DE4012526A1

DE4012526A1 - Dna-konstrukte zur expression von proteinen in der milchdruese transgener saeugetiere

Info

Publication number: DE4012526A1
Application number: DE19904012526
Authority: DE
Inventors: Peter Dipl Chem Dr Hartl; Gottfried Prof Dr Dr Brem
Original assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Current assignee: Consortium fuer Elektrochemische Industrie GmbH
Priority date: 1990-04-19
Filing date: 1990-04-19
Publication date: 1991-11-14

Description

Seit langem ist eine Gewinnung von Proteinen wie z. B. Albumin, Rennin, Interleukinen, Interferonen, Blut gerinnungsfaktoren, Insulin, Wachstumshormonen oder Somatostatinen aus Körperflüssigkeiten oder Gewebe extrakten von Mensch und Tier bekannt. Ebenso bekannt sind die Probleme, die dabei auftreten: virale Infektionen (AIDS, Hepatitis) oder Immunreaktionen (Insulin). Wei terhin ist in vielen Fällen auch eine Befriedigung der Nachfrage mit diesen Verfahren der Proteingewinnung nicht möglich (Insulin aus Schweinen, Rennin aus Käl bern).

Eine weitere Möglichkeit zur Gewinnung von Proteinen besteht in der chemischen Vollsynthese. Dies ist jedoch nur bei Proteinen mit weniger als 50 Aminsosäuren mög lich. Ein weiterer Nachteil dieses Verfahrens beruht auf der falschen Faltung und dem Fehlen der Glykosylierung bei chemisch synthetisierten Proteinen.

Anreicherungsverfahren von rekombinanten Proteinen aus Bakterien und Hefezellkulturen haben den Nachteil einer geringen Ausbeute, oftmals sind auch die Proteine falsch gefaltet (inclusion bodies), besitzen keine (Bakterien) oder die falsche (Hefen) Glykosylierung oder sie können aufgrund der Konstruktionsmöglichkeiten nur mit einer veränderten Aminosäurenzusammensetzung hergestellt wer den. Desweiteren enthalten die zur Herstellung verwen deten Mikroorganismen oft toxische Substanzen, die eine Anwendung in der Lebensmittelindustrie nicht zulassen (E. coli), oder bei der medizinischen Anwendung zu Im munreaktionen führen können. Diese Probleme ziehen ko stenintensive Verfahren zur Aufreinigung und/oder Aktivierung der rekombinanten Proteine nach sich.

Eine weitere Möglichkeit beruht auf der Gewinnung von rekombinierten Proteinen aus Kulturen höherer Zellen (Abstammung: Mensch, Tier). Geringe Ausbeuten und mög liche Kontaminationen (DNA, Fremdproteine) führen auch bei dieser Art der Herstellung zu hohen Kosten.

In jüngerer Zeit wurde die Produktion rekombinanter Proteine in der Milch transgener Tiere als Lösung dieser Probleme vorgeschlagen (R. Lathe et al., p. 91 bis p. 102 in: Exploiting New Technologies in Animal Breeding, Published by Oxford University Press 1986, eds. C. Smith, J.W.B. King and J.C. McKay). Die Erstellung transgener Tierlinien ist seit längerer Zeit möglich (Wagner et al,. 1981, Proc. Natl. Acad, Sci. USA 78: 6376-80; Patente: WO 82/04 443;WO 87/5 325).

Die gewebespezifische Expression von Proteinen unabhän gig von der Art der Proteine wurde nachgewiesen (Übersicht: Palmiter et Brinster, 1986, Ann. Rev. Genet. 20: 465-499). Auch die spezifische Expression von Pro teinen in der Milchdrüse transgener Tiere ist bekannt (Stewart et al. 1984, Cell 38: 627-37; Gordon et al. 1987, BIO/TECHNOLOGY 5: 1183-87; Pittius et al. 1988, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85: 5874-78; Clark et al. 1989, BIO/TECHNOLOGY 7: 487-92; Andres et al. 1987, Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84: 1299-1303; WO 88/10 118; WO 88/00 239; EP 02 79 582, WO 88/01 648; EP 02 64 166).

So beansprucht die EP-A-02 64 166 eine DNA-Sequenz, die ein Gen enthält, welches für ein Protein kodiert, wobei das Gen auf der DNA-Sequenz unter transkriptioneller Kontrolle eines Milchprotein-Promotors aus Säugetieren ist, welcher nicht natürlicherweise die Transkription des Gens kontrolliert, wobei die DNA-Sequenz weiterhin einen Bereich enthält, der die Sekretion des Proteins ermöglicht.

Die WO 88/01 648 beansprucht ein rekombinantes Expres sionssystem, welches eine lactogen induzierbare regula torische Region und eine strukturelle Region, die für ein heterologes Protein kodiert, enthält. Die regu latorische Region stammt vorzugsweise von α-Lactalbumin.

Die EP-A 02 79 582 beansprucht eine rekombinante DNA, die eine Promotorsequenz, eine Enhancer-Sequenz, eine Signalpeptidsequenz und eine kodierte Sequenz enthält, wobei die Promotor-, Anhancer- und Signalpeptid-Sequenz von mindestens einem Milchdrüsen-spezifischen Gen stam men und die Expression der kodierten Sequenz in der Milchdrüse verbessern. Offenbart wird die Synthese des Ratten-β-Caseins und eines Chloramphenicolacetyltrans ferase-Fusionsproteins in der Milchdrüse der Maus.

Die WO 88/10 118 beansprucht eine DNA-Sequenz, die einen milchspezifischen Promotor oder einen spezifisch im Brustgewebe aktivierten Promotor opterativ mit einer DNA- Sequenz verknüpft enthält, die für ein rekombinantes Protein kodiert, wobei die Verknüpfung über eine DNA- Sequenz geschieht, die für ein Signalpeptid kodiert, das die Sekretion und Reifung des rekombinanten Proteins im Brustgewebe bewirkt. Gezeigt wird eine geringe Expres sion eines t-PA-Fusionsproteins in der Maus (0,2 bis 0,5 µg/ml in der Milch) und im Schaf.

Die zur Expression von Proteinen in der Milchdrüse be nutzten DNA-Konstrukte führten bisher in allen Fällen zu geringen Ausbeuten oder/und zu Fusionsproteinen, so daß im wesentlichen die zuvor beschriebenen Nachteile der bekannten Verfahren zur Proteingewinnung nicht beseitigt werden.

Daher war es die Aufgabe der vorliegenden Er findung, nach einem verbesserten Expressionssystem zur Gewinnung von Proteinen auch ohne Fusionsanteil aus der Milch transgener Tiere zu suchen, das hohe Ausbeuten des gewünschten Proteins liefert sowie eine Aufreinigung des Proteins erleichtert.

Durch die vorliegende Erfindung werden diese Probleme gelöst. Die Erfindung beruht auf einem rekombinanten DNA-Konstrukt, das verschiedene Sequenzbereiche enthält, die einerseits zu einer hohen Expression gewünschter Proteine oder Peptide in der Milchdrüse von transgenen Tieren führen und andererseits die Sekretion der gebil deten Proteine in die Milch veranlassen. Die Aktivierung des rekombinanten DNA-Konstrukts ist ausschließlich auf die Milchdrüse beschränkt.

Die verwendeten DNA-Sequenzbereiche werden erfindungs gemäß zu einem gewebespezifisch in der Milchdrüse akti ven DNA-Konstrukt zusammengefügt, das aus Promotor-, Enhancer- und Signalpeptidsequenzen sowie aus spezifi schen 5′- und 3′-nichttranslatierten und -transkribier ten DNA-Bereichen besteht. Teile der verwendeten transkribierten DNA-Bereiche werden bei der Reifung des Primärtranskripts zur mRNA durch Spleißvorgänge ent fernt. Desweiteren enthält das DNA-Konstrukt auch einen für ein heterologes Protein oder ein Peptid kodierenden Bereich, der gegebenenfalls durch Introns unterbrochen sein kann. Diese DNA-Sequenzen werden funktionell zu einer operativen Einheit verknüpft, die in der Milch drüse positiv reguliert ist und zu einer hohen Protein expression führt. So bewirkt die Integration eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts in die Keimbahn von Kaninchen oder Rindern, daß die Milch der resultierenden transgenen Tiere eine hohe Konzentration der rekombi nanten Proteine aufweist.

Ein Gegenstand der Erfindung ist somit ein rekombinantes DNA-Konstrukt zur Expression von Proteinen in der Milchdrüse transgener Säugetiere und nachfolgender Sekretion in der Milch, das die im folgenden aufgeführ ten DNA-Bereiche in der angegebenen Reihenfolge und in funktioneller Verknüpfung zueinander enthält:

(1) eine Transkriptions-Kontrollregion aus einem oder mehreren spezifisch in der Milchdrüse aktivierten Genen,
(2) ein erster DNA-Sequenzbereich, der nicht transla tiert wird,
(3) eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, das eine Sekretion in die Milch erlaubt,
(4) eine DNA-Sequenz, welche die genetische Information für ein heterologes Peptid oder ein Protein ent hält und
(5) eine DNA-Sequenz, die eine Polyadenylierungsstelle und ein Transkriptions-Terminationssignal enthält.

