JPH08502240A - 二官能性キレート剤としての置換チオ尿素 - Google Patents

二官能性キレート剤としての置換チオ尿素

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JPH08502240A JP5518423A JP51842393A JPH08502240A JP H08502240 A JPH08502240 A JP H08502240A JP 5518423 A JP5518423 A JP 5518423A JP 51842393 A JP51842393 A JP 51842393A JP H08502240 A JPH08502240 A JP H08502240A
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ジェー． カグリン，ダニエル
エー． ベリンカ，ジュニア．，ベンジャミン
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サイトゲン コーポレーション
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Abstract

(57)【要約】 本発明は、金属イオンを生物学的に活性な分子に結合するために使用されるキレート剤に関する。特に、テクネチウムのような金属をキレート化する際に重要なチオ尿素が提供され、これは、抗体、ペプチドまたはプロテインのような標的分子に複合することが可能である。

Description

【発明の詳細な説明】 二官能性キレート剤としての置換チオ尿素 本出願は、参考としてこの文書中に組み込まれている1992年4月9日に提出され たSer．No．07/866,375の一部継続出願である。 １．技術分野 本発明は、生物学的に活性な分子に金属イオンを結合するために使用されるキ レート剤に関する。 ２．背景技術 抗体とある種のペプチドは、生体内の標的器官、腫瘍または血栓に薬剤または 放射性同位元素を伝達するための極めて特異的な伝達体として使用できることが 知られている。放射性同位元素で抗体を直接的に標識することについてはいくつ かの方法が報告されており（Huang等，1980，J.Nucl.Med.21:783; Rhodes等，” Tumor Imaging”，BurchielとRhodes，eds.,Masson: New York，p.111，1982;及 びSundrehagen，1982，Eur.J.Nucl.Med.7:549）、これらはプロテインジスルフ ィド結合の部分還元を利用してテクネチウムのような放射性金属を結合すること ができる遊離チオール基を生成するものである。プロテインまたはペプチドの全 てが還元し易いジスルフィドを含んではいないし、部分還元によって自然分子に 関する生物学的活性が改質されることもあるため、二官能性放射性金属キレート 剤を利用して生体内の放射性金属を標的にすることが可能な放射性金属−キレー ト剤−ペプチド／プロテインの共有結合複合体を形成することは望ましいことで あろう。 核医学において特に興味のあるのは放射性金属テクネチウム-99mで、これはシ ンチグラフィの撮像に応用される好ましい同位元素の一つである（Pinkerton等 、1985,J.Chem.Educ.62:965）。テクネチウムは、硫黄含有化合物、特にチオー ル（例えば、メタロチオネイン）と、またチオ尿素とも、強力な配位結合を形成 する金属イオンの一種である（Koponec等、1977,Radiochem.Radioanal.Lett.29: 171）。Koponec等は、錯体を形成するチオ尿素によるテクネチウムの結合につい て述べている。このことは、チオカルボニル官能基はテクネチウムと結合するこ と、従ってテクネチウム結合二官能性キレート剤の１要素として有用であるだ ろうことを説明している。 直接標識系に比して放射性標識のキレート剤複合体を使うことは、多くの理由 から好ましいだろう。先ず第一に、キレート剤はより高い生体内安定度を有する 金属錯体を供給できる。第二の利点は、非標的組織内の放射性標識プロテインの 速やかな除去とその堆積を減らすことを考慮できるよう、代謝により開裂可能な 基が二官能性キレート剤の結合部分に含まれているときに現れる。最後は、直接 標識を付けるのは、プロテインの官能基に放射性同位元素を付着させることを要 するかも知れないが、それで生体内ペプチドまたはプロテインの標的を抑え、さ もなければ妨げることになるかも知れない。 多くの二官能性キレート剤が科学文献に報告されてきた。Tolman等（米国特許 第4,732,864）は、標的とする分子に複合されたシステインに富んだ金属結合プ ロテインであるメタロチオネン及びメタロチオネンフラグメントの使用について 述べている。しかしこの方法は、メタロチオネンはそれ自体大きい分子であり、 そのような複合体を精製し特性付けをするには困難である場合もあるというのが 欠点である。 Schwartz等（1991，Bioconjugate Chem．2:333）は、ピリジルヒドラジルを素 地とした一連の二官能性のテクネチウムキレート剤について述べている。この放 射性金属を結合する方法は新しいが、これらのキレート剤は、テクネチウム結合 ヒドラジド末端はアルデヒドと優先的に反応するかもしれないので、酸化炭化物 を通して抗体または糖タンパク質と特異的に結合する部位には有効ではないかも 知れない。この問題に対する化学的解法は記述されていない。 Fritzberg等（EP 0188526；1988，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．85:4025） は、二官能性のジチオラート・ジアミド・テクネチウムキレート剤について数例 を記述している。しかし、テクネチウムをキレート化するそうした方法は、化合 物をテクネチウムと予めキレート形成させ、その後、抗体に複合しなければなら ないので扱いにくい。またそうした化合物は、テクネチウムとのキレート化に遊 離チオール基を必要とする。遊離チオールは酸化／二量化に対して幾分不安定で ありプロテインにさらされるとプロテインジスルフィド結合を減らすかも知れな いので、最終合成中はキレート剤のチオールの作用を保護（遮へい）し、その後 テク ネチウムとのキレート化の前に保護を解除しなければならない。 Yokoyama等（米国特許No．4,287,362；1986，Int.J.Nucl.Med.Biol．12:425;1 987，J．Nucl．Med．28:1027）は、1,2-ジカルボニル化合物のチオセミカルバゾ ン誘導体を素地とする二官能性キレート剤について記述している。これらの化合 物はテクネチウムをキレート化する基としてチオカルボニル部を有する。同様の 系は、Wu（EP 0306168）によって報告されており、またジカルボニル化合物のチ オセミカルバゾン誘導体を素地とするものである。水を脱離する縮合反応によっ て形成されるチオセミカルバゾン誘導体は加水分解に影響され易いかも知れない 。そうした化合物は、酸性の水媒体で加水分解され易く、また生体内では多分早 めに加水分解されると予測でき、金属−キレート錯体の本来の状態を喪失するに 至る。これらの種類のヒドラゾンキレート剤は、本発明とは別のものである。 それ故、本発明の目的は、これらの若干の欠点を克服する硫黄含有キレート剤 の新種を提供することにある。更に目的とするのは、標的とする分子に対する特 異的または非特異的複合について必要な手段を講じることである。 本発明の他の目的は、遊離チオール基を含まず、且つ、特に生体に投与した時 にプロテインとの潜在的な好ましくない副作用のない硫黄含有金属キレート剤を 提供することにある。 本発明の更に他の目的は、化学的に安定であり、且つ特に、酸化に対し耐性が あり、その複合体は加水分解に対し更に耐性がある硫黄含有金属キレート剤を提 供することにある。 本発明の他の目的は、ある場合に、チオカルボニルキレート基の対に加えて、 生体内で放射性金属キレートに安定性を付加するのに有効かも知れない更に別の キレート化できるアミノ、アミド、チオカルボニルまたはカルボニル基を含有す る硫黄含有金属キレート剤を提供することにある。 ３．発明の開示 本発明は、下記の式をもつ二官能性キレート剤を提供する： ここでLはリンカ（連鎖）、Dは、1,2-，1,3-，1,4-または1,5-（等）の位置にNH CSNHR基を有するアルキルのバックボーン、環式アルキルバックボーンまたはア リールバックボーン基であり、RはHまたは下記一般式を持つ置換基である： ここで、ａ＝０または１； ｂ＝０−１０； ｃ＝０または１； もしｃ＝１なら，Ｙ＝Ｓ，ＯまたはＨ2； ｄ＝０−２； ｅ＝０−１０；及び Z=H,N+(R')3X-,SO3H,CO2H,OH,H2PO3にこで、X-はハロゲン化物または酸アニ オンのような対イオンであり、R'はC1からC4の低級アルキルである。 １実施態様においては、Dは1,2-または1,3-置換直鎖アルキル基である。好ま しい実施態様では、Dは1,2-または1,3-置換ベンゼン環である。 本発明は、更に、ジイソチオシアン酸塩基を求核試薬と、特にアミン、ヒドラ ジド及びチオセミカルバジドと反応させることにより二官能性キレート剤を作成 する方法を提供する。 ジイソチオシアン酸塩の出発物質について特に述べるが、この発明のキレート 剤は、それには限定しないが、例えばジアミン、ジヒドラジド、またはジチオセ ミカルバジドとモノイソチオシアン酸塩との反応を含む多くの合成経路によって 、またはジイソチオシアン酸塩の等価物である試薬を使って作成できよう。 この開示の化合物は、先に述べたものとは機能的に異なる一連のチオカルボニ ル化合物を素地としている。その系には、プロテインジスルフィドと干渉する遊 離チオールは含まれず、むしろ、金属、例えばテクネチウムに対する硫黄供与体 として作用できるチオカルボニル部が含まれる。 リンカを含むチオカルボニル含有化合物は特に有用なキレート剤であることが 発見されている。本発明のキレート剤は、部位特異的または非部位特異的に付着 して標的とする分子、例えばプロテイン、抗体、ペプチド、核酸、またはステロ イドに複合する上で特に有利である。そのキレート剤の他の利点は、それらには 遊離チオールがないことである。従って、金属キレートは標的分子に対するキレ ート剤の複合後に形成することができる。そのキレート剤の更に利点とするとこ ろは、それらの化学的安定性、特に加水分解及び酸化に対するそれらの抵抗力で ある。本発明はまた、ある場合に、チオカルボニル基に加えて、金属イオンをキ レート化するのに役立つアミノ、アミド、カルボニルまたはチオカルボニル対を 含有するキレート剤を作成する機会も提供する。 本発明のキレート剤は、よく知られた連接法を使ってリンカを介して種々の標 的分子と複合させることかできる。標的分子−キレート剤複合体は金属イオン、 好ましくは放射性金属と錯体化（キレートを形成）させることができ、疾病の診 断または治療のために生体内または生体外で使用できる。 ４．図面の簡単な説明 図１ 水で発現させた瞬間薄層クロマトグラフィー（ITLC）プレートのオートラジオ グラム。Tc-99m-GLUCOSCAN（登録商標）は左に適用した。キレート剤AはTc-GLUC OSCAN（登録商標）と共に保温され、右に適用。プレートは10分間溶離した。 図２ （a）キレート剤A−ペプチド複合体および（b）キレート剤Aのみのキレート容 量のITLC分析のオートラジオグラム。試料は、複合体ng当たりTc-99mのマイクロ キューリ（μCi）の増加を示せるようスポットされている。 図３ Tc-99mで標識されたキレート剤B−抗体複合体のHPLC分析。この実験では抗体 上のアルデヒド基に対するキレート剤の比は1:1。 HPLC分析の条件は後の１３ 節に記述されている。パネル（a）及び（c）：280nmでOD検出。抗体ピークが主 要する。 パネル（b）及び（d）：Tc-99mからのガンマ放射検出（カウント／分(cpm)）。 放射能のほとんどは、抗体ピークに検出されている。パネル（a）及び（b）は、 1.48 mg/mlの複合体−Tc-99mの錯体：（c）及び（d）は0.74mg/mlの複合体−Tc- 99mの錯体の試料から得た。 図４ このHPLC分析は、抗体上のアルデヒド基に対するキレート剤Bの比で3:1が使わ れた以外は、一般的に図３について記述されたように実行された。パネル（a） 及び（b）：1.86mg/mlの試料；パネル（c）及び（d）：0.93mg/mlの試料。 図５ 対照HPLC分析。最初の対照分析では、酸化された抗体（非−複合）をTc-99mと 共に保温した（パネル(a)及び(b)）。第二の対照分析では、酸化された抗体を（ 酸化抗体上のアルデヒド基と結合しない）キレート剤Aと混合し、その後でTc-99 mと共に保温した（1.46mg/mlの試料、パネル（c）及び（d））。抗体の溶離は28 0nmのODに示されている。（パネル(a)及び(c)）。Tc-99mの放射能はcpmで示され ている（パネル(b)及び(d)）。 図６ Tc-99m−標識のGLUCOSCAN（登録商標）及びキレート剤Aの生物分布。実験は、 後の14節で記述。略語：BLDは血液；LUNは肺臓；SPLは牌臓；LIVは肝臓；KIDは 腎臓；STOは胃；MUSは筋肉；及びTHYは甲状腺である。結果は（器官のCPM/グラ ム）／（血液のCPM/グラム）で示されている。水平線：注入後4時間でのTc-GLUC OSCAN（登録商標）分布；左斜線：23時間でのTc-GLUCOSCAN（登録商標）；右斜 線：4時間でのTc−キレート剤A；大斜交平行線：23時間でのTc−キレート剤A。 図７ キレート剤Bと複合されたTc-99m-標識の抗乳ガン抗体B72.3を注入されたマウ スのガンマカメラ腫瘍像。像は、標識された複合体注入後（a）3時間及び（b）2 0.5時間に得たものである。腫瘍部位は写真に表されている。 図８ Tc-99m−標識のSYRGDVRGDF−キレート剤A複合体によるガンマカメラ血餅像。 ペプチド複合体が凝塊に局在し、ラビットのモデルにおいて図中矢印で示されて いる。像は、標識された複合体注入後（a）2時間及び（b）4時間に得たものであ る。 ５．発明を実施するための最良の形態 本発明は、標的分子に連接することができる二官能性のチオ尿素含有キレート 剤を提供するものである。