RU2085587C1 - Способ получения трансгенной овцы - Google Patents
Способ получения трансгенной овцы Download PDFInfo
- Publication number
- RU2085587C1 RU2085587C1 SU4355314/13A SU4355314A RU2085587C1 RU 2085587 C1 RU2085587 C1 RU 2085587C1 SU 4355314/13 A SU4355314/13 A SU 4355314/13A SU 4355314 A SU4355314 A SU 4355314A RU 2085587 C1 RU2085587 C1 RU 2085587C1
- Authority
- RU
- Russia
- Prior art keywords
- dna
- sheep
- gene
- lactoglobulin
- milk
- Prior art date
Links
- 241001494479 Pecora Species 0.000 title claims abstract description 66
- 230000009261 transgenic effect Effects 0.000 title claims abstract description 24
- 238000000034 method Methods 0.000 title abstract description 25
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 73
- 108010060630 Lactoglobulins Proteins 0.000 claims abstract description 33
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims abstract description 30
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims abstract description 30
- 229960004222 factor ix Drugs 0.000 claims abstract description 24
- 102100022641 Coagulation factor IX Human genes 0.000 claims abstract description 21
- 108010076282 Factor IX Proteins 0.000 claims abstract description 21
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 claims abstract description 20
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 claims abstract description 16
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 claims abstract description 9
- 239000002753 trypsin inhibitor Substances 0.000 claims abstract description 9
- 210000001161 mammalian embryo Anatomy 0.000 claims abstract description 8
- 230000001105 regulatory effect Effects 0.000 claims abstract description 6
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 claims description 69
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 10
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 claims description 2
- 102000008192 Lactoglobulins Human genes 0.000 abstract description 28
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 abstract description 25
- 239000000126 substance Substances 0.000 abstract description 10
- 239000003814 drug Substances 0.000 abstract description 4
- 230000000694 effects Effects 0.000 abstract description 4
- 230000003248 secreting effect Effects 0.000 abstract description 3
- 238000002054 transplantation Methods 0.000 abstract description 2
- 238000010276 construction Methods 0.000 abstract 1
- 235000013336 milk Nutrition 0.000 description 30
- 239000008267 milk Substances 0.000 description 30
- 210000004080 milk Anatomy 0.000 description 30
- 235000018102 proteins Nutrition 0.000 description 23
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 description 22
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 21
- 235000013601 eggs Nutrition 0.000 description 21
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 20
- 108010076119 Caseins Proteins 0.000 description 18
- 210000005075 mammary gland Anatomy 0.000 description 16
- 102000011632 Caseins Human genes 0.000 description 15
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 14
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 14
- 230000004927 fusion Effects 0.000 description 13
- 108010011756 Milk Proteins Proteins 0.000 description 12
- 241000699670 Mus sp. Species 0.000 description 12
- 210000004369 blood Anatomy 0.000 description 11
- 239000008280 blood Substances 0.000 description 11
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 11
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 description 11
- 239000002299 complementary DNA Substances 0.000 description 10
- 229920001184 polypeptide Polymers 0.000 description 10
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 108010017384 Blood Proteins Proteins 0.000 description 9
- 210000002257 embryonic structure Anatomy 0.000 description 9
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 9
- 102000004506 Blood Proteins Human genes 0.000 description 8
- HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N Chloroform Chemical compound ClC(Cl)Cl HEDRZPFGACZZDS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N EDTA Chemical compound OC(=O)CN(CC(O)=O)CCN(CC(O)=O)CC(O)=O KCXVZYZYPLLWCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 8
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 description 8
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 8
- 239000012528 membrane Substances 0.000 description 8
- 101710081722 Antitrypsin Proteins 0.000 description 7
- 241000283973 Oryctolagus cuniculus Species 0.000 description 7
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 7
- 230000001475 anti-trypsic effect Effects 0.000 description 7
- 235000021240 caseins Nutrition 0.000 description 7
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 7
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 7
- 102000014171 Milk Proteins Human genes 0.000 description 6
- 241000699666 Mus <mouse, genus> Species 0.000 description 6
- 239000011324 bead Substances 0.000 description 6
- BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N casein, tech. Chemical compound NCCCCC(C(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CC(C)C)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(C(C)O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=O)N=C(O)C(COP(O)(O)=O)N=C(O)C(CCC(O)=N)N=C(O)C(N)CC1=CC=CC=C1 BECPQYXYKAMYBN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 6
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 6
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 6
- 235000021239 milk protein Nutrition 0.000 description 6
- 210000003101 oviduct Anatomy 0.000 description 6
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 5
- 108010046377 Whey Proteins Proteins 0.000 description 5
- 238000013459 approach Methods 0.000 description 5
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 5
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 5
- 210000004602 germ cell Anatomy 0.000 description 5
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 5
- 238000000520 microinjection Methods 0.000 description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 5
- 239000000047 product Substances 0.000 description 5
- 238000011830 transgenic mouse model Methods 0.000 description 5
- 230000014616 translation Effects 0.000 description 5
- 239000013598 vector Substances 0.000 description 5
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Chemical compound O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 108091027974 Mature messenger RNA Proteins 0.000 description 4
- 108090000143 Mouse Proteins Proteins 0.000 description 4
- 241000699660 Mus musculus Species 0.000 description 4
- ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N Phenol Chemical compound OC1=CC=CC=C1 ISWSIDIOOBJBQZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 4
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 4
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 4
- 229940021722 caseins Drugs 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 238000011161 development Methods 0.000 description 4
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 4
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 4
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 230000012173 estrus Effects 0.000 description 4
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 description 4
- 229960000027 human factor ix Drugs 0.000 description 4
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 4
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 4
- 230000006651 lactation Effects 0.000 description 4
- 230000004481 post-translational protein modification Effects 0.000 description 4
- 230000028327 secretion Effects 0.000 description 4
- 235000020254 sheep milk Nutrition 0.000 description 4
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 4
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 4
- 102000006734 Beta-Globulins Human genes 0.000 description 3
- 108010087504 Beta-Globulins Proteins 0.000 description 3
- 241000283690 Bos taurus Species 0.000 description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 description 3
- 108090000144 Human Proteins Proteins 0.000 description 3
- 102000003839 Human Proteins Human genes 0.000 description 3
- 241000555745 Sciuridae Species 0.000 description 3
- 238000002105 Southern blotting Methods 0.000 description 3
- 229930006000 Sucrose Natural products 0.000 description 3
- CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N Sucrose Chemical compound O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](CO)O[C@@]1(CO)O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CO)O1 CZMRCDWAGMRECN-UGDNZRGBSA-N 0.000 description 3
- 239000005018 casein Substances 0.000 description 3
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 3
- 239000012153 distilled water Substances 0.000 description 3
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 3
- 238000001502 gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 description 3
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 description 3
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 description 3
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 description 3
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 3
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 3
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 230000035935 pregnancy Effects 0.000 description 3
- 239000000583 progesterone congener Substances 0.000 description 3
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 3
- 210000000952 spleen Anatomy 0.000 description 3
- 230000006641 stabilisation Effects 0.000 description 3
- 238000011105 stabilization Methods 0.000 description 3
- 239000005720 sucrose Substances 0.000 description 3
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 3
- 238000012546 transfer Methods 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- 238000001262 western blot Methods 0.000 description 3
- 235000021247 β-casein Nutrition 0.000 description 3
- 235000021246 κ-casein Nutrition 0.000 description 3
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 2
- 108020005065 3' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 108020005029 5' Flanking Region Proteins 0.000 description 2
- 206010002091 Anaesthesia Diseases 0.000 description 2
- 101000878595 Arabidopsis thaliana Squalene synthase 1 Proteins 0.000 description 2
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 2
- 108010067770 Endopeptidase K Proteins 0.000 description 2
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 description 2
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 description 2
- 241000701959 Escherichia virus Lambda Species 0.000 description 2
- 108091029865 Exogenous DNA Proteins 0.000 description 2
- 108700024394 Exon Proteins 0.000 description 2
- 239000000020 Nitrocellulose Substances 0.000 description 2
- GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N Nitrous Oxide Chemical compound [O-][N+]#N GQPLMRYTRLFLPF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 241000283903 Ovis aries Species 0.000 description 2
- 101800001442 Peptide pr Proteins 0.000 description 2
- 102000004160 Phosphoric Monoester Hydrolases Human genes 0.000 description 2
- 108090000608 Phosphoric Monoester Hydrolases Proteins 0.000 description 2
- 241000700159 Rattus Species 0.000 description 2
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 2
- 241000282849 Ruminantia Species 0.000 description 2
- 101000642819 Solanum tuberosum Soluble starch synthase 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 2
- 101000642821 Triticum aestivum Starch synthase 1, chloroplastic/amyloplastic Proteins 0.000 description 2
- 230000009471 action Effects 0.000 description 2
- 230000037005 anaesthesia Effects 0.000 description 2
- 230000027455 binding Effects 0.000 description 2
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 2
- 239000013060 biological fluid Substances 0.000 description 2
- 210000000481 breast Anatomy 0.000 description 2
- 244000309466 calf Species 0.000 description 2
- 238000012512 characterization method Methods 0.000 description 2
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 2
- 239000007795 chemical reaction product Substances 0.000 description 2
- YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N chloroform;phenol Chemical compound ClC(Cl)Cl.OC1=CC=CC=C1 YTRQFSDWAXHJCC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 235000013365 dairy product Nutrition 0.000 description 2
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 2
- 239000012470 diluted sample Substances 0.000 description 2
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 2
- 210000003754 fetus Anatomy 0.000 description 2
- 230000006251 gamma-carboxylation Effects 0.000 description 2
- 210000002288 golgi apparatus Anatomy 0.000 description 2
- 239000005556 hormone Substances 0.000 description 2
- 229940088597 hormone Drugs 0.000 description 2
- 239000012678 infectious agent Substances 0.000 description 2
- NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N insulin Chemical compound N1C(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(NC(=O)CN)C(C)CC)CSSCC(C(NC(CO)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CCC(N)=O)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(=O)NC(CC=2C=CC(O)=CC=2)C(=O)NC(CSSCC(NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2C=CC(O)=CC=2)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(C)NC(=O)C(CCC(O)=O)NC(=O)C(C(C)C)NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(CC=2NC=NC=2)NC(=O)C(CO)NC(=O)CNC2=O)C(=O)NCC(=O)NC(CCC(O)=O)C(=O)NC(CCCNC(N)=N)C(=O)NCC(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC=CC=3)C(=O)NC(CC=3C=CC(O)=CC=3)C(=O)NC(C(C)O)C(=O)N3C(CCC3)C(=O)NC(CCCCN)C(=O)NC(C)C(O)=O)C(=O)NC(CC(N)=O)C(O)=O)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C(CO)NC(=O)C(C(C)O)NC(=O)C1CSSCC2NC(=O)C(CC(C)C)NC(=O)C(NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(NC(=O)C(N)CC=1C=CC=CC=1)C(C)C)CC1=CN=CN1 NOESYZHRGYRDHS-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000000968 intestinal effect Effects 0.000 description 2
- 210000004185 liver Anatomy 0.000 description 2
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 2
- 230000012976 mRNA stabilization Effects 0.000 description 2
- 239000000693 micelle Substances 0.000 description 2
- 230000003228 microsomal effect Effects 0.000 description 2
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 2
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 2
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 2
- 229920001220 nitrocellulos Polymers 0.000 description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 2
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 description 2
- 239000002243 precursor Substances 0.000 description 2
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 2
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 2
- 238000001243 protein synthesis Methods 0.000 description 2
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 2
- 210000002955 secretory cell Anatomy 0.000 description 2
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 2
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 2
- ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N spermidine Chemical compound NCCCCNCCCN ATHGHQPFGPMSJY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000001356 surgical procedure Methods 0.000 description 2
- 239000000725 suspension Substances 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 230000002103 transcriptional effect Effects 0.000 description 2
- 235000021249 α-casein Nutrition 0.000 description 2
- KBDDIZRDKLGWGW-UHFFFAOYSA-N 3-[4-(3-aminopropylamino)butylamino]propylazanium;chloride Chemical compound [Cl-].NCCCNCCCCNCCC[NH3+] KBDDIZRDKLGWGW-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 208000030507 AIDS Diseases 0.000 description 1
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M Acetate Chemical compound CC([O-])=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 229920001817 Agar Polymers 0.000 description 1
- 244000153158 Ammi visnaga Species 0.000 description 1
- 235000010585 Ammi visnaga Nutrition 0.000 description 1
- 108010039209 Blood Coagulation Factors Proteins 0.000 description 1
- 102000015081 Blood Coagulation Factors Human genes 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 235000011293 Brassica napus Nutrition 0.000 description 1
- 240000008100 Brassica rapa Species 0.000 description 1
