドイソメ
ラーゼ、酵母アルコールデヒドロゲナーゼ、α-グリセロールリン酸デヒドロゲ
ナーゼ、トリオースリン酸イソメラーゼ、ペルオキシダーゼ、アルカリ性ホスフ
ァターゼ、アスパラギナーゼ、グルコースオキシダーゼ、β-ガラクトシダーゼ
、リボヌクレアーゼ、ウレアーゼ、カタラーゼ、グルコース-6-リン酸デヒドロ
ゲナーゼ、グルコアミラーゼ、アセチルコリンエステラーゼなどが挙げられる。
好適な非放射性同位体標識としては、たとえば、¹⁵⁷Gd、⁵⁵Mn、¹⁶²Dy、⁵²Tr、⁵⁶ Feなどが挙げられる。

【００９８】 好適な蛍光標識としては、たとえば、¹⁵²Eu標識、フルオレセイン標識、イソ
チオシアネート標識、ローダミン標識、フィコエリトリン標識、フィコシアニン
標識、アロフィコシアニン標識、o-フタルアルデヒド標識、フルオレスカミン標
識などが挙げられる。

【００９９】 発光標識としては、たとえば、ルミナール標識、イソルミナール標識、芳香族
アクリジニウムエステル標識、イミダゾール標識、アクリジニウム塩標識、シュ
ウ酸エステル標識、ルシフェリン標識、ルシフェラーゼ標識、エクオリン標識な
どが挙げられる。本発明に従って利用しうる他の好適な標識は、当業者には分か
るであろう。抗体またはその断片へのこれらの標識の結合は、当業者に一般に知
られている標準的な方法を用いて行うことが可能である。典型的な方法について
は、Kennedy, J. H.ら(Clin. Chim. Acta 70:1-31 (1976))およびSchurs, A. H.
W. M.ら(Clin. Chim. Acta 81:1-40 (1977))によって報告されている。後者の
文献中に記載のカップリング法は、グルタルアルデヒド法、過ヨウ素酸塩法、ジ
マレイミド法、m-マレイミドベンジル-N-ヒドロキシ-スクシンイミドエステル法
である。これらの方法はいずれも、参照により本明細書に組み入れるものとする
。

【０１００】 上記のin vitroアッセイには、現在使用されているアッセイよりも低コストで
行いうるとともに多数の薬剤を容易にスクリーニングする能力を備えているとい
う有利な特徴がある。この実施形態を使用すると、異なる時点および条件で取得
された試験結果の比較が容易になる。さらに、そのようなアッセイにおいて非常
に多くの細胞を使用することができるので、きわめて低い濃度においても腫瘍形
成性薬剤の腫瘍形成活性を検出することが可能である。最後に、ヒト細胞を用い
てこの実施形態を実行することができるので、ヒト細胞に対する試験化合物の腫
瘍形成(または新生物形成)の可能性を決定するための手段が提供される。

【０１０１】 2. in vivoアッセイ 第2の実施形態では、本発明の非ヒト動物を利用して、腫瘍形成の可能性の測
定対象となる所定量の薬剤を、そのような動物に供給することが可能である(た
とえば、吸入、摂取、注入、埋植などにより)。そのような動物で腫瘍が形成さ
れた場合(直接的な目視検査により、または生検、イメージング、腫瘍抗原の検
出などによって証拠づけられる)、アッセイされた薬剤の腫瘍形成活性が実証さ
れる。

【０１０２】 天然の動物には2つのanx7対立遺伝子が含まれており、したがって、機能性anx
7活性の消失を引き起こすためには2つの突然変異事象が必要になるので、天然に
存在する非ヒト動物を使用するよりも本発明の非ヒト動物を使用する方が好まし
い。対照的に、本発明の非ヒト動物は機能性anx7対立遺伝子を1つしか有してい
ないので、anx7機能を完全に消失させるのに1つの突然変異事象が必要であるの
みである。

【０１０３】 そのような動物中の腫瘍の検出は、生検、イメージング、または腫瘍抗原を発
現する細胞の存在に関して動物をアッセイすることによって行うことができる。
たとえば、被験者から組織のサンプルを採取し、次に、先に記載したように適切
に標識された任意の抗体(または抗体断片)で、単離されたサンプルを処理するこ
とにより、そのような検出を行うことが可能である。好ましくは、被験者から組
織学的試験片を採取し、そのような試験片に標識抗体を提供することにより、そ
のようなin situ検出を行う。抗体(または断片)は、好ましくは、組織のサンプ
ルに標識抗体(または断片)を適用することにより、または重ねることにより提供
される。そのような手順を用いることにより、抗原の存在だけでなく検査された
組織上の抗原の分布をも決定することができる。そのようなin situ検出を行う
ために本発明を用いて多種多様な組織学的方法のいずれか(たとえば、染色法)を
変更できることは、当業者には容易に分かるであろう。

【０１０４】 このほか、in vivoイメージング法により腫瘍細胞の検出を行うことが可能で
あり、この方法では、標識抗体(またはその断片)を被験者に提供し、任意の組織
サンプルをあらかじめ採取することなく腫瘍の存在を検出する。そのようなin v
ivo検出法には、他の検出法よりも侵襲性が少ないうえに、患者から容易に採取
することのできない組織中の抗原発現細胞の存在を検出できるという利点がある
。さらに、体液(たとえば、血液、リンパ液など)、糞便、または細胞抽出物中の
腫瘍抗原の存在をアッセイすることができる。そのようなイムノアッセイでは、
以下に記載するように、抗体(または抗体断片)を液相中で利用してもよいし、あ
るいは固相担体に結合させてもよい。

【０１０５】 in vivoアッセイの使用には、いくつかの有利な特徴がある。in vivoアッセイ
を用いると、腫瘍形成性薬剤を同定することができるだけでなく、薬剤によって
引き起こされる腫瘍の種類、誘発されたいずれかの腫瘍の数および位置(すなわ
ち、器官または組織特異性)、ならびにそのような誘発された腫瘍の等級(臨床的
重要性)を評価することもできる。さらに、導入された薬剤の可能な自然代謝で
あると本質的にみなされる腫瘍形成性、導入された薬剤(またはその代謝副産物)
がレシピエント動物の特異的な組織または器官に選択的に蓄積する可能性、レシ
ピエント動物が腫瘍形成を認識して修復または防止する可能性を評価することも
できる。要するに、そのようなアッセイは、生きている非ヒト動物において薬剤
の腫瘍形成の可能性を研究および評価するための真の生物学的モデルを提供する
。

【０１０６】 3. 腫瘍抗原のイムノアッセイ 抗体(または抗体の断片)を用いる腫瘍抗原のin vitro、in situ、またはin vi
vo検出は、担体を使用することにより改良することができる。周知の担体として
は、ガラス、ポリスチレン、ポリプロピレン、ポリエチレン、デキストラン、ナ
イロン、アミロース、天然および変性セルロース、ポリアクリルアミド、アガロ
ースおよびマグネタイトが挙げられる。担体の性質は、本発明の目的に応じて、
ある程度まで可溶性であってもよいしあるいは不溶性であってもよい。担体材料
は、結合された分子が抗原に結合できる限り、事実上任意の可能な構造形態をと
るこができる。したがって、担体の形態は、ビーズの場合のように球状であって
もよいし、試験管の内面や棒の外面のように円筒状であってもよい。このほか、
表面は、シート、試験片などのようにフラットであってもよい。当業者には、結
合モノクロナール抗体に対する他の多くの好適な担体が思い当たるであろう。あ
るいは慣用的な実験を行ってそうした担体を確認することができるであろう。

【０１０７】 「2部位」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイとしても知られるイムノ
メトリックアッセイに利用すべく、本発明の結合分子を適用することも可能であ
る。典型的なイムノメトリックアッセイでは、所定量の非標識抗体(または抗体
の断片)が、試験される流体(すなわち、血液、リンパ液、液化糞便、組織ホモジ
ネートなど)に不溶性の固体担体に結合され、そして固相抗体と抗原と標識抗体
とで形成された3元複合体の検出および／または定量ができるように、所定量の
検出可能に標識された可溶性抗体が添加される。

【０１０８】 典型的なイムノメトリックアッセイとしては、「フォワード」アッセイが挙げ
られる。このアッセイでは、最初に、2元固相抗体-抗原複合体の形成によってサ
ンプルから抗原を抽出すべく、固相に結合させた抗体と試験対象のサンプルを接
触させる。好適なインキュベーション時間の後、固体担体を洗浄して、もしあれ
ば未反応抗原を含む流体サンプルの残分を除去し、次に、未知量の標識抗体(「
リポーター分子」として機能する)を含む溶液と接触させる。非標識抗体を介し
て固体担体に結合された抗原に標識抗体を複合化させるための第2のインキュベ
ーション時間の後、固体担体を2回洗浄して未反応の標識抗体を除去する。この
タイプのフォワードサンドイッチアッセイは、抗原が存在するかを調べる単純な
「イエス/ノー」アッセイであってもよいし、標識抗体の測定値を、既知量の抗
原を含有する標準サンプルで得られた値と比較することにより定量的に行っても
よい。そのような「2部位」アッセイまたは「サンドイッチ」アッセイについて
は、「ラジオイムノアッセイ法」(Radioimmune Assay Method)、KirkhamおよびH
unter編、E. & S . Livingstone, Edinburgh, 1970の199〜206ページにWideによ
って解説されている。

【０１０９】 同様に腫瘍抗原を同定するうえで有用でありうる他のタイプの「サンドイッチ
」アッセイでは、いわゆる「同時」アッセイおよび「リバース」アッセイが使用
される。同時アッセイでは、固体担体に結合された抗体および標識抗体の両方が
試験対象のサンプルに同時に添加され、その際、インキュベーションステップが
1回行われる。インキュベーションが終了した後、固体担体を洗浄して、流体サ
ンプルの残分および非複合化標識抗体を除去する。その後、従来の「フォワード
」サンドイッチアッセイの場合と同じように、固体担体に会合した標識抗体の存
在を調べる。

【０１１０】 「リバース」アッセイでは、最初に、標識抗体の溶液を流体サンプルに段階的
に添加し、続いて、好適なインキュベーション時間の後、固体担体に結合された
非標識抗体を添加する。第2のインキュベーションの後、固相を従来の方法で洗
浄して、試験対象のサンプルの残分および未反応標識抗体の溶液を除去する。そ
の後、「同時」アッセイおよび「フォワード」アッセイの場合と同じように、固
体担体に会合した標識抗体の測定を行う。

【０１１１】 抗原のイムノメトリックアッセイを行うには、特定の結合分子が「リポーター
分子」で標識されていることが必要である。これらのリポーター分子または標識
は、先に規定したように、慣例的なものであり、当技術分野で周知である。本発
明を実施する場合、酵素標識が好ましい実施形態である。単一の酵素ではないこ
とが、考えられるあらゆるイムノメトリックアッセイにおいて標識として使用に
は理想的である。その代わりに、どの酵素が特定のアッセイ系に適しているかを
決定しなければならない。酵素の選択にとって重要な判定規準は、純粋な酵素の
代謝回転数(単位時間あたり1酵素部位ごとの産物に変換される基質分子の数)、
酵素調製物の純度、その産物の検出感度、酵素反応の検出の容易さおよびスピー
ド、妨害因子の欠如または試験流体中の酵素様活性の欠如、酵素およびそのコン
ジュゲートの安定性、酵素およびそのコンジュゲートの利用可能性およびコスト
などである。本発明のイムノメトリックアッセイで好ましい標識として使用され
る酵素としては、ペルオキシダーゼ、アルカリホスファターゼ、β-ガラクトシ
ダーゼ、ウレアーゼ、グルコースオキシダーゼ、グリコアミラーゼ、リンゴ酸デ
ヒドロゲナーゼ、およびグルコース-6-リン酸デヒドロゲナーゼが挙げられる。
ウレアーゼは、特に、その活性を肉眼で容易に観察することのできる発色性pH指
示薬であるため、より好ましい酵素標識の1つである。

【０１１２】 B. 治療上の有用性 意義深いことに、本発明の細胞と動物は細胞もしくは動物の潜在的な腫瘍原性
(または新生物形成性)を低減させる薬剤の同定に用いることができる。そのよう
な薬剤は「抗癌剤」および/または「化学的防御剤」となりうる。「抗癌剤」は
細胞の増殖(またはキメラもしくはトランスジェニック動物中での腫瘍の増殖、
播種、もしくは転移)が減少するように作用する。「化学的防御剤」は新たな腫
瘍の形成を阻害するように作用する。そのような薬剤は、腫瘍の一般的な活性(
新たな腫瘍形成の全てを阻害する)を有するものであるか、または特定の器官も
しくは組織中の特定の腫瘍型に特異的な活性(分布、頻度、グレード、その他の
阻害)をで示すものである可能性がある。このように、本発明によって新規の抗
新生物治療剤の同定ができる。上記のA節に記載のアッセイのいずれかを、腫瘍
抑制活性を測定するために用いることができる。

