JP2003532681A - 遺伝子導入により産生されたデコリン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 遺伝子導入により産生されたデコリンおよび遺伝子導入により産生されたデコリンを産生および使用する方法。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】 本出願は、ここに完全に引用される2000年5月5日に先に出願された米国仮特許
出願第60/201,932号の恩恵を主張する。

【０００２】 発明の背景 ますます多くの組換えタンパク質が、治療、診断、農業、獣医、栄養および他
の用途のために開発されてきている；しかしながら、これらのタンパク質の多く
は、従来の方法を使用して大量に機能的な形態で産生することは困難であるかま
たは費用がかかる。

【０００３】 従来の方法は多くの場合、特定のタンパク質を産生する遺伝子を細菌、酵母、
または哺乳類細胞のような宿主細胞中に挿入する工程を含む。細胞を培養培地で
培養し、所望のタンパク質を細胞または培養培地から回収する。従来の細菌また
は酵母系は、機能的な形態で複雑なタンパク質を産生することができない場合が
ある。いくつかの哺乳類細胞は複雑なタンパク質を再生産することができるが、
多くの場合培養が困難であるかまたは費用がかかり、比較的少量のタンパク質し
か産生しない。さらに、非分泌タンパク質は多くの場合、培養培地中に分泌され
ないので、原核細胞または哺乳類細胞から精製するのが比較的困難である。

【０００４】 PG-IIまたはPG-40としても知られるデコリンは、繊維芽細胞により産生される
小さいプロテオグリカンである。そのコアタンパク質は、約40,000ダルトンの分
子量を有する。コアは配列決定され（ここに引用されるクルシウスおよびルオス
ラティ(Krusius and Ruoslahti)著, Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 83:7683(19
86)）、コンドロイチン硫酸／デルマタン硫酸型の一本のグリコサミノグリカン
鎖を有することが知られる（ここに引用されるイー.ルオスラティ(E. Ruoslahti
)著, Ann. Rev. Cell Biol., 4:229-255(1988)）。デコリンのほとんどのコアタ
ンパク質は、約24アミノ酸のロイシンに富む繰返し(LRR)の存在により特徴付け
られる。

【０００５】 プロテオグリカンは、1つ以上のグリコサミノグリカン鎖を有するタンパク質
である。既知のプロテオグリカンは、広範囲の機能を有し、様々の細胞位置で見
られる。多くのプロテオグリカンは、マトリクスの凝集に関与しマトリクスへ細
胞を接着させる細胞外マトリクスの成分である。

【０００６】 デコリンは、TGF−βにより誘発される細胞増殖および細胞外マトリクスの産
生を妨げるために使用されてきた。したがってデコリンは、癌、糸球体腎炎およ
び余剰マトリクスにより特徴付けられる病状のような、TGF−βで調節される活
性により引き起こされる病状を低減または抑制するために有用である。例えば、
癌において、デコリンを使用して、癌細胞における活性を刺激するTGFβ−1を産
生させなくすることができる。デコリンはまた、細胞外マトリクスのタンパク質
を必要とする傷の収縮を低減または抑制するのに有用である。

【０００７】 発明の概要 概して、本発明は、遺伝子導入により産生されたデコリン、好ましくはヒトデ
コリンの製剤を特徴とする。

【０００８】 遺伝子導入により産生されるデコリンは、トランスジェニック生物、すなわち
トランスジェニック植物または動物中で産生される。好ましいトランスジェニッ
ク動物には、哺乳類；鳥類；爬虫類；および両生類が含まれる。適切な哺乳類に
は、反芻動物；有蹄動物；家畜動物；および酪農動物が含まれる。特に好ましい
動物には、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、メウシ、ブタ、ウマ、オウシ、ウサギおよび
ラマが含まれる。適切な鳥類には、ニワトリ、ガチョウおよび七面鳥が含まれる
。トランスジェニックタンパク質がトランスジェニック動物の乳中に分泌される
場合、動物は1年に少なくとも1、より好ましくは少なくとも10、または100リッ
トルの乳を産生することができなければならない。

【０００９】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
好ましくはトランスジェニック生物中で生成され、天然発生の非トランスジェニ
ック供給源から検出されるまたは単離されるあるいは細胞培養中で組換えにより
産生されるデコリンから単離されるデコリンのグリコシル化と比較して、グリコ
シル化が80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、または5%未満である（グリ
コシル化された製剤中の分子の数の点から、または製剤中の分子量への糖の全体
的な寄与の点から）。好ましくは、遺伝子導入により産生されるデコリンは、グ
リコサミノグリカン(GAG)鎖を有しない。好ましい実施の形態において、デコリ
ンの製剤は、GAG鎖を有するデコリン分子が50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%ま
たは1%未満である製剤である。別の好ましい実施の形態において、製剤が有する
、GAG鎖を有するデコリン分子対GAG鎖を有しないデコリン分子の割合は、約1:2
、1:3、2:3、1:4、3:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9である。

【００１０】 好ましい実施の形態において、トランスジェニック製剤は、好ましくはトラン
スジェニック生物中で生成され、グリコシル化および非グリコシル化形態を含み
、グリコシル化形態のいくつかまたはすべては、例えば標準的な分離方法により
、例えば乳のような体液から除去される。

【００１１】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳腺で生成される。

【００１２】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳中に分泌される。

【００１３】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されるデコリンは、乳腺
特異的プロモーター、例えば乳血清またはカゼイン特異的プロモーターのような
乳特異的プロモーターのコントロール下で生成される。乳特異的プロモーターは
、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸性タン
パクプロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターでもよい。

【００１４】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、膀胱または卵特異的プロ
モーターのコントロール下で生成され、尿または卵中に分泌される。

【００１５】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
平均分子量、活性、クリアランス時間、またはタンパク質分解に対する耐性にお
いて非遺伝子導入形態と異なる。

【００１６】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグ
リコシル化は、細胞培養中で組換えにより産生されたデコリンから検出されるま
たは単離されるデコリンと異なる。

【００１７】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック生物から発現され、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤の
グリコシル化は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、例えばCHO、COS、またはHeLa
細胞のような培養哺乳類細胞から検出されるまたは単離されるデコリンのグリコ
シル化と異なる。

【００１８】 好ましい実施の形態において、例えばSDS-PAGEにより測定されるような、デコ
リン製剤の電気泳動度は、天然発生ヒトデコリンの電気泳動度と異なる；この製
剤の電気泳動度は、例えばCHO、COS、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、また
は細菌のような原核細胞、酵母、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより
産生されたヒトデコリンの電気泳動度と異なる。

【００１９】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、天然発生ヒトデコリンと
少なくとも1つのアミノ酸残基により異なる；このデコリンは、例えばCHO、COS
、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例えば細菌のような原核細胞、または酵
母、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより産生されたヒトデコリンと少
なくとも1つのアミノ酸残基により異なる。

【００２０】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンのアミノ酸配列は、哺乳類ま
たは霊長類、好ましくはヒトのデコリンのものである。

【００２１】 好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10、または100ミリグラ
ムのデコリンを含む。好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10
、または100グラムのデコリンを含む。

【００２２】 好ましい実施の形態において、製剤は、1ミリリットルごとに少なくとも1、10
、100、または500ミリグラムのデコリンを含む。

【００２３】 別の態様において、本発明は、組織特異的プロモーターに機能可能に結合され
たデコリンタンパク質コード配列、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中の
タンパク質に分泌される哺乳動物の分泌腺特異的プロモーター配列を含む単離さ
れた核酸分子を特徴とする。

【００２４】 好ましい実施の形態において、プロモーターは、乳特異的プロモーター、例え
ば乳血清タンパク質またはカゼインプロモーターである。乳特異的プロモーター
は、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸性タ
ンパク質プロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターでもよい。

【００２５】 好ましい実施の形態において、プロモーターは、膀胱または卵特異的プロモー
ターであり、デコリンは尿または卵中に分泌される。

【００２６】 好ましい実施の形態において、デコリンアミノ酸配列は、哺乳類または霊長類
、好ましくはヒトのデコリンのものである。

【００２７】 別の態様において、本発明は、遺伝子導入によるデコリンを生成する方法また
はデコリンの遺伝子導入による製剤を特徴とする。この方法は、 デコリン、好ましくはヒトデコリンの発現を方向付けるトランスジーンを含む
トランスジェニック生物、すなわちトランスジェニック動物または植物を提供し
；このトランスジーンを発現させ；生物または生物により産生された産物、例え
ば乳、種子、毛髪、血液、卵、または尿から、遺伝子導入により産生されたデコ
リンまたは遺伝子導入により産生されたデコリンの製剤を回収する、 各工程を含む。

【００２８】 好ましい実施の形態において、本発明の方法はさらに、デコリンの発現を方向
付ける核酸を細胞中に挿入し、この細胞をトランスジェニック生物に成長させる
、各工程を含む。

【００２９】 好ましいトランスジェニック動物には、哺乳類；鳥類；爬虫類；および両生類
が含まれる。適切な哺乳類には、反芻動物；有蹄動物；家畜動物；および酪農動
物が含まれる。特に好ましい動物には、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、メウシ、ブタ、
ウマ、ウサギおよびマウスが含まれる。適切な鳥類には、ニワトリ、ガチョウお
よび七面鳥が含まれる。トランスジェニックタンパク質がトランスジェニック動
物の乳中に分泌される場合、動物は1年に少なくとも1、より好ましくは少なくと
も10、または100リットルの乳を産生することができなければならない。

【００３０】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れた、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグリコシル化は、天然発生の
非トランスジェニック供給源から検出されるまたは単離される、あるいは細胞培
養中で組換えにより産生されるデコリンから単離されるグリコシル化と比較して
80%、70%、60%、50%、40%、30%、20%、10%、または5%未満である（グリコシル化
された製剤中の分子の数、または製剤中の分子量への糖の全体的な寄与の点から
）。好ましくは、遺伝子導入により産生されるデコリンは、グリコサミノグリカ
ン(GAG)鎖を有しない。好ましい実施の形態において、トランスジェニック生物
中で生成される場合、デコリンの製剤は、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%ま
たは1%未満のデコリン分子がGAG鎖を有する製剤である。別の好ましい実施の形
態において、トランスジェニック生物中で生成される場合、製剤が有する、GAG
鎖を有するデコリン分子対GAG鎖を有しないデコリン分子の割合は、約1:2、1:3
、2:3、1:4、3:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9である。

【００３１】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れるトランスジェニック製剤は、グリコシル化および非グリコシル化形態を含み
、グリコシル化形態のいくつかまたはすべては、例えば標準的な分離方法により
、例えば乳のような体液から除去される。

【００３２】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳腺で生成される。

【００３３】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳中に分泌される。

【００３４】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されるデコリンは、乳腺
特異的プロモーター、例えば乳血清タンパク質またはカゼインプロモーターのよ
うな哺乳動物分泌腺特異的プロモーターのコントロール下で生成される。乳特異
的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモータ
ー、乳漿酸性タンパクプロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターでも
よい。

【００３５】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、膀胱または卵特異的プロ
モーターのコントロール下で生成され、尿または卵中に分泌される。

【００３６】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
平均分子量、活性、クリアランス時間、またはタンパク質分解に対する耐性にお
いて非遺伝子導入形態と異なる。

【００３７】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグ
リコシル化は、細胞培養中の組換えにより産生されたデコリンから検出されるま
たは単離されるデコリンと異なる。

【００３８】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンはトラン
スジェニック生物から発現され、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグ
リコシル化は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、例えばCHO、COS、またはHeLa細
胞のような培養哺乳類細胞から検出されるまたは単離されるデコリンのグリコシ
ル化と異なる。例えば、デコリンの発現をコードするまたは方向付ける核酸を挿
入された培養哺乳類細胞により生成されるタンパク質と異なる。

【００３９】 好ましい実施の形態において、例えばSDS-PAGEにより測定されるような、デコ
リン製剤の電気泳動度は、天然発生ヒトデコリンの電気泳動度と異なる；この製
剤の電気泳動度は、例えばCHO、COS、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例え
ば細菌のような原核細胞、酵母細胞、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えに
より産生されたヒトデコリンの電気泳動度と異なる。

【００４０】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、天然発生ヒトデコリンと
少なくとも1つのアミノ酸残基により異なる；このデコリンは、例えばCHO、COS
、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例えば細菌のような原核細胞、または酵
母、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより産生されたヒトデコリンと少
なくとも1つのアミノ酸残基により異なる。

【００４１】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンのアミノ酸配列は、哺乳類ま
たは霊長類、好ましくはヒトのデコリンのものである。

【００４２】 好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10、または100ミリグラ
ムのデコリンを含む。好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10
、または100グラムのデコリンを含む。

【００４３】 好ましい実施の形態において、製剤は、1ミリリットルごとに少なくとも1、10
、100、または500ミリグラムのデコリンを含む。

【００４４】 別の態様において、本発明は、トランスジェニック哺乳動物の乳中に外因性の
デコリンを含む遺伝子導入による製剤を提供する方法であって、 哺乳動物分泌腺上皮細胞中のタンパク質コード配列を発現させるプロモーター
配列に機能可能に結合されたデコリンタンパク質コード配列を生殖細胞系列に導
入したトランスジェニック哺乳動物から乳を得、それにより哺乳動物の乳中にデ
コリンを分泌させて製剤を提供する、 各工程を含む方法を特徴とする。

【００４５】 適切な哺乳類には、反芻動物；有蹄動物；家畜動物；および酪農動物が含まれ
る。特に好ましい動物には、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、メウシ、ブタ、ウマ、オウ
シ、およびラマが含まれる。トランスジェニック動物は、1年に少なくとも1、よ
り好ましくは少なくとも10、または100リットルの乳を産生することができなけ
ればならない。

【００４６】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れた、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、天然発生の非トランスジェ
ニック供給源から検出されるまたは単離される、あるいは細胞培養中で組換えに
より産生されるデコリンから単離されるグリコシル化と比較してグリコシル化が
80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%または1%未満で
ある（グリコシル化された製剤中の分子の数、または製剤中の分子量への糖の全
寄与の点から）。好ましくは、遺伝子導入により産生されるデコリンは、グリコ
サミノグリカン(GAG)鎖を有しない。好ましい実施の形態において、デコリンの
製剤は、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%または1%未満のデコリン分子がGAG鎖
を有する製剤である。別の好ましい実施の形態において、トランスジェニック生
物において生成される場合に製剤が有する、GAG鎖を有するデコリン分子対GAG鎖
を有しないデコリン分子の割合は、約1:2、1:3、2:3、1:4、3:4、1:5、1:6、1:7
、1:8、1:9である。

【００４７】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れるトランスジェニック製剤は、グリコシル化および非グリコシル化形態を含み
、グリコシル化形態のいくつかまたはすべては、例えば標準的な分離方法により
乳から除去される。

【００４８】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳類、例えばヤギのような反芻動物の乳腺で生成される。

【００４９】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳類、例えばヤギのような反芻動物の乳中に分泌される。

【００５０】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されるデコリンは、乳腺
特異的プロモーター、例えば乳血清またはカゼイン特異的プロモーターのような
乳特異的プロモーターのコントロール下で生成される。乳特異的プロモーターは
、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモーター、乳漿酸性タン
パクプロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターでもよい。

【００５１】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
平均分子量、活性、クリアランス時間、またはタンパク質分解に対する耐性にお
いて非遺伝子導入形態と異なる。

【００５２】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
細胞培養中の組換えにより産生されたデコリンから検出されるまたは単離される
デコリンと異なる。

【００５３】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンはトラン
スジェニック哺乳動物から発現され、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤
のグリコシル化は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、例えばCHO、COS、またはHe
La細胞のような培養哺乳類細胞から検出されるまたは単離されるデコリンのグリ
コシル化と異なる。例えば、デコリンの発現をコードするまたは方向付ける核酸
を挿入された培養哺乳類細胞により生成されるタンパク質と異なる。

【００５４】 好ましい実施の形態において、例えばSDS-PAGEにより測定されるような、デコ
リン製剤の電気泳動度は、天然発生ヒトデコリンの電気泳動度と異なる；この製
剤の電気泳動度は、例えばCHO、COS、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、また
は例えば細菌、酵母のような原核細胞、あるいは昆虫細胞中で産生される組換え
により産生されたヒトデコリンの電気泳動度と異なる。

【００５５】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、天然発生ヒトデコリンと
少なくとも1つのアミノ酸残基により異なる；このデコリンは、例えばCHO、COS
、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例えば細菌のような原核細胞、または酵
母あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより産生されたヒトデコリンと少な
くとも1つのアミノ酸残基により異なる。

【００５６】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンのアミノ酸配列は、哺乳類ま
たは霊長類、好ましくはヒトのデコリンのものである。

【００５７】 好ましい実施の形態において、乳は、1ミリリットルごとに少なくとも1、10、
100、500、1,000または2,000ミリグラムのデコリンを含む。

【００５８】 別の態様において、本発明は、遺伝子導入によるデコリン、好ましくはヒトデ
コリンを発現させ、そこからデコリンの遺伝子導入による製剤を得ることができ
るトランスジェニック生物を特徴とする。

【００５９】 トランスジェニック生物は、トランスジェニック植物または動物である。好ま
しいトランスジェニック動物には、哺乳類；鳥類；爬虫類；および両生類が含ま
れる。適切な哺乳類には、反芻動物；有蹄動物；家畜動物；および酪農動物が含
まれる。特に好ましい動物には、ヤギ、ヒツジ、ラクダ、メウシ、ブタ、ウマ、
ウサギおよびマウスが含まれる。適切な鳥類には、ニワトリ、ガチョウおよび七
面鳥が含まれる。トランスジェニックタンパク質がトランスジェニック動物の乳
中に分泌される場合、動物は1年に少なくとも1、より好ましくは少なくとも10、
または100リットルの乳を産生することができなければならない。

