PT1497417E

PT1497417E - Epítopos t do antigénio epha2.

Info

Publication number: PT1497417E
Application number: PT03740654T
Authority: PT
Inventors: Kostas Kosmatopoulos; Pedro Alves
Original assignee: Inst Nat Sante Rech Med; Roussy Inst Gustave
Priority date: 2002-04-23
Filing date: 2003-04-23
Publication date: 2007-06-01
Also published as: EP1497417B1; DK1497417T3; ATE356867T1; US20060034856A1; AU2003262810A1; FR2838742A1; EP1497417A2; FR2838742B1; AU2003262810A8; DE60312502T2; CA2482930A1; CA2482930C; WO2003091383A2; ES2283791T3; WO2003091383A3; DE60312502D1

Description

DESCRIÇÃO EPÍTOPOS T DO ANTIGÉNIO EPHA2 A presente invenção tem por objecto péptidos derivados da proteína EphA2 e a sua utilização em imunoterapia anti-tumoral. A vacinação ou imunoterapia peptídica é uma abordagem terapêutica, que é actualmente objecto de um grande interesse no quadro da prevenção ou do tratamento dos cancros. 0 princípio que a rege assenta na imunização através de péptidos que reproduzem epítopos T de antigénios tumorais reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicos (LTC), que desempenham um papel fundamental na eliminação das células cancerosas que expressam esses antigénios na sua superfície.

Recorde-se que os LTC não reconhecem os antigénios proteicos inteiros, mas reconhecem os seus fragmentos peptídicos, apresentados pelas moléculas do complexo principal de histocompatibilidade (CPH), expressos à superfície de diferentes células. São estes fragmentos peptídicos que constituem os epítopos T. 0 aparecimento destes péptidos resulta de um processo complexo, denominado "maturação do antigénio", que envolve 3 etapas principais: - a degradação cítosólica dos antigénios por um complexo multi-enzimático denominado proteasoma; - a translocação dos péptidos resultantes desta degradação no retículo endoplásmico (RE) pelas proteínas transportadoras TAP (proteína heterodimérica dependente de ΆΤΡ); 1 a associação destes péptidos com o CPH para formar complexos estáveis de péptido/CPH, que serão exportados para a superfície celular. A presença dos epítopos T na superfície celular depende, nomeadamente, da estabilidade da proteína anti-genica no citosol, dos sítios e da frequência dos cortes efectuados pela proteasoma, da eficácia da translocação no RE pelas proteínas transportadoras TAP e ainda da capacidade dos péptidos se fixarem às moléculas do CPH e formarem complexos estáveis de péptido/CPH.

Os epítopos presentes no complexo principal de histocompatibilidade de classe I (CPH-I) têm geralmente entre 8 e 11 aminoácidos e são reconhecidos pelas células T CD8+, que representam o componente principal da resposta citotóxica. Os epítopos presentes no complexo principal de histocompatibilidade da classe II (CPH-II) têm geralmente entre 13 e 18 aminoácidos e são reconhecidos pelas células T CD4+. A identificação destes epítopos e nomeadamente (considerando o papel essencial da resposta de CD8+ à citotoxidade) dos presentes em CPH-I, constitui assim uma etapa essencial para o desenvolvimento de composições de imunoterapia anti-tumoral.

Actualmente conhecem-se numerosos antigénios tumorais capazes de induzir uma resposta mediada pelo LTC. Identificaram-se alguns dos epítopos T destes antigénios e verificou-se, em muitos casos, a eficácia de vacinas à base de péptidos que reproduzem estes epítopos T. Contudo, a expressão da maior parte destes antigénios está restrita a 2 certos tipos histológicos de tumores, o que limita a sua utilização clínica. É por isso desejável identificar assim outros antigénios tumorais expressos por um grande número de tumores de origem variada e que sejam, além disso, capazes de induzir uma resposta imunitária citotóxica anti-tumoral. 0 receptor EphA2, anteriormente denominado por ECK (LINDBERG e HUNTER, Mole. Cell. Blol. 10, 6316-6324, 1990), é um receptor de membrana, com uma actividade de tirosina-cinase. A sequência do receptor EphA2 de seres humanos está representada na figura 1 (SEQ ID N° 1). Este receptor compreende um domínio extracelular de 534 aminoácidos, um domínio transmembranário de 24 aminoácidos e um domínio citoplásmico de 418 aminoácidos que contém o domínio de tirosina-cinase. Este receptor é sobre-expresso em vários tipos de cancro, tais como o cancro do cólon, do seio, da próstata, do pulmão, do estômago, do esófago, bem como o melanoma metástico, mas não está sobre-expresso nas lesões não cancerosas desses mesmos tecidos (ROSENBERG e outros, Am. J. Physiol., 273, 824, 1997; ZELINZKI e outros, Câncer Res. 61, 2301, 2001; NEMOTO e OUtros, Pãthobiology 65, 195, 1997; EASTY e outros, Int. J. Câncer, 60, 129, 1995; WALKER DANIEL e outros, Prostate 41, 275, 1999). Verificou-se que a sobre-expressão de EphA2 estava associada à transformação maligna e facilitava a progressão metastâsica dos tumores. Além disso, o EphA2 desempenha um papel importante na neovascularização tumoral (OGAWA e outros, Oncogene 19, 6043, 2000).

Devido à sua sobre-expressão em muitos tipos de tumores e à sua implicação na transformação maligna e na angiogénese tumoral, propôs-se utilizar o EphA2 como alvo de tratamentos anti-tumorais. Assim, o pedido de patente de invenção PCT WO 01/12172 propõe a utilização de anticorpos dirigidos contra 3 os epítopos B contidos no domínio extracelular do receptor EphA2, para a imunoterapia anti-tumoral passiva.

Contudo, ignorava-se até agora se o EphA2 podia ser maturado eficazmente para dar origem a epítopos T capazes de induzir uma resposta citotóxica anti-tumoral. A fortiori, nenhum epítopo T deste antigénio tinha sido identificado.

Os requerentes identificaram agora, no EphA2, péptidos immunogénicos representados pelo CPH-I e que induzem linfócitos T citotóxicos capazes de lisar células tumorais que expressam EphA2.

Por esta razão a presente invenção tem por objecto um péptido imunogénico que constitui um epítopo T representado pelo CPH-I, caracterizado pelo facto de ser constituído por um fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos do antigénio EphA2.