【０１１３】 本発明のトランスジェニック細胞およびヒト以外の動物を、anx7遺伝子のヒト
遺伝子調節を研究するために用いることができる。例えば、そのような細胞およ
び動物はanx7遺伝子と腫瘍遺伝子またはその他の腫瘍抑制遺伝子との相互作用を
研究するために用いることができる。このようにそれらの細胞および動物は、腫
瘍原性のものの発生を低減させるかまたは防止する能力を有する治療用薬剤の同
定に用いることができる。そのような薬剤はヒトおよび動物における癌の治療お
よび治癒に有用である。意義深いことに、治療用薬剤となる可能性のあるものは
、1つの動物モデルでは毒性を誘発するが別の動物モデルでは誘発しないことが
しばしば見られる。そのような薬剤の潜在的特性を解明するために、いろいろな
動物種での代謝パターンを明らかにし、次いで代謝産物の毒性を明らかにするこ
とがしばしば必要となる。本発明を用いてそのような解明を容易にするトランス
ジェニック細胞またはトランスジェニック動物を作成することができる。

【０１１４】 本発明の治療用薬剤をある動物の細胞に提供する際には、製薬上許容される担
体(すなわち、リポソームその他)を用いることが好ましい。そのような薬剤は、
製薬上有用な組成物を調製するための既知の方法に従って製剤化することができ
、それによってこれらの物質、もしくはそれらの機能を有する誘導体は、製薬上
許容される担体ビヒクルと組み合わされて混合物となる。適切なビヒクルおよび
それらを用いた製剤化については例えば、Nicolau, C.ら, (Crit. Rev. Ther. D
rug Carrier Syst. 6:239-271(1989))中に記載されており、これは本明細書中に
参照により組み入れることとする。

【０１１５】 効果的な投与を行うのに適した、製薬上許容される組成物を作成するためには
、そのような組成物は所望の遺伝子配列の有効量を適切な量の担体ビヒクルとと
もに含むものとなろう。

【０１１６】 さらに別の製剤学的方法も作用の持続時間を制御するために用いることができ
る。放出を制御した製剤は、所望の遺伝子配列(それに伴う担体と共に、もしく
は担体を伴わず)と複合体を形成する、もしくはそれを吸収するためのポリマー
を用いることによって作ることができる。送達の制御は、適切な巨大分子(例え
ば、ポリエステル、ポリアミノ酸、ポリビニルピロリドン、エチレン酢酸ビニル
、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、もしくは硫酸プロタミン)
、および巨大分子の濃度、ならびに放出を制御するための取り込み方法を選択す
ることによって行うことができる。放出を制御した製剤によって作用の持続時間
を制御する別の方法として可能なものは、その薬剤をポリエステル、ポリアミノ
酸、ハイドロゲル、ポリ(乳酸)、もしくはエチレン酢酸ビニル共重合体などのポ
リマー性物質の粒子中に取り込むことである。あるいはまた、それらの薬剤をポ
リマー性粒子中に取り込むかわりに、マイクロカプセル中に捕捉させることも可
能であり、マイクロカプセルは例えば、コアセルベーション技法によって、また
は界面重合によって、それぞれ例えばヒドロキシメチルセルロースもしくはゼラ
チンマイクロカプセル、ならびにポリ(メチルメタクリレート)マイクロカプセル
を調製することができ、またはコロイド状薬物送達システム、例えばリポソーム
、アルブミンマイクロスフェア、マイクロエマルション、ナノ粒子、およびナノ
カプセル、もしくはマクロエマルション中に捕捉させることができる。

【０１１７】 C. 研究および遺伝子治療での使用 本発明の細胞およびヒト以外の動物を、動物体内での遺伝子の調節、発現、お
よび組織化を調べるために用いることができる。本発明の方法は、天然のanx7遺
伝子配列の調節領域中に変化をを与えるために用いることができる。従って、本
発明はanx7遺伝子の転写もしくは翻訳の性質もしくは制御を変えるための、およ
びanx7遺伝子それ自体を変えるための方法を提供する。 例えば、本発明は遺伝
子の発現を増加または低減させる結果となるような変異の導入を可能とする。同
様にして、本発明は天然のanx7遺伝子の発現を低減もしくは増加させるためにそ
の遺伝子の転写の能力を抑えるかもしくは増大させることを可能とする。このよ
うに、本発明では、anx7遺伝子の操作および分析(dissection)が可能である。そ
のような能力は遺伝子治療プロトコールおよび癌のより良い動物モデルの開発に
おいて特に重要である。

【０１１８】 遺伝子治療の原理についてはOldham, R.K.(「生体治療の原理」(Principles o
f Biotherapy)中、Raven Press, N. Y., 1987)、および類似の文献に記載されて
いる。遺伝子治療のための方法および使用については、Boggs, S.S.(Int.J. Cel
l Clon. 8:80-96(1990)); Karson, E.M. (Biol. Reprod. 42:39-49(1990)); Led
ley, F.D. (「バイオテクノロジー；包括的専門書」(Biotechnology, A Compreh
ensive Treatise), 第7B巻, Gene Technology, VCH Publishers, Inc. NY, pp39
9-458(1989))に開示されており、これらの全ては本明細書中に参照により組み入
れることとする。

【０１１９】 本発明の1実施形態においては、機能しうるanx7遺伝子、その遺伝子の変異体
、またはanx7遺伝子の活性に影響を及ぼす他の遺伝子をコードするDNAは、癌の
治療(すなわち遺伝子治療)を行うために動物(特にヒトを含む哺乳動物)の体細胞
中に導入することができる。最も好ましくは、この目的にはウイルス性もしくは
レトロウイルス性のベクターが用いられる。

【０１２０】 レトロウイルスベクターは送達の一般的な方法であり、この文脈においては、
ウイルス性遺伝子の全てが除去された、もしくはそのベクターで感染させた細胞
中でウイルス性タンパク質が作られないように改変されたレトロウイルスである
。ウイルス複製機能は、ウイルス性タンパク質の全てを産生するが感染性ウイル
スは産生しないレトロウイルス「パッケージング」細胞を用いることによって提
供される。

【０１２１】 パッケージング細胞中へのレトロウイルスベクターDNAの導入によってベクタ
ーRNAを有しているウイルス粒子が産生され、ターゲット細胞に感染することが
できるようになるが、それは感染後にウイルスの拡散がされないような形で行わ
れる。このプロセスを、ウイルスが複製し続け拡散する天然のウイルス感染と区
別するために、感染ではなく形質導入という用語がしばしば用いられる。

【０１２２】 レトロウイルス以外のベクターも遺伝子治療では用いられてきた。そのような
ものの１つにアデノウイルスがある(Rosenfeld, M. A.ら, Cell 68:143-155(199
2); Jaffe, H.A.ら, Nature Genetics 1:372-378(1992); Lemarchand, P.ら, Pr
oc. Natl. Acad. Sci. USA 89:6482-6486(1992))。アデノウイルスベクターの主
たる利点はDNAの大きなセグメントを運ぶことができ(36Kb ゲノム)、非常に力価
が高く(10¹¹/mL)、複製していない細胞に感染することができ、in situの組織、
特に肺に感染することができる点である。現在までのところ、このベクターの最
も驚くべき使用法は、コットン・ラット(cotton rat)の気道上皮への気管内静置
によるヒト嚢胞性線維症膜貫通調節因子(CFTR)遺伝子の送達である(Rosenfeld,
M. A.ら, Cell 63:143-155(1992))。同様にして、ヘルペスウイルスもヒト遺伝
子治療に価値のあるものであろう(Wolfe, J.H.ら, Nature Genetics 1:379-384(
1992))。当然のことながら、その他のウイルスベクターも適切なものは全て本発
明で遺伝子治療に用いることができる。

【０１２３】 ヒトでの遺伝子導入の別の方法としてはリポソーム中に入れたプラスミドDNA
をin situのヒト細胞に直接的に導入する方法がある(Nabel, E.G.ら, Science 2
49:1285-1288(1990))。プラスミドDNAはレトロウイルスベクターとは異なり、均
一に精製しうるので、ヒトの遺伝子治療で使用について容易に確認しうるはずで
ある。さらに、リポソームがメディエートするDNA導入に加えていくつかの他の
物理的なDNA導入方法、例えばプラスミドDNAをタンパク質とコンジュゲートさせ
ることによりDNAを細胞上の受容体にターゲッティングするなどの方法は、ヒト
の遺伝子治療での有望性を示してきた(Wu,G.Y.ら、J. Biol. Chem. 266:14338-1
4342(1991); Curiel, D.T.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 88:8850-8854(1991
))。

【０１２４】 これらの治療方法を適用する際に、特定の腫瘍細胞では、正常な細胞と融合す
ると正常な機能を有するものに復帰することが観察され、このことは失われてい
た因子、例えば野生型腫瘍抑制遺伝子発現産物などの置換によって腫瘍細胞の正
常状態への復帰が行われうることを示唆している(これに関する総説はWeinberg,
R.A., Cancer Research 49:3713-3721(1989) のp.3717に述べられている)。

【０１２５】 これらの観察結果から、腫瘍抑制遺伝子に欠損のある腫瘍細胞の遺伝子治療を
目的とする研究が行われるようになった。提唱された治療法を行うには、損傷を
受けている腫瘍抑制遺伝子を同定すること、および対応する損傷を受けていない
遺伝子(プロモーターおよび完全なコード配列を含んだもの)を、影響を受けてい
る腫瘍細胞中へ、該遺伝子産物を発現し得るベクター(アデノウイルスベクター
など)を用いて導入することを必要とする。取り込まれた機能しうる遺伝子がタ
ーゲット細胞を非悪性状態に転換するであろう、とされている。

【０１２６】 例えば、The Regents of the University of CaliforniaのPCT特許出願(Leeら
, WO 90/05180, 国際出願日1989年10月30日、公開1990年5月17日)では、不活性
な、もしくは欠損した腫瘍抑制遺伝子の同定、およびその欠損遺伝子を機能を有
する同等物で置換するための方策を開示している。特に、出願WO 90/05180ではi
n vitro研究に基づいて、RB⁻腫瘍細胞中に、そのような細胞を非悪性化するた
めに、機能を有するRB^１１０遺伝子をレトロウイルスベクターを用いて挿入する
方法を提案している。

【０１２７】 上述のとおり、そのような遺伝子治療をその治療を受けるレシピエントに対し
て、そのレシピエントの持つ腫瘍状態を治療(すなわち、抑制、減弱、もしくは
縮退を生ぜしめる)するために提供することができるが、本発明の原理はまた、
遺伝的な遺伝子変異によって、または体細胞変異によってanx7遺伝子発現が損な
われた(例えば、anx7遺伝子の機能しうる対立遺伝子が一方のみであるような)細
胞を含んでいる個体に予防的遺伝子治療を提供するために用いることもできる。
そのような治療法は、個体の疾患への素因を低減させるために、癌の検出に先立
って投与することができる。

【０１２８】 本発明について概括的に述べてきたので、同様な事項は下記の実施例を参照す
ることによってより容易に理解されるであろうが、下記の実施例は説明のために
示したものであり、特に記す場合以外は本発明を限定する意図はない。

【０１２９】実施例Ｉ anx7遺伝子についてのトランスジェニックマウスの作成と特性決定 トランスジェニックマウスの実際の産生を開始する前に、アネキシンVII(anx7
)の遺伝子座の特性を明らかにした。次いで、トランスジーン構築物(「ターゲッ
ティングベクター」)をこの特性決定に基づいて調製した。この構築物は、トラ
ンスジェニック動物の構築を補助するために必要なエレメントを有している。

【０１３０】 129SV/CPJマウスゲノムライブラリー(Stratagene)から得たanx7遺伝子座はanx
7遺伝子の約34kbに及ぶ14個のエキソンを有し、マウスanx7 cDNAプローブでスク
リーニングした(Zhang-Keckら, Biochem. J. 301:835-845)。

