WO2017209389A1 - 신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 thy1 유전자 프로모터 - Google Patents

신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 thy1 유전자 프로모터 Download PDF

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최영석
이옥희
김영호
김은영
박미선
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제주대학교 산학협력단
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    • C12N2830/008—Vector systems having a special element relevant for transcription cell type or tissue specific enhancer/promoter combination

Definitions

  • the present invention relates to a Thy1 gene promoter specifically expressed in neurons.
  • a promoter is a genome region that is connected to the upper side of a gene, and controls the gene so that the gene is linked to mRNA.
  • the promoter is activated by combining various general transcription factors, and generally has base sequences such as TATA box and CAT box that regulate gene expression. Proteins necessary for the basic metabolism of the living body must maintain a constant concentration in the cell, so the promoters linked to these genes are always activated by the action of the general transcription factor.
  • proteins that do not play a role in normal life and require function only under special circumstances are linked with an inducible promoter that induces expression of the structural gene.
  • Inducible promoters are activated by the binding of specific transcription factors activated during development of the organism or by external stimuli from environmental factors from the environment. That is, in the case of producing a brain disease model pig, a gene expression system may work well when a promoter capable of inducing disease-related genes to be specifically expressed in pig brain or nerve cells is introduced together.
  • Another object of the present invention is to provide a transformed cell line using a Thy1 gene promoter specifically expressed in neurons and a recombinant vector comprising the same.
  • Thy1 gene promoter that specifically expresses in neurons, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • Thy1 gene promoter that specifically expresses neurons, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 4.
  • the promoter may comprise a binding site of the PBX and CREB transcription factors.
  • a primer set consisting of the sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 and for amplifying the promoter of claim 1 is provided.
  • a primer set consisting of the sequences of SEQ ID NO: 5 and SEQ ID NO: 6 and for amplifying the promoter of claim 2 is provided.
  • a recombinant expression vector comprising a Thy1 gene promoter having a nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 or SEQ ID NO: 4 and a gene related to Alzheimer's disease is provided.
  • the Alzheimer's disease-related gene may be an APP mutant gene, a Tau mutant gene or a PS1 mutant gene.
  • a mammalian somatic cell is transformed by introducing the recombinant expression vector.
  • a mammalian fertilized egg injected with the recombinant expression vector is provided.
  • a transgenic mammal obtained by implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother is provided.
  • a step of constructing a first vector comprising a restriction enzyme site and promoter and gene clusters are removed; Preparing a recombinant second vector by inserting the promoter, the APP gene, the PS1 gene, and the Tau gene of claim 1 into the second vector, respectively; Inducing mutations in each of the APP gene, PS1 gene, and Tau gene on the recombinant second vector; And inserting the recombinant second vector into the first vector.
  • preparing the recombinant expression vector comprising: Separating somatic cells from pigs; Introducing the expression vector into the somatic cell; Selecting and culturing the cloned somatic cells into which the expression vector is introduced; Removing the nucleus of the egg collected from the surrogate mother and fusing the cloned somatic cell; Transplanting the fused cloned embryos into surrogate mother; provides a method of producing a transgenic pig.
  • Promoters specifically expressed in neurons of the present invention derived from pigs, have high activity in brain cells or neurons, and thus may be used to regulate expression of target genes.
  • pigs are highly similar to human genes and have many similarities in terms of metabolism. Therefore, the promoter of the present invention can be used as a disease model after being transformed with a recombinant vector. Can be.
  • Figure 1 shows the phylogenetic similarity of the Thy-1 gene via the ClustalV method.
  • Figure 2 is an analysis of the Thy-1 gene similarity between humans and pigs using zPicture.
  • Figure 3 is an analysis of the Thy-1 gene similarity between pigs and mice using zPicture.
  • Figure 4 shows the positions of transcriptional regulators that bind to the Thy1 gene promoter.
  • Figure 5 shows a primer for the production of luciferase reporter vector.
  • Figure 6a shows the position of the Thy1 promoter DNA inserted in the Luciferase reporter vector.
  • 6B is a schematic diagram of luciferace reporter vectors for measuring activity of the Thy1 promoter.
  • 6B is a schematic diagram of luciferace reporter vectors for measuring activity of the Thy1 promoter.