No âmbito do exposto na presente invenção, entende-se por «péptido imunogénico» um péptido capaz de induzir uma resposta de LTC específica contra o antigénio EphA2.

Podem obter-se os péptidos de acordo com a presente invenção, por diversos modos, a partir do antigénio EphA2. Sabe-se, por exemplo, que péptidos capazes de formar um complexo com uma dada molécula do CPH-I têm em comum a presença, em determinadas posições, de resíduos de aminoácidos particulares, denominados «resíduos de ancoragem». Definiu-se assim para as diferentes moléculas de CPH-I, sítios de ancoragem específicos que envolvem aminoácidos denominados «resíduos de ancoragem primários». Também se mostrou que resíduos situados fora dos elementos de ancoragem primários (resíduos de ancoragem secundários) 4 podiam exercer um efeito favorável ou desfavorável na afinidade do péptido para o CPH. A escolha das sequências peptídicas susceptíveis de formar epítopos, apresentados por uma dada molécula do CPH-I, pode-se efectuar, de forma clássica, por análise da sequência peptídica do antigénio EphA2, com o fim de seleccionar os péptidos que possuem a totalidade ou parte do elemento de ancoragem primário correspondente a esta molécula. Estão disponíveis diferentes bases de dados enumerando os elementos de ancoragem conhecidos: cita-se, a título de exemplo, a base SYFPEITHI (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/); RAMMENSEE e outros, Iimunogenetics, 50, 213-219, 1999) ou a base BIMAS (http://bimas.dcrt.nih.gov/molbio/hlabind); PARKER e ou-tros, J. Iimunol. 152, 163, 1994)

Geralmente, a seguir determina-se a afinidade de ligação dos péptidos assim identificados para a respectiva molécula do CPH-I bem como a estabilidade do complexo péptido/molécula do CPH-I formado. Na verdade, os péptidos não imunogénicos apresentam, a maior parte das vezes, uma fraca afinidade para as moléculas do CPH-I e/ou formam com elas um complexo pouco estável. Os processos para determinar a afinidade do péptido à molécula do CPH-I e a estabilidade do complexo formado são já conhecidos por si mesmos. Referir-se-á, por exemplo, o descrito por Firat e outros (Eur. J. Immuno., 29, 3112, 1999). A afinidade de um péptido para uma molécula do CPH-I ê, a maior parte das vezes, definida pela relação com a de um péptido de referência (por exemplo, IVGAETFYV (SEQ ID Nu 2) para HLA-A*02Q1 (HLA - Sistema Humano de Antigénios Leucocíticos, variante humana do CPH) ou RPHERNGFTV (SEQ ID N° 3) para HLA-B*0702), sob a forma de afinidade relativa. A afinidade relativa é definida como a relação entre a 5 concentração do péptido ensaiado e a concentração do péptido de referência que permite a formação, nas mesmas condições, da mesma quantidade do complexo péptido/molécula de CPH-I. Quanto mais significativa for a afinidade relativa, mais fraca será a afinidade de ligação do péptido à molécula do CPH-I. A estabilidade do complexo péptido/molécula de CPH-I é muitas vezes definida pela DC50, que representa o tempo necessário para a dissociação de 50 % dos complexos formados.

Por exemplo, no caso dos péptidos potencialmente imunogénicos e representados pelo HLA-A*0201, a afinidade relativa é em geral inferior a 5 e a DC50 superior a 2 horas. A imunogenicidade dos péptidos potencialmente imunogénicos, assim detectadas, pode ser verificada, por exemplo, por processos clássicos de determinação da capacidade deste péptido gerar, in vivo, ex vivo ou in vitro uma resposta dos LTC específica para células alvo carregadas com este péptido ou expressando o antigénio EphA2 de que é resultante.

Os péptidos com uma fraca afinidade para a molécula do CPH-I envolvida e/ou que formam com esta última um complexo pouco estável, têm geralmente fraca imunogenicidade. Mesmo assim, estes péptidos podem apresentar um interesse terapêutico, na medida em que aparentemente os epítopos com fraca afinidade só participam pouco, ou não participam, no estabelecimento de fenómenos de tolerância, que constituem um dos principais obstáculos da vacinação anti-tumoral.

Neste caso, é possível preparar péptidos de variantes, em que a imunogenicidade é mais significativa, substituindo 6 ura ou vários aminoácidos do péptido natural por um ou vários aminoácidos favoráveis à afinidade para a molécula do CPH-I envolvido e/ou à estabilidade do complexo péptido/ molécula do CPH-I.

Estes pêptidos de variantes são também objecto da presente invenção.

Os aminoácidos favoráveis à afinidade para uma molécula do CPH-I envolvida e/ou à estabilidade do complexo péptido/ molécula do CPH-I podem, por exemplo, ser constituídos por resíduos de ancoragem e, nomeadamente, pelos resíduos de ancoragem secundários, reconhecidos pela molécula do CPH-I envolvida. Estes resíduos de ancoragem podem facilmente ser identificados pela consulta das bases de dados disponíveis, como as referidas anteriormente. A título de exemplo da substituição que permite aumentar a imunogenicidade de um péptido apresentado por uma molécula do CPH-I e nomeadamente por HLA-A*0201, referiremos a substituição do terminal-N do aminoácido do referido péptido por uma tirosina, conforme descrito no pedido de patente de invenção PCT WO 02/08716. A afinidade de um péptido variante para a molécula do CPH-I envolvida, bem como a sua imunogenicidade podem ser verificadas em seguida, como indicado anteriormente para os pêptidos naturais.

Como exemplo não limitativo da realização da presente invenção, os requerentes identificaram cinco pêptidos, denominados a seguir por p58, p61, p546, p550 e p883, presentes em HLA-A*0201. 7

As sequências (código de 1 letra) destes péptidos são as seguintes: P58: IMNDMPIYM (SEQ ID N° 4); P61: DMPIYMYSV (SEQ ID N° 5); P546: VLLLVLAGV (SEQ ID N° 6); P550: VLAGVGFFI (SEQ ID N° 7); P883: TLADFDPRV (SEQ ID N° 8);

Os requerentes obtiveram também, a partir do péptido p61, que apresenta apenas uma fraca afinidade para a HLA-A*0201 e também uma fraca imunogenicidade, um péptido denominado a seguir por p61Y de sequência YMPIYMYSV (SEQ ID N° 9) e que resultou da substituição do resíduo do terminal N de p61 por um resíduo de tirosina.