【００６０】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れた、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、天然発生の非トランスジェ
ニック供給源から検出されるまたは単離される、あるいは細胞培養中で組換えに
より産生されるデコリンから単離されるグリコシル化と比較してグリコシル化が
80%、70%、60%、50%、40%、30%、25%、20%、15%、10%、5%、2.5%、または1%未満
である（グリコシル化された製剤中の分子の数、または製剤中の分子量への糖の
全寄与の点から）。好ましくは、遺伝子導入により産生されるデコリンは、グリ
コサミノグリカン(GAG)鎖を有しない。好ましい実施の形態において、トランス
ジェニック生物中で生成される場合、デコリンの製剤は、50%、40%、30%、20%、
10%、5%、2%または1%未満のデコリン分子がGAG鎖を有する製剤である。別の好ま
しい実施の形態において、トランスジェニック生物中で生成される場合、製剤が
有する、GAG鎖を有するデコリン分子対GAG鎖を有しないデコリン分子の割合は、
約1:2、1:3、2:3、1:4、3:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9である。

【００６１】 好ましい実施の形態において、好ましくはトランスジェニック生物中で生成さ
れるトランスジェニック製剤は、グリコシル化および非グリコシル化形態を含み
、グリコシル化形態のいくつかまたはすべては、例えば標準的な分離方法により
、例えば乳のような体液から除去される。

【００６２】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳腺で生成される。

【００６３】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンは、トラ
ンスジェニック哺乳動物、例えばヤギのような反芻動物の乳中に分泌される。

【００６４】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されるデコリンは、乳腺
特異的プロモーター、例えば乳血清タンパク質またはカゼインプロモーターのよ
うな哺乳動物分泌腺特異的プロモーターのコントロール下で生成される。乳特異
的プロモーターは、カゼインプロモーター、ベータラクトグロブリンプロモータ
ー、乳漿酸性タンパクプロモーター、またはラクトアルブミンプロモーターでも
よい。

【００６５】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、膀胱または卵特異的プロ
モーターのコントロール下で生成され、尿または卵中に分泌される。

【００６６】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤は、
平均分子量、活性、クリアランス時間、またはタンパク質分解に対する耐性にお
いて非遺伝子導入形態と異なる。

【００６７】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグ
リコシル化は、細胞培養中の組換えにより産生されたデコリンから検出されるま
たは単離されるデコリンと異なる。

【００６８】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入により産生されたデコリンはトラン
スジェニック生物から発現され、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤のグ
リコシル化は、細菌細胞、酵母細胞、昆虫細胞、例えばCHO、COS、またはHeLa細
胞のような培養哺乳類細胞から検出されるまたは単離されるデコリンのグリコシ
ル化と異なる。例えば、デコリンの発現をコードするまたは方向付ける核酸を挿
入された培養哺乳類細胞により生成されるタンパク質と異なる。

【００６９】 好ましい実施の形態において、例えばSDS-PAGEにより測定されるような、デコ
リン製剤の電気泳動度は、天然発生ヒトデコリンの電気泳動度と異なる；この製
剤の電気泳動度は、例えばCHO、COS、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例え
ば細菌のような原核細胞、酵母、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより
産生されたヒトデコリンの電気泳動度と異なる。

【００７０】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンは、天然発生ヒトデコリンと
少なくとも1つのアミノ酸残基により異なる；このデコリンは、例えばCHO、COS
、またはHeLa細胞のような哺乳類細胞、例えば細菌のような原核細胞、または酵
母、あるいは昆虫細胞中で産生される組換えにより産生されたヒトデコリンと少
なくとも1つのアミノ酸残基により異なる。

【００７１】 好ましい実施の形態において、本発明のデコリンのアミノ酸配列は、哺乳類ま
たは霊長類、好ましくはヒトのデコリンのものである。

【００７２】 好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10、または100ミリグラ
ムのデコリンを含む。好ましい実施の形態において、製剤は、少なくとも1、10
、または100グラムのデコリンを含む。

【００７３】 好ましい実施の形態において、製剤は、1ミリリットルごとに少なくとも1、10
、100、または500ミリグラムのデコリンを含む。

【００７４】 別の態様において、本発明は、治療上有効な量の遺伝子導入によるデコリン、
またはデコリンの遺伝子導入による製剤、および薬学的に許容できるキャリアを
含む薬剤組成物を特徴とする。

【００７５】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、例えばここに記載される任
意の方法または生物により生成できる。

【００７６】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、例えばここに記載される任
意のものでよい。

【００７７】 別の態様において、本発明は、遺伝子導入により産生されたデコリン製剤、好
ましくはヒトデコリン製剤、および少なくとも1つのデコリン以外の他の成分、
例えば栄養成分を含む製剤を特徴とする。

【００７８】 好ましい実施の形態において、本発明の製剤は固体または液体である。

【００７９】 好ましい実施の形態において、本発明の製剤はさらに液体キャリアを含む。

【００８０】 好ましい実施の形態において、栄養性分は、タンパク質、例えば乳タンパク質
；ビタミン、例えばビタミンA、ビタミンB、ビタミンD；炭水化物；無機物、例
えばカルシウム、リン、鉄である。

【００８１】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、ここに記載される任意の方
法または生物により生成してもよい。

【００８２】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、ここに記載される任意のも
のでよい。

【００８３】 別の態様において、本発明は、遺伝子導入により産生されたデコリンまたはデ
コリンの遺伝子導入による製剤、好ましくはヒトデコリン、および少なくとも1
つのデコリン以外の栄養成分を含む栄養補助食品を特徴とする。

【００８４】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、ここに記載される任意の方
法または生物により生成してもよい。

【００８５】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、ここに記載される任意のも
のでよい。

【００８６】 別の態様において、本発明は、デコリンを必要とする被験者にデコリンを提供
する方法を特徴とする。この方法は、遺伝子導入により産生されたデコリンまた
はデコリンの遺伝子導入による製剤を被験者に投与する工程を含む。

【００８７】 好ましい実施の形態において、被験者は、ヒト、例えばデコリンを必要とする
患者である。例えば、本発明は、遺伝子導入によるデコリンを傷に適用すること
により瘢痕化を防ぐまたは減少させる方法に関する。皮膚の瘢痕化は、様々の皮
膚の損傷後の過程であり、コラーゲン、フィブロネクチン、およびプロテオグリ
カンを含む繊維細胞を過剰に蓄積する。繊維マトリクスの蓄積の誘導により、血
小板細胞および炎症性細胞により傷の部位において増殖因子が放出される。繊維
瘢痕組織の沈着を誘導すると考えられる主な増殖因子は、形質転換成長因子−β
(TGF−β)である。デコリンは、細胞外マトリクスの誘導を含むTGF−βの様々
の生物学的な機能を結び付け、無効にする。この繊維性細胞外マトリクスに弾性
特性がないために、激しい皮膚の損傷から生ずる瘢痕組織はしばしば、実質的な
組織の機能を損ない、醜い瘢痕を生じ得る。

【００８８】 本発明の方法において遺伝子導入によるデコリンを使用することの利点は、そ
れが通常のヒトのタンパク質であり、天然のTGF−β調節経路に関連すると考え
られることである。したがって、遺伝子導入によるデコリンを使用して、火傷、
他の侵入性の皮膚の損傷、および整容外科または再建外科から生ずる皮膚の瘢痕
化を防ぐまたは減少することができる。

【００８９】 デコリンで治療した傷は、デコリンで治療しなかった対照の傷と比較して検出
可能な瘢痕を実質的に示さないことが分かった。TGF−βにより誘導される瘢痕
化過程は、成人および妊娠第3期ヒト胎児に独特であることが示されたが、妊娠
第1期には胎児で実質的に存在しない。胎児の傷における瘢痕の不存在は、傷床
におけるTGF−βの不存在と相関する。対照的に、成人の組織の傷床はTGF−βが
ひどく沈着しており、完全に治癒した傷は、広範囲に繊維性、コラーゲン性マト
リクスを含有する赤く皺が寄った瘢痕により置換される。デコリンで治療した傷
は、組織学的に正常であり、妊娠第1期の胎児の傷に似ている。

【００９０】 別の態様において、本発明は、上述の方法で有用な遺伝子導入によるデコリン
および薬学的に許容できるキャリアを含有する薬剤組成物を特徴とする。薬学的
に許容できるキャリアには、例えば、ヒアルロン酸、および重炭酸塩緩衝液、リ
ン酸緩衝液、リンガー溶液、および所望なら5%デキストロースまたはヒト血清ア
ルブミンを加えた生理食塩水のような溶液が含まれる。薬剤組成物には、当業者
に既知の傷の治癒を促進する他の物質が含まれてもよい。そのような物質には、
例えば、ここに引用される1990年6月28日に公開された国際特許出願公開第90/06
767号に記載されるような生物分解性のポリマーに付着されたRGDを含有するポリ
ペプチドを含む生物学的に活性の化学物質およびポリペプチドが含まれてもよい
。そのようなポリペプチドは、例えば共有結合またはイオン結合を含む当該分野
において知られる任意の方法によりポリマーに付着されてもよい。

【００９１】 別の態様において、本発明は、被験者中の傷の収縮を減少または抑制する方法
であって、被験者に遺伝子導入によるデコリンを含む薬剤組成物を投与する工程
を含む方法を特徴とする。本発明は、例えば、傷の収縮を減少または抑制する方
法であって、被験者に遺伝子導入によるデコリンを含む薬剤組成物を投与する工
程を含む方法を提供する。

【００９２】 別の態様において、被験者中の癌、例えば乳癌を治療する方法であって、被験
者に治療上有効な量の遺伝子導入によるデコリンを投与する工程を含む方法を特
徴とする。

【００９３】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、例えばここに記載される任
意の方法または生物により生成できる。

【００９４】 遺伝子導入によるデコリンまたはデコリン製剤は、例えばここに記載される任
意のものでよい。

【００９５】 ここに記載される任意の組成物および方法において、遺伝子導入によるデコリ
ンの製剤または調剤は、グリコサミノグリカン(GAG)鎖を有しなくてもよく、非
常に同質のデコリン製剤となる。別の好ましい実施の形態において、遺伝子導入
による製剤または調剤は、50%、40%、30%、20%、10%、5%、2%または1%未満のデ
コリン分子がGAG鎖を有する製剤または調剤である。別の好ましい実施の形態に
おいて、遺伝子導入によるデコリン製剤または調剤が有する、GAG鎖を有するデ
コリン分子対GAG鎖を有しないデコリン分子の割合は、約1:2、1:3、2:3、1:4、3
:4、1:5、1:6、1:7、1:8、1:9である。

【００９６】 いくつかの遺伝子導入によるタンパク質の発現により、トランスジェニック動
物またはその子孫の代謝または健康に所望でない効果が生じ得る。

【００９７】 したがって、別の態様において、本発明は、トランスジェニック動物中で遺伝
子導入によるタンパク質を産生する方法であって（遺伝子導入によるタンパク質
はトランスジェニック動物の代謝に効果を与えるものである）、 例えばトランスジェニック動物の乳中で遺伝子導入によるタンパク質を発現さ
せ、 トランスジェニック動物を治療してトランスジェニック動物における遺伝子導
入によるタンパク質の効果を抑制する、 各工程を含む方法を特徴とする。

【００９８】 例えば、動物における遺伝子導入によるデコリンの効果を抑制する物質、例え
ば遺伝子導入によるデコリンの活性を抑制する物質を動物に投与する、または遺
伝子導入により発現させてもよい。好ましい実施の形態において、この物質はポ
リペプチドである。一例として、この物質は、酵素またはレセプター、またはそ
の断片、あるいは遺伝子導入によるデコリンと相互作用するまたは結合する他の
分子でもよい。デコリンの分布または輸送を変化させることによる、遺伝子導入
によるデコリンの活性の競合または非競合抑制によってもよい。

【００９９】 遺伝子導入によるタンパク質が、トランスジェニック動物の特定の部位、例え
ば組織、体液、または器官で見られる場合、物質をその部位に投与するまたはそ
の部位で発現させてもよい。例えば、トランスジェニック動物の乳中で発現され
る遺伝子導入によるタンパク質の場合、トランスジェニック動物の乳に投与する
または乳で発現させてもよい。

【０１００】 物質が遺伝子導入により発現される場合、遺伝子導入によるデコリンおよび物
質を同じ種類のプロモーターから発現させてもよい、例えば乳特異的プロモータ
ーのような乳腺特異的プロモーターから発現させてもよい。遺伝子導入によるデ
コリンおよび物質は、二つを等しく発現するプロモーターから発現させてもよく
、異なる強さの異なるプロモーターから発現させてもよい。これにより、一方ま
たは他方の発現がより大きくまたはより小さくなり得る。例えばモルまたは重量
に基づく物質の発現が遺伝子導入によるデコリンの発現を越えることが所望であ
る場合もある。別の場合において、逆のことが物質の産生を最適化し得る。物質
は、デコリンが発現される部位以外の部位で発現されてもよい。例えば、物質は
、遺伝子導入によるデコリンが所望でない部位、例えば血液のような遺伝子導入
によるタンパク質が中へ漏れる部位に投与されるまたはそこで発現されてもよい
。好ましい実施の形態において、遺伝子導入によるデコリンは、トランスジェニ
ック動物の乳中で発現され、物質はトランスジェニック動物の血液に投与される
または血液中で発現される。

【０１０１】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入によるデコリンに結合する抗体をト
ランスジェニック動物に投与するまたは動物中で発現させる。一例として、抗体
は一本鎖抗体または細胞内発現抗体(intrabody)でもよい。好ましい実施の形態
において、遺伝子導入によるデコリンは乳中で発現され、抗体は血液中で発現さ
れる。

【０１０２】 物質をトランスジェニック動物に投与する、または動物中で第2の遺伝子導入
によるタンパク質として発現させてもよい。しかしながら、トランスジェニック
動物、例えば遺伝子導入によるヤギのような大きいトランスジェニック動物を産
生する前に、物質の有効性を調べなければならない。これは、デコリンおよび物
質を動物、例えばヤギに投与、例えば注射し、トランスジェニック動物の代謝ま
たは健康におけるデコリンの効果を観察することにより達成できる。物質の適切
な効果が見られる場合、その後トランスジェニック動物を産生できる。遺伝子導
入によるデコリンを発現するトランスジェニック動物を構成し、二つのトランス
ジェニック動物、すなわちデコリンおよび物質についてのトランスジェニック動
物の産生に物質が有用であるかを評価するために候補物質を動物に投与すること
が所望である。

【０１０３】 宿主の健康はまた、組織特異的発現、例えば乳腺、好ましくは乳における発現
により最適化できる。

【０１０４】 遺伝子導入によるデコリンの構造は、治療上または予防上の効果、または安定
性（例えば半ビボの保存性およびインビボにおけるタンパク分解に対する耐性）
を高めるような目的のために、あるいは動物の健康を最適化するために修飾して
もよい。そのような修飾されたデコリンは、天然デコリンの少なくとも1つの活
性を保持するように設計された場合、ここにより詳細に記載されるデコリンの機
能等価物である。そのような修飾されたペプチドは、例えばアミノ酸置換、欠失
、または付加により産生できる。

【０１０５】 好ましい実施の形態において、遺伝子導入によるデコリンは、第2のポリペプ
チドに融合された遺伝子導入による融合タンパク質として発現されてもよい。融
合タンパク質としての発現を使用して、動物の健康、タンパク質の単離または回
収を最適化し、タンパク質の半ビボの保存性を修飾できる。

【０１０６】 好ましい実施の形態において、デコリンは、融合によりトランスジェニック動
物の代謝または健康におけるデコリンの所望でない効果が最小となる融合タンパ
ク質として第2のポリペプチド配列と共に発現される。第2のポリペプチドは、例
えばデコリン成分と第2の分子、例えばデコリンレセプターのようなレセプター
との相互作用との干渉により、融合のデコリンの活性を変化させるものでもよい
。第2のタンパク質は、融合タンパク質の組織分布を変化させるものでもよい。
例えば、デコリン成分への第2のポリペプチドの融合により、融合が発現の部位
、例えば乳腺組織または乳からトランスジェニック動物中の別の部位、例えば循
環系または血液に移行または輸送されることが妨げられ得る。

【０１０７】 好ましい実施の形態において、第2のタンパク質は、融合タンパク質が発現ま
たは単離された後デコリン成分から開裂される。

【０１０８】 遺伝子導入によるデコリンは、遺伝子導入によるデコリンの単離または回収を
最適化する第2のポリペプチドとの融合タンパク質として発現されてもよい。例
えば、第2のポリペプチドは、融合タンパク質において所望の可溶性特性を与え
る、例えば多少可溶性にすることにより；生成を簡単にする成分を供給する、例
えば親和性成分を供給することより単離を最適化し得る。

【０１０９】 ここで用いたように、以下のパラメーターの1つ以上が異なる場合、2つのタン
パク質のグリコシル化は異なる： （１）タンパク質に結合した糖残基の全分子量； （２）タンパク質に結合した糖残基の総数； （３）結合された糖残基のサブユニットの構成； （４）結合された糖に存在する分岐点の数； （５）結合された糖における分岐点の位置； （６）糖がタンパク質に結合された部位の数； （７）糖が結合されたタンパク質における位置； （８）O結合型グリコシル化部位の数； （９）N結合型グリコシル化の数。