Der Begriff "funktionelle Verknüpfung" bedeutet, daß die einzelnen DNA-Sequenzen jeweils auf solche Weise mit einander verknüpft sind, so daß die Expression des er findungsgemäßen DNA-Konstrukts ein Vorläufer-Peptid oder -Protein ergibt, aus dem nach Abspaltung einer Signal sequenz direkt das gewünschte Peptid oder Protein, so fern gewünscht, ohne jeden Fusionsanteil entsteht. Die Verknüpfung der einzelnen DNA-Abschnitte zum erfin dungsgemäßen DNA-Konstrukt erfolgt im Einzelfall mittels molekularbiologischer Techniken, die dem Fachmann auf diesem Gebiet an sich bekannt sind. In einigen Fällen ist es möglich, Fragmente von Genen direkt durch Liga tion miteinander zu verknüpfen. In den meisten Fällen ist es jedoch zur Herstellung eines erfindungsgemäßen DNA-Konstrukts erforderlich, Fragmente von Genen über synthetisch hergestellte DNA-Fragmente zu verknüpfen. Weiterhin ist es auch möglich, das gesamte DNA-Konstrukt oder wesentliche Teile davon durch die Verknüpfung syn thetischer DNA-Fragmente zu konstruieren.

Der Begriff "Transkriptions-Kontrollregion" bedeutet einen Promotor- und Enhancer-Bereich, der die gewebe spezifische Initiation und Aktivierung der Transkription in der Milchdrüse eines transgenen Tieres ermöglicht. Die Transkriptions-Kontrollregion stammt dabei von min destens einem speziell in der Milchdrüse aktivierten Gen, wie z. B. vom α- oder β-Lactoglobulingen oder von einem Mitglied der Caseingen-Familie, z. B. vom α-S₁- Caseingen. Besonders bevorzugt ist die Verwendung der Transkriptions-Kontrollregion des α-S₁-Caseingens, ins besondere vom Ring oder vom Kaninchen. Die Transkrip tions-Kontrollregion muß nicht aus einem einzigen Gen stammen, es ist auch möglich, die zur gewebespezifischen Expression des DNA-Konstrukts erforderlichen Regula tionselemente aus zwei oder mehreren Genen zu entneh men.

Auf diese Transkriptions-Kontrollregion folgt ein erster DNA-Sequenzbereich, der nicht translatiert wird. Vor zugsweise enthält dieser Bereich eine Sequenz, die für das nichttranslatierte Exon I eines Gens aus der Caseinfamilie (α-S₁, α-S₂, β, K-Casein) kodiert, wobei besonders bevorzugt das Exon I aus dem α-S₁-Caseingen verwendet wird. Es folgt dann vorzugsweise eine DNA- Sequenz, die für ein erstes Intron kodiert, wobei die DNA-Sequenz am Exon/Intron-Übergang eine native Splice- Stelle eines Milchdrüsen-spezifischen Gens, besonders bevorzugt des α-S₁-Caseingens sein soll. Der restliche Bereich des Introns muß nicht aus einem milchdrüsen spezifischen Gen stammen, vorzugsweise verwendet man jedoch das erste Intron aus dem α-S₁-Caseingen.

Die Verknüpfung der für das zu exprimierende Protein kodierenden DNA-Sequenz mit den spezifisch in der Milchdrüse zu hoher Expression führenden DNA-Sequenzen geschieht über eine DNA-Sequenz, die für ein Signal peptid kodiert, welche zur Sekretion des Proteins aus den Zellen der Milchdrüse in die Milch führt. Erfin dungsgemäß werden vorzugsweise entweder die eigenen, für ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenzen des zu ex primierenden Proteins oder die für ein Signalpeptid kodierenden DNA-Sequenzen eines milchdrüsenspezifischen Proteins verwendet. Besonders bevorzugt werden hier die Signalsequenzen des α-S₁-Caseingens von Rind oder Kaninchen eingesetzt. Die Sequenz des Signalpeptides ist so mit der für das Protein kodierenden Sequenz ver knüpft, daß beim Export des Proteins aus den Milchdrü senzellen dieses Signalpeptid exakt an der Verknüpfungsstelle abgespalten wird, so daß in der Milch das gewünschte Protein in der entsprechenden aktiven oder inaktiven Form vorliegt.

Das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt enthält ferner die genetische Information für ein zu exprimierendes hete rologes Protein oder Peptid. Der Begriff "heterolog" bedeutet dabei, daß sich die kodierende DNA-Sequenz unter Kontrolle einer fremden Transkriptions-Kontroll region befindet. Die Expression der kodierenden DNA- Sequenzen führt zur Synthese eines inaktiven Propepti des, eines reifen, aktiven Proteins und, sofern ge wünscht, auch eines Fusionsproteins in der Milchdrüse. Die Wahl einer dieser Möglichkeiten kann jeweils nach den Eigenschaften und dem Verwendungszweck des expri mierten Proteins erfolgen. Milchverändernde Proteine werden bevorzugt in einer inaktiven Form exprimiert. So wird Rennin (oder Chymosin, EC 3.4.23.4) bevorzugt in der inaktiven Form Prorennin (oder Prochymosin) gebil det. Proteine, welche keine Veränderung der Milch be wirken, z. B. menschlicher IGF-I (Insulin-ähnlicher Wachstumsfaktor I) und menschliches Albumin dagegen werden bevorzugt in der reifen Form gebildet. Die Syn these eines Fusionsproteins kann z. B. von Nutzen sein, wenn der Fusionsanteil eine leichtere Reinigung des Produkts (z. B. durch Affinitätschromatographie) ermög licht und anschließend durch eine spezifische Spaltung (z. B. chemisch oder proteolytisch) entfernt werden kann.

Als genetische Information für das entsprechende Protein kann man entweder genomische DNA-Sequenzen, die ent sprechenden cDNA-Sequenzen oder eine Kombination dieser Sequenzen verwenden. Ebenso sind aber auch über Oligo nukleotidsynthese hergestellte, totalsynthetische, für ein Protein kodierende Sequenzen geeignet. Die Erfindung beinhaltet weiterhin die Verwendung beliebiger Kombi nationen aus genomischen DNA-Sequenzen, cDNA-Sequenzen und chemisch synthetisierten DNA-Sequenzen, die für ein Protein oder verschiedene Proteine kodieren und zu dem gewünschten Produkt führen. Vorzugsweise achtet man bei der Konstruktion synthetischer DNA-Sequenzen auf die dem Fachmann bekannte Benutzungshäufigkeit der Nukleinsäure- Codons in der zur Erzeugung transgener Tiere jeweils verwendeten Tierart.

An das Stopcodon der für das zu exprimierende Protein kodierenden DNA-Sequenz schließt sich entweder unmit telbar eine DNA-Sequenz an, welche eine Polyadenylie rungsstelle und Transkriptions-Terminations-Stelle enthält, oder bevorzugt ein zweiter nicht-translatierter DNA-Sequenzbereich, der einen Exon/Intron-Übergang ent hält. Vorzugsweise handelt es sich dabei um eine DNA- Sequenz, die den Exon/Intron-Übergang zwischen dem vor letzten Exon und dem letzten Intron eines Gens der Caseingen-Familie, besonders bevorzugt dem α-S₁-Casein gen enthält.

Diesem Exon/Intron-Übergang folgt vorzugsweise eine DNA- Sequenz, die für ein weiteres Intron kodiert. Es folgt dann darauf die DNA-Sequenz, die eine Polyadenylie rungsstelle und eine Transkriptions-Terminations-Stelle enthält.

Polyadenylierungsstelle und Transkriptions-Terminations- Stelle der in der Erfindung verwendeten DNA-Konstrukte können dem eingenen Genbereich des zu synthetisierenden Proteins oder einem milchdrüsenspezifischen Gen entnom men werden. Vorzugsweise wird die Polyadenylierungs stelle des α-S₁-Caseingens verwendet. Erfindungsgemäß können auch künstliche, chemisch synthetisierte Termi nationssequenzen (z. B. beschrieben in Lecitt et al., 1989, Genes and Development 3: 1019-1025) verwendet werden.

Im Anschluß an die Polyadenylierungsstelle werden vor zugsweise in den verwendeten DNA-Konstrukten weitere nichttranskribierte und nichttranslatierte 3′-DNA-Se quenzen benutzt, welche eine Expression fördern. Diese Sequenzen stammen aus dem ursprünglichen, von dem zu synthetisierenden Protein stammenden Genbereich oder von einem milchdrüsenspezifischen Gen. Vorzugsweise wird hierzu der α-S₁-Caseingenbereich des Rindes oder des Kaninchens verwendet.

Erfindungsgemäß bevorzugt werden die DNA-Bereiche zu einer Expressionskassette zusammengesetzt, deren 5′- und 3′-Ende durch Anfügen von Oligonukletoiden so modifi ziert ist, daß die Abtrennung dieser Expressionskassette von einem größeren DNA-Komplex durch vollständige Spal tung mit Restriktionsenzymen möglich ist, ohne daß dabei die Expressionskassette zerstört ist. Dabei verwendet man vorzugsweise Schnittstellen für Restriktionsenzyme, welche eine eukaryotische DNA statistisch selten schneiden. Dadurch ist es möglich, die Expressionskas sette von DNA-Bereichen abzuspalten, die zur Replikation in Bakterien befähigt sind und eine genomische Integra tion bei der Erzeugung transgener Tiere stören. Vor zugsweise werden solche Enzyme und ihre Schnittstellen verwendet, die 8 Basenpaare als Erkennungssequenz be sitzen oder/und in ihrer Erkennungsstelle mindestens einmal, besser mehrmals, die in eukaryontischer DNA seltene Basenfolge CpG besitzen wie z. B. SalI, NotI, SacII, PcuI. So spalten Enzyme mit einer Erkennungsse quenz, die zweimal die Basenfolge CpG enthält, eine eukaryotische DNA statistisch nur ca. alle 150 kb. Mit Hilfe der erfindungsgemäßen Expressionskassette kann jedes beliebige Protein in aktiver oder inaktiver Form, in reifer Form oder als Bestandteil eines Vorläufer- bzw. eines Fusionsproteins in hoher Ausbeute spezifisch in der Milch transgener Tiere gebildet werden.