- 235000000540 Brassica rapa subsp rapa Nutrition 0.000 description 1
- OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N Calcium Chemical compound [Ca] OYPRJOBELJOOCE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 240000001432 Calendula officinalis Species 0.000 description 1
- 235000005881 Calendula officinalis Nutrition 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 1
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 1
- 102000016911 Deoxyribonucleases Human genes 0.000 description 1
- 108010053770 Deoxyribonucleases Proteins 0.000 description 1
- 229920004511 Dow Corning® 200 Fluid Polymers 0.000 description 1
- 241001076388 Fimbria Species 0.000 description 1
- 102000012673 Follicle Stimulating Hormone Human genes 0.000 description 1
- 108010079345 Follicle Stimulating Hormone Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 108090001061 Insulin Proteins 0.000 description 1
- 102000004877 Insulin Human genes 0.000 description 1
- GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N Lactose Natural products OC[C@H]1O[C@@H](O[C@H]2[C@H](O)[C@@H](O)C(O)O[C@@H]2CO)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O GUBGYTABKSRVRQ-QKKXKWKRSA-N 0.000 description 1
- 235000019687 Lamb Nutrition 0.000 description 1
- 125000001429 N-terminal alpha-amino-acid group Chemical group 0.000 description 1
- 239000004677 Nylon Substances 0.000 description 1
- 102400000050 Oxytocin Human genes 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N Oxytocin Natural products N1C(=O)C(N)CSSCC(C(=O)N2C(CCC2)C(=O)NC(CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)NC(=O)C(CC(N)=O)NC(=O)C(CCC(N)=O)NC(=O)C(C(C)CC)NC(=O)C1CC1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 101800000989 Oxytocin Proteins 0.000 description 1
- 108020002230 Pancreatic Ribonuclease Proteins 0.000 description 1
- 102000005891 Pancreatic ribonuclease Human genes 0.000 description 1
- 201000007131 Placental site trophoblastic tumor Diseases 0.000 description 1
- 108010001014 Plasminogen Activators Proteins 0.000 description 1
- 102000001938 Plasminogen Activators Human genes 0.000 description 1
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 description 1
- 229920001213 Polysorbate 20 Polymers 0.000 description 1
- 206010037660 Pyrexia Diseases 0.000 description 1
- 101150014221 Son gene Proteins 0.000 description 1
- 241000282887 Suidae Species 0.000 description 1
- 206010042573 Superovulation Diseases 0.000 description 1
- IUJDSEJGGMCXSG-UHFFFAOYSA-N Thiopental Chemical compound CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC(=S)NC1=O IUJDSEJGGMCXSG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108700019146 Transgenes Proteins 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008272 agar Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N alpha-D-galactose Chemical compound OC[C@H]1O[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-PHYPRBDBSA-N 0.000 description 1
- 210000004102 animal cell Anatomy 0.000 description 1
- 239000003242 anti bacterial agent Substances 0.000 description 1
- 229940088710 antibiotic agent Drugs 0.000 description 1
- 230000000890 antigenic effect Effects 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N atomic oxygen Chemical compound [O] QVGXLLKOCUKJST-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 210000003719 b-lymphocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- WHRVRSCEWKLAHX-LQDWTQKMSA-N benzylpenicillin procaine Chemical compound [H+].CCN(CC)CCOC(=O)C1=CC=C(N)C=C1.N([C@H]1[C@H]2SC([C@@H](N2C1=O)C([O-])=O)(C)C)C(=O)CC1=CC=CC=C1 WHRVRSCEWKLAHX-LQDWTQKMSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000012620 biological material Substances 0.000 description 1
- 239000003114 blood coagulation factor Substances 0.000 description 1
- 239000005388 borosilicate glass Substances 0.000 description 1
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 1
- 239000011575 calcium Substances 0.000 description 1
- 229910052791 calcium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 230000008859 change Effects 0.000 description 1
- 239000013611 chromosomal DNA Substances 0.000 description 1
- 230000002759 chromosomal effect Effects 0.000 description 1
- 230000001112 coagulating effect Effects 0.000 description 1
- 239000012141 concentrate Substances 0.000 description 1
- 230000007850 degeneration Effects 0.000 description 1
- 238000005238 degreasing Methods 0.000 description 1
- 238000000326 densiometry Methods 0.000 description 1
- 238000013461 design Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I dipotassium trisodium dihydrogen phosphate hydrogen phosphate dichloride Chemical compound P(=O)(O)(O)[O-].[K+].P(=O)(O)([O-])[O-].[Na+].[Na+].[Cl-].[K+].[Cl-].[Na+] LOKCTEFSRHRXRJ-UHFFFAOYSA-I 0.000 description 1
- 238000009826 distribution Methods 0.000 description 1
- 238000011143 downstream manufacturing Methods 0.000 description 1
- 210000002472 endoplasmic reticulum Anatomy 0.000 description 1
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 1
- ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N ethidium bromide Chemical compound [Br-].C12=CC(N)=CC=C2C2=CC=C(N)C=C2[N+](CC)=C1C1=CC=CC=C1 ZMMJGEGLRURXTF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960005542 ethidium bromide Drugs 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 1
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 1
- 230000035558 fertility Effects 0.000 description 1
- 239000012894 fetal calf serum Substances 0.000 description 1
- 210000002950 fibroblast Anatomy 0.000 description 1
- 229940028334 follicle stimulating hormone Drugs 0.000 description 1
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 1
- 229930182830 galactose Natural products 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000000291 glutamic acid group Chemical group N[C@@H](CCC(O)=O)C(=O)* 0.000 description 1
- 239000008187 granular material Substances 0.000 description 1
- 239000004519 grease Substances 0.000 description 1
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 1
- 208000006454 hepatitis Diseases 0.000 description 1
- 231100000283 hepatitis Toxicity 0.000 description 1
- 238000009776 industrial production Methods 0.000 description 1
- 238000013383 initial experiment Methods 0.000 description 1
- 238000007689 inspection Methods 0.000 description 1
- 229940125396 insulin Drugs 0.000 description 1
- 239000007927 intramuscular injection Substances 0.000 description 1
- 238000010255 intramuscular injection Methods 0.000 description 1
- 239000007928 intraperitoneal injection Substances 0.000 description 1
- 238000010253 intravenous injection Methods 0.000 description 1
- 238000002955 isolation Methods 0.000 description 1
- 239000008101 lactose Substances 0.000 description 1
- 210000000265 leukocyte Anatomy 0.000 description 1
- 230000007246 mechanism Effects 0.000 description 1
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 1
- 239000001272 nitrous oxide Substances 0.000 description 1
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 1
- 229920001778 nylon Polymers 0.000 description 1
- 210000000056 organ Anatomy 0.000 description 1
- 239000001301 oxygen Substances 0.000 description 1
- 229910052760 oxygen Inorganic materials 0.000 description 1
- XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N oxytocin Chemical compound C([C@H]1C(=O)N[C@H](C(N[C@@H](CCC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CC(N)=O)C(=O)N[C@@H](CSSC[C@H](N)C(=O)N1)C(=O)N1[C@@H](CCC1)C(=O)N[C@@H](CC(C)C)C(=O)NCC(N)=O)=O)[C@@H](C)CC)C1=CC=C(O)C=C1 XNOPRXBHLZRZKH-DSZYJQQASA-N 0.000 description 1
- 229960001723 oxytocin Drugs 0.000 description 1
- 238000012856 packing Methods 0.000 description 1
- 230000007170 pathology Effects 0.000 description 1
- 230000037361 pathway Effects 0.000 description 1
- 239000008188 pellet Substances 0.000 description 1
- 238000002205 phenol-chloroform extraction Methods 0.000 description 1
- 239000002953 phosphate buffered saline Substances 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 229940127126 plasminogen activator Drugs 0.000 description 1
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 1
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 1
- 230000008488 polyadenylation Effects 0.000 description 1
- 239000000256 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Substances 0.000 description 1
- 235000010486 polyoxyethylene sorbitan monolaurate Nutrition 0.000 description 1
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 description 1
- 238000001556 precipitation Methods 0.000 description 1
- 230000008569 process Effects 0.000 description 1
- 230000008707 rearrangement Effects 0.000 description 1
- 210000005000 reproductive tract Anatomy 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 230000035945 sensitivity Effects 0.000 description 1
- 238000012163 sequencing technique Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 241000894007 species Species 0.000 description 1
- 229940063673 spermidine Drugs 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 1
- 230000008961 swelling Effects 0.000 description 1
- 230000001360 synchronised effect Effects 0.000 description 1
- MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N tetradifon Chemical compound C1=CC(Cl)=CC=C1S(=O)(=O)C1=CC(Cl)=C(Cl)C=C1Cl MLGCXEBRWGEOQX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M thiopental sodium Chemical compound [Na+].CCCC(C)C1(CC)C(=O)NC([S-])=NC1=O AWLILQARPMWUHA-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 238000004448 titration Methods 0.000 description 1
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 1
- 230000001131 transforming effect Effects 0.000 description 1
- 230000007723 transport mechanism Effects 0.000 description 1
- YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N trichloroacetic acid Chemical compound OC(=O)C(Cl)(Cl)Cl YNJBWRMUSHSURL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002604 ultrasonography Methods 0.000 description 1
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 description 1
- 210000004291 uterus Anatomy 0.000 description 1
- 210000003462 vein Anatomy 0.000 description 1
- 230000035899 viability Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/8509—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells for producing genetically modified animals, e.g. transgenic
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K67/00—Rearing or breeding animals, not otherwise provided for; New or modified breeds of animals
- A01K67/027—New or modified breeds of vertebrates
- A01K67/0275—Genetically modified vertebrates, e.g. transgenic
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/87—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation
- C12N15/89—Introduction of foreign genetic material using processes not otherwise provided for, e.g. co-transformation using microinjection
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
- C12N9/14—Hydrolases (3)
- C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
- C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
- C12N9/64—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue
- C12N9/6421—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from animal tissue from mammals
- C12N9/6424—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12N9/644—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Y—ENZYMES
- C12Y304/00—Hydrolases acting on peptide bonds, i.e. peptidases (3.4)
- C12Y304/21—Serine endopeptidases (3.4.21)
- C12Y304/21022—Coagulation factor IXa (3.4.21.22)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2207/00—Modified animals
- A01K2207/15—Humanized animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2217/00—Genetically modified animals
- A01K2217/05—Animals comprising random inserted nucleic acids (transgenic)
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/103—Ovine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2227/00—Animals characterised by species
- A01K2227/10—Mammal
- A01K2227/105—Murine
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A01—AGRICULTURE; FORESTRY; ANIMAL HUSBANDRY; HUNTING; TRAPPING; FISHING
- A01K—ANIMAL HUSBANDRY; AVICULTURE; APICULTURE; PISCICULTURE; FISHING; REARING OR BREEDING ANIMALS, NOT OTHERWISE PROVIDED FOR; NEW BREEDS OF ANIMALS
- A01K2267/00—Animals characterised by purpose
- A01K2267/01—Animal expressing industrially exogenous proteins
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2830/00—Vector systems having a special element relevant for transcription
- C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Environmental Sciences (AREA)
- Biodiversity & Conservation Biology (AREA)
- Animal Husbandry (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Peptides Or Proteins (AREA)
- Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Coloring Foods And Improving Nutritive Qualities (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
Использование: биотехнология, медицина. Сущность изобретения: конструируют рекомбинантную плазмиду psstgxs-Targ, содержащую последовательность ДНК, которая кодирует овечий β - лактоглобулин, слитый либо с фактором IX, либо с a1 - антитрипсином, из полученной плазмиды изолируют фрагмент, включающий по крайней мере регуляторную и секреторную сигнальную последовательности гена β\ -лактоглобулина, слитую с последовательностью гена целевого белка, вводят его в оплодотворенную яйцеклетку или эмбрион овцы, трансплантируют полученную яйцеклетку или эмбрион в реципиентных овцематок и затем отбирают трансгенных животных. 9 ил., 3 табл.
Description
Изобретение относится к способу получения слитого полипептида. Более конкретно, изобретение относится к получению белка и к получению биологического материала, чье образование катализируется ферментивными белками.
Для получения важных в промышленном отношении биологических продуктов в последние десять лет во все больших масштабах используются методы биотехнологии. В этой связи осуществлено клонирование ДНК-последовательностей, кодирующих важные с точки зрения медицины белки человека. В число таких белков входят инсулин, активатор плазминогена, альфа1-антитрипсин и факторы коагуляции VIII и IX. В настоящее время, даже при постоянно появляющихся новых методах биотехнологии, такие белки, как правило, выделяемые из крови и тканей с использованием дорогостоящих и требующих больших затрат времени способов, могут привести к риску занесения инфекционных агентов, например, таких, которые вызывают СПИД или гепатит.
Несмотря на то, что экспрессия ДНК-последовательностей в бактериях с целью получения целевых важных в медицинском отношении белков выглядит весьма привлекательно, на практике бактерии часто оказываются неудовлетворительными в роли хозяев, поскольку в бактериальной клетке посторонние белки неустойчивы и не процессируются соответствующим образом.
С пониманием данной проблемы связаны попытки экспрессии клонированных генов в культуре тканей млекопитающих, которые в некоторых случаях доказали свою жизнеспособность. Однако широкомасштабная ферментация клеток животного является дорогостоящим и требующим широкого технологического обеспечения процессом.
Таким образом, существует необходимость в высокопродуктивном дешевом способе получения биологических веществ, таких как необходимым образом модифицированные эукариотные полипептиды. Отсутствие инфекционных для человека агентов будет служить преимуществом такого способа.
Согласно первому аспекту изобретения предложен способ получения трансгенной овцы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, кодирующей слитый белок, выделение фрагмента SalI XbaI плазмиды PSST tg XS или PSSI tg XS FIX, кодирующего овечий бета лактоглобулин, слитый с фактором IX или антитрипсин, введение полученного фрагмента ДНК в яйцо или эмбрион овцы в результате микроинъекции, трансплантацию яйца или эмбриона в рецинистных овцематок с последующим отбором трансгенных овцематок.
α Антитрипсин или фактор IX может быть полипептидом или модифицированным полипептидом (например, гликозилированным), или же полипептид может быть сшит путем посттрансляционной модификации полипептида.
Изобретение может быть использовано, к примеру, для получения a1 - антитрипсина или фактора IX.
Получаемые настоящим изобретением ферменты могут оказаться способны действовать на продуцирующие их субстраты in vitro в молочной железе, т.е. на получение вещества, являющегося продуктом реакции фермента. Продукт реакции, как правило, может быть выделен из молока взрослой женской особи млекопитающего.
