JPH05294994A - アクチノマイシンｄ複合体の製造方法 - Google Patents
アクチノマイシンｄ複合体の製造方法Info
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- JPH05294994A JPH05294994A JP3232061A JP23206191A JPH05294994A JP H05294994 A JPH05294994 A JP H05294994A JP 3232061 A JP3232061 A JP 3232061A JP 23206191 A JP23206191 A JP 23206191A JP H05294994 A JPH05294994 A JP H05294994A
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Abstract
(57)【要約】
【構成】 本発明は、図１Ｂで表わされるアクチノマイ
シンＤ誘導体（ここで、Ｒ1は、ＮＣＯ、ＮＨ2、ＮＨＣ
Ｈ2ＣＯ2ＨまたはＮＨＣＯＲＸであり、Ｒは炭化水素な
らびにＸは、ＮＣＯ、ＣＯ2ＨおよびＮＣＳからなる群
から選択され、Ｒ2およびＲ3は、ＣＨ3、ＣＨ2Ｂｒまた
ＣＨＯであり、Ｒ4およびＲ5は、ＨまたはＳＯ3Ｈであ
り、但しＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5における基の組
合せは図１Ａに示されるアクチノマイシンＤを生じな
い）、および標的細胞結合タンパクに結合したアクチノ
マイシンＤ誘導体の複合体、ならびにこれらの製造方法
を提供する。このような複合体を、誘導された部分の結
合を介して標的細胞結合性タンパクまたはスペーサー上
の反応基に結合させる方法が提供される。 【効果】 標的細胞結合性タンパクに結合されて複合体
を形成するアクチノマイシンＤ誘導体が提供される。複
合体は動物に投与され、標的細胞に特異的に結合して細
胞障害作用を生じ得る。
シンＤ誘導体（ここで、Ｒ1は、ＮＣＯ、ＮＨ2、ＮＨＣ
Ｈ2ＣＯ2ＨまたはＮＨＣＯＲＸであり、Ｒは炭化水素な
らびにＸは、ＮＣＯ、ＣＯ2ＨおよびＮＣＳからなる群
から選択され、Ｒ2およびＲ3は、ＣＨ3、ＣＨ2Ｂｒまた
ＣＨＯであり、Ｒ4およびＲ5は、ＨまたはＳＯ3Ｈであ
り、但しＲ1、Ｒ2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5における基の組
合せは図１Ａに示されるアクチノマイシンＤを生じな
い）、および標的細胞結合タンパクに結合したアクチノ
マイシンＤ誘導体の複合体、ならびにこれらの製造方法
を提供する。このような複合体を、誘導された部分の結
合を介して標的細胞結合性タンパクまたはスペーサー上
の反応基に結合させる方法が提供される。 【効果】 標的細胞結合性タンパクに結合されて複合体
を形成するアクチノマイシンＤ誘導体が提供される。複
合体は動物に投与され、標的細胞に特異的に結合して細
胞障害作用を生じ得る。
Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、抗体および治療剤の複
合体に関し、特に、抗体の特異性によって指定される作
用部位へアクチノマイシンＤを運搬するための抗体と結
合したアクチノマイシンＤの治療用調製物に関する。
合体に関し、特に、抗体の特異性によって指定される作
用部位へアクチノマイシンＤを運搬するための抗体と結
合したアクチノマイシンＤの治療用調製物に関する。
【０００２】
【従来の技術】侵入する生物体または病気になった細胞
に、治療剤を特異的に標的付けることが長い間切望され
てきた。特異的標的付けは、投与される治療剤の投与量
を少量にし、治療剤の非特異的作用に起因する副作用を
減少させる。リポソーム、タンパクおよび抗体のような
様々な標的細胞結合性の薬剤が、特異的標的付け分子と
しての微生物毒素、タンパク合成阻害剤（すなわち、ジ
フテリアトキシン）および放射性化合物のような薬剤ま
たは細胞障害剤と共に使用されている。
に、治療剤を特異的に標的付けることが長い間切望され
てきた。特異的標的付けは、投与される治療剤の投与量
を少量にし、治療剤の非特異的作用に起因する副作用を
減少させる。リポソーム、タンパクおよび抗体のような
様々な標的細胞結合性の薬剤が、特異的標的付け分子と
しての微生物毒素、タンパク合成阻害剤（すなわち、ジ
フテリアトキシン）および放射性化合物のような薬剤ま
たは細胞障害剤と共に使用されている。
【０００３】特異的に選択された抗原を認識する、抗
体、特にモノクローナル抗体は、治療剤の運搬に特に適
している。モノクローナル抗体は、細胞上の単一の分子
部位、即ちエピトープを認識する能力を有するため、有
利である。研究によって、腫瘍関連抗原、ならびに癌細
胞、Ｔ細胞およびＢ細胞のその他の抗原に特異的なモノ
クローナル抗体が同定された。これらのモノクローナル
抗体は、標的細胞に直接および特異的に薬剤を運搬する
のに使用され得る。このような標的細胞を攻撃する強力
な手段の一つは、抗生物質のような薬物を付着したモノ
クローナル抗体の使用である。特異的細胞、組織、器官
またはその他の部位への抗体−治療剤のインビボにおけ
る運搬は、全抗体または抗体の断片を使用することによ
って成し遂げられ得る。選択された抗原を認識する能力
を保持するのであれば、Ｆａｂのような断片が全抗体の
かわりに使用され得る。
体、特にモノクローナル抗体は、治療剤の運搬に特に適
している。モノクローナル抗体は、細胞上の単一の分子
部位、即ちエピトープを認識する能力を有するため、有
利である。研究によって、腫瘍関連抗原、ならびに癌細
胞、Ｔ細胞およびＢ細胞のその他の抗原に特異的なモノ
クローナル抗体が同定された。これらのモノクローナル
抗体は、標的細胞に直接および特異的に薬剤を運搬する
のに使用され得る。このような標的細胞を攻撃する強力
な手段の一つは、抗生物質のような薬物を付着したモノ
クローナル抗体の使用である。特異的細胞、組織、器官
またはその他の部位への抗体−治療剤のインビボにおけ
る運搬は、全抗体または抗体の断片を使用することによ
って成し遂げられ得る。選択された抗原を認識する能力
を保持するのであれば、Ｆａｂのような断片が全抗体の
かわりに使用され得る。
【０００４】抗体−治療剤の複合体は、共有結合を介し
てこの２つを化学的に結合させることによって形成され
得る。抗体分子のバックボーンに共有付着させることの
１つの欠点は、抗原結合領域内で化学的修飾が起こる場
合、抗体の認識が変化され得ることである。抗体の機能
上の特性に対するこのような逆効果は、薬剤と抗体との
ランダムな結合に対して問題であった。得られた複合体
の重要な特性は、生物的活性（抗体および治療剤の両
方）を維持すること、およびインビボにおいて使用され
ても安定していることである。治療剤の標的細胞結合性
タンパクに対する付着は、患者への投与のあらゆる条件
および作用部位における微環境に存在するすべての条件
下において安定していなければならない。さらに、ヒト
または動物に有効量の投与をする場合、複合体は、特異
的細胞または組織上の抗原決定基に対する免疫特異性を
残していなければならない。
てこの２つを化学的に結合させることによって形成され
得る。抗体分子のバックボーンに共有付着させることの
１つの欠点は、抗原結合領域内で化学的修飾が起こる場
合、抗体の認識が変化され得ることである。抗体の機能
上の特性に対するこのような逆効果は、薬剤と抗体との
ランダムな結合に対して問題であった。得られた複合体
の重要な特性は、生物的活性（抗体および治療剤の両
方）を維持すること、およびインビボにおいて使用され
ても安定していることである。治療剤の標的細胞結合性
タンパクに対する付着は、患者への投与のあらゆる条件
および作用部位における微環境に存在するすべての条件
下において安定していなければならない。さらに、ヒト
または動物に有効量の投与をする場合、複合体は、特異
的細胞または組織上の抗原決定基に対する免疫特異性を
残していなければならない。
【０００５】アクチノマイシンＤは、ＤＮＡの一方の１
本鎖上の遺伝子情報が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）と呼ばれる塩基の相補的な組合せにコピーされる過
程、即ちＲＮＡの転写を阻害する抗生物質である。アク
チノマイシンＤは二重鎖ＤＮＡのＧ−Ｃ塩基対の間に食
込みまたは挿入して、ＤＮＡ鋳型を変形させることによ
り、有効なＲＮＡ転写を防止する。即ち、アクチノマイ
シンＤは、ＤＮＡのジッパーに割り込む。
本鎖上の遺伝子情報が、メッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮ
Ａ）と呼ばれる塩基の相補的な組合せにコピーされる過
程、即ちＲＮＡの転写を阻害する抗生物質である。アク
チノマイシンＤは二重鎖ＤＮＡのＧ−Ｃ塩基対の間に食
込みまたは挿入して、ＤＮＡ鋳型を変形させることによ
り、有効なＲＮＡ転写を防止する。即ち、アクチノマイ
シンＤは、ＤＮＡのジッパーに割り込む。
【０００６】さらに、アクチノマイシンＤは、低濃度に
おけるその効力のために特に魅力的である。低濃度にお
いて、アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ複製またはタンパ
ク合成にあまり影響せずに、転写を阻害する。原核細胞
および真核細胞の両方での新しいＲＮＡ形成に対する非
常に特異的な阻害剤であり、最終的には細胞の死を招く
ものとして、広く使用されている。さらに、迅速に分割
している細胞の増殖を阻止するため、アウチノマイシン
Ｄは、いくつかの癌の治療において、有効な非選択的治
療剤となっている。
おけるその効力のために特に魅力的である。低濃度にお
いて、アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ複製またはタンパ
ク合成にあまり影響せずに、転写を阻害する。原核細胞
および真核細胞の両方での新しいＲＮＡ形成に対する非
常に特異的な阻害剤であり、最終的には細胞の死を招く
ものとして、広く使用されている。さらに、迅速に分割