Estes péptidos são capazes de induzir uma resposta LTC específica às células HLA-AA*0201 que expressam o EphA2. Eles induzem particularmente uma resposta citotóxica perante as células HLA-A*0201 resultantes de diferentes tipos de tumores. A presente invenção tem também por objecto composições que compreendem pelo menos um péptido imunogénico de acordo com a presente invenção ou uma molécula do ácido nucleico que codifica o referido péptido.

Pode tratar-se de composições multi-epitópicas, capazes de gerar uma resposta LTC poli-específica e, com esse objectivo, compreendem também um ou vários outro(s) epítopos 8 imunogénicos. Estes outros epítopos podem ser provenientes do EphA2 ou de um ou de vários outros antigénios.

Estas composições multi-epitópicas, de acordo com a presente invenção, podem compreender, para poderem ser amplamente utilizadas numa população cujos indivíduos possuam alelos HLA diferentes, epítopos apresentados por diferentes moléculas do CPH-I. Além disso, podem também compreender pelo menos um epítopo apresentado por uma molécula do CPH-I e capaz de induzir uma resposta T auxiliar.

Segundo um modo de realização preferido da presente invenção, a composição compreende pelo menos um polipéptido quimérico que contem uma ou mais cópias de um péptido imunogénico de acordo com a presente invenção. No caso de uma composição multi-epitópica, o referido polipéptido quimérico compreende ainda uma ou mais cópias de pelo menos um outro epítopo imunogénico.

Pode-se obter facilmente o referido polipéptido quimérico por processos já conhecidos dos especialistas desta técnica e em particular pelas técnicas clássicas do ADN recombinante. A presente invenção tem também por objecto as moléculas do ácido nucleico que codifica um péptido imunogénico ou um polipéptido quimérico de acordo com a presente invenção. A presente invenção tem também por objecto a utilização de um epítopo peptídico imunogénico, de uma composição ou de uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção para a obtenção de um fármaco e principalmente de um fármaco destinado à imunoterapia antitumoral e em particular ao tratamento de tumores que expressam o EphA2, 9

Este tratamento engloba uma grande variedade de tumores, entre os quais referiremos os tumores do cólon, do seio, da próstata, do pulmão, do estômago, do rim e do esófago.

Utilizam-se, principalmente, os péptidos p58, p61, p546, p883 e p61Y na obtenção dos fármacos destinados ao tratamento de pacientes com HLA-A*0201. A presente invenção abrange também os medicamentos que compreendem, como princípio activo, pelo menos um péptido imunogénico, uma composição ou uma molécula de ácido nucleico de acordo com a presente invenção.

Segundo um modo de realização preferido da presente invenção os referidos medicamentos são vacinas.

Os medicamentos de acordo com a presente invenção, podem compreender, além disso, os excipientes habituais, assim como os adjuvantes normalmente utilizados em imunoterapia e que permitem, por exemplo, facilitar a administração do princípio activo, do estabilizar, aumentar a sua imunogenicidade, etc.

Compreender-se-á melhor a presente invenção com a ajuda da descrição do complemento que se segue, através de exemplos não limitativos que ilustram a indução de uma resposta citotóxica antitumoral dada pelos péptidos provenientes do EphA2, de acordo com a presente invenção. EXEMPLO 1: IDENTIFICAÇÃO DE EPÍTOPOS DE EPHA2 PRESENTE NA MOLÉCULA HLA-A*-02Q1

Analisou-se a sequência de aminoãcidos da proteína EphA2 com a ajuda do software BIMAS (Parker e outros, J. Immunol. 10 152, 163, 1994), para identificar pêptidos potencialmente capazes de se ligarem a HLA-A*0201. Entre os epítopos potenciais identificados, escolheram-se os cinco pêptidos seguintes: P58: IMNDMPIYM (SEQ ID N° 4) P61: DMPIYMYSV (SEQ ID N° 5) P546: VLLLVLAGV (SEQ ID N” 6) P550: VLAGVGFFI (SEQ ID N° 7) P883: TLADFDPRV (SEQ ID N° 8)

Os pêptidos que correspondem a estas sequências foram sintetizados pela SYNT:EM (Nimes, França). Controlou-se a pureza (> 85 %) por cromatografia líquida de elevado rendimento em fase inversa. Liofilizaram-se os pêptidos, a seguir dissolveram-se em DMSO (dimetil-sulfóxido) a 10 mg/mL e armazenaram-se à temperatura de -80 °C.

Avaliou-se a imunogenicidade destes pêptidos pela medição da sua afinidade para HLA-A*0201. Esta é definida por dois parâmetros: a afinidade relativa (AR) que reflecte a capacidade de fixação dos pêptidos na HLA-A*Q201 e pela velocidade de dissociação dos complexos de HLA-A*0201/péptido (DC50) que verifica a sua estabilidade. Os pêptidos com afinidade elevada (AR < 5 e DC50 > 2 h) são potencialmente imunogénicos, ao contrário dos pêptidos com fraca afinidade (AR > 5 e DC50 < 2 h) .

Afinidade relativa

Incubaram-se células T de seres humanos (FIRAT e outros, Eur. J. Irnmuno. , 29, 3112, 1999) (3 x 105 células/mL) , que são deficitárias em proteínas transportadoras TAP, a uma temperatura de 37 °c, durante um período de tempo de 16 11 horas, com diversas concentrações (100 μΜ, 10 μΜ, 1 μΜ, 0,1 μΜ) de cada péptido a ensaiar, num meio RPMI 1640 (meio desenvolvido por Moore et al. no Roswell Park, Memorial Institute, composto por sais orgânicos, aminoácidos, vitaminas, etc) sem soro, complementado com 100 ng/mL de p2~microglobulina humana. A seguir lavaram-se duas vezes e marcaram-se com o anticorpo monoclonal BB7.2 (PARHAM e outros, Hum. Immunol., 3, 4, 277-299, 1981) que é específico da molécula HLA-A*02Q1, depois com um anticorpo de cabra anti-IgG de rato, cortado com o isotiocianato de fluoresceína (ITCF).