ДНК-последовательность, кодирующую α1 -антитрипсин фактор IX ("представляющая интерес ДНК-последовательность") вводят in vitro в ген белка сыворотки молока, способный экспрессироваться в молочной железе взрослой женской особи млекопитающего с образованием гена слияния, который вводят в зародышевую линию путем инъекции в оплодотворенное яйцо млекопитающего, после чего оплодотворенное инъецированное яйцо трансплантируют во взрослую женскую особь млекопитающего. Следует ожидать, что не все оплодотворенные инъецированные яйца разовьются во взрослые женские особи, экспрессирующие представляющую интерес ДНК-последовательность. Помимо всего прочего примерно половина животных будет мужского пола, от которых женские особи могут быть получены в следующих поколениях.
Приемлемые методики, в которых чужеродные ДНК-последовательности вводят в зародышевую линию млекопитающего, апробированы на мышах. В настоящее время наиболее эффективный подход заключается в прямом микроинъецировании нескольких сот линейных молекул ДНК в проядро оплодотворенного одноклеточного яйца, и такой путь является предпочтительным методом настоящего изобретения. Микроинъецированные яйца могут быть затем перенесены в яйцеводы псевдобеременных приемных матерей для дальнейшего развития. В работе сообщается, что около 25% развивающихся мышей наследуют одну или несколько копий микроинъектированной ДНК [1] Известен способ получения трансгенной овцы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, выделение слитого гена из полученной ДНК, инъекцию слитого гена в яйцо эмбрион овцы, пересадку эмбрионов реципиентным овцематкам с последующим отбором трансгенной овцы [2]
После внедрения в зародышевую линию чужеродная ДНК может быть экспрессирована на высоком уровне в выбранной ткани с образованием функционального белка, который может быть извлечен из животного. Для этого ДНК-последовательность, кодирующая представляющий интерес пептид, как правило, сливается с ДНК-последовательностью или последовательностями, обеспечивающими ее экспрессию в соответствующей ткани. Хотя отдельные начальные опыты на мышах показывают, что специфическая экспрессия внедренной ДНК в тканях до некоторой степени изменчива [3] существующее в настоящее время общее мнение заключается в том, что нужная специфическая экспрессия большинства трансфекированных генов достижима [4-7] Для необходимой тканевой специфичности, видимо, важно удалить все прокариотные векторные последовательности, используемые в клонировании представляющей интерес ДНК-последовательности, перед микроинъецированием.
После внедрения в зародышевую линию чужеродная ДНК может быть экспрессирована на высоком уровне в выбранной ткани с образованием функционального белка, который может быть извлечен из животного. Для этого ДНК-последовательность, кодирующая представляющий интерес пептид, как правило, сливается с ДНК-последовательностью или последовательностями, обеспечивающими ее экспрессию в соответствующей ткани. Хотя отдельные начальные опыты на мышах показывают, что специфическая экспрессия внедренной ДНК в тканях до некоторой степени изменчива [3] существующее в настоящее время общее мнение заключается в том, что нужная специфическая экспрессия большинства трансфекированных генов достижима [4-7] Для необходимой тканевой специфичности, видимо, важно удалить все прокариотные векторные последовательности, используемые в клонировании представляющей интерес ДНК-последовательности, перед микроинъецированием.
Несмотря на то, что приведенные публикации и указывают на некоторые различные ткани, которые могут быть выбраны в качестве мишеней для создания трансгенного животного, ни в одной из них не предполагается возможность использования какой-то конкретной ткани для промышленного получения содержащих полипептид веществ. В работах также не предполагается возможность использования конкретного гена, экспрессируемого в данной ткани, и который мог бы служить для направленной экспрессии внедренной ДНК.
В связи со слитым полипептидом и тканью, в которой он будет экспрессироваться, следует учесть целый ряд факторов. Многие белки для проявления ими полной биологической активности требуют интенсивной посттрансляционной модификации. Например, фактор IX для проявления биологической активности требует гамма-карбоксилирования специфических участков остатков глутаминовой кислоты. Печень, являющаяся местом синтеза фактора IX в природе, избирательно выдает именно эту модификацию. Фибробласты также способны осуществлять гамма-карбоксилирование, хотя и не столь эффективно [10] Однако некоторые белки могут быть нужным образом модифицированы, только если их синтез осуществляется в специфических тканях, и в некоторых случаях может оказаться необходимым связать место экспрессии с требованиями, предъявляемыми к получаемому белку. Полагают, что использование молочной железы в качестве ткани для экспрессии позволяет преодолеть либо полностью, либо до удовлетворительного предела эти затруднения.
Предпочтителен сбор целевого продукта из биологических жидкостей, а не твердых тканей, поскольку в этом случае этот источник в большей степени возобновляем, и кроме того, большая часть представляющих биомедицинскую ценность белков сами по себе секретируются в биологические жидкости. Возможным путем является секреция в кровеносный поток из печени или B-лимфоцитов, однако коагулирующие свойства крови и присутствие в ней биологически активных пептидов, также как и антигенных молекул может создать затруднения при последующем нисходящем процессинге.
В соответствии с настоящим изобретением эти трудности могут быть преодолены с использованием в качестве ткани для экспрессии молочной железы. Молоко легко собирать, образуется оно в больших количествах и хорошо характеризуется биохимически. Кроме того, большая часть молочных белков присутствует в молоке в высоких концентрациях (от примерно 1 до 15 г/л).
Для овец интервал молочной продуктивности составляет 1-3 л в день в зависимости от породы. Следует отметить, что промышленностью освоен выпуск специального оборудования для дойки овец и, разумеется, для дойки крупного рогатого скота. Таким образом, выбранными животными стали овцы, в частности выращиваемые на фермах овцы, такие как Восточно-Фризляндской породы. В качестве вполне возможной альтернативы может рассматриваться линия, полученная скрещиванием подходящей высокопродуктивной молочной породы овец с черноголовыми овцами.
Лактирующие молочные железы представляют собой высоко специализированный орган, состоящий из разветвленной системы каналов, осушающих сложные дольки секреторных клеток. Молочные клетки самым разным образом приспособлены к высокому уровню секреции. Например, эти клетки обладают специализированным транспортным механизмом, обеспечивающим эффективный прием предшественников из крови, и интенсивной системой межклеточных мембран (грубая эндоплазмическая сетка, аппарат Гольджи и т.п.), позволяющих эффективно проводить синтез белка, его посттрансляционное модифицирование и вынос из клеток.
Молочные железы зависят от гормонов на всем протяжении их роста и функционирования. Действующие на молочные железы гормоны вызывают в них в период беременности и лактации поразительные изменения. Например, у овцематок их действие приводит к почти к двукратному увеличению общего числа клеток, а также к изменению соотношения между различными типами клеток и к конечному дифференцированию секреторных клеток.
Молочная железа секретирует в молоко ряд различных белков. Существуют качественные и количественные различия состава молока различных видов животных, хотя общее отличие может быть сделано между казеинами и растворимыми /сыворотка/ белками [13] У основных жвачных животных к белкам сыворотки, которые синтезируются молочной железой, принадлежат альфа-лактаальбумин и бета-лактоглобулин.
Существует три основных типа казеина. Это альфа-казеин, бета-казеин и каппа-казеин, и они присутствуют в молоке большей части рассматриваемых видов животных. Их роль в молоке заключается в изоляции кальция, с которым они агрегируются в виде мицелл. Роль бета-лактоглобулина основного белка сыворотки жвачных неизвестна, хотя он, видимо, взаимодействует с каппа-казеином. Альфа-лактоальбумин является существенным кофактором превращения глюкозы и галактозы в лактозу. В табл. 1 приведен белковый состав молока различных животных.
По большей части считают, что различные молочные белки кодируются одной копией [16] Гены казеина, видимо, связаны с мышами [18] и коровами. Поскольку гены казеина, видимо, экспрессируются в молоке на гораздо более высоком уровне по сравнению с генами белка сыворотки, вполне естественно выбрать гены казеина для введения чужеродной ДНК с целью ее экспрессии. Однако в настоящем изобретении реализуется введение ДНК-последовательности, кодирующей представляющий интерес пептид, в ген, кодирующий белок сыворотки.
Ген альфа-лактоальбумина крыс состоит из четырех экзонов и находится в хромосомной ДНК размером 2,5 кb [19] Ген коровьего альфа-лактоальбумина, видимо, организован аналогично. В настоящее время установлено, что ген овечьего бета-лактоглобулина наиболее вероятно имеет одну копию, состоит из семи экзонов в пределах транскрипционного звена в 4,9 kb, и именно этот ген рекомендуется использовать в настоящем изобретении.
Изменения в уровнях молочного белка (мРНК) в ходе развития молочной железы у крыс [20] у кроликов [21] и мышей [22] выявлены с использованием как трансляции in vitro, так и гибридизации кДНК. Молочная железа аккумулирует где-то около 80000-100000 молекул мРНК, специфичных для белка молока, образовавшихся в результате действия согласованного механизма, включающего как синтез на высоком уровне молочного белка мРНК, так и эффективную стабилизацию этих молекул. Существуют, однако, и исключения. Для овцематок бета-казеин составляет до 45% всего молочного белка, но только 17% клонов кДНК, выделенных из библиотеки кДНК, соответствуют этому гену [25] У кроличьих количество альфа-лактоальбумина, собранного в микросомных пузырьках, значительно меньше, чем можно было бы ожидать на основании скорости синтеза белка в отсутствие микросомных пузырьков, возможно вследствие того, что сигнальный пептид не обладает оптимальной конфигурацией [26] Первичные продукты трансляции многих генов молочного белка подвергаются интенсивной модификации. Например, альфа-лактоальбумин N-гликозилируется, каппа-казеин O-гликозилируется, альфа- и бета-казеин O-фосфорилируется. Кроме того, свою роль в посттрансляционной модификации выполняет и комплекс Гольджи, осуществляя конденсацию и упаковку казеинов в мицеллы. Существует вероятность того, что казеины и белки сыворотки выводятся из клетки различными путями. В этом смысле интересно отметить, что как при между-, так и при внутриспецифическом сравнении сигнальный пептид казеина (в сравнении с большей частью молекулы) в высшей степени консервативен и, следовательно, этот пептид может играть роль в выделении предшественника пептида в правильном направлении [24]
Как указано выше, гены молочного белка в изобилии экспрессируются в лактирующей молочной железе. Для овцематки, например, мРНК альфаSI-казеина составляет примерно 30% и мДНК бета-лактоглобулина составляет примерно 5% полиА+РНК [25] Допустим, что эти транскрипты происходят из единичных копий генов, приведенные концентрации в этом случае указывают на высокую скорость транскрипции и эффективную стабилизацию мРНК [27] Специфическая стабилизация мРНК может быть передана через последовательности, присутствующие в зрелой мРНК. В рекомендуемых вариантах настоящего изобретения могут быть достигнуты одинаковые уровни экспрессии ДНК-последовательности, вводимой в зародышевую линию овцы. Это достигается ее лигированием с ДНК-последовательностями, связанными с геном белка молочной сыворотки, придающего высокие значения специфичной для тканей экспрессии и стабилизации мРНК, для этих целей рекомендуется ген бета-лактоглобулина.
Как указано выше, гены молочного белка в изобилии экспрессируются в лактирующей молочной железе. Для овцематки, например, мРНК альфаSI-казеина составляет примерно 30% и мДНК бета-лактоглобулина составляет примерно 5% полиА+РНК [25] Допустим, что эти транскрипты происходят из единичных копий генов, приведенные концентрации в этом случае указывают на высокую скорость транскрипции и эффективную стабилизацию мРНК [27] Специфическая стабилизация мРНК может быть передана через последовательности, присутствующие в зрелой мРНК. В рекомендуемых вариантах настоящего изобретения могут быть достигнуты одинаковые уровни экспрессии ДНК-последовательности, вводимой в зародышевую линию овцы. Это достигается ее лигированием с ДНК-последовательностями, связанными с геном белка молочной сыворотки, придающего высокие значения специфичной для тканей экспрессии и стабилизации мРНК, для этих целей рекомендуется ген бета-лактоглобулина.
Перенос новых генов, осуществляемый на мышах, является в настоящее время обычным способом. У трансгенных мышей, показывающих высокие значения специфичной для тканей экспрессии чужеродного гена, экзогенная ДНК включает не только структурный ген, но также 5'- и 3'-фланкирующие последовательности. Несмотря на то, что существуют многочисленные факты, подтверждающие, что многие важные регулирующие элементы расположены в интервале с 5' до сар сайта мРНК [28-31] а также очевидно, что важные регулирующие последовательности, в частности последовательности, определяющие специфичную для тканей экспрессию, могут быть расположены в пределах структурного гена или даже в интервале с 3' до этого гена [32-33] Более того, экзонные последовательности (т. е. последовательности зрелой мРНК) могут содержать последовательности, определяющие стабильность мРНК. В табл. 2 показаны некоторые детали специфичной для ткани экспрессии чужеродного гена у мышей.
Именно по той причине (о чем сказано выше), вышеуказанные гены слияния будут использованы для направления экспрессии ДНК-последовательности, кодирующей представляющий интерес пептид, эти гены включают один или более промотр, старт-сайт для транскрипции, одну или более /предположительно/ дистальных 5' регулирующих последовательностей гена молочного белка, 3' последовательности, фланкирующие ген молочного белка. Наиболее рекомендуемый ген слияния включает последовательности всех указанных типов.