ここで用いられている用語”二官能性の”は、連接基 を介して標的分子に複合でき（第一の機能）且つある金属をキレート化できる（ 第二の機能）化合物を指す。特に、その誘導体はチオ尿素（HNCSNH）官能基を有 する。ここでは”キレート剤”と呼ばれる、チオ尿素含有キレート剤は、ジイソ チオシアン酸塩から誘導できる。そのキレート剤は次の式のものである： ここでLはリンカ、Dは1,2-，1,3-，1,4-または1,5-（等）の位置にNHCSNHR基 を有するアルキルのバックボーン、環式アルキルバックボーンまたはアリールバ ックボーン基であり、Rは水素（H）または下記一般式を持つ置換基である： ここで、ａ＝０または１； ｂ＝０−１０； ｃ＝０または１； もしｃ＝１なら，Ｙ＝Ｓ，ＯまたはＨ2； ｄ＝０−２； ｅ＝０−１０；及び Z=H,N+(R')3X-,SO3H,CO2H,OH,H2PO3;ここで、X-はハロゲン化物または酸ア ニオンのような対イオンであり、R'はC1からC4の低級アルキルである。 Dのアルキル、環式アルキルまたはアリールバックボーンは、これには限定さ れないが、リンカとしては作用せずまた金属イオンのキレート化には直接寄与し ないが他の性質、特に溶解性を左右するアミンまたはアルコールのような官能基 を含んでよいことが想像される。 リンカ、Lは、キレート剤を標的分子に複合させるには向いている。一般的に 、リンカは標的分子上で、酸化炭水化物基、遊離スルフヒドリル、または遊離ア ミンのような官能基と反応して共有結合をなす。リンカ基は標的分子との特異的 付着、即ちその分子上での予測部位への結合、を規定できるように、または標的 分子との不特定付着、即ち1つまたは複数の部位が予測し得ない分子上での1つ以 上の部位への結合、を規定できるように選択することができる。リンカについて は、後の５．２節で詳細に議論する。 更に、リンカ、Lは、アルキル、環式アルキルまたはアリールバックボーンか らスペーサー群を介して間隔を保って、即ち、そのバックボーンから0乃至20原 子の間隔をとってよいことが考えられる。そのスペーサーはアルキル鎖から成っ てよい。更に、そのスペーサーはエステル、エーテルまたはアミド連鎖で繋がれ たアルキル鎖から成ってよいと考えられる。スペーサーはまたキレート剤の水溶 解性を高めるアミノ、ヒドロキシルまたはカルボン酸の官能性で置換することも できる。スペーサーは、よく知られているように、エステル、エーテルまたはア ミド連鎖によってバックボーンに繋がれてよい。スペーサーは開裂することがで きる。 好ましい実施態様においては、化合物のキレート化強度は、R置換基のところ にアミノ、アミド、カルボニルまたはチオカルボニル基のような付加キレート− 官能基を置くことにより高めることができる。本発明の化合物は、所望の特性を 有するR基を選択することによってよく水に溶けるように（親水性に）、または ほとんど水に溶けないように（疎水性に）製造することができる。 本発明のキレート剤は、標的分子に付着（複合）して標的分子−キレート剤複 合体、ここで云う”複合体”、を形成する上で特に有用である。化合物と複合体 は金属をキレート化し、次いでこれが特異的に標的となり得る。ここで記述され るように、標的分子−キレート剤−金属の錯体は、疾病または不調の治療処置に 、または生体内もしくは生体外の診断に、有用である。ジイソチオシアン酸塩か ら誘導されるチオカルボニル化合物及びその製法は、後の５．１節で詳述される 。 本発明のキレート剤は、キレート剤の2つ以上の電子対−供与体群と電子対ア セプタとしての金属の間で多重配位結合をすることによって金属と結合する。こ の発明によれば、チオ尿素基の硫黄原子は電子対アセプタ金属と好ましい配位結 合をなす。 キレート剤から電子対を受け入れることができる金属はいずれも、本発明のキ レート剤と結合できる。しかし、ある金属は硫黄含有置換基とより強力に配位結 合するものもあり、そこでこれらの金属か好まれる。好ましくは、その金属は放 射性金属、即ち、配位金属の放射性同位元素である。そのような金属は、診断の 際に撮像剤として、および標的化放射線療法での治療剤として有用である。 ここで用いられているように、用語”標的分子”は、標的と特異的に相互作用 をする分子を指す。標的分子（及びその標的）の例は、（その抗原を標的とした ）抗体、（受容体、基質、または、例えばDNA（遺伝子）もしくはRNA配列上の、 調節部位を標的とした）プロテイン、（通常、受容体を標的とした）ペプチド、 （相補核酸、例えばRNAまたはDNA、を標的とした）核酸、（ステロイド受容体を 標的とした）ステロイド、及びそれと類似するもの、である。本発明は、標的分 子の選択で制限を受けない。 標的分子と複合され（複合体）及び（キレート基を介して）金属イオンと錯体 化される二官能性キレート剤は、疾病の治療または生体内もしくは生体外診断に 有効に使うことができる。好ましい実施例では、その複合体または複合体−金属 の錯体は、被験対象に適用される製薬的に受け入れられる担体または付形剤と混 和することができる。好ましくは、その被験対象は、動物であり、より好ましく は、それには限定されないが、犬、猫、マウス、ラット、馬、畜牛または他の家 畜などの哺乳動物であり、最も好ましくは、ヒトである。 ５．１．二官能性の置換チオ尿素 本発明の二官能性チオカルボニル含有キレート剤は、標的分子と共有結合可能 な連接基（後の５．２節で更に議論）に加えて、金属と配位結合可能なチオカル ボニル基を有することで特徴付けられる。チオカルボニルは、好ましくは、チオ 尿素、チオセミカルバジド及びその誘導体である。その化合物は、好ましくは、 1,2-，1,3-，1,4-または1,5-（等）のジアミンまたは（後で記述する）ジアミン −類似体とチオホスゲンまたはチオホスゲン同価物とを反応させてジイソチオシ アン酸塩を形成して、製造する。このジイソチオシアン酸塩の生成物は求核攻撃 され易く、結果的にジイソチオシアン酸塩から誘導されるチオカルボニル基を形 成する。 ５．１．１．ジイソチオシアン酸塩およびその製法 本発明の化合物製造のためのジイソチオシアン酸塩の出発物質は、好ましくは 、1,2-，1,3-，1,4-または1,5-（等）のジイソチオシアン酸塩であり、より好ま しくは、1,2-または1,3-のジイソチオシアン酸塩である。ジイソチオシアン酸塩 は、ジアミン、または還元可能なジニトロ置換化合物から容易に作ることができ るため、両者はキレート剤を合成するのに使用できる系を準備する上で有用であ る。そのような化合物、特にジアミンは、化学的安定性が比較的高い故、好まし い出発物質であろう。 イソチオシアン酸塩基は、炭素数２以上のアルキルバックボーン鎖、環式アル キルバックボーン、１つ以上のヘテロ原子で置換されたアルキルバックボーン、 アリールバックボーンまたはヘテロ芳香族のバックボーン基上の置換基であるこ とが予測される。アルキルバックボーンまたはアリールバックボーンによってチ オカルボニル基の置換及びそのリンカに対する一つの足掛かりが提供される。バ ックボーンの性質に応じて、連接基は同一のまたは別の炭素原子のところでイソ チオシアン酸塩またはイソチオシアン酸塩誘導体基の一つとして見いだすことが できる。このように、そのバックボーンはリンカと結びつき、直接的にかまたは スペーサー基を介してかのいずれかで、キレート剤官能基と結びつく。 バックボーンの種々のジイソチオシアン酸塩とリンカの置換は、本発明の範囲 内であると考えられ、そしてここに提供された特定例には限定されない。例えば 、限定するのではないが、ジイソチオシアン酸塩は、1,2-置換エタン、1,2-置換 プロパン、1,3-置換プロパン、1,2-置換ブタン、1,3-置換ブタン、1,4-置換ブタ ン、1,2-乃至1,5-置換ペンタン（リシンより想像的に誘導）、及びその他に見る ことができる。アルキルバックボーン基は、直鎖または枝分れ鎖のアルキルであ ってよい。直鎖または枝分れ鎖のアルキルバックボーンにおいては、Lは1,2,3,. ...n位置（nはアルキル基の炭素原子数）のところであってよい。そのバックボ ーンも、環式アルキル基、例えば、限定するのではないが、シクロペンタン（1, 2- または1,3-位置でイソチオシアン酸塩基及び1-,2-,または3-位置でＬと置換）、 シクロヘキサン（1,2-、1,3-または1,4-位置でイソチオシアン酸塩基及び1-,2-, または3-位置でLと置換）及びシクロヘプタン（1,2-、1,3-または1,4-位置でイ ソチオシアン酸塩基及び1-,2-,3-,4-または5-位置でLと置換）であってもよい。 ここで使われているように、用語「環式アルキル基」には、置換及び非置換の環 式アルキル基、例えばメチルで置換された環式アルキル基、エチルで置換された 環式アルキル基、およびその類似物、及びヘテロ原子を含むまたはヘテロ原子で 置換された環式アルキル基、例えば、ピロリジン、ピペリジン及びその類似物が 含まれる。他の実施態様では、そのバックボーンは芳香族環またはヘテロ芳香族 環から成ってよい。ここで用いられている用語”アリール”は、π電子の共役系 を指し、ここでは、最少でも6個の、4m＋2個のπ電子（ここでmは整数）がある 。アリール基（位置1でリンカを有する）は、限定はされないが、2,3-または2,4 -ジ-置換ベンゼン、ピリジン、フラン、ピロール及びその類似物を含む。後の特 殊な実施例では、そのバックボーンは1,2-置換ベンゼン環と1,3-置換ベンゼン環 である。この議論の目的としては、リンカ基の位置は必ずしも1と明示されない が、バックボーン上のリンカ付着部位は、命名の標準規則に従って、位置1にあ ると明示してよい。 上述のジイソチオシアン酸塩は、この分野でよく知られた方法により調製でき る（例えば、D'Angeli等，1963，J．Org．Chem．28:1596-1600; LieberとSlutki n,962，J．Org．Chem.27:2214-2217；及びKlopplngとvan der Kerk，1951，Reｃ ．Trav．Chem．70:949-961）。特定例では、ジイソチオシアン酸塩は、ジアミン は環化反応が起こるほど近くに接近しておらずまたはたわみ易いバックボーン上 にないという条件付きで、ジアミン置換バックボーン基または類似体化合物を過 剰チオホスゲンと反応させることにより作成し得る。そのような好ましくない環 化は、隣合っているイソチオシアン酸塩に対する未反応アミンの求核攻撃によっ て起こり得る。ジイソチオシアン酸塩の一般的製法は、よく知られた反応である 。特定の反応条件は、ジアミンまたは下記に議論するようなジアミン類似体の選 択に依存することになる。そのバックボーンもまた、リンカとして作用しまたは リンカを形成する官能基を有する故、もしそれ自体が化学的変換を受けまたは反 応 によって作られるイソチオシアン酸塩官能基と反応するようなことがあるなら、 その官能基を保護するよう注意しなければならない。例えば、もしリンカ基が遊 離アミンを含むなら、tert-ブトキシカルボニル基のような保護基でそのアミン を封鎖することができる。その後、トリフルオロ酢酸で処理してそのtert-ブト キシカルボニル基を取り除くことができる。 好ましい実施例では、バックボーンはベンゼン環から成る。1,2-置換ベンゼン 環が使われる時は、チオホスゲンとの反応に使う好ましい出発物質はベンゾイミ ダゾール（例えば、5-カルボン酸ベンゾイミダゾール）である。イミダゾール環 の窒素はチオホスゲンと反応する性質がある。イミダゾール環以外の1,2位置の 遊離アミンがチオホスゲンと反応すると、優勢でないとしても顕著な一つのアミ ンによる求核攻撃の副反応が他のアミンのイソチオシアン酸塩誘導体のところで 多分起こるであろう。従って、この環化反応を避けるためにベンゾイミダゾール 基が使われる（Hull，1979，Synthetic Commun．9:477-481参照）。故に、好ま しい実施例では、キレート剤は下記の式を持つ： ここで、Rは上に定義されている。 1,3-置換ベンゼン環が使用される状態においては、遊離アミンをチオホスゲン と反応させ、1,3-ジイソチオシアナトベンゼンを得ることができる。この発明は 、特定のメカニズムに限定されないが、ほとんど配座自由度を持たないベンゼン 環の剛構造、及び1,3-位置にあるアミン間の距離によって、一つのアミンが他の アミンのイソチオシアン酸塩誘導体と反応することが妨げられ、従って両アミン をチオホスゲンと反応させることが可能となる。従って、他の好ましい実施例で は、キレート剤は下記の式を持つ： ここで、Rは上に定義されている。 ５．１．２．ジイソチオシアン酸塩への付加用試薬 前の式Ｉに示されているR基は、求核攻撃によってイソチオシアン酸塩に付加 される。イソチオシアン酸塩に関する求核攻撃の適当な試薬は、アミンを含むが 限定はされない。ここで用いられる用語アミンは、第一級または第二級アルキル アミン、環式アルキルアミン、またはアリールアミンを指す。また、用語アミン によって予想されるものとしては、置換アルキルアミン、置換環式アルキルアミ ン、置換アリールアミン、アミノ酸、ヘテロ原子で置換されたアミン、及びその 類似物がある。 好ましい実施態様では、酸ヒドラジドまたはセミカルバジド基は、イソチオシ アン酸塩と反応させてチオセミカルバジド誘導体を生ずることができる。他の態 様では、チオ酸ヒドラジドまたはチオセミカルバジドを反応させることができる 。チオ酸ヒドラジドおよびチオセミカルバジド基は、ここではヒドラジドおよび セミカルバジド基の”チオ−類似体”と呼ばれる。チオカルボニル−またはカル ボニル−含有基の付加は、これによってキレート用金属に利用できる電子対供与 体の密度が増やされるので、望ましい。チオカルボニル基は、次の理由からより 望ましい：チオ酸ヒドラジドまたはチオセミカルバジドのジイソチオシアン酸塩 への付着は、金属をキレート化できるよう、即ち、金属の配位球面に硫黄電子供 与体原子をより多く配置できるように接近して4つのチオカルボニル基を有する キレート剤を生ずるであろうから。本発明に使用するためのチオ−類似体を含む ヒドラジドまたはセミカルバジドは、限定されないがヘテロ原子が置換基に含ま れている置換アルキル、置換環式アルキル及び置換アリール基を含むアルキル、 環式アルキルまたはアリール基で置換してよい。 