している細胞の増殖を阻止するため、アウチノマイシン
Ｄは、いくつかの癌の治療において、有効な非選択的治
療剤となっている。
【０００７】
【発明が解決しようとする課題】アクチノマイシンＤ
は、いかなるタイプの結合を介してもキャリアには付着
されなかった。選択的標的剤へアクチノマイシンＤを付
着させる化学反応は、不必要な副作用が伴い、すべての
試みは失敗に終わっている。
は、いかなるタイプの結合を介してもキャリアには付着
されなかった。選択的標的剤へアクチノマイシンＤを付
着させる化学反応は、不必要な副作用が伴い、すべての
試みは失敗に終わっている。
【０００８】従って、治療または診断の目的で使用され
得る、アクチノマイシンＤに結合した標的細胞結合性薬
剤が必要とされている。好ましくは、このような複合体
は、インビボにおいて安定していなければならない。本
発明は、これらの必要性を満たすものであり、同時にそ
れに関連する利点を提供する。
得る、アクチノマイシンＤに結合した標的細胞結合性薬
剤が必要とされている。好ましくは、このような複合体
は、インビボにおいて安定していなければならない。本
発明は、これらの必要性を満たすものであり、同時にそ
れに関連する利点を提供する。
【０００９】
【課題を解決するための手段】本発明は、アクチノマイ
シンＤ誘導体、および他の物質にアクチノマイシンＤを
結合させるのに有用な、アクチノマイシンＤ誘導体を製
造する方法を提供する。このような誘導体には、イソシ
アネート、チオイソシアネート、カルボン酸、臭素、ア
ルデヒドおよびスルホン酸誘導体が含まれる。本発明は
また、標的細胞結合性タンパクに結合されたアクチノマ
イシンＤ誘導体を提供することである。標的細胞結合性
タンパクまたはスペーサー上の反応基への誘導体の結合
を介して、このような複合体を合成する方法が提供され
る。
シンＤ誘導体、および他の物質にアクチノマイシンＤを
結合させるのに有用な、アクチノマイシンＤ誘導体を製
造する方法を提供する。このような誘導体には、イソシ
アネート、チオイソシアネート、カルボン酸、臭素、ア
ルデヒドおよびスルホン酸誘導体が含まれる。本発明は
また、標的細胞結合性タンパクに結合されたアクチノマ
イシンＤ誘導体を提供することである。標的細胞結合性
タンパクまたはスペーサー上の反応基への誘導体の結合
を介して、このような複合体を合成する方法が提供され
る。
【００１０】複合体は、動物に投与され、標的細胞に対
する局所的な細胞障害効果を生じ得る。
する局所的な細胞障害効果を生じ得る。
【００１１】本発明は、アクチノマイシンＤの化学的誘
導体を製造する簡単で効果的な方法およびこのような誘
導体を標的細胞結合性タンパクに結合させてアクチノマ
イシンＤ複合体を製造する方法に関する。これまで、ア
クチノマイシンＤ誘導体を製造する化学反応には、不必
要な副作用が伴ったため、このようなアクチノマイシン
Ｄ複合体はなかった。アクチノマイシンＤ抗生物質が実
質的にすべてのタイプの細胞におけるＲＮＡ合成の非常
に強力な阻害剤であることが、アクチノマイシンＤの化
学的誘導体およびアクチノマイシンＤ複合体を製造する
ことに関する重要な利点である。アクチノマイシンＤ誘
導体を標的細胞結合性タンパクに結合させることによ
り、標的細胞結合性タンパクが利用され得るすべての細
胞型を特異的に破壊することができる。従って、アクチ
ノマイシンＤの化学的誘導体から製造されたアクチノマ
イシンＤ複合体は、患者の腫瘍増殖を特異的に抑制した
り、培養物中の汚染細胞の増殖を抑制したりするのに適
用され得る。
導体を製造する簡単で効果的な方法およびこのような誘
導体を標的細胞結合性タンパクに結合させてアクチノマ
イシンＤ複合体を製造する方法に関する。これまで、ア
クチノマイシンＤ誘導体を製造する化学反応には、不必
要な副作用が伴ったため、このようなアクチノマイシン
Ｄ複合体はなかった。アクチノマイシンＤ抗生物質が実
質的にすべてのタイプの細胞におけるＲＮＡ合成の非常
に強力な阻害剤であることが、アクチノマイシンＤの化
学的誘導体およびアクチノマイシンＤ複合体を製造する
ことに関する重要な利点である。アクチノマイシンＤ誘
導体を標的細胞結合性タンパクに結合させることによ
り、標的細胞結合性タンパクが利用され得るすべての細
胞型を特異的に破壊することができる。従って、アクチ
ノマイシンＤの化学的誘導体から製造されたアクチノマ
イシンＤ複合体は、患者の腫瘍増殖を特異的に抑制した
り、培養物中の汚染細胞の増殖を抑制したりするのに適
用され得る。
【００１２】１つの実施態様において、アクチノマイシ
ンＤの化学的誘導体を製造する方法は、アクチノマイシ
ンＤのイソシアネート誘導体の形成を含む。アクチノマ
イシンＤは、分子の３環芳香族成分上に単一の第一アミ
ンを有する。塩化オキサリルとアクチノマイシンＤを反
応させると、第一アミンがイソシアネート部分に変換さ
れる。イソシアネート部分は、セリンのヒドロキシル部
分およびリジンの第一アミン部分のような標的細胞結合
性タンパク上の化学基に反応性である。イソシアネート
部分を標的細胞結合性タンパク上のヒドロキシル基また
は第一アミン基と結合させると、標的細胞の増殖を選択
的に抑制するのに有用なアクチノマイシンＤ複合体が製
造される。
ンＤの化学的誘導体を製造する方法は、アクチノマイシ
ンＤのイソシアネート誘導体の形成を含む。アクチノマ
イシンＤは、分子の３環芳香族成分上に単一の第一アミ
ンを有する。塩化オキサリルとアクチノマイシンＤを反
応させると、第一アミンがイソシアネート部分に変換さ
れる。イソシアネート部分は、セリンのヒドロキシル部
分およびリジンの第一アミン部分のような標的細胞結合
性タンパク上の化学基に反応性である。イソシアネート
部分を標的細胞結合性タンパク上のヒドロキシル基また
は第一アミン基と結合させると、標的細胞の増殖を選択
的に抑制するのに有用なアクチノマイシンＤ複合体が製
造される。
【００１３】あるいは、アクチノマイシンＤのイソシア
ネート誘導体は、スペーサーを介して標的細胞結合性タ
ンパクに結合され得る。スペーサーは、ヒドロキシル基
または第一アミン反応基を介してイソシアネート部分に
その一端が結合され得る。スペーサーの他端は、標的細
胞結合性タンパクに結合され得るカルボン酸のような化
学部分を有する。
ネート誘導体は、スペーサーを介して標的細胞結合性タ
ンパクに結合され得る。スペーサーは、ヒドロキシル基
または第一アミン反応基を介してイソシアネート部分に
その一端が結合され得る。スペーサーの他端は、標的細
胞結合性タンパクに結合され得るカルボン酸のような化
学部分を有する。
【００１４】本発明の他の実施態様において、様々な他
のアクチノマイシンＤ誘導体の製造方法が提供される。
これらの方法には、アクチノマイシンＤの第一アミンを
改変して、他のイソシアネート誘導体、チオイソシアネ
ート誘導体およびカルボン酸誘導体を製造することが含
まれる。芳香族メチル基置換体を改変してアクチノマイ
シンＤの臭化メチレン誘導体およびアルデヒド誘導体を
製造する方法もまた提供される。さらに、アクチノマイ
シンＤのスルホン酸誘導体が、芳香族水素原子を置換す
ることによって製造され得る。上記の誘導体の各々は、
誘導された部分を介して標的細胞結合性タンパクに結合
され得、標的細胞の増殖を特異的に抑制するのに使用さ
れるアクチノマイシンＤ複合体が製造される。
のアクチノマイシンＤ誘導体の製造方法が提供される。
これらの方法には、アクチノマイシンＤの第一アミンを
改変して、他のイソシアネート誘導体、チオイソシアネ
ート誘導体およびカルボン酸誘導体を製造することが含
まれる。芳香族メチル基置換体を改変してアクチノマイ
シンＤの臭化メチレン誘導体およびアルデヒド誘導体を
製造する方法もまた提供される。さらに、アクチノマイ
シンＤのスルホン酸誘導体が、芳香族水素原子を置換す
ることによって製造され得る。上記の誘導体の各々は、
誘導された部分を介して標的細胞結合性タンパクに結合
され得、標的細胞の増殖を特異的に抑制するのに使用さ
れるアクチノマイシンＤ複合体が製造される。
【００１５】本願で使用されているように、用語「標的
細胞結合性タンパク」は、標的細胞に選択的な結合を示
すタンパクのことをさしていう。例えば、このタンパク
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル血清抗体、タ
ンパクホルモン、成長因子および細胞接着タンパクのよ
うな細胞表面結合タンパクであり得る。また、この用語
は、標的細胞結合性タンパクの機能的断片を含むもので
ある。本願で使用されている「機能的断片」は、完全な
分子の標的細胞への選択的結合特性を示す断片をさして
いう。選択的結合とは、標的細胞に対する標的細胞結合
タンパクの親和性および結合特異性をさす。標的細胞上
で結合される分子は、代表的には、タンパク抗原のよう
な細胞表面分子である。但し、炭水化物、脂質、リン酸
および硫酸のような無機分子、ポリペプチドおよびペプ
チド分子もまた、標的細胞結合性タンパクがこれらの分
子に対して選択的結合を示す限りにおいて、同様に結合
され得る。標的細胞は、標的細胞結合性タンパクによっ
て結合され得る細胞表面分子を有するすべての細胞また
は細胞群であり得る。培養物中の細胞が、生物体内の細
胞と同様に含まれる。
細胞結合性タンパク」は、標的細胞に選択的な結合を示
すタンパクのことをさしていう。例えば、このタンパク
は、モノクローナル抗体、ポリクローナル血清抗体、タ
ンパクホルモン、成長因子および細胞接着タンパクのよ
うな細胞表面結合タンパクであり得る。また、この用語
は、標的細胞結合性タンパクの機能的断片を含むもので
ある。本願で使用されている「機能的断片」は、完全な
分子の標的細胞への選択的結合特性を示す断片をさして
いう。選択的結合とは、標的細胞に対する標的細胞結合
タンパクの親和性および結合特異性をさす。標的細胞上
で結合される分子は、代表的には、タンパク抗原のよう
な細胞表面分子である。但し、炭水化物、脂質、リン酸
および硫酸のような無機分子、ポリペプチドおよびペプ
チド分子もまた、標的細胞結合性タンパクがこれらの分
子に対して選択的結合を示す限りにおいて、同様に結合