【０１１０】 選ばれた特徴、例えば上述のものの1つ以上を有する遺伝子導入によるデコリ
ン分子の割合が、第2の製剤における前記の特徴を有する分子の割合と異なる場
合、2つの製剤は互いに異なる。例えば、2つの製剤のそれぞれは、グリコシル化
されたデコリンおよびGAG鎖を有しないデコリンを含有してもよい。

【０１１１】 ここで用いたように、製剤とは、1つ以上のトランスジェニック動物により産
生された複数の分子を称する。これは、異なるグリコシル化の分子を含んでもよ
く、この点について同種でもよい。ここで用いたように、「遺伝子導入により産
生されたデコリンの実質的に同種の製剤」とは、10%、5%、2%または1%のデコリ
ン分子がGAG鎖を有するデコリンの製剤である。

【０１１２】 ここで用いたように、生成された製剤、ポリペプチドの実質的に純粋な製剤、
または単離されたポリペプチドとは、遺伝子導入により産生されたポリペプチド
の場合、トランスジェニック動物中でまたは乳のような体液中で、あるいはトラ
ンスジェニック動物により産生される他の物質、例えば卵中で一緒に発生する少
なくとも1つの他のタンパク質、脂質、または核酸から分離されたポリペプチド
を意味する。ポリペプチドは、好ましくは、生成に使用される抗体のような物質
またはポリアクリルアミドのようなゲルマトリクスから分離される。ポリペプチ
ドは、好ましくは、生成された製剤の少なくとも10、20、50、70、80または95%
の乾燥重量である。好ましくは、製剤は、タンパク質の配列を可能にするために
十分なポリペプチド；少なくとも1、10、または100μgのポリペプチド；少なく
とも1、10、または100mgのポリペプチドを含有する。

【０１１３】 実質的に純粋な核酸とは、以下のものの一方または両方である核酸である：核
酸が由来する器官の天然発生ゲノム中ですぐ隣接する（すなわち5’端および3’
端）配列、例えばコード配列の一方または両方と隣接しない；または核酸が由来
する器官中で発生する核酸配列を実質的に有しない。この用語には、例えば、ベ
クター、例えば自己複製プラスミドまたはウィルス中に、または原核生物または
真核生物のゲノムDNA中に組み込まれる、あるいは他のDNA配列と独立した別個の
分子（例えばPCRまたは制限エンドヌクレアーゼ処理により産生されたcDNAまた
はゲノムDNA断片）として存在する組換えDNAが含まれる。実質的に純粋なDNAは
また、追加のデコリン配列をコードするハイブリッド遺伝子の一部である組換え
DNAを含む。

【０１１４】 ペプチド、タンパク質、およびポリペプチドという用語は、ここで相互に交換
して使用される。

【０１１５】 ここで用いたように、相同性、または配列の同一性とは、2つのポリペプチド
分子間または2つの核酸分子間の配列の類似性を称する。第1の配列における位置
が、第2の配列における対応する位置において同じアミノ酸残基またはヌクレオ
チドが位置する場合、この分子はその位置で相同である（すなわち、ここで用い
たようにアミノ酸または核酸の「相同性」は、アミノ酸または核酸の「同一性」
と同義である）。2つの配列間の相同性の割合は、この配列により共有される同
一の位置の数の関数である（すなわち、相同性の%＝同一の位置の数／位置の総
数×100）。

【０１１６】 例えば、2つの配列の位置の10のうち6が一致または相同である場合、2つの配
列は60%相同であるまたは60%の配列同一性を有する。一例として、DNA配列ATTGC
CとTATGGCとは50%の相同性または配列同一性を有する。通常、最大の相同性また
は配列同一性を与えるように2つの配列をそろえた場合に比較を行う。

【０１１７】 配列の比較および2つの配列間の相同性の割合の測定は、数学的アルゴリズム
を使用して達成できる。好ましくは、配列の比較に使用する数学的アルゴリズム
の限定されない例は、カーリンおよびアルツシュル(Karlin and Altschul)著(19
93) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 90:5873-77で修正されたカーリンおよびアル
ツシュル（Karlin and Altschul）著(1990) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 87:2
264-68のアルゴリズムである。そのようなアルゴリズムは、アルツシュル(Altsc
hul)等著(1990) J. Mol. Biol. 215:403-10のNBLASTおよびXBLASTプログラム(ve
rsion 2.0)に組み込まれる。BLASTヌクレオチドサーチは、本発明のITALY核酸分
子に相同なヌクレオチド配列を得るために、スコア＝100、ワード長＝12でNBLAS
Tプログラムで行うことができる。BLASTタンパク質サーチは、本発明のITALYタ
ンパク質分子に相同なアミノ酸配列を得るために、スコア＝50、ワード長＝3でX
BLASTプログラムで行うことができる。比較の目的のため隙間のある整合を得る
ため、アルツシュル(Altschul)等著, (1997) Nucleic Acids Res. 25(17):3389-
3402に記載されるGapped BLASTを使用してもよい。BLASTおよびGapped BLASTプ
ログラムを使用した場合、それぞれのプログラム（例えばXBLASTおよびNBLAST）
の初期設定パラメーターを使用してもよい。http://www.ncbi.nlm.nih.gov参照
。配列を比較するために使用する数学的アルゴリズムの別の好ましい、限定され
ない実施例は、MyersおよびMiller, CABIOS(1989)のアルゴリズムである。その
ようなアルゴリズムを、GCG配列整合ソフトウェアパッケージの一部であるALIGN
プログラム(version 2.0)に組み込む。アミノ酸配列を比較するためにALIGNプロ
グラムを使用する場合、PAM120重量残余表(weight residue table)、12のギャッ
プ長ペナルティ、および4のギャップペナルティを使用してもよい。

【０１１８】 ここで用いたように、トランスジーンという用語は、導入されるトランスジェ
ニック動物または細胞に一部または全部が非相同である、または導入されるトラ
ンスジェニック動物または細胞の内因性遺伝子に相同であるが、挿入される細胞
のゲノムを変化させるような方法で動物のゲノム中に挿入されるように設計され
るまたは挿入される（例えば、天然の遺伝子と異なる位置で挿入され、挿入によ
りノックアウトが生ずる）、核酸配列（例えば1つ以上のデコリンポリペプチド
をコードする）を意味する。トランスジーンには、すべて選択されたデコリン核
酸に機能可能に結合した、例えば乳腺中でデコリンをコードする選択された核酸
の最適の発現および分泌に必要であり、エンハンサー配列を含み得る、1つ以上
の転写調節配列およびイントロンのような他の核酸が含まれてもよい。デコリン
配列は、例えばトランスジェニック哺乳動物の乳中にタンパク質を分泌させる乳
腺特異的タンパク質のような組織特異的プロモーター、尿特異的プロモーター、
または卵特異的プロモーターに機能可能に結合してもよい。

【０１１９】 ここで用いたように、「トランスジェニック細胞」という用語は、トランスジ
ーンを含有する細胞を称する。

【０１２０】 ここで用いたように、トランスジェニック生物とは、トランスジェニック動物
または植物を称する。

【０１２１】 ここで用いたように、「トランスジェニック動物」とは、ヒト以外の動物であ
って、該動物の1つ以上、および好ましくは実質的にすべての細胞が、ヒトの介
入により、例えば当該技術において既知の遺伝子導入技術により導入される異種
核酸を含有する動物である。トランスジーンは、故意の遺伝子操作により、例え
ばマイクロインジェクションまたは組換えウィルスによる感染により、直接また
は間接に細胞中に導入できる。

【０１２２】 哺乳動物とはここで、乳腺を有し乳を産生する、ヒトを除くすべての動物とし
て定義される。

【０１２３】 ここで用いたように、「酪農動物」とは、乳を産生する動物を称する。好まし
い実施の形態において、酪農動物は、大量の乳を産生し、長い泌乳期間を有する
、例えばウシまたはヤギである。

【０１２４】 ここで用いたように、「植物」という用語は、植物全体、植物の一部、植物の
細胞、または一群の植物細胞を称する。本発明の方法に使用できる植物の種類は
、概して単子葉および双子葉植物を含む、形質転換技術に従う高等植物の種類で
ある。倍数体、二倍体および半数体を含む、様々の倍数性レベルの植物が含まれ
る。

【０１２５】 「薬学的に許容できる組成物」とは、治療上有効な量の遺伝子導入によるデコ
リンを含み、1つ以上の薬学的に許容できるキャリアと共に調製された組成物を
称する。

【０１２６】 ここで用いたように、「製剤」とは、遺伝子導入によるデコリンを含む固体、
例えば粉末、または液体形態の組成物を称する。製剤は、治療上または栄養上の
利益を提供する。好ましい実施の形態において、製剤は、デコリン以外の少なく
とも1つの栄養成分を含んでもよい。これらの組成物は、微生物の成長を妨げる
防腐剤を含んでもよい。

【０１２７】 ここで用いたように、「栄養補助食品」という用語は、遺伝子導入によるデコ
リンを含む食物物質または食物の一部を称する。栄養補助食品は、病気の予防、
治療または治癒を含む医療または医療補助を提供し得る。遺伝子導入によるタン
パク質は、少なくとも1mg/kgの濃度で栄養補助食品中に存在してもよい。栄養補
助食品は、トランスジェニック動物の乳を含んでもよい。

【０１２８】 ここで用いたように、「デコリン」という用語は、デコリンの少なくとも1つ
の生物活性を有するプロテオグリカンまたは断片あるいはその類似物を称する。
ポリペプチドは、以下の特性の1つを有する場合にはデコリン生物活性を有する
：１）細胞外マトリクス成分、例えばフィブロネクチン（例えばフィブロネクチ
ンの細胞結合領域および／またはヘパリン結合領域）、コラーゲン（例えばコラ
ーゲンI、II、VI、XIV）と相互作用する、例えば結合する；２）原繊維発生を調
節する、例えば抑制する；３）トロンボスポンジンと相互作用する、例えば結合
する；４）上皮成長因子レセプターと相互作用する、例えば結合する；５）上皮
成長因子レセプターを調節する、例えば活性化する；６）キナーゼ抑制因子、例
えばサイクリン依存性キナーゼ抑制因子p21を誘導する経路を促進するようなシ
グナル経路を調節する、例えば促進または抑制する；７）成長因子、例えばTGF
−βと相互作用する、例えば結合する；８）細胞増殖を調節する、例えば抑制す
る；９）細胞移動を調節する、例えば抑制する；１０）細胞接着を調節する；お
よび１１）マトリクス集合および組織を調節する。好ましくは、ヒトデコリンと
は、クルシウス(Krusius)等著(1986) Prot. Natl Acad. Sci 米国 83:7683に記
載されるアミノ酸配列またはその変異体を有するデコリンを称する。天然発生ヒ
トデコリンは、セリン残基、例えばクルシウス(Krusius)等著(1986) Prot. Natl
Acad. Sci 米国 83:7683に記載されるアミノ酸配列のセリン残基4において一本
のGAG鎖を有する。さらに、天然発生ヒトデコリンは、オリゴ糖に結合した2つま
たは3つのアスパルギニン(asparginine)を含んでもよい。例えばグロスル(Gloss
l)著(1984) J. Biol. Chem 259:14144-14150参照。

【０１２９】 ここで用いたように、「被験者」という用語は、ヒトおよびヒト以外の動物を
含むことを意図する。好ましい実施の形態において、被験者は、デコリンを必要
とする人、例えば患者である：例えば、異常なTGF-β活性と関連する疾患、例え
ば癌、糖尿病性腎臓病、または侵入性の皮膚の損傷、例えば火傷に苦しむ人、ま
たは整容外科または再建外科、または結合組織異常、骨損失または異常な骨の成
長（例えば骨形成不全症、変形性関節症）と関連する疾患を受けた人。本発明の
「ヒト以外の動物」という用語には、すべての脊椎動物、例えばヒト以外の霊長
類、反芻動物、鳥類、両生類、爬虫類のような哺乳類および非哺乳類が含まれる
。トランスジェニック動物の乳中に組換えタンパク質を量産するための遺伝子導
入技術の適用により、従来のタンパク質産生の方法をこえる大きな利点が提供さ
れる。これらの利点には、必要な基本的経費の総量の減少、商品開発サイクルの
初期における設備建設の資本受託の必要性の排除、および複雑なタンパク質につ
いてのユニットごとの直接製品コストの低下が含まれる。最も重要なのは、ある
複雑なタンパク質について、遺伝子導入による産生は、唯一の技術的および経済
的に実現可能な量産の方法を示すかもしれないという可能性である。

【０１３０】 ここで用いたように、「傷の収縮」という用語は、傷の端が傷をふさごうとし
て集められる、傷の治癒の過程におけるある段階を称する（例えばグリンネル(G
rinnell)著, J. Cell Biol. 124:401-404(1994)参照）。ここで用いたように、
「傷の治癒」という用語は、傷を受けた時から傷の治癒と関連する生理的特性が
完了するまでの全過程を意味するよう最も広い意味で使用される。傷の収縮は、
例えば傷の治癒過程の一部である。したがって、傷の収縮を減少または抑制する
組成物は、傷の治癒を強めることができる。傷の治癒は、必ずしも、傷を受けた
組織が傷を受ける前に存在したのと同じレベルを達成するわけではないことを認
識する。

【０１３１】 ヒトは、グリコシル化されたデコリンおよび1つ以上のGAG鎖を有しないデコリ
ンを産生する。GAG鎖を有しないデコリンは、生物学的に活性である。トランス
ジェニック生物、例えば動物は、より同種のデコリンの製剤を生ずるGAG鎖を有
しないデコリンの好ましい供給源である。

【０１３２】 本発明の他の特徴および利点は、以下の詳細な説明および特許請求の範囲から
明らかとなるであろう。

【０１３３】 詳細な説明 トランスジェニック哺乳動物 ヒト以外のトランスジェニック動物を産生するための詳細な説明を、ここにお
よび以下の「実施例」と題される欄に記載する。

【０１３４】 そのような方法は、DNA構成体を哺乳動物の生殖系に導入しトランスジェニッ
ク哺乳動物を産生する工程を含んでもよい。例えば、標準の遺伝子導入技術によ
り構成体の1つまたはいくつかのコピーを哺乳動物の胚のゲノム中に導入しても
よい。

【０１３５】 ウシおよびヤギが好ましいが、他のヒト以外の哺乳動物を使用してもよい。好
ましいヒト以外の哺乳動物は、反芻動物、例えばウシ、ヒツジ、ラクダまたはヤ
ギである。好ましいヒト以外の動物のさらなる例には、ウマ、ブタ、ウサギ、マ
ウスおよびラットが含まれる。核転移技術について、細胞、例えば遺伝子工学的
に処理される細胞の供給源として使用される哺乳動物は、得ようとするトランス
ジェニック哺乳動物に依存する。例として、ウシからのゲノムは、ウシ卵母細胞
による核転移から使用しなければならない。

【０１３６】 様々のトランスジェニック動物を調製する方法が当該技術において知られてい
る。遺伝子導入されたヤギを産生するプロトコルが当該技術において知られてい
る。例えばエバート(Ebert)等著 (1994) Bio/Technology 12:699に記載されるよ
うにマイクロインジェクションにより、または例えば国際特許出願公開第WO 98/
30683号に記載されるように核転移技術によりヤギの生殖細胞系にトランスジー
ンを導入してもよい。遺伝子導入されたブタを産生するプロトコルは、ホワイト
およびヤノウトソス(White and Yannoutsos)著, Current Topics in Complement
Research: 64^th Forum in Immunology, pp. 88-94；米国特許第5,523,226号；
米国特許第5,573,933号；国際特許出願公開第WO93/25071号；および国際特許出
願公開第WO95/04744号に記載されている。遺伝子導入されたラットを産生するプ
ロトコルは、バーダーおよびガンテン(Bader and Ganten)著, Clinical and Exp
erimental Pharmacology and Physiology, Supp. 3:S81-S87, 1996に記載されて
いる。遺伝子導入されたウシを産生するプロトコルは、米国特許第5,741,957号
、国際特許出願公開第WO98/30683号、およびTransgenic Animal Technology, A
Handbook, 1994, ed., Carl A. Pinkert, Academic Press, Incに記載されてい
る。遺伝子導入されたヒツジを産生するプロトコルは、国際特許出願公開第WO97
/07669号、およびTransgenic Animal Technology, A Handbook, 1994, ed., Car
l A. Pinkert, Academic Press, Incに記載されている。

【０１３７】トランスフェクションされた細胞系 遺伝子工学的に処理された細胞は、関心のある核酸、例えばタンパク質をコー
ドする核酸が導入される細胞系から得てもよい。

【０１３８】 従来の形質転換またはトランスフェクション技術により、構成体を細胞中に導
入してもよい。ここで用いたように、「トランスフェクション」および「形質転
換」という用語は、リン酸カルシウムまたは塩化カルシウム共同沈降、DEAE−デ
キストラン−媒介トランスフェクション、リポフェクション、またはエレクトロ
ポレーションを含む、遺伝子導入配列を宿主細胞中に導入する様々の技術を含む
。さらに、以下に記載されるように、生物学的なベクター、例えばウィルスベク
ターを使用してもよい。宿主細胞を形質転換またはトランスフェクションする適
切な方法は、サンブルック(Sambrook)等著, Molecular Cloning: A Laboratory
Manual, 2^nd ed., Cold Spring Harbor Laboratory, (Cold Spring Harbor Labo
ratory Press, Cold Spring Harbor, NY, 1989)および他の適切な実験マニュア
ルに見ることができる。