  • Figure 7 is a graph showing the brain cell specific activity of the pig Thy1 promoter measured by Luciferase assay.
  • 8A is a schematic diagram of a reporter vector (pThy1-EGFP vector) for measuring activity of the Thy1 promoter.
  • 8B is a schematic diagram of a reporter vector (pThy1-EGFP vector) for measuring the activity of the Thy1 promoter.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph showing the intracellular Thy1 promoter and CMV promoter activity.
  • 10A is a graph showing the degree of Thy1 expression in PC12 neuronal cell lines.
  • 10B is a graph showing the degree of Thy1 expression in NIH3T3 fibroblasts.
  • 10C is a graph showing the degree of Thy1 expression in 293T embryonic kidney cells.
  • 11A is a graph analyzing the expression level of GFP in PC12 cells.
  • 11B is a photograph showing the expression level of GFP in PC12 cells.
  • Figure 13 is a graph showing the activity after transfection of each vector to 293T cells.
  • 15 is a schematic diagram showing the one-dimensional structure of the multi-cystronic vector of pTet retrovirus prepared to express hAPP, hTau and PSEN1 genes using the Thy1 promoter.
  • 16 is a schematic diagram showing the cyclic structure of the multi-cystronic vector of the pTet retrovirus prepared to express the hAPP, hTau and PSEN1 genes using the Thy1 promoter.
  • Recombinant refers to a cell in which a cell replicates a heterologous nucleic acid, expresses the nucleic acid, or expresses a protein encoded by a peptide, a heterologous peptide, or a heterologous nucleic acid.
  • Recombinant cells can express genes or gene fragments that are not found in their natural form in either the sense or antisense form.
  • Recombinant cells can also express genes found in natural cells, but the genes have been modified and reintroduced into cells by artificial means.
  • vector is used to refer to a DNA fragment (s), a nucleic acid molecule, that is delivered into a cell. Vectors can replicate DNA and be reproduced independently in host cells.
  • carrier is often used interchangeably with “vector”.
  • expression vector refers to a recombinant DNA molecule comprising a coding sequence of interest and a suitable nucleic acid sequence necessary to express a coding sequence operably linked in a particular host organism. Promoters, enhancers, termination signals and polyadenylation signals available in eukaryotic cells are known.
  • the mouse Thy1 promoter which has been mainly used in the past, has markedly low similarity between the pig or human Thy1 promoter, whereas the pig Thy1 promoter and the human Thy1 promoter have very high similarities (see Example 1).
  • the Thy1 promoter is likely to be used in the future.
  • a Thy1 gene promoter that specifically expresses in neurons, including the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1.
  • the base sequence size of SEQ ID NO: 1 is 500 bp, but any base sequence including the same may be used without limitation.
  • a promoter having a nucleotide sequence of 500 bp to 2579 bp may be used.
  • SEQ ID NO: 4 shows the nucleotide sequence of the promoter having a size of 2579 bp in the -4858 to -2279 position. Referring to SEQ ID NO: 1 and SEQ ID NO: 4, a promoter having a base sequence of 500 bp to 2579 bp in size may be used.
  • variants of such promoter sequences are included within the scope of the present invention.
  • a variant is a nucleotide sequence that changes in base sequence but has similar functional properties to that of SEQ ID NO: 1.
  • the promoter may include at least 70%, at least 80% or at least 90%, or at least 95% sequence homology with the base sequence of SEQ ID NO: 1, respectively.
  • the "% sequence homology" for a polynucleotide is identified by comparing two optimally arranged sequences with a comparison region, wherein part of the polynucleotide sequence in the comparison region is the reference sequence (addition or deletion) for the optimal alignment of the two sequences. It may include the addition or deletion (ie, gap) compared to).
  • the promoter may comprise a binding site of the PBX and CREB transcription factors.
  • the PBX and CREB transcriptional regulators are transcription factors known to be associated with brain diseases.
  • a primer set consisting of the sequences of SEQ ID NO: 2 and SEQ ID NO: 3 and for amplifying the promoter of claim 1 is provided.
  • a recombinant expression vector comprising a Thy1 gene promoter having the nucleotide sequence of SEQ ID NO: 1 and an Alzheimer's-related gene is provided.