Выбранный ген слияния состоит из кДНК, кодирующей представляющий интерес пептид, внедренный в первый экзон гена белка молочной сыворотки. Рекомендуется, чтобы несколько кb 5' фланкирующих последовательностей гена молочного белка были включены в такой ген слияния. В таких конструкциях секреция представляющего интерес пептида предпочтительно будет обеспечиваться его собственным сигнальным пептидом, вследствие чего рекомендуется, чтобы ген слияния включал сигнальный пептид для представляющего интерес пептида. Однако специфичный по отношению к ткани сигнальный пептид может оказаться важным и для направления предшественника пептида на правильный секреторный путь (о чем речь шла выше). Таким образом, особенно рекомендуется, чтобы кодирующие сигнальный пептид белка сыворотки ДНК-последовательности были точнейшим образом сцеплены с ДНК-последовательностями вставки, кодирующими N-концевые аминокислоты зрелого белка. 3'-конец места вставки предпочтительно обрывается после его стоп-кодона, но перед его собственным сайтом расщепления при трансляции и полиаденилирования. В нисходящем направлении от сайта вставки остальная часть структурного гена, как правило, сохраняется, так же как и отдельные 3' фланкирующие последовательности.
У трансгенных животных такая конструкция будет максимально увеличивать уровень специфичной для молочной железы экспрессии. Необходимо, чтобы первичный транскрипт был правильно полиаденилирован и подвергнут сплайсингу в сохранившихся сайтах гена белка молочной сыворотки. Необходимо, чтобы зрелая мРНК имела последовательности для эффективной стабилизации. Необходимо, чтобы в конструкциях, использующих сигнальный пептид гена молока, зрелая мРНК была транслирована с образованием предшественника полипептида слияния, в котором сигнальный пептид, происходящий из гена молочного белка, эффективно направляет секрецию зрелого пептида, закодированного внедренной кДНК.
Как было указано выше, бета-лактоглобулин овцы является выбранным геном молочной сыворотки, который "нагружают" кДНК, кодирующей представляющий интерес пептид. У овец бета-лактоглобулин является наиболее изобильно экспрессируемым в молочной железе белком сыворотки, и его мРНК составляет примерно 8% всей полиА+РНК. Этот ген в достаточной степени охарактеризован и был использован для создания конструкций с кДНК-последовательностями, кодирующими фактор IX человека и альфаI-антитрипсин человека.
На фиг. 1-4 схематично показаны основные стадии создания гена сцепления бета-лактоглобулина способом настоящего изобретения; на фиг.5 - блоттинг-анализ по Саузерну ДНК овцы; на фиг.6 блоттинг-анализ по Саузерну ДНК и наследуемость гена сцепления путем реальной генерации; на фиг.7 анализ белка сыворотки молока мышей и овец с помощью НДС-ПАГЭ; на фиг.8 - Вестерн-блоттинг белков мышей и овец; на фиг.9 P и А молока, полученного от трансгенной овцематки, несущей описанный ген сцепления бета-лактоглобулина.
Пример 1.
А. Методика с рекомбинантной ДНК
Если нет специальных указаний, использованы методики с рекомбинантной ДНК [34-35] Если не указано особо, то все химикаты фирмы были BDH Chemical Ltd, Пул, Дорсет, Англия или фирмы Sigma Chemical Company, Пул, Дорсет, Англия.
Если нет специальных указаний, использованы методики с рекомбинантной ДНК [34-35] Если не указано особо, то все химикаты фирмы были BDH Chemical Ltd, Пул, Дорсет, Англия или фирмы Sigma Chemical Company, Пул, Дорсет, Англия.
Конструкция гена сцепления бета-лактоглобулина овцы
Получение ДНК из селезенки овцы
Из только что убитой овцы черноголовой суффольской породы получают ткани селезенки, из которых выделяют ядра [36] Ядерные шарики лизируют в 0,3 М растворе NaCl, 10мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТК, 1% НДС /pH 7,4/ и 400 мкг/мл протеиназы К /Sigma Co. Fancy Road, Пул, Дорсет ВН17 711Н/ и инкубируют 2 ч при 37oC. Проводят непрерывную экстракцию смесью фенола с хлороформом до полной депротеинизации препарата. ДНК осаждают этанолом и сматывают с помощью стеклянной палочки, промывают 70% EtОН-30% ТЭ /ТЭ 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТК, pH 8/, высушивают на воздухе и вновь суспендируют в ТЭ до концентрации 1 мг/мл.
Получение ДНК из селезенки овцы
Из только что убитой овцы черноголовой суффольской породы получают ткани селезенки, из которых выделяют ядра [36] Ядерные шарики лизируют в 0,3 М растворе NaCl, 10мМ трис-HCl, 10 мМ ЭДТК, 1% НДС /pH 7,4/ и 400 мкг/мл протеиназы К /Sigma Co. Fancy Road, Пул, Дорсет ВН17 711Н/ и инкубируют 2 ч при 37oC. Проводят непрерывную экстракцию смесью фенола с хлороформом до полной депротеинизации препарата. ДНК осаждают этанолом и сматывают с помощью стеклянной палочки, промывают 70% EtОН-30% ТЭ /ТЭ 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТК, pH 8/, высушивают на воздухе и вновь суспендируют в ТЭ до концентрации 1 мг/мл.
Конструкция лямбда-гена сцепления ДНК селезенки овцы
Для построения геномной библиотеки используют лямбда-фаг ЕМВ13 30 мкг ДНК бактериофага /обрабатывают 5-кратным избытком ферментов рестрикции EсоRI и Bam HI /представлены Amersham и Intgernational pIc, Линкольн Плайс, Грийн Энд, Олесбери, Букингемпшир, Англия/ в условиях рекомендованных изготовителем. После обработки добавляют хлоргидрат спермина до концентрации 5мМ с целью осаждения лямбда-ДНК. После инкубирования на льду в течение часа ДНК превращают в шарики при 10,000g в течение 15 мин с помощью ступенчатой микроцентрифуги, промывают в 70% EtOH, 300 мМ NaAc, 100 mM MgCl2, снова превращают в шарики и, наконец, вновь суспендируют в ТЭ до концентрации 1 мг/мл.
Для построения геномной библиотеки используют лямбда-фаг ЕМВ13 30 мкг ДНК бактериофага /обрабатывают 5-кратным избытком ферментов рестрикции EсоRI и Bam HI /представлены Amersham и Intgernational pIc, Линкольн Плайс, Грийн Энд, Олесбери, Букингемпшир, Англия/ в условиях рекомендованных изготовителем. После обработки добавляют хлоргидрат спермина до концентрации 5мМ с целью осаждения лямбда-ДНК. После инкубирования на льду в течение часа ДНК превращают в шарики при 10,000g в течение 15 мин с помощью ступенчатой микроцентрифуги, промывают в 70% EtOH, 300 мМ NaAc, 100 mM MgCl2, снова превращают в шарики и, наконец, вновь суспендируют в ТЭ до концентрации 1 мг/мл.
ДНК овцы частично обрабатывают с помощью фермента рестрикции Sau3A /Amersham/. Аликвоты по 100 мкг ДНК овцы гидролизуют различными количествами Sau3A /от 5-40 единиц/ в течение 20 мин при 37oC. Реакции прекращают добавлением ЭДТК до концентрации 15 мМ. Степень рестрикции выявляют с помощью электрофореза на 0,6% агарозном геле. Надлежащим образом гидролизованные образцы объединяют и наносят на 38 мл 10-40% градиента сахарозы, приготовленного в IM NaCl, 20 mM трис-HCl, 5 мМ ЭДТК при pH 8. Такие градиенты центрифугируют 24 ч при скорости 26000 об/мин на роторе Beckman SW28. Градиенты сахарозы фракционируют сверху с отбором фракций по 1 мл. Распределение молекул ДНК по размерам в каждой фракции выявляют с помощью электрофореза на агарозном геле, фракции, содержащие молекулы ДНК размером в 14-21 кb, объединяют. После двукратного разбавления в ТЭ добавляют 2 объема EtOH и в течение суток при -20oC осаждают ДНК. После этого ДНК вновь суспендируют в ТЭ до концентрации 300 мкг/мл.
Обработанную BamHI-ECORI фракцию ЕМВ13 в 7,5 мкг и 2,5 мкг ДНК из селезенки овцы, частично обработанные Sau3A, смешивают в 50 мкл раствора, содержащего 60 мМ трис-HCl, 6 мM MgCl2, 10 мМ ДДТ, 0,01% желатина, 0,25 мМ рАТФ и 25 единиц Т4ДНК-лигазы /Boehringer Company, Boehringer Mannheim Haise Белл Лейн, Лийвес, Ист Сассекс/ и инкубируют при 14oC в течение суток.
После лигации аликвоты по 1 мкг ДНК упаковывают с помощью прибора фирмы Amersham согласно методике, рекомендованной изготовителем. Упакованную библиотеку титруют на штамме E.coli ED 8654. Установленный размер библиотеки составляет 5,7х106 образующих бляшки единиц /о.б.е./. Сразу же после титрования аликвоты неамплифицированной библиотеки наносят на чашечки Петри размером 10х22 см2 /мегапластинки/ при использовании штамма E.coli ED 8654 при плотности примерно 50000 о.б.е. на пластинку.
Отбор геномномной лямбды-библиотеки.
На мембраны из нитроцеллюлозы в 20 см2 осуществляют перенос с мегапластин вышеполученные бляшки. Клон кДНК бета-лактоглобулина /р931/ никтранслируют с помощью 32P дЦТФ до удельной активности > 108 dpm/мкг [39] кДНК бета-лактоглобулина была клонирована [40] Заключительную промывку проводят 1хSET/SET 0,15 мМ NaCl, 2 мМ ЭДТК, 0,03 М трис-HCl с pH 8/. Фильтры в сухом виде метят 32P с целью их ориентации перед экспозицией на рентгеновскую пленку. Области, содержащие положительно гибридизированные бляшки, располагают на мегапластинах со ссылкой на меченные 32P пятна, собранные с использованием стерильного тупого конца пипетки Пастера. Первоначально перенесенные бляшки титруют на штамме E.coli ED 8654 и помещают в чашечки Петри диаметром 15 см при плотности бляшек примерно 500 на чашку. Эти чашки подвергают повторному отбору по вышеприведенной методике, в результате чего отбирают отдельные положительно гибридизованные бляшки с использованием зубочистки в 1 мл фагового буфера/фаговый буфер 10 мМ трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 0,01% желатина, pH 7,4/.
Получение клонированной ДНК бета-лактоглобулина.
К E. coli ED 8654 добавляют 0,4 мл раствора фага [41] и помещают в чашечки Петри диаметром 9 см с целью получения зоны лизиса бактерий. Получают зону лизиса, с которых в 10 мл фагового буфера снимают верхний слой агара и инкубируют сутки с несколькими каплями хлороформа. Бактериальные лизаты превращают в гранулы с помощью центрифугирования со скоростью 5000 об./мин, а фаговое сырье хранят при 4oC. Полученное сырье титруют на E.coli ED 8654 для определения значения о.б.е./мл.
На 7х109 клетках E.coli в 10 мл мМ MgSO4 при 37oC адсорбируют 8х107 о.б. е. Спустя 15 мин в колбе на один литр к 100 мл 1-бульона-10 мМ MgSO4 добавляют аликвоты по 2,5 мл. Бактериальную суспензию несколько часов интенсивно встряхивают и каждый час проверяют значение ОД540. Лизис, как определено по падению значения ОД540, происходит через несколько часов. После завершения лизиса к каждым 100 мл культуры добавляют 0,2 мл хлороформа и культуру оставляют при 4oC на сутки.
Бактериальные лизаты удаляют центрифугированием в течение 15 мин при скорости 10000 об. /мин. К центрифугату добавляют 10 мкг/мл РНКазы А и 10 мкг/мл ДНКазы 1, после чего инкубируют один час при 37oC. После инкубирования добавляют NaCl до концентрации 40 г/л и полиэтиленгликоль /ПЭГ/ до концентрации 10% Препарат охлаждают до 4oC и оставляют по меньшей мере на два часа для осаждения фага. Фаговые бляшки превращают в шарики при 10000 об/мин в течение 15 мин и вновь суспендируют в 16 мл фагового буфера. 8 мл полученной суспензии наносят в виде слоя на ступенчатый градиент, содержащий 1,5 мл 56% CsCl, 1,6 мл 45% CsCl и 2,5 мл 31% CsCI /в растворе фагового буфера/, помещенного в ультрацентрифужную пробирку на 14 мл. Ступенчатые градиенты центрифугируют 1,5 ч при скорости 35000 об./мин в роторе с колебательно-вращательным движением и 20oC. С помощью иглы и шприца удаляют полосу фага и для завершения очистки частиц фага проводят центрифугирование второго ступенчатого градиента.
Очищенные частицы фага подвергают диализу в 0,1 М NaCl, 10 мМ трис-HCl, 1 мМ ЭДТК /pH 8/, после чего депротонизируют последовательной экстракцией фенолом и хлороформом. Добавляют NaCl до окончательной концентрации 0,3 М, после чего добавлением 2 объемов Et ОН осаждают ДНК фага. Центрифугированием при 10000 в течение 15 мин ДНК превращают в шарики, промывают 70% EtOH, 30% ТЭ, сушат и вновь суспендируют в ТЭ до конечной концентрации 200-400 мкг/мл.
Характеристика рекомбинантных клонов бета-глобулина.
Аликвоты по 0,5 мкг вышеописанных препаратов ДНК подвергают рестрикции различными рестрикционными ферментами и продукты единичного и двойного расщепления анализируют с помощью электрофореза на 0,6% и 1% агарозном геле. ДНК с таких гелей переносят на фильтры из нитроцеллюлозы или мембраны Hybond (Amersham Intenational, Литтл Чалфонт, Бакс) [42] и гибридизуют с клоном p931, меченным 32Р. Использованная процедура по существу аналогична вышеприведенной, и гибридизованные фильтры анализируют с помощью афторадиографии. С использованием различных рестрикционных ферментов и специфических зондов из 5'- и 3'-концов p931 построена карта рестрикции, на основании которой определен размер и ориентация гена/ов/ бета-лактоглобулина /фиг.1/.