【０１３９】 2つの有用な方法は、エレクトロポレーションおよびリポフェクションである
。それぞれの簡単な実施例を以下に記載する。

【０１４０】 DNA構成体は、以下のプロトコルを使用するエレクトロポレーションにより供
与体細胞、例えば胚体細胞系のような胚細胞中に安定して導入することができる
：細胞を、約4×10⁵細胞/mlでPBS中に再懸濁する。15マイクログラムの線状DNA
を0.5mlの細胞懸濁液に加え、懸濁液を0.4cmの電極ギャップキュベット(electro
de gap cuvette)(Biorad社)中に配置する。25mAで330ボルトのパルス、1000マイ
クロファラドおよび無限抵抗でBiorad社のGene Pulserエレクトロポレーターを
使用してエレクトロポレーションを行う。DNA構成体は、選択のためのネオマイ
シン耐性遺伝子を含有する場合、15日間350マイクログラム/mlのG418(GibcoBRL)
とともにインキュベートした後、ネオマイシン耐性クローンを選択する。

【０１４１】 以下のようなプロトコルを使用するリポフェクションにより、DNA構成体を供
与体細胞中に安定して導入することができる：約2×10⁵細胞を3.5cmの直径のウ
ェル中に配置し、LipfectAMINE^TM(GibcoBRL社)を使用する2マイクログラムの線
状DNAでトランスフェクションする。トランスフェクションの48時間後、細胞を1
：1000および1：5000に分け、DNA構成体が選択のためのネオミオシン耐性遺伝子
を含有する場合には、G418を加えて最終濃度を0.35mg/mlにする。低温保存並び
に核移入のためにネオミオシン耐性クローンを分離し膨張させる。

【０１４２】 タンパク質の組織特異的発現 タンパク質、例えば異種タンパク質を、遺伝子導入動物の特定の組織または体
液、例えば乳、血液または尿で発現させることはしばしば所望である。異種タン
パク質は、発現される組織または体液から回収できる。例えば、乳中で異種タン
パク質を発現させることはしばしば所望である。乳特異的プロモーターの制御下
で、異種タンパク質を産生する方法が以下に記載される。さらに、他の組織特異
的プロモーター、並びに他の調節要素、例えばシグナル配列および非分泌タンパ
ク質の分泌を強める配列が以下に記載される。

【０１４３】 乳特異的プロモーター 有用な転写プロモーターは、哺乳動物上皮細胞中で好ましく活性化されるプロ
モーターであり、カゼイン、ベータラクトグロブリン(クラーク(Clark)等著, (1
989) Bio/Technology 7:487-492)、乳漿酸性タンパク質(ゴードン(Gordon)等著(
1987) Bio/Technology 5:1183-1187)、およびラクトアルブミン(ソウリアー(Sou
lier) 等著, (1992) FEBES Letts. 297:13)のような乳タンパク質をコードする
遺伝子を調節するプロモーターを含む。カゼインプロモーターは、任意の哺乳動
物の種類のアルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼイン遺伝子に由来しても
よい；好ましいプロモーターは、ヤギベータカゼイン遺伝子に由来する(DiTulli
o, (1992) Bio/Technology 10:74-77)。乳特異的プロモーターまたは哺乳動物組
織中で特異的に活性化されるプロモーターは、cDNAまたはゲノム配列に由来して
もよい。好ましくは、原ゲノム配列である。

【０１４４】 DNA配列情報は、少なくとも1つ、およびしばしば複数の生体において、上述さ
れる乳腺特異的遺伝子に有用である。例えば、リチャーズ(Richards) 等著, J.
Biol. Chem. 256, 526-532(1981)（α−ラクトアルブミンラット）；キャンプベ
ル(Campbell) 等著、Nucleic Acids Res. 12, 8685-8697(1984)（ラットWAP）;
ジョーンズ(Jones) 等著, J. Biol. Chem. 260, 7042-7050(1985)（ラットβ−
カゼイン）; ブ−リー＆ローセン(Vu-Lee&Rosen)著, J. Biol. Chem. 258, 1079
4-10804(1983)（ラットγ−カゼイン）; ホール(Hall)著, Biochem. J. 242, 75
3-742(1987)（α−ラクトアルブミンヒト）; スチュワート(Stewart)著, Nuclei
c Acids Res. 12, 389(1984)（ウシαs1およびkカゼインcDNA）;ゴロデスキ( Go
rodetsky) 等著, Gene 66, 87-96(1988)（ウシβカゼイン）;アレキサンダー( A
lexander) 等著, Eur. J. Biochem. 178, 395-401(1988)（ウシkカゼイン）; ブ
リグノン(Brignon) 等著, FEBS Lett. 188, 48-55(1977)（ウシαS2カゼイン）;
ジャミエソン(Jamieson) 等著, Gene 61, 85-90(1987), イワノフ(Ivanov) 等
著, Biol. Chem. Hoppe- Seyler 369, 425-429(1988), アレキサンダー( Alexan
der) 等著, Nucleic Acids Res. 17, 6739(1989)（ウシpラクトグロブリン）;
ビロット(Vilotte)等著, Biochimie 69, 609-620(1987)（ウシα−ラクトアルブ
ミン）参照。様々の乳タンパク質の構造および機能は、メルシア＆ビロット(Mer
cier & Vilotte)著, J. Dairy Sci. 76, 3079-3098(1993)（すべての目的のため
に完全に引用される）に記載される。異種タンパク質の発現の最適化においてさ
らなるフランキング配列が有用な場合、プローブとして存在する配列を使用する
ことによりそのような配列をクローン化してもよい。様々の生体からの乳腺特異
的調節配列を、既知のコグネートヌクレオチド配列、またはコグネートタンパク
質に対する抗体をプローブとして使用してそのような生体からのライブラリをス
クリーニングすることにより得てもよい。

【０１４５】 シグナル配列 有用なシグナル配列は、真核生物または原核生物タンパク質を分泌する乳特異
的シグナル配列または他のシグナル配列である。好ましくは、シグナル配列は、
乳特異的シグナル配列から選択される、すなわち、乳中に分泌される産物をコー
ドする遺伝子に由来する。より好ましくは、乳特異的シグナル配列は、以下に記
載される構成体において使用される乳特異的プロモーターに関連する。シグナル
配列のサイズは、重要ではない。必要なことは、配列が、例えば乳組織において
所望の組換えタンパク質を分泌するのに十分な大きさであることである。例えば
、カゼイン、例えばアルファ、ベータ、ガンマまたはカッパカゼインをコードす
る遺伝子からのシグナル配列は、ベータラクトグロブリン、乳漿酸性タンパク質
、およびラクトアルブミンを使用できる。好ましいシグナル配列は、ヤギβ−カ
ゼインシグナル配列である。

【０１４６】 他の分泌タンパク質、例えば腎細胞、膵細胞または肝細胞により分泌されるタ
ンパク質からのシグナル配列を使用してもよい。好ましくは、シグナル配列は、
例えば尿または血液中にタンパク質を分泌する。

【０１４７】 他の組織特異的プロモーター 特定の組織において発現を提供する他の組織特異的プロモーターを使用しても
よい。組織特異的プロモーターは、他よりも特定の組織において強く発現される
プロモーターである。組織特異的プロモーターはしばしば、特定の組織において
実質的に限定して発現される。例えば、変容タンパク質は通常肝臓で発現され、
肝臓−特異的プロモーターが使用される。これは、サプレッサーtRNAを使用して
血清アルブミンを変容させる場合のケースである。この場合において、サプレッ
サーtRNAをコードする遺伝子導入された配列は、肝臓−特異的プロモーターの調
節下にあってもよい。

【０１４８】 使用できる組織特異的プロモーターには、神経特異的プロモーター、例えばネ
スチン(nestin)、Wnt-1、Pax-1、エングレイルド-1、エングレイルド-2、ソニッ
クヘッジホッグ；肝臓特異的プロモーター、例えばアルブミン、アルファ−1ア
ンチトリプシン；筋肉特異的プロモーター、例えばミオゲニン、アクチン、MyoD
、ミオシン；卵母細胞特異的プロモーター、例えばZP1、ZP2、ZP3；精巣特異的
プロモーター、例えばプロタミン、ファーチリン(fertilin)、シナプトネマルコ
ンプレックスタンパク質−１；血液特異的プロモーター、例えばグロブリン、GA
TA-1、ポルホビリノーゲンデアミナーゼ；肺特異的プロモーター、例えば界面活
性タンパク質C；皮膚または毛特異的プロモーター、例えばケラチン、エラスチ
ン；内皮特異的プロモーター、例えばTie-1、Tie-2；および骨特異的プロモータ
ー、例えばBMPが含まれてもよい。

【０１４９】 さらに、一般的なプロモーターを、複数の組織での発現に使用してもよい。一
般的なプロモーターの例には、β−アクチン、ROSA−21、PGK、FOS、c-myc、Jun
-AおよびJun-Bが含まれる。

【０１５０】 インシュレーター配列 遺伝子導入された動物を産生するために使用されるDNA構成体には、少なくと
も1つのインシュレーター配列が含まれる。「インシュレーター」、「インシュ
レーター配列」および「インシュレーター要素」という用語は、ここで相互に交
換して使用される。インシュレーター要素は、作用の範囲内に位置する遺伝子の
転写を防護するが、消極的にも積極的にも遺伝子発現を変化させない調節要素で
ある。好ましくは、インシュレーター配列は、転写されるDNA配列のいずれかの
側で挿入される。例えば、インシュレーターは、関心のある遺伝子の3’端にお
いて、プロモーターから約200bpから約1kbまで、およびプロモーターから少なく
とも約1kbから5kbまでに位置してもよい。関心のあある遺伝子のプロモーターお
よび3’端からのインシュレーター配列の距離は、構成体において使用される関
心のある遺伝子、プロモーターおよびエンハンサーの相対的なサイズに依存して
、当業者により測定できる。さらに、1つ以上のインシュレーター配列が、プロ
モーターから5’にまたはトランスジーンの3’端に位置してもよい。例えば、2
つ以上のインシュレーター配列が、プロモーターから5’に位置してもよい。ト
ランスジーンの3’におけるインシュレーターは、関心のある遺伝子の3’端に、
または3’調節配列、例えば3’非翻訳領域(UTR)または3’フランキング配列の3
’端に位置してもよい。

【０１５１】 好ましいインシュレーターは、チキンβ−グロビン位置の5’端を含み、ここ
に引用される国際特許出願第94/23046号に記載されるチキン5’構成性過敏性部
位に一致する。

【０１５２】 DNA構成体 異種タンパク質をコードするカセットを、プロモーター、例えば乳上皮細胞の
ような特定の組織に対するプロモーター、例えばカゼインプロモーター、例えば
ヤギベータカゼインプロモーター、乳特異的配列、例えばカゼインシグナル配列
、例えばβ−カゼインシグナル配列、および異種タンパク質をコードするDNAを
含む構成体として組み合わせてもよい。

【０１５３】 構成体には、非分泌タンパク質をコードするDNA配列の下流の3’非翻訳領域が
含まれる。そのような領域は、発現系のRNA転写物を安定化させ、したがって発
現系からの所望のタンパク質の収率を増加させる。本発明において使用するため
の構成体において有用な3’非翻訳領域は、ポリAシグナルを提供する配列である
。そのような配列は、例えばSV40の小さいt抗原、カゼイン3’非翻訳領域または
当該技術においてよく知られる他の3’非翻訳配列に由来してもよい。ある態様
において、3’非翻訳領域は、乳特異的タンパク質に由来する。3’非翻訳領域の
長さは重要ではないが、ポリA転写物の安定化効果は、発現配列のRNAを安定させ
ることにおいて重要であると考えられる。

【０１５４】 随意に、構成体は、プロモーターとシグナル配列をコードするDNA配列との間
の5’非翻訳領域を含んでもよい。そのような非翻訳領域は、プロモーターが得
られる同じ調節領域、または異なる遺伝子に由来してもよい、例えば他の合成、
半合成または天然供給源に由来してもよい。また、特定の長さは重要ではないが
、発現のレベルの改良において有用であると考えられる。

【０１５５】 構成体には、好ましくは乳上皮細胞において発現される遺伝子のN末端コード
領域の約10%、20%、30%またはそれ以上が含まれてもよい。例えば、N末端コード
領域は、使用されるプロモーター、例えばヤギβ−カゼインN末端コード領域に
一致してもよい。

【０１５６】 構成体は、当該技術において知られる方法を使用して調製できる。構成体は、
より大きいプラスミドの一部として調製してもよい。そのような調製により、有
効な方法で正しい構造のクローニングおよび選択が可能となる。構成体は、所望
の哺乳動物中に組み込むために残存するプラスミド配列から容易に分離できるよ
うに、プラスミド上の都合のよい制限部位の間に位置してもよい。

【０１５７】薬剤組成物 本発明の遺伝子導入により産生されたポリペプチドまたは製剤は、例えば癌の
ような病気または疾患あるいは例えば火傷のような侵入性の損傷を和らげ、抑制
し、治療しまたは予防するのに有用な薬剤組成物中に組み込んでもよい。組成物
は、薬学的に許容できるキャリア中でまたはトランスジェニック動物の乳中で、
治療または予防のための量の遺伝子導入により産生されたデコリンを含まなけれ
ばならない。

【０１５８】 薬剤のキャリアは、ポリペプチドを患者に供給するのに適切な、任意の適合す
る非毒性の物質でよい。滅菌水、アルコール、脂肪、ロウ、および不活性固体を
キャリアとして使用してもよい。薬学的に許容できるアジュバント、緩衝剤、分
散剤等を薬剤組成物中に組み込んでもよい。薬剤組成物中の遺伝子導入により産
生されたペプチドまたはたの活性物質の濃度は、広く、すなわち、重量で約0.1%
未満、通常は少なくとも約1%から重量で20%以上まで、変化してもよい。

【０１５９】 経口投与については、活性成分を、カプセル、錠剤、および粉末のような固形
の剤型、またはエリキシル剤、シロップ剤、および懸濁液のような液体の剤型で
投与してもよい。活性の組成物は、グルコース、ラクトース、スクロース、マン
ニトール、デンプン、セルロースまたはセルロース誘導体、ステアリン酸マグネ
シウム、ステアリン酸、サッカリンナトリウム、滑石粉、炭酸マグネシウム等の
ような不活性成分および粉末化キャリアと共にゼラチンカプセル中に被包しても
よい。所望の色、味、安定性、緩衝力、分散または他の既知の所望の特徴を提供
するために加える追加の不活性成分の実施例は、弁柄、シリカゲル、ラウリル硫
酸ナトリウム、二酸化チタン、食用白インク等である。同様の希釈剤を使用して
、圧縮錠を生成してもよい。錠剤およびカプセルは、数時間の間薬剤を連続的に
放出する徐放性産物として製造できる。圧縮錠は、糖コーティングまたはフィル
ムコーティングして、任意の不快な味を隠し、空気から錠剤を保護してもよく、
また消化管中で選択的に分解されるように腸溶コーティングしてもよい。経口投
与のための液体の剤型は、患者が容認しやくするために着色剤および調味料を含
有してもよい。

【０１６０】 経鼻投与については、ポリペプチドはエアロゾルとして調製してもよい。「エ
アロゾル」という用語は、細気管支または鼻腔に吸入できる本発明の組成物のガ
スで生ずる浮遊相を含む。詳細には、エアロゾルは、計量式吸入器または噴霧器
、あるいはミスト散布器中で産生され、本発明の組成物の小滴のガスで生ずる懸
濁を含む。エアロゾルはまた、例えば吸入器装置からの吸入により供給される、
空気または他のキャリアガス中に浮遊する本発明の化合物の乾燥粉末組成物を含
む。ガーダートン＆ジョーンズ(Ganderton & Jones)著, Drug Delivery to the
Respiratory Tract, Ellis Horwood (1987); Gonda (1990) Critical Reviews i
n Therapeutic Drug Carrier Systems 6:273-313; and Raeburn et al. (1992)
J. Pharmacol. Toxicol. Methods 27:143-159参照。

【０１６１】 本発明の薬剤組成物は、静脈注射によりまたは経口により投与してもよい。皮
内または筋肉内投与もまた、ある環境で可能である。治療上の用途については、
例えば癌または侵入性の皮膚の損傷に苦しむ患者に、病気を抑制、予防、または
改善するのに十分な量で薬剤組成物を投与する。これを達成するのに十分な量は
、「治療上有効な量または投与量」として定められる。

【０１６２】製剤 製剤は、遺伝子導入により産生されたデコリンを含む。好ましい実施の形態に
おいて、製剤は、遺伝子導入によるデコリン、およびデコリン以外の少なくとも
1つの栄養成分を含む。栄養成分は、タンパク質、例えば乳タンパク質；ビタミ
ン、例えばビタミンA、ビタミンB、ビタミンD；淡水化物；無機物、例えばカル
シウム、リン、鉄でもよい。製剤は、固体または液体形態でもよい。好ましい実
施の形態において、製剤はさらに液体キャリア、例えば水のような希釈剤を含む
。

【０１６３】 好ましい実施の形態において、これらの製剤は、患者への経口、局所または静
脈内あるいは筋肉内投与に適切である。製剤は、治療および／または栄養上の用
途に有用である。