イソチオシアン酸塩対への付着に使われるアミンまたはヒドラジドまたはセミ カルバジド（そのチオ−類似体を含む）基は、例えば、置換されていないアルキ ル、環式アルキルまたはアリール基との置換によって、主として疎水特性を有し てもよい。他の態様では、イソチオシアン酸塩対への付着に使われるアミンまた はヒドラジドまたはセミカルバジド（そのチオ−類似体を含む）基は、例えば、 限定はされないが、第四級アミン塩、酸または酸塩、ヒドロキシ基、およびその 類似物のような極性基との置換によって、親水特性を有してよい。極性置換基の 例には、限定されないが、塩化トリメチルアンモニウム、酢酸トリメチルアンモ ニウム、トリフルオロ酢酸トリメチルアンモニウム及びその類似物；及びスルホ ン、ホスホン及びカルボンのような酸とそのナトリウム、カリウム、リチウム、 カルシウム、及びマグネシウム塩が含まれる。 この分野の通常の技術によって容易に認識されるように、Rは多くの特定構造 を有してよい。特定の態様において、aは1、bは0、cは1、Yは酸素、dは0、eは1 、及びZはN(CH3)3 +Cl-である。他の態様では、aは1、bは0、cは1、Yは硫黄、dは 1、eは1、及びZは水素である。更に他の態様では、aは0、bは2、c、d及びeは0及 びZはN(CH3)3"Cl-である。更に他の態様では、aは1、b,c,d及びeは0及びZは水素 である。前出の実施態様は、単に本発明の説明用としてのみ提供されるものであ る。 後の、実施例に記述される特定の実施態様において、（カルボキシメチル）塩 化トリメチルアンモニウムヒドラジド（ジラール試薬-T）及び4-メチル-3-チオ セミカルバジドは、ジイソチオシアン酸塩と反応させる。これら及び、限定はさ れないが、酢酸ヒドラジド、安息香酸ヒドラジド、フルオレセインチオセミカル バジド、4-2-（トリメチルアンモニウム）エチル-3-チオセミカルバジド、及び4 -スルホメチル-3-チオセミカルバジドを含む、この発明に使用される他の基は、 市販元、例えばAldrlchまたはSigma、から入手してよいし、またはその代わりに 通常の合成経路を経て合成してよい。 求核剤、即ち、アミンまたはヒドラジドまたはセミカルバジド（またはそのチ オ類似体）と、ジイソチオシアン酸塩との反応はほぼ標準条件の下で実行してよ い。一般的に、ジイソチオシアン酸塩および反応性求核剤は、その中ではそれら が溶解できる極性不活性溶媒に溶かす。そのような溶媒の例としては、アセトニ トリル、ジメチルホルムアミド、ジオキサン、水、アルコールまたはその混合物 がある。一般的に、その反応は室温で実行してよいが、イソチオシアン酸塩に対 する求核付加が困難であると予想される場合は、温度を上昇してよい。求核剤は 、定量的2モル付加を確実にするため、ジイソチオシアン酸塩に対し2倍を越える モル超過量を付加しなければならない。 ５．１．３．ジアミンとイソチオシアン酸塩誘導体との反応 本発明のチオ尿素誘導体を得るため、ジイソチオシアン酸塩化合物に向かう求 核攻撃の逆反応を使ってよいことは、この分野の普通の技術を有する人には容易 に理解されるであろう。例えば、一般式： SCNR″ （ここでR″は水素または上記のRに対する一般式を持つ置換基）を持つイソチオ シアン酸塩誘導体は、上記５．１．１節に記述されたように、チオ尿素誘導体を 製造するためにジアミンと反応させることができる。 ５．２．リンカ基 本の発明の化合物に使用されるリンカ基、ここでは”リンカ”ともよばれる、 はキレート剤を標的分子に複合させるために適している。他の実施態様では、リ ンカ基はキレート剤を固形支持体に複合させるために使われてもよい。特にリン カ基は、プロテイン、特に抗体または抗体フラグメント、ペプチド、核酸、ステ ロイド、及び関係のある他の標的分子の官能基と反応する性質がある。後で詳細 に述べるように、前述の官能基には、限定はされないが、酸化炭水化物部（その 場合、リンカは、例えば、第一級アミン、ヒドロオキシアミン、ヒドラジド、チ オヒドラジド、フェニルヒドラジド、セミカルバジドまたはチオセミカルバジド であってよい）、スルフヒドリル（この場合、リンカは、例えば、二硫化ピリジ ルまたはマレイミドであってよい）、アミノ基（この場合、リンカは、例えば、 イソチオシアン酸塩、カルボン酸、エステルまたはコハク酸塩であってよい）、 及びカルボキシ基（この場合、リンカは、例えば、アミン、ヒドラジド、または セミカルバジドであってよい）が含まれる。 リンカの反応基は、この分野で知られる任意のスペーサー基を介してバックボ ーンから離してよい。そのスペーサは、（飽和及び不飽和を含む）アルキル基、 環式アルキル基、置換されたアルキルもしくは環式アルキル基、またはペプチド 配列を含む同価のスペーサー基であってよい。ある場合は、そのスペーサーは、 炭素−炭素結合以外を含んでよい。例えば、限定されないが、スペーサーのアル キル鎖はエステル、アミドまたはエーテル機能で繋がれてよい。特定の実施例で は、スペーサーは、エステル、エーテルまたはアミド結合を介してバックボーン 、またはリンカと繋がれてよい。更にスペーサーは、この発明のキレート剤の水 可溶性を高めることのできる種々の官能基、例えば、アミノ、ヒドロキシルまた はカルボン酸の官能性を含んで、即ちそれらで置換されてよい。特定の実施例で は、20原子を超えるスペーサーも予想されるが、リンカはバックボーンから0乃 至約20原子の間隔をあける。 特定の実施態様では、スペーサー基は、その全体が参考としてここに特に組み 入れられている、米国特許No.4,671,958に開示されているように、開裂しうるも のであってよい。他の開裂可能なスペーサー基、例えば、エステルはよく知られ ており、この発明に使うことができる。 リンカは、求核付加によりジイソチオシアン酸塩基の誘導化以前にバックボー ンに存在していてよい。イソチオシアン酸塩の誘導体生成のある段階でリンカが 反応性であろう場合、そのリンカは保護されなければならない。例えば、もしリ ンカがアミンなら、そのアミンは、別の且つ対抗するイソチオシアン酸塩を形成 しないよう、チオホスゲンとの反応に先立ち保護されなければならない。適当な 保護基はtert-ブトキシカルボニルである。 あるいは、リンカは、ジイソチオシアン酸塩の誘導化の後、付加または修正さ れてよい。ジイソチオシアン酸塩の誘導体は、大体、非反応性であるので、この 方策は望ましいであろう。後の特殊例では、バックボーン上のカルボン酸基は修 正され、バックボーンにアミド含有スペーサーで連結されているヒドラジドリン カを有するキレート剤を生ずる。他の実施態様では、バックボーンから間隔をあ けたアミノ基を架橋結合剤と反応させ、ジスルフィドまたはマレイミドリンカを 持つ二官能性キレート剤を得る。これらのリンカは、標的とする系上のスルフヒ ドリルへの付着に使用することができる。リンカの種々の修正及び従って方策は この分野でよく知られており、且つ本発明の範囲内に入るものである。 ５．２．１．酸化炭水化物部への付着 糖タンパク質は、生物学的に重要な巨大分子であり、これは構造特性、特にポ リペプチドのバックボーンに共有結合的に付着した炭水化物残基を共有する。抗 体は糖タンパク質である故、化合物はその分子の炭水化物の部分に付着できる。 免疫グロブリンのFc領域の炭水化物の部分は利用してよい。あるいは、炭水化物 の部分を含有する免疫グロブリンのFabまたはFab'は、ここで述べる反応に利用 してよい。前述の免疫グロブリンの例としては、Putnam等（1973，Science 182: 287）によってシーケンスされたヒトのIgMがある。 以下に詳細に説明するように、糖タンパク質の炭水化物側鎖、特にその抗体フ ラグメント、は選択的に酸化されてアルデヒドを生ずることができる。得られる アルデヒドは、次いで、アミン基（例えば、第一級アミン、ヒドロキシルアミン 、酸ヒドラジド、チオヒドラジド、フェニルヒドラジド、セミカルバジドまたは チオセミカルバジドのようなアンモニア誘導体）と反応させて、シッフ塩基また は還元シッフ塩基（例えば、イミン、オキシム、ヒドラゾン、フェニルヒドラゾ ン、セミカルバゾンまたはチオセミカルバゾン、またはその還元型）を形成して よい。 開裂しうるスペーサーは、キレート剤−金属の錯体を比較的早く除去すること が望まれるところでは好ましい。スペーサーが開裂可能ペプチド基質から成る場 合には、ヒドラジドまたはヒドラジド誘導体は開裂可能ペプチドの一方の末端に 付着させてよく、他方、反対側の末端は、例えば、エステルまたはアミド連接に よってバックボーンに繋がれる。これらのヒドラジド及びヒドラジド誘導体は、 次いで、例えば、酸化炭水化物を含有する免疫グロブリンまたは免疫グロブリン フラグメントと反応させる。これによって、ヒドラゾンが形成され、その化合物 がリンカ基を介して糖タンパク質の炭水化物側鎖に共有結合的に付着することに なる。 炭水化物の一部または抗体分子部の酸化によってアルデヒド基が形成される。 多様な化学酸化剤、例えば、過ヨウ素酸、パラ過ヨウ素酸、メタ過ヨウ素酸ナト リウム及びメタ過ヨウ素酸カリウム、を使ってよい。これらのうち、酸素酸及び その塩は、二次的または望ましくない副作用がそれ程頻繁に生じないので、好ま しい。一般的議論に関しては、Jackson，1944，Organic Reactions 2:341；及 びBunton 1965，Oxidation in Organic Chemistry，Vol.1 （Wiberg,ed.），Aca demic Press，New York，p.367を参照せよ。 これらの酸化剤による糖タンパク質の酸化は、周知の方法によって実行するこ とができる。酸化に際しては、糖タンパク質は、一般的に、水溶液の形で使われ 、その濃度は、一般的に、100mg/mlより少なく、好ましくは1乃至20mg/mlである 。酸素酸またはその塩が酸化剤として使われる時は、一般的に、水溶液の形で使 われ、その濃度は、一般的に、0.001乃至10mM、好ましくは1.0乃至10mMである。 酸素酸またはその塩の量は、抗体の種類によって変動するが、一般的に超過して 、例えば、酸化しうる炭水化物の量の2乃至10倍で使われる。しかし、最適量は 日常の実験により決めてよい。 酸素酸またはその塩によって糖タンパク質を酸化する過程において、最適範囲 はpHは約4から8、温度は0℃から37℃、及び反応期間は約15分から12時間である 。 酸素酸またはその塩で糖タンパク質を酸化中は、光は好ましくは遮断して、糖 タンパク質の過剰な酸化が起こらないようにする。 あるいは、糖タンパク質の炭水化物の部分は、他の化学基に付着またはそれと 反応できるよう酵素技法によって修正してよい。そのような酵素の一例には、酸 素の存在するところでガラクトースを酸化してアルデヒドを形成するガラクトー スオキシダーゼがある。 酵素、ガラクトースオキシダーゼによる分子の炭水化物部分の酸化については 既に記述がある（Cooper等，1959，J．Biol．Chem．234:445-448）。糖タンパク 質は水溶液で用いられ、その濃度は、一般的に、0.5から20mg/mlである。酵素は 、一般的に、5.5から8.0のpH範囲で、溶液ml当たり約5乃至100単位で用いられる 。pH、基質濃度、緩衝液および緩衝液濃度が酵素反応に及ぼす影響については上 記のCooper等により報告されている。 酸化抗体へのリガンドの複合例は、米国特許No.4,741,900に与えられており、 その全体はここに参考として特に組み入れられている。 ５．２．２スルフヒドリル基への付加 遊離スルフヒドリル基は、１つ以上のジスルフィド、例えば、免疫グロブリン 分子、を含むプロテインまたはペプチドのジスルフィド結合から生成してよい。 これはプロテイン分子の緩和な還元によって達成される。緩和な還元条件は、プ ロテイン機能を妨げるほどプロテインの二次及び三次構造が顕著に変更しないよ うにすることが望まれる。過剰還元をすればプロテインを変性することになろう 。 特に興味のあるのは、免疫グロブリンのプロテインである。一般的に還元に最 も敏感なIgGのジスルフィド結合は、2つの重鎖（H鎖）を連鎖する結合である。 抗体分子の抗原結合領域近くに配位されたジスルフィド結合は、比較的影響され ない状態のままで存在する。H鎖領域内に生成された遊離スルフヒドリル基は、 次いで、融和性のキレート剤のリンカと反応させて、免疫グロブリンの抗原結合 部位と干渉しない共有結合を形成してよい。前述の反応基には、限定されないが 、ジスルフィド移動を経て遊離チオールと反応し得るジスルフィド、例えば、ピ リジルジスルフィド、安息香酸ｐ-第二水銀基、及びマイケル方式付加反応の可 能な基（例えば、Mitra及びLawton，1979，J．Amer．Chem．Soc．101:3097-3110 に記述されているマレイミド及びその種類の基を含む）が含まれる。 ここに一般的に記述されたような抗体及び抗体フラグメントの緩和な還元に適 する条件、方法及び材料の詳細は、その章がここに参考として組み入れられてい るStanwoth及びTurner，in Handbook of Experimental Immunology，Vol．1，Se cond Edition，Weir（ed），Chapter 10，Blackwell Scientific Publications ，London，1973に見られるであろう。 IgGの免疫グロブリンのフラグメントは、抗体分子をペプシンで開裂すること により（二価フラグメントを生ずる、F(ab')2）、またはパパインで開裂するこ とにより（２つの一価フラグメントを生ずる、2Fab）得られる。FabとF(ab')2フ ラグメントは抗体分子全体より小さく、従って、標的部位または組織に容易に浸 透する。これによって、複合体はより容易に生体内部位（例えば、腫瘍集団、感 染部位、等）に浸透するだろうから、生体内撮像は明らかに有利になる。 抗体フラグメントで形成された複合体を使うときは、これらのフラグメントは 胎盤障壁を越えることができないため有利となる。結果として、本発明のこの実 施態様を使って、（腫瘍のような）生体内部位は、妊婦の場合、撮像化合物、例 えば、放射性金属、に胎児をさらすことなく撮像できる。 抗体分子のスルフヒドリル基に対する化合物の付着は、米国特許No.4,671,958 に記述されているような補体仲介の放出系に使用される抗体複合体を作るために 使ってよい。 