Идентичность клонов бета-лактоглобулина и точное положение 5'- и 3'-концов гена непосредственно подтверждено определением ДНК-последовательности. С использованием подходящих фрагменты субклонируют в рестрикционные сайты плазмидных векторов и векторов М13. Установление последовательности проводят с помощью дидезокси-метода [43]
Обработка генов сцепления бета-глобулина.
Обработка генов сцепления бета-глобулина.
Подход, используемый для обработки генов сцепления, включающих бета-глобулин и представляющих интерес генов, экспрессируемых в молочной железе, отражен на фиг. 1-4. В таком подходе используют последовательности, образованные лямбда-клоном, характеристика которых и выделение описано выше. Такой подход включает внедрение представляющей интерес ДНК-последовательности в область ДНК, соответствующую 5' нетрансляционной области мРНК бета-лактоглобулина. Белки, транслируемые с транскриптов мРНК такого гена, будут содержать секреторный пептид целевого белка.
Субклон pss-Itg SE конструируют так, как показано на фиг. 1, путем лигирования фрагмента SphI-EcoRI 1,4 кb лямбда-фага SS-1 с векторной плазмидой pPOIy, которую также разрезают с помощью SphI + EcoRI и с последующей трансформацией штамма E.coli D ДН1 для придания ему компетентности [44] Выделяют устойчивые к амплицилину клоны и из них получают ДНК [45]
На фиг. 1 верхняя стрелка определяет ориентацию и протяженность /примерно 4,9 к.о./ транскрипционного звена бета-лактоглобулина, присутствующего в пределах SS 1, тот же масштаб сохранен повсюду. В более общем смысле следует отметить, что на фиг. 1-4 показаны только относящиеся к делу рестрикционные сайты. Большие открытые прямоугольники представляют ветви лямбда-EMBL3, узкие открытые прямоугольники представляют pPoIy, узкий закрашенный прямоугольник представляет экспрессируемую целевую последовательность, линии представляют последовательности для овцы, соответствующие гену бета-лактоглобулина и его фланкированным последовательностям.
На фиг. 1 верхняя стрелка определяет ориентацию и протяженность /примерно 4,9 к.о./ транскрипционного звена бета-лактоглобулина, присутствующего в пределах SS 1, тот же масштаб сохранен повсюду. В более общем смысле следует отметить, что на фиг. 1-4 показаны только относящиеся к делу рестрикционные сайты. Большие открытые прямоугольники представляют ветви лямбда-EMBL3, узкие открытые прямоугольники представляют pPoIy, узкий закрашенный прямоугольник представляет экспрессируемую целевую последовательность, линии представляют последовательности для овцы, соответствующие гену бета-лактоглобулина и его фланкированным последовательностям.
Субклон PSS-ItgSE линеаризуют путем гидролиза с рестрикционной эндонуклеазой PVU11 /фиг.2/, которая разрезает плазмиду в уникальном сайте той области ДНК, которая соответствует 5' нетранслированных мРНК-последовательностей бета-лактоглобулина. 5 мкг полностью гидролизованной плазмиды растворяют в 0,5 М трис-HCl, 10 мМ MgCl2, 1 мM MnCl2, 10 мM спермидина /pH 9/ и обрабатывают 0,01-0,04 единицами кишечной фосфатазы теленка /Boehringer/ в течение 30 мин при 56oC. Кишечную фосфатазу теленка дезактивируют в 0,5 НДС, а ДНК выделяют экстракгированием фенолом-хлороформом и осаждением EtOH.
Клон ДНК фактора 1Х p5'G3'CV1 получен от Др.G.Brownlee из школы Паталогии cэра Вильяма Дунна, Оксфордского Университета, Оксфорд. Такой клон имеет вставку в 1579 по плазмиде, полученной из PAT153 [46] Она простирается от TagI-сайта у-7 от предполагаемого старт-сайта мРНК до +1572 и содержит полную кодирующую последовательность фактора 1Х человека [47]
Фрагмент Nhel-Hind II, включающий 1553 по последовательность фактора IХ, отрезают из векторных последовательностей и очищают нижеописанными способами. Hind III и Nhel концы фрагмента затупляют с помощью полимеразы Кленова [48] и фрагмент лигируют в PVU II сайт, обработанной рестриктазой и фосфитазой плазмиды pSSItg SE /см.выше/ с образованием pSSItg SE-фактор IХ после трансформирования штамма Е.coli H-I на устойчивость к амплициллину.
Фрагмент Nhel-Hind II, включающий 1553 по последовательность фактора IХ, отрезают из векторных последовательностей и очищают нижеописанными способами. Hind III и Nhel концы фрагмента затупляют с помощью полимеразы Кленова [48] и фрагмент лигируют в PVU II сайт, обработанной рестриктазой и фосфитазой плазмиды pSSItg SE /см.выше/ с образованием pSSItg SE-фактор IХ после трансформирования штамма Е.coli H-I на устойчивость к амплициллину.
Последовательность кДНК фактора IХ, далее обозначаемая как TARG, что можно видеть на фиг.2.
Плазмидную ДНК получают, как указано выше, и проверяют путем обработки соответствующим рестрикционным ферментом. Плазмидную ДНК обрабатывают с помощью Sphl + ECORI и подвергают электрофорезу на 1% агарозном геле, содержащем 0,5 мкг/мл этидий-бромида /Sigma/. Нужный Sphl ECORI фрагмент локализуют освещением УФ-лампой. Кусок диализной мембраны вставляют в переднюю часть полосы и затем ДНК подвергают электрофорезу на мембране. ДНК вымывают с диализной мембраны и изолируют с использованием "EIU-tip" [49]
Плазмиду pSSItgXS /фиг.3/ конструируют путем лигирования фрагмента XbaI-SaII лямбда-SSI и XbaI SaII и фрагмента плазмиды pPoIy. Клоны изолируют и плазмидную ДНК получают, как описано ранее. Из этой плазмиды выделяют независимо два фрагмента ДНК или более мелкие субклоны, образовавшиеся из плазмиды (фрагмент 10,5 к.в. SphI) частичный Hind II и фрагмент 1,2 к.в. EcoRI-Hind III /фиг. 4/. Эти фрагменты выделяют электрофорезом на геле, как описано выше.
Плазмиду pSSItgXS /фиг.3/ конструируют путем лигирования фрагмента XbaI-SaII лямбда-SSI и XbaI SaII и фрагмента плазмиды pPoIy. Клоны изолируют и плазмидную ДНК получают, как описано ранее. Из этой плазмиды выделяют независимо два фрагмента ДНК или более мелкие субклоны, образовавшиеся из плазмиды (фрагмент 10,5 к.в. SphI) частичный Hind II и фрагмент 1,2 к.в. EcoRI-Hind III /фиг. 4/. Эти фрагменты выделяют электрофорезом на геле, как описано выше.
Фрагменты SphI-EcoRi, SphI-HindII и EcoRI-HindIII лигируют совместно в примерно равных отношениях и ДНК, используемой для трансформации ДН-1. Плазмидную ДНК /pSSItgXS-TARC/ получают, как описано выше, и гидролизуют с помощью Xbal и Sall с отщеплением от вектора гена слияния бета-лактоглобулина. Такой фрагмент очищают электрофорезом на геле с последующим использованием "Е1u-tip". Осажденную этанолом ДНК превращают в шарики, вновь суспендируют в ТЭ, экстрагируют фенол-хлороформом и снова суспендируют. Наконец ДНК вновь суспендируют в ТЭ и непосредственно применяют для микроинъекций.
В. Создание трансгенных животных
Отбор оплодотворенных яиц
Использованные методики аналогичны.
Отбор оплодотворенных яиц
Использованные методики аналогичны.
Эмбрионы извлекают из овцематок, у которых во время течки, регулируемой действием прогестагена, вызвана суперовуляция. Зрелые овцематки с доказанной оплодотворяемостью обрабатывают 12-16 дн внутривагинально тампоном, пропитанным 60 мг медрогпроксиэстеронацетата. Фолликулстимулирующий гормон лошади вводят в виде 2 равных внутримышечных инъекций /3,5-4,3 мг в водном растворе на овцематки/ за 28 ч до конца обработки прогестагеном и во время удаления тампона. Во время течки, происходящей через 20-72 после удаления тампона, овцематок несколько раз спаривают. Овцематки ежедневно в 8.00, 12.00, 16.00 и 20.00 осматривают на предмет начала повышения температуры. Через 36-72 ч после начала течки хирургическим путем извлекают эмбрионы на 1-4 клеточной стадии развития.
Анастезию вызывают внутривенной инъекцией тиопентона натрия /Intraval, Mayano Baker/ и поддерживают смесью кислорода с закисью азота в полузамкнутой циркуляционной системе. Извлечение эмбрионов осуществляют [49] Репродуктивный тракт обнажают через средне-центральный надрез и через фимбрию в яйцевод вводят найлоновый катетер. Через затупленную иглу 18 размера в просвет матки вводят среду, которую пропускают через соединение матки с фаллопиевыми трубами и яйцевод. Эмбрионы извлекают в фосфатном буферном солевом растворе, содержащем источники энергии и белок. Во время хранения и микроинъекции яиц такую среду дополняют 20% плодной сыворотки теленка.
Инъецирование ДНК
ДНК инъецируют в количестве 1-2 мкг/мл в одно проядро единичных одноклеточных яиц в одно или более ядер 2 и 4 клеточных яиц. Обработку яиц проводят в камере, заполненной культуральной средой яиц. Камера состоит из силиконизированного слайда микроскопа со стеклянными держателями /25 мм х 2 мм х 3 мм/, параллельными длинной стороне слайда. Верхняя часть держателей накрыта лентой, места соединения герметизируют силиконовой смазкой. Открытый конец камеры заполнен 50 мл жидкости Dow-Corning 200 (ВДН Chemicals).
ДНК инъецируют в количестве 1-2 мкг/мл в одно проядро единичных одноклеточных яиц в одно или более ядер 2 и 4 клеточных яиц. Обработку яиц проводят в камере, заполненной культуральной средой яиц. Камера состоит из силиконизированного слайда микроскопа со стеклянными держателями /25 мм х 2 мм х 3 мм/, параллельными длинной стороне слайда. Верхняя часть держателей накрыта лентой, места соединения герметизируют силиконовой смазкой. Открытый конец камеры заполнен 50 мл жидкости Dow-Corning 200 (ВДН Chemicals).
Предназначенные для инъецирования яйца удерживают путем засасывания в тупую стеклянную пипетку. Проядра или ядра осматривают с использованием инвертируемого микроскопа Nihon Diaphet (Nikoon) /Великобритания/Ltd. Нейбрук, Нэйсфилд 9, Тэлфорд, Шропшир/. ДНК инъецируют с помощью микропипетки, вытянутой из капиллярной трубочки/боросиликатное стекло, внутренний диаметр 1 мм, тонкостенная с нитью Clarc Electromedical Instrument, PO Box 8, Пэнгбурн, Рийдинг, R68 7HU/, в проядро или ядро на микроэлектродном выталкивателе /Campdem Instruments 186 Кэмпден Нил Роуд, Лондон/. Положение двух микроинструментов регулируют с применением микроманипуляторов /leitz Mechanical Micromanipulators, E. Leitz (Instruments) Ltd, 48 Парк Стрит, Лутон, Англия/. Микропипетку с инъецируемой ДНК соединяют воздухонепроницаемой трубочкой со стеклянным шприцем на 100 мл. Инъецирование осуществляют созданием с помощью шприца давления. Успешное инъецирование видно по набуханию проядра или ядра. Инъецированные яйца инкубируют минимум 30 мин при комнатной температуре, чтобы выявить поврежденные яйца по их вырождению.
Эмбрионы, которые считают выжившими после инъецирования, пересаживают неспаривавшимся рецепиентным овцематкам, у которых цикл течки синхронизирован с циклом доноров введением прогестагена /Veromix, Upjohn Ltd/. Эмбрионы пересаживают в яйцевод с применением мелко вытянутой пипетки для рта. Каждой овцематки пересаживают до 4 эмбрионов. Эмбрионы распределяют между яйцеводами.
Стенку тела овцематки зашивают растворимой нитью /Descon, Davisand Creek/, а шкуру затягивают зажимами Мишеля. Каждой овце дают антибиотики /Duphapen L. A. Duphar, Amersham/ во время хирургической операции. Через 10-20 дн после операции зажимы снимают.
Развитие и рост
После того как овцы очнутся от анестезии, их возвращают в загон, где они остаются на весь срок беременности. По мере необходимости овцы получают дополнительное сено, турнепс и концентраты. В ходе третьего месяца беременности ультразвуковым сканированием определяют число плодов [50] Уход за беременными овцами после этого устанавливают в зависимости от числа плодов. По мере приближения ожидаемой даты родов овец помещают в помещение, облегчающее их осмотр и помощь во время ягнения.
После того как овцы очнутся от анестезии, их возвращают в загон, где они остаются на весь срок беременности. По мере необходимости овцы получают дополнительное сено, турнепс и концентраты. В ходе третьего месяца беременности ультразвуковым сканированием определяют число плодов [50] Уход за беременными овцами после этого устанавливают в зависимости от числа плодов. По мере приближения ожидаемой даты родов овец помещают в помещение, облегчающее их осмотр и помощь во время ягнения.