され得る。標的細胞は、標的細胞結合性タンパクによっ
て結合され得る細胞表面分子を有するすべての細胞また
は細胞群であり得る。培養物中の細胞が、生物体内の細
胞と同様に含まれる。
【００１６】本願で使用されているように、用語「アク
チノマイシンＤ誘導体」は、アクチノマイシンＤの改変
形をさしていう。アクチノマイシンＤは、図１ａに示さ
れる化合物である。アクチノマイシンＤ上には改変され
得る５つの部分がある。この部分は、アクチノマイシン
Ｄの３環芳香族成分上にあり、図１ｂにおいて基Ｒ1か
らＲ5に置き換えられている。以下の化学式においては
これらの部分は、文字「ＡＭＤ」に結合した部分として
図示される。ここで、ＡＭＤは、アクチノマイシンＤ分
子の残りの部分を示す。例えば、アクチノマイシンＤの
芳香族成分上の第一アミンであるＲ1は、ＡＭＤ−ＮＨ2
として示される。アクチノマイシンＤ誘導体を製造する
ためのこのような部分の改変には、例えば、化学基の付
加または置換が含まれる。アクチノマイシンＤ誘導体に
は、例えば、イソシアネート誘導体、カルボン酸誘導
体、臭化メチレン誘導体、チオイソシアネート誘導体、
アルデヒド誘導体およびスルホン酸誘導体が含まれる。
このような誘導体はまた、上記と同様の様式で表され
る。
チノマイシンＤ誘導体」は、アクチノマイシンＤの改変
形をさしていう。アクチノマイシンＤは、図１ａに示さ
れる化合物である。アクチノマイシンＤ上には改変され
得る５つの部分がある。この部分は、アクチノマイシン
Ｄの３環芳香族成分上にあり、図１ｂにおいて基Ｒ1か
らＲ5に置き換えられている。以下の化学式においては
これらの部分は、文字「ＡＭＤ」に結合した部分として
図示される。ここで、ＡＭＤは、アクチノマイシンＤ分
子の残りの部分を示す。例えば、アクチノマイシンＤの
芳香族成分上の第一アミンであるＲ1は、ＡＭＤ−ＮＨ2
として示される。アクチノマイシンＤ誘導体を製造する
ためのこのような部分の改変には、例えば、化学基の付
加または置換が含まれる。アクチノマイシンＤ誘導体に
は、例えば、イソシアネート誘導体、カルボン酸誘導
体、臭化メチレン誘導体、チオイソシアネート誘導体、
アルデヒド誘導体およびスルホン酸誘導体が含まれる。
このような誘導体はまた、上記と同様の様式で表され
る。
【００１７】本願で使用されているように、用語「アク
チノマイシンＤ複合体」または「複合体」は、標的細胞
結合性タンパクに結合したアクチノマイシンＤ誘導体を
さしていう。本願で使用されるように、用語「結合し
た」は、アクチノマイシンＤ誘導体および標的細胞結合
性タンパク間の共有結合を介するような、２つの分子が
互いに結合することをさしていう。この２つの分子はま
た、アクチノマイシンＤ誘導体およびスペーサーであり
得る。従って、アクチノマイシンＤ誘導体の結合は、標
的細胞結合性タンパクへの直接的な結合またはスペーサ
ー分子を介した結合であり得る。
チノマイシンＤ複合体」または「複合体」は、標的細胞
結合性タンパクに結合したアクチノマイシンＤ誘導体を
さしていう。本願で使用されるように、用語「結合し
た」は、アクチノマイシンＤ誘導体および標的細胞結合
性タンパク間の共有結合を介するような、２つの分子が
互いに結合することをさしていう。この２つの分子はま
た、アクチノマイシンＤ誘導体およびスペーサーであり
得る。従って、アクチノマイシンＤ誘導体の結合は、標
的細胞結合性タンパクへの直接的な結合またはスペーサ
ー分子を介した結合であり得る。
【００１８】本願で使用されるように、用語「反応基」
は、結合形成活性を示す化学作用部分をさしていう。反
応基を介して分子を結合すると、分子と反応基との間に
結合を形成することになる。反応基は、例えば、第一ア
ミン、ヒドロキシル、カルボン酸、イソシアネート、ア
ルデヒド、スルホン酸および臭化メチレンであり得る。
結合形成には、結合形成を成し遂げるために化学作用部
分を前もって活性化することが含まれる。
は、結合形成活性を示す化学作用部分をさしていう。反
応基を介して分子を結合すると、分子と反応基との間に
結合を形成することになる。反応基は、例えば、第一ア
ミン、ヒドロキシル、カルボン酸、イソシアネート、ア
ルデヒド、スルホン酸および臭化メチレンであり得る。
結合形成には、結合形成を成し遂げるために化学作用部
分を前もって活性化することが含まれる。
【００１９】本願で使用されるように、「活性化」は、
化学作用部分の化学的反応性を改変させる化学反応をさ
していう。この改変は代表的には、部分の化学特異性を
あまり変化させないが、その代わりに部分がより迅速に
容易に、そしてしばしば副産物をあまり生成せずに反応
するようにさせる。カルボン酸部分の、例えばカルボジ
イミド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、Ｎ−エトキシカ
ルボニル−２−エトキシ−１、２−ジヒドロキノリン
（ＥＥＤＱ）またはイソブチルクロロホルメートによる
活性化は、活性化されたカルボン酸部分を第一アミンに
迅速で効率的に結合させて、アミド結合を形成する。
化学作用部分の化学的反応性を改変させる化学反応をさ
していう。この改変は代表的には、部分の化学特異性を
あまり変化させないが、その代わりに部分がより迅速に
容易に、そしてしばしば副産物をあまり生成せずに反応
するようにさせる。カルボン酸部分の、例えばカルボジ
イミド、Ｎ−ヒドロキシスクシニミド、Ｎ−エトキシカ
ルボニル−２−エトキシ−１、２−ジヒドロキノリン
（ＥＥＤＱ）またはイソブチルクロロホルメートによる
活性化は、活性化されたカルボン酸部分を第一アミンに
迅速で効率的に結合させて、アミド結合を形成する。
【００２０】他の活性化試薬には、例えば、イソシアネ
ート、チオイソシアネート、アジ化物およびジアゾ−ハ
ロゲン化物が含まれる。好ましい活性化試薬は、関与す
る特定の化学作用部分および製造しようとする所望の結
合による。このような反応は、当業者により既知であ
る。
ート、チオイソシアネート、アジ化物およびジアゾ−ハ
ロゲン化物が含まれる。好ましい活性化試薬は、関与す
る特定の化学作用部分および製造しようとする所望の結
合による。このような反応は、当業者により既知であ
る。
【００２１】本願で使用されるように、用語「スペーサ
ー」は、アクチノマイシンＤ誘導体と標的細胞結合性タ
ンパクとの間に橋のような構造を形成する分子をさして
いう。スペーサーは、例えば、２つの分子を反応基を介
して直接結合させる方法以外の、アクチノマイシンＤ誘
導体を標的細胞結合性タンパクへ結合させる別の手段と
して使用され得る。このようなスペーサーは、１つまた
はそれ以上の原子から構成され得るが、好ましくは長さ
が約２０原子未満である。スペーサーは、二価性、また
は好ましくはヘテロ二価性で有り得、この両方のタイプ
のスペーサーは分子の各末端に反応基を含み、アクチノ
マイシンＤ誘導体を抗体に結合させるのに有用である。
二価性スペーサーは、各末端に同一の反応基を有する。
一方、ヘテロ二価性スペーサーは、各末端に、異なる反
応基を有する。ヘテロ二価性は、有効である。なぜな
ら、ヘテロ二価性は、結合反応において架橋および不必
要な副産物の生成を減少させるからである。ヘテロ二価
性スペーサーは、例えば、長さが２０個未満、好ましく
は約１０個の炭素原子で、一端に様々な化学作用部分の
１つおよび他端に異なる化学作用部分を有する炭化水素
を含む。好ましくは、化学作用部分の１つとして、カル
ボン酸基が含まれる。他端には、アクチノマイシンＤ誘
導体への結合に必要な化学作用に依存して、様々な化学
作用部分の１つが含まれ得る。
ー」は、アクチノマイシンＤ誘導体と標的細胞結合性タ
ンパクとの間に橋のような構造を形成する分子をさして
いう。スペーサーは、例えば、２つの分子を反応基を介
して直接結合させる方法以外の、アクチノマイシンＤ誘
導体を標的細胞結合性タンパクへ結合させる別の手段と
して使用され得る。このようなスペーサーは、１つまた
はそれ以上の原子から構成され得るが、好ましくは長さ
が約２０原子未満である。スペーサーは、二価性、また
は好ましくはヘテロ二価性で有り得、この両方のタイプ
のスペーサーは分子の各末端に反応基を含み、アクチノ
マイシンＤ誘導体を抗体に結合させるのに有用である。
二価性スペーサーは、各末端に同一の反応基を有する。
一方、ヘテロ二価性スペーサーは、各末端に、異なる反
応基を有する。ヘテロ二価性は、有効である。なぜな
ら、ヘテロ二価性は、結合反応において架橋および不必
要な副産物の生成を減少させるからである。ヘテロ二価
性スペーサーは、例えば、長さが２０個未満、好ましく
は約１０個の炭素原子で、一端に様々な化学作用部分の
１つおよび他端に異なる化学作用部分を有する炭化水素
を含む。好ましくは、化学作用部分の１つとして、カル
ボン酸基が含まれる。他端には、アクチノマイシンＤ誘
導体への結合に必要な化学作用に依存して、様々な化学
作用部分の１つが含まれ得る。
【００２２】例えば、構造：Ｒ−ペプチド−Ｒ1−ＣＯ
ＯＨを有するペプチドスペーサーも含まれる。Ｒは、ア
クチノマイシンＤ反応性末端に相当し、オキシム（Ｈ2
Ｎ−Ｏ）、フェニルヒドラジン（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−Ｐ
ｈ）、ヒドラジン（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＯ）およびヒドラ
ジンスルホニル（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＳＯ2−Ｐｈ）のような
化学作用部分を含む。ヒドロキシル、第一アミン、芳香
族酸素おび臭化メチレン基のような他の化学作用部分も
含まれる。Ｒ1は、標的細胞結合性タンパクの反応性末
端に相当し、例えば、マレイン酸、コハク酸、シトラコ
ン酸、ジグルコン酸およびジメチルマレイン酸のような
構造を含み得る。ペプチドは任意の長さおよび配列であ
り得るが、好ましくは長さが約３から４個のアミノ酸で
ある。配列は、好ましくはAla-Ala-Ala, Ala-Leu-Ala-L
eu, Leu-Ala-Leu-AlaまたはSer-Ser-Serである。