【０１３１】 その遺伝子座のどのセグメントがターゲッティングベクター中に用いるために
最も適しているかを評価するために、この領域を包含する3種類のXbaI断片(1.9
、3.6、および3.1kb)および1種類のXhoI断片(2.0kb)を含むいくつかの制限酵素
切断断片をサブクローン化し、³²[P]で標識し、反復配列の存在を調べた。反復
配列はanx7遺伝子の染色体のいかなる部分へもランダムな挿入を生じうるので望
ましくない。従って、これらの領域を除外した。サザンブロット分析では調べた
4種類の断片のうち3.1kbのXbaIゲノムDNA断片、および2.0kbのXhoIゲノムDNA断
片のみが、プローブとして用いた場合に、マウスES細胞DNAのゲノムサザンブロ
ッティングでシャープなバンドを示した。図2では、ES細胞由来のゲノムDNAをHi
ndIIIで消化し、ブロットし、³²P標識ゲノム断片とハイブリダイズさせた。マウ
スanx7の3.1kb XbaI断片(レーン1)および2.0kb XhoI断片(レーン2)由来のプロー
ブでは単一のバンドが認められた。1.9kbおよび3.6kb XbaI断片(それぞれレーン
3,4、および5,6)ではスメアが認められた。この単一のバンドは反復配列を含ん
でいないという結論が引き出され、従ってターゲッティングベクター中に用いた
。

【０１３２】 A. ターゲッティングベクターの構築 anx7遺伝子ターゲッティングベクターを構築するために、2.0kb XhoIゲノムDN
A断片(エキソン4および5を含む)および3.1kb XbaIゲノムDNA断片(エキソン7およ
び8を含む)をpPNTのXhoI部位およびXbaI部位中にそれぞれ挿入して、置換タイプ
のターゲッティングベクターを作りKSBX.pPNTと名付けた(図1A参照)。ベクターp
PNT(NIHのNICHDのDr.Heiner Westphalの研究室から入手)はPGKneoおよびPGKtkカ
セットを含み、多数のユニークなクローニング部位によって分離されそれらと隣
接している。neo遺伝子はanx7遺伝子と同じ方向であった。単純ヘルペスウイル
スチミジンキナーゼ(TK)遺伝子もマーカー配列としてターゲッティングベクター
中に追加し、これはターゲッティングベクターと野生型対立遺伝子との間の相同
組換えの際には除去されるものである。このことによって、非相同的なインテグ
レーションが行われた細胞の選択が可能となった。

【０１３３】 B. ES細胞のトランスフェクションおよび選択 多能性胚性幹細胞(ES細胞と称する)は胚形成時の着床後の初期まで胚から得る
ことのできる細胞である。その細胞は培地中で増殖させることとができ、in vit
roで、またはマウスに腫瘍として移植するとin vivoで分化することができる。E
S細胞は正常な核型を有している(Evans, M.J.ら, Nature 292:154-156(1981); M
artin, G.R.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (U.S.A.) 78:7634-7638(1981))。

【０１３４】 分裂中の胚の胚盤胞中に注入することによって、ES細胞は増殖、分化し、その
結果キメラ動物が産生されることとなる。ES細胞はそのようなキメラ動物の体細
胞系統および生殖細胞系統の双方でコロニーを形成することができる(Robertson
, E.ら, Cold Spring Harb. Conf. Cell Prolif. 10:647-663(1983); Bradley
A.ら, Nature 309:255-256(1984); Bradley, A.ら, Curr. Top. Devel. Biol. 2
0:357-371(1986); Wagner, E.F.ら, Cold Spring Harb. Symp. Quant. Biol. 50
:691-700(1985); (これら参照文献は全て本明細書中に参照により組み入れるこ
ととする)。

【０１３５】 ES細胞はin vitroで増殖しうるので、ES細胞を体細胞遺伝学の技法を用いて操
作することができる。従って、変異(hprt遺伝子(ヒポキサンチンホスホリボシル
トランスフェラーゼをコードする)中などの)を有するES細胞を選択することがで
きる(Hooper, M.ら, Nature 326:292-295(1987); Kuehn, M.R.ら, Nature 326:2
95-298(1987))。次いでそのようにして選択された細胞を、ある活性な酵素の発
現ができないキメラまたはトランスジェニックマウスを作成するために用いるこ
とができ、従って、疾患の動物モデルが提供されることとなる。

【０１３６】 本明細書で用いているES細胞はマウス129SvJ系統由来のもので、ネオマイシン
遺伝子を有しているマウス一次胚線維芽細胞(PMEF)フィーダー細胞上で培地中で
維持されたものである。培地には白血病阻止因子(1500ユニット/mL)を添加した
。ターゲッティングベクターを制限エンドヌクレアーゼNotIで直鎖化し、３×10 ^６ 個のES細胞の電気穿孔によってJ1細胞系統(Liら, 1992)中へトランスフェクト
した。遺伝子操作で改変された、ターゲット対立遺伝子を含むES細胞は、350μg
/mLのG418(Gibco)および0.2μMのガンシクロビル(Bristro Myers)で選択した。

【０１３７】 相同組換えされたESクローンをスクリーニングするために、2重の耐性(ネオマ
イシンおよびガンシクロビルに対して選択された)を示すクローンからゲノムDNA
を単離した。ゲノムDNAは培養細胞から溶解用バッファー(10mM Tris-HCl, pH7.5
/100mM NaCl/1mM EDTA/100μgプロテイナーゼK)中で55℃で一晩消化した後、イ
ソプロパノールで沈殿させて単離した。そのペレットを70%エタノールで洗い、1
00μLの１×TE、pH8.0中で一晩55℃で溶解させた。

【０１３８】 各クローンからのゲノムDNAをPCR増幅の鋳型として用い、そのPCRではanx7特
異的隣接配列プライマーおよびPGK-neo特異的プライマー(5'-CGGATCGATCCCCTCAG
AAGAAC-3')を用いた。250個のクローンのうち3個が正しいサイズのPCRバンドを
示した。図3AはKSBX.pPNTでトランスフェクトされたES細胞クローンのPCR分析結
果を示している。PCRスクリーニングの結果を確かめるために、PCR陽性ESクロー
ンから得たDNAクローンをXbaIで消化しゲノムDNAプローブKXXとハイブリダイズ
させたが、そのプローブはターゲッティングベクター中に導入された5'隣接配列
の外側にあるものである(図3B参照)。そのプローブは、予測どおりanx7の正常な
対立遺伝子および改変された対立遺伝子をそれぞれ示している3.6kb 野生型およ
び4.5kb 変異断片を検出した。従って、このデータはターゲッティングベクター
がうまく作成され、遺伝子操作で改変させたヘテロ接合体ES細胞が単離され、そ
の細胞ではanx7遺伝子座にターゲッティングしたインテグレーションが1回のみ
起こったことを示していた。

【０１３９】 C. キメラの調製 ターゲッティングした所望の変異を含んでいるキメラの作成のための方策を図
4に示した。この例では、改変されたES細胞を、C57B1/6Jマウスから得た着床4.5
日前のマウス胚の胞胚腔の内腔中にマイクロインジェクションした。次いで、そ
の胚を偽妊娠させたマウスの子宮角中に外科的に移し、出生まで生育させた。

【０１４０】 その結果得られたキメラ動物をC57BL6/Jマウスと戻し交配し、生殖系細胞への
伝達を体毛の色でスコア化した。全体がまだらの(agouti)(A/A)マウス(すなわち
茶色)の子で、変異anx7対立遺伝子の存在について、ES細胞での相同組換えのイ
ベントの検出のために用いた上述の条件と同じ条件を用いたPCR増幅によって試
験した。通常はES細胞は、レシピエントの胚盤胞(黒色、図4では白く示されてい
る)と比べて識別可能な体毛色対立遺伝子(茶色、図4では黒く示されている)を有
するマウスから由来するものが用いられる。

【０１４１】 より特定して述べれば、まだらの(A/A)マウス(茶色)由来のES細胞(ターゲッテ
ィング構築物を有する)を、レシピエントのまだらでない(a/a)(黒色雌)C57B1/6
胚盤胞中に注入した(図5Ａ参照)。キメラの雄および雌を、まだらでない(黒色、
a/a)の雌および雄とそれぞれ交配させた。黒色の体毛を有する子孫は全て直ちに
除外した。キメラの雌のうちの1匹が茶色の雄マウスを生んだため、それは全細
胞中のanx7遺伝子の2つのコピーのうちの一方に選択した変異が含まれるものの
候補とした。キメラの雌は図5Ｂに示す：ほぼ完全にまだらの茶色の体毛を有し
、従って毛包細胞の95%以上がanx7トランスジェニックキメラマウスがES細胞由
来であった。さらに、このキメラマウスの子孫は、C57B1/6黒色雄もしくは黒色
雌と交配すると全てまだら(茶色)であり、このマウスが産生する、全てではない
かもしれないが大多数の生殖細胞もES細胞由来のものであると結論づけられた(
図5C)。

【０１４２】 このキメラをC57B1/6J系と交配して、anx7遺伝子の30の生殖細胞系統ヘテロ接
合体を得た。スクリーニングした140の仔のうちanx7(−/−)変異体は観察されず
、anx7欠損変異体は子宮中で死亡したものと考えられた。胚性死がどの時点であ
ったのかを調べるために、胚のE8からE17日目までのマウスの遺伝子型を調べた
。分析した120の生育し得る胚のうち25%がE10日目にanx7(−/−)であったが、そ
のうちE11日目まで生存していたものはなかった。これらの胚の卵黄嚢DNAを上述
のPCR分析での鋳型として用いた。PCR分析ではanx7転写物がanx7(−/−)変異体
中では存在していないことが示された(図6参照)。

【０１４３】D. 上記キメラの解剖学的、および組織学的研究 anx7(＋/−)およびanx7(＋/＋)マウスから得た30個のF2世代雑種の重量を一定
の間隔で測定した。9ヶ月齢のanx7(＋/−)およびanx7(＋/＋)マウスを屠殺し、
内臓の重量を測定した。次の組織を10%緩衝化ホルマリンで固定した：脳、脳下
垂体、心臓、肺、肝臓、膵臓、副腎、腎臓、脾臓、および胸腺。病理学的研究の
ために、これらの組織をパラフィンに包埋し、5μmの切片とし、ヘマトキシリン
・エオジンで染色した。この結果は図8に示し、下記で考察した。

【０１４４】 出生時には、anx7(＋/−)ヘテロ接合体は野生型同腹仔もしくは創始つがい個
体(founder mate)とその大きさもしくは行動では区別が付けられなかった。しか
し、図7Aに示すとおり、6〜8週目までには、雄のanx7(＋/−)ヘテロ接合体はよ
り大きくなり、相対的に巨大である点でより小さな正常個体とは明瞭に区別しう
るものとなった。この差を定量的に測定するために、1組の動物の体重を計画的
に追跡調査した(図7B参照)。生後9ヶ月までに、雄のヘテロ接合体の体重は40.7
±4.4(SEM, n＝5)グラムとなり、これに対して対照群では33.2±2.2(SEM, n＝5)
グラムであった。この雄の約25%という相対的な体重増加は、統計学的に有意で
あり、これは肥満症によるものではなかった。これに対して、雌では加齢に伴い
体重増加に変化は認められなかった。

【０１４５】 雄のanx7(＋/−)マウスは生後約4週間までには正常な同腹仔対照群よりもはや
い速度で成長を始める。これに対して、雌のanx7(＋/−)マウスでは雌の対照群
と異ならない。それ以降の雄の変異体の成長は衰えることはないようである。図
7のデータは6ヶ月齢までの成長を示している。しかし、これらの同じ動物の体重
を13ヶ月齢で測定すると、その後の期間中も成長し続けたことの証拠が認められ
た。これらのヘテロ接合体のマウスの何匹かについては60グラムもの重い体重と
なった。死後の検査ではこれらの動物は肥満しておらず、単に大きいだけである
ことが全身的に示された。6ヶ月齢時に臓器重量を調べたところ、anx7(＋/−)の
雄では多くの内臓の重量が正常のマウスよりはるかに重かったが、大体において
構造的には正常であった。我々の関心を次にランゲルハンス島の過形成に向けた
ところ、膵臓は正常のものより大きくなっていなかったいくつかの臓器の１つで
あったことは驚くべきことである。しかし、前記ランゲルハンス島は容積では該
島の2%以下を構成しているに過ぎない。