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein rekombinanter Vektor, der ein erfindungsgemäßes DNA- Konstrukt enthält. Dabei ist die Art dieses Vektors beliebig, d. h. es kann ein eukaryontischer oder ein prokaryontischer Vektor sein, er kann zur Integration in ein Genom oder zur extrachromosomalen Replikation fähig sein. Alle derartigen Vektoren sind dem Fachmann auf dem Gebiet der Molekularbiologie bekannt. Man kann den re kombinanten Vektor zur Vermehrung der erfindungsgemäßen DNA-Konstrukte verwenden, man kann jedoch auch einen rekombinanten Vektor herstellen, der zur Integration von erfindungsgemäßen DNA-Konstrukten in die Keimbahn von Säugetieren geeignet ist, z. B. ein replikationsdefekter Retrovirus. (Übersicht: Palmiter et Brinster, (1986), Ann. Rev. Genet. 20: 465-499).

Weiterhin ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist ein Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus der Milch transgener Säugetiere, wobei man ein erfindungsgemäßes rekombinantes DNA-Konstrukt oder einen rekombinanten Vektor, welcher das erfindungsgemäße DNA-Konstrukt ent hält, in die Keimbahn eines Tieres einbringt, wobei ein transgenes Tier entsteht, und das Protein auf übliche Weise aus der Milch des Tieres oder seiner weiblichen Nachkommen isoliert.

Für das erfindungsgemäße Verfahren ist es nicht ent scheidend, auf welche Art die transgenen Tiere erzeugt werden. Bevorzugt werden die transgenen Tiere durch Mikroinjektion in den Pronukleus einer Keimzelle erzeugt. Es ist jedoch auch möglich, andere dem Fachmann bekannte Verfahren zur Herstellung transgener Tiere zu verwenden. So kann z. B. ein retroviraler Vektor kon struiert werden, der das erfindungsgemäße Konstrukt enthält, und den man dann in den Genom eines Tieres einbringen kann. Die Embryonen oder die geborenen Tiere werden auf Integration der Konstrukte überprüft. Posi tive, mindestens eine vollständige Kopie des Expres sionssystems enthaltende Tiere (Primärtiere) werden zur Aufzucht verwendet. Positive Tiere werden vermehrt und deren Nachkommen (F-1-Generation) ebenfalls auf Gehalt des Transgens überprüft. Üblicherweise wird das Transgen über die Keimbahn von den Primärtieren auf die F-1-Gene ration nach den Mendelschen Vererbungsregeln übertra gen.

Von positiven weiblichen Primärtieren wird in der Lak tationsperiode die Milch auf Gehalt des Proteins über prüft. Von positiven männlichen Tieren werden weibliche F-1-Nachkommen oder weibliche Nachkommen einer späteren Generation bezüglich der Bildung des Proteins in ihrer Milch getestet. Positive Tiere, deren Nachkommen oder die selbst in ihrer Milch die rekombinanten Proteine bilden, werden durch Vermehrung zur Aufzucht stabiler Tierlinien verwendet.

Die rekombinanten Proteine werden aus der Milch nach üblicherweise bekannten, für das jeweilige Protein ge eigneten Verfahren isoliert. Erfindungsgemäß wird die Isolation der rekombinanten Proteine erleichtert durch eine geeignete Auswahl der zur Erzeugung transgener Tiere verwendeten Ei- und Samenzellen. Dieses Auswahl verfahren wird dann durchgeführt, wenn normalerweise ein endogenes, zum rekombinanten Protein homologes, Protein in der Milch vorliegt. In diesem Fall werden Keimbahn zellen zur Erzeugung transgener Tiere herangezogen, die aufgrund genetischer Bedingungen das entsprechende endogene Protein nicht in der Milch bilden. Die geneti schen Bedingungen sind entweder natürlicher Art oder können durch gezielte Manipulation erreicht werden. Vorzugsweise wird daher z. B. zur Gewinnung von mensch lichem Serumalbumin aus der Milch transgener Tiere eine Variante gewählt, die kein eigenes Serumalbumin bildet (Esumi et al. (1982), Proc. Natl. Acad. Sci. USA 79: 734- 738; Inoue (1985), Hepatology 5: 892-898).

Die Erfindung beinhaltet auch eine Auswahl von Keim bahnzellen zur Erzeugung transgener Tiere von einer Spezies, die in ihrer Milch bezüglich der Aminosäure sequenz ein zum rekombinanten Protein vollständig homolo ges Protein bildet. Diese Homologie kann natürlicher Art sein oder auf einer genetischen Variante beruhen. Vor zugsweise wird der reife, menschliche IGF-I in der Milch transgener Schweine und Rinder gebildet, deren endogener reifer IGF-I die identische Aminosäuresequenz besitzt.

Erfindungsgemäß ist auch die Gewinnung eines aus zwei oder mehreren Untereinheiten zusammengesetzten Proteins aus der Milch eines transgenen Tieres möglich. Dies geschieht so, daß man ein transgenes Tier verwendet, das zwei oder mehrere verschiedene erfindungsgemäße DNA- Konstrukte in seinem Genom integriert besitzt. Somit beinhaltet die Erfindung auch ein Verfahren zur Her stellung transgener Tiere, die zwei oder mehrere ver schiedene Fremdgene in ihrem Genom integriert besitzen. Dafür existieren zwei Möglichkeiten. So kann man zwei transgene Tiere der gleichen Art, die aber jeweils ein verschiedenes Fremdgen, vorzugsweise in Form eines er findungsgemäßen DNA-Konstrukts in ihrem Genom integriert besitzen, auf übliche Weise (z. B. durch Mikroinjektion in die Keimzellen) herstellen, diese Tiere oder deren Nachkommen miteinander kreuzen und aus den Nachkommen dieser Kreuzung diejenigen transgenen Tiere auswählen, welche gleichzeitig für die verschiedenen Fremdgene beider Elterntiere positiv sind. Andererseits kann man auch ein transgenes Tier mit zwei oder mehreren Fremd genen in seinem Genom herstellen, indem man ein Fremd gen, vorzugsweise ein erfindungsgemäßes DNA-Konstrukt in die Keimbahn eines Tieres einbringt, das bereits eines oder mehrere andere Fremdgene in seinem Genom integriert besitzt. Auf diese Weise sind transgene Tiere herstell bar, die beliebig viele aktive Fremdgene in ihrem Genom integriert besitzen. Bei Verwendung von erfindungsge mäßen DNA-Konstrukten erfolgt eine gleichzeitige Sekre tion von mehreren Proteinen oder Peptiden in die Milch, so daß sich gegebenenfalls dort ein aus zwei oder meh reren verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzter Proteinkomplex assemblieren kann.

Weiterhin ist somit ein Gegenstand der vorliegenden Erfindung die Milch eines transgenen Tieres, das ein oder mehrere rekombinante erfindungsgemäße DNA-Kon strukte in seinem Genom integriert enthält.

Die Erfindung beinhaltet die Expression jeglicher Pro teine. Dies können inaktive Vorläuferproteine, aktive reife Proteine oder Teilproteine eines größeren Pro teinkomplexes sein sowie Teile eines Fusionsproteins. Allein die kodierende DNA-Sequenz bestimmt die Form des kodierenden Proteins. Bei erfindungsgerechter Verwendung der beschriebenen DNA-Sequenzen können z. B. Human- oder Tier-Serumalbumin, Urokinase, t-PA, Wachstumshormone, Interferone, Peptidhormone, Prorennin und andere Pro teine gebildet werden.

Für die Verwendung erfindungsgemäß hergestellter Pro teine besteht keine Einschränkung. Vorzugsweise werden sie im medizinischen bzw. pharmazeutischen Bereich oder in der Lebensmitteltechnik eingesetzt. Besonders geeig net ist die Verwendung für Zwecke in der Lebensmittel technologie, da die Begleitproteine des rekombinanten Proteins aus der Milch bei diesen Anwendungen nicht toxisch sind. Daher ist bei bestimmten rekombinanten Proteinen keine oder nur eine partielle Trennung von den Milchproteinen nötig.

Schließlich beinhaltet die Erfindung auch noch ein rekombinantes DNA-Konstrukt zur Herstellung einer Expressionskassette, das anstelle des DNA-Bereichs, welcher die genetische Information für ein heterologes Peptid oder ein Protein enthält, eine Klonierungsstelle zum Einbau eines derartigen DNA-Bereichs enthält. Bei dieser Klonierungsstelle kann es sich um die Schnitt stelle eines Restriktionsenzyms handeln. Vorzugsweise handelt es sich um eine singuläre Restriktionsschnitt stelle, d. h. um eine Schnittstelle, die nur einmal im gesamten DNA-Konstrukt vorkommt. Besonders bevorzugt enthält diese Klonierungsstelle die Schnittstellen für mehrere Restriktionsenzyme, wobei man günstigerweise solche Restriktionsenzyme auswählt, die im gesamten DNA- Konstrukt nur eine Schnittstelle besitzen.

Die folgenden Beispiele sollen zusammen mit den Abb. 1 bis 5 die Erfindung besser verdeutlichen.

In den Abbildungen sind Exons sowie Konstrukte zueinan der nicht maßstabgerecht wiedergegeben.

Es zeigt

Abb. 1

α-S₁-Caseingenbereich des Rindes mit Subklonen, siehe Beispiel 1 (die Nukleotidsequenz des Konstrukts p19 ist in Anhang 1 dargestellt).