ＯＨを有するペプチドスペーサーも含まれる。Ｒは、ア
クチノマイシンＤ反応性末端に相当し、オキシム（Ｈ2
Ｎ−Ｏ）、フェニルヒドラジン（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−Ｐ
ｈ）、ヒドラジン（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＣＯ）およびヒドラ
ジンスルホニル（Ｈ2Ｎ−ＮＨ−ＳＯ2−Ｐｈ）のような
化学作用部分を含む。ヒドロキシル、第一アミン、芳香
族酸素おび臭化メチレン基のような他の化学作用部分も
含まれる。Ｒ1は、標的細胞結合性タンパクの反応性末
端に相当し、例えば、マレイン酸、コハク酸、シトラコ
ン酸、ジグルコン酸およびジメチルマレイン酸のような
構造を含み得る。ペプチドは任意の長さおよび配列であ
り得るが、好ましくは長さが約３から４個のアミノ酸で
ある。配列は、好ましくはAla-Ala-Ala, Ala-Leu-Ala-L
eu, Leu-Ala-Leu-AlaまたはSer-Ser-Serである。
【００２３】本発明は、アクチノマイシンＤのイソシア
ネート誘導体およびそのようなアクチノマイシンＤのイ
ソシアネート誘導体の製造方法を提供する。アクチノマ
イシンＤは、塩化オキサリルのような化合物との反応に
よってイソシアネート部分に変換され得る単一の第一ア
ミンを含む。塩化オキサリルとの反応は以下のようであ
る。
ネート誘導体およびそのようなアクチノマイシンＤのイ
ソシアネート誘導体の製造方法を提供する。アクチノマ
イシンＤは、塩化オキサリルのような化合物との反応に
よってイソシアネート部分に変換され得る単一の第一ア
ミンを含む。塩化オキサリルとの反応は以下のようであ
る。
【００２４】
【化２】
【００２５】ここで、AMD-NH2は、第一アミンまたはア
クチノマイシンＤである。
クチノマイシンＤである。
【００２６】塩化オキサリルに類似した化合物はまた、
アクチノマイシンＤの他のイソシアネート誘導体、カル
ボン酸誘導体およびチオイソシアネート誘導体を製造す
るのに使用され得る。このような化合物には、例えば、
Ｒが炭化水素およびＸがイソシアネートカルボン酸、ま
たはチオイソシアネートであるＣｌ−ＣＯ−Ｒ−Ｘの構
造をもつ酸塩化物が含まれる。この酸塩化物とアクチノ
マイシンＤの第一アミンとの間の反応によって、第一ア
ミンと酸塩化物のカルボニル基との間にアミド結合が形
成される。生じた誘導体は、ＡＭＤ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−
Ｘの構造を有する。上記の構造の酸塩化物部分の代わり
に、アルデヒド基のような他の化学作用部分もまた使用
され得る。それ故、本発明は、様々なイソシアネート、
カルボン酸、チオイソシアネート誘導体、およびこのよ
うな誘導体の製造方法を提供する。
アクチノマイシンＤの他のイソシアネート誘導体、カル
ボン酸誘導体およびチオイソシアネート誘導体を製造す
るのに使用され得る。このような化合物には、例えば、
Ｒが炭化水素およびＸがイソシアネートカルボン酸、ま
たはチオイソシアネートであるＣｌ−ＣＯ−Ｒ−Ｘの構
造をもつ酸塩化物が含まれる。この酸塩化物とアクチノ
マイシンＤの第一アミンとの間の反応によって、第一ア
ミンと酸塩化物のカルボニル基との間にアミド結合が形
成される。生じた誘導体は、ＡＭＤ−ＮＨ−ＣＯ−Ｒ−
Ｘの構造を有する。上記の構造の酸塩化物部分の代わり
に、アルデヒド基のような他の化学作用部分もまた使用
され得る。それ故、本発明は、様々なイソシアネート、
カルボン酸、チオイソシアネート誘導体、およびこのよ
うな誘導体の製造方法を提供する。
【００２７】本発明はまた、上記と異なる構造を有する
アクチノマイシンＤのカルボン酸誘導体およびこのよう
なカルボン酸誘導体を製造する方法を提供する。アクチ
ノマイシンＤと、ブロモ酢酸のような臭化カルボン酸と
の反応は、臭化水素を放出し、アクチノマイシンＤ上に
ある第一アミンとブロモ酢酸のメチレン基との間に結合
を形成する。反応は以下のように示され、結果として第
二アミンが形成される。
アクチノマイシンＤのカルボン酸誘導体およびこのよう
なカルボン酸誘導体を製造する方法を提供する。アクチ
ノマイシンＤと、ブロモ酢酸のような臭化カルボン酸と
の反応は、臭化水素を放出し、アクチノマイシンＤ上に
ある第一アミンとブロモ酢酸のメチレン基との間に結合
を形成する。反応は以下のように示され、結果として第
二アミンが形成される。
【００２８】
【化３】
【００２９】臭素以外のハロゲン原子もまた、カルボン
酸反応物に使用され得る。このようなハロゲン原子は、
例えば、クロロまたはヨードであり得、当業者により既
知である。
酸反応物に使用され得る。このようなハロゲン原子は、
例えば、クロロまたはヨードであり得、当業者により既
知である。
【００３０】本発明は、アクチノマイシンＤの臭化メチ
レン誘導体およびそのような誘導体の製造方法を提供す
る。臭素またはブロモトリクロロメタンの、例えば、紫
外線存在下でのアクチノマイシンＤとの反応により、芳
香族環のメチル基置換体が臭化される。あるいは、以下
に示すような臭化もまた、アクチノマイシンＤの臭化メ
チレン誘導体を生じる。
レン誘導体およびそのような誘導体の製造方法を提供す
る。臭素またはブロモトリクロロメタンの、例えば、紫
外線存在下でのアクチノマイシンＤとの反応により、芳
香族環のメチル基置換体が臭化される。あるいは、以下
に示すような臭化もまた、アクチノマイシンＤの臭化メ
チレン誘導体を生じる。
【００３１】
【化４】
【００３２】ここで、ＡＭＤ−ＣＨ3は、アクチノマイ
シンＤの２つの芳香族メチル基置換体のいずれかを表
す。
シンＤの２つの芳香族メチル基置換体のいずれかを表
す。
【００３３】本発明はさらに、アクチノマイシンＤのア
ルデヒド誘導体およびそのような誘導体の製造方法を提
供する。アクチノマイシンＤの芳香族メチル基置換体
は、以下のように選択的に酸化され、アルデヒド誘導体
を製造し得る。
ルデヒド誘導体およびそのような誘導体の製造方法を提
供する。アクチノマイシンＤの芳香族メチル基置換体
は、以下のように選択的に酸化され、アルデヒド誘導体
を製造し得る。
【００３４】
【化５】
【００３５】本発明はまた、スルホン酸誘導体およびス
ルホン酸誘導体の製造方法を提供する。アクチノマイシ
ンＤの２つの芳香族水素原子は、クロロスルホン酸（Ｃ
ｌＳＯ3Ｈ）のような化合物と反応して、スルホン酸誘
導体を生成し得る。この反応は以下に示される。
ルホン酸誘導体の製造方法を提供する。アクチノマイシ
ンＤの２つの芳香族水素原子は、クロロスルホン酸（Ｃ
ｌＳＯ3Ｈ）のような化合物と反応して、スルホン酸誘
導体を生成し得る。この反応は以下に示される。
【００３６】
【化６】
【００３７】ここで、ＡＭＤ−Ｈは、アクチノマイシン
Ｄの２つの芳香族水素原子のいずれかを表す。
Ｄの２つの芳香族水素原子のいずれかを表す。
【００３８】本発明は、標的細胞結合性タンパクに結合
した上記のすべてのアクチノマイシン誘導体を含むアク
チノマイシンＤ複合体およびこのような複合体の製造方
法を提供する。上記のすべてのアクチノマイシンＤ誘導
体は、様々な手段によって標的細胞結合性タンパクと結
合し得る。このような結合反応は、誘導部分のようなア
クチノマイシンＤの部分で、アクチノマイシンＤの機能
に影響を及ぼさない条件下で、さらに抗原結合部位の特
異性および親和性が維持される部位において抗体上で行
われ得る。このように結合したアクチノマイシンＤ複合
体は、好ましくは、患者への投与および標的細胞位置へ
の運搬中に存在する生理学的条件に対して安定でなけれ
ばならない。アクチノマイシンＤ誘導体の標的細胞結合
性タンパクへの共有結合は、このような安定性のために
好ましい。
した上記のすべてのアクチノマイシン誘導体を含むアク
チノマイシンＤ複合体およびこのような複合体の製造方
法を提供する。上記のすべてのアクチノマイシンＤ誘導
体は、様々な手段によって標的細胞結合性タンパクと結
合し得る。このような結合反応は、誘導部分のようなア
クチノマイシンＤの部分で、アクチノマイシンＤの機能
に影響を及ぼさない条件下で、さらに抗原結合部位の特
異性および親和性が維持される部位において抗体上で行
われ得る。このように結合したアクチノマイシンＤ複合
体は、好ましくは、患者への投与および標的細胞位置へ
の運搬中に存在する生理学的条件に対して安定でなけれ
ばならない。アクチノマイシンＤ誘導体の標的細胞結合
性タンパクへの共有結合は、このような安定性のために
好ましい。
【００３９】アクチノマイシンＤのイソシアネートおよ
びチオイソシアネート誘導体の標的細胞結合性タンパク
への結合は、例えば、イソシアネート部分と、標的細胞
結合性タンパク上のヒドロキシルまたは第一アミン反応
基との反応によって成し遂げられ得る。これらの２つの
反応基のうち、第一アミンが、イソシアネートとの反応
に好ましい。イソシアネートとヒドロキシルまたは第一
アミン基との反応は、迅速に起こる傾向があるため、ア
クチノマイシンＤ複合体の効率のよい製造に効果的であ
る。
びチオイソシアネート誘導体の標的細胞結合性タンパク
への結合は、例えば、イソシアネート部分と、標的細胞
結合性タンパク上のヒドロキシルまたは第一アミン反応
基との反応によって成し遂げられ得る。これらの２つの
反応基のうち、第一アミンが、イソシアネートとの反応
に好ましい。イソシアネートとヒドロキシルまたは第一
アミン基との反応は、迅速に起こる傾向があるため、ア
クチノマイシンＤ複合体の効率のよい製造に効果的であ
る。
【００４０】同様の方法で、アクチノマイシンＤのカル
ボン酸誘導体もまた、標的細胞結合性タンパクに直接結
合され得る。これらのアクチノマイシンＤ誘導体では、
例えば、カルボン酸部分が、タンパク上の第一アミンと
結合してアクチノマイシンＤ誘導体と標的細胞結合性タ
ンパクとの間にアミド結合が形成される前に、活性化さ
れ得る。他の反応基を介したカルボン酸誘導体の結合も
また、アクチノマイシンＤ複合体を形成するのに使用さ
れ得、当業者により既知である。