【０１４６】 anx7(＋/−)マウスの性特異的巨大化および巨大臓器化という成長の表現型は
、報告されている他のノックアウトマウスの表現型とは基本的に異なっている。
p27^kip1(−/−)マウス(Feroら, 1996; Nakayama, K.ら, Cell 85:707-720(1996
))を例外として、これまでに報告されている突然変異に基づく巨大化の例は大多
数が内分泌物に起因するものであり、成長ホルモン(GH)の増加(Palmiter, R.ら,
Nature 300:611-615(1982))、IGF-1の増加(Mathews, L.ら, Endocrinology 123
:2827-2833(1988))、またはIGF-2の増加(Wolf, E.ら, Endocrinology 135:1877-
1886(1994))によるものである。しかし、anx7(＋/−)マウスの血清中のIGF-1レ
ベルは正常範囲内であった。さらに、IGF-1レベルは成長ホルモンの脈動レベル
と調和しているので、anx7(＋/−)マウスでの平均のGHレベルは同様におそらく
正常であろうと結論づけられた。一晩絶食させた動物で測定したGHレベルは、雄
で変化が見られなかった。雄のanx7(＋/−)マウスと、GHまたはIGF-1についてト
ランスジェニックなマウスとの間の成長速度論の１つの質的な類似点は、出生後
の成長増強の開始が遅れることである。anx7(＋/−)の雄マウスとGHトランスジ
ェニックマウスは3〜4週目にそのような成長を開始するが、IGF-1トランスジェ
ニックマウスは6〜8週以降に初めてそのような成長を開始する。IGF-2を過剰に
産生するマウスは出生時に対照のマウスよりも体重が重いが、その体重の増加を
成獣期まで維持しない。雄および雌のanx7(＋/−)変異体の脳下垂体の組織学的
所見では、野生型の組織学的所見との差は見られなかった(データはここには示
していない)。このことと一致して、anx7(＋/−)雄変異体に認められた臓器巨大
化の選択的分布は、GH、IGF-1、およびIGF-2が高レベルであること(Palmiter, R
.ら, Science 222:809-814(1983); Mathews, L.ら, Endocrinology 123:2827-28
33(1988); Quaife, C .ら, Endocrinology 114:40-48(1989); Wolf, E.ら, Endocrinology 135:1877-1
886(1994); Ward, A.ら, Proc. Natl. Acad. Sci. (USA) 91:10365-10369(1994)
)、またはp27kip1(−/−)マウスで報告されている性別と無関係の一般的な臓器
巨大化、に関連するものとは、区別される。結局のところ、絶食させたかまたは
餌を与えたanx7(＋/−)マウスの血中インスリンレベルは対照の動物のレベルと
大きな差はなく、このことは高インスリン症ということではどちらの場合にも説
明となりえないことを示している。したがって、これらを総合して考慮すると、
これらのデータは、anx7(＋/−)マウスで認められた異常な成長はおそらくは脳
下垂体機能亢進と関係していないとの結論をさらに確認するものである。anx7(
＋/−)マウスにおけるユニークな異常成長が性特異的であるという事実は、anx7
(＋/−)マウス突然変異に対して明確な内在性遺伝的制御が存在することを示し
ている。

【０１４７】 図8にさらに示したとおり、anx7(＋/−)の雄マウスの体重増加は内臓の多くの
肥大と同時に起こっていることが見出された。さらに、この別の研究では、主要
臓器の多くが、全体重の約25%の増加とは不釣り合いに大きいことが見出される
。このような状況の最も明瞭な例は心臓であり、対照の正常な雄の同腹仔の心臓
よりほぼ80%重い。脳は正常な対照の脳と比べて平均で8%重いが、この差は統計
学的に有意ではない。総体的に見ると、これらの雄の変異体はただ大きいだけで
肥満ではなかった。

【０１４８】 最後に、雌雄間で二相性を示す成長ホルモンもしくはその他の脳下垂体起源の
ホルモンの異常が、雄の巨大化を説明し得るか否かを判断するために、本発明者
らは野生型とヘテロ接合型の動物のIGF-1およびコルチコステロンの血漿中濃度
を調べた。しかし、IGF-1、コルチコステロンのレベルはいずれも、同じ性別で
比較したとき野生型と変異体との間で変化は見られなかった。さらに、雄および
雌の、変異体ならびに正常な同腹仔対照の脳下垂体は、同じ性別で比較したとき
組織学的な差は認められなかった(各群n＝6、データは示していない)。

【０１４９】実施例II anx7(＋/−)マウスでの自然発生腫瘍 合計50匹の100〜200日齢のヘテロ接合体動物について完全な死後検査を行った
ところ、10匹に組織学的に確認しうる、肉眼的に認められる腫瘍が見られた。こ
れらの腫瘍は雄、雌の双方に生じた。認められる腫瘍は主として胸腺のリンパ肉
腫、インスリノーマ、および肝細胞癌であった。対照の動物には上記の腫瘍例は
認められなかった。

【０１５０】 50匹の約1年齢のヘテロ接合体からなる第2のセットでは、腫瘍発生率が約50%
と非常に高くなっていた。この年齢のより高い動物でも腫瘍は主として胸腺のリ
ンパ肉腫、および肝細胞癌であった。いくつかの例では同一個体内に2種以上の
腫瘍が検出された。さらに、いくつかの例では、他の点では「正常」である変異
体動物で異形成性の胸腺の器質化が認められた。

【０１５１】 胸腺のリンパ肉腫はこれらの変異体ではしばしば生ずる腫瘍である。この腫瘍
の特に興味深い1例を図9に示す。この腫瘍は被包されていない状態であり、前胸
腔に充満して心臓を取り巻き、肺を圧迫している1cm³の黄褐色の肉塊として認め
られた。この腫瘍塊は毛細線維血管性の基質に支持された単形性細胞のシートか
らなっている。図9Bに示すとおり、それらの細胞は小さく、丸い形で非接着性で
あり、区分の明瞭な境界を有し、わずかに好塩基性の細胞質を有し、中央に丸く
高度に塩基性の単一の核を有し、多くは単一の中央にある明確な核小体を有する
。有糸分裂の速度は中等度で、平均すると強拡大の1視野あたり1個であり、多数
の大きな「白く抜けて見える」マクロファージが新生物形成細胞中に散在してい
る。臓器レベルではその新生物形成細胞は浸潤し縦隔に拡張していることが見出
され、肺動脈の枝に沿って肺の中へと伸びている(図10Bを参照せよ)。その腫瘍
は気管リンパ節を見えなくし、腎臓にも広がっていること(ここには示していな
い)が認められた。

【０１５２】 リンパ肉腫より頻度は少ないが、肝細胞癌はその大きさが大きいため顕著であ
る。図11に示した肝細胞癌は被包のない塊(1×0.5×0.5 cm)で索状および柱状の
形をとった大きな多角形の細胞からなるものであった。有糸分裂の速度は強拡大
の10視野あたり1個未満である。細胞には、別個の細胞質境界、顆粒性〜微細空
胞化した好酸性細胞質が豊富に見られ、中央に大きな円形の小胞性の核が認めら
れる。時には複数の核小体を有する核も認められるが、大多数の細胞では、単一
で明瞭に認められる赤紫色の核小体がある。新生物形成細胞は隣接した肝実質に
浸潤していることが観察される。

【０１５３】 (1) 胸腺のリンパ肉腫の例 胸腺のリンパ肉腫から得た切片を50倍に拡大したものを図9Bに示し、比較のた
めに図9Aに正常の胸腺サンプルを示す。広域資格を有する獣医病理学者の説明は
下記のとおりである： マウスMS9801634の胸腺の塊についての説明：前胸腔を占めている1cm³の黄褐
色の肉塊は心臓を取り囲み、肺を圧迫している。この腫瘍塊は毛細線維血管性基
質に支持された単形性細胞のシートからなっている。それらの細胞は小さく、丸
い形で非接着性であり、区分の明瞭な境界を有し、わずかに好塩基性の細胞質を
有し、中央に丸く高度に塩基性の単一の核を有し、多くは単一の中央にある明確
な核小体を有する。有糸分裂の速度は中等度で、平均すると強拡大の1視野1個で
あり、多数の大きな「白く抜けて見える」マクロファージが腫瘍細胞中に散在し
ている。臓器レベルではその腫瘍細胞は浸潤し縦隔に拡張していることが見出さ
れ、肺動脈の枝に沿って肺の中へと伸びている。その腫瘍は気管リンパ節を見え
なくし、腎臓にも広がっていることが認められた。細胞の形態はリンパ肉腫のも
のと一致している。

【０１５４】 図10Bでは切片は腫瘍細胞の肺への浸潤を示しており、そこでは肺の気管支に
沿った拡張が明瞭に認められる。比較のためにanx7(＋/＋)マウスから得た対照
の肺を図10Aに示している。胸腺のリンパ肉腫のその他の多数の例では、膵臓へ
の転移が高頻度に認められている。

【０１５５】 (2) 肝細胞癌の例 肝細胞癌から得た切片を100倍に拡大したものを図11Bに示している。比較のた
めに図11Aにanx7(＋/＋)から得た正常な肝臓のサンプルを示す。広域資格を有す
る獣医病理学者の説明は下記のとおりである。

【０１５６】 マウスM9901058から(肝臓周辺領域から)得た塊(1×0.5×0.5 cm)についての説
明：その塊は索状および柱状の形をとった大きな多角形の細胞からなるものであ
った。細胞には、別個の細胞質境界、顆粒性〜微細空胞化した好酸性細胞質が豊
富に見られ、中央に大きな円形の小胞性の核が認められる。大多数の細胞では、
単一で明瞭に認められる赤紫色の核小体がある；時には複数の核小体を有する核
も認められる。その塊は非被包性で新生物形成細胞は隣接した肝実質に浸潤して
いる。有糸分裂の速度は強拡大の10視野あたり1個未満である。

【０１５７】 細胞の形態は胸腺のリンパ肉腫および肝細胞癌と一致するものである。他のタ
イプの腫瘍も頻度は低いものの検出されているので、anx7(＋/−)表現型は、他
の腫瘍を排除しある1種の腫瘍のタイプに明確に優先性を持って発現されるので
はないものと考えられる。野生型ヒトanx7遺伝子は種々のヒト腫瘍細胞系等の増
殖を抑制する。

【０１５８】実施例III anx7(＋/−)マウスから得た組織中のANX7タンパク質の量の測定 上述のとおり、anx7(＋/−)マウスの特定の臓器(例えば、心臓および膵島)は
臓器巨大を示す。anx7(＋/−)および対照のマウスから組織を採取し、ドライア
イスで凍結し、次いで沸騰させたSDSバッファー中でホモジナイズし、次いでANX
7タンパク質を評価した。同量のタンパク質を含有するアリコートをSDS-PAGEで
分離し、ニトロセルロースにブロットし、ウサギ抗ANX7一次抗体、HRP結合二次
抗体、およびX線フィルム上でのECLの検出を用いてANX7を可視化した。

【０１５９】 図13に示すとおり、雄のanx7(＋/−)マウスの膵臓中のANX7の量は対照の動物
から得た膵臓組織中のANX7量の20〜30%であった。心臓組織も並行して調べたと
ころ、同様の結果であった。心臓から得たANX7は、より高分子量の編集された産
物へと編集される組織特異的カセットエキソンを有している。

【０１６０】 ANX7レベルは変異体では対照の膵臓、心臓、および他の組織におけるよりもは
るかに低いようである。組織特異的編集プロセスは変異体のマウスでの発現レベ
ルがより低いことに影響を与えていないものと考えられる。従って、anx7(＋/−
)マウスにおけるanx7遺伝子の残存しているインタクトなコピーはノックアウト
された対立遺伝子の機能の喪失を補償することはできないものと考えられる。

【０１６１】実施例IV 野生型および突然変異anx7を発現している遺伝子治療用組換えアデノウイルスの
産生 化学的方法に基づく遺伝子導入系と比べて、アデノウイルス系は特定の遺伝子
を細胞中に導入する上でより効率的であり定量的である。anx7センス、アンチセ
ンス、および突然変異を有するアデノウイルスの組換え体は、複製欠陥アデノウ
イルスベクターQBI-Ad5(Quantum Biotechnologies, Inc., Laval, カナダケベッ
ク州)を用いてヒト胚性腎細胞(HEK293)中に同時トランスフェクションすること
によって構築する。HEK293細胞中で、anx7 cDNA配列を含んでいる組換えアデノ
ウイルスベクターが相同組換えにより形成される。１構築物について約20個のプ
ラークから得たHEK293細胞溶解物を、PCRによりanx7 cDNAから得たプライマーを
用いて、組換えウイルスに関して分析する。PCR分析で陽性を示したプラークか
ら得た細胞溶解物を、さらにウエスタンブロット分析によってANX7タンパク質の
発現について特性解析する。ANX7を強く発現しているプラークをさらにプラーク
精製し、さらなる実験のためにHEK293細胞からより高力価で単離する。