【０１６４】栄養補助食品 遺伝子導入によるデコリンは、栄養補助食品に含まれてもよい。好ましくは、
本発明の遺伝子導入によるタンパク質を発現するトランスジェニック動物から得
られる乳または乳産物であるかまたはトランスジェニック植物から得られる植物
の一部である。他の栄養補助食品の実施例は、本発明の遺伝子導入によるタンパ
ク質を組み込むデザート、アイスクリーム、プディングおよびゼリー、並びにス
ープおよび飲料を含むがこれに限定されない。さらに、本発明の単離された遺伝
子導入によるタンパク質は、他の既知の添加剤、キャリア、充填剤および希釈剤
を有するまたは有しない粉末または錠剤で提供されてもよい。栄養補助食品は、
スコットヘゲンハート(Scott Hegenhart)著, Food Product Design, Dec. 1993
に記載される。

【０１６５】トランスジェニック植物 トランスジェニック生物は、DNAトランスジーンが核または葉緑体ゲノム中に
挿入されたトランスジェニック植物でもよい。植物の形質転換は当該技術におい
て既知である。概して、Methods in Enzymology Vol. 153 (“Recombinant DNA
Part D”)1987, ウーおよびグロスマン(Wu and Grossman)著 Eds., Academic Pr
essおよび欧州特許出願第EP693554号参照。

【０１６６】 マイクロピペットの使用によるマイクロインジェクションにより、外来の核酸
を植物細胞へ直接に機械的に転移できる。細胞が有する遺伝物質との沈降複合体
を形成するポリエチレングリコールの使用により、外来の核酸を植物細胞中に転
移することができる(パスコウスキ(Paszkowski)等著、(1984) EMBO J. 3:2712-2
2)。

【０１６７】 外来の核酸は、エレクトロポレーションにより植物細胞中に導入してもよい(
フロム(Fromm)等著、(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 82:5824)。この技術
において、植物のプロトプラストは、適切な遺伝物質を含有するプラスミドまた
は核酸の存在下でエレクトロポレーションされる。強い磁界の電気的衝撃が生体
膜を可逆的に透過し、プラスミドの導入が可能となる。エレクトロポレーション
された植物のプロトプラストは、細胞壁を再形成し、分裂し、植物カルスを形成
する。形質転換されt遺伝子を有する形質転換された植物細胞の選択は、表現型
マーカーを使用して達成できる。

【０１６８】 外来の核酸を植物細胞中に導入するためのベクターとして、カリフラワーモザ
イクウィルス(CaMV)を使用してもよい(ホウン(Hohn)等著、(1982) “Molecular
Biology of Plant Tumors,” Academic Press, New York, pp. 549-560; ハウエ
ル(Howell), 米国特許第4,407,956号)。細菌中で増殖できる組換えDNA分子を産
生する親細菌プラスミド中にCaMVウィル性DNAゲノムを挿入する。クローニング
の後、組換えプラスミドを再びクローン化し、所望のDNA配列をリンカーの特異
的な制限部位中に導入することによりさらに修飾してもよい。次に組換えプラス
ミドの修飾されたウィルス部分を親細菌プラスミドから切断し、植物細胞または
植物に接種するために使用する。

【０１６９】 外来の核酸を植物細胞中に導入する別の方法は、小さいビーズまたは粒子のマ
トリクス内、あるいは表面上に核酸を有する小さい粒子により高速弾道透過であ
る(クレイン(Klein)等著、(1987) ネイチャー(Nature) 327:70-73)。通常は新し
い核酸の単一の導入が必要であるが、この方法は特に複数の導入を提供する。

【０１７０】 核酸を植物細胞中に導入する好ましい方法は、核酸により形質転換されたアグ
ロバクテリウムツメファシエンスにより、植物細胞、外植片、成長点または種子
を感染させることである。当該技術において既知の適切な条件下で、形質転換さ
れた植物細胞を成長させて、若枝、根を形成させ、さらに植物に発達させる。例
えばアグロバクテリウムツメファシエンスのTiプラスミドにより、核酸を適切な
植物細胞中に導入してもよい。アグロバクテリウムツメファシエンスによる感染
に基づいてTiプラスミドを植物細胞に感染させ、植物ゲノム中に安定して統合さ
せる(ホーシュ(Horsch)等著、(1984) “Inheritance of Functional Foreign Ge
nes in Plants,” サイエンス(Science) 233:496-498; フラリー(Fraley)等著、
(1983) Proc. Natl. Acad. Sci. 米国 80:4803)。

【０１７１】 Tiプラスミドは、形質転換された細胞を産生するために必要な2つの領域を含
有する。これらの1つはトランスファーDNA(T DNA)と称され、腫瘍形成を誘導す
る。もう1つは、毒性領域と称され、植物へのT DNAの導入に必要である。植物ゲ
ノムへ転移するトランスファーDNA領域は、転移能力に影響を与えずに外来の核
酸配列を挿入することによりサイズを増加させることができる。もはや干渉しな
いように腫瘍の原因となる遺伝子を除去することにより、修飾されたTiプラスミ
ドを本発明の遺伝子構成体を適切な植物細胞に転移するためのベクターとして使
用してもよい。

【０１７２】 アグロバクテリウムを使用して植物細胞を形質転換するのに少なくとも3つの
異なる方法が存在する：（１）アグロバクテリウムと培養した単離プロトプラス
トとの共培養；（２）アグロバクテリウムによる細胞または組織の形質転換；ま
たは（３）アグロバクテリウムによる種子、交叉点または成長点の形質転換。第
1の方法は、プロトプラストの培養および培養プロトプラストからの植物の再生
を可能とする確立された培養系を必要とする。第2の方法は、植物細胞または組
織がアグロバクテリウムにより形質転換できること、および形質転換された細胞
または組織を植物全体を再生するように誘導できることを必要とする。第3の方
法は、マイクロプロパゲーションを必要とする。

【０１７３】 バイナリーシステム(binary system)において、感染するために2つのプラスミ
ドが必要である：プラスミドを含有するT-DNAおよびウィルスプラスミド。プラ
スミドを含有する多くのT-DNAの任意の1つは、2つのプラスミドのそれぞれにつ
いて独立して選択できるという唯一の条件を満たせば使用できる。

【０１７４】 植物細胞または植物の形質転換の後、所望のDNA断片が統合されるようにTiプ
ラスミドにより形質転換された植物細胞または植物は、適切な表現型マーカーに
より選択できる。これらの表現型マーカーは、抗生物質耐性、除草剤耐性または
目視観測を含むがこれに限定されない。他の表現型マーカーは当該分野で知られ
ており、本発明に使用できる。

【０１７５】 プロトプラストを単離し植物全体を単離するまで培養できる植物を、形質転換
された外来の遺伝子を含有する植物全体が回収されるように形質転換してもよい
。適切な植物には、例えば、フラガリア(Fragaria)、ロータス(Lotus)、メディ
カゴ(Medicago)、オノブリキス(Onobrychis)、トリフォリウム(Trifolium)、ト
リゴネラ(Trigonella)、ビグナ(Vigna)、シトラス(Citrus)、リナム(Linum)、ゼ
ラニウム(Geranium)、マニホット(Manihoto)、ダウカス(Daucus)、アラビドプシ
ス(Arabidopsis)、ブラシカ(Brassica)、ラファナス(Raphanus)、シナピス(Sina
pis)、アトロパ(Atropa)、カプシカム(Capsicum)、ヒオシャムス(Hyoscyamus)、
リコペルシコン(Lycopersicon)、ニコチアナ(Nicotiana)、ソラナム(Solanum)、
ペチュニア(Petunia)、ディジタリス(Digitalis)、マジョラナ(Majorana)、キオ
ホリウム(Ciohorium)、ヘリアンタス(Helianthus)、ラクツカ(Lactuca)、ブロマ
ス(Bromus)、アスパラガス(Asparagus)、アンチリウム(Antirrhinum)、ヘレロカ
リス(Hererocallis)、ネメシア(Nemesia)、ペラルゴニウム(Pelargonium)、パニ
カム(Panicum)、ペニセタム(Pennisetum)、ラナンクルス(Ranunculus)、セネシ
オ(Senecio)、サルピグロシス(Salpiglossis)、ククミス(Cucumis)、ブロワアリ
ア(Browaalia)、グリシン(Glycine)、ロリウム(Lolium)、ジー(Zea)、トリチカ
ム(Triticum)、ソルガム(Sorghum)、およびダチュラ(Datura)の属が含まれる。

【０１７６】 多くの植物は、培養した細胞または組織から再生できる。ここで用いたように
「再生」という用語は、植物細胞、一群の植物細胞、植物の一部または植物の一
片から（例えばプロトプラスト、カルス、または組織の一部から）植物全体を発
生させることを意味する(Methods in Enzymology Vol. 153 (“Recombinant DNA
Part D”)1987, ウーおよびグロスマン(Wu and Grossman)著、Eds., Academic
Press; Methods in Enzymology,第118巻:およびクリー(Klee)等著, (1987) Annu
al Review of Plant Physiology, 38:467-486)。

【０１７７】 培養されたプロトプラストからの植物の再生は、エバンズ(Evans)等著, “Pro
toplasts Isolation and Culture,” Handbook of Plant Cell Cultures 1:124-
176(MacMillan Publishing Co. New York 1983);M.Rデービー(M.R.)著、Davey,
“Recent Developments in the Culture and Regeneration of Plant Protoplas
ts,” Protoplasts (1983)-Lecture Proceedings, pp. 12-29, (Birkhauser, Ba
sal 1983); P.J.デール(P.J. Dale)著, “Protoplast Culture and Plant Regen
eration of Cereals and Other Recalcitrant Crops,” Protoplasts (1983)-Le
cture Proceedings, pp. 31-41, (Biekhauser, Basel 1983); および H.ビンデ
ィング(H. Binding)著, “Regeneration of Plants,” Plant Protoplasts, pp.
21-73, (CRC Press, Boca Raton 1985)に記載されている。

【０１７８】 プロトプラストからの再生は植物の種類で変化するが、通常は、外因性の配列
のコピーを含有する形質転換されたプロトプラストの懸濁液をまず生成する。あ
る種において、その後プロトプラスト懸濁液から天然の胚と同様に胚形成を成熟
および発芽の段階まで誘導できる。培養培地は、様々のアミノ酸およびオーキシ
ンおよびサイトカインのようなホルモンを含有してもよい。特にトウモロコシお
よびアルファルファのような種については、培地にグルタミン酸およびプロリン
を加えることが有用である。若枝および根は通常同時に発生する。効率的な再生
は、培地、遺伝子型、および培養の過程に依存する。これらの3つの変量をコン
トロールし、再生を完全に再現および反復可能にする。

【０１７９】 無性的に繁殖された作物において、成熟したトランスジェニック植物を切断に
よりまたは組織培養技術により繁殖させ、産物の特性についてのテストのような
試験のために複数の同一の植物を産生する。所望のトランスジェニック植物の選
択を行い、それにより新しい品種を得て、市販のために無性的に繁殖させる。繁
殖された作物の種子において、成熟したトランスジェニック植物は、自己交差し
て同型の近交植物を産生する。近交植物は、新しく導入された外来遺伝子活性レ
ベルのために遺伝子を含有する種子を産生する。これらの種子を生長させて、選
択された表現型を有する植物を産生することができる。本発明による近交を使用
して、新しい雑種を発生できる。この方法において、選択された近交系を別の近
交系と交差させて雑種を産生する。

【０１８０】 花、種子、葉、枝、果実等のような再生された植物から得られる部分は、これ
らの部分が形質転換された細胞を含む場合、本発明に含まれる。再生された植物
の子孫および変異株、および突然変異体もまた、これらの部分が導入されたDNA
配列を含む場合、本発明の範囲内に含まれる。再生された植物の子孫および変異
株、および突然変異体もまた本発明の範囲内に含まれる。

【０１８１】 しかしながら、導入される核酸断片の分解に対する耐性を与える、ゲノム統合
の過程を補助する、または形質転換される細胞または植物を容易に選択する方法
を提供する任意のさらなる付着ベクター配列が有用であり、有効なトランスジェ
ニック植物または植物細胞の選択の困難性を大きく減少させる。

【０１８２】 トランスジェニック植物または植物細胞の選択は通常、色の変化（例えば白い
花、変化する色素産物、および花における均等色のパターンまたは不規則なパタ
ーン）の観察のような視覚的分析に基づくが、酵素活性または産物の量の生化学
分析を含んでもよい。トランスジェニック植物または植物細胞を、関心のある植
物部分を有する植物に生長させ、外観（フラボノイド遺伝子について）または性
化学分析（ノザンブロット）；ウェスタンブロット；分光法を含む酵素分析およ
びフラボノイド化合物分析により遺伝子活性を観察する（ハーボーン(Harborne)
等著、(1975) The Flavonoids, 第1巻および第2巻, [Acad. Press]参照）。適切
な植物を選択しさらに評価する。遺伝子操作された植物を産生する方法はさらに
、米国特許第5,283,184号、米国特許第5,482,852号、および欧州特許出願第EP69
3554号に記載される。

【０１８３】乳からの精製 遺伝子導入タンパク質は、比較的に高い濃度でおよび大量に乳中で産生するこ
とができ、回復できる供給源から容易に回収される通常の加工タンパク質が継続
的に高いレベルで産生される。乳からタンパク質を単離する様々の方法が当該技
術において知られている。

【０１８４】 乳タンパク質は通常、工程の組合せにより単離される。まず未処理の乳を分別
して、例えばスキミング、遠心分離、沈降(H.E.スワイスグッド(H.E. Swaisgood
)著, Developments in Dairy Chemistry, I: Chemistry of Milk Protein, Appl
ied Science Publishers, NY, 1982)、酸沈殿（米国特許第4,644,056号）または
レンニンまたはキモトリプシンによる酵素凝析(Swaisgood, ibid)により脂肪を
除去する。次に、主要な乳タンパク質を、関心のある特定のタンパク質を容易に
精製できる透明な溶液または混合沈殿に分別する。

【０１８５】 フランス国特許第2487642号には、排除クロマトグラフィまたはイオン交換ク
ロマトグラフィと組み合わせた膜限外濾過により脱脂乳または乳漿から乳タンパ
ク質を単離することが記載されている。まず、レンネットまたは乳酸による凝固
によってカゼインを除去することにより乳漿を産生する。米国特許第4,485,040
号には、2つの連続的な減外濾加工程により乳漿からレテンテート(retentate)中
でアルファ−ラクトグロブリンに富む産物を単離することが記載される。米国特
許第4,644,056号により、pH4.0−5.5における酸沈殿、およびまず産物のプール
の不純物を除去するために0.1−1.2マイクロメートルの孔の大きさの膜上でおよ
び次に濃縮するために5−80kdの分離制限の膜上で連続的な交差流動(cross-flow
)濾過することにより乳または初乳から免疫グロブリンを精製する方法が提供さ
れる。

【０１８６】 同様に、米国特許第4,897,465号には、pHシフトによるい金属酸化物膜上にお
ける連続的な限外濾過によって、血清、卵黄または乳漿から免疫グロブリンのよ
うなタンパク質を濃縮および集積することが開示されている。まず、選択された
タンパク質の等電点(pI)以下のpHで濾過を行い、タンパク質レテンテートから大
量の混入物を除去し、次に選択されたタンパク質のpIより大きいpHで行い不純物
を保持し、選択されたタンパク質を浸透させる。異なる濾過濃縮方法は、脱脂乳
をpI以下のpH3−4に減少してカゼインおよび乳漿タンパク質を可溶化する、欧州
特許第467 482 B 1号に開示されている。次に、限外濾過または濾過の3つの継続
的なラウンドによりタンパク質を濃縮して90%がタンパク質である15−20%の固体
を含有するレテンテートを形成する。あるいは、英国特許第2179947号には、限
外濾過によりサンプルを濃縮し、その後ほぼ中性のpHにおいて弱い陽イオン交換
クロマトグラフィを行うことにより、乳漿からラクトフェリンを単離することが
開示される。純度の測定は報告されていない。国際特許出願公開第95/22258号に
において、ラクトフェリンのようなタンパク質は、濃縮された塩を加え、その後
陽イオン交換クロマトグラフィにより高いイオン強度に調節された乳から回収さ
れる。

【０１８７】 これらの方法のすべてにおいて、まず乳またはその画分を処理して、脂肪、脂
質、および濾過膜またはクロマトグラフィ培地を汚す他の特定の物質を除去する
。このように産生された最初の画分は、カゼイン、乳漿、または全乳タンパク質
からなり、関心のあるタンパク質がその後単離される。

【０１８８】 国際特許出願公開第94/19935号には、アルギニン、イミダゾールまたはBis-Tr
isのような陽性荷電物質により全乳タンパク質の可溶性を安定化させることによ
って、乳全体からの生物学的に活性のタンパク質を単離する方法が開示される。
この処理により、例えば他の方法では沈殿したタンパク質により詰まる膜を通し
て濾過することにより、タンパク質が単離される不純物が除去された溶液が形成
される。

【０１８９】 USSN第08/648,235号には、接線流動(tangential flow)濾過により乳全体また
は乳画分から生物学的に活性の形態で、ペプチドのような可溶性の乳成分を単離
する方法が開示される。従来の単離方法と異なり、これによって乳全体の第一の
分別について脂肪およびカゼインミセルを除去する必要が除去され、それにより
工程が簡単になり、回復および生物活性の喪失が避けられる。さらに混入物を除
去し、関心のある成分を精製するために、この方法をさらなる精製の工程と組み
合わせて使用してもよい。