ボン酸誘導体もまた、標的細胞結合性タンパクに直接結
合され得る。これらのアクチノマイシンＤ誘導体では、
例えば、カルボン酸部分が、タンパク上の第一アミンと
結合してアクチノマイシンＤ誘導体と標的細胞結合性タ
ンパクとの間にアミド結合が形成される前に、活性化さ
れ得る。他の反応基を介したカルボン酸誘導体の結合も
また、アクチノマイシンＤ複合体を形成するのに使用さ
れ得、当業者により既知である。
【００４１】同様の方法で、アクチノマイシンＤのアル
デヒドおよびスルホン酸誘導体は、標的細胞結合性タン
パクに直接結合されて、アクチノマイシンＤ複合体を製
造し得る。これらの誘導体は両方とも、例えばリジンの
第一アミン基と反応性である。アルデヒドは、シフ塩基
形成を経て結合され得、一方スルホン酸誘導体は結合前
に活性化され得る。
デヒドおよびスルホン酸誘導体は、標的細胞結合性タン
パクに直接結合されて、アクチノマイシンＤ複合体を製
造し得る。これらの誘導体は両方とも、例えばリジンの
第一アミン基と反応性である。アルデヒドは、シフ塩基
形成を経て結合され得、一方スルホン酸誘導体は結合前
に活性化され得る。
【００４２】アクチノマイシンの臭化メチレン誘導体と
のアクチノマイシンＤ複合体の形成は、スペーサーを使
用して成し遂げられ得る。スペーサーは、一端が臭化メ
チレン基のメチレン部分と反応し、他端が上記に定義し
た標的細胞結合性タンパクと結合し得るように、選択さ
れなければならない。一端に臭化メチレンと反応するた
めの芳香族酸素原子を、他端にカルボン酸を含む、４−
カルボキシーナトリウム−フェノレート（ＮａＯ−Ａｒ
−ＣＯＯＨ）のようなスペーサーは、その１つの例であ
る。
のアクチノマイシンＤ複合体の形成は、スペーサーを使
用して成し遂げられ得る。スペーサーは、一端が臭化メ
チレン基のメチレン部分と反応し、他端が上記に定義し
た標的細胞結合性タンパクと結合し得るように、選択さ
れなければならない。一端に臭化メチレンと反応するた
めの芳香族酸素原子を、他端にカルボン酸を含む、４−
カルボキシーナトリウム−フェノレート（ＮａＯ−Ａｒ
−ＣＯＯＨ）のようなスペーサーは、その１つの例であ
る。
【００４３】スペーサーのカルボン酸部分を含む末端
は、アクチノマイシンＤの臭化メチレン誘導体に結合し
た後、自由のまま残り、標的細胞結合性タンパクへの結
合に利用できる。あるいは、まず、スペーサーは、標的
細胞結合性タンパクに結合され、次いでアクチノマイシ
ンＤの臭化メチレン誘導体に結合され得る。カルボン酸
部分以外の反応基もまた、スペーサーの自由端に使用さ
れ得る。例えば、第一アミンは、スペーサーの自由端を
標的細胞結合性タンパクに結合して、アクチノマイシン
Ｄ複合体を形成するのに使用され得る。
は、アクチノマイシンＤの臭化メチレン誘導体に結合し
た後、自由のまま残り、標的細胞結合性タンパクへの結
合に利用できる。あるいは、まず、スペーサーは、標的
細胞結合性タンパクに結合され、次いでアクチノマイシ
ンＤの臭化メチレン誘導体に結合され得る。カルボン酸
部分以外の反応基もまた、スペーサーの自由端に使用さ
れ得る。例えば、第一アミンは、スペーサーの自由端を
標的細胞結合性タンパクに結合して、アクチノマイシン
Ｄ複合体を形成するのに使用され得る。
【００４４】本発明はまた、アクチノマイシンＤのイソ
シアネート、チオイソシアネート、カルボン酸、アルデ
ヒドおよびアクチノマイシンＤのスルホン酸誘導体との
アクチノマイシンＤ複合体を製造するためのスペーサー
の使用を提供する。スペーサー分子は、標的細胞結合性
タンパクに結合されるアクチノマイシンＤ誘導体に依存
して様々なタイプのものであり得る。好ましい特徴は、
スペーサーが、結合される特異的な誘導体に適切な反応
基を含むことである。例えば、イソシアネートまたはチ
オイソシアネート誘導体との複合体を形成するために、
スペーサーは、一端に誘導体のイソシアネートまたはチ
オイソシアネート部分を介した結合のためのヒドロキシ
ル、またはさらに好ましくは第一アミンを含まなければ
ならない。他端は、例えば、標的細胞結合性タンパクへ
の結合のためのカルボン酸を含み得る。
シアネート、チオイソシアネート、カルボン酸、アルデ
ヒドおよびアクチノマイシンＤのスルホン酸誘導体との
アクチノマイシンＤ複合体を製造するためのスペーサー
の使用を提供する。スペーサー分子は、標的細胞結合性
タンパクに結合されるアクチノマイシンＤ誘導体に依存
して様々なタイプのものであり得る。好ましい特徴は、
スペーサーが、結合される特異的な誘導体に適切な反応
基を含むことである。例えば、イソシアネートまたはチ
オイソシアネート誘導体との複合体を形成するために、
スペーサーは、一端に誘導体のイソシアネートまたはチ
オイソシアネート部分を介した結合のためのヒドロキシ
ル、またはさらに好ましくは第一アミンを含まなければ
ならない。他端は、例えば、標的細胞結合性タンパクへ
の結合のためのカルボン酸を含み得る。
【００４５】同様に、スペーサーは、一端が第一アミン
のようにカルボン酸部分と反応し得、他端が標的細胞結
合性タンパクと結合し得る限りにおいて、アクチノマイ
シンＤのカルボン酸誘導体に使用され得る。アクチノマ
イシンＤのカルボン酸誘導体のヘテロ二価性スペーサー
の他の例には、アミノカルボン酸、メルカプトカルボン
酸およびヒドロキシカルボン酸が含まれる。これらのス
ペーサーは、それぞれ尿素、チオウレタンまたはウレタ
ンスペーサー基の各々を有する中間体を生じる。このよ
うなスペーサーの末端カルボン酸部分は、活性化されて
例えば標的細胞結合性タンパクのリジン部分とのアミド
結合を形成し得る。アルデヒドおよびスルホン酸誘導体
は、同様にスペーサーの適切な反応基を介して結合され
得る。アルデヒドおよびスルホン酸誘導体を標的細胞結
合性タンパクに直接結合させるための、上記に類似した
反応は、例えばスペーサーに次いで標的細胞結合性タン
パクに結合するために使用され得る。
のようにカルボン酸部分と反応し得、他端が標的細胞結
合性タンパクと結合し得る限りにおいて、アクチノマイ
シンＤのカルボン酸誘導体に使用され得る。アクチノマ
イシンＤのカルボン酸誘導体のヘテロ二価性スペーサー
の他の例には、アミノカルボン酸、メルカプトカルボン
酸およびヒドロキシカルボン酸が含まれる。これらのス
ペーサーは、それぞれ尿素、チオウレタンまたはウレタ
ンスペーサー基の各々を有する中間体を生じる。このよ
うなスペーサーの末端カルボン酸部分は、活性化されて
例えば標的細胞結合性タンパクのリジン部分とのアミド
結合を形成し得る。アルデヒドおよびスルホン酸誘導体
は、同様にスペーサーの適切な反応基を介して結合され
得る。アルデヒドおよびスルホン酸誘導体を標的細胞結
合性タンパクに直接結合させるための、上記に類似した
反応は、例えばスペーサーに次いで標的細胞結合性タン
パクに結合するために使用され得る。
【００４６】アクチノマイシンＤ誘導体を標的細胞結合
タンパクに結合するために用いられる反応の順序は、使
用される結合の特異的化学によって決定され、最初にリ
ンカーをアクチノマイシンＤ誘導体に結合させて、最後
に標的細胞結合性タンパクに結合させる順序か、または
まずリンカーを標的細胞結合性タンパクに結合させて、
次いでアクチノマイシンＤ誘導体に結合させる順序かの
いずれかに従う。化学および上記の結合反応順序は、当
業者により既知であり、M. J. EmbletonおよびM.C. Gar
nett, Monoclonal Antibody for Cancer Detection and
Therapy, Academic Press 16:317-343 (1985); Ghose
ら、Methods of Enzymology, Academic Press 93:280-3
38 (1983); H. Tae, Bifunctional Reagents, Methods
Enz. 91:580(1983)において記載されている。これら
は、本願で参考文献として取り入れている。
タンパクに結合するために用いられる反応の順序は、使
用される結合の特異的化学によって決定され、最初にリ
ンカーをアクチノマイシンＤ誘導体に結合させて、最後
に標的細胞結合性タンパクに結合させる順序か、または
まずリンカーを標的細胞結合性タンパクに結合させて、
次いでアクチノマイシンＤ誘導体に結合させる順序かの
いずれかに従う。化学および上記の結合反応順序は、当
業者により既知であり、M. J. EmbletonおよびM.C. Gar
nett, Monoclonal Antibody for Cancer Detection and
Therapy, Academic Press 16:317-343 (1985); Ghose
ら、Methods of Enzymology, Academic Press 93:280-3
38 (1983); H. Tae, Bifunctional Reagents, Methods
Enz. 91:580(1983)において記載されている。これら
は、本願で参考文献として取り入れている。
【００４７】アクチノマイシンＤは、ＤＮＡ分子に作用
することによって動作するため、ＤＮＡを含む標的細胞
上の分子の選択的な任意の標的細胞結合性タンパクに結
合し得る。このような分子は、例えば、ウイルスまたは
バクテリア抗原を含み得る。アクチノマイシンＤの誘導
体は、例えば、所望の標的特異性をもつ任意の抗体また
は抗体断片に結合するように調製され得る。アクチノマ
イシンＤ誘導体はまた、ホルモン、成長因子および様々
なタイプの細胞表面結合タンパクのような他のタイプの
標的細胞結合性タンパクと結合するように調製され得
る。これらのタイプタンパクはすべて、特異的な標的細
胞分子に対して結合特異性を示す。
することによって動作するため、ＤＮＡを含む標的細胞
上の分子の選択的な任意の標的細胞結合性タンパクに結
合し得る。このような分子は、例えば、ウイルスまたは
バクテリア抗原を含み得る。アクチノマイシンＤの誘導
体は、例えば、所望の標的特異性をもつ任意の抗体また
は抗体断片に結合するように調製され得る。アクチノマ
イシンＤ誘導体はまた、ホルモン、成長因子および様々