本発明により、還元プロテインのスルフヒドリル基への付着には、そのリンカ は、好ましくはマレイミドまたはジスルフィド基である。リンカは、例えばスペ ーサーを介して、キレート剤のバックボーンに共有結合的に付着させられる。例 えば、（Partis等，1983，J．Pro Chem.2:263；およびMeans及びFeeney，1990 B ioconjugate Chem．1:2-12）に記述されているように、スルフヒドリルー反応性 リンカは、エステルまたはアミド結合を介して、キレート化合物に複合される。 マレイミドまたはジスルフィドリンカが、還元プロテインまたはペプチドを含 む、還元プロテインフラグメントと反応する時、リンカ基は共有結合的にプロテ インまたはフラグメントに付着することになる。 ５．２．３．プロテインのアミノまたはカルボキシ基への付加 化合物をプロテインまたはペプチドに連接するための従来法の改良型も本発明 の目的で使用してもよい。これらの従来法は化合物をプロテインまたはペプチド のアミノまたはカルボキシ基へ付加させるものである。従来法の欠点は、抗体分 子の抗原結合領域へのリンカの結合が特異的でないため、その標的に対するプロ テインの、例えば抗原に対する抗体分子の結合親和力が減少すること（即ち、免 疫特異活性が減少すること）である。従って、従来の連接法を使うためには、そ のリンカをプロテイン上の（例えば抗体分子上の）より最適の位置へ向かわせて 免疫複合体を形成させるようにしなければならない。この目的のために、免疫グ ロブリンまたはそのフラグメントの抗原結合領域は、抗原結合領域外のアミノま たはカルボキシ基の何れかが、例えば可溶性カルボジイミド反応によって、リン カと反応させられる間、保護されねばならない。プロテインに対するリンカの結 合を干渉し得るキレート剤中の反応基は何れも、プロテインをリンカと反応させ る前に遮へいされなければならない。 反応性アミン（例えば、リシンのα−アミンまたはより適当なε−アミン）に 付着する特定基には、イソチオシアン酸塩、カルボン酸、カルボン酸エステル、 例えばメチルエステル、コハク酸及びその類似物が含まれる。カルボン酸（例え ば、アスパラギン酸またはグルタミン酸）に付着する特定基には、アミン、ヒド ラジン、ヒドラジド、セミカルビジド、及びその類似物が含まれる。アミンとカ ルボン酸との結合は、好ましくはカルボジイミドで仲介された縮合物で仲介され る。 ５．２．４．非−プロテイン標的分子及び支持体との複合用リンカ 一般的に、酸化されたアルデヒド基または遊離アミノ基との複合について上述 されたものと同じ方策は、発明のキレート剤を他の標的分子に複合するために使 用してよい。例えば、核酸配列のリボースまたはデオキシリボースの酸化によっ て、前の５．２．１節で述べられたリンカとの反応に使われるアルデヒドが生成 できる。同様に、ステロイドまたは他の標的分子は、反応性アルデヒドの官能性 を使って生成できる。ステロイドまたは他の標的分子は、本来、反応性のアルデ ヒドを持つことがある。 他の実施態様では、標的分子は、前の５．２．３節で述べられたリンカと反応 するアミノ基で生成できる。前の５．２．２節で述べられているようなリンカ基 と反応できる反応性チオールで標的分子を生成することさえ可能である。 更に、この分野の普通の技術を有する人に知られているように、同様の反応基 は、固形支持体、例えば、セファデックス、セファロース、臭化シアンで活性化 されたセファロース、カルボキシメチルセルロース、アガロース、及びその類似 物に見ることができ、またはそれらに基づいて生成できる。 ５．３．錯体の調製 キレート剤−金属イオンの錯体は金属イオンを直接キレート剤に結合して生成 することができる。結合を達成するのに、金属イオンをキレート剤に付着する従 来法を使ってよい。一般的に、還元された過テクネチウム酸（テクネチウムはTc （III），Tc（IV）またはTc（V）、またはその任意の組合わせの形をしていると 考えられる）、還元された過レニウム酸（レニウムはRe（III），Re（IV）また はRe（V）、またはその任意の組合わせの形であると考えられる）、銅（Cu(I)及 びCu(III)も可能だが、一般的にはCu(II)）、水銀（Hg(I)またはHg(II)、または 両方）または鉛（通常、Pb(II)またはPb(IV)）は、発明のキレート剤とのキレー ト化に好ましい金属イオンである。キレート化のための放射性金属の例は、テク ネチウム-99m（Tc-99m）、レニウム-186（Re-186）、及び-188（Re-188）、銅67 （Cu-67）、銀 111（Ag-111）、水銀197（Hg-197）、鉛212（Pb-212）及びビスマス212（Bi-212 ）がある。Bi-212はPb-212の崩壊生成物である。約10.6時間の半減期を有するPb -212は急速に崩壊してBi-212になり、これもまたアルファ粒子を放出して早急に 崩壊する（半減期約1時間）。他の金属イオン、例えば、インジウム（特に、In- III）及びランタニドイオン（一般的に、Ln(III)）、及び特に、ガドリニウムGd (III)）は除外できない。生体内診断に使われるその他の金属イオンは、後の５ ．４．２節で議論される。 好ましくは、キレート剤は、金属とのキレート化に先立ち、標的分子、例えば 、抗体またはペプチド、に複合される。キレート化に先だって標的分子に複合す ることは次の理由から有利である：硫黄原子の電子対供与体は、チオール以外の チオカルボニルとして存在し、それ故、例えば、プロテイン、特に免疫グロブリ ン中のジスルフィドまたは遊離スルフヒドリルとは反応しない。本キレート剤の 他の利点は、それらの安定性にあり、そのため標的分子−キレート剤複合体は、 金属イオンとのキレート化に先だって保管可能である。複合体を保管できるとい うことは、大規模の製造及び配給を可能とし、ロット毎の均一性検査および品質 管理を可能にするものである。 キレート剤のテクネチウム標識は従来の処置で効果がある。好ましい実施例で は、還元Tc-99mは、確立されている方法（例えば、Dswanjee，1990，Seminar in Nuclear Medicine 20:5-27）を使って、Tc-99m-GLUCOSCAN（登録商標）（DuPont ，North Billerica，MA）の形で複合体に付加される。 他の実施態様では、過テクネチウム酸は、通常イオン水溶液中のNH4TcO4また はNaTcO4の形で、市販元から得ることができる。他の形の過テクネチウム酸は、 キレート化処置を適当に変更して使ってよい。過テクネチウム酸の還元は、約pH 4から約pH7に緩衝された、水溶液または水性有機溶液中で、種々の還元剤、例え ば第一スズイオン、亜ジチオン酸塩、ホウ素水素化物、第一鉄イオン、及びその 類似物を用いて達成することができる。還元剤、好ましくは第一スズイオンは、 過テクネチウム酸の完全な還元を確実にできるよう、超過して付加しなければな らない。還元は、標準的には、ほぼ室温で、不活性ガス、例えば窒素またはアル ゴン雰囲気の下で達成される。還元された過テクネチウム酸は、次いで、キレー ト剤と、またはより好ましくはその錯体と反応させ、キレート化させる。キレー ト化されないテクネチウムは、複合物の分子量、疎水性、及びイオン性に応じて 、簡単な技術、例えばゲル濾過クロマトグラフィー、膜濾過、逆相クロマトグラ フィー、またはイオン交換クロマトグラフィーにより複合体から排除することが できる。あるいは、キレート化がキレート剤だけで行われる場合は、さらに反応 が進むのを防ぐため、未反応の還元過テクネチウム酸用の捕集剤を付加してよい 。 レニウムの標識化は、実質上、テクネチウム標識化と同一の方法で達成するこ とができる。しかし、レニウムの場合、その系から酸素を排除するよう特に注意 が必要である。 銅の標識化は複合体またはキレート剤を、塩化物、クエン酸塩、酒石酸塩及び その類似物のような銅イオン塩、通常、対イオンをもつCu（III）の溶液と反応 させることによって行うことができる。同様に、水銀または鉛塩、または塩に容 易に変換しうる形の水銀または鉛は、銅と類似の方法でキレート化できる。現在 、67CuCl2，197HgCl2，及び197Hg(NO3)2は、契約注文で同位元素供給先より入手 可能である。例えば、Oak Ridge National Laboratoriesは、これらの化合物を 供給できる。ビスマス-212は、通常、鉛-212の崩壊から得られる。従って、複合 体−鉛-212の錯体は崩壊させて複合体−ビスマス-212の錯体を形成する。 ５．４．標的分子−キレート剤−金属イオン錯体の使用 本発明の標的分子金属イオン錯体は、種々の治療及び生体外及び生体内診断の 応用上有用である。 この応用例を通して、用語”細胞疾患”は、がん、腺腫、及び過形成を含む全 ての腫瘍；自己免疫病、移植病（例えば、骨髄移植後の移植片−対−宿主病、ま たは移植の拒絶反応）、例えば、腎臓または骨髄移植後の免疫抑制病を含む、あ る免疫不整を包含するものと解される。例えば、骨髄移植を含む前述の細胞疾患 の処置は、望ましくない細胞、例えば、悪性細胞または成熟Tリンパ球を（殺す ことにより）排除することを含んでよい。 好ましい一実施態様では、標的分子は、腫瘍撮像に使用される発明のキレート 剤と複合された抗体である。特定例では、その抗体は腫瘍細胞と、好ましくはヒ トの腫瘍細胞と反応してよい。例えば、その抗体は、ヒトの乳がん細胞と反応す るモノクローナル抗体（Colcher等，1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78 ：3199-3203）、例えば、後の実施例で示されるような、モノクローナル抗体B72 .3であってよい。他の実施態様では、その抗体は、前立腺がん用マーカーに特異 的なモノクローナル抗体（米国特許No.5,162,504，Nov．10,1992発行；Horoszew icz等、1987，Cancer Res．7:927-936）、即ち、モノクローナル抗体7E11であっ てよい。更に他の実施態様では、その抗体は、結腸直腸がん抗原に特異的なモノ クローナル抗体、例えば、モノクローナル抗体C46であってよい（Granowska等， 1989，Int.J.Colorect．Dis．4:97-108）。前出の例は、標的剤として使われる 抗体の特定例として与えられたもので、この発明はこれらの実施例で制限される ことはない。他の抗体標的剤はこの分野で知られており、発明のキレート剤とと もに使ってよい。 他の実施態様では、標的分子は血栓血餅を撮像するのに有用なペプチドである 。後の特定例では、アミノ酸配列SYRGDVRGDF-NH2をもつペプチドが使われる。し かし、本発明のキレート剤は、多くの撮像または治療用ペプチドと併用できる故 、このペプチドとの使用に限定されるものではない。 ５．４．１．生体内治療 治療上の応用は、一般的に、本発明の標的−金属イオン錯体の有効量を投与す ることによる、上に概略述べられたものを含む種々の細胞疾患に集中する。特殊 な標的に特異的であり且つそれと反応する分子の性質のため、その分子は、その 特殊抗原を有する特異的な細胞、組織、器官または他のいづれかの部位に金属イ オンを伝達するのに理想的に向いている。金属イオンは一般的には放射性金属で あろう。好ましくは、その放射性金属はレニウム-186または鉛-212（ビスマス-2 12）であり、この両者とも高エネルギー崩壊をする。 この局面における特殊な用法については、ポリクローナル及びモノクローナル 抗体を含む抗体、及びそのフラグメントがある。抗体は、抗原と呼ばれる特有標 的に対し免疫的特異性をもつ。抗原に対する抗体の結合親和力は、通常、非常に 高く；同様に、他の抗原との交差反応性は通常は低い。従って、抗体は、キレー ト化された金属イオンを標的抗原に伝達し且つ標的抗原のない周囲の組織が金属 イオンの影響下にさらされるのを制限するのに特に適している。 他の実施態様では、標的分子は受容体のペプチドのリガンド（配位子）である 。抗体同様、ペプチドリガンドは、標的、即ち、その受容体に極めて特異的であ る。ペプチドには、サイズが小さいという別の利点があり、それによって、細胞 間のスペース、血液−脳関門、腫瘍性塊、及び細胞膜ですら他のものより容易に 浸透する。膜移植が望まれるところでは、キレート剤は、前の５．１．２節で述 べられたように、他よりもより疎水性を持つように生成してよい。従って、ペプ チドは前述の場所に放射性金属を向けるのに効果的である。同様に、ステロイド 、これも受容体−特異性の、小さい上、容易に細胞膜を越える特性があり、細胞 疾患の性質に依存する有用な標的分子である。適用経路は、非経口であってよく 、一般に好まれる静脈内適用であってよい。 ５．４．２．生体内診断 生体内診断上の用途としては、本発明の抗体−金属イオン錯体の十分な量を適 用することにより特有組織または細胞の不整を撮像することが含まれ、その錯体 を検出できるような適当な時間枠でその組織に錯体を集中させることが可能とな る。 生体内の組織撮像に適する多種類の金属イオンが、臨床上、試験され且つ利用 されている。放射性同位元素による撮像については、下記の特性が望ましくおよ び／または必要であると一般に認識されている：（a）患者に対する放射線量が 低いこと；（b）光子収率が高いこと（これにより核治療処置を短時間で実行す ることが可能となる）；（c）十分多量に製造される可能性；（d）受け入れ可能 なコスト；（e）適用に際し準備が簡単；及び（f）それに伴い患者を隔離する必 要がないこと。これらの特性は、一般的には下記のように解釈される：（a）も っとも危険のある器官への放射線照射は５radより少ない；（b）注入後数時間以 内で単一の像を得ることができる；（c）放射性同位元素は粒子放射により崩壊 しない；（d）同位元素は容易に検出できる；及び（e）その半減期は４日より少 ない。（LambとKramer，”Comm ercialProduction of Radioisotopes for Nucle ar Medicine”,InRadiotracers For Medidcal Applications，Vol.1，Rayudu（ ed．），CRC Press，Inc.,Boca Raton,pp．17-62）好ましくは、その金属はテク ネチウム-99mである。 放射性同位元素によるその他の撮像法としては、陽電子放射断層撮影法がある 。 