Abb. 2

Renningenbereich des Rindes mit Subklonen, s. Beispiel 2

Für die Abb. 3.1 bis 3.14 bedeuten, sofern nichts anderes angegeben ist, die folgenden Symbole:

Abb. 3.1 bis 3.3

Verknüpfung des Bovinen α-S₁-Caseinpromotors mit dem Renningen, s. Beispiel 3a.

Abb. 3.4 bis 3.6

Verknüpfung des Renningens mit dem α-S₁-Caseinpromotor über den für das Signalpeptid des α-S₁-Caseins kodie renden Bereich, s. Beispiel 3b.

Abb. 3.7 bis 3.8

Verknüpfung des Renningens mit dem α-S₁-Caseinpromotor, dem α-S₁-Signalpeptid sowie 3′-nichttranslatierten Se quenzen des α-S₁-Caseingens, s. Beispiel 3c.

Abb. 3.9 bis 3.10

Expressionssystem für menschlichen IGF-I unter Kontrolle 5′- und 3′-regulierender DNA-Sequenzen aus dem bovinen α-S₁-Caseingenbereich.

Abb. 3.11

Entwicklung einer Expressionskassette zur Synthese von Proteinen in der Milchdrüse transgener Tiere, siehe Beispiel 3e.

Abb. 3.12 bis 3.14

Expressionssystem für Rennin unter Kontrolle regulie render 5′- und 3′-Sequenzen aus dem bovinen α-S₁-Ca seinbereich unter Verwendung eines synthetischen Renninges, siehe Beispiel 3f (die kodierende Nuklein säuresequenz des synthetischen Renningens ist in Anhang 2a, die komplementäre Nukleinsäuresequenz in Anhang 2b dargestellt).

Abb. 4

Untersuchung der Integration des Konstruktes p77 in Kaninchengenom nach Mikroinjektionsexperimenten.

Abb. 5

Analyse der Nachkommen transgener Tiere.

Beispiele

Methoden wurden - falls nicht besonders erwähnt - nach Maniatis et al. 1982, Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory und Ausubel et al. 1987, Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley & Sons durchgeführt. Enzyme wurden von Gibco-BRL, Che mikalien von Sigma bezogen, Ausnahmen davon sind ge kennzeichnet.

Beispiel 1 Klonierung und Charakterisierung des α-S₁-Casein genbereichs des Rindes

Der α-S₁-Caseingenbereich des Rindes wurde über eine γ-Genbank isoliert. Aus Rinderlymphozyten (isoliert aus Rinderblut mit Ficoll Paque von Pharmacia LKB, gemäß den Angaben des Herstellers) isolierte DNA wurde mit dem Enzym Sau3AI (New England Biolabs) partiell gespalten. DNA-Fragmente im Größenbereich von 14 bis 21 Kb wurden über einen Salzgradienten angereichert, mit alkalischer Phosphatase (Boehringer Mannheim) behandelt und mit dem Vektor γEMBL3 (Genofit, Heidelberg; Lit.: Frischauf et al. 1983, J. Mol. Biol. 170: 827-842) ligiert; wobei der Vektor zuvor mit den Enzymen BamHI und EcoRI gespalten worden war. Die ligierte DNA wurde in vitro mit einem γ-Verpackungsextrakt (Stratagene, Giga Pack Plus) gemäß den Angaben des Herstellers verpackt. Die so erhaltenen γ-Klone wurden auf dem E. coli-Stamm K803 vermehrt; aus 1×10⁶ amplifizierten Klonen wurde eine Rindergenbank etabliert. 1×10⁶ Klone der Genbank wurden parallel mit zwei Oligonukleotiden (CP4 und CP5) durchmustert. Die Oligonukleotide

wurden gemäß den publizierten Sequenzen von Bonsing und Mackinlay 1987, Journal of Dairy Research 54: 447-461 (CP4: S. 451; CP5: S. 450) chemisch synthetisiert (Cyclone, Milligen-Biosearch). Sie entsprechen einem Teil des ersten, nichtkodierenden Exons (CP4) und dem für das Signalpeptid kodierenden Bereich (CP5). Positive Klone, die mit beiden Proben hybridisierten, wurden durch Subklonierungen und Spalten mit Restriktionsenzy men näher charakterisiert. Vom 5′- und vom 3′-Ende des Klons γ84 wurden jeweils repititionsfreie Fragmente (p26 bzw. p84, Abb. 1) isoliert. Mit ihnen wurde die Rinder genbank erneut durchmustert, positive Klone wurden wie beschrieben charakterisiert. Durch Sequenzanalyse von p19 und p86 (Abb. 1) konnte im Vergleich mit publizier ten Sequenzen (Stewart et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12: 3895-3907; Bonsing und Mackinlay 1987, Loc. cit., Yu-Lee et al. 1986, Nucl. Acids Res. 14.: 1883-1902) gezeigt werden, daß sowohl das 5′- als auch das 3′-Ende des Rinder-α-S₁-Caseingens, sowie daran anschließende Gen bereiche, isoliert worden waren. Damit waren insgesamt 40 Kb des α-S₁-Caseingenbereichs (Abb. 1) isoliert wor den.

Beispiel 2 Klonierung des Renningens des Rindes

1×10⁶ Klone der unter Beispiel 1 beschriebenen Rinder genbank wurden mit dem Oligonukleotid RN(5′- GAG GTG TCT CTG GGT GCT ACT TGC TGT CTT CGC TCT CTC CCA GGG CAC 3′) durchmustert. RN wurde chemisch (Cyclone, Milligen-Bio search gemäß der publizierten Sequenz: Hidaka et al. 1986, Gene 43: 197-203) synthetisiert; das Oligonukleo tid RN entspricht einem Teil des ersten Exons des Renningens (Position 28-75, Hidaka et al. 1986, loc. cit.). Von dem Klon γ522 (Abb. 2), der dabei erhalten worden war, wurde am 3′-Ende ein repititionsfreies DNA- Fragment isoliert (p6, Abb. 2), mit dem die Genbank erneut durchmustert wurde. Dabei konnte der Klon γ215/1 erhalten werden (Abb. 2). Beide Klone wurden durch Sub klonierungen und Spalten mit Restriktionsenzym cha rakterisiert. Durch Vergleiche des Musters der Schnittstellen mit dem publizierten Bereich (Hidaka et al. 1986, loc. cit.) konnte gezeigt werden, daß beide Klone einen ca. 33 Kb großen Bereich des Renningens umfassen, das vollständig in diesem Bereich enthalten ist (Abb. 2).

Beispiel 3 Konstruktion von milchdrüsenspezifischen Expres sionssystemen a) Verknüpfung des bovinen α-S₁-Caseinpromotors mit dem Renningen

Ein mögliches Protein, das durch den beschriebenen Prozeß in der Milch transgener Tiere gewonnen wer den kann, ist Rennin. Die Konstruktion wird dabei so gewählt, daß Rennin in der inaktiven Form Pro rennin gebildet wird, um eine Spaltung von Milch proteinen durch das aktive Rennin zu verhindern.

Das in E. coli-Stamm WA321 (AB1157, dam-4; Drei seikelmann et al. 1979, Biochim Biophys Acta 562: 418-428) vermehrte Plasmid p19 (Abb. 1) wurde zu nächst mit dem Enzym EcoRI partiell gespalten, anschließend wurde mit dem Enzym BamHI der Spalt ansatz vollständig gespalten. Dadurch konnte das 6,7 Kb Fragment, das an der EcoRI-Schnittstelle im Polylinker gespalten worden war, von den anderen Spaltprodukten abgetrennt werden.

Dieses Fragment wurde mit BclI gespalten und das 4,2 Kb Spaltprodukt isoliert (Abb. 3.1), dies ent spricht der Spaltung an Position 1485 (Anhang 1) des α-S₁-Caseinpromotors. Die verwendete Spalt stelle liegt zwischen der TATA-box und dem Trans kriptionsstart des α-S₁-Caseingen, das Fragment enthält den unmittelbaren Promotorbereich.

Zur problemlosen Kombination des α-S₁-Caseinpromo torbereiches mit dem Renningen eignet sich die BstYI-Schnittstelle, die zwischen der TATA-Box und dem Transkriptionsbeginn des Renningens liegt und die aufgrund gleicher überhängender Enden problem los mit der BclI-Schnittstelle neu kombiniert wer den kann. Dazu wurde das Konstrukt p9 (Abb. 2), das den Promotorbereich und das erste Exon des Rennins enthält, mit HindIII und EcoRI vollständig und an schließend mit BstYI partiell gespalten. Ein ca. 2,9 Kb großes Fragment wurde isoliert und mit dem BclI/EcoRI-Fragment ligiert (Abb. 3.1). Mit dem Ligationsansatz transformierte E. coli HB101 wurden untersucht, durch Sequenzanalyse konnte gezeigt werden, daß das Plasmid p 33 (Abb. 3.1) auf dem 4,2 Kb isertierten Fragment die richtige Verknüp fung besaß.

Der Bereich von Exon 2 bis Exon 5 des Renningens wurden zu dem Konstrukt hinzugefügt, indem p33 mit EcoRI partiell und SalI vollständig gespalten (Abb. 3.2) und das 4,2 Kb Fragment isoliert wurde, das den α-S₁-Caseingenpromotorbereich mit dem Exon 1 des Renningens enthielt. Dieses Fragment wurde mit einem 7,7 Kb Fragment ligiert (Abb. 3.2), das nach vollständiger Spaltung mit SalI und partieller Spaltung mit EcoRI aus p10 (Abb. 2) erhalten worden war (Abb. 3.2). Daraus wurde das Plasmid p34 (Abb. 3.2) erhalten, das den α-S₁-Caseinpromotor sowie Exon 1-5 des Renningens enthielt.