なタイプの細胞表面結合タンパクのような他のタイプの
標的細胞結合性タンパクと結合するように調製され得
る。これらのタイプタンパクはすべて、特異的な標的細
胞分子に対して結合特異性を示す。
【００４８】本発明のアクチノマイシンＤ複合体は、標
的細胞に細胞障害効果を生じるのに使用され得る。例え
ば、アクチノマイシンＤ誘導体を所望のＴ細胞またはＢ
細胞の集団に対して結合特異性を示す標的細胞結合性タ
ンパクに結合させることによって、生物体中のＴ細胞ま
たはＢ細胞のような特定の細胞集団を破壊するために、
アクチノマイシンＤ複合体を使用することが可能であ
る。同様の方法で、標的細胞結合性タンパクが汚染の細
胞型に対して結合特異性を有するアクチノマイシンＤ複
合体で培養物を処理することによって、培養物中の汚染
細胞群から特定の細胞型を精製することが可能である。
従って、本発明は、標的細胞に選択的結合を示すアクチ
ノマイシンＤ複合体の有効量を標的細胞に投与すること
によって標的細胞に細胞障害効果を生じさせる方法を提
供する。複合体は、薬学上受け入れられるキャリアと組
み合わせることが可能である。
的細胞に細胞障害効果を生じるのに使用され得る。例え
ば、アクチノマイシンＤ誘導体を所望のＴ細胞またはＢ
細胞の集団に対して結合特異性を示す標的細胞結合性タ
ンパクに結合させることによって、生物体中のＴ細胞ま
たはＢ細胞のような特定の細胞集団を破壊するために、
アクチノマイシンＤ複合体を使用することが可能であ
る。同様の方法で、標的細胞結合性タンパクが汚染の細
胞型に対して結合特異性を有するアクチノマイシンＤ複
合体で培養物を処理することによって、培養物中の汚染
細胞群から特定の細胞型を精製することが可能である。
従って、本発明は、標的細胞に選択的結合を示すアクチ
ノマイシンＤ複合体の有効量を標的細胞に投与すること
によって標的細胞に細胞障害効果を生じさせる方法を提
供する。複合体は、薬学上受け入れられるキャリアと組
み合わせることが可能である。
【００４９】
【実施例】以下の実施例は、本発明を説明するためのも
のであり、限定するものではない。
のであり、限定するものではない。
【００５０】（実施例Ｉ） 塩化オキサリルとアクチノマイシンＤとの反応 １０ｍｌの丸底のフラスコにおいて、１０ｍｇのアクチ
ノマイシンＤを１ｍｌ酢酸ブチルに溶解し、次いで１ｍ
ｌクロロベンゼンを加えた。赤に変色した溶液を、２０
μｌの塩化オキサリルを加えながら、攪拌した。ガスが
激しく発生し、溶液は暗い赤色に変色した。フラスコを
０．１時間加熱し、次いでさらに２０μｌの塩化オキサ
リルを加えた。色は、暗い血液の赤色から淡い黄色へと
変色した。混合物を暖め、１８時間攪拌した。２０μｌ
のサンプルを取り出し、ＮａＣｌディスク上においた。
溶剤を蒸発させ、赤外分光分析（ＩＲ）を行った。ピー
クは、新たに形成されたアクチノマイシンＤのイソシア
ネート誘導体のＮＣＯ基に対応する２３６０および２３
４１において観察された。
ノマイシンＤを１ｍｌ酢酸ブチルに溶解し、次いで１ｍ
ｌクロロベンゼンを加えた。赤に変色した溶液を、２０
μｌの塩化オキサリルを加えながら、攪拌した。ガスが
激しく発生し、溶液は暗い赤色に変色した。フラスコを
０．１時間加熱し、次いでさらに２０μｌの塩化オキサ
リルを加えた。色は、暗い血液の赤色から淡い黄色へと
変色した。混合物を暖め、１８時間攪拌した。２０μｌ
のサンプルを取り出し、ＮａＣｌディスク上においた。
溶剤を蒸発させ、赤外分光分析（ＩＲ）を行った。ピー
クは、新たに形成されたアクチノマイシンＤのイソシア
ネート誘導体のＮＣＯ基に対応する２３６０および２３
４１において観察された。
【００５１】真空蒸留後の残留物は、黄色い個体であっ
た。
た。
【００５２】アクチノマイシンＤの初期溶剤として酢酸
エチルおよび加熱を使用して、上記の反応を繰り返し
た。生成物を蒸発させ、酢酸ジメチル中に再溶解させた
（ＤＭＡｃ）（１０ｍｇ／３００μｌ）。
エチルおよび加熱を使用して、上記の反応を繰り返し
た。生成物を蒸発させ、酢酸ジメチル中に再溶解させた
（ＤＭＡｃ）（１０ｍｇ／３００μｌ）。
【００５３】（実施例ＩＩ） アクチノマイシンＤ−塩化オキサリル誘導体と抗体との
反応 実施例Ｉに示されるように調製したアクチノマイシンＤ
のイソシアネート誘導体（１０ｍｇ／５００μｌ、２ｍ
ｇのアクチノマイシンＤ）を含有する１００μｌのＤＭ
Ａｃ溶液を使用して、モノクローナル抗体９．２．２
７，１ｍｌ（６ｍｇ）を反応させた。製造業者によって
推薦されるように、複合体混合物をＰＤ−１０カラム
（Pharmacia, Piscataway, NJ）上でゲル濾過した。
反応 実施例Ｉに示されるように調製したアクチノマイシンＤ
のイソシアネート誘導体（１０ｍｇ／５００μｌ、２ｍ
ｇのアクチノマイシンＤ）を含有する１００μｌのＤＭ
Ａｃ溶液を使用して、モノクローナル抗体９．２．２
７，１ｍｌ（６ｍｇ）を反応させた。製造業者によって
推薦されるように、複合体混合物をＰＤ−１０カラム
（Pharmacia, Piscataway, NJ）上でゲル濾過した。
【００５４】ゲル濾過後、このサンプルの半分０．５ｍ
ｌを３ｍｇのカルボジイミドと反応させ、ｐＨを６．７
まで下げた。反応を２時間続け、この物質を再びＰＤ−
１０カラム上でゲル濾過した。
ｌを３ｍｇのカルボジイミドと反応させ、ｐＨを６．７
まで下げた。反応を２時間続け、この物質を再びＰＤ−
１０カラム上でゲル濾過した。
【００５５】得られた複合体を分析し、抗体に対するア
クチノマイシンＤのモル比を、εアク チノマイシンD＝６．５×
１０6、ＯＤ437 nm（光学密度）アクチノマイシンＤ＝
０．３７１，１０：１希釈；抗体濃度５ｍｇ／ｍｌ、Ｍ
Ｗ（分子量）１５５，０００ｇ／モルに基づいて測定し
たところ１７であった。
クチノマイシンＤのモル比を、εアク チノマイシンD＝６．５×
１０6、ＯＤ437 nm（光学密度）アクチノマイシンＤ＝
０．３７１，１０：１希釈；抗体濃度５ｍｇ／ｍｌ、Ｍ
Ｗ（分子量）１５５，０００ｇ／モルに基づいて測定し
たところ１７であった。
【００５６】（実施例ＩＩＩ） アクチノマイシンＤのメチル基臭化 Ｎ−ブロモスクシニミド（ＮＢＳ）による臭化は、クロ
ロベンゼン中の２．２４ミリモルのアクチノマイシンＤ
を２ミリモルのＮＢＳおよび少量の過酸化ジベンゾイル
に加えることによって成し遂げられる。混合物を８０℃
に加熱し、６時間反応させる。ＡＭＤ−ＣＨ2Ｂｒの収
率は、７０から８０％である。次いで、臭化誘導体をア
ミノカプロン酸とさらに反応させて、ＡＭＤ−アミノカ
プロン酸複合体（ＡＭＤ−ＣＨ2ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯＯ
Ｈ）を生産する。
ロベンゼン中の２．２４ミリモルのアクチノマイシンＤ
を２ミリモルのＮＢＳおよび少量の過酸化ジベンゾイル
に加えることによって成し遂げられる。混合物を８０℃
に加熱し、６時間反応させる。ＡＭＤ−ＣＨ2Ｂｒの収
率は、７０から８０％である。次いで、臭化誘導体をア
ミノカプロン酸とさらに反応させて、ＡＭＤ−アミノカ
プロン酸複合体（ＡＭＤ−ＣＨ2ＮＨ（ＣＨ2）5ＣＯＯ
Ｈ）を生産する。
【００５７】（実施例ＩＶ） アクチノマイシンＤのメチル基の酸化 等モル量のアクチノマイシンＤと５０％の水性酢酸中の
第二セリウム硝酸アンモニウムを６０℃で２４時間加熱
して、収率６０％でアルデヒド誘導体を成生する。抗体
に対するアルデヒド誘導体の結合は、ｐＨ９．５のアル
デヒド誘導体と８ｍｇの抗体に２０μｌの２００ｍＭ炭
酸緩衝液を加えることによって、リジン基を介して行わ
れる。混合物を室温で２時間攪拌する。次いで、０．１
μｌのホウ化水素ナトリウム（４μｇ／μｌの水中）を
加え、４℃で２時間インキュベートする。
第二セリウム硝酸アンモニウムを６０℃で２４時間加熱
して、収率６０％でアルデヒド誘導体を成生する。抗体
に対するアルデヒド誘導体の結合は、ｐＨ９．５のアル
デヒド誘導体と８ｍｇの抗体に２０μｌの２００ｍＭ炭
酸緩衝液を加えることによって、リジン基を介して行わ
れる。混合物を室温で２時間攪拌する。次いで、０．１
μｌのホウ化水素ナトリウム（４μｇ／μｌの水中）を
加え、４℃で２時間インキュベートする。
【００５８】（実施例Ｖ） アクチノマイシンＤのスルホン酸誘導体 ジメチルホルムアミド（ＤＭＦ）中のアクチノマイシン
Ｄの溶液を０℃に冷却し、塩化メチレン中の等モル量の
クロロスルホン酸を滴下する。この反応混合物を室温に
暖め、すべてのＨＣｌが除去されスルホン酸誘導体が得
られるまで窒素でパージする。
Ｄの溶液を０℃に冷却し、塩化メチレン中の等モル量の
クロロスルホン酸を滴下する。この反応混合物を室温に
暖め、すべてのＨＣｌが除去されスルホン酸誘導体が得
られるまで窒素でパージする。
【００５９】（実施例ＶＩ） アクチノマイシンＤ複合体の免疫反応 アクチノマイシンＤ複合体が結合活性および抗原特異性
を保持しているかどうかを評価するために、標的および
非標的細胞系においてＥＬＩＳＡを行う。標的細胞系
は、アクチノマイシンＤ誘導体に結合された標的細胞結
合性タンパクによって特異的に認識される抗原を発現し
ている。非標的細胞系は、このような抗原を発現してい
ない。
を保持しているかどうかを評価するために、標的および
非標的細胞系においてＥＬＩＳＡを行う。標的細胞系
は、アクチノマイシンＤ誘導体に結合された標的細胞結
合性タンパクによって特異的に認識される抗原を発現し
ている。非標的細胞系は、このような抗原を発現してい
ない。
【００６０】対数増殖期にある適切な細胞系を、１ｍＭ
のＥＤＴＡを使用して収穫する。１０００×ｇで細胞を
遠心分離にかけ、１×ＰＢＳで２回すすぐ。細胞ペレッ
トを１×ＰＢＳで再懸濁し、１×１０6細胞／ｍｌに等
しいボリュームにする。１２チャンネルミクロピペッタ
ーを使用して、細胞を５×１０4細胞／ウェルとなるよ
うに５０μｌ／ウェルのボリュームで柔軟な９６ウェル
プレート中にまく。ウェルが完全に乾燥するまで、９６
ウェルプレートを乾燥した３７℃インキュベーター中に
３から５日間置く。特異的なアッセイに使用する前に、
プレートを精製したモノクローナル抗体標準で試験す
る。