陽電子を放射する適当な同位元素には、43スカンジウム、44スカンジウム、52鉄 、55コバルト及び68ガリウムが含まれる。 組織の撮像には、54鉄、56鉄、57鉄、58鉄、157ガドリニウム及び55マンガン のような非放射性の常磁性金属イオンを使ってもよく、これらは核磁気共鳴分光 によって検出される。 撮像できる標的には、固形異常成長のいくつかの器官、例えば、リンパ節、副 甲状腺、牌臓及び腎臓、炎症または感染部位（例えば、前述部位にあるマクロフ ァージ）、心筋梗塞または血栓症（繊維素または血小板上のネオ抗原決定基）、 等が含まれる。 ５．４．３．生体外診断 本発明の抗体−金属イオン錯体を使って特定抗原を検出する生体外分析処置に は標準の免疫放射線検定法の技術が用いられる。そうした技術の一般的概説につ いては、Hales及びWoodhead，1980，Methods in Enzymology 70:334-355を参照 せよ。一般的に、免疫放射線検定法（IRA）では、標識されていない抗原を検出 するのに標識された抗体が関係する。免疫放射線検定法について多数の変形型が 開発されており、それらには例えば、2-部位IRA及び間接IRAが含まれる。これら の２つの方法は、一般的には下記のように説明される。 ２-部位IRAの目的は、固形相、例えばセルロースまたはセファロース上で、特 定の抗体を使って抗原を抽出することにある。その抗体が固形相に結合されてい る間に、二番目の標識された抗体を抗原の別の部位に結合させる。その後、抗原 の量は、結合された標識抗体の量の関数として測定される。この方法では、抗原 は、抗原上の２つの部位で２つの異なった抗体と結合させられる。他の方法では 、精製された抗原は固形相の支持体に吸着・連結される。 間接IRAでは、抗原測定に使われる（最初の）抗体は、最初の抗体が刺激され るのと同じ種の免疫グロブリンに対して標識された抗体を使って間接的に標識さ れる。この標識された抗−免疫グロブリン抗体は、次いで最初の抗体及び抗原と 反応させる。標識された抗体は、また従来のIRAまたは2部位IRAに使用してもよ い。 これらの診断技術及びその他は、本発明に包含される。 本発明に関連して、抗原試験用のこれらの全てのIRA法は、共通して、下記の ２つの操作段階からなる：（a）抗体−金属イオン錯体と抗原を含んでいること が予想される試料とを混合すること、及び（b）もし何らかの抗原が存在するな ら、前記錯体とその抗原との相互作用を検出すること。 本発明に関連して、プロテイン複合体、ペプチド複合体および核酸複合体は、 生体外で受容体、リガンドまたは（抗原の代わりの）相補核酸配列との相互作用 を検出するための抗体複合体の代わりとして用いてよい。 生体外診断には、全てのガンマ及び陽電子放射金属イオン、同じく、5.4.2節 の常磁性金属イオン、同じく、153ガドリニウムは適している。蛍光診断検定法 には、プラセオジム、ネオジム、サマリウム、ユウロピウム、ガドリニウム、テ ルビウム、ジスブロシウム、ホルミウム、エルビウム、ツリウム及びイッテルビ ウムを含む、ランタニドを用いてよい。 ５．５．薬剤組成物 本発明の治療用または生体内診断用薬剤は、製薬的に受け入れられる適当な担 体、付形剤、希釈剤及び補助剤との混合による薬剤組成物として製造される。こ こに用いられている用語”製薬的に受け入れられる”は、連邦または州政府の取 締機関によって認可されたものまたは米国薬局方もしくは他の一般に認められた 薬局方において動物用、及びより特殊には、ヒト用としてリストされているもの を意味する。前述の製薬的に受け入れられる担体は、水及び油のような無菌の液 体であってよく、それらには石油、動物、野菜または合成原料からのもの、例え ば、落花生油、大豆油、鉱油、ごま油及びその類似物が含まれる。水は、薬剤組 成物が静脈に投与されるときに好ましい担体である。塩類溶液及び水性デキスト ロース及びグリセロール溶液もまた、液体担体として、特に注入可能溶液として 用いてもよい。適当な製薬的に受け入れられる付形剤には、デンプン、グルコー ス、ラクトース、スクロース、ゼラチン、モルト、米、小麦粉、チョーク、シリ カゲル、炭酸マグネシウム、ステアリン酸マグネシウム、ステアリン酸ナトリウ ム、グリセリンモノステアラート、滑石、塩化ナトリウム、乾燥スキムミルク、 グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノール及び類似物が含まれる。 これらの組成物は、溶液、懸濁液、錠剤、ピル、カプセル、パウダー、徐放性製 剤及 びその類似物の形をとってよい。製薬的に受け入れられる適当な担体は、E.W.Ma rtin著の”Remington's Pharmaceutical Sciences”に記載されている。 前述の組成物は、治療上または診断上有効な量の活性化合物と、患者に適切に 投与できる形を供給できるよう適当量の担体を含むことになろう。静脈注射は非 常に効果的な投与の形の一つであるが、他の様式、即ち、限定はしないが、筋肉 内、脳室内、細動脈内、腹腔内及び皮下注射、及び経口、点鼻及び非経口投与を 用いてよい。 本発明の治療用薬剤及び診断用薬剤は、動物の、より好ましくは、犬、猫、馬 、牛、豚、てんじくねずみ、はつかねずみ、ねずみのような哺乳動物と同様に、 ヒトを含む哺乳動物の、病気の処置および／または診断に使用できる。 本発明は以後の実施例によって説明されるが、これらは例証の手段として提供 されるもので限定するものではない。 ６．実施例：3,5-ジ-(1-トリメチルアンモニウムアセチル)-4-チオセミカルバジド安息香酸、ジクロリド塩（キレート剤A）、３の製造 この実施例は、バックボーン、D、がベンゼン環であり、Lが位置1に配位され 、且つカルボン酸基であり、及びチオ尿素誘導体が位置3及び5に配位される本発 明のキレート剤の製法について説明するものである。下記実施例（7節）におい て、スペーサー基が付加され且つ酸ヒドラジド機能はリンカ、Lである。化学式1 に、これらのキレート剤の両方の合成を概説する。式１ ６．１．3,5-ヂイソチオシアネイト安息香酸、２ 500mlの1-ネック丸底フラスコに、3,5-ジアミノ安息香酸を15.2g（0.10mol） 、１（Aldrich）、クロロホルム175ml、水175mlを充填した。次に、チオホスゲ ン（Aldrich）17.0ml（0.223mol）を室温で15分間にわたり得られたスラリーに 加えた。2相、オレンジ−赤色の反応混合物を更に6時間周囲温度でかくはんさせ 、その後、水層を有機層から分離した。水層はクロロホルム100mlで２回抽出さ れ、次いで、有機層同士が混ぜられ、水400mlで３回洗浄した。クロロホルム溶 液は無水硫酸マグネシウム上で乾燥され、ろ過され、そしてその溶媒は、真空下 で濾液から蒸発させ、3,5-安息香酸ヂイソチオシアネイト20.7ｇ（77mmol，収率 88%）を生じた、２；mp 125-127℃；1H NMR（CDCL3,TMS）:δ7.81（s，2H），7. 27（s，1H）． ６．２．キレート剤A，３ 500mlの1-ネック丸底フラスコに、室温で3,5-安息香酸ヂイソチオシアネイト2 0.65g（87.4mmol），２，アセトニトリル175ml，水175ml及び塩化（カルボキシ メチル）トリメチルアンモニウムヒドラジド（ジラール試薬-T）（Aldrich）31. 0g（185mmol）を充填した。反応混合物中の全ての固体は、約2時間かけて溶解し た。得られた溶液は、CELITE（登録商標）（Aldrich）のパッドを通してろ過し 、その溶媒は低圧で濾液から蒸発させ、白まがいの固形残留物を残した。この残 留物をイソプロパノル中の20%の水から晶出させ、40.0g（70mmol，収率80%）の キレート剤Aを生じた、３，白色固形物として；mp 198-202℃；1H NMR（D2O,TMS PA）：δ7.89（s，2H），7.69（s，1H），4.28（s，4H），3.36（s，18H）． キレート剤Aでは、カルボン酸は、例えば、後の12節で示されるプロテイン上 のアミノ基への結合用リンカとして使ってよく、または、後の7節に示されるよ うに、標的分子の求電子部位への結合のため、求核リンカを付着できるよう変更 されてよい。 ７．実施例：キレートAのヒドラジドリンカの類似体（キレート剤B）、５の製造 キレート剤B、５、は酸ヒドラジド含有スペーサー基をキレート剤A、３（式1 ）のカルボン酸機能に付加することにより生成された。機能化スペーサーは、式 ２ に概説されるように作られた。式２ ７．１．N-BOC-6アミノカプロン酸、７の製造 250ml丸底フラスコに、2.62g（0.02mol）の6-アミノカプロン酸、６，（Aldrl ch）、40mlジオキサン、25mlの水及び25mlの1.ON水酸化ナトリウム液を充填した 。反応液を0℃まで冷却し、4.583g（0.021mol）のジ-tert-ブチルジカーボネー ト（BOC2O）（Aldrich）を加えた。反応液を0℃で1.5時間かくはんさせ、次いで 、ほとんどの溶媒を真空下で取り除き液体残留物を残した。この残留物を30mlの 酢酸エチルに溶かし、10分間0℃に冷却し、次いで、5%のリン酸水素カリウム溶 液（約50-60ml）を加えてその溶液のpHを2と3の間にした。反応液は50mlの水と3 0 mlの酢酸エチルに加えられた。水層は有機層から分離され、その水層は3部の30m l酢酸エチルで抽出された。有機層は混ぜられ、2部分の水75mlで洗浄され、NaSO4 上で乾燥され、ろ過され、そしてその溶媒は減圧の下で取り除かれ、4.22g（0. 0182mol，収率91%）のN-BOC-6-アミノカプロン酸、７、を濃い黄色油として生じ た。1H NMR（CDCI3,TMS）は、1.48ppmで大きい一重線に加えて、6-アミノカプロ ン酸に通常観測されるピークを示した（BOC基）。 ７．２．N-BOC-6-アミノカプロン酸、N'-FMOC（フルオレニルメトキシカルボニル）ヒドラジド、８の製造 250ml丸底フラスコに、4.190g（0.0181mol）のN-BOC-6-アミノカプロン酸、７ 、 4.60gの9-フルオレニルメチルカルバザト（FMOC）（Carpino等，1972，J．Org ．Chem.，37:3404の方法により作成）及び35mlのN,N-ジメチルホルムアミドを充 填した。その反応液を0℃に冷却し、次いで3.75g（0.0182mol）の1,3-ジシクロ ヘキシルカルボジイミド（Aldrich）を加えた。反応混合物を0℃で2時間かくは んさせた。この時間の間に作られた白色沈澱物をろ過し、その溶媒を減圧下で蒸 発させた。その残油は225ccのシリカゲルのパッド（Merck）に通し、次いで1lの クロロホルムで洗浄した。生成物は、次いで、クロロホルムに溶かした50%メタ ノール1lを使用してカラムから溶離された。溶媒は求める溶離液分から蒸発させ 、4.98g（0.011mol，収率59%）のN-BOC-6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジ ド、８、を黄色油として生じた。1H NMR（DMSO-d6,TMS）は、出発物質と7-8ppm 間（FMOC基）の芳香族領域において新しいプロトンとして観測されるピークを示 した。 ７．３．6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジド、９の製造 無水条件を使い且つ窒素ガスのブランケットの下で、200ml丸底フラスコに、4 .90g（10.48mmol）のN-BOC-6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジド、８、と10 mlの塩化メチレンを充填した。反応混合物に、次いで、16mlの塩化メチレンに溶 かされた16mlのトリフルオロ酢酸（Schweizerhall）を徐々に加えながら、室温 でかくはんした。得られた均質の溶液は、更に2時間かくはんされ、その後、15m lのトルエンが加えられた。次いで、溶媒及び残留しているトリフルオロ酢酸は 残らず減圧下で蒸留された。蒸留残留物は15ml部分のトルエンと共に2回より 多く共沸させ、8.49gのオレンジ色油を残した。1H NMRによって、この粗生成物 は、アミノカプロン酸及びFMOC置換基に基づくピークを示した。しかし、tert- ブチルのピークは、1-2ppm間で観測されなかったので、BOC防御基が除去された ことを示す。この生成物は、これ以上精製しないで使用した。 ７．４．キレート剤Aの6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジド誘導体４、の製造 250mlの丸底フラスコに、乾燥窒素ガスのブランケットの下で、2.909gのキレ ート剤A，３（前の6節）及び35mlの乾燥N,N-ジメチルホルムアミドを充填した。 反応フラスコは、次いで、0℃に冷却され、1.33ml（7.64mmol）のN,N-ジイソプ ロピルエチルアミン（Aldrich）に続いて660ml（5.09mmol）のクロロギ酸イソブ チル（Aldrich）が加えられた。反応混合物は0℃で１時間かくはんされ、その後 、12mlのN,N-ジメチルホルムアミドに溶かされた2.45gの粗6-アミノカプロン酸 、N'-FMOCヒドラジド、９及び2.66ml（15.28mmol）のN,N-ジイソプロピルエチル アミン（Aldrich）が加えられた。反応混合物はあざやかな黄色になった。そし てかくはんは0℃で1時間、そして更に周囲温度で2時間続けられた。その後、反 応液はろ過され、その溶媒は減圧下で蒸発させ、濃い油を残した、これは分離用 HPLC（RP-18ウォーターズ−ミリポアカラム、5x30cm，H2O/CH3CN，0.1%TFA，グ ラジエント溶離）で精製され、1.787g（前の2つの合成操作との累積収率38%）の キレート剤Aの6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジド誘導体、４を白色固体の 形で生じた。M+=849．1H NMR（DMSO,TMS）：δ7.30-8.00（m,11H），4.20-4.50 （m,4H），4.19-4.50（s,4H），3.28（s,18H），1.3-2.2（m,8H）。 ７．５．