【０１６２】 野生型および突然変異anx7遺伝子を複製欠陥アデノウイルスベクター中へと遺
伝子工学的に作製し、さらにアデノウイルス粒子を調製し、精製し、力価測定し
、HEK293細胞に適用することにより系統立って試験する。種々の野生型および突
然変異anx7遺伝子がアデノウイルスベクター中に作製され、そのうちの多くが組
換えアデノウイルス粒子として発現された。ここに示していないが、anx7突然変
異としては、4つのリピート中の突然変異カルシウム結合部位の16種の組み合わ
せ；プロテインキナーゼC部位に対する2つの部位特異的突然変異；GTP結合部位
に対する5つの突然変異；および1種のアンチセンスanx7構築物が含まれる。

【０１６３】実施例Ｖ ANX7のドミナントネガティブ突然変異体の産生 腫瘍抑制遺伝子のドミナントネガティブ突然変異体は、腫瘍抑制遺伝子の作用
機構を研究するのに有用である。腫瘍抑制性anx7遺伝子の役割を研究することに
代わるアプローチは、内在性anx7遺伝子の機能を抑制するドミナントネガティブ
活性を有する突然変異anx7構築物を用いることである。「ドミナントネガティブ
」遺伝子は、正常対応物の機能を優先的に抑制する異常タンパク質をコードする
。したがって、anx7の役割を調べる方法の1つは、正常ANX7の機能を抑制する「
ドミナントネガティブ」突然変異体構築物を野生型細胞において用いて、これら
の構築物の発現が、特にCa^2＋制限条件下において、その成長及び分化を変化さ
せるかどうかを決定するというものである。

【０１６４】 これらのドミナントネガティブ突然変異体を構築するため、ANX7の4つのCa^2＋ 結合部位のうちの幾つか又は全てにおける突然変異を突然変異生成の部位として
選択した。標準技術を用いて、部位特異的突然変異を、結晶学的に定義された全
部で4つのエンドネキシン折り畳みモチーフと組み合わせてカルシウム結合部位
に導入した。4つは全てコンセンサス配列［GXGTDE］を有しており、荷電残基の
アミド化類似体（すなわち、［GXGTNQ］）を産生するように突然変異を遺伝子工
学的に導入した。したがって、野生型ANX7を含む16種類の異なる組合せを調製し
た。これらの組合せは、単一突然変異（例えば、1、2、3及び4）；2つの部位で
の突然変異（例えば、1及び2、1及び3等）；3つの部位での突然変異（例えば、1
及び2及び3、2及び3及び4等）並びに4つ全ての部位での突然変異（例えば、1及
び2及び3及び4）であった。

【０１６５】 上記突然変異体を全て作製し、ホスファチジルセリンリポソーム融合アッセイ
（Couhayら, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA) 93:10797-10802 (1996)）において
試験した。幾つかは野生型と同様に活性を示したが、他のものは活性がより低か
った。図14に示されるように、突然変異体の１つであるANX7Jは、本質的に不活
性であり、かつ、等モル量の野生型ANX7（すなわち、各々1μgのANX7タンパク質
）と混合したときに非常に阻害性であった。すなわち、ANX7Jはこのin vitro試
験においてドミナントネガティブ突然変異体として振る舞う。

【０１６６】実施例VI in vitro及びin vivoおけるプロテインキナーゼの標的としてのヒトANX7 トレオニン／セリン・プロテインキナーゼ、例えば、プロテインキナーゼC（P
KC）及びチロシンキナーゼは腫瘍抑制遺伝子、例えばp53またはBRCA1をそれぞれ
リン酸化することが知られている。in vitro試験としては、精製組換えANX7を精
製プロテインキナーゼと混合し、アッセイを行う。in vivo試験としては、特異
的受容体のアゴニストを細胞と混合し、内在性ANX7標識を検出する。

【０１６７】 一連の精製プロテインキナーゼをin vitro活性について組換えANX7で試験した
。これらにはプロテインキナーゼC（PKC）、cAMP依存性プロテインキナーゼ（PK
A）、cGMP依存性プロテインキナーゼ（PKG）、カゼインキナーゼI及びカゼイン
キナーゼII、Ca^2＋／カルモジュリンキナーゼII、並びにチロシンキナーゼ、p60 ^src 及び上皮成長因子受容体キナーゼ（EGFR−キナーゼ）が含まれていた。これ
らのアッセイにより、最良の実験条件下で30分のインキュベーションの後の³²[P
]／ANX7タンパク質のモル比を決定した。図15に部分的に概説されるように、試
験した酵素のうち5つのみが活性であった。これらは、PKC（モル比＝2.0）、PKG
（モル比＝1.0）、PKA（モル比＝1.0）、p60^src（モル比＝1.0）、及びEGFR（モ
ル比は決定されず）キナーゼであった。Ca^2＋依存性膜融合アッセイにおけるANX
7活性はANX7のPKC処理によって大幅に増強された。ANX7の2つの候補PKC部位のう
ちの1つを選択し、実質的に活性を喪失させることなくセリン（S）からアラニン
（A）に突然変異させた。対照的に、組換えANX7をカゼインキナーゼI、カゼイン
キナーゼII、又はCa^2＋／カルモジュリンキナーゼIIに晒したときには活性は検
出されなかった。

【０１６８】 in vivo条件の下でPKCリン酸化について試験するため、クロム親和性細胞を³² [P]で平衡化して内在性ATPを標識し、ホルボール−12−ミリステート−13−アセ
テート（PMA）に晒してPKCを活性化した。かなりの量の³²[P]標識内在性ANX7が
免疫沈降によって検出され、これは特異的PKC阻害剤によって遮断された。

【０１６９】 加えて、in vivo細胞レベルで、ヒト腺癌A431細胞を上皮成長因子（EGF）又は
血小板由来成長因子（PDGF）のいずれかに晒したときに内在性ANX7が標識され得
るかどうかも調べた。いずれの場合においても、かなりのレベルの³²[P]標識内
在性ANX7が免疫沈降によって検出された。

【０１７０】 したがって、ANX7は、in vitro及びin vivoの両者で、広範囲のプロテインキ
ナーゼによって標識することができる。カゼインキナーゼI及びIIの例外はANX7
をp53型の標的分子と区別するのに役立つ。

【０１７１】実施例VII ヒトanx7におけるGTP結合部位突然変異 ANX7は5つの推定上のRAS型標準GTP結合部位を含むCa^2＋活性化GTPアーゼであ
る。これらのGTPアーゼドメインにおける突然変異がANX7の活性に重要であり得
ることは本実験以前には知られていなかったため、分散的な部位特異的RAS様突
然変異を含む突然変異体ANX7を構築し、発現させた。これらの突然変異は、G−2
（QinT）；G−4（NRsN）；及びG−5（EiSG）であった。こうして、8−アジド−G
TPの結合をGTP結合の評価に用いることができた。

【０１７２】 これらの野生型及び突然変異体ANX7タンパク質を大腸菌（E.coli）におけるpT
rc99A発現系において発現させ、格差硫酸アンモニウム沈殿及びUltragel AcA54
でのカラムクロマトグラフィーにより約90％に精製した（より詳細にはCauhuyら
、1996を参照）。47KDa又は51KDaのバンドのANX7タンパク質比含量を、¹²⁵[I]抗
マウスIgG二次抗体を用いて一次モノクローナル抗体10E7が結合しているニトロ
セルロース上のブロットされたサンプルを標識することによって見積もった。AN
X7及びANX7突然変異体は、非特異的結合をブロックするための2mMグルタチオン
の存在下において、8−N₃−³²[P]−GTPで光標識した。

【０１７３】 ウェスタンブロット及びタンパク質ブロットにより、かなりの量の突然変異体
タンパク質を調製できることが示された。PhosphoImagerによるデータは、LI突
然変異体がGTP結合を完全に遮断し、それに対してNI、TA1及びFL突然変異体は約
60％の活性を示すことを明らかにする。一方、TA2突然変異は約50％の活性を示
した。「FLS」は組換え完全長anx7、又はANX7を表す。TA1及びTA2突然変異はカ
セットエクソン＃6を含むより高分子量のANX7イソ型として存在し、そのためSDS
ゲル上でよりゆっくりと移動する。RASにおいては、ANX7において行われるのと
まさに同様に、等価物LI突然変異がGTPの結合を妨げる。

【０１７４】 これらのデータは、ANX7の内因性GTPアーゼ活性の構造的基盤の立証に役立つ
。

【０１７５】実施例VIII 培養及び腫瘍細胞株における腫瘍抑制遺伝子活性のアッセイ：ヒトanx7遺伝子に よるヒト腫瘍細胞増殖の抑制 腫瘍細胞株をin vitroで増殖させることができ、この増殖は野生型腫瘍抑制遺
伝子が腫瘍細胞内にトランスフェクトされると抑制される（例えば、Greenblatt
, M.S.ら, Mutations in the p53 Tumor Suppressor Gene: Clues to Cancer Et
iology and Molecular Pathogenesis, Cancer Res., 54:4855-4878 (1994)）。
例えば、特定のヒト前立腺腫瘍細胞株は、突然変異Rb遺伝子が野生型Rb遺伝子で
置き換えられると、抑制され得る（Huang. H.J-S.ら, Science 242:1563-1566,
(1988)；Bookstein, R.ら, Science 247:712-715, (1990)）。同等の結果がヒト
膀胱癌細胞株について報告されている（Takahashi, R.ら, Proc. Nat. Acad. Sc
i. (USA) 88:5257-5261 (1991)）。同様の報告はp53遺伝子についてもなされて
いる（例えば、Eliyahu, D.ら, Proc. Nat. Acad. Sci. (USA), 86:8763-8767 (
1989)；Finlay, C.A.ら, Cell 57:1083-1093 (1989)；Isaacs, W.B.ら, Cancer
Res., 51:4716-4720 (1991)）。具体的な例にはヒト結腸直腸癌細胞（Baker, S.
J.ら, Science 249:912-915 (1990)）ならびにヒト前立腺癌細胞株、例えば、LN
CaP及びDU145（Srivastava, S.ら, Nature 348:747-749 (1998)）の増殖抑制が
含まれる。多くの感受性腫瘍細胞はp53突然変異を含むが、内在性野生型p53を含
むp53をトランスフェクトすることにより癌細胞の増殖を抑制することも可能で
ある（Clayman, G.L.ら, Cancer Res. 55:1-6 (1995)；Katayose, D.ら, Clin.
Cancer Res. 1:889-897 (1995)）。このトランスフェクション・パラダイムを用
いると、野生型p53のレベルを対照発現レベルの100倍にまで上昇させることがで
きる。

【０１７６】 細胞をATCCから入手し、以下のように扱った： 前立腺癌細胞株DU145を、1.5g／L重炭酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、1.0
mMピルビン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO）、及び10％ウ
シ胎児血清（Intergen Co.、Purchase、NY）を含むように調整された、2mM L−
グルタミン及びアールBSS（Earle's BSS）を含有するイーグル最小必須培地にお
いて培養した。

【０１７７】 前立腺癌細胞株LNCaPは、1.5％重炭酸ナトリウム、4.5g／Lグルコース、10mM
HEPES、1.0mMピルビン酸塩（Sigma Chemical Co.）、及び10％ウシ胎児血清（In
tergen Co.、Purchase、NY）を含むように調整された、2mM L−グルタミンを含
有するRPMI 1640培地において培養した。

【０１７８】 骨肉腫細胞株Saos−2は、1.5mM L−グルタミン（Sigma Chemical Co.）、及び
15％ウシ胎児血清（Intergen Co.、Purchase、NY）を含有するマッコイ5a培地（
McCoy's 5a medium）において培養した。

【０１７９】 乳癌細胞株MCF7は、1.5g／L重炭酸ナトリウム、0.1mM非必須アミノ酸、1.0mM
ピルビン酸ナトリウム（Sigma Chemical Co.、St. Louis、MO）、0.01mg／mlウ
シインシュリン（Life Technologies Inc.）、及び10％ウシ胎児血清（Intergen
Co.、Purchase、NY）を含むように調整された、2mM L−グルタミン及びアールB
SSを含有するイーグル最小必須培地において培養した。