【０１９０】デコリンの配列 ここで用いたように、「デコリン」という用語は、デコリンの少なくとも1つ
の生物活性を有するプロテオグリカンまたはその断片または類似物を称する。ポ
リペプチドは、以下の特性の1つを有する場合にデコリンの生物活性を有する：
１）細胞外マトリクス成分、例えばフィブロネクチン（例えばフィブロネクチン
の細胞結合領域および／またはヘパリン結合領域）、コラーゲン（例えばコラー
ゲンI、II、VI、XIV）と相互作用する、例えば結合する；２）原繊維発生を調節
する、例えば抑制する；３）トロンボスポンジンと相互作用する、例えば結合す
る；４）上皮成長因子レセプターと相互作用する、例えば結合する；５）上皮成
長因子レセプターを調節する、例えば活性化する；６）キナーゼ抑制因子、例え
ばサイクリン依存性キナーゼ抑制因子p21を誘導する経路を促進するようなシグ
ナル経路を調節する、例えば促進または抑制する；７）成長因子、例えばTGF−
βと相互作用する、例えば結合する；８）細胞増殖を調節する、例えば抑制する
；９）細胞移動を調節する、例えば抑制する；１０）細胞接着を調節する；およ
び１１）マトリクス集合および組織を調節する。

【０１９１】 デコリンをコードする配列は既知である。好ましくは、ヒトデコリンとは、ク
ルシウス(Krusius)等著、(1986) Prot. Natl Acad. Sci 米国 83:7683に記載さ
れるアミノ酸配列またはその変異体を有するデコリンを称する。天然発生ヒトデ
コリンは、セリン残基、例えばクルシウス(Krusius)等著、(1986) Prot. Natl A
cad. Sci 米国 83:7683に記載されるアミノ酸配列のセリン残基4において一本の
GAG鎖を有する。さらに、天然発生ヒトデコリンは、オリゴ糖に結合した2つまた
は3つのアスパルギニン(asparginine)を含んでもよい。例えばグロスル(Glossl)
著(1984) J. Biol. Chem 259:14144-14150参照。

【０１９２】デコリンの断片および類似物 遺伝子導入により産生されたデコリンは、天然発生タンパク質のアミノ酸配列
を有してもよく、天然発生タンパク質の断片または類似物でもよい。

【０１９３】 好ましい実施の形態において、デコリンポリペプチドは、天然発生デコリンの
配列と1、2、3、5または10残基以下のアミノ酸配列において異なる。他の好まし
い実施の形態において、デコリンポリペプチドは、天然発生デコリンの配列と1
、2、3、5または10%以下の残基でアミノ酸配列が異なる。好ましい実施の形態に
おいて、この相違は、デコリンポリペプチドがデコリン生物活性を示すものであ
る。他の好ましい実施の形態において、この相違は、デコリンポリペプチドがデ
コリン生物活性を有しないものである。好ましい実施の形態において、相違の1
つ以上またはすべては、保存的なアミノ酸変化である。他の好ましい実施の形態
において、相違の1つ以上またはすべては、保存的なアミノ酸変化ではない。

【０１９４】 好ましい実施の形態において、デコリンポリペプチドは、全長デコリンポリペ
プチドの断片、例えば天然発生デコリンポリペプチドの断片である。

【０１９５】 好ましい実施の形態において、断片は少なくとも5、10、20、50、100、または
150のアミノ酸の長さである；断片は、200、150、100、50のアミノ酸残基の長さ
より短い；断片は天然発生デコリンの生物活性を有する；断片は、天然発生デコ
リンの生物活性のアゴニストまたはアンタゴニストである；断片は、レセプター
または酵素へのデコリンの結合を、例えば競合的にまたは非競合的に抑制できる
。

【０１９６】 好ましい実施の形態において、断片は、対応する天然発生デコリンのアミノ酸
配列に少なくとも60、より好ましくは少なくとも70、80、90、95、99、または10
0%の配列同一性を有する。

【０１９７】 好ましい実施の形態において、断片は、脊椎動物、例えば哺乳類、例えばヒト
のような霊長類のデコリンポリペプチドの断片である。

【０１９８】 好ましい実施の形態において、断片は、天然発生のデコリンの対応する残基と
1、2、3、5または10残基以下のアミノ酸配列において異なる。他の好ましい実施
の形態において、断片は、天然発生デコリンの対応する残基と1、2、3、5または
10%以下の残基でアミノ酸配列が異なる。好ましい実施の形態において、この相
違は、断片がデコリン生物活性を示すものである。他の好ましい実施の形態にお
いて、この相違は、断片がデコリン生物活性を有しないものである。好ましい実
施の形態において、相違の1つ以上またはすべては、保存的なアミノ酸変化であ
る。他の好ましい実施の形態において、相違の1つ以上またはすべては、保存的
なアミノ酸変化ではない。

【０１９９】 本発明のポリペプチドは、同義遺伝子、代わりの転写イベント、代わりのRNA
スプライシングイベント、および代わりの翻訳および翻訳後イベントの存在の結
果として生ずるものである。

【０２００】 断片および類似物の産生 当業者は、断片および類似物を産生することによりデコリンの開示された構成
体を変化させ、新しく産生された構成体を活性についてテストすることができる
。断片および類似物を産生およびテストすることが可能な従来技術の方法の例は
、以下に開示されている。これらのまたは他の方法を使用して、デコリンポリペ
プチドの断片および類似物を産生しスクリーニングすることができる。好ましい
実施の形態において、変化されたデコリン構成体はヒトデコリンである。

【０２０１】 断片の産生 タンパク質の断片は、例えば組換えのような様々の方法で、タンパク質分解ま
たは化学合成により産生できる。ポリペプチドの内部または末端断片は、ポリペ
プチドをコードする核酸の一端（末端断片について）または両端（内部断片につ
いて）から1つ以上のヌクレオチドを除去することにより産生できる。突然変異
を起こしたDNAの発現により、ポリペプチド断片が産生される。したがって、「
エンド−ニブリング(end-nibbling)」エンドヌクレアーゼによる分解によって、
断片の配列をコードするDNAを産生できる。タンパク質の断片をコードするDNAは
、ランダム剪断、制限酵素分解または上述の方法の組合せにより産生できる。

【０２０２】 断片は、従来のメリフィールド固相f-Mocまたはt-Boc化学のような当該技術に
おいて知られる技術を使用して化学的に合成できる。例えば、本発明のペプチド
は、断片の重複のない所望の断片に任意に分ける、または所望の長さの重複する
断片に分けてもよい。

【０２０３】 類似物の産生：ランダム法による変化したDNAおよびペプチド配列の産生 タンパク質のアミノ酸配列は、タンパク質またはタンパク質の特定の領域また
は部位をコードするDNAのランダム突然変異により調製できる。有用な方法には
、PCR突然変異誘発および飽和突然変異誘発が含まれる。ランダムアミノ酸配列
変異体のライブラリはまた、一群の変性オリゴヌクレオチド配列により産生でき
る。（変異体のライブラリ中でタンパク質をスクリーニングする方法は他に記載
される。） PCR突然変異誘発 PCR突然変異誘発において、減少したTaqポリメラーゼ適合度を使用して、DNA
のクローン化断片中にランダム突然変異を導入する(レウン(Leung)等著, 1989,
Technique 1:11-15)。これは、ランダム突然変異を導入する非常に強力で比較的
素早い方法である。例えば1:5の割合のdGTP/dATPを使用しPCR反応にMn²⁺を加え
ることにより、Taq DNAポリメラーゼによるDNA合成の適合度を減少させる条件下
で、ポリメラーゼ連鎖反応(PCR)を使用して突然変異を起こされるDNAを増幅する
。増幅したDNA断片のプールを適切なクローニングベクター中に挿入し、ランダ
ム突然変異ライブラリを提供する。

【０２０４】 飽和突然変異誘発 飽和突然変異誘発により、クローン化されたDNA断片へ多くの単一の塩基置換
を素早く導入することができる(マイヤーズ(Mayers)等著, 1985, サイエンス(Sc
ience) 229:242)。この技術には、例えばインビトロにおける一本鎖DNAの化学的
処理または放射線照射、および相補的DNA鎖の合成による突然変異の産生を含む
。突然変異の頻度は、処理の厳格さを調節することにより調節でき、実質的にす
べての可能な塩基置換を得ることができる。この方法は突然変異断片についての
遺伝的選択を含まないので、両方の中性の置換、並びに機能を変化させる置換が
得られる。点突然変異の分配は、保存された配列要素に偏らない。

【０２０５】 変性オリゴヌクレオチド 相同物のライブラリは、一群の変性オリゴヌクレオチド配列から産生できる。
変性配列の化学合成を自動DNA合成器で行い、合成遺伝子を適切な発現ベクター
中にライゲーションしてもよい。変性オリゴヌクレオチドの合成は、当該技術に
おいて知られている（例えば、ナラング(Narang)著, SA (1983) Tetrahedron 39
:3; イタクラ(Itakura)等著、(1981) Recombinant DNA, Proc 3^rd Cleveland Sy
mpos. Macromolecules, ed. AG Walton, Amsterdam: エルセビア(Elsevier)著、
pp273-289; イタクラ(Itakura)等著、(1984) Annu. Rev. Biochem. 53:323; イ
タクラ(Itakura)等著、(1984) Science 198:1056; イケ(Ike)等著、(1983) Nucl
eic Acid Res. 11:477参照）。そのような技術は、他のタンパク質の定方向進展
に使用されてきた（例えば、スコット(Scott)等著、(1990) サイエンス(Science
) 249:386-390; ロバーツ(Roberts)等著、(1992) PNAS 89:2429-2433; デブリン
(Devlin)等著、(1990) サイエンス(Science) 249:404-406; クワーラ(Cwirla)等
著、(1990) PNAS 87:6378-6382；並びに米国特許第5,223,409号、同第5,198,346
号、および同第5,096,815号参照）。

【０２０６】 類似物の産生：定方向突然変異誘発による変化したDNAおよびペプチド配列の
産生 非ランダムまたは定方向の突然変異技術を使用して、特定の配列または特定の
領域における突然変異を提供できる。これらの技術を使用して、タンパク質の既
知のアミノ酸配列の残基のたとえば欠失、挿入、または置換を含む変異体を産生
できる。突然変異の部位は、例えば（１）まず保存されたアミノ酸により、次に
達成された結果に依存してよりラジカルな選択により置換し、（２）標的残基を
除去し、または（３）同じまたは異なる酒類の残基を定められ部位の隣に挿入す
る、あるいは選択肢1−3を組み合わせることにより、個々にまたは連続して調節
できる。

【０２０７】 アラニンスキャニング突然変異誘発 アラニンスキャニング突然変異誘発は、突然変異誘発に好ましい位置または領
域である所望のタンパク質の特定の残基または領域を同定する有用な方法である
。カンニンガムおよびウェルス(Cunningham and Wells)著、(サイエンス(Scienc
e) 244:1081-1085, 1989)。アラニンスキャニングにおいて、1つの標的残基また
は標的残基の群を同定し（例えばArg、Asp、His、Lys、およびGluのような帯電
した残基）、中性のまたは負に帯電したアミノ酸（最も好ましくはアラニンまた
はポリアラニン）により置換する。アミノ酸の置換は、アミノ酸と細胞内または
外の周囲の水溶性環境との相互作用に影響を与え得る。置換に対する機能的感受
性を示すそれらの領域は、置換の部位においてまたはそれに向かって、さらなる
または他の変異体を導入することにより精製される。したがって、アミノ酸配列
突然変異を導入する部位は予め定まっているが、突然変異それ自体の性質は予め
定まっている必要はない。例えば、所定の部位における突然変異の実行を最適化
するために、アラニンスキャニングまたはランダム突然変異誘発を標的のコドン
または領域で行い、発現された所望のタンパク質サブユニット突然変異を所望の
活性の最適な組合せについてスクリーニングする。

【０２０８】 オリゴヌクレオチドにより媒介される突然変異誘発 オリゴヌクレオチドにより媒介される突然変異誘発は、DNAの置換、欠損、お
よび挿入突然変異を調製するための有用な方法である。たとえば、アデルマン(A
delman)等著、(DNA 2:183, 1983)参照。簡単に言えば、所望のDNAは、突然変異
をコードするオリゴヌクレオチドを、所望のタンパク質の変化していないまたは
天然のDNA配列を含有するプラスミドまたはバクテリオファージの一本鎖形態で
あるDNAテンプレートにハイブリダイズさせる。ハイブリダイゼーションの後、D
NAポリメラーゼを使用して、オリゴヌクレオチドプライマーを組み込み、所望の
タンパク質DNA中の選択された変化をコードするテンプレートの完全な第二の相
補鎖を合成する。通常、少なくとも25ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチド
を使用する。最適なオリゴヌクレオチドは、突然変異をコードするヌクレオチド
の一方の部位におけるテンプレートに完全に相補性を有する12から15までのヌク
レオチドを有する。これにより、オリゴヌクレオチドは一本鎖DNAテンプレート
分子に適切にハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、クレア(Crea)等著、
(Proc. Natl. Acad. Sci. 米国, 75:5765[1978])に記載されるような当該技術に
おいて既知の技術を使用して容易に合成できる。

【０２０９】 カセット突然変異誘発 突然変異を調製する別の方法であるカセット突然変異誘発は、Wells et al. (
Gene, 34:315[1985])により記載される技術に基づく。開始物質は、突然変異さ
れるタンパク質サブユニットDNAを含むプラスミド（または他のベクター）であ
る。突然変異されるタンパク質サブユニットDNA中のコドンを同定する。同定さ
れる突然変異部位のそれぞれの側の固有の制限部位エンドヌクレアーゼ部位がな
ければならない。そのような制限部位が存在しない場合、所望のタンパク質サブ
ユニットDNA中の適切な場所において導入するための上述のオリゴヌクレオチド
により媒介される突然変異誘発を使用して産生してもよい。制限部位をプラスミ
ド中に導入した後、プラスミドをこれらの部位で切断して線形化する。所望の突
然変異部位を含有する制限部位間のDNAの配列をコードする二本鎖オリゴヌクレ
オチドを、標準的な方法を使用して合成する。2つの鎖を別々に合成した後、標
準的な技術を使用して互いにハイブリダイズさせる。この二本鎖オリゴヌクレオ
チドをカセットと称する。このカセットは、プラスミドに直接ライゲーションで
きるように、線形化したプラスミドの端と類似する3’および5’端を有するよう
に設計する。このプラスミドは、突然変異された所望のタンパク質サブユニット
DNA配列を含有する。

【０２１０】 組合せの突然変異誘発 組合せの突然変異誘発を使用して突然変異を産生することもできる。例えば、
一群の相同物または他の関連するタンパク質についてのアミノ酸配列を、好まし
くは可能な最も高い相同性を促進するように整合する。整合された配列の所定の
位置に表れるすべてのアミノ酸を選択し、組合せの配列の変性した一群を産生す
る。突然変異の斑入りのライブラリを、核酸レベルでの組合せの突然変異誘発に
より産生し、斑入りの遺伝子ライブラリによりコードする。例えば、潜在的な配
列の変性セットが個々のペプチドとして、あるいは一群の変性配列を含有するよ
り大きい融合タンパク質の一群として発現できるように、合成オリゴヌクレオチ
ドの混合物を、遺伝子配列中に酵素によりライゲーションしてもよい。

【０２１１】 ペプチド断片または相同物のライブラリをスクリーニングするための一次高生 産性方法 産生された突然変異遺伝子産物をスクリーニングするための様々の技術が当該
技術において知られている。大規模な遺伝子ライブラリをスクリーニングするた
めの技術には、複製可能な発現ベクターへの遺伝子ライブラリのクローニング、
生じたベクターのライブラリによる適切な細胞の形質転換、および所望の活性、
例えばこの場合には、デコリンレセプターのようなデコリン相互作用ポリペプチ
ドへのデコリンの結合等の相互作用、産物が検出される遺伝子をコードするベク
ターの単離を比較的容易にするデコリンポリペプチドとの候補ポリペプチドの結
合のような相互作用等が検出される条件下での遺伝子の発現が含まれる。以下に
記載されるそれぞれの技術は、例えばランダム突然変異誘発技術により産生され
る大量の配列をスクリーニングするための高生産性分析に従う。

【０２１２】 2つのハイブリッド系 上述の系のような2つのハイブリッドアッセイ（ここに記載される他のスクリ
ーニング法と同様に）を使用して、デコリン相互作用因子に結合するデコリンポ
リペプチドの断片または相同物を同定することができる。

【０２１３】 表示ライブラリ アッセイをスクリーニングするための1つの方法において、候補ペプチドを細
胞またはウィルス粒子の表面上で表示し、表示された産物を経由する適切なレセ
プタータンパク質に結合する特定の細胞またはウィルス粒子の能力を「パンニン
グアッセイ」で検出する。例えば、細菌細胞の表面膜タンパク質についての遺伝
子中に遺伝子ライブラリをクローン化し、生じた融合タンパク質をパンニングに
より検出する(ラドナー(Ladner)等著、国際特許出願公開第88/06630号；フクス(
Fuchs)等著、(1991) Bio/Technology 9:1370-1371；およびゴワード(Goward) 等
著、(1992) TIBS 18:136-140)。同様の方法で、検出可能に標識されたリガンド
を使用して、潜在的に機能的なペプチド類似物に印をつけることができる。蛍光
標識されたリガンド、例えばレセプターを使用して、リガンド結合活性を保有す
る相同物を検出してもよい。蛍光標識されたリガンドを使用することにより、細
胞を蛍光顕微鏡下で視覚的に調べ分離することができる、あるいは、細胞の形態
が許せば、蛍光により活性化された細胞選別器により分離できる。