Анализ трансгенных ягнят
По меньшей мере через 2 нед после рождения у ягнят из вены с помощью медицинского шприца отбирают по 10 мл образца крови, которую собирают в гепаринизированную пробирку. Из образцов крови приготовляют ДНК следующим образом: к 10 мл образца крови добавляют 30 мл раствора лизиса /155 мМ NH4Cl, 10 мM KHCO3, 1 мM ЭДТК/ и смесь инкубируют 15 мин на льду. Белые кровяные тельца центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин при 40oC и вновь суспендируют в 10 мл SE /75 мM NaCl, 2 мM ЭДТК/ и затем один раз промывают SE/. К 100 мкг/мл добавляют протеиназу К, затем 1 мл 20% SDS и препарат инкубируют 4 ч. Проводят непрерывную экстракцию фенолхлороформом до полной депротонизации препарата. Для осаждения ДНК к водной фазе прибавляют 1/30 об. 0,3 M NaAc-1 об. изобропанола, ДНК подцепляют крючком, промывают 70% Et OH и вновь суспендируют в SE.
По меньшей мере через 2 нед после рождения у ягнят из вены с помощью медицинского шприца отбирают по 10 мл образца крови, которую собирают в гепаринизированную пробирку. Из образцов крови приготовляют ДНК следующим образом: к 10 мл образца крови добавляют 30 мл раствора лизиса /155 мМ NH4Cl, 10 мM KHCO3, 1 мM ЭДТК/ и смесь инкубируют 15 мин на льду. Белые кровяные тельца центрифугируют при 1500 g в течение 10 мин при 40oC и вновь суспендируют в 10 мл SE /75 мM NaCl, 2 мM ЭДТК/ и затем один раз промывают SE/. К 100 мкг/мл добавляют протеиназу К, затем 1 мл 20% SDS и препарат инкубируют 4 ч. Проводят непрерывную экстракцию фенолхлороформом до полной депротонизации препарата. Для осаждения ДНК к водной фазе прибавляют 1/30 об. 0,3 M NaAc-1 об. изобропанола, ДНК подцепляют крючком, промывают 70% Et OH и вновь суспендируют в SE.
Аликвоты ДНК по 10 мкг обрабатывают приемлемым рестрикционным ферментом /напр. EcoRI/ и подвергают электрофорезу на 0,8% гелях. Такие гели анализируют блоттингом по Саузерну, гибридизацию проводят по существу так, как было описано.
Положительно гибридизированные животные, т.е. животные, имеющие ген слияния /предположительно расположенный в хромосомной области/, оставляют расти до зрелого возраста. Женские особи спаривают и после начала лактации их молоко анализируют на содержание представляющего интерес вещества /см. пример 7/. Положительно гибридизированные особи спаривают и родившихся от них дочерей отбирают на предмет присутствия экзогенных ДНК-последовательностей, а их молоко затем анализируют на присутствие представляющего интерес вещества.
Пример 2
Воспроизводят методику примера 1 за тем исключением, что ДНК-последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид /TARG-последовательность/, кодирует альфа1 антитрипсин /получена от R. Cortese EMБL, Майерхофштрассе 1, D-6900 Гейдельберг, ФРГ/. Фрагмент TagI-bstIII 1294 п.о. [51] отрезают, выделяют из таких клонов и клонируют в Pvu II сайт p SSItgSE способами, описанными в примере 1.
Воспроизводят методику примера 1 за тем исключением, что ДНК-последовательность, кодирующая представляющий интерес полипептид /TARG-последовательность/, кодирует альфа1 антитрипсин /получена от R. Cortese EMБL, Майерхофштрассе 1, D-6900 Гейдельберг, ФРГ/. Фрагмент TagI-bstIII 1294 п.о. [51] отрезают, выделяют из таких клонов и клонируют в Pvu II сайт p SSItgSE способами, описанными в примере 1.
Пример 3
Воспроизведена методика примера 1 за исключением того, что вместо плазмиды pPoIy используют плазмиду pVC18 /Pharmacia Ltd. Pharmacia House, Мидсаммер Бульвар, Милтон Кейнес, Англия/.
Воспроизведена методика примера 1 за исключением того, что вместо плазмиды pPoIy используют плазмиду pVC18 /Pharmacia Ltd. Pharmacia House, Мидсаммер Бульвар, Милтон Кейнес, Англия/.
Пример 4
Воспроизведена методика примера 1 за исключением того, что вместо плазмиды pPoIy используют плазмиду pVC19 /Pharmacia Ltd. Pharmacia House, Мидсаммер Бульвар, Милтон Кейнс, Англия/.
Воспроизведена методика примера 1 за исключением того, что вместо плазмиды pPoIy используют плазмиду pVC19 /Pharmacia Ltd. Pharmacia House, Мидсаммер Бульвар, Милтон Кейнс, Англия/.
Пример 5
Создание трансгенной овцы
Фрагмент Sal_ XbaI, вырезанный из плазмиды pSSItgXS /обозначаемая также как pSSItgXS, см. пример 1/, инъецируют в яйца овцы. Инъецируют примерно 200 копий на оплодотворенное яйцо. Из 252 одноклеточных яиц, инъецированных и пересаженных овцам-реципиентам, родилось 52 живых ягненка. На основе анализа ДНК, приготовленной из образца крови, установлено, что четыре из числа этих животных являлись носителями экзогенных последовательностей бета-лактоглобулина-фактора IX /табл.3/. Все яйца инъецируют на стадии проядра и не подвергают центрифугированию.
Создание трансгенной овцы
Фрагмент Sal_ XbaI, вырезанный из плазмиды pSSItgXS /обозначаемая также как pSSItgXS, см. пример 1/, инъецируют в яйца овцы. Инъецируют примерно 200 копий на оплодотворенное яйцо. Из 252 одноклеточных яиц, инъецированных и пересаженных овцам-реципиентам, родилось 52 живых ягненка. На основе анализа ДНК, приготовленной из образца крови, установлено, что четыре из числа этих животных являлись носителями экзогенных последовательностей бета-лактоглобулина-фактора IX /табл.3/. Все яйца инъецируют на стадии проядра и не подвергают центрифугированию.
Число копий определяют денситометрией с количественным сканированием.
На фиг. 5 приведены результаты блоттинг-анализа по Саузерну. ДНК овцы получают, как описано, обрабатывают указанным рестрикционным ферментом, подвергают электрофорезу на 0,8% агарозном геле и переносят на мембраны Hybond /Amersham International, Литтл Чалфонт, Бакс, Великобритания/. Фильтр зондируют меченной 32P плазмидой, pSSItgXS-FIX /полосы 1-7/ и затем /после отделения от мембраны/ /плазмидой p931 /полосы 1' 7'/. Контроль копий pSSItgXS-FIX проведен на геле там, где указано. Полоса 1 контрольные ДНК овцы /нетрансгенной/; полосы 2 и 3 контрольная ДНК плюс 1 и 5 копия эквивалентов p5 C3 C VI: Полосы 4-7 ДНК трансгенных овец 6LL 225, 6LL 231, 6LL 239 и 6LL 240. Каждая трансгенная овца дает полосы 5,95 к.b /EcoRI/ и 6,05 к.b. /BamHI/, идентичные по размерам полосам, образовавшимся из pSSItgXS-FIX, что указывает на интактность 5'-концов трансгенов. Значительной гибридизиции в случае фактора IX овцы не наблюдалось. Гибридизация с p931 выявила фрагменты 4,4 к.b /EcoRI/ и 2,1 к.b /BamHI/. Хотя гены бета-лактоглобулина эндогенной овцы вносят вклад в гибридизацию этих полос, повышенная интенсивность в образцах от 6LL 225, 6LL 231, 6LL 240 указывает на происхождение этих полос, в первую очередь, из инъецированного гена слияния бета-глобулин-фактор IX, что подтверждает неприкосновенность 3'-концов конструкта. ДНК, расщепленная HindIII-полоса 1, 1, 12,1 к, b, плазмиды pSSItgX-FIX; полосы 2-5 ДНК от овец 6LL 225, 6LL 231, 6LL 239 и 6LL 240. Зондом служит p5'G3'GYI. Гибридизованный фрагмент HindIII в 12,1 к. b. /6LL 225, 6LL 231 и 6LL 240/, идентичный по размерам инъецированному фрагменту, указывает на расположение голова к хвосту, фрагмент в 15,6 к. b. общий для той же овцы, указывает на присутствие также повторов с расположением голова к голове. Эти данные указывают, что у овец 6LL 225, 6LL 231 и 6LL 240 фрагмент pSSItgX-FIX, образовавшийся из pSSItgX-FIX /ген слияния бета-лактоглобулин-фактор IX/, интегрирован без обнаруживаемой перегруппировки расположения тандема. Для овцы 6II239 данные сопоставимы с интегрированием единичной неперегруппированной копии этого фрагмента.
Пример 6
Передача последовательностей фактора IX следующим поколениям.
Передача последовательностей фактора IX следующим поколениям.
Трансгенного барана 6LL 225 примера 5 /несущего примерно 40 копий фрагмента SaII XbaI, приготовленного из pSSItgXS-FIX/ успешно спаривают с рядом овцематок Финн-Дорсетской и Восточно Фризояндской пород. ДНК из образцов крови его потомства подвергают блоттинг-анализу по Саузарену с применением плазмидного зонда p5'G3'GYI фактора IX человека /см. выше/. Результаты для отдельных представителей этого потомства приведены на фиг. 6. Полосы под NN 1, 3, 4, 5, 6, 7, 9, 11, 43, 45, 48 и 49 ДНК от потомства барана 6LL 225 /обозначены как 7R1, 7R3 7R49/, полоса с 211 ДНК от контрольной /нетрансгенной/ овцы 6LL 211, полосы 5-211 и 1-211 ДНК от овцы 6LL 211 плюс 5 и 1 копии эквивалентов pSSIIgXS-FIX. Полученные данные показывают, что 6 и 12 представителей потомства трансгенного барана 6LL 225 унаследовали последовательности фактора IX, т.е. то, что эти последовательности оказались включенными в зародышевую линию.
Пример 7
Экспрессия гена, кодирующего бета-лактоглобулин овцы, в трансгенных мышах.
Экспрессия гена, кодирующего бета-лактоглобулин овцы, в трансгенных мышах.
Выращивают трансгенных мышей [52] Получено несколько трансгенных мышей, несущих фрагмент SaII клона лямбда I /фиг. 3/. Одна из этих мышей /самка B-Lac 7/, как было показано, является носительницей 15-20 копий фрагмента SaII. Мышь B-Lac 7 многократно спаривалась и произвела многочисленное потомство, унаследовавшее SS-I последовательности.
Через 8-12 дн после рождения приплода у мыши забирают молоко. Для этого проводят внутрибрюшинную инъекцию 0,31 Е окситоцина /Sigma/ и 7 мкл/г зверька Гипнорм-Гипновеля [53] после предварительного удаления мышат на 1 ч, выжидания в течение 20 мин и затем миссирования вручную каждой отдельной молочной железы. Молоко отбирают в капиллярную трубочку на 50 мкл.
Мышиное молоко разбавляют дистиллированной водой /1:5/, центрифугируют в течение короткого промежутка на ступенчатой центрифуге для обезжиривания, казеины осаждают добавлением I н HCl до окончательного pH 4,6. После центрифугирования на ступенчатой центрифуге удаляют белки сыворотки, осаждают 5% трихлоруксусной кислотой и анализируют с помощью электрофореза на полиакриламидном геле согласно LaemmIi [54] На фиг. 7 приведен НДС ПАГЭ анализ белков сыворотки молока мыши и овцы. Полоса 1 белки-метки; 2 - нормальный белок мыши; 3 белок овцы; 4 белок нормальной мыши; 5 белок мыши B-Lac7; 6 белок B-Lac7 /2,5 х 5/. Антисыворотка, выработанная у кроликов к бета-лактоглобулину овцы, использована для обнаружения бета-лактоглобулина овцы вестерн-блоттингом [55] образцов, разделенных электрофорезом на геле. На фиг. 8 приведены результаты вестерн-блоттинг анализа. Пятна подвергают реакции с анти-бета-лактоглобулин сывороткой кролика и анти-I -пероксидаза сывороткой кролика. /Полоса 1 белки-метки; 2 белок овцы; 3 белок мыши B; 4 белок нормальной мыши; 5 очищенный бета-лактоглобулин; 6 окрашенный красителем Кумасси белок овцы /параллельный опыт/.
Результаты этого анализа показывают, что бета-лактоглобулин в больших количествах секретируется в молоко мыши, указывая на высокую степень экспрессии SS-I у мыши B-Lac7. Такой клон предположительно содержит все необходимые последовательности, гарантирующие высокий уровень экспрессии в молочной железе трансгенной мыши, и таким образом можно ожидать, что этот клон будет действовать столь же эффективно, если не еще лучше, в гомологичных видах, т.е. в трансгенной овце. Следовательно, образовавшийся из такого клона ген слияния будет экспрессироваться /успешно/ в молочной железе овцы.
Пример 8
Экспрессия фактора IX человека в молоке трансгенной овцематки
Две овцематки /6LL 231 и 6LL 240/, каждая является носителем примерно 10 копий фрагмента SaII-XbaI, полученного из pSSItg XS-FIX/, успешно спаривают с баранами Восточно Фриэляндской породы. После рождения оставляют сосать естественным путем примерно на две недели с целью стимулирования лактации. В стерильные пластиковые сосуды вручную собирают молоко /примерно по 25 мл от каждой овцы/. Образцы молока замораживают до -20oC и отсылают в Национальную службу переливания крови Шотландии при Королевской Лечебнице, где проводят радиоиммунологические испытания /РИИ/ на фактор IX человека.