【０１８０】 細胞を6ウェルプレート（35mmウェル）に播き、その細胞型に適する培地中で
のトランスフェクションに適切な培地中で約70％集密にまで増殖させた。最初に
、β−ガラクトシダーゼを発現するプラスミドを用いてトランスフェクション・
パラメータを最適化した。これらの研究は、2−4μgのプラスミドDNA及び6μlの
リポフェクタミンが最大トランスフェクション効率を生じることを示唆した。し
たがって、基本的には供給業者が推奨するように、細胞を5時間かけて、様々な
量（1−6μg）の数種のプラスミド（得られるpcDNA3.1単独、又はヒトanx7、p53
もしくはNMDA受容体サブユニット2CをコードするcDNAを含有／発現するpcDNA3.1
）及びリポフェクタミン（6μl；Life Technologies Inc.、Grand Island、NY）
により、還元血清培地（Optimem 1、Life Technologies Inc.）中でトランスフ
ェクトした。

【０１８１】 約36時間後、G418（Geneticin、Life Technologies Inc.）を培地ml当たり800
μgで用いる選択を開始した。その後、3−4日ごとに常にG418を含む培地で交換
しながら細胞を維持した。G418選択の約1週間後、ほとんどの非トランスフェク
ト細胞が死んでいた。選択の約2週間後、pcDNA3でトランスフェクトしたウェル
中に多くのコロニーを肉眼で認められたとき、細胞をリン酸緩衝生理食塩水（PB
S）ですすぎ、PBS中2％のホルムアルデヒドで15分間固定し、PBS中0.5％のクリ
スタルバイオレットで15分間染色し、蒸留H₂Oで1−2回すすぎ、乾燥させて引き
続くコロニーの定量化のために保存した。拡大することなく視認し得る各ウェル
中のコロニーをカウントし、各濃度の各プラスミドでトランスフェクトしたウェ
ルについて平均値（平均＋該平均の標準誤差）を決定した。

【０１８２】 図12に示されるように、4種類の全ての細胞株はanx7及びp53の両者によってDN
A用量依存性の様式で抑制されるが、ベクター対照によっては抑制されない。2種
類の前立腺腫瘍細胞株、DU145（図12A）及びLNCaP（図12B）、乳癌細胞株MCF−7
（図12C）、並びに骨肉腫細胞株（Saos−2）（図12D）をベクター単独又はanx7
を発現するベクター（＋anx7）もしくはp53を発現するベクター（＋p53）でトラ
ンスフェクトした。

【０１８３】実施例IX ヒト線維芽細胞における細胞周期内のanx7 mRNA及びANX7タンパク質の状態 腫瘍抑制遺伝子は、細胞増殖の制御について、主として細胞周期の異なる側面
に対するそれらの作用によって知られる。anx7がこのプロセスにおいて役割を果
たすかどうかを決定するため、anx7 mRNA及びANX7タンパク質の状態を非形質転
換細胞の細胞周期における位置付けとの相関関係にあるものとして知ることが重
要である。細胞周期を同調させる血清欠乏／追加法によりヒトIMR−90線維芽細
胞におけるanx7 mRNA及びANX7タンパク質の状態を研究することができ、それに
よりこの期間内に生じる変化を研究することができる。

【０１８４】 （1）細胞、細胞周期アッセイ、及び免疫検出： ATCCから入手したIMR−90細胞を培養し、Raynalら（1997）（上記参照）によ
って記載されるように、血清欠乏によって同調させてそれらの細胞をG₀に停止さ
せた後、血清追加によって活性化させた。細胞周期の進行を、4時間にわたる³[H
]−チミジン取込み（5μCi／ml）及びcdc−2（Zymed）のモノクローナル免疫検
出によって追跡した。ANX7は、保存性内部ANX7ペプチド（RDLEKDI RSDTSG）に対
するポリクローナルウサギ抗ANX7抗体で検出した。検出は、¹²⁵[I]−二次抗体及
びMolecular Dynamics PhosphoImager定量に基づいて行った。これらのアッセイ
を標準化するのには発明者ら自身の組換えANX7を用いた。

【０１８５】 （2）mRNAの分析： anx7 RNアーゼ保護アッセイを構築するため、PCR増幅キット（Perkin-Elmer C
etus、Norwalk、CT）を用い、Raynalら（1997）によって記載されるプライマー
の組を用いて鋳型を構築した。RNアーゼ保護アッセイは、変性PAGEによる産物の
分離及びオートラジオグラフィーによって分析した。

【０１８６】 集密ヒトIMR−90線維芽細胞を無血清培地において72時間インキュベートし、
時間ゼロの時点で10％血清を添加して細胞周期を活性化させる。Raynalら（Bioc
hem. J. 322:365-371 (1997), これは参照により組み込まれる）において示され
るように、cdc2（別名、cdk2）合成の後には免疫ブロットを行ってG2／M相を特
徴付け、これに対してS相を特徴付けるDNA合成の後には³[H]−チミジンの取込み
を行う。この周期の期間にわたるANX7の相対的発現をウェスタンブロット分析に
よって決定する。他のアネキシンはRaynalらの実験の対照として役立つ。

【０１８７】 SとG2／Mとの間の移行時にANX7タンパク質のレベルは低程度であるが有意に減
少する。しかしながら、anx7 mRNAのレベルは全細胞周期にわたって容易に認め
得るほどには変化しない。

【０１８８】実施例X anx7遺伝子における多型又は突然変異を判定するための方法 （1）RNA転写物の分析： マウス及びヒトに由来する対応腫瘍及び隣接する正常組織を採取し、直ちにOC
T（Miles Inc. Diagnostics Division Elkhart、IN）に埋め込んで−70℃で凍結
する。LCM（レーザー遺伝子捕捉顕微解剖）を用いて、腫瘍及び正常細胞を異種
接合マウス及びヒト種から入手する。クリオトームを用いて1.0ミクロン切片を
凍結組織から切り出し、ヘマトキシリン（H）及びエオシン（E）によって染色す
る。これらのH＆Eスライドを病理学者が読み取り、70％を上回る腫瘍細胞の存在
を確認する。各スライド上で新生物領域の輪郭を描く。これらのスライド上の非
染色凍結切片を、DNAが抽出されるまで−70℃で保存する。H＆E染色スライドを
テンプレートとして用い、対応する凍結切片をそれに重ね合わせる。LCMによっ
て切開された正常及び腫瘍細胞をRNA抽出に用い、Ransom B試薬（Tel-Test, Inc
.、Friendwood、Texas）によって精製する。腫瘍及び正常組織RNAを、ランダム
・ヘキサマー及びSuperscript（Life Technology、Gaithersburg、MD）を用いて
逆転写する。完全anx7タンパク質コーディング配列に相当する5つのcDNA断片を
、pfu DNAポリメラーゼを用いて増幅する。pfu DNAポリメラーゼはプルーフリー
ディング活性を有するため、Taq DNAポリメラーゼと比較して誤りの傾向が少な
い。それらのPCR断片を、各断片に最適化した温度で「Cold SSCP」に付す。SSCP
ゲルからの異常バンドを再増幅し、配列決定する。

【０１８９】 （2）腫瘍サンプルにおけるanx7遺伝子座での対立遺伝子喪失の分析： 腫瘍細胞の規定領域を、上述の隣接正常組織をこすり落とさないように注意を
払いながら、新しいカミソリの刃でこすり落とす。こすり落とした組織をプロテ
イナーゼKで消化し、フェノール／クロロホルムで抽出した後、エタノール沈殿
する。凍結組織からのゲノムDNAの完全性及び濃度をアガロースゲルで決定する
。対応する正常DNAを、腫瘍細胞を含まない組織学的に正常な組織切片から抽出
する。anx7遺伝子座における多型及び欠失を検出するため、制限酵素で消化した
高分子量DNAを用いてサザンブロット分析を行う。0.6％アガロースゲルでの電気
泳動によってバンドを分画し、ナイロンメンブランに移す。これらのナイロンメ
ンブランをニックトランスレーションcDNA anx7プローブとハイブリダイズさせ
る。その後、疾患サンプルにおける多型変化を分析する。

【０１９０】 （3）PCR及び多型分析： ジヌクレオチド反復配列に隣接するプライマーがanx7遺伝子において同定され
ている（Shirvanら、1994）。ゲノムDNAサンプルに対して以下の条件を用いてPC
Rを行う：最終容積50μl中に5ナノグラム（ng）のDNA鋳型、50ngの各プライマー
、0.5単位のAmpliTaq Gold（Perkin Elmer Emeryville、CA）、1×PCRバッファ
、200μl dNTP混合物。PCR条件は用いた全てのプライマーで同一である。PCRサ
イクルは、95℃で10分間の1サイクル、それに続く95℃で30秒間、55℃で45秒間
、及び72℃で1分間の25サイクルからなる。プライマーのうちの1つは³²P−ATP及
びT4ポリヌクレオチドキナーゼキット（Life Technology、Gaitherburg、MD）を
用いて末端標識する。対立遺伝子の喪失／獲得を示す各遺伝子座をβ−アクチン
と共増幅し、PCR反応において同程度の量の投入DNAを用いていることを確認する
。ヒト胎盤DNAをPCR反応の陽性対照として用いる。放射性手法によって分析する
サンプルのため、PCR産物を7％アクリルアミド／尿素／ホルムアミドゲルでの電
気泳動に供す。このゲルを乾燥させ、オートラジオグラフィー用の処理を施す。

【０１９１】 （4）「Cold SSCP」／DNA配列決定によるanx7の突然変異分析： anx7 cDNAに相当するPCR産物を水酸化メチル水銀で変性させ、予め作製した20
％ポリアクリルアミドミニゲル（Novex）を通して高電圧及び一定温度で電気泳
動した。バッファ及びゲルの温度は特別に設計した冷却システムによる定温水循
環によって正確に維持される。wt anx7配列の存在下における突然変異体anx7対
立遺伝子の検出においてSSCPが直接DNA配列決定よりも高感度であることを指摘
することも重要である。これらのwt anx7配列は、腫瘍組織構造における正常細
胞の存在のため、又は腫瘍組織内の全ての細胞が必ずしもanx7突然変異を含むも
のではないという腫瘍細胞不均一性のため、不可避的に存在する。wt配列の存在
下において30％以下の突然変異対立遺伝子を含むPCR産物を直接DNA配列解析する
ことによって、突然変異を見出す合図とすることは困難である。しかしながら、
SSCPにおける突然変異対立遺伝子の移動度変化のため、大過剰のwt対立遺伝子中
において約10％の突然変異対立遺伝子が確実に検出される。突然変異体によるコ
ンホメーションがひとたび同定されると、それをSSCPゲルから単離し、DNA配列
決定用に選択的に増幅することができる。これらの問題は、腫瘍不均一性が相当
程度認められる癌の一次サンプルに由来する腫瘍DNAに特に適切である。ゲルの
銀染色又はSYBRグリーン染色はゲル上のSSCPバンドの検出感度を増加させる。「
Cold SSCF」法によって同定された異常SSCPバンドをゲルから切り出し、同じプ
ライマーを用いて再増幅する。PCR産物を精製し、ローダミン・ターミネーター
・サイクルシークエンシングキット（PE Applied Biosystem）を供給者が推奨す
る方法に従って用いて配列決定する。DNA配列は自動DNAシーケンサー（310 Gene
tic Analyzer、Applied Biosystem）で解析する。

【０１９２】 （5）LOHの評価 PCRの後、最初に、正常DNAと腫瘍DNAの間で対立遺伝子に相当するバンドの強
度を比較することにより腫瘍サンプルのLOH「ヘテロ接合性の喪失」を視覚的に
決定する。腫瘍DNAにおける2種以上の対立遺伝子の腫瘍DNAにおけるシグナル強
度が、正常のものと比較して５０％を上回る低下を示したものをLOHとして評点
する。乾燥したゲルを蛍光体蓄積スクリーンに4−5時間曝露し、画像をMolecula
r Dynamics Phosphorimagerで取得してImage Quantソフトウェア（Sunnyvale、C
A）で解析することによって定量を行う。定量は、バックグランドを減算し、バ
ンド上に手作業で配置した等サイズの矩形領域内の体積積分法により行う。