キレート剤B、５の製造 250mlの丸底フラスコに、窒素ガスのブランケットの下で、1.646g（1.79mmol ）のキレート剤Aの6-アミノカプロン酸、N'-FMOCヒドラジド誘導体、４、25mlの N,N-ジメチルホルムアミド及び1.78ml（18mmol）のピペリジン（Aldrich）を充 填した。反応混合物は周囲温度で2時間かくはんされ、次いで、その溶媒は減圧 下で蒸留され、残留物を残し、これを水200mlとジエチルエーテル150mlの混合液 に溶解した。有機層を水層から分離し、そして有機層を水50mlで２回抽出した。 水層を混合し、エーテル150mlで３回洗浄し、その溶媒を減圧下で取り除き、 0.800g（1.145mmol，収率64%）のキレート剤B，５，を無色ガラス状で得た。1H NMR（DMSO-d6,TMS）：δ7.75（s,2H），7.53（s,1H），3.20-3.4（m,8H），3.00 （bs,18H），1.20-2.05（m,6H）。 キレート剤Bの酸ヒドラジドリンカは、13節に示されるように、酸化された糖 タンパク質、特に、酸化抗体との複合に、特に適している。 ８．実施例：3,4-ジ-（(1-メチルチオホルムアミド)-4-チオセミカルバジド） 安息香酸、メチルエステル（キレート剤Ｃ）、１２の製造 キレート剤Cの合成を式３に概説する。式３ ８．１．5-カルボン酸ベンゾイミダゾール、メチルエステル、１０の製造 加熱マントル、還流凝縮器、及びDrierite（登録商標）充填乾燥管を備えた50 0ml丸底フラスコに、16.22g（0.10mol）の5-カルボン酸ベンゾイミダゾール、40 0mlの無水メタノール及びその後（注意！）20mlの濃硫酸（Fisher）を入れた。 反応混合物は18時間加熱して還流させ、次いで周囲温度まで冷却した。約75%の 溶媒を真空下で排除し、その後、残っている液体残留物を徐々に500mlの飽和重 炭酸ナトリウム液に注入した。得られた２相系は、その後、酢酸エチル250mlで ３回抽出された。有機層同士を合わせ、5%重炭酸ナトリウム液250mlで３回洗浄 し、続いてブライン食塩水250mlで１回洗浄した。酢酸エチル層はMgSO4上で乾燥 させ、ろ過し、次いで、その溶媒を減圧下で取り除き、褐色の固体として、15.6 8ｇ（0.089mol,収率89％）の5-カルボン酸ベンゾイミダゾール、メチルエステル 、10を生じた。1H NMR（CDCl3，TMS):δ7.3-7.9（m，3H）,3.70（s，3H）。 ８．２．3,4-ジイソチオシアナト安息香酸、メチルエステル、１１の製造 250ml丸底フラスコに、4.98ｇ（50mmol）の炭酸カルシウム、10mlの塩化メチ レン、及び3mlの水を入れた。得られたスラリーは、10℃に冷却され、その後、2 .27ml（3.43g，30mmol）のチオホスゲン(Aldrich)と、続いて水とアセトニトリ ルの1:1の混合液50mlに溶解された2.50ｇ（14.2mmol）の5-カルボン酸ベンゾイ ミダゾール、メチルエステル、10とを徐々に加えた。その反応混合物は４時間か くはんされ、温度は15-20℃に上げた。オレンジ白色の反応スラリーは、次いで 、ろ過され、その濾液は塩化メチレン50mlで３回洗浄した。有機層を混ぜ、MgSO4 上で乾燥させ、ろ過し、次いで、その溶媒を減圧下で取り除き、ベージュ色の 残留物を残した。この残留物を石油エーテルと共に４回すりつぶして、25℃−30 mm圧で16時間乾燥後、2.14g（8.56mmol，収率60%）の3,4-ジイソチオシアナト安 息香酸、メチルエステル、11をオフホワイトの粉体として得た。1H NMR（CDCl3 ，TMS）:δ7.85-7.95（m，2H），7.30（d，1H），3.92（s，3H）。IRは2140cm-1 で二重線(NCS)を示した。 ８．３．キレート剤C、１２の製造 50mlの丸底フラスコに、0.25g（1.0mmol）の3,4-ジイソチオシアナト安息香酸 、メチルエステル、1l、25mlのアセトニトリル、及び0.210g（2mmol）の4- メチルー３-チオセミカルバジド(Aldrich)を入れた。反応混合物を周囲温度で16 時間かくはんさせ、その時間中に白色の沈澱物が生成した。次いで、その沈澱物 をろ過し、25mlのアセトニトリルで洗浄し、25℃-20mm圧で乾燥して、0.29ｇ（0 .63mmol,収率63％）のキレート剤C，12を白色粉体の形で生じた。1H NMR（DMSO- d6,TMS）：δ7.79（d，1H），7.67（s，1H），7.20（d，1H），3.85（s，3H）， 3.35（s，6H）。MH+＝461。 キレート剤Ｃは、メチルエステルの加水分解後、ペプチドまたはプロテイン基 上のアミンへの結合および得られた遊離酸を標準の結合法、例えば、カルボジイ ミドによってアミノ基へ結合するのに適している、加えて、メチルエステルは加 ヒドラジン分解によってそれに対応する酸ヒドラジドに変換でき、これは結合部 位に特に有用である（前述）。キレート剤Cの特に有利な点は、放射性金属をキ レート化する４つのチオカルボニルが存在することである。 ９．実施例：3,5-ジ-(2-チオ-3-(2-トリメチルアンモニウムエチル)-ウレイド)-ジクロリド安息香酸（キレート剤D）、１３の製造 この実施例は、水に良好な可溶性を有するキレート剤（キレート剤D）の製法 を報告するものである。下記の実施例では、チオセミカルバジドキレート剤（キ レート剤Ｅ）の製法が報告される。両キレート剤とも、出発材料として,3,5-ジ イソチオシアナート安息香酸、２を使って生成される。その合成を式４に概説す る。式４ 磁気かくはん棒を備えた250ml丸底フラスコに、2.36g（10mmol）の3,5-ジイソ チオシアナート安息香酸、２、50mlのN,N-ジメチルホルムアミド(DMF)、3.05ｇ （22mmol）の2-塩化トリメチルアンモニウムエチルアミン、及び8.62ml（50mmol ）のN,N-ジイソプロピルエチルアミンを充填する。反応混合物は室温で22時間か くはんされ、その後、溶媒をロータリーエバポレーターで排除した。蒸留残留物 は30mlの水に溶かし、そして求める生成物、キレート剤D、13(4.71g，9.18mmol ，収率92％)は、次いで、水／アセトニトリル(0.1%TFA)グラジエント溶離剤を使 うWaters Novapakカラム(19mm x 30cm)付きの逆相分離用HPLCにより分離された 。1H NMR（D2O，TMSPA）：7.70 ppm（s，2H），7.51 ppm（s，1H），4.52ppm（t ，4H），3.56 ppm（t，4H），3.lppm（s，18H）。 １０．実施例：3,5−ジ-(4-チオセミカルバジド)-安息香酸（キレート剤Ｅ）、１５の製造 １０．１．１４の製造 磁気かくはん棒とDRIERITE（登録商標）充填乾燥管を備えた100 ml丸底フラス コに、118mg（0.5mmol）の3,5-ジイソチオシアナート安息香酸、2、25mlのDMF、 351μl（2.0mmol）のN,N-ジイソプロピルエチルアミン、及び145 mg（1.1mmol） のtert-ブチルカルバザトを入れる。得られた均質の反応溶液は室温(RT)で16時 間かくはんされ、次いで、その溶媒は減圧下で蒸発させ、淡黄色油を残した。蒸 留残留物は25mlのジクロロメタンと共にすりつぶし、無色の結晶性沈澱物を生じ た、これをろ過し、ブフナー漏斗上で乾燥し、134 mgの14（0.27 mmol，収率53 ％）を得た。1H NMR（DMSO-d6，TMS）：1.45 ppm（s，18H），7.86 ppm，（s，1 H），7.92 ppm（s，2H）。 １０．２．キレート剤Ｅ、１５の製造 100 ml丸底フラスコに、室温において、14を100 mg及びトリフルオロ酢酸と塩 化メチレンの1:1の溶液60mlを充填した。その混合液中に存在する固形物は徐々 に溶け、得られた均質の反応混合物はRTで更に３時間かくはんされた。その溶媒 を次にロータリーエバポレーターで排除し、無色の油を生じた、これを50ml部の トルエンと２回共沸した。次いで、2%のHCIを50ml加え、得られた溶液を２部分 のクロロホルム25mlで洗浄した。次いで、水層は減圧下で蒸発させ、71mg(0.19 mmol，95%)のキレート剤Ｅ、15を白色粉体として生じた。1H NMR（D2O，TMSPA） ：7.66 ppm（s，1H），7.72 ppm（s，1H）。 キレート剤Eは、ITLCにより、キレート剤のμg当たりTc-99mについて20μCiを 有する標識することが判った。 １１．実施例：２交差官能基を使ってリンカにスペーシング基を持つ２つのキレート剤の製法 この実施例は、離されたリンカ前駆体から成る発明のキレート剤の製法に関す る。そのような分子は、２つのリンカの官能性の付着を規定してキレート剤FとG を生ずることが示されている。リンカの間隔が増せば、標的分子への結合に関わ る立体干渉の可能性は減少する。これらのキレート剤を生成するための一般的概 要を式５に示す。式５ この合成図式の一つの注目すべき特長は、19は安価に作ることができ、且つ、 例えばシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより、一度に多量に精製でき るということである。この方策によって、費用のかからない19へのルートが与え られ、そしてその後の中間生成物からの、収量の低い、クロマトグラフイーによ る精製が避けられる。 １１．１．N-tert-ブトキシカルボニル-1,2-エタンジアミン、17 磁気かくはん棒、予備漏斗及び乾燥管を備えた1-L、1ネック型の丸底フラスコ に、78.75g（1.31mol）の1,2-ジアミノ-エタン、16、及び450mlの1,4-ジオキサ ンを入れた。次いで、450mlの1,4-ジオキサンに溶かした36.75g（0.168mol）の 二炭酸ジ-tert-ブチルを４時間かけて加えながら、反応液を室温で磁気的にかく はんした。反応混合物は室温にて更に22時間かくはんされ、その後、ほとんどの 溶媒はロータリーエバポレーターで排除された。750 mlの水を蒸留残留物に加え 、得られた白色スラリーを室温で２時間かくはんし、その後ろ過した。濾液を3 ×750mlのジクロロメタンで抽出し、有機層を加え、そして溶媒を減圧下で蒸発 し、24.00g（0.15lmol，収率90％）の17を淡黄色の油として残した。1H NMR（CD CL3，TMS）：1.20ppm（s，2H），1.45 ppm（s，9H），2.80 ppm（t，2H），3.15 ppm（q，2H），4.95 ppm（bs，1H）。 １１．２．19の製造 磁気かくはん棒及び乾燥管を備えた1-L、1ネック型の丸底フラスコに、8.49g( 40mmol)の3,5-ジニトロ安息香酸、18、及び500mlのDMFを入れた。得られた明る い黄色の溶液を氷／水浴で10℃まで冷却し、次いで、7.84g（41mmol）の１-（3- ジメチルアミノプロピル）-3-塩酸エチルカルボジイミド(EDCI)(Aldrich)を１度 に加えた。反応混合物に存在する固形物は徐々に溶解して明るいオレンジ色の均 質の液を生じ、次いで、100 mlのDMFに溶かした6.41g（40 mmol）の17を加えた 。反応混合物は鮮紅色になり、１時間後にその内部温度は22℃に上がった。反応 液は更に室温にて22時間かくはんされ、次いで、80mlの水が加えられた。溶媒は ロータリーエバポレーターで排除され、暗赤色の蒸留残留物を残し、これはその 後350mlの酢酸エチルで溶解した。得られた赤色の溶液は、750mlの水で１回、50 0ml部の飽和重炭酸ナトリウム液で２回、最後に飽和塩化ナトリウム液で、 洗浄した。次いで、溶媒を有機層から蒸発させ、そして求める生成物、19（5.11 g，14.4 mmol，収率36%）を、溶離剤としてクロロホルムに溶かした15%メタノー ルを使用するシリカゲルの500ｇパッドでのフラッシュクロマトグラフィーによ り得た。1H NMR（CDCL3，TMS）：1.49 ppm（s，9H），3.47 ppm（t，2H），3.63 ppm（m,2H），9.09 ppm（s，2H），9.16 ppm（s，1H）。 １１．３．20の製造 200 mlの水素添加用フラスコに、4.50g（12.7mmol）の19、200mlのメタノール 、及び約10 mgの5%Pd-C触媒を入れた。得られた不均一の混合物は、次いで、室 温にて76時間、PARRの水素化装置で水素添加された(45-48 psi)。反応液は、次 いで、CELITE（登録商標）のパッドを通してろ過され、溶媒は減圧下で蒸発させ て暗赤色の固形の蒸留残留物を得た。求める生成物、20（2.69g，9.14mmol，収 率72%）はこの粗混合物から、溶離剤としてCHCl3に溶かした15%CH3OHを使用する シリカゲルの500gパッドでのフラッシュクロマトグラフィーにより得られた。IR （Nujol）は3459cm-1（NH2）で二重ピークを示した。 １１．４．22の製造 磁気かくはん棒を備えた1-Lの１ネック丸底フラスコに、0.70g（2.38mmol）の20 、200mlのDMF、及び4mlのDIEAを入れた。次いで、反応液は約10℃まで冷却さ れ、0.5mlのチオホスゲンが１回分加えられた。暗オレンジ色の反応混合物はRT まで暖められそして1.5時間かくはんされた。次いで、溶媒はロータリーエバポ レーターで排除され、21の約４ｇの暗赤色固形混合物及びN,N-ジイソプロピルエ チル塩酸アンモニウムを残した。２ｇ（推定約1.19mmol）の蒸留残留物はそれか ら50 mlのDMFに溶かし、その得られた液に、25mlの水に溶かした0.67g（4.Ommol ）のジラール試薬-Ｔが加えられた。暗赤色の反応液はRTにて36時間かくはんさ れ、次いで、その溶媒をすっかり蒸発させ、濃いシロップを残した。求める生成 物、22（0.50g，0.69mmol，収率58%）は、蒸留残留物から、水／アセトニトリル の勾配（0.1% TFA）溶離剤を使う分離用HPLC（Waters Novapak C-18カラム、直 径1.92cm×長さ30cm）により分離された。1H NMR（D2O，TMSPA）：３.26 ppm（t ，2H），3.34 ppm（s，9H），3.70 ppm（t，2H），4.21 ppm（ｓ，4H），7.62 p pm（s，1H），7.71 ppm（s，2H）。マススペクトル分析では、543.3でMW-1のピ ークを示 した。 １１．５．