  • the expression vector but can be used without limitation, if it can be used to efficiently induce the expression of the Alzheimer-related protein specific to neurons, preferably can be used retroviral vector have.
  • pTet-CKOS can be used.
  • the expression vector may further include an enhancer to further improve the expression of a gene, for example, may include a Cytomegalo virus (CMV) enhancer.
  • CMV Cytomegalo virus
  • the Alzheimer's disease-related gene may be an APP mutant gene, a Tau mutant gene or a PS1 mutant gene.
  • APP, Tau, and PS1 which are known as the leading causes of Alzheimer's disease, contribute to the overexpression of ⁇ -amyloid and the aggregation of Tau protein, the pathogenesis causing Alzheimer's disease.
  • ⁇ -amyloid is produced through a proteolysis process from amyloid precursor protein (APP).
  • APP amyloid precursor protein
  • Preprotein APP is a protein with one transmembrane domain, expressed by several isotypes by alternating splicing, and known to go through two metabolic pathways in cells. Mutations have been found in this APP protein in patients with familial Alzheimer's disease.
  • PS1 is a protein with eight transmembrane domains that plays an important role in development and is known to act as a ⁇ -secretase itself or as a member of a complex. More than 45 mutations that cause familial Alzheimer's disease have been reported throughout PS1, and these mutations have also been shown to increase the amount of ⁇ -amyloid.
  • Alzheimer's disease caused by ⁇ -amyloid is accompanied by a process of neuronal cell damage caused by hyperphosphorylation of Tau protein, and several kinases are known to act on hyperphosphorylation of Tau protein.
  • Tau's tangle formation also plays a role in damaging neurons, and mutations in Tau have been found in which tangles form well.
  • the recombinant expression vector may further include a 2A sequence between each of the APP mutant gene, the Tau mutant gene, and the PS1 mutant gene. In one embodiment, further comprising a 2A sequence between the APP mutant gene and the tau mutant gene, and may further include a 2A gene between the tau mutant gene and the PS1 mutant gene.
  • the 2A gene sequence encodes 18 to 22 amino acids, and four amino acids, Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G) and Proline (P), which are located at the terminal, are importantly conserved among species. Amino acids. When the sequences are synthesized into peptides, self-cleavage tends to occur. Due to this property, when Ribosome reaches the genetic code that encodes N, P, and G located at the end of 2A sequence during protein transcription, NPG is recognized in order to make peptide bond and then the next amino acid proline Instead of bringing the prolyl-tRNA with Proline bound to the coding code, we get the releasing factor (RF) factor.
  • RF releasing factor
  • the coded code operates normally to proceed to the next protein transcription.
  • one gene can be used to express several genes.
  • the recombinant expression vector of the present invention can express these genes simultaneously by inserting these 2A sequences between each of the three genes.
  • the APP mutant gene, amino acid 595, amino acid 596, or both may be mutated, and the tau mutant gene may be mutated amino acid 243.
  • the PS1 mutant gene, amino acid 146, amino acid 286, or both may be mutated.
  • the APP mutant gene may be a gene in which the amino acid Lys of 595 of APP695 is Asn and the amino acid Met of Lys of 596 is Lys, and the tau mutant gene of Lys of amino acid 243 Phe is Lys. It may be a mutated gene.
  • the PS1 mutant gene may be a gene mutated to Leu at amino acid 146 and Leu to amino acid Pro at 286.
  • a mammalian somatic cell is transformed by introducing the recombinant expression vector.
  • the cells can be used without limitation except for humans as long as they are derived from mammals. However, in the case of mice that are mainly used in the past, metabolism is very fast and life changes are very different from that of humans, so it is difficult to use as an accurate disease model. Therefore, an animal having a similar size to a human body and having a similar form in terms of metabolism is preferred, and pigs are most preferred among them.
  • a mammalian fertilized egg injected with the recombinant expression vector is provided.
  • a transgenic mammal obtained by implanting the fertilized egg into the uterus of the surrogate mother is provided.
  • a step of constructing a first vector comprising a restriction enzyme site and promoter and gene clusters are removed; Preparing a recombinant second vector by inserting the promoter, the APP gene, the PS1 gene, and the Tau gene of claim 1 into the second vector, respectively; Inducing mutations in each of the APP gene, PS1 gene, and Tau gene on the recombinant second vector; And inserting the recombinant second vector into the first vector.