Um das vollständige Renningen verknüpft mit dem α-S₁-Caseinpromotor zu erhalten, wurde zunächst das Plasmid p34 mit HindIII linearisiert (Abb. 3.3) und mit alkalischer Phosphatase behandelt (Boehringer Mannheim). Aus dem Plasmid p15 (Abb. 2) wurde nach vollständiger Spaltung mit HindIII ein 5,5 Kb Fragment isoliert (Abb. 3.3), das Exon 6 - Exon 9 des Renningens enthielt. Das Fragment wurde mit dem linearisierten p34 ligiert, daraus konnte p42 (Abb. 3.3) erhalten werden, welches das komplette Renningen enthielt.

Bei Mikroinjektionsexperimenten zur Erzeugung transgener Tiere stören Plasmidanteile. Um das Expressionssystem einfach vom Vektoranteil trennen zu können, wurde p42 durch partielle Spaltung mit HindIII linearisiert und mit alkalischer Phospha tase (Boehringer Mannheim) behandelt. Die beiden phosphorylierten Oligonukleotide HS1 (5′- AGC TAG TCG ACT CTA GAC CGC GGT -3′) und HS2 (5′- AGC TAC CGC GGT CTA GAG TCG ACT -3′) wurden hybridisiert und mit dem linearisierten p42 ligiert. Durch Se quenzanalyse und SalI-Spaltung konnte gezeigt wer den, daß p43 (Abb. 3.3) ein Oligonukleotidpaar an der richtigen Position enthielt; durch Spaltung mit SalI ist es möglich, das insertierte Fragment des p43 vom Vektoranteil zu trennen. Nach SalI-Spaltung von p43 konnte ein 14,7 Kb Fragment isoliert wer den, welches das Renningen unter Kontrolle des α-S₁-Caseinpromotors enthält. Signalsequenz und RNA-Terminationssignal stammen vom Renningen.

b) Verknüpfung des Renningens mit dem α-S₁-Caseinpro motor über den für das Signalpeptid kodierenden Bereich des α-S₁-Caseingens

Nach Spaltung des Konstruktes p19 (Abb. 1) mit SacI und BglII wurde ein 5,6 Kb Fragment isoliert und mit dem Oligonukleotidpaar CIIR1/CIIR2 ligiert (Abb. 3.4). Das Fragment enthielt den Vektoranteil von p19 sowie den α-S₁-Caseinpromotoranteil bis zur BglII-Schnittstelle an Position 2898 (Anhang 1), die kurz vor Beginn des zweiten Exons des α-S₁- Caseingens liegt (Position 2900, Anhang 1). Die Oligonukleotide CIIR1 und CIIR2 wurden chemisch synthetisiert (Cyclone, Milligen-Biosearch), phosphoryliert und miteinander hybridisiert. Sie enthielten die kodierende Information für das Signalpeptid des bovinen α-S₁-Caseingens verknüpft mit den Aminosäuren 1 bis 6 des bovinen Prorennins, sowie aus klonierungstechnischen Gründen weitere Sequenzen:

Durch Sequenzierung wurde bestätigt, daß der Klon p73 (Abb. 3.4) die Konstruktion in der richtigen Anordnung enthielt. Die BamHI-Schnittstelle im Oligonukleotidpaar CIIR1/CIIR2 ermöglichte eine Fusion an das zweite Exon des Renningens an der Aminosäure 6 des Prorennins, wobei der Leserahmen erhalten blieb. Dazu wurde zunächst das Plasmid p10 (Abb. 2), das Exon 1-5 des Renningens enthielt, mit SalI vollständig und BamHI partiell gespalten (Abb. 3.5). Ein 6,8 Kb Fragment, das den Vektoran teil von p10 sowie Exon 2-5 des Renningens ent hielt, wurde mit einem 3 Kb Fragment ligiert, welches nach Spaltung von p73 (Abb. 3.4) mit den Enzymen BamHI und SalI erhalten worden war (Abb. 3.5).

Der Klon p75 (Abb. 3.5) enthielt Exon 2-Exon 5 des Renningens mit dem α-S₁-Caseinpromotor über das Signalpeptid α-S₁-Casein verknüpft. Der Vektoran teil wurde von p75 nach Spalten mit SalI und HindIII entfernt (Abb. 3.6), das 7,1 Kb Fragment wurde mit einem 7,3 Kb Fragment ligiert, welches nach Spaltung von p43 (Abb. 3.3) mit HindIII (vollständig) und SalI (partiell) erhalten worden war (Abb. 3.6) und Exon 6-Exon 9 des Renningens enthält. Der daraus resultierende Klon p77 (Abb. 3.6) enthielt die genetische Information für das Prorennin, welches mit der für das Signalpeptid des α-S₁-Caseins kodierenden Sequenz verknüpft war. Daneben enthielt p77 den α-S₁-Caseinpromotor und das erste nichtkodierende Exon sowie das erste Intron des α-S₁-Caseingens verknüpft mit der α-S₁- Casein-Signalpeptidsequenz in der natürlichen An ordnung. Terminationssignal und Polyadenylierungs stelle stammen vom Renningen. Durch Spaltung mit SalI konnte das Expressionssystem vom Vektoranteil getrennt werden.

c) Verknüpfung des Renningens mit dem α-S₁-Caseinpro motor, dem α-S₁-Signalpeptid sowie 3′-nichttrans latierten Sequenzen des α-S₁-Caseingens

Das Konstrukt p86 (Abb. 1) wurde mit BamHI und SalI gespalten und mit dem Oligonukleotidpaar BSI/BSII (BSI: 5′- GAT CTG GGG TCT CCT ACC ATC G -3′; BSII: 5′- TCG ACG ATG GTA GGA GAC CCC A -3′) ligiert (Abb. 3.7). BSI und BSII waren chemisch syntheti siert worden (Cyclone, Millingen-Biosearch). Damit wurde die BamHI-Schnittstelle entfernt (p87; Abb. 3.7). Das Konstrukt p87 wurde mit EcoRI lineari siert und mit dem Oligonukleotidpaar C3′RI/C3′RII ligiert (Abb. 3.7). Die Oligonukleotide C3′RI und C3′RII:

waren chemisch synthetisiert worden (Cyklone, Milligen-Biosearch) und enthielten den kodierenden Teil des neunten Exons 3′-seitig von der BamHI- Schnittstelle bis zum Stopkodon, daran anschließend den 3′-nichtkodierenden Bereich nach dem Stopkodon des α-S₁-Caseingens bis zur EcoRI-Schnittstelle (Position 724, Stewart et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12: 3895-3907). Durch Sequenzierung wurde bestätigt, daß der Klon p94 das Oligonukleotidpaar in der richtigen Orientierung enthielt. Das Kon strukt p94 wurde mit SalI partiell und BamHI voll ständig gespalten (Abb. 3.8). Ein 6,2 Kb Fragment enthielt den Vektoranteil sowie das vollständige Insert. Dieses Fragment wurde mit einem 10,7 Kb Fragment ligiert (Abb. 3.8), das nach Spaltung von p77 (Abb. 3.6) mit SalI (vollständig) und BamHI (partiell) erhalten wurde (Abb. 3.8). Dieses Frag ment enthielt das vollständige Expressionssystem des p77 mit Ausnahme des 3′-Anteils nach der BamHI- Schnittstelle im neunten Exon des Renningens. Das Konstrukt p99 (Abb. 3.8) enthielt nun ein Expres sionssystem, das dem von p77 (s. Beispiel 3b) ent sprach, bei dem jedoch der 3′-Bereich des Renningens unmittelbar nach dem Stopkodon ersetzt durch den unmittelbar an das Stopkodon des α-S₁- Caseingens anschließenden DNA-Bereich worden war. Dieser Bereich enthält neben einem Intron ein Exon, das die Signale für die Termination der Transkrip tion und für die Polyadenylierung enthielt. Auf diese Weise wurde eine Expressionskassette kon struiert, die 5′- und 3′-regulierende Sequenzen aus dem α-S₁-Caseingenbereich sowie für Prorennin ko dierende Sequenzen enthält. Sie kann durch SalI- Spaltung des Plasmids p99 vom Vektoranteil getrennt werden.

d) Expressionssystem für menschlichen IGF-I unter Kontrolle 5′- und 3′-regulierender DNA-Sequenzen aus dem bovinen α-S₁-Caseingenbereich

Das Konstrukt p19 (Abb. 1) wurde mit EcoRI partiell und BglII vollständig gespalten (Abb. 3.9). Ein 5,6 Kb Fragment wurde isoliert, das den α-S₁- Caseinpromotorbereich, das erste nichtkodierende Exon sowie Intron A bis Position 2898 (Anhang 1) enthielt. Mit diesem Fragment wurde ein anderes DNA-Fragment ligiert, das aus den 6 Oligonukleoti den IF1-IF6 bestand, die chemisch synthetisiert worden waren (Cyclone, Milligen-Biosearch).