3,5-ジ-(2-チオ-3-(N-トリメチルアンモニウムアセトイミド)-ウレ イド)-安息香酸、((N'-3-(2-ピリジルジチオ)-プロピルアミド)-1, 2-ジアミノエタン)-アミドジクロリド(キレート剤F)、23の製造 磁気かくはん棒及び乾燥管を備えた250mlの１ネック型丸底フラスコに、0.205 （0.315mmol）の22、40mlの乾燥DMF、及び165μl（0.945mmol）のDIEAを入れた 。この混合物に、0.103gの3-（2-ピリジルジチオ）プロピオン酸、Ｎ-ヒドロオ キシスクシンイミド エステル（Sigma）を加え、得られた反応混合物は室温で 更に３時間かくはんされた。次いで、溶媒はロータリーエバポレーターで排除さ れ、明るい黄色の蒸留残留物を残し、これを水に溶かした25%アセトニトリル3ml に溶解した。その後、所望の生成物、キレート剤F，23（0.087g，0.106mmol，収 率34%）は、水／アセトニトリルの勾配（0.1%TFA）を使う分離用HPLC（Water'sN ovapak C-18カラム、直径1.9cm×長さ30cm）により分離された。1H NMR（D2O,TM SPA）：3.39 ppm（s，18H），3.53 ppm（m，2H），4.31 ppm（ｓ，4H），7.58 p pm（s，1H），7.80 ppm（s，2H）。マススペクトル分析では、738.5（MW-1）で 一つのピーク及び369.4で二重荷電のピークを示した。 １１．６．3,5-ジ-(2-チオ-3-(N-トリメチルアンモニウムアセトイミド)-ウレ イド)-安息香酸、((N'-3-マレイミドプロピルアミド)-1,2-ジアミ ノエタン)-アミドジクロリド(キレート剤G)、24の製造 ミニかくはん棒を備えた20mlの反応びんに、160mg（0.22mmol）の22、5mlのDM F、及び175μlのDIEAを入れた。得られた液は、氷／水浴において11℃まで冷却 され、次いで、75mg（0.30mmol）の３-マレイミドプロピオン酸、2mlのDMFに溶 かされたN-ヒドロオキシスクシンイミド エステル（Sigma）が１度に加えられた 。反応びんは密閉され、反応混合物は室温まで暖められそして更に３時間かくは んされた。その後、溶媒は減圧下で取り除かれ、無色の蒸留残留物は20mlの水に 溶かされ、それに５滴のトリフルオロ酢酸が加えられて、透明液を生じた。所望 の生成物、キレート剤G，24（117mg，0.15mmol，収率70%）は、水／アセトニト リルの勾配溶離剤（0.1%TFA）を使う分離用HPLC（Water' s Novapak C-18カラム 、直径1.9cmｘ長さ30cm）により分離された。1H NMR（D2O，TMSPA）： 3.35 ppm（m，2OH），3.50 ppm（m，2H），3.73 ppm（m，4H），4.28 ppm（s，4 H），6.74 ppm（s，2H），7.68 ppm（bs，3H）。マススペクトル分析では、764. 5（MWー1）で一つのピーク及び282.3で二重荷電ピークを示した。 １２．ペプチド複合体及び同位元素標識の製造 １２．１．キレート剤AとSYRGDVRGDF-NH2ペプチドとの結合 無水条件下で、20mlの反応びんに、7.0mg（12.24 mmol）のキレート剤A、5.9m lの乾燥N,N-ジメチルホルムアミド、3.7mg（28.7mmol）のN,N-ジイソプロピルエ チルアミン、及びN,N-ジメチルホルムアミド（Applied Biosystems）に溶かされ たHBTU/H0Bt（それぞれは2-（1H-ベンゾフォリアゾール-1-イル）-1,1,3,3-テト ラメチルウロニウム・ヘキサフルオロリン酸塩と1-ヒドロオキシベンゾトリアゾ ール）の0.5M溶液74ml（37.0mmol）を充填した。反応混合物はすぐに明るい黄色 になり、周囲温度で0.5時間、その状態におかれた。この液の一部1.55mlは、次 いで、3.0mg（2.0mmol）のSYRGDVRGDF-NH2ペプチドを含有する反応びんに加えら れた。反応液は周囲温度に３時間そのままにしておき、その後、溶媒を減圧下で 蒸発させた。ペプチド複合体生成物（分析用HPLCの追試は新ピーク観測）は、水 ／アセトニトリルの勾配溶離剤を使う分離用HPLC（Waters-Millipore RP-18，19 mm×30cm SSカラム）により分離された（2.4mg，1.2mmol，収率60%）。分離され た複合体は、アミノ酸分析で予期されたペプチドのプロフィールを示した。 １２．２．Tc-99Mによるペプチド複合体の標識化 pH 4.5の酢酸ナトリウム20 nMに溶かしたペプチド複合体生成物4.0mgを含有す る新規作成の混合物は、0.22μの酢酸セルロース・フィルターを通してガラス製 試験管に入れた。次いで、過テクネチウム酸ナトリウムをGLUCOSCAN（登録商標 ）キット（DuPont，Bitterica，MA）に加えて作られたTc-99mの200 mCiの液をそ の試験管に加え、37℃で90分間、保温した。保温された材料１μlは、シリカゲ ル含浸瞬間薄層クロマトグラフィー（ITLC）のガラスファイバシート上に滴下さ れた。その後、ITLCのシートは、0.9%の食塩水1.5mlが含まれている10mlのガラ スびんの中に入れた。クロマトグラフィーを1.5分間実行し、次いで、ITLCの試 験片を取り出し乾燥させた。その試験片を半分に切り、そして上部下部の両部分 をLKBのガンマ計数管で計数した。ITLC試験片の下部に残存するガンマ線のパー セント は、”取込みパーセント”と命名された。複合体もまた増量したTc-99m-GLUCOSC AN（登録商標）と共に保温し、そのキレート化容量を検定した。 １２．３．放射性標識化の結果 ペプチド複合体の錯体はITLCのプレート上を移動しないが（スプレー式ペプチ ド検出試薬で確認）、Tc-GLUCOSCAN（登録商標）は移動する。従って、ITLCプレ ートの上部及び下部でのガンマ線を測定することにより、ペプチド−キレート剤 複合体におけるTc取込み量に関する定量的輪郭が計算できる。その結果は次の通 り： cpm ITLC試験片下部 1752221.2 ITLC試験片上部 117530.0 ペプチド−キレート剤複合体上へのTc-99m取込みのパーセント：94%。 別の実験から得た代表的なITLCのオートラジオグラムを図１に示す。図２は、 Tc-99mをキレート化するためペプチドに複合されたキレート剤Ａの容量を示す。 その結果は、キレート剤A-ペプチド複合体のng当たり50と100μCiの間の容量を 示す。 １３．実施例：抗体複合体の製法とTc-99m放射性標識化 １３．１．材料と方法 １３．１．１．酸化処理 抗体B72.3（”抗体”）の酸化は、米国特許No．4,741,900に教示された酸化手 続きに準じて達成された。この抗体は、ヒトの乳ガン抗原に特異的である（Colc her等、1981，Proc．Natl．Acad．Sci．U.S.A．78:3199-3203）。特に、抗体に 対し383倍モル過剰のメタ過ヨウ素酸ナトリウムが使われた。その抗体は、6.2mg /mlのホスフェート緩衝塩水（PBS），pH 6の溶液中にいれた。その混合物は、室 温で１時間暗所において保温された。 次いで、余分の過ヨウ素酸は、0.1M酢酸塩緩衝液pH 5.0で平衡化されていたア クリルアミン樹脂（”Speedy”カラム、Pierce Chemical Co.）でのゲル濾過ク ロマトグラフィーを用いて排除された。酸化された抗体は、CENTRICON-30（登録 商標）（Amicon）を使って、0.1M酢酸塩緩衝液pH 5.0で4.73mg/mlに濃縮され た。 １３．１．２．複合処理 複合は、0.1M酢酸塩緩衝液pH 5で酸化抗体を約5mg/mlに濃縮することで実行さ れた。キレート剤Ｂ（上記、キレート剤Ａ（キレート剤Ｂ）のヒドラジドリンカ の類似体の製造法，５）は、酢酸塩緩衝液で作られ、酸化抗体の分子当たりのア ルデヒド数に対し1Xまたは3Xの何れかのモル超過で加えられた。 複合体は、室温で一晩、反転混合しながら保温された。個々の複合反応混合物 は、280及び300nmにおけるUV吸収を監視しながら、流量0.5ml／分でPBS，pH 6で 運転されるガラスTSK G3000SWカラム付きHPLCでそれぞれ精製された。留分は35 分運転を通して毎分採取された。IgGピークに対応する採取された画分は、280nm で素早く読みとられ、適当な画分を混ぜ、全容積を測り、プロテイン濃度を決定 した。各複合体はPBS pH 6緩衝液中でAmiconかくはん細胞装置により2.0-2.5mg/ mlに濃縮し、次に2-8℃でマイクロ遠心分離管に保管した。 １３．１．３．Tc-99mの放射性標識化処理 放射性標識化は、確立されている方法（上記５．３節参照）に準拠するTc-99m -GLUCOSCAN（登録商標）を用いて実施された。還元されたTc-99mをPBS pH 6の緩 衝液中で作成された複合体に付加した。試料は室温にて１時間保温され、その取 込みパーセントは、塩水で展開されるITLC（上記１２．２節参照）により決定さ れた。試料はまた、1.0 ml／分−PBS pH 6のTSK G3000SWXL付きHPLCにより分析 された。画分は注入後５分から始めて0.4分間隔で採取された。採取された画分 はガンマ計数管で計数され、プロテインピークに対する放射能ピークの関連性を 示すため曲線をプロットした。 １３．２結果 HPLC実行によって得られた結果を図３および４に示す。これらの実行によって 、放射能は、酸化抗体−キレート剤Ｂの複合体におけるIgGと関連することが示 された。酸化抗体だけ及び非反応性キレート剤Ａ化合物に混合された酸化抗体の 負の対照から、化合物がそこで溶離する塩のピークとのみ関連し、抗体とは全く 関連しないことが示される（図５）。 １４．実施例：Tc-99m-標識キレート剤の生物分布 本発明のキレート剤−Tc-99mの錯体は正常な生物分布特性を有することを示す ため、生物分布検定が実行された。対照として、Tc-99m-GLUCOSCAN（登録商標） が使用された。Tc-99m-GLUCOSCAN（登録商標）またはキレート剤A-Tc-99mの試料 を腫瘍を持たないBALB/cマウスに注入した。生物分布は、器官のグラム当たりの 放射能量（CPM）を測ることにより評価され、血液のグラム当たりの放射能量（C PM）に規格化された。放射能は注入後４時間及び23時間に測定された。その結果 を図６に示す。キレート剤A-Tc-99mの錯体は、Tc-99m-GLUCOSCAN（登録商標）と 類似した生物分布特性を有していることが結果に示されている。 １５．実施例：Tc-99m-標識抗体による腫瘍の撮像 上記の１０節で作られたTc-99m-標識抗体−キレート剤Ｂの複合体の生物分布 が検定された。ネズミ科の腫瘍は、その複合体よって特異的に標的とされ、ガン マカメラで撮像された。 １５．１．材料及び方法 LS174Tの腫瘍を持つヌードマウスは、約500μCiのTc-99m-標識抗体−キレート 剤Ｂの複合体を０日に静脈内に注入された。対照マウスには、複合されていない 抗体（20μg）とTc-99m-標識キレート剤B（500μCi）の混合物を与えた。複合及 びTc-99m-標識化の処理法は上記の１３節に記述されている。 マウスは、静脈内（後方眼縁部静脈洞）に注入され、注入後直ちに線量キャリ ブレータで計数された。使用された注射器も秤量及び計数された。各マウスに対 するTc-99mの線量は、Tc-99m用線量キャリブレータで測定され、平均値の70%以 内のマウスのみを対象とした。動物は、投与後、及び１日１回、外観、しぐさ、 排泄機能及び排泄物について観察され、0.1グラム以内の精度で秤量された。 各グループからの２匹のマウスは、注入の後、３時間と20.5時間に撮像された 。血液もまた、注入に使われたのとは反対側の後方眼縁部静脈洞から、注入後種 々の時間に得た。 解剖直前に、各動物の腫瘍はカリパスを使って測定された。注入に使われたの とは反対側の後方眼縁部静脈洞から250μlの血液試料を得、秤量した。次の器官 は、外来組織を排除するよう注意深く解剖した後、最小ミリグラム近くまで秤量 された：(1)血液、(2)肺臓、(3)牌臓、(4)肝臓、(5)右腎臓、(6)左腎臓、(7)腫 瘍、(8)筋肉、及び(9)大腿骨。 １５．２．結果 Tc-99m-標識抗体−キレート剤Ｂの複合体を注入された腫瘍を持つマウスのガ ンマカメラ像を図７に示す。注入後３時間で、腫瘍はバックグランドを背にして ハッキリと見ることができる（図7a）。注入後20.5時間でも腫瘍は依然として明 らかに観察でき（図7b）、バックグランド信号は、かなりその時間までに減少し ていた。 １５．３．結論 本発明のキレート剤は、撮像のため、標的分子、例えば抗体、を標識するのに 使うことができる。ここに示すように、腫瘍はネズミ科のモデル系で撮像するこ とができる。 ガンマカメラの結果から、腎臓からのTc-99mの非特定信号は相対的に低いこと が解る。非キレート化のTc-99mは、しばしば非特異的に腎臓に局在する故、この 結果は特に満足のいくものである。 １６．実施例：ペプチド−キレート剤Ａ複合体による血栓の撮像 Tc-99m標識のペプチドSYRGDVRGDF-キレート剤Ａ複合体のラビット血栓への取 り込み特異性は、誘導血栓を有する動物で得られた組織の取込み及び像と、誘導 血栓を持たないで模擬手術を受けるそれらとを直接比較することにより決定され た。 １６．１．材料及び方法 ３ラビットから成る２グループが使われた。全ての動物は、下に詳述するよう に、手術に供して外面の頸静脈を露出させた。第一の動物グループでは、頸静脈 を止め、絹糸をその頸静脈に挿入した。これらの静脈にも、0.1mlの等張性の塩 水に溶かした10単位のウシ属の血栓を注入した。第二の（模擬対照の）動物グル ープは、これらの動物の静脈には絹糸を挿入しなかったこと及び0.1mlの等張性 の塩水だけを注入したこと以外は、実験グループと同じ手術処置を施された。一 度に６匹の動物を扱う際の計画上の困難さから、実験は３部に分けて行われ、各 部は３日毎に平行して処置される１模擬及び１血栓誘導動物から構成された。特 定の病原体を持たないニュージーランド白ラビット（2-2.6 kg）が使用された。 ラビットは、表Ｉに示すように試験用にグループ分けされた。 ラビットに実験用の血栓を誘導するのに、Collen等（1983，J．Clin．Invest ．71:368-376）のモデル系が（下に記述するように多少修正して）使用された。 