Экспрессия фактора IX человека в молоке трансгенной овцематки
Две овцематки /6LL 231 и 6LL 240/, каждая является носителем примерно 10 копий фрагмента SaII-XbaI, полученного из pSSItg XS-FIX/, успешно спаривают с баранами Восточно Фриэляндской породы. После рождения оставляют сосать естественным путем примерно на две недели с целью стимулирования лактации. В стерильные пластиковые сосуды вручную собирают молоко /примерно по 25 мл от каждой овцы/. Образцы молока замораживают до -20oC и отсылают в Национальную службу переливания крови Шотландии при Королевской Лечебнице, где проводят радиоиммунологические испытания /РИИ/ на фактор IX человека.
Образцы трансгенного и контрольного молока диализуют по дистиллированной воде при 4oC в течение суток и затем сушат вымораживанием. Высушенный вымораживанием образец вновь суспендируют в дистиллированной воде и затем центрифугируют и исследуют на присутствие фактора IX человека /РИИ/ следующим образом. С использованием смешанной плазмы нормального человека, разбавленной РИИ-буфером /50 мм Трис-HCl, 0,25% желатина, 1% Твин-20, 10 мм HCl, pH 7,2/, получают стандартную кривую при разбавлениях 1/10-1/1280 /фиг.9/. Для того чтобы выявить влияние на испытание молока, одновременно нормальную смешанную плазму разбавляют в контрольном молоке и получают стандартную кривую. Испытаниям подвергают разбавленные образцы высушенного вымораживанием молока овец 6LL 231 и 6LL 240. Содержимое каждой пробирки для РИИ следующее: 50 мкл РИИ-буфера, 50 мкл разбавленного образца, 50 мкл поликлональных антител анти-фактора IX кролика с разбавлением 1/30000 и 50 мкл 1125меченного фактора IX. Был установлен контроль для максимального связывания, содержащий 100 мкл РИИ-буфера, 50 мкл антител и 50 мкл 1125фактора IX. Установлен контроль для неспецифичевкого связывания, содержащий 150 мкл РИИ-буфера, 50 мкл антител, 1125фактор IX-следы.
После инкубирования в течение суток 50 мл Сефарозы-SI000, сопряженные со вспомогательным анти-IgG кролика, смешивают в пробирках и сепарацией с сахарозой получают шарики. РИИ чувствителен в пределах примерно 0,125 международных единиц (iu)/dI.
В РИИ откладывают связывания по отношению к обратному фактору разбавления для следующих образцов:
1. Нормальная смешанная плазма
2. Нормальная смешанная плазма плюс молоко
3. Высушенные вымораживанием образцы молока овцы 6LL 231 (TI)
4. Высушенные вымораживанием образцы молока овцы 6LL 240 (T2).
1. Нормальная смешанная плазма
2. Нормальная смешанная плазма плюс молоко
3. Высушенные вымораживанием образцы молока овцы 6LL 231 (TI)
4. Высушенные вымораживанием образцы молока овцы 6LL 240 (T2).
Полученные результаты приведены на фиг. 9.
В молоке обеих овец 6LL 231 (TI) и 6II240 (T2) обнаруживаются уровни фактора IX соответственно при 2,5 iw/dI и 8 iu/dI. Никакой активности не обнаруживается в контрольном молоке на уровне чувствительности испытания. Полученные данные показывают, что трансгенные овцематки, являющиеся носителем гена слияния бета-лактоглобулин-фактор IX (особенно фрагмент SaII XbaI, образовавшийся из pSSItgXS-FIX (также часто обозначаемый как pSSItgXS -TARG), экспрессируют этот ген и секретируют белок человека в молоко. Тем самым создается основа для получения подобными способами белка человека.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Brinster et al. Proc. Acad. Sci, 82/1985/4438-4442.
1. Brinster et al. Proc. Acad. Sci, 82/1985/4438-4442.
2. Nature, vol. 315, 20.06.85, R. E. Hammer et. al. "Production of trasgenic rablits, sheep. and pigs by microinfection" pp. 680-683 (прототип).
3. Laceу et. al. Cell, 34 (1983), 343-346.
4. Brinster et. al. Cell, 27 (1981), 223-231.
5. Swift et. al. Cell, 38 (1984), 639-646.
6. Shani, Nature, 314 (1985), 283-286.
7. Magram et. al. Nature, 315 (1985), 338-340.
8. Krumlauf. et. al. mol. Cell Biol. 5 (1985), 1639-1698.
9. De Slipio and Davie, Biochemistry 18 (1979), 899-904.
10. de le Jalle et. al. Nature 316 (1985) 268-270.
11. Topper and Treeman, Physiol Rev. (1980), 1049-1106.
12. Биохимия лектации, под ред. Mepham, Elsevier (1982), 309-349.
13. I. Daicy Sci 64 (1981), 1038-1054.
14. Brew, Nature, 223 (1969), 671-672.
15. Mercier and Gaye "Биохимия лактации"./ Под ред. Mepham, Elsevier (1983), 177-225.
16. Rosen et. al. Biochem. Soc. Trans. 9 (1982), 112.
17. Gross Claude, Proc. 16th, 2n tl. Cons, Animal. Blood Groups Biohem. Polymorphy, 1 (1979), 54-59.
18. Qasba u Jafaya, Nature, 311 (1984), 377-580.
19. Narhasi and Qasba, I, Biol. Chem. 254 (1979 6016-6025).
20. Shuster et al. Eur. I. Biochem. 71 (1976), 193-199.
21. Panley et al. Nature, 275 (1978), 455-457.
22. Merciev and Cuyelle et. al. Cell 17 (1979) 1013 1073.
23. Mercies et al. Biochimie 67, (1985), 959-971.
24. Gaye et al. Biochimie 64 (1982), 173-184.
25. Teyss ot and Houde fine, Eur. I, Biochem, 110 (1980) 263-272.
26. Mc Knight and Kinsgs bury, Science 217 (1982) 316-324.
27. Payvar et al. Cell 35 (1983), 381-392.
28. Renka witz et al. Cell, 37 (1984), 503-510.
29. Korin et Nature, 308 (1984), 513-578.
30. Charuay et al. Cell 38 (1984) 251-263.
31.Gillies et al. Cell 33 (1983), 717-718.
32.Молекулярное клонирование Гоулд Сиринг Нарбор (1982).
33. Методы энзимологии, т. 68, 100 и 101 (Wr. под ред. Crossman Moldave), Academic Press.
34. Burch and Weintraub, Cell 33, (1983) 65.
35. Trischauf et al. J Hcol. Biol. 170, (1983), 827.
36. Science, 196, 180 (1977).
37. Rigby et. al. J Hcol. 113 (1977), 237.
38. Mescier et. al. Biochimie 67 (1985), 959, 971.
39. Borg and et al. Mol. Con. Genetics, 146 (1976), 199-207.
40. Southern J. Mol. Biol. 98/1975, 503.
41. Sanger et al. PNAS, 74 (1977), 5463.
42. Hanahan and Mesel Son Gene 10 (1980), 63.
43. Birnboim and Doty, Huc. Acid. Res. 7 (1979), 1513.
44. Twig et al. Hature 283 (1980), 216-218.
45. Anson et al. Embo J. 3 (1984), 1053-1060.
46. Maniatis et. al. Молекулярное клонирование, 1982, Колд.
47. Sch leicher anol Schull, Pestfach, 4, Д-335 4, Дассель, ДЕ.
48. Hunter et. al. J Agric Sci, 46/1955,143-149.
49. White et al. Vet Rec. 115 (1986), 140-143.
50. Ciliberto et. al. Cell 41 (1985), 531-540.
51. Gordon and Ruddle. Методы энзимологии, т. 101, 1983, под. ред. Grossman and Moldave, Academic Press с. 411-432.
52. Flecrnoil. Vet. Rec. 10.12.83, p. 574.
53. Nature 277 (1970), 680-684.
54. Burnett Anal. Biochem. 112 (1981), 195-203.
Claims (1)
- Способ получения трансгенной овцы, предусматривающий конструирование рекомбинантной плазмидной ДНК, содержащей ген слитого белка, выделение из полученной плазмиды участка ДНК, включающего названный ген, введение указанного участка ДНК в яйцо или эмбрион овцы, трансплантацию полученного яцца или эмбриона в реципиентную овцематку и последующий отбор трансгенных животных, отличающийся тем, что в яйцо или эмбрион вводят участок ДНК, содержащий по крайней мере Хва II PvuII фрагмент рекомбинантной плазмиды рSStg XS TARG, включающий регуляторную и секреторную сигнальную последовательности гена β - лактоглобулина, слитые с последовательностью ДНК, кодирующей либо фактор IX, либо α1 антитрипсин.
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
GB868615942A GB8615942D0 (en) | 1986-06-30 | 1986-06-30 | Peptide production |
GB8615942 | 1986-06-30 | ||
PCT/GB1987/000458 WO1988000239A1 (en) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | Peptide production |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
RU2085587C1 true RU2085587C1 (ru) | 1997-07-27 |
Family
ID=10600324
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
SU4355314/13A RU2085587C1 (ru) | 1986-06-30 | 1987-06-30 | Способ получения трансгенной овцы |
Country Status (16)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US20050229262A1 (ru) |
EP (2) | EP0791652A1 (ru) |
JP (1) | JP3145377B2 (ru) |
CN (1) | CN1046550C (ru) |
AT (1) | ATE159289T1 (ru) |
AU (1) | AU605497B2 (ru) |
CA (1) | CA1340723C (ru) |
DE (1) | DE3752130T2 (ru) |
DK (1) | DK106588D0 (ru) |
GB (1) | GB8615942D0 (ru) |
HK (1) | HK1002434A1 (ru) |
IL (1) | IL83028A (ru) |
NZ (1) | NZ220893A (ru) |
RU (1) | RU2085587C1 (ru) |
WO (1) | WO1988000239A1 (ru) |
ZA (1) | ZA874728B (ru) |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2601128C2 (ru) * | 2009-12-17 | 2016-10-27 | Санофи | Животная модель, экспрессирующая люциферазу под контролем промотора основного белка миелина (mbp-luci), и применение модели для визуализации биолюминесценции in vivo |
Families Citing this family (77)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0264166B1 (en) | 1986-04-09 | 1996-08-21 | Genzyme Corporation | Transgenic animals secreting desired proteins into milk |
EP0279582A3 (en) * | 1987-02-17 | 1989-10-18 | Pharming B.V. | Dna sequences to target proteins to the mammary gland for efficient secretion |
US6048729A (en) * | 1987-05-01 | 2000-04-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
JPH03500482A (ja) * | 1987-06-16 | 1991-02-07 | オハイオ ユニバーシティ | ホスホエノールピルベート カルボキシキナーゼに係る遺伝子のプロモーターの制御下における、遺伝子導入動物の外来遺伝子の発現の食餌およびホルモンによる調節 |
US4873316A (en) * | 1987-06-23 | 1989-10-10 | Biogen, Inc. | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals |
FR2627779B1 (fr) * | 1988-02-26 | 1991-03-15 | Sodima Union Coop Agricoles | Procede d'epaississement d'un produit du type lait fermente, notamment de yaourt et nouveau polysaccharide utile pour la mise en oeuvre de ce procede |
US6020015A (en) * | 1988-09-22 | 2000-02-01 | Gaull; Gerald E. | Infant formula compositions and nutrition containing genetically engineered human milk proteins |
US5948644A (en) * | 1988-09-26 | 1999-09-07 | Biotechnology Australia Pty Ltd. | Polynucleotides encoding excretory/secretory proteins of parasitic nematodes, host cells transformed therewith |
GB8823869D0 (en) * | 1988-10-12 | 1988-11-16 | Medical Res Council | Production of antibodies |
GB8826446D0 (en) * | 1988-11-11 | 1988-12-14 | Agricultural & Food Res | Peptide production |
US5650503A (en) * | 1988-11-11 | 1997-07-22 | Ppl Therapeutics (Scotland) Limited | Genetic construct of which protein coding DNA comprises introns and is designed for protein production in transgenic animals |
EP0370813A3 (en) * | 1988-11-25 | 1991-06-19 | Exemplar Corporation | Rapid screening mutagenesis and teratogenesis assay |
US6689610B1 (en) | 1989-08-22 | 2004-02-10 | University Of Utah Research Foundation | Cells and non-human organisms containing predetermined genomic modifications and positive-negative selection methods and vectors for making same |
US5464764A (en) * | 1989-08-22 | 1995-11-07 | University Of Utah Research Foundation | Positive-negative selection methods and vectors |
CN1122719C (zh) | 1989-10-12 | 2003-10-01 | 艾姆特兰有限公司 | 经修饰的生物材料 |
US6482404B1 (en) | 1989-10-12 | 2002-11-19 | David James White | Transplantation of tissue comprising a DNA sequence encoding a homologous complement restriction factor |
US5633076A (en) * | 1989-12-01 | 1997-05-27 | Pharming Bv | Method of producing a transgenic bovine or transgenic bovine embryo |
JPH04365487A (ja) * | 1990-04-11 | 1992-12-17 | Consortium Elektrochem Ind Gmbh | 組換dna−構造体、組換ベクター、トランスゲン動物の乳からの蛋白質の取得法、トランスゲン動物の製法及びトランスゲン動物の乳 |
GB9028062D0 (en) * | 1990-12-24 | 1991-02-13 | Agricultural & Food Res | Production of transgenic animals |
US5714345A (en) * | 1990-12-24 | 1998-02-03 | Pharmaceutical Proteins Limited | Increased expression of a gene by a second transferred mammary gland specific sequence transgenic |
US6984772B1 (en) | 1994-02-18 | 2006-01-10 | Virginia Tech Intellectual Properties, Inc. | Transgenic non-human mammals producing fibrinogen in their milk |