Dazu waren zunächst die Oligonukleotide IF1 und IF2, IF3 und IF4 sowie IF5 und IF6 getrennt hybri disiert worden. Die Hybridisierungsansätze wurden zusammengegeben und ligiert (Abb. 3.10a), bevor sie mit dem aus p19 isolierten Fragment (s. o.) ligiert wurden (Abb. 3.9). Die Oligonukleotide IF1-IF6 enthalten die Information ab Position 2899 (Anhang 1) des bovinen α-S₁-Caseingens bis zum Ende des für das Signalpeptid kodierenden Bereichs (Position 2956). Direkt daran schließt im Leserah men ein DNA-Bereich an, der die Information für das reife menschliche IGF-1 trägt (Aminosäuresequenz: Tavekkol et al. 1988, Mol. Endo. 2: 648-681). Die Nukleinsäure-Kodons wurden nach der Benutzungshäu figkeit im Kaninchen ausgewählt (nach einer Methode von R. Lathe 1985, J. Mol. Biol. 183: 1-12). An diesen Bereich anschließend folgt ein Stopkodon, der 3′-nichttranslatierte Bereich des α-S₁-Casein gens (siehe Beispiel 3c) bis zur EcoRI-Schnitt stelle an Position 724 (Stewart et al. 1984, Nucl. Acids Res. 12: 3895-3907) sowie weitere, für den Klonierungsvorgang wichtige Sequenzen (Abb. 3.10b).

Durch Sequenzierung wurde bestätigt, daß der Klon p98 (Abb. 3.9) die korrekte Information enthielt. Das Konstrukt p98 wurde mit EcoRI partiell und BamHI vollständig gespalten. Das isolierte 5,9 Kb Fragment, das den Vektoranteil sowie das Insert von p98 enthielt, wurde mit dem 3,5 Kb EcoRI/BamHI Fragment aus p86 (Abb. 1) ligiert (Abb. 3.9).

Das Konstrukt p100 wurde durch Restriktionsschnitt charakterisiert, es enthielt die IGF-I-Expressions kassette in der korrekten Orientierung. Die IGF-I- Expressionskassette benutzt zur Steigerung der Expression die Spleißstellen des ersten und des letzten Introns des bovinen α-S₁-Caseingens sowie diese Introns selbst. In der Expressionskassette ist die für das reife IGF-I kodierende Sequenz über die Signalsequenz des α-S₁-Caseins mit dem α-S₁- Caseinpromotorbereich und dem ersten Intron des α-S₁-Caseingens verbunden. Im Anschluß an das Stopkodon folgt eine 3,5 Kb 3′-Sequenz des α-S₁- Caseingens, welche die DNA-Sequenz ab dem Stopkodon des α-S₁-Caseingens, das letzte Intron sowie das letzte, nichttranslatierte Exon des bovinen α-S₁- Caseingens und weitere nichttranslatierte 3′-Se quenzen enthält. In diesem Exon sind die Signale für die Polyadenylierung enthalten. Die Expres sionskassette kann vom Vektoranteil nach SalI- Spaltung abgetrennt werden.

e) Entwicklung einer Expressionskassette zur Synthese von Proteinen in der Milchdrüse transgener Tiere

Das Konstrukt p100 (Abb. 3.9) wurde mit EcoRI par tiell und mit BglIII vollständig gespalten (Abb. 3.11). Das linearisierte 9,1 Kb Fragment wurde mit dem hybridisierten Oligonukleotidpaar BgEI/BgEII ligiert. Die zueinander komplementären Oligonukleotide BgEI (5′- GAT CTA GAC TAG GGT AAG GGT TGC TG -3′) und BgEII (5′- AAT TCA GCA ACC CTT ACC CTA GTC TA -3′) waren chemisch synthetisiert worden (Cyclone, Milligen-Biosearch). Das daraus resultierende Konstrukt p115 (Abb. 3.11) enthielt das Oligonukleotidpaar. Durch partielle Spaltung von p115 mit EcoRI und nachfolgender Spaltung mit BglII konnte ein 9,1 Kb Fragment isoliert werden, das 5′- und 3′-Anteile des α-S₁-Caseingenbereichs enthielt. Über die BglII- und EcoRI-Schnittstellen können beliebige, für Proteine kodierende DNA- Fragmente mit dem aus p115 isolierten Fragment verknüpft werden und zur Expression in der Milch drüse transgener Tiere verwendet werden (s. nach folgendes Beispiel).

f) Expressionssystem für Rennin unter Kontrolle regu lierender 5′- und 3′-Sequenzen aus dem bovinen α-S₁-Caseingenbereich unter Verwendung eines syn thetischen Renningens

Aus 26 Oligonukleotiden wurde ein synthetisches Renningen gebildet, das die Information für die Bildung des Prorenning verknüpft mit dem Signal peptid bovinen α-S₁-Caseins enthielt. Die DNA-Se quenz des Prorennins wurde gemäß der Aminosäuresequenz (Hidaka et al. 1986, Loc. cit.) gewählt. Vorzugsweise wurden die natürlichen Kodons verwendet, aus klonierungstechnischen Gründen wur den jedoch Enzymschnittstellen hinzugefügt oder deletiert. Folgende Oligonukleotide wurden nach der Sequenz des kodierenden Stranges (Anhang 2a) ge bildet:

Nach der Sequenz des dazu komplementären Stranges (Anhang 2b) wurden die folgenden Oligonukleotide synthetisiert:

Das gesamte Renninkonstrukt wurde aus 4 Blöcken zusammengesetzt. Jeder Block bestand aus mehreren Paaren zueinander komplementärer Oligonukleotide (z. B. Block II: R07/R08 und R09/R10), die zunächst in getrennten Ansätzen hybridisiert wurden, bevor die Oligonukleotidpaare eines Blockes miteinander ligiert und kloniert wurden. Die Blöcke bestanden aus den folgenden Oligonukleotiden (Abb. 3.12): Block I: R01-R06; Block II: R07-R10; Block III: R11-R18 und Block IV: R19-R26.

Der Klonierungsvorgang ist schematisch in Abb. 3.13 dargestellt, sämtliche Konstrukte wurden durch Sequenzierung überprüft. Block I wurde über PstI- und KpnI-Schnittstellen in den Vektor pUC18 klo niert. Das daraus resultierende Konstrukt p110 wurde mit KpnI und SacI linearisiert und mit Block II ligiert. Das resultierende Konstrukt p111 ent hielt die Blöcke I und II (R01-R10). Block IV wurde in einen mit EcoRV und KpnI linearisierten Bluescript-Vektor (Fa. Stratagene) kloniert. Das daraus resultierende Konstrukt p112 wurde mit SmaI und EcoRV linearisiert und mit Block III ligiert. Das Konstrukt p113 enthielt die Blöcke III und IV (R11-R26). Das resultierende Konstrukt p111 wurde mit SmaI und SacI linearisiert und mit einem Fragment ligiert, das nach Spaltung von p113 mit SmaI und SacI erhalten wurde und den ligierten Blöcken III und IV entsprach. Das Konstrukt p114 enthielt die gesamte, für das α-S₁-Caseinsignal peptid und Prorennin kodierende genetische Infor mation.

Um diese genetische Konstruktion in die Expres sionskette p115 einzusetzen, wurde p115 mit EcoRI partiell und mit BglII vollständig gespalten (Abb. 3.14). Das linearisierte 9,1 Kb große Frag ment wurde mit dem 1,2 Kb Fragment ligiert, das nach Spaltung des Konstruktes p114 mit den Enzymen BglII und EcoRI erhalten wurde und die genetische Information für das Prorennin verknüpft mit dem α-S₁-Caseinsignalpeptid enthielt. Das Konstrukt p116 (Abb. 3.14) enthielt das synthetische Rennin gen, verknüpft mit dem α-S₁-Signalpeptid unter Kon trolle 5′- und 3′-regulierender Sequenzen aus dem bovinen α-S₁-Caseingenbereich. Nach Spaltung mit SalI konnte das Expressionssystem vom Vektoranteil getrennt werden.

Beispiel 4 Erstellung transgener Säugetiere

Die Erstellung transgener Säugetiere umfaßt die Her stellung injizierbarer DNA-Lösung, die Gewinnung be fruchteter Eizellen und Embryonen, die Mikroinjektion der DNA-Lösung in Vorkerne oder Kerne, den Transfer der injizierten Zygoten auf synchronisierte Empfängertiere und die Untersuchung der geborenen Tiere auf Integra tion. Dabei sind für die einzelnen Säugerspezies wie Kaninchen oder Rind einige speziesbedingte Unterschiede bei der Vorbereitung der Spender- und Empfängertiere, der Gewinnung und dem Transfer der Embryonen sowie der Mikroinjektion zu beachten.

a) Herstellung einer injizierbaren DNA-Lösung

Von Vektormolekülen abgetrennte DNA-Fragmente (über Gelelektrophorese), welche die vollständigen Ex pressionskonstrukte enthielten, wurden in steril filtriertem TE-Puffer (10 mM Tris, 0,2 mM EDTA, pH 7,6) zu einer Konzentration von 1000 Kopien pro Picoliter aufgenommen und für die Mikroinjektion verwendet.

b) Gewinnung von Embryonen aus Kaninchen

Geschlechtsreife Spenderkaninchen erhalten zur Superovulation eine einmalige Gabe von 10 bis 40 IE PMSG (Pregnant Mares' Serum Gonadotropin) pro kg Körpergewicht. Dieser Superovulation ging eine 21tägige Einzelhaltung oder eine Vorsynchronisation mit 120 IE HCG (Human Chorionic Gonadotropin) voraus. 72 bis 76 Stunden nach der PMSG-Injektion werden die Kaninchen zweimal im Abstand von einer Stunde künstlich besamt oder im Natursprung belegt. Unmittelbar danach erhalten sie zur Ovulationsin duktion 120 bis 180 IE HCG i. v. Die Embryogewin nung erfolgt 19 bis 21 Stunden nach der Belegung durch Schlachttötung der Spenderkaninchen. Die Eileiter werden mit Kulturmedium für Kaninchenem bryonen (BSM II+20% FKS oder PBS+20% FKS) durch Spülung vom Fimbrientrichter in Richtung Uterus hornende gewonnen. Falls erforderlich, wird der noch vorhandene Cumulus Oophorus durch Hyaluroni dase-Behandlung entfernt. Die Embryonen werden gewaschen und bis zur Mikroinjektion kultiviert.