Analisaram-se a seguir as células por citometria de fluxo. Para cada concentração de péptido, calculou-se a fluorescência específica do HLA-A*0201 em percentagem da fluorescência obtida com 100 μΜ de um péptido de referência (HIVpol589, IVGAETEYV, SEQ ID N° 2). A afinidade relativa (AR) é definida como a relação entre a concentração de cada péptido que induz 20 % da fluorescência obtida com 100 μΜ do péptido de referência e a concentração do péptido de referência que induz 20 % da fluorescência obtida com 100 μΜ do referido péptido de referência. Quanto mais fraca é a afinidade relativa mais forte é a ligação do péptido a HLA-A*0201. Determinou-se a AR média para cada péptido através de pelo menos três experiências independentes. Em todas as experiências obteve-se 20 % da fluorescência máxima para 1 a 3 μΜ do péptido de referência.

Estabilidade:

Incubaram-se células T2 (106/mL), durante uma noite, à temperatura de 37 °C, com 100 μΜ de cada péptido a ensaiar no meio RPMI sem soro, complementado com 100 ng/mL de p2-microglobulina humana. A seguir, lavaram-se as células quatro vezes para eliminar os péptidos livres, depois 12 incubaram-se com BREFELDIN A (metabõlito de um fungo) (SIGMA; 10 μΜ/mL), durante uma hora, para evitar a expressão à sua superfície das moléculas HLA-A*0201 recém sintetizadas, lavaram-se e incubaram-se, à temperatura de 37 °C, durante períodos de tempo de 0, 2, 4, 6 ou 8 horas na presença de BREFELDIN A (0,5 pg/mL). Para cada um dos intervalos de tempo de incubação, marcaram-se a seguir as células, como indicado anteriormente, com os anticorpos BB7.2 e analisaram-se por citometria de fluxo para calcular a quantidade de complexo péptido/ HLA-A*0201 presente na sua superfície. Esta quantidade é avaliada pela fórmula: (fluorescência média das células T2 pré-incubadas com o péptido - fluorescência média das células tratadas em condições similares sem a presença do péptido). Definiu-se a DC50 (dissociação do complexo: DC) como o tempo (em horas) necessário para a perda de 50 % dos complexos péptido/ HLA-A*0201, estabilizados no instante t = 0

Os resultados destes ensaios estão apresentados no Quadro I a seguir:

Quadro I Péptido Sequência AR DC50 P58 IMNDMPIYM 1 4 P61 DMPIYMYSV > 10 ND P61Y DMPIYMYSV 1,5 ND P546 VLLLVLAGV 1,4 4-6 P550 VLAGVGFFI 1 4-6 P883 TLADFDPRV 2,2 2-4 ND - Não determinado

Estes resultados demonstram que os pêptidos p58, p61, p546 e p883 possuem uma afinidade de ligação significativa 13 (AR de 1 a 2,2). Pelo contrário, o péptido p61 apresenta uma fraca afinidade para HLA-A*0201 (AR > 10) e portanto não deveria ser imunogénico. Para melhorarem a afinidade deste péptido para HLA-A*0201, os requerentes substituíram o ácido aspártico na posição 1 por um resíduo de tirosina. 0 péptido da variante p61Y obtido apresenta uma afinidade de ligação significativa (AR = 1,5), bem superior à do péptido de onde derivou.

Os resultados mostram também que os péptidos p58, p546, p550 e p883 formam complexos estáveis com as moléculas de HLA-A*0201 (DC50 > 2 horas para cada um deles) . EXEMPLO 2: IMUNOGENICIDADE DOS PÉPTIDOS P58, P546, P550 E P883

Indução dos LTC específicos para vacinação com os péptidos

Avaliou-se a imunogenicidade dos péptidos p58, p61Y, p546, p550 e p883 pela criação de LTC em ratos modificados geneticamente HHD (PASCOLO e outros, J. Exp. Med., 185, 2043, 1997). Estes ratos são 2pm-/-,Db-/- e expressam uma cadeia única de HLA-A*02Q1, composta pelos domínios al e a2 de HLA-A*0201 e por domínios a3 e intracelular de Db , ligados pela sua extremidade N-terminal à extremidade C-terminal da p2-microglobulina de seres humanos por um péptido de 15 aminoácidos.

Injectaram-se os ratos HHD por via subcutânea, na base da cauda, com uma emulsão composta por 100 pg da cada um dos péptidos a ensaiar no seio de adjuvante incompleto de Freund, na presença de 14 0 pg de um epítopo T auxiliar, derivado do antigénio do «núcleo» de VHB (Vírus da hepatite B) ¢128-140, sequência TPPAYRPPNAPIL, SEQ ID NQ 10). 14

Após um período de tempo de 11 dias, estimularam-se in vitro células esplénicas colhidas dos ratos (5 x 107 células em 10 mL) com o péptido a ensaiar (10 μΜ) . Ensaiaram-se, ao 6o dia de cultura as populações que deram resposta, para determinar uma citotoxicidade específica. Estimularam-se nocamente in vitro as células que responderam com 2 x 107 células esplénicas HHD irradiadas (3.000 rad), com intervalos de uma semana e com 1 a 0,1 μΜ de péptido na presença de 50 UI/mL de IL2 (interleucina-2) recombinante (PROLEUKIN, CHIRON CORP).

Efectuaram-se ensaios de citotoxicidade 6 dias após a última estimulação.

Utilizaram-se células RMAS-HHD (RMAS- linhas de células de linfoma induzidas por vírus de leucemia deficiente em TAP, da Rausher) como alvos para estudar a citotoxicidade. Obtiveram-se estas células por transfecção das células RMAS de murino com a estrutura de HHD como descrito por PASCOLO e outros (J. Exp. Med., 185. 2043, 1997).

Marcaram-se estas células alvo com 100 μΟί de 51Cr, durante 90 minutos, depois lavaram-se 3 vezes e repartiram-se pelas placas de 96 tubos de fundo redondo (3 x 103 células/tubo em 100 pL de RPMI 1640 + 3 % de soro fetal bovino). Carregam-se as placas com 1 μΜ do péptido a ensaiar ou de um péptido de controlo não relevante, a 37 °C, durante 90 minutos. A seguir, adicionaram-se 100 pL das células efectoras (relação células efectoras/células alvo = 40/1) nos tubos e incubaram-se as placas, à temperatura de 37 °C, durante 4 15 horas. Após a incubação, recolheu-se 100 pL do sobrenadante e mediu-se a radioactividade num contador de raios gama. A percentagem de lise específica é calculada pela fórmula: [(libertação de 51Cr experimental - libertação de 51Cr espontâneo)/(libertação de 51Cr máxima - libertação de 51Cr espontâneo)]x 100. Em todas as experiências, a libertação espontânea é inferior a 20 % da libertação máxima induzida por HC1 3N.