【０１９３】実施例XI ヒト前立腺腫瘍組織マイクロアレーにおけるANX7タンパク質発現のレベル ヒト前立腺腫瘍の進行の全てのステージから採取した301の検体を収容する前
立腺組織マイクロアレーにおけるANX7タンパク質発現のレベルを測定した。図16
Aに示されるように、ANX7発現の有意な減少がステージ特異的な様式で生じるこ
とが見出された。ANX7の発現は高頻度の転移（57％）及びホルモン抵抗性前立腺
癌の局所的再発（63％）において完全に失われた。対照的に、ANX7は良性前立腺
、高進行度前立腺上皮内新生物（PIN）、及びステージT2及びT3／4原発性癌にお
いては正常に近いレベルで認められる（全て89−96％の範囲内）。図16Bにおい
ては、ヒト腫瘍マイクロアレーにおいて用いたサンプルから採取した典型的な例
を、H＆Eにより（左側）、及び抗ANX−7モノクローナル抗体を用いて褐色ジアミ
ノベンジジン（DAB）により（右側）、染色した。（BPH−良性前立腺肥大。）上
段の3つの切片は濃く染色され、それに対して、それぞれ転移性腫瘍及び局所再
発腫瘍を示す下段の2つの切片は陰性である。ステージ特異的喪失のp値はp＝0.0
001である。この視覚的比較は上記の2つの最悪予後状況における統計的に有意な
ANX7の欠如を強く支持する。

【０１９４】実施例XII 前立腺癌におけるKi67（増殖画分）とANX7発現との関係 本発明者らは、Ki67免疫染色を腫瘍細胞増殖の指標として用いて、高いKi67標
識指数とANX7発現の欠如との正の相関だけでなく、進んだ段階の前立腺癌と高い
Gleason評点との相関を見出した。図17Aに見られるように、ANX7陽性ヒト前立腺
癌細胞は、Ki67抗体による免疫染色が高レベルである細胞（赤のバー）が、免疫
染色が低レベルの細胞（紫のバー）のパーセンテージと比較してかなり少ない。
対照的に、ANX7陰性ヒト前立腺癌細胞は、Ki67抗体による免疫染色が高レベルで
ある細胞（赤のバー）のパーセンテージが高い。これらのデータは301の腫瘍の
分析に基づくものであり、統計的に有意である（p＝0.0003）。

【０１９５】 図17Bは、図17Aにおいて用いたサンプルから取られた組織学的画像の例である
。左欄のサンプルはKi67によって染色したものであり、増殖状態を示す。右欄の
サンプルはANX7タンパク質について染色した連続切片である。良性前立腺肥大（
BPH）及び原発性上皮内新生物（PIN）を示すサンプルは、Ki67については低いが
ANX7タンパク質については高い。対照的に、転移性前立腺癌（MET）を示すサン
プルは高レベルのKi67を示すが、肉眼視されるANX7染色はなかった。

【０１９６】実施例XIII ヒト乳癌組織マイクロアレーにおけるANX7タンパク質発現のレベル 異なる正常組織をANX7遺伝子発現の「高」又は「低」レベルのいずれかによっ
て特徴付ける。上に見られるように、前立腺癌の場合、正常前立腺は高レベルの
ANX7を示し、これに対して転移性及びホルモン非感受性局所的再発はANX7のレベ
ルが非常に低い。対照的に、正常乳組織のレベルは非常に低く（図26を参照）、
これに対して癌形態はますます高いANX7レベルを示す（図19を参照）。また、図
19〜25においては、乳癌におけるANX7タンパク質発現のレベルの増加がより低い
生存の可能性と強く相関することも示される。

【０１９７】実施例XIV 他の腫瘍型におけるANX7タンパク質発現のレベル 正常組織が低レベルのANX7を示すことが見出されている様々な他の腫瘍型に加
えて、より高いレベルを示す傾向にある腫瘍型において、ANX7タンパク質発現の
レベルを決定した。データはANX7タンパク質について陽性である腫瘍細胞のパー
セントとして与えられる。これらの腫瘍型には肉腫、肺癌、及び精巣が含まれ、
それらの結果が図26に示される。正常成人肺は実質的にANX7が欠如していること
が見出され、これに対して幼児の肺は25％陽性であった。カルチノイド、小及び
大細胞肺癌では正常組織のANX7レベルとは大きく異なる。

【０１９８】 図27に示される腫瘍型について、正常組織は高レベルのANX7を示したが、腫瘍
の幾つかはレベルが低い傾向にある。図27に示される組織には、皮膚、リンパ系
組織、前立腺（前立腺に関する詳細な研究についてはこの説明の前出部分を参照
のこと）、及び神経組織が含まれる。

【０１９９】 図28において、腫瘍型が約50％の正常レベルのANX7タンパク質を示すことが見
出された。これらには唾液腺癌（腺癌は完全に陽性である）、腎臓、婦人科系、
及び甲状腺が含まれていた。

【０２００】 脳組織は一般に低レベルのANX7を示し、この組織から得られた腫瘍も同様であ
った（図30を参照）。

【０２０１】 GI腫瘍はANX7のレベルが様々である（図31を参照）。正常な外分泌腺である膵
臓は100％陽性であり、これに対して正常大腸は80％の範囲にある。大腸腺腫G1
（進行度1）、大腸腺腫G2（進行度2）、及び大腸癌の進行については、ANX7陽性
細胞において定常的な下方突出が出現することに注意されたい。

【０２０２】 内分泌腺腫瘍における変動は劇的ではない。正常内分泌腺組織はANX7タンパク
質が多い傾向にある（図32を参照）。

【０２０３】 本明細書は、本明細書内で引用される参考文献の教示に照らして最も完全に理
解され、これらの参考文献は参照により本明細書に組み込まれるものとする。本
明細書内の態様は本発明の態様の説明を提供するものであり、本発明の範囲を限
定するものと解釈されるべきではない。当業者であれば、多くの他の態様が本発
明に包含されることを容易に認める。

【図面の簡単な説明】

【図１】 図1AはターゲッティングベクターKSBX.pPNTを示す。 図1Bはマウスanx7遺伝子の制限マップを示す。

【図２】 図２はターゲッティング構築物のサザンブロット分析を示す。

【図３】 図3Aは、KSBX.pPNTでトランスフェクトさせたES細胞クローンのPCR分析を示す
。 図3Bは、XbaIで消化し、ブロットし、KXXプローブとハイブリダイズさせたゲ
ノムDNAのサザンブロット分析を示す。

【図４】 図４は、キメラの作出の模式的スケッチを示す。

【図５】 図5Aは、レシピエントのまだらでない(a/a)(黒、雌)C57Bl/6の未分化胚芽細胞
を示す。 図5Bは、まだらの(A/A)マウス(茶色)から誘導されたES細胞(ターゲッティング
構築物を含む)の注入により作出されたsynexinトランスジェニックキメラマウス
を示す。 図5Cは、C57Bl/6黒雄とC57Bl/6黒雌を交配させた場合の、このキメラマウスか
らのまだらの子供全てを示す。

【図６】 図６は、anx7(+/+)、anx7(+/-)、anx7(-/-)胚の卵黄嚢からのゲノムDNAのPCR
分析を示す。

【図７】 図7Aは、対照マウスと比較したanx7(+/-)マウスの増大した成長を示す。 図7Bは、同腹子の30匹のanx7(+/+)、anx7(+/-)の子の、年齢の関数としての代
表的な成長曲線である。

【図８】 図８は、anx7(+/-)トランスジェニックマウスと比較した対照マウスの器官の
重量の増加した割合を示す。

【図９】 図9Aは、anx7(+/-)マウスの対照の同腹子に由来する、ヘマトキシリンおよび
エオシン(HおよびE)で染色した、胸腺の転移性リンパ肉腫である。 図9Bは、anx7(+/-)マウスに由来する、ヘマトキシリンおよびエオシン(Hおよ
びE)で染色した、胸腺の転移性リンパ肉腫である。

【図１０】 図10Aは、anx7(+/-)マウスの対照の同腹子に由来する、肺へ転移した胸腺のリ
ンパ肉腫である。 図10Bは、anx7(+/-)マウスに由来する、肺へ転移した胸腺のリンパ肉腫である
。

【図１１】 図11Aは、anx7(+/-)マウスの対照の同腹子に由来する、肝臓組織中の肝細胞癌
である。 図11Bは、anx7(+/-)マウスに由来する、肝臓組織中の肝細胞癌である。

【図１２】 図12Aは、pcDNA3.1単独(ベクター)またはanx7(+anx7)もしくはp53(+p53)を発
現するベクターでトランスフェクトされた前立腺腫瘍細胞系DU145における、anx
7とp53による腫瘍細胞の増殖の抑制である。 図12Bは、pcDNA3.1単独(ベクター)またはanx7(+anx7)もしくはp53(+p53)を発
現するベクターでトランスフェクトされた前立腺腫瘍細胞系LNCaPにおける、anx
7とp53による腫瘍細胞の増殖の抑制である。 図12Cは、pcDNA3.1単独(ベクター)またはanx7(+anx7)もしくはp53(+p53)を発
現するベクターでトランスフェクトされた乳癌細胞系MCF-7における、anx7とp53
による腫瘍細胞の増殖の抑制である。 図12Dは、pcDNA3.1単独(ベクター)またはanx7(+anx7)もしくはp53(+p53)を発
現するベクターでトランスフェクトされた骨肉腫細胞系Saosにおける、anx7とp5
3による腫瘍細胞の増殖の抑制である。

【図１３】 図１３は、anx7(+/-)および対照の(+/+)の同腹子に由来する膵臓β-細胞を示
すEM図を示す。

【図１４】 図１４は、野生型ANX7とin vitro膜融合アッセイにおいて混合した場合のANX7
J変異体の主要な陰性活性を示す。

【図１５】 図１５は、異なるプロテインキナーゼサブユニットによるANX7のリン酸化を示
す。

【図１６】 図16Aは、ヒト前立腺腫瘍進行の全てのステージからの、301の検体を含む前立
腺組織マイクロアレイにおける、ANX7発現のステージ特異的様式での頻度を示す
。 図16Bは、図16Aに示されたヒト腫瘍マイクロアレイのサンプルから得た典型的
な例の、抗ANX7モノクローナル抗体免疫染色(右側)からの、H&E染色したセクシ
ョン茶色のジアミノベンジン(DAB)染色を示す。（BPH-良性前立腺肥大；PIN-初
期上皮内新生物）

【図１７】 図17Aは、Ki67抗体によるヒト前立腺癌細胞の免疫染色を示す。 図17Bは、抗体Ki67(左列)により染色された組織学的イメージの例、またはANX
7タンパク質について染色された連続的セクション(右列)を示す。（BPH-良性前
立腺肥大；PIN-初期上皮内新生物；MET-転移性前立腺癌）

【図１８】 図１８は、乳癌組織マイクロアレイからのデータを示す；通常の乳組織は実質
的にANX7を発現しない(図２６を参照)。ANX7に関して陽性であるサンプルの割合
は、診断のカテゴリーが「悪く」なるにつれて段階的に増加する。分数は、陽性
だった場合の数/この診断カテゴリにおける場合の総数である。略語：dcis(in s
ituの管癌:ductal carcinoma in situ)。

【図１９】 図１９は、病理ステージpT:1の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
および１は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中の陽
性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間０で
取得した。pT:1に関しては、ANX7レベルは影響を持たないか、または生存によっ
て影響を受けないように見受けられることに注意されたい。

【図２０】 図２０は、病理ステージpT:2の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
、１および０は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中
の陽性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間
０で取得した。このわずかに悪化した病理ステージでは、ANX7レベルが上昇する
につれて生存の可能性が低くなるように見受けられることに注意されたい。

【図２１】 図２１は、病理ステージpT:3の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
、１および０は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中
の陽性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間
０で取得した。このさらに悪化した病理ステージでは、ANX7レベルが上昇するに
つれて生存の可能性が低くなることに注意されたい。

【図２２】 図２２は、病理ステージpT:4の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
、１および０は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中
の陽性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間
０で取得した。このさらに悪化した病理ステージでは、ANX7レベルが高いと生存
の可能性が低くなることに注意されたい。ANX7の異なるレベルに関して、別々の
ANX7レベルの値はより明確に輪郭を描いていた。

【図２３】 図２３は、臨床ステージBRE:1の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
および１は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中の陽
性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間０で
取得した。この穏やかな病理ステージでは、生存率は明確にはANX7タンパク質の
レベルによっては影響されなかった。

【図２４】 図２４は、臨床ステージBRE:2の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
および１は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中の陽
性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時間０で
取得した。このさらに攻撃的なステージでは、最も高いANX7タンパク質のレベル
であるANX7=3が、生存頻度に深く影響している。