c) Gewinnung von Embryonen aus Rindern

Rinder und Kühe werden nach gynäkologischer Unter suchung unabhängig vom Zyklusstand durch zweimalige PG-Applikation (PG-F2 α-Analog Estrumate, 500 mg Cloprostenol-Natriumsalz, i. m.) im Abstand von 12 Tagen synchronisiert. 48 bis 72 Stunden später sind die Tiere dann in Brunst. 11 bis 14 Tage nach die ser Brunst erhalten die Tiere morgens um 6 Uhr 2000 bis 3000 I.E. PMSG i. m. und nach 60 Stunden eine weitere PG-Applikation. Zwei Tage später kommen die Tiere in Brunst und werden um 18.00 Uhr besamt. Am darauffolgenden Tag um 6.00 Uhr erfolgt die zweite Besamung. Einen Tag später erfolgt zwischen 7.00 und 9.00 Uhr nach Schlachtung der Spendertiere die Gewinnung der Genitalorgane. Dazu wird nach dem Betäubungsschuß während des Ausblutens kranial des Euters ein etwa zwei handbreiter Schnitt in der Linie alba gesetzt und die Bauchhöhle geöffnet. Zervix und Gebärmutter mit Eileitern und Eier stöcken werden entnommen. Die Eileiter werden von den Eierstöcken freipräpariert und am uterotubalen Übergang abgetrennt. Eine 2,5 mm dicke Knopfkanüle wird in das Infundibulum eingeführt und fixiert. Der Eileiter wird mit etwa 20 ml PBS (Phosphat Buffer Saline) mit 20% FCS (Fetal Calf Serum) durchgespült. Die in einer Petrischale aufgefangene Spülflüssigkeit wird unter dem Mikroskop nach Ei zellen abgesucht. Die gefundenen Eizellen werden gewaschen, in Embryogläser verpackt und ins Labor transportiert.

d) Mikroinjektion der DNA-Lösung

Für die Mikroinjektion werden ein Inversmikroskop (Zeiss, ICM 405) zwei Leitz-Mikromanipulatoren und ein Injektionsgerät (Eppendorf) verwendet. Der eine Manipulator trägt eine Haltepipette, mit der der Embryo durch Unterdruck fixiert werden kann. Auf dem zweiten Mikromanipulator wird die mit DNA-Lö sung gefüllte Injektionspipette in einem Nanostep per fixiert und mit dem Injektionsgerät verbunden. Die Spitze der Injektionspipette hat einen Durch messer von 1 bis 2 µm. Zur Mikroinjektion wird die Pipettenspitze durch die Zona Pellucida, die Zell membran und die Kernmembran in das Kernlumen vor geschoben, und ca. 1 bis 2 pl DNA-Lösung werden dort abgesetzt. Die Volumenzunahme des Vorkerns signa lisiert eine erfolgreiche Mikroinjektion. Z. T. erfolgt auch eine Mikroinjektion der Kerne von Embryonen im Zweizellstadium. Die Mikroinjektion erfolgt in einem Mediumtropfen auf einem Deckglas oder in einer sogenannten Injektionskammer. Nach der Mikroinjektion werden die Eizellen oder Em bryonen bis zum Transfer kultiviert.

In Rindereizellen und in -embryonen sind aufgrund der dunklen lipidhaltigen Granula keinerlei Kern strukturen erkennbar. Durch Zentrifugation der Eizellen bzw. Embryonen in einer Eppendorf-Zentri fuge bei 15 000 g für ca. 3 Minuten können die Kerne sichtbar gemacht werden.

e) Kultur und Transfer der mikroinjizierten Eizellen und Embryonen bei Kaninchen

Empfängerkaninchen werden 21 Tage vor dem voraus sichtlichen Termin zur Zyklussynchronisation ein zeln aufgestallt und erhalten zur Induktion einer Pseudogravidität 120 IE HCG. Am Tag vor dem Trans fer erhalten die Empfängerkaninchen zur Ovula tionsinduktion 120 IE HCG i. v. Zum Transfer werden die Kaninchen mit 0,4 ml Rompun 2% pro kg/Körpergewicht und 0,8 ml Ketamin 10% pro kg/Körpergewicht narkotisiert. Nach Vorbereitung des Operationsfeldes und Entleerung der Harnblase durch transabdominalen Druck werden die Kaninchen in Rückenlage ausgebunden und in Schräglage fi xiert. Unmittelbar kaudal des Nabels wird die Bauchhöhle in einer Länge von ca. 4 bis 5 cm ge öffnet. Ovar, Eileiter und kraniales Uterushorn werden vorgelagert, und nach Kontrolle der Ovar reaktion werden die mikroinjizierten Embryonen mit Hilfe einer Transferpipette ca. 2 bis 2,50 cm tief in die Eileiterampulle transferiert. Pro Seite werden zwischen 8 und 15 Embryonen transferiert. Nach Verschluß der Bauchhöhle wird die Opera tionswunde durch eine Hautfaltendecknaht geschützt. Die Geburt der Jungtiere erfolgt 29 bis 31 Tage nach dem Transfer.

f) Kultur und Transfer der mikroinjizierten Eizellen und Embryonen bei Rindern - in vitro Kultur

Die Kultur der mikroinjizierten Zygoten wird in vitro durchgeführt. Für diese in vitro Kultur wer den Granulosazellen aus dem Kumulus oder Epithel zellen aus dem Eileiter mit den Embryonen kokultiviert. Als Medium verwenden wir das modifi zierte Parker Medium TCM 199. Von entscheidender Bedeutung ist, daß die Kultur in einer Gasatmo sphäre mit reduziertem Sauerstoffgehalt (5% O₂) und bei 5% CO₂ in 90% Stickstoff erfolgt. Die Kultur wird bei 39°C und maximaler Luftfeuchtigkeit durchgeführt. In 6 Tagen entwickeln sich die inji zierten Eizellen in der in vitro Kultur bis zu Morula/-Blastozystenstadien, die für den unblutigen Transfer geeignet sind.

- Transfer auf Empfängertiere

Die Empfängertiere erhalten gleichzeitig mit den Spendertieren am Tag 2 eine PGF-2-Injektion zur Zyklussynchronisation. Eine Sedierung der Empfän gertiere (6,8 mg Acepromazinmaleat pro 100 kg Kör pergewicht) und eine kleine Epiduralanästhesie (Lidocain 2%ig) erleichtert die Durchführung der Embryoübertragung. Der unblutige Transfer wird mit Hilfe eines sterilen Transfergerätes (Firma Wörrlein) vorgenommen, wobei der Embryo möglichst tief in das ipsilaterale Uterushorn übertragen wird. Nach dem Transfer erhalten die Empfänger Clenbuterolhydrochlorid als Uterustelaxans. Fünf bis sechs Wochen nach dem Transfer können die Empfängertiere durch rektale Palpation auf Träch tigkeit untersucht werden.

Beispiel 5 Untersuchung der Integration von Konstrukten im Kanin chengenom nach Mikroinjektionsexperimenten

Von Kaninchen, die z. B. mit dem Konstrukt p77 (Beispiel 3b) gemäß Beispiel 4 erzeugt worden waren, wurden zur Untersuchung Gewebeproben (meist Schwanz) verwendet. 20 µg der aus dem Gewebe isolierten DNA wurden mit 100 U EcoRI gespalten und zusammen mit einer DNA-Probe eines negativen Kaninchens einer Gelelektrophorese unterzogen. Die über ein Agarosegel aufgetrennten Fragmente wurden mit einer Vacu-Blot-Apparatur (Pharmacia - LKB) über Nitrocellulosefilter (Schleicher+Schuell, BA85) über tragen und mit radioaktiv markierten p26 (Abb. 1) hybridisiert. Das transgene Kaninchen # 2848 konnte dadurch leicht identifiziert werden (Abb. 4).

Beispiel 6 Untersuchung der Integration von Konstrukten im Rinder genom nach Mikroinjektionsexperimenten

Die Untersuchung wurde analog Beispiel 5 durchgeführt, jedoch wurde zur Hybridisierung der Filter eine radio aktive Probe verwendet, die frei von Repititionen war und aus dem α-S₁-Caseinpromotor entnommen war (p26, Abb. 1). Durch Analyse der Fragmentgrößen konnte das endogene hybridisierende Fragment von dem des Transgens unterschieden werden.

Beispiel 7 Analyse der Nachkommen transgener Tiere

Die Analyse wurde durch Southern-Blot-Experimente wie unter Beispiel 5 durchgeführt. Zur Kontrolle wurde auch DNA aus negativen Kaninchen und dem transgenen Elterntier (# 2848, s. Beispiel 5) untersucht (Abb. 5). Anhand des Restriktionsspaltmusters wären etwaige gene tische Umlagerungen zu erkennen gewesen, die jedoch nicht auftraten.

Beispiel 8 Untersuchung der Milch transgener laktierender Kanin chen, die mit Konstrukt p43 erzeugt wurden a) Rennin-Aktivitätsrest

0,5 ml Milch eines transgenen laktierenden Kanin chens, das mit p43 (siehe Beispiel 3a) erzeugt worden war, wurden mit 0,5 ml Ca-Acetat-Puffer (10 mM CaCl₂, 100 mM NaAc, pH 6) und 20 Minuten bei 4°C und 3000 g zentrifugiert. Anschließend wurde die Fettphase abpipettiert und verworfen. Die restliche Suspension (ca. 0,8 ml) wurde mit HCl auf pH 2,5 eingestellt und die ausgefallenen Proteine abzentrifugiert (RT, 5 min, 13 000 g). Die autoka talytische Aktivierung des Rennins wurde 90 Minuten bei 30°C durchgeführt. Anschließend wurde mit NaOH der pH-Wert auf 6,5 eingestellt. Der erneut ent standene Niederschlag wurde abzentrifugiert (RT, 5 min, 13 000 g) und verworfen. 0,5 ml der klaren Lösung wurden mit 0,5 ml käuflicher Vollmilch (pasteurisiert) vermischt und bei 30°C inkubiert und die Zeit bis zum Beginn der Gerinnung be stimmt.