Os resultados destas experiências para os péptidos p 58 e p550 estão ilustrados na figura 2. o : péptido não relevante * : péptido EphA2

Estes resultados mostram que a imunização conseguida com o péptido p58 ou com o p55Q gera LTC que matam os alvos RMAS-HHD carregados com o mesmo péptido, mas não matam as células carregadas com o péptido não pertinente. Obtiveram-se resultados equivalentes com os péptidos p61Y, p546 e p883.

Estabeleceram-se linhas de LTC, denominadas respectivamente mLTC58, mLTC61Y, mLTC546, mLTC55Q e mLTC883, a partir das células esplénicas de ratos HDD imunizadas com o péptido p58, p61Y, p546, p550 ou p883 por estimulação, repetidas in vitro com concentrações decrescentes (10 μΜ - 1 μΜ) do mesmo péptido. A avidez destas linhas pelo respectivo péptido indutor foi determinada pela medição, como descrito anteriormente, da sua citotoxicidade face às células alvo RMAS-HHD carregadas com concentrações crescentes (1 pM a 10 μΜ) do péptido envolvido. 16

Os resultados estão ilustrados na figura 3.

Estes resultados mostram que as linhas mLTC58, mLTC61Y, mLTC546, mLTC550 e mLTC883 possuem uma avidez relativamente elevada. Obtêm-se 50 % da lise máxima para concentrações do péptido que variam entre 3 nM no caso da mLTC546 e 40 nM no caso da mLTC61Y. EXEMPLO 3: RECONHECIMENTO DOS EPÍTOPOS PROCESSADOS NATURALMENTE A PARTIR DO ANTIGÉNIO EPHA2 PELOS LTC INDUZIDOS PELOS PÉPTIDOS P58 OU P550.

Para verificar se os péptidos p58 e p550 constituem epítopos originados naturalmente a partir do antigénio EphA2, avaliou-se a resposta das células das linhas mLTC58 e mLTC550 face às células que expressam este antigénio, de dois modos diferentes. 1) Estimulação por células COS-7 transfectadas que expressam o EphA2

Estimularam-se as células das linhas mLTC58 e mLTC550 com células COS-7 (células de fibroblasto do rim) de macaco co-transfectadas com a estrutura HHD (Pascolo e outros, referido anteriormente) e um plasmido contendo o ADNc do EpHA2. Como controlos negativos utilizaram-se células COS-7 transfectadas seja apenas com a estrutura HHD, seja só com o plasmido contendo o ADNc do EphA2.

Avaliou-se a estimulação das moléculas LTC pela medição da secreção de FNT - α (factor de necrose tumoral) . Como controlo positivo, utilizaram-se as células COS-7 transfectadas com a estrutura HHD e carregadas com o péptido p58 ou p55Q. 17 4 dias após a transfectação, as células COS-7 foram postas em contacto com as células mLTC58 e mLTC550 à razão de 5 x 104 LTC por 3 x 104 células de COS em meio RPMI 1640, na presença de 10 % de SVF (solução vermelha de fenol).

Recolheu-se o sobrenadante (50 pL), 6 horas após a incubação e pôs-se em contactos com células de fibrossarcoma de rato WEHI164, clone 13, (3 x 104 por tubo) que se caracterizam por uma grande sensibilidade à apoptose induzida pelo FNT-α. Para quantificar o teor de FNT nos sobrenadantes, utilizou-se em paralelo uma escala de valores de FHT-a (concentrações de 0 a 104 pg/mL). Após 16 horas de incubação, à temperatura de 37 °C, determinou-se a viabilidade das células de WEHI-164, clone 13, por meio de um ensaio calorimétrico com MTT (brometo de 3-(4,5-di-metilazol-2-il)-2,5-difeniltetrazólio) (SIGMA) (ESPEVIK e NISSEN MEYER, J. Immunol. Methods., 95, 99, 1986).

Os resultados estão ilustrados na figura 4. -: células COS-7 não transfectadas;

EphA2: células COS-7 transfectadas apenas com o ANNc do EphA2; HHD: células COS-7 transfectadas apenas com a estrutura HHD; HHD + péptido: células COS-7 transfectadas com a estrutura HHD e carregadas com o péptido p58 ou p550; HHD + EphA2: células COS-7 transfectadas com a estrutura HHD e com o ADNc do EphA2;

Estes resultados mostram que as linhas mLTC58 e mLTC550 respondem à estimulação pelas células COS que co-expressam HHD e EphA2. 18

Ao contrário, não se observa nenhuma reposta às células COS transfectadas separadamente pela estrutura HHD ou pelo ADNc do EphA2. 2) Estimulação por células tumorais de seres humanos HLA-A*0201 que expressam EphA2

Utilizaram-se as seguintes linhas tumorais de HLA-A*0201: SAOS (sarcoma), 1355 (cancro do pulmão), Caco-2 (cancro do cólon), HIEG (carcinoma renal) e LNCaP (cancro da próstata). Utilizou-se também a linha DU145 (cancro da próstata) que não expressa a HLA-A*02Q1 como controlo negativo.

Entre estas linhas, a Dul45 e a Caco-2 são conhecidas por expressarem EphA2 e a LNCaP por não expressar o EphA2.

Avaliou-se a expressão do EphA2 nas outras linhas tumorais por transferência de mancha de Western. 0 nível de expressão do EphA2 no conjunto das linhas utilizadas está resumido no quadro II a seguir.

Quadro II

Linhas celulares Expressão de HLA-A*0201 Expressão de EphA2 SAOS + + 1355 + + Caco-2 + + HIEG + LNCaP + + Dul45 - - + : grande expressão - : não há expressão 19

As linhas de células mLTC58 e mLTC55Q foram estimuladas pelas linhas tumorais SAOS, 1355, Caco-2, HIEG, LNCaP e DU145 mencionadas anteriormente. As linhas mLTC61Y, mLTC545 e mLTC883 foram estimuladas pelas linhas tumorais LNCaP, DU145 e Caco-2 anteriormente mencionadas. Avaliou-se a estimulação pela detecção da secreção de TNF-α, como descrito anteriormente.