US5831141A (en) * | 1991-01-11 | 1998-11-03 | United States Of America As Represented By The Department Of Health And Human Services | Expression of a heterologous polypeptide in mammary tissue of transgenic non-human mammals using a long whey acidic protein promoter |
JPH06507307A (ja) * | 1991-01-11 | 1994-08-25 | アメリカン・レツド・クロス | トランスジェニック動物の乳腺組織における活性ヒトプロテインcの発現 |
US6262336B1 (en) | 1991-01-11 | 2001-07-17 | American Red Cross | Expression of a heterologous protein C in mammary tissue of transgenic animals using a long whey acidic protein promoter |
US5965789A (en) * | 1991-01-11 | 1999-10-12 | American Red Cross | Engineering protein posttranslational modification by PACE/furin in transgenic non-human mammals |
WO1993004171A1 (en) * | 1991-08-19 | 1993-03-04 | Symbicom Aktiebolag | Human beta-casein, process for producing it and use thereof |
US6692737B1 (en) | 1991-11-05 | 2004-02-17 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
US5968502A (en) * | 1991-11-05 | 1999-10-19 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
NZ245015A (en) * | 1991-11-05 | 1995-12-21 | Transkaryotic Therapies Inc | Delivery of human growth hormone through the administration of transfected cell lines encoding human growth hormone, which are physically protected from host immune response; the transfected cells and their production |
US6054288A (en) * | 1991-11-05 | 2000-04-25 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo protein production and delivery system for gene therapy |
US6063630A (en) | 1991-11-05 | 2000-05-16 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Targeted introduction of DNA into primary or secondary cells and their use for gene therapy |
US5641670A (en) * | 1991-11-05 | 1997-06-24 | Transkaryotic Therapies, Inc. | Protein production and protein delivery |
DK8892D0 (da) | 1992-01-23 | 1992-01-23 | Symbicom Ab | Humant proteingen |
US6670178B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-12-30 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In Vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
US6531124B1 (en) | 1992-07-10 | 2003-03-11 | Transkaryotic Therapies, Inc. | In vivo production and delivery of insulinotropin for gene therapy |
US5667839A (en) * | 1993-01-28 | 1997-09-16 | Collagen Corporation | Human recombinant collagen in the milk of transgenic animals |
US5827690A (en) * | 1993-12-20 | 1998-10-27 | Genzyme Transgenics Corporatiion | Transgenic production of antibodies in milk |
US5639940A (en) | 1994-03-03 | 1997-06-17 | Pharmaceutical Proteins Ltd. | Production of fibrinogen in transgenic animals |
MX198456B (es) * | 1994-03-09 | 2000-09-05 | Abbott Lab | Animales trangenicos que producen oligosacaridos y glucoconjugados. |
US5750176A (en) * | 1994-03-09 | 1998-05-12 | Abbott Laboratories | Transgenic non-human mammal milk comprising 2'-fucosyl-lactose |
JPH09509847A (ja) * | 1994-03-09 | 1997-10-07 | アボツト・ラボラトリーズ | 人乳化乳 |
US6204431B1 (en) | 1994-03-09 | 2001-03-20 | Abbott Laboratories | Transgenic non-human mammals expressing heterologous glycosyltransferase DNA sequences produce oligosaccharides and glycoproteins in their milk |
GB9406974D0 (en) | 1994-04-08 | 1994-06-01 | Pharmaceutical Proteins Ltd | Transgenic production |
US6518482B2 (en) | 1994-09-13 | 2003-02-11 | American National Red Cross | Transgenic non-human mammals expressing human coagulation factor VIII and von Willebrand factor |
US5880327A (en) | 1994-09-21 | 1999-03-09 | American National Red Cross | Transgenic mammals expressing human coagulation factor VIII |
US5905185A (en) * | 1995-11-30 | 1999-05-18 | Ppl Therapeutics | Protein C production in non-human transgenic mammals |
WO1997020043A1 (en) * | 1995-11-30 | 1997-06-05 | Zymogenetics, Inc. | Protein c production in transgenic animals |
US6077697A (en) | 1996-04-10 | 2000-06-20 | Chromos Molecular Systems, Inc. | Artificial chromosomes, uses thereof and methods for preparing artificial chromosomes |
GB9621383D0 (en) * | 1996-10-14 | 1996-12-04 | Roslin Inst Edinburgh | Transgene expression |
GB2318732A (en) * | 1996-11-01 | 1998-05-06 | Johnson & Johnson Medical | Wound healing compositions containing alpha-1-antitrypsin |
DE69841459D1 (en) * | 1997-02-14 | 2010-03-11 | American Nat Red Cross | Expression des active human factor ix im brustdrüsengewebe transgener tiere |
GB9715064D0 (en) * | 1997-07-17 | 1997-09-24 | Ppl Therapeutics Scotland Ltd | Protein expression |
US7030289B2 (en) | 1998-11-19 | 2006-04-18 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd | Stabilization of milk from transgenic animals |
EP1958503A3 (en) * | 1999-01-06 | 2008-11-26 | Merrimack Pharmaceuticals, Inc. | Expression of secreted human alpha-fetoprotein in transgenic animals |
GB9905498D0 (en) | 1999-03-11 | 1999-05-05 | Glaxo Group Ltd | Expression |
WO2001000855A1 (en) | 1999-06-23 | 2001-01-04 | Ppl Therapeutics (Scotland) Ltd. | Fusion proteins incorporating lysozyme |
IL154520A0 (en) | 2000-09-13 | 2003-09-17 | Novo Nordisk As | Human coagulation factor vii variants |
US20040133930A1 (en) | 2002-03-11 | 2004-07-08 | Cooper Julian D. | Production of high levels of transgenic factor ix without gene rescue, and its therapeutic uses |
PL371800A1 (en) | 2001-03-22 | 2005-06-27 | Novo Nordisk Health Care Ag | Coagulation factor vii derivatives |
ES2376694T3 (es) | 2001-09-27 | 2012-03-16 | Novo Nordisk Health Care Ag | Polipã‰ptidos del factor vii de coagulaciã“n humano. |
ATE446675T1 (de) | 2002-04-29 | 2009-11-15 | Univ Jefferson | Humane chronische lymphozytische leukämie im mausmodell durch gezielte expression von tcl1 |
EP1908782B1 (en) | 2002-09-25 | 2010-01-06 | Novo Nordisk Health Care AG | Human coagulation factor VII polypeptides |
CN101818138A (zh) | 2003-03-18 | 2010-09-01 | 诺和诺德医疗保健公司 | 生产含有gla残基的丝氨酸蛋白酶的方法 |
GB0309064D0 (en) | 2003-04-22 | 2003-05-28 | Univ Manchester | Modified peptides and their uses |
CN101870729A (zh) | 2003-09-09 | 2010-10-27 | 诺和诺德医疗保健公司 | 凝固因子ⅶ多肽 |
US7968762B2 (en) | 2004-07-13 | 2011-06-28 | Van Andel Research Institute | Immune-compromised transgenic mice expressing human hepatocyte growth factor (hHGF) |
US20090055942A1 (en) | 2005-09-14 | 2009-02-26 | Novo Nordisk Healthcare A/G | Human Coagulation Factor VII Polypeptides |
IL173104A0 (en) | 2006-01-12 | 2006-06-11 | Yeda Res & Dev | Siva and ubiquintination |
WO2010119088A2 (en) * | 2009-04-15 | 2010-10-21 | Bodo Melnik | Milk and milk-based products modified to exhibit a reduced insulinemic index and/or reduced mitogenic activity |
EP3395828A1 (en) | 2009-07-17 | 2018-10-31 | Rigshospitalet | Inhibitors of complement activation |
WO2011107591A1 (en) | 2010-03-05 | 2011-09-09 | Rigshospitalet | Chimeric inhibitor molecules of complement activation |
EP2793921B1 (en) | 2011-12-22 | 2019-04-24 | Children's Medical Center Corporation | Saposin-a derived peptides and uses thereof |
JP6517018B2 (ja) | 2012-02-09 | 2019-05-22 | ヴァー2・ファーマシューティカルズ・アンパルトセルスカブVAR2 Pharmaceuticals ApS | コンドロイチン硫酸グリカンのターゲティング |
CN104704118A (zh) | 2012-10-15 | 2015-06-10 | 诺和诺德保健Ag(股份有限公司) | 凝血因子vii多肽 |
EP2956003A2 (en) | 2013-02-13 | 2015-12-23 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Proteins with modified glycosylation and methods of production thereof |
EP2956480B1 (en) | 2013-02-13 | 2019-09-04 | Laboratoire Français du Fractionnement et des Biotechnologies | Highly galactosylated anti-tnf-alpha antibodies and uses thereof |
EP3821244A1 (en) | 2018-07-13 | 2021-05-19 | Varct Diagnostics ApS | Isolation of circulating cells of fetal origin using recombinant malaria protein var2csa |
Family Cites Families (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
EP0264166B1 (en) * | 1986-04-09 | 1996-08-21 | Genzyme Corporation | Transgenic animals secreting desired proteins into milk |
-
1986
- 1986-06-30 GB GB868615942A patent/GB8615942D0/en active Pending
-
1987
- 1987-06-30 ZA ZA874728A patent/ZA874728B/xx unknown
- 1987-06-30 EP EP97200314A patent/EP0791652A1/en not_active Withdrawn
- 1987-06-30 IL IL83028A patent/IL83028A/xx not_active IP Right Cessation
- 1987-06-30 JP JP50393987A patent/JP3145377B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-30 NZ NZ220893A patent/NZ220893A/en unknown
- 1987-06-30 DE DE3752130T patent/DE3752130T2/de not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-30 RU SU4355314/13A patent/RU2085587C1/ru not_active IP Right Cessation
- 1987-06-30 CA CA000540942A patent/CA1340723C/en not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-30 EP EP87904286A patent/EP0274489B1/en not_active Expired - Lifetime
- 1987-06-30 AU AU76490/87A patent/AU605497B2/en not_active Ceased
- 1987-06-30 CN CN87105412A patent/CN1046550C/zh not_active Expired - Fee Related
- 1987-06-30 AT AT87904286T patent/ATE159289T1/de not_active IP Right Cessation
- 1987-06-30 WO PCT/GB1987/000458 patent/WO1988000239A1/en active IP Right Grant
-
1988
- 1988-02-29 DK DK106588A patent/DK106588D0/da not_active Application Discontinuation
-
1998
- 1998-02-23 HK HK98101390A patent/HK1002434A1/xx not_active IP Right Cessation
-
2005
- 2005-05-27 US US11/138,640 patent/US20050229262A1/en not_active Abandoned
Non-Patent Citations (1)
Title |
---|
R.E.Hammer et al, Production of transgenic rabbits, sheep and pigs by microinjection, Nature v. 315, p. 680 - 683, 1985. * |
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
RU2601128C2 (ru) * | 2009-12-17 | 2016-10-27 | Санофи | Животная модель, экспрессирующая люциферазу под контролем промотора основного белка миелина (mbp-luci), и применение модели для визуализации биолюминесценции in vivo |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
HK1002434A1 (en) | 1998-08-21 |
US20050229262A1 (en) | 2005-10-13 |
CN1046550C (zh) | 1999-11-17 |
JP3145377B2 (ja) | 2001-03-12 |
IL83028A0 (en) | 1987-12-20 |
CA1340723C (en) | 1999-09-07 |
AU605497B2 (en) | 1991-01-17 |
ATE159289T1 (de) | 1997-11-15 |
EP0791652A1 (en) | 1997-08-27 |
JPH01500162A (ja) | 1989-01-26 |
GB8615942D0 (en) | 1986-08-06 |
DK106588A (da) | 1988-02-29 |
AU7649087A (en) | 1988-01-29 |
NZ220893A (en) | 1990-04-26 |
DE3752130T2 (de) | 1998-04-09 |
CN87105412A (zh) | 1988-02-24 |
WO1988000239A1 (en) | 1988-01-14 |
EP0274489A1 (en) | 1988-07-20 |
IL83028A (en) | 1992-02-16 |
DK106588D0 (da) | 1988-02-29 |
EP0274489B1 (en) | 1997-10-15 |
DE3752130D1 (de) | 1997-11-20 |
ZA874728B (en) | 1989-02-22 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
RU2085587C1 (ru) | Способ получения трансгенной овцы | |
US5366894A (en) | Peptide production | |
USRE42704E1 (en) | Production of fibrinogen in transgenic animals | |
US4873316A (en) | Isolation of exogenous recombinant proteins from the milk of transgenic mammals | |
US5648243A (en) | Human serum albumin expression construct | |
EP0871357B1 (en) | Method for development of transgenic goats | |
US6545198B1 (en) | Transgenically produced prolactin | |
AU763326B2 (en) | Genetic manipulation of spermatogonia | |
KR20030060772A (ko) | 형질전환법으로 생성된 데코린 | |
EP0451823A2 (de) | DNA-Konstrukte zur Expression von Proteinen in der Milchdrüse transgener Säugetiere | |
JP2002512021A (ja) | トランスジェニックヒツジから得られるヒト胆汁酸塩−刺激リパーゼ(bssl) | |
US20050043530A1 (en) | Seminal vesicle tissue-specific promoters and uses thereof | |
WO1998058051A1 (en) | Transgenically produced prolactin | |
JP2005211079A (ja) | mC26遺伝子発現制御領域を用いてトランスジェニック動物乳腺において物質を生産する新規製造法 | |
DE4012526A1 (de) | Dna-konstrukte zur expression von proteinen in der milchdruese transgener saeugetiere |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
MM4A | The patent is invalid due to non-payment of fees |
Effective date: 20030701 |