のＥＤＴＡを使用して収穫する。１０００×ｇで細胞を
遠心分離にかけ、１×ＰＢＳで２回すすぐ。細胞ペレッ
トを１×ＰＢＳで再懸濁し、１×１０6細胞／ｍｌに等
しいボリュームにする。１２チャンネルミクロピペッタ
ーを使用して、細胞を５×１０4細胞／ウェルとなるよ
うに５０μｌ／ウェルのボリュームで柔軟な９６ウェル
プレート中にまく。ウェルが完全に乾燥するまで、９６
ウェルプレートを乾燥した３７℃インキュベーター中に
３から５日間置く。特異的なアッセイに使用する前に、
プレートを精製したモノクローナル抗体標準で試験す
る。
【００６１】上記のように調製した乾燥細胞プレート
（標的および非標的細胞）を、ＰＢＳ中の０．５％のＢ
ＳＡ（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌでコートす
る。プレートを攪拌器に室温で１時間置き、次いで以下
の方法で０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄する。最初の
洗浄で、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌ加え、
すばやく払いおとし、teriタオルでたたきつけて乾燥す
る。残りの洗浄で、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳを３００
μｌ加え、はじいて乾燥させる。前に室温で３から５分
間インキュベートさせてから最後の洗浄に次いで、プレ
ートをteriタオルでたたきつけて乾燥する。
（標的および非標的細胞）を、ＰＢＳ中の０．５％のＢ
ＳＡ（０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ）２００μｌでコートす
る。プレートを攪拌器に室温で１時間置き、次いで以下
の方法で０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳで洗浄する。最初の
洗浄で、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳを３００μｌ加え、
すばやく払いおとし、teriタオルでたたきつけて乾燥す
る。残りの洗浄で、０．５％のＢＳＡ／ＰＢＳを３００
μｌ加え、はじいて乾燥させる。前に室温で３から５分
間インキュベートさせてから最後の洗浄に次いで、プレ
ートをteriタオルでたたきつけて乾燥する。
【００６２】上記のように調製し洗浄したプレートに、
標準およびサンプルを１０μｇ／ｍｌから始めて１ｐｇ
／ｍｌまで連続的に希釈されるように、１００μｌ体積
／ウェルで加える。サンプルを０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で希釈し、攪拌しながら室温で１時間インキュベートし
た。インキュベーション後、プレートを上記のように洗
浄し、１００μｌ／ウェルの第二抗体（ホースラディッ
シュペロキサイドに結合したヤギ抗マウス）（BioRad L
aboratories, Richmond, CA）を０．５％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ中で１：４０００希釈して加える。抗体を室温で攪拌
しながら３０分間結合させた。プレートを上記のように
再び洗浄し、１００μｌ／ウェルのＯＰＤ／Ｐｈｏｓ−
クエン酸緩衝液（４０ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液、
１２ｍｇのＯ−フェニレン−ジアミン、６μｌのＨ
2Ｏ2）を加えることによって攪拌しながら、ペルオキシ
ダーゼ染色を５から２０分間行う。反応は、５０μｌ／
ウェルの４Ｎ硫酸を加えることによってクエンチングさ
せ、titertek Multiskan MCC/340 ELISAリーダーで４９
０ｎｍで読む。
標準およびサンプルを１０μｇ／ｍｌから始めて１ｐｇ
／ｍｌまで連続的に希釈されるように、１００μｌ体積
／ウェルで加える。サンプルを０．５％ＢＳＡ／ＰＢＳ
で希釈し、攪拌しながら室温で１時間インキュベートし
た。インキュベーション後、プレートを上記のように洗
浄し、１００μｌ／ウェルの第二抗体（ホースラディッ
シュペロキサイドに結合したヤギ抗マウス）（BioRad L
aboratories, Richmond, CA）を０．５％ＢＳＡ／ＰＢ
Ｓ中で１：４０００希釈して加える。抗体を室温で攪拌
しながら３０分間結合させた。プレートを上記のように
再び洗浄し、１００μｌ／ウェルのＯＰＤ／Ｐｈｏｓ−
クエン酸緩衝液（４０ｍｌのリン酸−クエン酸緩衝液、
１２ｍｇのＯ−フェニレン−ジアミン、６μｌのＨ
2Ｏ2）を加えることによって攪拌しながら、ペルオキシ
ダーゼ染色を５から２０分間行う。反応は、５０μｌ／
ウェルの４Ｎ硫酸を加えることによってクエンチングさ
せ、titertek Multiskan MCC/340 ELISAリーダーで４９
０ｎｍで読む。
【００６３】（実施例ＶＩＩ） インビトロにおけるアクチノマイシンＤ複合体の細胞毒
性 アクチノマイシンＤ複合体で処理した後に生存し分裂す
る細胞の尺度として、ＤＮＡへのチミジン取り込みを使
用した。
性 アクチノマイシンＤ複合体で処理した後に生存し分裂す
る細胞の尺度として、ＤＮＡへのチミジン取り込みを使
用した。
【００６４】実施例ＩＩで調製した複合体のインビトロ
における細胞毒性を以下のようにして評価した。９６ウ
ェルプレートの各ウェルにおいて、１０％のＣＯ2を用
いて３７℃で１０4Ｍ２１−ＵＣＬＡメラノーマ細胞を
増殖させた。この細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ１６４
０（GIBCO, Grand Island, NY）および１０％の胎児ウ
シ血清（ＦＢＳ）中で増殖させた。２４時間後培地を除
去し、濃度が１０-12から１０-5Mの免疫複合体である１
００μｌのＲＰＭＩ１６４０で置き換えた。２４時間の
インキュベーション後、１μＣｉ／ウェルの3Ｈ−チミ
ジンを加えてＤＮＡ合成を測定した。細胞を２４時間標
識し、次いで、プレートを−７０℃で衝撃凍結し、３７
℃で解凍し、製造業者によって推薦されるようにＰＨＤ
細胞収穫器（Cambridge Technology, Inc., Cambridge,
MA）を使用して細胞を収穫した。収集したサンプルの
フィルターを４ｍｌのEcolune scint（ICN Biomedical
s, Costa Mesa, CA）中に置き、Beckman液体シンチレー
ションカウンター（Beckman, Carlsbad, CA）中に置い
た。インビトロにおけるアッセイの結果は、抗体アクチ
ノマイシンＤ複合体の高い細胞毒性のレベルを示した。
における細胞毒性を以下のようにして評価した。９６ウ
ェルプレートの各ウェルにおいて、１０％のＣＯ2を用
いて３７℃で１０4Ｍ２１−ＵＣＬＡメラノーマ細胞を
増殖させた。この細胞を、１００μｌのＲＰＭＩ１６４
０（GIBCO, Grand Island, NY）および１０％の胎児ウ
シ血清（ＦＢＳ）中で増殖させた。２４時間後培地を除
去し、濃度が１０-12から１０-5Mの免疫複合体である１
００μｌのＲＰＭＩ１６４０で置き換えた。２４時間の
インキュベーション後、１μＣｉ／ウェルの3Ｈ−チミ
ジンを加えてＤＮＡ合成を測定した。細胞を２４時間標
識し、次いで、プレートを−７０℃で衝撃凍結し、３７
℃で解凍し、製造業者によって推薦されるようにＰＨＤ
細胞収穫器（Cambridge Technology, Inc., Cambridge,
MA）を使用して細胞を収穫した。収集したサンプルの
フィルターを４ｍｌのEcolune scint（ICN Biomedical
s, Costa Mesa, CA）中に置き、Beckman液体シンチレー
ションカウンター（Beckman, Carlsbad, CA）中に置い
た。インビトロにおけるアッセイの結果は、抗体アクチ
ノマイシンＤ複合体の高い細胞毒性のレベルを示した。
【００６５】（実施例ＶＩＩＩ） 複合体のヨウ素化 実施例ＩＩに記載されるように調製した免疫複合体を、
Pierce（Pierce, Rockford, IL）から入手したIodoGen
を使用してヨウ素化した。２ｍｇのIodoGenを４．７ｍ
ｌのクロロホルム中に溶解し、１２０と２４０μｌの間
のこの溶液をヨウ素化のためにポリスチレン試験管に分
注した。試験管を氷の上に置き、１００μｌ中の５０と
５００μｇの間のアクチノマイシンＤ複合体を加えた。
Ｎａ125Ｉを０．５から１．０μＣｉに加え混合した。
この混合物をゆるやかに攪拌しながら氷上で２５分間イ
ンキュベートした。未反応の125Ｉを、ＰＤ１０カラム
（Pharmacia Pleasant Hill, CA）を使用してＰＢＳ中
でのゲル濾過によって、標識されたアクチノマイシンＤ
複合体から除去した。
Pierce（Pierce, Rockford, IL）から入手したIodoGen
を使用してヨウ素化した。２ｍｇのIodoGenを４．７ｍ
ｌのクロロホルム中に溶解し、１２０と２４０μｌの間
のこの溶液をヨウ素化のためにポリスチレン試験管に分
注した。試験管を氷の上に置き、１００μｌ中の５０と
５００μｇの間のアクチノマイシンＤ複合体を加えた。
Ｎａ125Ｉを０．５から１．０μＣｉに加え混合した。
この混合物をゆるやかに攪拌しながら氷上で２５分間イ
ンキュベートした。未反応の125Ｉを、ＰＤ１０カラム
（Pharmacia Pleasant Hill, CA）を使用してＰＢＳ中
でのゲル濾過によって、標識されたアクチノマイシンＤ
複合体から除去した。
【００６６】（実施例ＩＸ） インビボにおける複合体の結合 実施例ＩＩからの抗体−アクチノマイシンＤ複合体のイ
ンビボにおける結合特異性および親和性を評価した。胸
腺欠損ＢＡＬＢｃ（ヌード／ヌード）マウスに２×１０
6Ｍ２１−ＵＣＬＡメラノーマ細胞を皮下注射した。２
週間後、実施例ＶＩＩＩに記載のように調製した３μＣ
ｉの125Ｉ免疫複合体を尾部静脈に投与した。４８およ
び１６８時間後、動物を殺し、個々の器官の放射能をシ