【図２５】 図２５は、病理ステージBRE:3の患者についての生存曲線である。ANX7=３、２
および１は、ANX7タンパク質の下降した相対発現レベルである。サンプル中の陽
性の細胞の割合により相対発現を評価する。分析のためにサンプルは、時刻０で
取得した。このさらに攻撃的なステージでは、最も高いANX7タンパク質のレベル
であるANX7=3、生存頻度に深く影響している。しかしながら、一般的な生存レベ
ルは一般に良くない。

【図２６】 正常組織ではANX7が低く、かついくつかの腫瘍ではより高くなる傾向にある腫
瘍型。データはANX7タンパク質に関して陽性である腫瘍細胞の％として示す。左
上パネル：乳癌：対照を含まないこれらのデータに関しては図１８を参照された
い。右上パネル；肉腫。左下パネル：肺癌；正常な成人肺は実質的にANX7を欠い
ている一方、胎児肺は25％が陽性であることに注意されたい。カルチノイド、小
細胞および大細胞肺癌は、正常組織中で見られるANX7レベルとは大きく異なる。
右下パネル：精巣；ライディヒ腫瘍は正常組織から最も明瞭に区別される。

【図２７】 正常組織ではANX7が高く、かついくつかの腫瘍では低くなる傾向にある腫瘍型
。左上：皮膚；黒色腫が最も際だっていると考えられる。右上：リンパ組織；調
べた３種類の型が、正常リンパ節組織とは異なると思われる。左下パネル：前立
腺；前立腺の研究に関しては、この明細書の前半を参照されたい。右下パネル神
経。挙動のこのパターンの態様を伴う別のタイプの腫瘍は婦人病である(図２８
を参照)。

【図２８】 ANX7タンパク質の正常レベルが約50％であり、腫瘍も同じ範囲で変化する腫瘍
型。左上パネル：唾液腺腫瘍；腺癌は完全に陽性であることに注意されたい。右
上パネル：腎臓。左下パネル：婦人病；正常子宮頸部は完全に陽性である一方。
正常胎盤は中程度である。右下パネル：甲状腺。

【図２９】 対照が必ずしも明瞭ではない他の腫瘍。

【図３０】 脳；ANX7のレベルは一般にこの組織と誘導された腫瘍では低い。

【図３１】 GI腫瘍はANX7のレベルが変化する。正常な外分泌膵臓は100％陽性である一方
、正常な結腸は80％の範囲である。結腸腺腫G1(グレード１)、結腸腺腫G2(グレ
ード２)および結腸癌の進行に関して、ANX7陽性細胞では、一様な下方向の突起
の出現があることに注意されたい。

【図３２】 比較のための正常組織を取得し得るが、腫瘍による変化が劇的ではない内分泌
腫瘍。正常内分泌組織はANX7タンパク質において高い。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） Ａ６１Ｐ 35/00 Ａ６１Ｐ 43/00 １０５ ４Ｃ０８７ 43/00 １０５ Ｃ１２Ｎ 1/15 Ｃ１２Ｎ 1/15 1/19 1/19 1/21 1/21 Ｃ１２Ｑ 1/02 5/10 1/68 Ａ 15/09 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ Ｃ１２Ｑ 1/02 5/00 Ｂ 1/68 Ａ Ａ６１Ｋ 37/02 (72)発明者 スリヴァスタヴァ，メーラ アメリカ合衆国 メリーランド州 20854， ポトマック，マップレクレスト ドライブ 13216 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 AA12 BA21 BA80 CA04 DA02 EA02 EA04 FA10 GA11 HA12 4B063 QA01 QA12 QA17 QA18 QQ02 QQ13 QQ20 QQ42 QR32 QR40 QR55 QR59 QR62 QR72 QR80 QR82 QS24 QS25 QS34 4B065 AA90X AA91Y AB01 AC14 CA24 CA44 CA46 4C084 AA02 AA13 AA17 BA44 CA27 DA27 NA14 ZB212 ZB262 4C086 AA01 AA02 EA16 NA13 NA14 ZB21 ZB26 4C087 AA01 AA02 BC83 CA12 NA13 NA14 ZB21 ZB26

Claims (26)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 染色体性に組み込まれたトランスジーンを含んでなる体細胞
   および生殖系細胞を有するトランスジェニック哺乳類であって、ここにゲノム腫
   瘍抑制アネキシン遺伝子の少なくとも1つの対立遺伝子が前記トランスジーンに
   よって破壊され、それにより前記アネキシン遺伝子の発現が阻害され、およびこ
   こに前記トランスジーンは検出可能なマーカー配列を含んでなり、およびここに
   前記トランスジェニック哺乳類は野生型マウスと比較して腫瘍形成に対する感受
   性の増加を表す前記トランスジェニック哺乳類。
2. 【請求項２】 前記哺乳類が前記破壊に対してヘテロ接合性である、請求項
   1に記載のトランスジェニック哺乳類。
3. 【請求項３】 前記アネキシン遺伝子がアネキシンVIIである、請求項1に記
   載のトランスジェニック哺乳類。
4. 【請求項４】 哺乳類がマウスである、請求項1に記載のトランスジェニッ
   ク哺乳類。
5. 【請求項５】 機能的に破壊された内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子を有す
   るトランスジェニック哺乳類を作製する方法であって、 (a) (i)内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分を有する組換え領域お
   よび (ii)細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可能なシグナルを提供
   するマーカー配列 を含有するトランスジーン構築物を構築し； (b)トランスジーンを相同的組換えのプロセスにより哺乳類の胚性幹細胞中に導
   入し； (c)トランスジーン構築物と腫瘍抑制アネキシン遺伝子の間の正しくターゲッテ
   ィングされた相同的組換えを有する胚性幹細胞を選択し； (d)ステップ(c)の細胞を胚盤胞中に導入しかつ得られたキメラ胚盤胞を雌哺乳類
   中に着床させ；および (e)正しく標的された組換えを含んでなる内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子対立
   遺伝子を担持する子孫を選択するステップを含んでなる前記方法。
6. 【請求項６】 機能的に破壊された内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子を有す
   るトランスジェニック胚性幹細胞を作製する方法であって、 (a) (i)内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分を有する組換え領域、
   および (ii)細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可能なシグナルを提供
   するマーカー配列を含有するトランスジーン構築物を構築し； (b)トランスジーンを相同的組換えのプロセスにより哺乳類の胚性幹細胞中に導
   入し；および (c)トランスジーン構築物と腫瘍抑制アネキシン遺伝子の間の正しくターゲッテ
   ィングされた相同的組換えを有する胚性幹細胞を選択するステップを含んでなる
   前記方法。
7. 【請求項７】 薬剤の潜在的発癌性を評価する方法であって、 (a)請求項1のトランスジェニック哺乳類を試験薬剤と接触させ、および (b)処理したトランスジェニック哺乳類のサンプル中の形質転換細胞数を無処理
   のトランスジェニック哺乳類または対照薬剤を用いて処理したトランスジェニッ
   ク哺乳類由来のサンプル中の形質転換細胞数と比較するステップを含んでなり、
   ここで、処理した哺乳類中の形質転換細胞数の、処理の非存在または対照薬剤の
   存在のもとでの形質転換細胞数に対する差が、試験薬剤の潜在的発癌性を示す前
   記方法。
8. 【請求項８】 物質をアネキシン腫瘍抑制疾患の治療の有効性について試験
   する方法であって、請求項1記載の哺乳類を試験薬剤に曝し、前記哺乳類の前記
   疾患の進行を確認することを含み、無処理の哺乳類と比較した前記進行の停止、
   遅延または後退は前記物質が前記アネキシン腫瘍抑制疾患の治療に有用であるこ
   とを示す前記方法。
9. 【請求項９】 内因性野生型アネキシンタンパク質を欠如する哺乳類癌細胞
   を治療する方法であって、野生型アネキシン腫瘍抑制遺伝子を哺乳類癌細胞中に
   導入することを含んでなり、それによって前記哺乳類癌細胞の異常増殖の表現型
   が発現したアネキシンタンパク質により抑制される前記方法
10. 【請求項１０】 哺乳類癌細胞が野生型アネキシン腫瘍抑制遺伝子の少なく
    とも1つの対立遺伝子を欠如する、請求項9に記載の方法。
11. 【請求項１１】 哺乳類癌細胞が骨肉腫細胞、肺癌細胞、リンパ腫細胞、白
    血病細胞、軟組織肉腫細胞、乳癌細胞、膀胱癌細胞、または前立腺癌細胞である
    、請求項9に記載の方法。
12. 【請求項１２】 機能性アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物を欠如する異常増殖
    細胞により特徴づけられる新生物を治療する方法であって、組換えにより改変さ
    れてアネキシン腫瘍抑制遺伝子産物の細胞成長阻害活性を有するタンパク質を発
    現するDNAセグメントを含有する複製欠陥ウイルスの有効用量を新生物を有する
    患者に投与することを含んでなる前記方法
13. 【請求項１３】 ウイルスがレトロウイルス、アデノウイルス、単純ヘルペ
    スウイルス、ワクシニアウイルス、乳頭腫ウイルス、およびアデノ随伴ウイルス
    からなる群から選択される、請求項12に記載の方法。
14. 【請求項１４】 機能性アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物の欠如により特徴付
    けられる新生物疾患を治療するための組成物であって、組換えにより改変されて
    アネキシン腫瘍抑制遺伝子産物の細胞成長阻害活性を有するタンパク質を発現す
    るDNAセグメントを含有する複製欠陥アデノウイルスの有効用量を製薬上送達可
    能な形態で含んでなる前記組成物。
15. 【請求項１５】 哺乳類の異常増殖細胞により特徴づけられる疾患を治療す
    る方法であって、 (a)アネキシンタンパク質をコードする発現ベクターを前記異常増殖細胞中に挿
    入することにより、哺乳類に前記ベクターを投与し、 (b)異常増殖細胞において前記細胞の増殖を抑制するのに有効な量の腫瘍抑制ア
    ネキシン遺伝子を発現させることによる、前記方法。
16. 【請求項１６】 (i)内因性腫瘍抑制アネキシン遺伝子の全てまたは一部分
    を有する組換え領域；および (ii)細胞内のトランスジーンの存在を同定するための検出可能なシグナルを与え
    るマーカー配列、を含んでなるトランスジーン構築物。
17. 【請求項１７】 構築物がKSBX.pPNTである、請求項16に記載のトランスジ
    ーン構築物。
18. 【請求項１８】 請求項16に記載のトランスジーン構築物を含有する細胞。
19. 【請求項１９】 請求項17に記載のトランスジーン構築物を含有する細胞。
20. 【請求項２０】 細胞が腫瘍細胞である、請求項18に記載の細胞。
21. 【請求項２１】 腫瘍細胞が機能しているアネキシンVII遺伝子を欠如する
    、請求項18に記載の細胞。
22. 【請求項２２】 単離されたポリヌクレオチド配列を含んでなる発現ベクタ
    ーであって、前記ポリヌクレオチドが標準のハイブリダイゼーション条件下でア
    ネキシンVII配列とハイブリダイズしかつアネキシンVIIの細胞成長阻害活性を有
    するタンパク質をコードする前記発現ベクター。
23. 【請求項２３】 発現ベクターが、レトロウイルス、アデノウイルス、単純
    ヘルペスウイルス、ワクシニアウイルス、およびアデノ随伴ウイルスからなる群
    から選択される、請求項22に記載の発現ベクター。
24. 【請求項２４】 請求項22に記載の発現ベクターにより形質転換した細胞。
25. 【請求項２５】 ヒトの腫瘍抑制アネキシンVII遺伝子のエキソン中の多形
    性または突然変異を同定する方法であって、 (a)増幅条件下で、エキソンを含有するゲノムDNAのサンプルを、 (i)プロモーター領域もしくは前記エキソン上流のイントロンとハイブリダイズ
    する第1プライマー、および (ii)3'非コード領域もしくは前記エキソン下流のイントロンとハイブリダイズす
    る第2プライマー、 を含んでなるプライマー対を用いてインキュベートし、ここでプライマー対の少
    なくとも1つのプライマーがイントロンとハイブリダイズし、前記処理が前記エ
    キソンを含有する増幅産物を産生し； (b)前記増幅産物のヌクレオチド配列を決定して前記エキソンのヌクレオチド配
    列を与え；ならびに (c)ステップ(b)にて得た前記エキソンの配列を対応する野生型エキソンの配列と
    比較し、ここで多形性もしくは突然変異を配列中の差として同定するステップを
    含んでなる前記方法。
26. 【請求項２６】 請求項22の発現ベクターおよび生理学的に許容しうる希釈
    剤を含んでなる製薬製剤。