動物は、40 mg/kgの塩酸ケタミン及び4 mg/kｇのマレイン酸アセプロマジンの筋 肉注射によって麻酔がかけられた。手術のすぐ前に、動物は10 mg/kgのペントバ ルビタールナトリウムを注入され、これは、手術進行中も必要に応じて適用され た。頸部領域を剃毛し、防疫用殺菌消毒剤を塗布した。頸静脈は、約5 cmの中央 近くの切開によって露出させ、約4 cm距離にわたって（顔面静脈の主分岐部まで ）組織から離し、頸部の側分岐は結ばれた。１インチの体節は血止かん子で締め られ、実験用（グループ１）の動物には、絹糸を静脈内部に長さ方向におき、そ の両端をしばった。模擬対照の（グループ２）の動物の静脈には縫合はしなかっ た。0.1mlの等張性の塩水に溶かした10単位のウシ属の血栓（または模擬対照の 動物では塩水だけ）を締め付けられた静脈体節に27ゲージの針を使って注入した 。30分後、その動物全部に、2-7μCiのTc-99m標識ペプチド−キレート剤Ａ複合 体の混合物を（対側の端の耳静脈に）静脈注入で与えた。 上記実施例７のように作成されたペプチド−キレート剤Ａ複合体は，次のよう に、Tc-99mで放射性標識された。Tc-99mは、モリブデン製発生器から溶離され、 等張性の塩水で40 mCi/mlに調節された。この50 mCiの調製品は、GLUCOSCAN（登 録商標）びん（Dupont，Billerica，MA）に移され、混合された。その後、6 mCi のTc-99m/グルコサン混合物が、50μgのペプチドーキレト剤Ａ複合体を含んでい るびんに加えられ、室温で１時間保温された。この保温時間後、材料は適当に標 識された5 mlの注射器に取り出され、そして試料は瞬間薄層クロマトグラフィー （ITLC） によって分析され、上記実施例７［放射性標識化の結果］に記述されたように放 射化学的純度が決定された。この材料は、放射化学的純度が95%より大きく、且 つ注入に使える放射能量が、このプレトコール（例えば、4.8-7.3 mCi）に必要 な量の20％以内であるときだけ、ラビットへの注入用として受け入れることがで きた。 各注入剤のうち、３つの10μl試料は続いて行うガンマ計数及び崩壊補正用と して保管した。 試験材料を含んでいる各注射器はTc-99mを計るためにセットされた線量キャリ ブレータで計数された。動物には、対側端の耳静脈に挿入されたバタフライ型カ テーテルを通して注入された。動物は、先ずペプチドーキレト剤Ａ複合体-Tc-99 mを注入され、その後、そのカテーテルは2-5 mlの塩水で洗い流された。各注入 時間（分単位に切上げ）は実験ノートに記録された。各動物の体重は、使用に先 立ち、最小10グラム単位に切り上げて記録された。 動物は、注入完了から犠牲にする時まで少なくとも１時間毎に総合的効果につ いて監視された。どの様な悪影響または死亡数も記録された。次の観察期間まで 生き残ると思われない動物は、安楽死させた。 像は、注入後、５分、１時間、２時間および４時間に撮られた。注入前、動物 は広視野のビューガンマカメラ（General Electric，Milwaukee，WI，USA）を使 って、胸部前方所見を撮れるように配置された。カメラは、20%ウインドウで140 KeVの放射が得られるよう、低エネルギの全目的コリメータが装備された。Macin tosh IIx型コンピュータは、Nuclear Mac A/Dボード及びソフトウェア（Scienti fic Imaging，Denver，CO，USA）を使ってカメラとインターフェースされた。最 初、コンピュータは、トータル10分に対し10秒コマの動的連続データが得られる ようセットされた。その処理は放射トレーサーを注入直前に開始された。指定さ れた間隔で、10秒静止の、胸部前方所見が得られた。これらの像は、血液からの 放射能の排除化速度を決めるために使用された。各コマで、対象部位は心臓周辺 からとられた。心臓部位のカウントは崩壊について補正され、心臓部位での最大 カウントのパーセンテージとして表された。最初の動的処理の完了後直ちに、お よびその後、ほぼ１時間間隔で、ラビットは、頭部及び頸部の前方所見を 撮るために再配置された。静止像は、256×256のマトリックスで得られ、500,00 0カウントが累積された。 得られた像の写真および／またはフィルムは、像が撮影された時、動物に注入 されたのはどの試薬なのか、またグループ１またはグループ２のどちらのグルー プの動物なのかを知らない３人の別々の読み手による盲方式で評価してよい。像 評価には次の尺度を使うことができる： 判定 スコア 像観察されず........................................ ０ かすかな像／局在化が生じた低信頼性.................. １ 中位の像／像発生の中位信頼性........................ ２ はっきり識別できる像／局在化が生じた高信頼性........ ３ 全ての動物は、注入後４時間（240分）で解剖された。3 mlの血液試料が採取 され、その後、動物は、T-61安楽死溶液（American Hoechst，Sommerville，NJ ）の静脈注射で安楽死させた。静脈の体節は手術で取り出し、（もしあれば）そ の中の血栓を静脈から分離させた。対側静脈の体節も取り出し、および筋肉の試 料は、外科分野で頸部の末梢部領域から得た。次の組織は、注意深い解剖と外来 組織を取り除くトリミングに続いて、電子分析天秤で最小ミリグラム近くまで秤 量された： 凝塊（標的） 糸（静脈部内） 脈管 糸（静脈部外） 血液 対側静脈試料 筋肉 凝塊が耳静脈に沿って進行しているのが観察される場合、更にこの静脈から試 料を採取した。 解剖された器官は、番号を付けた試験管にいれ、秤量した。これらの管はラッ クに移され、それらの中の放射能はガンマ計数によって測定された。 １６．２．結果 ガンマカメラの撮像（図８）は、Tc-99m-標識SYRGDVRGDF-キレート剤Ａ複合体 が、処置後２時間（図8a）及び４時間（図8b）で、矢印領域の凝塊に局在してい る ことを示している。頭部の領域は暗く、非特異的であるペプチド−キレート剤Ａ に関し血液プールの蓄積を反映している。表IIの結果は、Tc-99m-標識ペプチド ーキレート剤Ａ複合体の凝塊への特異的局在化を示している。相対的標的化は、 組織のグラム当たりの注入線量のパーセント（%ID/G）によって反映される。凝 塊については、この値は0.33％で、これは血液脈管より４倍、血液より８倍大き かった。 １）組織のグラム当たりの注入線量のパーセント 血小板凝集計（Zucker，1989，Meth．Enzymol．169:117に記述されているよう に実行した）よりのデータは、表III示されるように、本来のペプチドに比して ペプチド−キレート剤Ａ複合体の、十分か、またはむしろ向上した凝塊を結合す る効力を示している。 １６．３．結論 前出の実施例は、この発明のペプチド−キレート剤の複合体は生体内撮像に使 えることをはっきりと表示している。特に、これらのデータは、SYRGDVRGDFのよ うなペプチドは、生体内の、例えば、活性化された血小板を標的にすることがで き、更に血液凝塊を撮像するのに当然有用である。 本発明は、ここに記述された特定の実施態様によって範囲を限定されるもので はない。事実、ここに記述されたものに加えて、本発明の種々の変更ができるこ とは、前出の記述及び添付図によりこの分野に熟練した当業者に明かであろう。 前述の変更は、添付クレームの範囲内に入ると考える。 種々の文献が引用され、それらの開示はその全体が参考として組み入れられて いる。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ Ｃ０７Ｃ 335/16 7106−4Ｈ Ｃ０７Ｄ 207/452 8217−4Ｃ 213/34 9164−4Ｃ Ｃ０９Ｋ 3/00 １０８ Ｃ 9155−4Ｈ // Ａ６１Ｋ 39/44 9284−4Ｃ Ｇ０１Ｎ 33/58 8310−2Ｊ (72)発明者 ベリンカ，ジュニア．，ベンジャミン エ ー. アメリカ合衆国 08824 ニュージャージ ー，ケンダル パーク，ペルハム ロード 15

Claims (1)

  1. 【特許請求の範囲】 １．式 〔式中、Lはリンカ；Dは、NHCSNHR基で置換されたアルキルバックボーン、環式 アルキルバックボーンまたはアリールバックボーン基を示し；Ｒは水素または一 般式 （式中、a=0または1;b=0-10;c=0または1;もしc=1なら,Y=S,0またはH2;d=0-2;e=0 -10;Z=H,N+(R')3X-,SO3H,CO2H,OH,H2PO3;ここでX-はハロゲン化合物または酸ア ニオンのような対イオンを示し、R’はC1からC4の低級アルキルを示す）の置換 基を示す〕 で表わされることを特徴とするキレート剤。 ２．Ｄが、エタン、プロパン、ブタン、シクロペンタン、シクロヘキサン、およ びシクロヘプタンから成る群から選択される請求項１記載のキレート剤。 ３．式 〔式中、Lは1位およびNHCSNHR基は2,3-または3,4-位にあり、Rは水素または一般 式 （式中、a=0または1;b=0-10;c=0または1;もしc=1なら，Y=S,0またはH2;d=0-2;e= 0-10;Z=H,N+(R')3X-,SO3H,CO2H,OH,H2PO3;ここでX-はハロゲン化合物または酸 アニオンのような対イオンを示し、R'はC1からC4の低級アルキルを示す）の置換 基を示す〕 で表わされることを特徴とするキレート剤。 ４．NHCSNHR基が3,4-位にある請求項３記載のキレート剤。 ５．式 〔式中、Lは1位およびNHCSNHR基は2,4-または3,5-位置にあり；Rは水素または一 般式 （式中、a=0または1;b=0-10;c=0または1;もしc=1なら,Y=S,0またはH2;d=0-2;e=0 -10;Z=H,N+(R')3X-,SO3H,CO2H,OH,H2PO3;ここでX-はハロゲン化合物または酸ア ニオンのような対イオンを示し、R'はC1からC4の低級アルキルを示す）の置換基 を示す〕 で表わされることを特徴とするキレート剤。 ６．NHCSNHR基が3,5-位にある請求項５記載のキレート剤。 ７．Lが、Dから0から約20原子離れている請求項１，３または５記載のキレート 剤。 ８．Lの反応基が、第一級アミン、ヒドラジド、酸ヒドラジド、チオ酸ヒドラジ ド、セミカルバジドまたはチオセミカルバジドから成る群から選択されることを 特徴とする請求項１，３または５記載のキレート剤。 ９．Lの反応基が、反応製ジスルフィド基、p-水銀安息香酸基およびマレイミド 基から成る群から選択される請求項１，３または５記載のキレート剤。 10．Lの反応基がカルボン酸、カルボン酸エステル、イソチオシアン酸塩および コハク酸から成る群から選択される請求項１，３または５記載のキレート剤。 11．Rが、式 （式中、Y=Sまたは0,a=1,c=0または1,e=0または1,及びZはHまたは極性基を示す ）である請求項１，３または５記載のキレート剤。 12．Zがアミンまたはその塩、酸またはその塩、及びヒドロキシ基から成る群か ら選択される請求項１１記載のキレート剤。 13．アミン−塩が、塩化トリメチルアンモニウム、酢酸トリメチルアンモニウム 、またはトリフルオロ酢酸トリメチルアンモニウムである請求項１２記載のキレ ート剤。 14．請求項１，３または５記載のキレート剤と、標的分子を含む複合体。 15．標的分子が、抗体、抗体のFabもしくはFab'フラグメント、または抗体のF(a b')2フラグメントである請求項１４記載の複合体。 16．標的分子がペプチドである請求項１４記載の複合体。 17．標的分子がプロテインである請求項１４記載の複合体。 18．請求項１，３または５記載のキレート剤と、金属イオンとから成る錯体。 19．金属イオンが、テクネチウム、レニウム、銅、水銀、鉛及びビスマスから成 る群から選択される同位元素である請求項１８記載の錯体。 20．金属イオンがテクネチウム-99mである請求項１９記載の錯体。 21．請求項１４記載の複合体と金属イオンを含む錯体。 22．金属イオンが、テクネチウム、レニウム、銅、水銀、鉛及びビスマスから成 る群から選択される同位元素である請求項２１記載の錯体。 23．金属イオンがテクネチウム-99mである請求項２２記載の錯体。 24．Lが、-CONHNH2である請求項８記載のキレート剤。 25．Lが、カルボン酸またはカルボン酸メチルエステルである請求項１０記載の キレート剤。 26．RがNHCOCH2N+(CH3)3X-であり、式中X-がハライドイオン、およびLが酸ヒド ラジドである請求項６記載のキレート剤。 27．RがNHCOCH2N+(CH3)3X-であり、式中X-がハライドイオン、およびLが酸ヒド ラジドである請求項６記載のキレート剤。 28．Rが(CH2)2N+(CH3)3X-であり、式中X-がハライドイオン、およびLがカルボン 酸である請求項６記載のキレート剤。 29．RがNH2であり、およびLがカルボン酸である請求項６記載のキレート剤。 30．RがNHCOCH2N+(CH3)3X-であり、式中X-がハライドイオン、およびLがピリジ ルジスルフィドである請求項６記載のキレート剤。 31．RがNHCOCH2N+(CH3)3X-であり、およびLがマレイミドである請求項６記載の キレート剤。 32．RがNHCSNHCH3であり、及びLがカルボン酸エステルである請求項４記載のキ レート剤。 33．請求項２６、３０または３１記載のキレート剤と、抗体、抗体のFabもしく はFab'フラグメント、または抗体のF(ab')2フラグメントを含む複合体。 34．請求項３３に記載の複合体と金属イオンを含み、金属イオンがテクネチウム -99mであることを特徴とする錯体。 35．請求項２７、２８または２９記載のキレート剤と、ペプチドまたはプロテイ ンを含む複合体。 36．請求項３５に記載の複合体と金属イオンを含み、金属イオンがテクネチウム -99mであることを特徴とする錯体。 37．治療上有効量の請求項１８記載の錯体と製剤上受け入れられる担体を含む製 剤組成物。 38．検出可能な量の請求項１８記載の錯体から成る診断用組成物。 39．金属イオンがテクネチウム-99mである請求項３８記載の診断用組成物。
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