ンチレーションカウンティングによって決定した。その
結果を図２に示し、１グラムの組織当りの投与放射能の
百分率として示した。４８時間後のサンプルは、４つの
動物の平均から決定した。１６８時間後のサンプルは、
３つの動物の平均から決定した。示される組織は、ＢＬ
血液、ＴＡ尾部、ＴＵ腫瘍、ＨＥ心臓、ＳＫ皮膚、ＭＵ
筋肉、ＢＯ骨、ＬＵ肺、ＬＩ肝臓、ＳＰ脾臓、ＳＴ胃、
ＴＨ甲状腺、ＫＩ腎臓、ＩＮ腸である。
ンビボにおける結合特異性および親和性を評価した。胸
腺欠損ＢＡＬＢｃ（ヌード／ヌード）マウスに２×１０
6Ｍ２１−ＵＣＬＡメラノーマ細胞を皮下注射した。２
週間後、実施例ＶＩＩＩに記載のように調製した３μＣ
ｉの125Ｉ免疫複合体を尾部静脈に投与した。４８およ
び１６８時間後、動物を殺し、個々の器官の放射能をシ
ンチレーションカウンティングによって決定した。その
結果を図２に示し、１グラムの組織当りの投与放射能の
百分率として示した。４８時間後のサンプルは、４つの
動物の平均から決定した。１６８時間後のサンプルは、
３つの動物の平均から決定した。示される組織は、ＢＬ
血液、ＴＡ尾部、ＴＵ腫瘍、ＨＥ心臓、ＳＫ皮膚、ＭＵ
筋肉、ＢＯ骨、ＬＵ肺、ＬＩ肝臓、ＳＰ脾臓、ＳＴ胃、
ＴＨ甲状腺、ＫＩ腎臓、ＩＮ腸である。
【００６７】腫瘍をもつヌードマウスから得られたイン
ビボにおける生体分布データは、複合体が高度な結合特
異性および親和性を有していることを示した。さらに、
データは、肝臓、腎臓、脾臓および腸において発見され
る比較的低レベルの複合体によって示されるように、す
べての非結合複合体が、体から除去されていることを示
した。
ビボにおける生体分布データは、複合体が高度な結合特
異性および親和性を有していることを示した。さらに、
データは、肝臓、腎臓、脾臓および腸において発見され
る比較的低レベルの複合体によって示されるように、す
べての非結合複合体が、体から除去されていることを示
した。
【００６８】本発明は、現在好ましい実施態様を参照し
て記載されているが、本発明の精神を逸脱しないような
様々な改変が可能であることが理解されなければならな
い。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
て記載されているが、本発明の精神を逸脱しないような
様々な改変が可能であることが理解されなければならな
い。従って、本発明は、請求の範囲によってのみ限定さ
れる。
【００６９】
【発明の効果】標的細胞結合性タンパクに結合されて複
合体を形成するアクチノマイシンＤ誘導体が提供され
る。複合体は動物に投与され、標的細胞に特異的に結合
して細胞障害作用を生じ得る。
合体を形成するアクチノマイシンＤ誘導体が提供され
る。複合体は動物に投与され、標的細胞に特異的に結合
して細胞障害作用を生じ得る。
【図１】ＡはアクチノマイシンＤの構造を示す図であ
る。Ｂは芳香族成分上のＲ1からＲ5として示される改変
され得るアクチノマイシンＤの部分の位置を示す図であ
る。
る。Ｂは芳香族成分上のＲ1からＲ5として示される改変
され得るアクチノマイシンＤの部分の位置を示す図であ
る。
【図２】125Ｉで標識されたアクチノマイシンＤ複合体
のインビボでの結合および分布を示す図である。示され
る組織は、ＢＬ血液、ＴＡ尾部、ＴＵ腫瘍、ＨＥ心臓、
ＳＫ皮膚、ＭＵ筋肉、ＢＯ骨、ＬＵ肺、ＬＩ肝臓、ＳＰ
脾臓、ＳＴ胃、ＴＨ甲状腺、ＫＩ肝臓、およびＩＮ腸で
ある。
のインビボでの結合および分布を示す図である。示され
る組織は、ＢＬ血液、ＴＡ尾部、ＴＵ腫瘍、ＨＥ心臓、
ＳＫ皮膚、ＭＵ筋肉、ＢＯ骨、ＬＵ肺、ＬＩ肝臓、ＳＰ
脾臓、ＳＴ胃、ＴＨ甲状腺、ＫＩ肝臓、およびＩＮ腸で
ある。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.5 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｋ 99:00
Claims (23)
- 【請求項１】以下の式で表されるアクチノマイシンＤ誘
導体であって、 【化１】 ここで、Ｒ1は、ＮＣＯ、ＮＨ2、ＮＨＣＨ2ＣＯ2Ｈまた
はＮＨＣＯＲＸであり、Ｒは炭化水素ならびにＸは、Ｎ
ＣＯ、ＣＯ2ＨおよびＮＣＳからなる群から選択され、 Ｒ2およびＲ3は、ＣＨ3、ＣＨ2ＢｒまたＣＨＯであり、 Ｒ4およびＲ5は、ＨまたはＳＯ3Ｈであり、但しＲ1、Ｒ
2、Ｒ3、Ｒ4およびＲ5における基の組合せは図１Ａに示
されるアクチノマイシンＤを生じない、アクチノマイシ
ンＤ誘導体。 - 【請求項２】前記アクチノマイシンＤ誘導体が、誘導さ
れた部分を介して標的細胞結合性タンパクと結合する、
請求項１に記載の組成物。 - 【請求項３】前記標的細胞結合性タンパクが、抗体、ホ
ルモン、成長因子および細胞表面結合タンパクまたはそ
れらの機能的断片からなる群から選択される、請求項２
に記載の組成物。 - 【請求項４】前記アクチノマイシンＤ誘導体が、誘導さ
れた部分を介してスペーサーに結合した、請求項１に記
載の組成物。 - 【請求項５】前記アクチノマイシンＤ誘導体が、スペー
サーを介して標的細胞結合性タンパクに結合し、該結合
がアクチノマイシンＤ上の誘導された部分を介する、請
求項１に記載の組成物。 - 【請求項６】前記標的細胞結合性タンパクが、抗体、ホ
ルモン、成長因子および細胞表面結合タンパクまたはそ
れらの機能的断片からなる群から選択される、請求項５
に記載の組成物。 - 【請求項７】イソシアネート誘導体を形成し、一酸化炭
素および塩化水素を放出するのに十分な温度で、塩化オ
キサリルをアクチノマイシンＤに結合させることを含
む、アクチノマイシンＤのイソシアネート誘導体の製造
方法。 - 【請求項８】カルボン酸誘導体を形成し、臭化水素を放
出するのに十分な温度で、アクチノマイシンＤをブロモ
酢酸で処理することを含む、アクチノマイシンＤのカル
ボン酸誘導体の製造方法。 - 【請求項９】アクチノマイシンＤの臭化メチレン誘導体
の製造方法であって、 （ａ）アクチノマイシンＤを臭素またはブロモトリフロ
ロメタンと結合させて混合物を形成する工程；および （ｂ）該混合物を紫外線で処理する工程、を含む、方
法。 - 【請求項１０】臭化メチレン誘導体を形成し、スクシニ
ミドを放出するのに十分な温度でアクチノマイシンＤを
Ｎ−ブロモスクシニミドに結合させることを含む、アク
チノマイシンＤの臭化メチレン誘導体の製造方法。 - 【請求項１１】Ｒが炭化水素、Ｘがイソシアネート、カ
ルボン酸およびチオイソシアネートからなる群から選択
される、構造Ｃｌ−ＣＯ−Ｒ−Ｘを含む酸塩化物とアク
チノマイシンＤを、誘導体を形成し、塩化水素を放出す
るのに十分な温度で結合させることを含む、イソシアネ
ート、カルボン酸およびチオイソシアネートからなる群
から選択されるアクチノマイシンＤ誘導体の製造方法。 - 【請求項１２】アルデヒド誘導体を形成するのに十分な
温度で、酸化剤を用いてアクチノマイシンＤを処理する
ことを含む、アクチノマイシンＤのアルデヒド誘導体の
製造方法。 - 【請求項１３】誘導体を形成するのに十分な温度でクロ
ロ−スルホン酸を用いてアクチノマイシンＤを処理する
ことを含む、アクチノマイシンＤのスルホン酸誘導体の
製造方法。 - 【請求項１４】標的細胞結合性タンパクを、イソシアネ
ート、カルボン酸、チオイソシアネート、臭化メチレ
ン、アルデヒドまたはスルホン酸からなる群から選択さ
れるアクチノマイシンＤの誘導体と結合させることを含
む、アクチノマイシンＤ複合体の製造方法。 - 【請求項１５】前記標的細胞結合性タンパクが、抗体、
ホルモン、成長因子および細胞表面結合タンパクまたは
その機能的断片からなる群から選択される、請求項１４
に記載の方法。 - 【請求項１６】前記アクチノマイシンＤ複合体が、アク
チノマイシンＤの誘導された部分および前記標的細胞結
合性タンパクの反応基を介して直接形成され、該誘導さ
れた部分が臭化メチレンでない、請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１７】前記アクチノマイシンＤ複合体が、アク
チノマイシンＤの前記誘導された部分およびスペーサー
の反応基を介して形成される、請求項１４に記載の方
法。 - 【請求項１８】アクチノマイシンＤ複合体の製造方法で
あって、 （ａ）アクチノマイシンＤの臭化メチレン誘導体をスペ
ーサーと結合させ、アクチノマイシンＤ−スペーサー複
合体を形成する工程；および （ｂ）該アクチノマイシンＤ−スペーサー複合体を標的
細胞結合性タンパクに結合させる工程、を含む、方法。 - 【請求項１９】前記標的細胞結合性タンパクが、抗体、
ホルモン、成長因子および細胞表面結合タンパクまたは
その機能的断片からなる群から選択される、請求項１８
に記載の方法。 - 【請求項２０】薬学上受け入れられるキャリア中の有効
量のアクチノマイシンＤ複合体を結合する工程であっ
て、該複合体が該標的細胞に対して選択的結合を有する
工程、および該複合体を標的細胞に投与する工程を含
む、標的細胞への細胞毒性の効力を与える方法。 - 【請求項２１】前記標的細胞が哺乳類宿主中にある、請
求項２０に記載の方法。 - 【請求項２２】前記アクチノマイシンＤ複合体が、静
脈、皮下、および腹腔内からなる群から選択される方法
によって投与される、請求項２０に記載の方法。 - 【請求項２３】汚染標的細胞に対して選択的結合を有す
る、有効量のアクチノマイシンＤ複合体を培養物に投与
することを含む、細胞の精製方法。
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| US07/580,835 US5155210A (en) | 1990-09-11 | 1990-09-11 | Methods of conjugating actinomycin d |
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- 1991-09-11 JP JP3232061A patent/JPH05294994A/ja active Pending
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