【０２１４】 遺伝子ライブラリは、ウィルス粒子の表面上で融合タンパク質として発現でき
る。例えば、糸状ファージシステムにおいて、外来のペプチド配列を感染性のフ
ァージの表面上で発現させることにより、2つの重要な利点を与えることができ
る。まず、これらのファージは1ミリリットルごとに10¹³を越えるファージの濃
度において親和性マトリクスに適用することができるので、多くのファージを一
度にスクリーニングできる。第2に、それぞれの感染性のファージは表面におい
て遺伝子産物を表示するので、特定のファージが低収率で親和性マトリクスから
回収される場合、ファージを別のラウンドの感染により増幅できる。ほとんど同
一の大腸菌糸状ファージM13、fd.、およびf1の群は、ファージ表示ディスプレイ
において最もよく使用される。ファージgIIIまたはgVIIIコーティングタンパク
質のそれぞれを使用して、ウィルス粒子の最終的なパッケージングを破壊するこ
となく融合タンパク質を産生することができる。外来のエピトープをpIIIのNH₂
−末端で発現させ、そのようなエピトープを有するファージをこのエピトープを
有しない過剰のファージから回収できる（ラドナー(Ladner)等著、国際特許出願
公開第90/02909号；ガラード(Garrard)等著、国際特許出願公開第92/09690号；
マークス(Marks)等著、(1992) J. Biol. Chem. 267:16007-16010；グリフィス(G
riffiths)等著、(1993) EMBO J 12:725-734；クラクソン(Clackson)等著、(1991
) ネイチャー(Nature) 352:624-628；およびバーバス(Barbas)等著、(1992) PNA
S 89:4457-4461）。

【０２１５】 通常の方法は、ペプチド融合パートナーとして、大腸菌のマルトースレセプタ
ー（外側の膜タンパク質、LamB）を使用する(チャービット(Charbit)等著、(198
6) EMBO 5, 3029-3037)。オリゴヌクレオチドをLamB遺伝子をコードするプラス
ミド中に挿入し、タンパク質の細胞外ループの1つに融合されたペプチドを産生
した。これらのペプチドは、リガンド、例えば抗体への結合に利用でき、細胞を
動物に適用する場合に免疫応答を誘導することができる。他の細胞表面タンパク
質、例えばOmpA(スカー(Schorr)等著、(1991) Vaccines 91, pp. 387-392)、Pho
E(アグタバーグ(Agterberg)等著、(1990) Gene 88, 37-45)、およびPAL(フッシ
ュ(Fuchs)等著、(1991) Bio/Tech 9, 1369-1372)、並びに大きい細菌表面構成体
は、ペプチド表示の媒体として役立つ。ペプチドを、重合して遺伝的情報の細菌
間交換のための線毛−a経路を形成するタンパク質であるピリンに融合してもよ
い(サリー(Thiry)等著、(1989) Appl. Environ. Microbiol. 55, 984-993)。他
の細胞との相互作用における役割のために、線毛は、細胞外環境にペプチドを示
すための有用な補助を提供する。ペプチド表示に使用される別の大きい表面構成
体は、細菌の原動力となる器官である、鞭毛である。サブユニットタンパク質の
フラジェリンへのペプチドの融合により、宿主細胞上に多くのペプチドコピーの
密集した配列が提供される(クワジマ(Kuwajima)等著、(1988) Bio/Tech. 6, 108
0-1083)。他の細菌の種類の表面タンパク質もまたペプチド融合パートナーとし
て役立つ。例として、ブドウ球菌タンパク質Aおよびナイセリアの外側の膜プロ
テアーゼIgAが含まれる(ハンソン(Hansson)等著、(1992) J. Bacteriol. 174, 4
239-4245およびクラウサー(Klauser)等著、(1990) EMBO J. 1991-1999)。

【０２１６】 上述の糸状ファージ系およびLamB系において、ペプチド間の物理的結合および
そのDNAのコードは、表面上にペプチドを有する粒子（細胞またはファージ）内
のDNAの封じ込めにより起こる。ペプチドを得ることにより粒子および内部のDNA
を得る。別の方法は、DNA結合タンパク質LacIを使用して、ペプチドおよびDNA間
の結合を形成する(カル(Cull)等著、(1992) PNAS 米国 89:1865-1869)。この系
は、3’端にオリゴヌクレオチドクローニング部位を有するLacI遺伝子を含有す
るプラスミドを使用する。アラビノースによる調節された誘導下で、LacIペプチ
ド融合タンパク質を産生する。この融合は、LacOオペレーター(LacO)として知ら
れる短いDNAに結合するLacIの天然の能力を保有する。発現プラスミド上にLacO
の2つのコピーを導入することにより、LacIペプチド融合は、それをコードする
プラスミドに強く結合する。それぞれの細胞中のプラスミドは単一のオリゴヌク
レオチド配列を含有し、それぞれの細胞は単一のペプチド配列を発現するので、
ペプチドは合成を方向付けたDNA配列と特異的におよび安定して結合する。ライ
ブラリの細胞は徐々に溶解され、ペプチド−DNA複合体は、活性ペプチドを含有
する複合体を回収するために固定化されたレセプターのマトリクスにさらされる
。次に結合したプラスミドDNAは、ペプチドリガンドの同一性を測定するための
増幅およびDNA配列決定のために細胞中に再導入される。方法の実際の有用性の
表示として、ドデカペプチドの大規模なランダムライブラリを作製し、オピオイ
ドペプチドのダイノルフィンBに対して産生されたモノクローナル抗体に基づい
て選択した。ペプチドの集団を回収し、ダイノルフィンBの6つの残基部分に対応
するコンセンサス配列によりすべて関連した(カル(Cull)等著、(1992) Proc. Na
tl. Acad. Sci. 米国 89-1869)。

【０２１７】 時にペプチド−オン−プラスミドと称されるこの方法は、ファージ表示法と2
つの重要な点で異なる。まず、融合タンパク質のC末端にペプチドが結合され、
遊離カルボキシ末端を有するペプチドとしてライブラリメンバーが表示される。
糸状ファージコーティングタンパク質であるpIIIおよびpVIIIはいずれも、C末端
を通してファージに固定され、ゲストペプチドは外側に伸長するN末端領域中に
配置される。いくつかの構造において、ファージ表示されたペプチドは、融合タ
ンパク質のアミノ末端に存在する(クワーラ(Cwirla)等著、(1990) Proc. Natl.
Acad. Sci. 米国 87, 6378-6382)。第2の相違は、ライブラリ中に実際に存在す
るペプチドの集団に影響を与える生物学的偏向である。LacI融合分子は、宿主細
胞の細胞質に限定される。ファージコーティングされた融合は、翻訳中細胞質に
短時間さらされるが、ペリプラズム区画中に内側の膜を介して素早く分泌され、
N末端と共に、ファージ粒子への集合を待つ一方でペリプラズム中へ突出するペ
プチドを含有する、C末端疎水性領域により膜中で固定されたままである。LacI
およびファージライブラリ中のペプチドは、異なるタンパク質分解活性にさらさ
れた結果として非常に異なる。ファージコーティングタンパク質は、内側の膜を
越える輸送およびファージ中への組込みの前置きとしてのシグナルペプチダーゼ
プロセシングを必要とする。あるペプチドは、これらの過程において有害な効果
を働かせ、ライブラリ中で表示が不十分である(ギャロップ(Gallop)等著、(1994
) J. Med. Chem. 37(9):1233-1251)。これらの特定の偏向は、LacI表示系におけ
る要因ではない。

【０２１８】 組換えランダムライブラリ中で有用な小さいペプチドの数は莫大である。10⁷
−10⁹の独立したクローンのライブラリは、ごく普通に調製できる。10¹¹ほどの
組換え体のライブラリが産生されているが、このサイズはクローンライブラリに
ついてのほぼ実用的な限界である。ライブラリのサイズにおけるこの限界により
、形質転換の工程において、宿主細菌細胞中に無作為に抽出された断片を含有す
るDNAが生ずる。この限界を回避するために、ポリソーム複合体中の初期ペプチ
ドの表示に基づくインビトロの系が最近開発された。この表示ライブラリ法は、
現在利用できるファージ／プラスミドまたはプラスミドライブラリよりも3−6倍
大規模なライブラリを産生する能力を有する。さらに、ライブラリの構成体、ペ
プチドの発現、およびスクリーニングは、完全に細胞のない形式で行われる。

【０２１９】 この方法の1つの適用において(ギャロップ(Gallop)等著、(1994) J. Med. Che
m. 37(9):1233-1251)、10¹²のデカペプチドをコードする分子DNAライブラリを構
成し、インビトロの連結した転写／翻訳系において大腸菌S30中でライブラリを
発現させる。条件を選択してmRNA上にリボソームを留めておき、ポリソーム中の
RNAの実質的な割合を蓄積し、コードRNAにまだ結合している初期ペプチドを含有
する複合体を産生する。ポリソームは、従来の組換えペプチド表示ライブラリが
スクリーニングされるのと同じ方法で固定化されたレセプター上で親和力により
精製するのに十分丈夫である。結合した複合体からのRNAを回収し、cDNAに転換
し、PCRにより増幅して次のラウンドの合成およびスクリーニングのためのテン
プレートを産生する。ポリソーム表示法は、ファージ表示系と合わせてもよい。
数回のスクリーニングの後、ポリソームに富むプールからのcDNAをファージミド
ベクター中にクローン化する。このベクターは、コーティングタンパク質に融合
したペプチドを表示するペプチド発現ベクターとして、およびペプチド同定のた
めのDNA配列決定ベクターとして有用である。ファージ上でポリソームに由来す
るペプチドを発現させることにより、この形式における親和性選択方法を続ける
またはファージELISA中の結合活性あるいは完成ファージELISA中の特異的な結合
について個々のクローンにおけるペプチドを分析ことができる(バレット(Barret
)等著、(1992) Anal. Biochem 204, 357-364)。活性ペプチドの配列を同定する
ために、ファージミド宿主により産生されるDNAを配列決定する。

【０２２０】 二次スクリーニング 上述の高生産性アッセイの後、例えば当業者がアゴニストとアンタゴニストと
を区別できるように、さらなる生物学的活性を同定するために二次スクリーニン
グをしてもよい。使用された二次スクリーニングの種類は、テストされることが
必要な所望の活性に依存する。例えば、関心のあるタンパク質とそれぞれのリガ
ンドとの間の相互作用を抑制する能力を使用して上述の一次スクリーニングの1
つにより単離されるペプチド断片の一群からアンタゴニストを同定することがで
きるアッセイを開発することができる。

【０２２１】 したがって、断片および類似物を酸静止、活性についてテストする方法は当該
技術において知られている。関心のあるコア配列が同定されると、当業者はごく
普通に類似物および断片を得ることができる。

【０２２２】 本発明は、以下の実施例によりさらに説明され、これは決してさらに制限する
ものとして解釈されてはならない。本出願に亘って記載されるすべての引用され
る参考文献（文献、特許、公開された特許出願、および同時期に出願中の特許出
願を含む）の内容がここに明白に引用される。

【０２２３】 実施例デコリン構成物の産生 1.7kbのヒトデコリンcDNAを含有するpGEMDecをBspH1により部分的に切断し、
アニーリングされたオリゴヌクレオチドBSPHXHO1およびBSPHXHO2(それぞれCATGC
TCGAGCCGCCAC(配列番号１))および(CATGGTGGCGGCTCGAG(配列番号２))をヒトデコ
リン翻訳開始部位のすぐ上流のBspH1部位にライゲーションした。これにより、
最適なKozakリボソーム結合配列並びにXhoIクローニング部位が産生された。次
にこのプラスミドを突然変異させ、ヒトデコリン翻訳停止コドンの2bp下流にXho
I部位を導入した。次に全ヒトデコリンコード配列を含有する1.1kbのXhoI断片を
単離し、XhoIで開裂したヤギベータカゼイン発現ベクターBC451にライゲーショ
ンし、BC543ヒトデコリン哺乳類発現カセットを産生した。このプラスミドを完
全に配列決定し、位置付けおよび可能な突然変異を確かめた。

【０２２４】 注入断片の調製 ヤギベータカゼイン−ヒトデコリン発現カセットを、NotIで完全に分解するこ
とによりプラスミドバックボーンから分離し、「ウィザード(Wizard)」法を使用
する注入のために調製した。NotIで完全に分解することによりプラスミドDNA(10
0μg)をベクターバックボーンから分離した。次に、ランニングバッファとして1
×TAE(マニアティス(Maniatis)、T.フリッシュ(T., Fritsch)、E. F.、およびサ
ンブルック(Sambrook)著、J. 1983. Molecular Cloning, A Laboratory Manual.
Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Laboratory)を使用して
、アガロースゲル中で分解物を電気泳動した。発現カセットに対応するDNA断片
を含有するゲルの領域をUV光（長波長）下で可視化した。関心のあるDNAを含有
するバンドを切り取り、透析バッグに移し、DNAを1×TAE中の電気溶出により単
離した。

【０２２５】 電気溶出の後、DNA断片を濃縮し、「ウィザードDNAクリーンアップシステム」
(Promega, Cat # A7280)を使用し、提供されたプロトコルに従い、125mlのマイ
クロインジェクションバッファ(10mM Tris pH7.5, EDTA 0.2mM)中で溶出するこ
とにより浄化した。断片濃度を比較アガロースゲル電気泳動により評価した。マ
イクロインジェクション断片ストックの推定濃度は150ng/mlであった。最終濃度
が1.5ng/mlになるように前核注入の直前にストックをマイクロインジェクション
バッファで希釈した。

【０２２６】 マイクロインジェクション CD1メスマウスを過剰排卵させ、受精卵を卵管から取り出した。次にオスの前
核をマイクロインジェクションバッファで希釈したDNAと共にマイクロインジェ
クションした。マイクロインジェクションされた胚をCZB培地中で一晩培養する
かまたは偽妊娠受容体のCD1メスマウスの卵管中にすぐに移した。20から30の2細
胞または40から50の1細胞をそれぞれの受容体メスに移し、分泌に向かわせた。

【０２２７】 創始動物の同定 イソプロパノールによる沈殿によって尾の組織からゲノムDNAを単離し、チキ
ンベータ−グロビンインシュレーターDNA配列の存在についてポリメラーゼ連鎖
反応(PCR)により分析した。PCR反応については、2.5ユニットのTaqポリメラーゼ
を有する50μlのPCRバッファ（20mM Tris pH8.3, 50mM KClおよび1.5mM MgCl₂、
100μMのデオキシヌクレオチドトリホスフェート、および600nMの濃度のそれぞ
れのプライマー）で約250ngのゲノムDNAを希釈し、以下のプログラムを使用して
行った：

【表１】 マウス搾乳 メスマウスに自然に子供を産ませ、通常は出産後7日および9日に搾乳した。搾
乳工程の約1時間前にマウスを同腹の子から分ける。1時間の保有期間後、25標準
規格注射針を使用して、滅菌したリン酸緩衝生理食塩水中で5 i. U.オキシトシ
ンの腹膜内注射を使用して乳の分泌を誘導した。効果を得るためにおきシトシン
について1から5分間の待機期間の後ホルモン注射を行った。

【０２２８】 18標準規格注射針が挿入され、1つの針の受け口形がヒト搾乳器に連結された
ゴムチューブ中に挿入されているゴムストッパーで密閉された15mlコニカルチュ
ーブから成る吸引および収集システムを搾乳に使用した。マウスをケージの上に
置き、尾だけで固定し、その他は制限または限定しなかった。15mlのコニカルチ
ューブ中に配置されたそれぞれのエッペンドルフチューブ中に乳を収集するため
に他の針の受け口形をマウスの乳首の上に配置した（一度に一つ）。それぞれの
サンプルの収集後エッペンドルフチューブを変えた。少なくとも150μlの乳が得
られるまで搾乳を続けた。収集の後、マウスを同腹の子の所に戻した。

【０２２９】 タンパク質分析 Harlow and Lane, 1988に記載されるようにウェスタンブロット分析を行った
。ヒトデコリン特異的ラビットポリクローナル抗体を使用するAntibodies, A La
boratory Manual. Cold Spring Harbor, New York: Cold Spring Harbor Labora
tory(Chemicon, cat# AB1909)。

【０２３０】 結果 トランスジェニックマウス 総計805の胚をマイクロインジェクションした。624(77.5%)の胚がマイクロイ
ンジェクション後生存し、537の胚を20の偽妊娠受容体マウスに転移した。総計1
42の創始マウスが生まれ（転移した胚の26.4%）、インシュレーター配列に特異
的なプライマーを使用してPCRにより分析した。

【０２３１】 全部で15のトランスジェニック創始者を同定し（10.5%、マイクロインジェク
ションされた胚の1.86%）、そのうち6を交配のために選択した。これらのけいに
ついての乳中のヒトデコリン発現を表１に概略する。

【０２３２】 表１：ウェスタンブロットにより測定された、BC543トランスジーンを有する
トランスジェニックマウスによるヒトデコリンの発現。N/A、適用せず。

【０２３３】

【表２】 乳中で発現されたデコリンのグリコシル化 BC543構成物を有するトランスジェニックマウスの乳中でデコリンを高レベル
で発現させる。6つの系の4つは1mg/mlを越えるレベルで発現した。より低いレベ
ルで発現した2つの系のうち、1つは子孫へのトランスジーンの伝達が観察されな
かったので明らかにモザイクであった（系14）。遺伝子導入により発現されたデ
コリンの1つの驚くべき態様は、約45kdから53kdまでの間のバンドの比較的密な
セットとしてSDA-PAGE上で移動するのに対し、哺乳類細胞培養物に由来するデコ
リンは約60から120kdまでに広がるスメアとして移動するということである。遺
伝子導入により発現されたデコリンのこの移動パターンは、グリコサミノグリカ
ン鎖を含有しない分子と一致する。