Os resultados estão ilustrados nas figuras 5A, 5B e 5C. A figura 5A mostra que as células mLTC58 e mLTC550 respondem à estimulação pelas células Caco-2 que expressam HLA-A*Q201 e EphA2, mas não respondem, nem âs células Dul45 que não expressam HLA-A*02Q1, nem às células LNCaP que não expressam EphA2. A figura 5B mostra que as células mLTC58 e mLTC550 respondem à estimulação pelas células HIEG, Caco-2, 1355 e SAOS que expressam quantidades significativas de EphA2, mas não respondem às células LNCaP que não expressam EphA2. A figura 5C mostra que as células mLTC61Y, mLTC546 e mLTC883 respondem à estimulação pelas células Caco-2 que expressam quantidades significativas de EphA2, mas não respondem às células LNCaP e DU145 que não expressam EphA2 e HLA-A*0201 respectivamente.

Os resultados das experiências anteriores mostram que os LTC induzidos por p58, p61Y, p546, p550 ou p883 reconhecem os epítopos processados naturalmente do antigénio EphA2. 20 EXEMPLO 4: INDUÇÃO DE LTC DE SERES HUMANOS ESPECÍFICOS DOS PÉPTIDOS P58 E P550

Verifícou-se, como descreveremos a seguir, a capacidade dos p58 e p550 para induzir LTC in vitro a partir de células mononueleares do sangue periférico (CMSP).

Obtiveram-se as CMSP, a partir de colheitas sanguíneas realizadas por aférese dos leucócitos em dadores sãos, depois de centrifugação a 2000 rpm, durante 20 minutos, em gradiente de densidade Fícoll/Hypaque (AMERSHAM). Depois de 3 lavagens com NaCl a 0,9 %, voltaram-se a suspender 107 CMSP em cada um dos tubos de uma placa de cultura de 6 tubos, no seio de 3 mL de um meio completo (RPMI 1640 complementado com 10 % de soro humano AB inactivado pelo calor) e incubaram-se, à temperatura de 37 °C, durante 2 horas. Após a incubação, colheram-se as células não aderentes e as células aderentes foram diferenciadas em células dendríticas por adição, a cada um dos tubos, de 3 mL de meio completo contendo GM-CSF (factor estimulador de colónias granulocíticas e monocíticas) a 50 ng/mL (R & D Systems) e 1000 Ul/mL de IL-4 (R & D Systems). Colheram-se as células dendríticas depois de 7 dias em cultura e carregaram-se com o péptido p58 ou p550 por incubação, durante 4 horas, à temperatura de 20 °C, com 40 pg/mL de péptido na presença de 3 pg/mL de p2-microglobulina e depois irradiaram-se a 4.200 rads: a seguir lavaram-se para eliminar o péptido livre. Isolaram-se células CD+8 a partir das células não aderentes com a ajuda de micro-esferas acopladas a um anti-corpo CD8 (MILTENYI BIOTEC).

Estimularam-se 0,5 x 106 células de CD8+ por co-cultura, numa placa de 48 microtubos, com 2,5 x 1Q4 células dendríticas carregadas com o péptido p58 ou com o p550, em meio completo complementado com 10 ng/mL de IL-7 num volume 21 final de 500 pL/microtubo. No dia a seguir à colocação em cultura, adiciona-se a cada um dos microtubos 10 ng/mL de IL-10 humana (R & D Systems); no segundo dia, adiciona-se a cada um dos microtubos 30 UI/mL de IL-2 humana. No sétimo e no décimo quarto dia após a primeira estimulação, voltou-se a estimular as células CD8+ com as células aderentes carregadas com 10 pg/L do péptido na presença de 3 pg/mL de P2-microglobulina e depois irradiaram-se. Adicionou-se IL-10 (10 ng/mL) e IL-2 (30 UI/mL) 24 e 48 horas após a re-estimulação, respectivamente. Sete dias após a segunda re-estimulação, avaliou-se a resposta destas células às células T2 carregadas com p58 ou com p550 ou com um péptido não pertinente ou com células tumorais HLA-A*0201 Caco-2 (que expressam EphA2 e HLA-A*0201), LNCaP (que expressam HLA-A*0201 e não expressam EphA2) e DU145 (que expressam EphA2 e não expressam HLA-A*02Q1) por dosagem da produção da iFNy intracelular.

Incubaram-se as células hLTC58 ou hLTC550 com as células T2 carregadas ou com as células da linha tumoral ensaiada, na presença de 20 pg/mL de BREFERDINE-A (SIGMA). Após 6 horas, lavaram-se, marcaram-se com um anticorpo anti-CD8 conjugado com r-ficoeritrina (CATAG LABORATORIES) no seio de (solução salina tamponada com sulfato), durante 25 minutos, à temperatura de 4 °c, lavaram-se e fixaram-se com paraformaldeído a 4 %. Permeabilizaram-se a seguir as células com saponina (SIGMA) a 0,2 % em STF e marcaram-se com um anticorpo monoclonal anti-IFNy conjugado com a aloficocianina (PHARMINGEN).

Analisaram-se depois as células por citometria de fluxo (FACSCalibur™ (BECTON DICKINSON) e por meio do software CellQuest™). 22

Os resultados (expressos era número de células CD8+ produtoras de IFNy para 1Q5 células CD8+) estão apresentados nas figuras 6A e 6B. A figura 6A mostra que os LTCs humanos obtidos a partir das células CD8+ estimuladas respectivamente pelo péptido p58 (hTLC58) ou pelo péptido p550 (hTLC550) foram activados pelas células T2 carregadas com o péptido correspondente e que não se observa nenhuma activação pelas células T2 carregadas com o péptido não pertinente. A figura 6B mostra uma resposta dos LTCs, LTCh58 e LTCh55Q face à linha tumoral Caco-2 (EphA2+ e HLA-A*0201+) , mas não face ãs linhas LNCaP (EphA2' e HLA-A*0201+) e Dul45(EphA2+ e HLA-A*0201") .