So behandelte Milch transgener Kaninchen zeigte Gerinnungsaktivität im Gegensatz zu ebenso behan delter Milch negativer Kontrolltiere.

b) Immunnachweis von Prorennin und Rennin in der Milch transgener Tiere, welche mit dem Konstrukt p43 erzeugt wurden

Nach a) behandelte Milchproben sowie unbehandelte Proben, denen das Fett entnommen worden war (4°C, 10 min, 3000 g), wurden auf denaturierenden PAA- Gelen aufgetrennt (s. Ausubel et al. 1987, Current Protocols in Molekular Biology, John Wiley & Sons, Punkt 10.2.1). Die Proteine wurden anschließend mit einem Elektroblotgerät (Pharmacia - LKB) auf Nitrocellulosefilter (BA85, Schleicher+Schuell) übertragen. Transferiertes Prorennin und Rennin wurden mit polyklonalen Antikörpern detektiert, die nach Immunisierung von Kaninchen mit Rennin (Sigma) gewonnen worden waren. Als Detektionssystem wurde an Protein A gekoppelte Horse-radish Peroxidase (Amersham) verwendet. (Transfer und Immunodetek tion: Ausubel et al. 1987, loc cit, Punkte 10.8.1- 10.8.4).

Transgene Tiere enthielten 0,2 bis 0,6 mg/ml Pro rennin in ihrer Milch. Laktierende Nachkommen, die ebenfalls das Konstrukt p43 in ihrem Genom ent hielten, produzierten vergleichbare Mengen Proren nin.

Beispiel 9 Untersuchung der Milch transgener laktierender Kanin chen, die mit Konstrukt p77 (Beispiel 3b) erzeugt wur den

a) Rennin-Aktivitätstest
Der Test wurde analog Beispiel 8a) durchgeführt. Eine Gerinnungsaktivität konnte ebenfalls nur mit der Milch transgener Tiere erzielt werden.

b) Immunnachweis von Prorennin und Rennin in der Milch transgener Tiere, welche mit dem Konstrukt p77 erzeugt wurden.
Der Nachweis verlief analog Beispiel 8b).
Transgene Tiere enthielten 1 bis 4 mg/ml Prorennin in ihrer Milch. Laktierende Nachkommen, die eben falls das Konstrukt p77 in ihrem Genom enthielten, produzierten vergleichbare Mengen Prorennin.

Claims

1. Rekombinantes DNA-Konstrukt zur Expression von Proteinen in der Milchdrüse transgener Säugetiere und nachfolgender Sekretion in die Milch,
dadurch gekennzeichnet,
daß es die folgenden DNA-Bereiche in der angege benen Reihenfolge und in funktioneller Verknüpfung zueinander enthält:

(1) eine Transkriptions-Kontrollregion aus einem oder mehreren spezifisch in der Milchdrüse aktivierten Genen,
(2) ein erster DNA-Sequenzbereich, der nicht translatiert wird,
(3) eine DNA-Sequenz, die für ein Signalpeptid kodiert, das eine Sekretion in die Milch er laubt,
(4) eine DNA-Sequenz, welche die genetische In formation für ein heterologes Peptid oder ein Protein enthält und
(5) eine DNA-Sequenz, die eine Polyadenylierungs stelle und ein Transkriptions-Terminations signal enthält.

2. DNA-Konstrukt nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkriptions-Kontrollregion aus einem oder meh reren Genen der Caseinfamilie stammt.

3. DNA-Konstrukt nach Anspruch 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Transkrip tions-Kontrollregion aus dem α-S₁-Caseingen stammt.

4. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß der erste nicht-translatierte Bereich das Exon I aus einem Gen der Caseingenfamilie, vorzugsweise dem α-S₁-Caseingen, enthält.

5. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß der erste nicht-translatierte Bereich das Intron aus einem Gen der Caseingenfamilie, vor zugsweise dem α-S₁-Caseingen, enthält.

6. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß die für ein Signalpeptid kodierende DNA-Sequenz die Signalsequenz des zu exprimierenden Proteins oder die Signalsequenz eines in die Milch sekre tierten Proteins ist.

7. DNA-Konstrukt nach Anspruch 6, dadurch gekennzeichnet, daß die Signalse quenz aus dem α-S₁-Caseingen stammt.

8. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz (4) enthält, die für ein Peptid oder ein Protein in aktiver Form ohne Fusionsanteil kodiert.

9. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz (4) enthält, die für ein Peptid oder ein Protein in einer inaktiven Vorläu ferform ohne Fusionsanteil kodiert.

10. DNA-Konstrukt nach Anspruch 8 oder 9, dadurch gekennzeichnet, daß es eine DNA-Sequenz (4) enthält, die für das Prorennin aus dem Rind oder den menschlichen IGF-I kodiert.

11. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 10, dadurch gekennzeichnet, daß es zwischen den DNA-Sequenzen (4) und (5) einen zweiten nicht-translatierten Sequenzbereich ent hält.

12. DNA-Konstrukt nach Anspruch 11, dadurch gekennzeichnet, daß der zweite nicht-translatierte DNA-Sequenzbereich den Exon/Intron-Übergang zwischen dem vorletzten Exon und dem letzten Intron einem Gen der Caseingenfa milie, vorzugsweise des α-S₁-Caseingens, enthält.

13. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß es an einem 3′-Ende noch zusätzliche nicht- transkribierte und nicht-translatierte DNA-Sequen zen enthält.

14. DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß es an seinem 5′- und 3′-Ende jeweils eine Re striktionsschnittstelle eines oder mehrerer Enzyme enthält, die innerhalb des DNA-Konstruktes keine Schnittstelle besitzen.

15. Rekombinanter Vektor, dadurch gekennzeichnet, daß er ein DNA- Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 ent hält.

16. Verfahren zur Gewinnung von Proteinen aus der Milch transgener Tiere, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rekombinierte DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder einem rekombinanten Vektor nach Anspruch 15 in die Keimbahn eines Tieres einbringt und das Protein auf übliche Weise aus der Milch des Tieres oder seiner weiblichen Nachkommen isoliert.

17. Verfahren nach Anspruch 16, dadurch gekennzeichnet, daß man eine rekombinante DNA nach einem der Ansprüche 1 bis 14 durch Mikroinjektion in die Keimbahn eines Tieres einbringt.

18. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tier verwendet, in dessen Milch kein endogenes, dem zu exprimierenden Protein homologes Protein vorliegt.

19. Verfahren nach Anspruch 16 oder 17, dadurch gekennzeichnet, daß man ein Tier verwendet, in dessen Milch ein endogenes, dem zu exprimierenden Protein vollstän dig homologes Protein vorliegt.

20. Verfahren nach Anspruch 16 zur Gewinnung eines aus zwei oder mehreren verschiedenen Untereinheiten zusammengesetzten Proteinkomplexes, dadurch gekennzeichnet, daß man transgene Tiere verwendet, die zwei oder mehrere verschiedene DNA-Konstrukte nach einem der Ansprüche 1 bis 13 in ihrem Genom integriert be sitzen.

21. Verfahren zur Herstellung transgener Tiere, die zwei oder mehrere verschiedene Fremdgene in ihrem Genom integriert besitzen, dadurch gekennzeichnet, daß man

(1) zwei transgene Tiere der gleichen Art, die aber jeweils ein oder mehrere verschiedene Fremdgene in ihrem Genom integriert besitzen, auf übliche Weise herstellt, diese Tiere oder deren Nachkommen miteinander kreuzt und aus den Nachkommen diejenigen transgenen Tiere auswählt, welche gleichzeitig für die ver schiedenen Fremdgene beider Elterntiere posi tiv sind, oder
(2) ein transgenes Tier auf übliche Weise her stellt, wobei man ein Fremdgen in die Keimbahn eines Tieres einbringt, das bereits eines oder mehrere andere Fremdgene in seinem Genom in tegriert besitzt.

22. Verfahren nach Anspruch 21, dadurch gekennzeichnet, daß man zum Ein bringen eines Fremdgens ein DNA-Konstrukt nach einem der Ansprüche 1 bis 14 oder einen Vektor nach Anspruch 15 verwendet.

23. Milch eines transgenen Tieres, das ein oder mehrere rekombinante DNA-Konstrukte nach einem der Ansprü che 1 bis 14 in seinem Genom integriert enthält.

24. Rekombinantes DNA-Konstrukt, dadurch gekennzeichnet, daß es die DNA- Bereiche (1), (2), (3) und (5) nach einem der An sprüche 1 bis 7 und anstelle des DNA-Bereichs (4), welcher die genetische Information für ein hetero loges Peptid oder ein Protein enthält, eine Klo nierungsstelle enthält.

25. DNA-Konstrukt nach Anspruch 24, dadurch gekennzeichnet, daß es einen oder mehrere weitere DNA-Bereiche nach einem der Ansprüche 11 bis 14 enthält.

26. DNA-Konstrukt nach Anspruch 24 oder 25, dadurch gekennzeichnet, daß die Klonierungsstelle die Schnittstellen für mehrere Restriktionsenzyme umfaßt.