【０２３４】 トランスジェニック動物の乳中でヒトデコリンを高レベルで(>1mg/ml)発現さ
せた。遺伝子導入により発現されたヒトデコリンはグリコサミノグリカン側鎖を
含有しない。グリコサミノグリカン鎖は非常に外来性であり治療上の組換えタン
パク質の必要な画一的製品特性を達成するための障害であるため、遺伝子導入に
より発現されたこの意外な特性は非常に有用である。さらに、治療の状況で使用
する場合にグリコサミノグリカン鎖はヒトデコリンの活性に必要とされないよう
である。

【０２３５】 トランスジェニックヤギの産生および特徴付け 構成物（例えば、ヤギベータ−カゼイン遺伝子の調節因子に機能可能に結合し
たヒトデコリン遺伝子を含有するBC355ベクター）をマイクロインジェクション
された受精したヤギの卵の転移により、創始者(F₀)のトランスジェニックヤギを
産生できる。この欄に続く方法を使用してトランスジェニックヤギを産生できる
。

【０２３６】 ヤギの種類および血統 スイス原産のヤギ、例えば、アルプス、ザーネンおよびトゲンバーグ(Toggenb
urg)産のヤギは、トランスジェニックヤギの産生に有用である。

【０２３７】 以下に概略される欄には、トランスジェニックヤギの産生に必要な工程が記載
される。これらの工程には、メスのヤギの過剰排卵、繁殖力のあるオスへの交配
および受精した胚の収集が含まれる。収集されると、1−細胞受精胚の前核にDNA
構成物をマイクロインジェクションする。1つの供与体メスからのすべての胚を
一緒に保存し、可能であれば単一の受容体メスに転移する。

【０２３８】 ヤギの過剰排卵 供与体中の発情期のタイミングは、6mgの皮下ノルゲストメット(norgestomet)
耳移植により0日目に同調させた(Syncromate-B, CEVA Laboratories, Inc., Ove
rland Park, KS)。プロゲステロンの内因性合成を停止させるために最初の7日か
ら9日後にプロスタグランジンを投与した。移植組織の挿入の13日後に開始し、
全部で18mgの卵胞刺激ホルモン(FSH-Schering Corp., Kenilworth, NJ)を日に2
度の注射で3日間に亘り筋肉注射で与えた。14日目に移植組織を除去する。移植
組織除去の24時間後に供与体動物を2日間に亘り繁殖力のあるオスと数回交配さ
せる(セルグラス(Selgrath)等著、Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205)。

【０２３９】 胚の収集 胚収集のための手術を繁殖後2日目（または移植組織除去の72時間後）に行っ
た。手術前の36時間過剰排卵したメスに食物および水を与えなかった。メスに0.
8mg/kgのジアゼパム(Valium登録商標)、IVを投与し、すぐに5.0mg/kgのケタミン
(Keteset)、IVを投与する。気管内チューブにより2L／分の酸素中で手術中にハ
ロタン(2.5%)を投与する。中線開腹切開により生殖道を体外に出す。黄体、直系
で6mmより大きい破裂していない卵胞、および卵巣嚢腫を計数して過剰排卵の結
果を評価し、卵管フラッシングにより収集される胚の数を予測する。カニューレ
を卵管の口に配置し、3.0プロレン(Prolene)の単一の一時的なひもで所定の位置
に固定する。A20標準規格注射針を子宮卵管接合部から約0.5cmの子宮中に配置す
る。10から20mlの滅菌したリン酸緩衝生理食塩水(PBS)を、カニューレを挿入し
た卵管を通して流し、ペトリ皿で収集する。この方法を反対側で繰り返し、生殖
道を腹部に戻す。閉鎖前に、10−20mlの滅菌生理食塩水グリセロール溶液を腹腔
に注ぎ、癒着を防ぐ。白線を2.0ポリジオキサノン(Polydioxanone)またはスプラ
ミド(Supramid)の単一の結節縫合で閉鎖し、皮膚を滅菌した創傷クリップで閉鎖
する。

【０２４０】 実体顕微鏡上で受精したヤギ卵をPBS卵管フラッシングから収集した後、Sigma
から購入した10%胎児ウシ血清(FBS)を含有するHam’s F12媒質(Sigma, St. Loui
s, MO)で洗浄する。前核が目に見える場合、すぐに胚にマイクロインジェクショ
ンする。前核が目に見えない場合、前核が目に見えるようになるまで、大気中で
5% CO₂を含有する湿ったガス室中で37℃において短時間、10% FBSを含有するHam
’s F12中に胚を配置する(セルグラス(Selgrath)等著、Theriogenology, 1990.
pp. 1195-1205)。

【０２４１】 マイクロインジェクション法 ガラス陥凹スライド上の油の下の微小滴の媒質中に1−細胞ヤギ胚を配置する
。ノルマルスキ(Normarski)光学を使用する固定ステージによりZeiss直立顕微鏡
上でフレームを磨いた支持マイクロピペットに2つの目に見える前核を有する受精し た卵を固定する。細いガラスのマイクロニードルを使用する注射バッファ(Tris-
EDTA)中で、関心のあるDNA構成物、例えばヤギベータ−カゼイン遺伝子の調節因
子に機能可能に結合されたヒトデコリン遺伝子を含有するBC355ベクターを前核
にマイクロインジェクションする(セルグラス(Selgrath)等著、Theriogenology,
1990. pp. 1195-1205)。

【０２４２】 胚発生 注射後、生存する胚を10%FBSを含有するHam’s F12の培養液中に配置し、受容
体動物が胚転移のために調製されるまで37℃で大気中に5%CO₂を含有する湿った
ガス室中でインキュベートする(セルグラス(Selgrath)等著、theriogenology, 1
990. p. 1195-1205)。

【０２４３】 受容体の調製 受容体動物中の発情期同調を6mgのノルゲストメット耳移植により誘導する(Sy
ncromate-B)。移植組織挿入の13日後に、Sigmaから得た妊馬血清ゴナドトロピン
(PMSG)の単一の非排卵過剰注射(400I.U.)を与える。受容体のメスを精管切除し
たオスに交配させて発情期共時性を確かめる(セルグラス(Selgrath)等著、Theri
ogenology, 1990. pp. 1195-1205)。

【０２４４】 胚転移 1つの供与体メスからのすべての胚を一緒に保存し、可能であれば単一の受容
体に転移する。手術工程は、卵管にカニューレが挿入されず、胚がガラスマイク
ロピペットを使用して線毛を経由して卵管ルーメン中に10%FBSを含有するHam’s
F12の極小量で転移されることを除いて、上述の胚収集について概略したのと同
じである。卵管上に6から8以上の排卵点を有する動物は受容体として適切でない
と判断される。切開、閉鎖および術後処置は供与体動物についてと同じである（
例えばセルグラス(Selgrath)等著、Theriogenology, 1990. pp. 1195-1205参照
）。

【０２４５】 妊娠および出産の観察 発情期開始の45日後に超音波検査により妊娠を測定する。110日目に第2の超音
波検査を行い、妊娠を確かめ胎児性ストレスを評価する。130日目に妊娠してい
る受容体メスに破傷風トキソイドおよびクロストリジウムC&Dのワクチン接種を
する。セレンおよびビタミンE(Bo-Se)をIMで与え、イベルメクチンをSCで与える
。145日目にメスを清潔な区画に移し、約147日目に陣痛を誘発する前にこの環境
に順応させる。147日目に40mgのPGF2a(Lutalyse, Upjohn Company, Kalamazoo M
ichigan)で出産を誘発する。この注射は、2度の投与量で、20mgの投与量の4時間
後に20mgの投与量で与える。147日目のLutalyseの第1の注射の後絶えず定期的に
観察する。2日目の朝から観察を30分ごとに増やす。第1の注射後30から40時間後
に出産が起こった。出産後メスを搾乳して初乳を集め、胎盤の経路を確かめる。

【０２４６】 F ₀ 動物の遺伝子導入による性質の検査 トランスジェニックF₀動物をスクリーニングするために、ゲノムDNAを2つの異
なる細胞系から単離し任意のモザイクトランスジェニックがないことを避ける。
モザイク動物は、すべての細胞で少なくとも1つのトランスジーンのコピーを有
しない任意のヤギとして定義される。したがって、耳組織サンプル（中胚葉）お
よび血液サンプルをゲノムDNAの単離のために2日目のF₀動物から得る(レーシー(
Lacy)等著、A Laboratory Manual, 1986, Cold Springs Harbor, NY; and Herrm
ann and Frischauf, Methods Enzymology, 1987. 152:pp. 180-183)。ヒトデコ
リン遺伝子に特異的なプライマーを使用してポリメラーゼ連鎖反応(ゴウルド(Go
uld)等著、Proc. Natl. Acad. Sci, 1989. 86:pp. 1934-1938)によりおよびラン
ダムプライマーのヒトデコリンcDNAプローブを使用してサザンブロット(トーマ
ス(Thomas)著、Proc Natl. Acad. Sci., 1980. 77:5201-5205)によりDNAサンプ
ルを分析する(フェインガーグ(Feingerg)およびボゲルステイン(Vogelstein)著
、Anal. Bioc., 1983. 132:pp. 6-13)。分析の感受性を、体細胞の10%中のトラ
ンスジーンの１つのコピーの検出として評価する。

【０２４７】 産生群の産生および選択 トランスジェニック創始者(F₀)ヤギ、並びに他のトランスジェニックヤギの産
生に上述の方法を使用できる。例えばトランスジェニックF₀創始者ヤギは、メス
であれば乳を産生し、オスであればトランスジェニックオス子孫を産生するよう
に育てられる。このトランスジェニック創始者オスは、トランスジェニックメス
子孫を産生するために非トランスジェニックメスに交配させてもよい。

【０２４８】 トランスジーンおよび適切な特徴の伝達 ヤギ系における関心のあるトランスジーンの伝達を、PCRおよびサザンブロッ
ト分析により耳組織および血液中で分析する。例えば、創始者のオスおよび3匹
のトランスジェニック子孫のサザンブロット分析により、世代間のコピー数に再
配列または変化は示されない。サザンブロットはヒトデコリンcDNAプローブで調
べる。ブロットをベータスコープ603で分析し、コピー数をヤギベータカゼイン
内因性遺伝子に対するトランスジーンの比較により測定する。

【０２４９】 発現レベルの評価 トランスジェニック動物の乳中で、遺伝子導入によるタンパク質の発現レベル
を、酵素分析またはウェスタンブロットを使用して測定する。

【０２５０】 ここに引用されるすべての特許および他の文献はここで言及することにより引
用される。他の実施の形態は特許請求の範囲内である。

【手続補正書】

【提出日】平成１５年１月２４日（２００３．１．２４）

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】特許請求の範囲

【補正方法】変更

【補正の内容】

【特許請求の範囲】

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号 ＦＩ テーマコート゛(参考） // Ｃ１２Ｐ 21/02 Ｃ１２Ｎ 15/00 Ａ (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＣＹ， ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，Ｉ Ｔ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ，ＴＲ)，ＯＡ(ＢＦ ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＧＷ， ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＧＨ，Ｇ Ｍ，ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＭＺ，ＳＤ，ＳＬ，ＳＺ，ＴＺ ，ＵＧ，ＺＷ)，ＥＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ， ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＥ，ＡＧ，ＡＬ，ＡＭ， ＡＴ，ＡＵ，ＡＺ，ＢＡ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，Ｂ Ｚ，ＣＡ，ＣＨ，ＣＮ，ＣＯ，ＣＲ，ＣＵ，ＣＺ，ＤＥ ，ＤＫ，ＤＭ，ＤＺ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ，ＧＤ， ＧＥ，ＧＨ，ＧＭ，ＨＲ，ＨＵ，ＩＤ，ＩＬ，ＩＮ，Ｉ Ｓ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＫＺ，ＬＣ，ＬＫ ，ＬＲ，ＬＳ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＡ，ＭＤ，ＭＧ， ＭＫ，ＭＮ，ＭＷ，ＭＸ，ＭＺ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，Ｐ Ｔ，ＲＯ，ＲＵ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＳＬ ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＲ，ＴＴ，ＴＺ，ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ， ＵＺ，ＶＮ，ＹＵ，ＺＡ，ＺＷ (72)発明者 ミード，ハリー エム アメリカ合衆国 マサチューセッツ州 02158 ニュートン グラスミア ストリ ート 62 (72)発明者 ピアーシュバチャー，マイケル アメリカ合衆国 カリフォルニア州 92013 サン ディエゴ ウェスト スプ ルース ストリート 148 Ｆターム(参考） 4B024 AA01 BA21 CA04 DA02 EA04 GA12 HA01 4B064 AG01 CA10 CA19 CC24 DA05 4C084 AA01 AA02 AA06 AA07 BA02 BA08 BA22 BA34 CA18 CA53 CA70 DC50 MA02 MA13 MA17 MA23 MA35 MA37 MA43 MA52 MA59 MA66 NA14 ZA892 ZB262

Claims (24)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 遺伝子導入により産生されたデコリンの製剤。
2. 【請求項２】 前記デコリンが、ヒトデコリンであることを特徴とする請求
   項１記載の製剤。
3. 【請求項３】 前記デコリンが、トランスジェニック動物中で産生されるこ
   とを特徴とする請求項１記載の製剤。
4. 【請求項４】 前記デコリンが、トランスジェニック哺乳動物中で産生され
   ることを特徴とする請求項１記載の製剤。
5. 【請求項５】 前記デコリンが、トランスジェニック酪農動物中で産生され
   ることを特徴とする請求項１記載の製剤。
6. 【請求項６】 前記デコリンが、トランスジェニックヤギ中で産生されるこ
   とを特徴とする請求項１記載の製剤。
7. 【請求項７】 前記遺伝子導入により産生されたデコリンが、GAG鎖を有し
   ないことを特徴とする請求項１記載の製剤。
8. 【請求項８】 前記遺伝子導入により産生されたデコリンが、トランスジェ
   ニック哺乳動物の乳腺中で産生されることを特徴とする請求項１記載の製剤。
9. 【請求項９】 製剤中のGAG鎖を有するデコリン分子が30%未満であることを
   特徴とするデコリンの遺伝子導入により産生された製剤。
10. 【請求項１０】 遺伝子導入によるデコリンの製剤を産生する方法であって
    、 デコリンの発現を方向付けるトランスジーンを含むトランスジェニック生物を
    提供し、 前記トランスジーンを発現させ、 前記生物からまたは前記生物により産生された産物から、遺伝子導入により産
    生されたデコリンの製剤を回収する、 各工程を含むことを特徴とする方法。
11. 【請求項１１】 前記デコリンが、ヒトデコリンであることを特徴とする請
    求項１０記載の製剤。
12. 【請求項１２】 前記デコリンが、トランスジェニック動物中で産生される
    ことを特徴とする請求項１０記載の製剤。
13. 【請求項１３】 前記デコリンが、トランスジェニック哺乳動物中で産生さ
    れることを特徴とする請求項１０記載の製剤。
14. 【請求項１４】 前記デコリンが、トランスジェニック酪農動物中で産生さ
    れることを特徴とする請求項１０記載の製剤。
15. 【請求項１５】 前記デコリンが、トランスジェニックヤギ中で産生される
    ことを特徴とする請求項１０記載の製剤。
16. 【請求項１６】 前記遺伝子導入により産生されたデコリンが、GAG鎖を有
    しないことを特徴とする請求項１２記載の製剤。
17. 【請求項１７】 前記遺伝子導入により産生されたデコリンが、トランスジ
    ェニック哺乳動物の乳腺中で産生されることを特徴とする請求項１０記載の製剤
    。
18. 【請求項１８】 異種のデコリンを含む遺伝子導入による製剤をトランスジ
    ェニック哺乳動物の乳中に提供する方法であって、 乳腺上皮細胞中のタンパク質コード配列を発現させるプロモーター配列に機能
    可能に結合したデコリンタンパク質コード配列を生殖細胞系に導入されたトラン
    スジェニック哺乳動物から乳を得て、それにより前記哺乳動物の乳中にデコリン
    を分泌して前記製剤を提供する、 各工程を含むことを特徴とする方法。
19. 【請求項１９】 遺伝子導入によるデコリンを発現し、デコリンの遺伝子導
    入による製剤を提供できることを特徴とするトランスジェニック生物。
20. 【請求項２０】 治療上有効な量の遺伝子導入によるデコリンまたはデコリ
    ンの遺伝子導入による製剤および薬学的に許容できるキャリアを含むことを特徴
    とする薬剤組成物。
21. 【請求項２１】 遺伝子導入により産生されたヒトデコリンおよび少なくと
    も1つの他の栄養成分を含むことを特徴とする製剤。
22. 【請求項２２】 デコリンを必要とする被験者にデコリンを提供する方法で
    あって、遺伝子導入により産生されたデコリンまたはデコリンの遺伝子導入によ
    る製剤を前記被験者に投与する工程を含むことを特徴とする方法。
23. 【請求項２３】 前記被験者が、癌にかかっていることを特徴とする請求項
    ２２記載の方法。
24. 【請求項２４】 前記被験者が、侵入性皮膚損傷にかかっていることを特徴
    とする請求項２２記載の方法。