Estes resultados demonstram que os péptidos p58 ou p550 induzem os LTCs humanos capazes de reconhecerem as células tumorais HLA-A*0201+ que exprimem EphA2. LISTAGEM DAS SEQUÊNCIAS <110> INSERM (Institut National de la Santé et de la Recherche Medicale IGR (Institut Gustave Roussy) KOSMATOPOULOS, Kostas ALANES, Pedro <120> EPITOPOS T DO ANTIGÉNIO EPHA2 <130> MJPah598/69EX <160> 10 <170> Patente versão 3.1 <210> 1 <211> 976 23

<212> PRT <213> Homo sapiens <4Q0> 1

Met Glu Leu Gin Ala Ala Arg Ala Cis Fen Ala Leu Leu Trp Gli Cis 1 5 10 15 Ala Leu Ala Ala Ala Ala Ala Ala Gin Gli Lis Glu Vai Vai Leu Leu 20 25 30 Asp Fen Ala Ala Ala Gli Gli Glu Leu Gli Trp Leu Tri His Pro Tir 35 40 45 Glí Lis Gli Trp Asp Leu Met Gin Asn Ile Met Asn Asp Met Pro Ile 50 55 60 Tír Met Tir Ser Vai Cis Asp Vai Met Ser Gli Asp Gin Asp Asn Trp 65 70 75 80 Leu Arg Tri Asn Trp Vai Tir Arg Gli Glu Ala Glu Arg Ile Fen Ile 85 90 95 Glu Leu Lis Fen Tri Vai Arg Asp Cis Asn Ser Fen Pro Gli Gli Ala 100 105 110 Ser Ser Cis Lis Glu Tri Fen Asp Leu Tir Tir Ala Glu Ser Asp Leu 115 120 125 Asp Tir Gli Tri Asn Fen Gin Lis Arg Leu Fen Tri Lis Ile Asp Tri 130 135 140 Ile Ala Pro Asp Glu Ile Tri Vai Ser Ser Asp Fen Glu Ala Arg His 145 150 155 160 Vai Lis Leu Asp Vai Glu Glu Arg Ser Vai Gli Pro Leu Tri Arg Lis 165 170 175 Glí Fen Tir Leu Ala Fen Gin Asp Ile Gli Ala Cis Vai Ala Leu Leu 180 185 190 Ser Vai Arg Vai Tir Tir Lis Lis Cis Pro Glu Leu Leu Gin Gli Leu 195 200 205 Ala His Fen Pro Glu Tri Ile Ala Gli Ser Asp Ala Pro Ser Leu Ala 210 215 220 Tri Vai Ala Gli Tri Cis Vai Asp His Ala Vai Vai Pro Pro Gl i Gli 225 230 235 240 Glu Glu Pro Arg Met Lis Cis Ala Vai Asp Gli Glu Trp Leu Vai Pro 245 250 255 Ile Gli Gin Cis Leu Cis Gin Ala Gli Tir Glu Lis Vai Glu Asp Ala 260 265 270 Cis Gin Ala Cis Ser Pro Gli Fen Fen Lis Fen Glu Ala Ser Glu Ser 275 280 285 24

Pro Cis Leu Glu Cis Pro Glu His Tri Leu Pro Ser Pro Glu Gli Ala 290 295 300 Tri Ser Cis Glu Cis Glu Glu Gli Fen Fen Arg Ala Pro Gin Asp Pro 305 310 315 320 Ala Ser Met Pro Cis Tri Arg Pro Pro Ser Ala Pro His Tir Leu Tri 325 330 335 Ala Vai Gli Met Gli Ala Lis val Glu Leu Arg Trp Tri Pro Pro Gin 340 345 350 Asp Ser Gli Gli Arg Glu Asp He Val Tir Ser Val Tri Cis Glu Gin 355 360 365 Cis Trp Pro Glu Ser Gli Glu Cis Gli Pro Cis Glu Ala Ser Val Arg 370 375 380 Tir Ser Glu Pro Pro His 0^ 11 Leu Tri Arg Tri Ser Val Tri Val Ser 385 390 395 400 Asp Leu Glu Pro His Met Asn Tir Tri Fen Tri Val Glu Ala Arg Asn 405 410 415 Gli Vai Ser Gli Leu Vai Tri Ser Arg Ser Fen Arg Tri Ala Ser Val 420 425 430 Ser Ile Asn Gin Tri Glu Pro Pro Lis Val Arg Leu Glu Gli Arg Ser 435 440 445 Tri Tri Ser Leu Ser Vai Ser Trp Ser Ile Pro Pro Pro Gin Gin Ser 450 455 460 Arg Vai Trp Lis Tri Glu Vai Tri Tir Arg Lis Lis Gli Asp Ser Asn 465 470 475 480 Ser Tir Asn Vai Arg Arg Tri Glu Gli Fen Ser Val Tri Leu Asp Asp 485 490 495 Leu Ala Pro Asp Tri Tri Tir Leu Val Gin Val Gin Ala Leu Tri Gin 500 505 510 Glu Gli Gin Gli Ala Gli Ser Lis Val His Glu Fen Gin Tri Leu Ser 515 520 525 Pro Glu Gli Ser Gli Asn Leu Ala Val Ile Gli Gli Val Ala Val Gli 530 535 540 Vai Vai Leu Leu Leu Vai Leu Ala G1 i Val Gli Fen Fen Ile His Arg 545 550 555 560 Arg Arg Lis Asn Gin Arg Ala Arg Gin Ser Pro Glu Asp Val Tir Fen 565 570 575 Ser Lis Ser Glu Gin Leu Lis Pro Leu Lis Tri Tir Val Asp Pro Lis 580 58 5 590 Tri Tir Glu Asp Pro Asn Gin Ala Val Leu Lis Fen Tri Tri Glu Ile 595 600 605 His Pro Ser Cis Vai Tri Arg Gin Lis Val Ile Gli Ala Gli Glu Fen 25 610 615

Gli Glu Vai Tir Lis Gli Met Leu 625 630 Vai Pro Vai Ala Ile Lis Tri Leu 645 Arg Vai Asp Fen Leu Gli Glu Ala 560 His Asn Ile Ile Arg Leu Glu Gli 675 680 Met lie He Tri Glu Tir Met Glu 690 695 Arg Glu Lis Asp Gli Glu Fen Ser 705 710 Arg Gli Ile Ala Ala Gli Met Lis 725 His Arg Asp Leu Ala Ala Arg Asn 740 Cis Lis Vai Ser Asp Fen Gli Leu 755 760 Glu Ala Tri Tri Tri Tri Ser Gli 770 775 Ala Pro Glu Ala Ile Ser Tir Arg 785 790 Trp Ser Fen Gli Ile Vai Met Trp 805 Pro Tir Trp Glu Leu Ser Asn His 820 Gli Fen Arg Leu Pro Tri Pro Met 835 840 Leu Met Met Gin Cis Trp Gin Gin 850 855 Ala Asp Ile Vai Ser Ile Leu Asp 865 870 Leu Lis Tri Leu Ala Asp Fen Asp 885 Ser Tri Ser Gli Ser Glu Gli Vai 900 Leu Glu Ser Ile Lis Met Gin Gin 915 920 Gli Tir Tri Ala Ile Glu Lis Vai 93 0 935 620