  • preparing the recombinant expression vector comprising: Separating somatic cells from pigs; Introducing the expression vector into the somatic cell; Selecting and culturing the cloned somatic cells into which the expression vector is introduced; Removing the nucleus of the egg collected from the surrogate mother and fusing the cloned somatic cell; Transplanting the fused cloned embryos into surrogate mother; provides a method of producing a transgenic pig.
  • Figure 1 shows the phylogenetic similarity of the Thy-1 gene via the ClustalV method.
  • Thy1 users of humans and pigs are very close to the phylogenetic tree compared to the Thy1 gene of mice.
  • the comparison tool used the zPicture analysis tool based on the pairwise sequence aligner.
  • Human, pig and mouse Thy1 genes consist of four exons, and ATG codons that start expressing proteins are located in the second exon.
  • the ATG of ATG was named as +1 position, and the nucleotide in front of it was named as "-number” and the back of A as "+ number”.
  • the gene sequence that regulates the Thy1 gene to be specifically expressed in brain tissue is important from the front of the first exon to the front of the second exon (-3463 to -1).
  • Fig. 2 shows the analysis of Thy-1 gene similarity between human and pig using zPicture
  • Fig. 3 shows the analysis of Thy-1 gene similarity between pig and mouse using zPicture.
  • the DNA sequence similarity in front of the first exon and the first intron (intro) sequence is similar.
  • the overall DNA sequence similarity is inferior.
  • the similarity between the pig and human Thy1 gene is very high, and among them, the gene sequence located at -4858 to -2278 of Thy1 is likely to be involved in the regulation of Thy1 expression.
  • Example 2 the character list of predicted transcription that binds to the human and pig Thy1 gene promoter>
  • RVista 2.0 was used as an analytical tool to investigate predicted transcriptional regulators that bind to human and porcine Thy1 gene promoters.
  • Table 1 below shows the transcriptional regulators that bind to the Thy1 gene promoter.
  • Figure 4 shows the positions of transcriptional regulators that bind to the Thy1 gene promoter.
  • transcription regulators such as TBX5, PBX, CREB, AREB6, AP2, E2F1, HSF1, SMAD4, EGR1, EGR2, EGR3, etc., bind in about 1 kb to the first exon of the pig Thy1 gene.
  • PBX and CREB transcriptional regulators are factors known to be associated with brain diseases. Therefore, the promoter region of pig Thy1 from -3858 to -2858, especially -3380 to -2880, is important for the expression of Thy1 specifically in brain tissue.
  • Luciferase reporter vectors were constructed to find pig Thy1 promoter DNA sequences that induce tissue-specific expression in real cells. Primers were designed to create -4858 / -2279_Luc vectors with Thy1 genes -4858--2279 in front of luciferase cDNA and -2578 / -40_Luc vector with -2578--40.
  • SEQ ID NO: 7 shows the nucleotide sequence (2579 bp) at the positions of the Thy1 promoters -4858 to -2279
  • SEQ ID NO: 8 shows the nucleotide sequence (2538 bp) at the positions of the Thy1 promoter -2578 to -40.
  • Figure 5 shows a primer for the production of luciferase reporter vector.
  • the primer was used to PCR the pig chromosome into a template to synthesize Thy1 promoter DNA having -4858 to -2279 sequences and -2578 to -40 sequences, and TA to the pTOP TA V2 vector. Cloned. The synthesized DNA sequence was confirmed to be correctly synthesized through sequencing.
  • the position of the Thy1 promoter DNA inserted into the Luciferase reporter vector may be roughly known.
  • SacI / NheI restriction enzyme and the -2578 / -40_Luc vector were cut from pTOP and inserted into the pGL4.10 [luc2] vector using KpnI / XhoI restriction enzyme.
  • SEQ ID NO: 9 shows the nucleotide sequence (4242 bp) of the pGL4.10 [luc2] vector.
  • 6B and 6C are schematic diagrams showing restriction enzymes used with each vector.
  • Luciferase assay was performed to investigate whether the synthesized two Thy1 promoters show actual neuron-specific expression patterns.