Lis Tri Ser Ser Gli Lis Lis Glu 635 640 Lis Ala G1 i Tir Tri Glu Lis Gin 650 655 Gli Ile Met Gli Gin Fen Ser His 665 670 Vai Ile Ser Lis Tir LÍS Pro Met 685 Asn Gli Ala Leu Asp LÍS Fen Leu 700 Vai Leu Gin Leu Vai Gli Met Leu 715 720 Tir Leu Ala Asn Met Asn Tir Vai 730 735 Ile Leu Vai Asn Ser Asn Leu Vai 745 750 Ser Arg Vai Leu Glu Asp Asp Pro 765 G1 i Lis Ile Pro Ile Arg Trp Tri 780 Lis Fen Tri Ser Ala Ser Asp Vai 795 800 Glu Vai Met Tri Tir Gli Glu Arg 810 815 Glu Vai Met Lis Ala Ile Asn Asp 825 830 Asp Cis Pro Ser Ala lie Tir Gin 845 Glu Arg Ala Arg Arg Pro Lis Fen 860 Lis Leu Ile Arg Ala Pro Asp Ser 875 880 Pro Arg Vai Ser Ile Arg Leu Pro 890 895 Pro Fen Arg Tri Vai Ser Glu Trp 905 910 Tir Tri Glu His Fen Met Ala Ala 925 Vai Gin Met Tri Asn Asp Asp Ile 26 940

Lis Arg Ile Gli Vai Arg Leu Pro Gli His Gin Lis Arg Ile Ala Tir 945 950 955 950

Ser Leu Leu Gli Leu Lis Asp Gin Vai Asn Tri Vai Gli Ile Pro Ile 955 970 975

<210> 2 <211> 9 <212> PRT <213> Vírus da imunodeficiência dos seres humanos <400> 2

Ile Vai Gli Ala Glu Tri Fen Tir Vai 1 5

<210> 3 <211:» 10 <212> PRT <213> Vírus de herpes humano 5 <40Q> 3

Arg Pro His Glu Arg Asn Gli Fen Tri Vai 15 10 <210> 4 <211> 9

<212> PRT <213> Homo sapiens <400> 4

Ile Met Asn Asp Met Pro Ile Tir Met 1 5

<21Q> 5 <211> 9 <212.-» PRT <213> Homo sapiens <400> 5

Asp Met Pro Ile Tir Met Tir Ser Vai 1 5 27

<210> 6 <211> 9 <212> PRX <213 > Homo sapiens <400> 6 <210> Vai Leu Leu 1 7 <211> 9 <212> PRT <213> Homo sapiens <400> 7 <210> Vai Leu Ala 1 8 <211> 9 <212> PRT <213 > Homo sapiens <400> 8 <210> Tri Leu Ala 1 9 <211> 9 <212> PRT <213 > Sequência artificial <22 0> <223 > péptido imunogénio <400> 9 <210> Tir Met Pro 1 10 <211> 13 <212> PRT <213> Vírus da hepatite B 28 <400> 10

Tri Pro Pro Ala Tir Arg Pro Pro Asn Ala Pro Ile Leu 15 10

Lisboa, 23 de Maio de 2007 29

Claims

REIVINDICAÇÕES 1. Péptido imunogénico que constitui um epítopo T apresentado pelo CPH-I caracterizado pelo facto de ser constituído por um fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos do antigénio EphA2.
2. Péptido imunogénico, de acordo com a reivindicação 1, caracterizado pelo facto de ser escolhido entre: - o péptido de sequência IMNDMPIYM (SEQ ID N° 4) - o péptido de sequência VLLLVLAGV (SEQ ID N° 6) - o péptido de sequência VLAGVGFFI (SEQ ID N° 7) - o péptido de sequência TLADFDPRV (SEQ ID N° 8)
3. Péptido imunogénico caracterizado pelo facto de ser capaz de induzir uma resposta de LTC específica contra o antigénio EphA2 e por ser derivado de um péptido constituído por um fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos do antigénio EphA2, por substituição de pelo menos um aminoácido do referido péptido, por um aminoácido que aumenta a afinidade do referido péptido para uma molécula de CPH-I.
4. Péptido imunogénico, de acordo com a reivindicação 3, caracterizado pelo facto de ser derivado de um péptido constituído por um fragmento de 8 a 11 aminoácidos consecutivos do antigénio EphA2, por substituição do aminoácido de terminal N do referido péptido por um resíduo de tírosína.
5. Péptido imunogénico, de acordo com a reivindicação 4, caracterizado pelo facto de ser definido pela sequência YMPIYMYSV (SEQ ID N° 9) 1
6. Polinucleótido caracterizado pelo facto de codificar um péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações de 1 a 5.
7. Composição caracterizada pelo facto de compreender pelo menos um péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações de 1 a 5 ou um polinucleótido de acordo com a reivindicação 6.
8. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de se tratar de uma composição multi-epitópica que compreende, além disso, um ou vários outro(s) péptidos imunogénico(s) ou um ou vários polinucleótido(s) que codifica(m) para o(s) referido(s) péptido(s).
9. Composição, de acordo com a reivindicação 7, caracterizada pelo facto de se tratar de um polipéptido quimérico compreendendo pelo menos uma cópia de um péptido, de acordo com uma qualquer das reivindicações de 1 a 5 ou pelo menos uma cópia de um outro péptido imunogénico ou de um polinucleótido que codifica para o referido péptido quimérico.
10. Utilização de um péptido de acordo com uma qualquer das reivindicações de 1 a 5, de um polinucleótido de acordo com a reivindicação 6 ou de uma composição de acordo com uma qualquer das reivindicações de 7 a 9, caracterizada pelo facto de se destinar à obtenção de um medicamento.
11. Utilização, de acordo com a reivindicação 10, caracterizada pelo facto de o referido medicamento se destinar à imunoterapia antitumoral. 2
12. Utilização, de acordo com a reivindicação 11, caracterizada ps lo facto de o referido farmaco se destinar à imunoterapia de tumores que expressam o antigénio EphA2.
13. Utilização, de acordo com qualquer umas das reivindicações de 10 a 12, caracterizada pelo facto de o referido medicamento se destinar ao tratamento de pacientes com HLA-A*0201. Lisboa,23 de Maio de 2007 3