  • Representative neuronal lines SH-SY5Y and PC12 were transfected with Lipofectamine 2000 with 500 ng of -4858 / -2279_Luc or -2578 / -40_Luc vector with 50 ng of pRL-TK vector.
  • 500 ng of basic pGL4.10 [luc2] was transfected.
  • promoter activity was investigated using 293T cells as a negative control cell line for neurons.
  • Figure 7 is a graph showing the brain cell specific activity of the pig Thy1 promoter measured by Luciferase assay.
  • non-neuronal 293T cells had low activity of two Thy1 promoters, whereas SH-SY5Y and PC12 neuron lines had high promoter activity of -4858 / -2279_Luc.
  • the promoter activity does not appear to be specific to the neuronal cell line, neuronal specific Thy1 expression is important for the DNA sequence present at the -4858 ⁇ -2279 region of the Thy1 promoter.
  • an EGFP expression vector and a DsRed2 expression vector subjected to transcriptional regulation of the Thy1 promoter -4858 / -2279 were prepared.
  • 8A and 8B are schematic views of reporter vectors for measuring activity of the Thy1 promoter.
  • Thy1 promoters from -4858 to -2279 were synthesized by plasmid PCR using -4858 / -2279_Luc as a template, and the Thy1 promoters from -4858 to -2279 were removed after removing the CMV promoters of pEGFP1 and pDsRed2 with AseI and NheI restriction enzymes.
  • PThy1-EGFP vector (FIG. 8A) and pThy1-DsRed2 vector (FIG. 8B) were prepared by inserting.
  • SEQ ID NO: 10 shows the nucleotide sequence (4733 bp) of the pThy1-EGFP vector
  • SEQ ID NO: 11 shows the nucleotide sequence (4689 bp) of the pThy1-DsRed2 vector.
  • the primers used to prepare the EGFP expression vector and DsRed2 expression vector are as follows.
  • 293T cells were transfected with pEGFP1, pThy1-EGFP, pDsRed2, and pThy1-DsRed2, using Lipofectamin2000, and observed by fluorescence microscopy two days later.
  • FIG. 9 is a fluorescence micrograph showing the intracellular Thy1 promoter and CMV promoter activity.
  • the expression of GFP and DsRed proteins regulated by the CMV promoter was very high in 293T cells, whereas the GFP and DsRed proteins under the Thy1 promoter showed relatively low expression rates. This is because 293T cells without Thy1 expression lack transcriptional regulators for activation of the Thy1 promoter.
  • Thy1 protein expressed in 293T embryonic kidney cells, NIH3T3 fibroblasts, and PC12 neuronal cell lines the cultured cells were treated with 0.25% trypsin-EDTA and separated into single cells. Produced in mice). Anti-mouse antibody conjugated with FITC was reacted and flow cytometry analysis was performed.
  • Figure 10a is a graph showing the level of expression of each Thy1 in PC12 neuronal cell line, Figure 10b NIH3T3 fibroblasts, Figure 10c 293T embryonic kidney cells.
  • Thy1 protein was hardly expressed in NIH3T3 and 293T, but the expression of Thy1 was very high in PC12 neurons of FIG. 10A.
  • the activity of the transcriptional regulator for Thy1 expression in PC12 cells is high, indicating that the promoter of the present invention plays a very large role in neuronal specific expression.
  • PEGFP1 cmv promoter
  • pThy1-EGFP Thy1 promoter
  • FIG. 11A is a graph analyzing the expression level of GFP in PC12 cells
  • FIG. 11B is a photograph showing the expression level of GFP in PC12 cells.
  • Thy1 promoter region was PCR synthesized, cut with SacI / NheI restriction enzyme and cloned into pGL4.10 [luc2].
  • Luciferase reporter vector 500 ng
  • pRL-TK 50 ng
  • FIG. 13 is a graph showing the activity after transfection of each vector to 293T cells
  • FIG. 14 is a graph showing the activity after transfection of each vector to PC12 cells.
  • the activity of the promoter was analyzed to be low in 293T cells.
  • the activity of the Thy1 promoter was very high, but -2880 / In the case of -2279-Luc, the activity of the promoter was significantly reduced. In other words, this indicates that about 500 bp of DNA sequence from -3380 to -2880 of the Thy1 promoter that induces neuronal specific expression is important.
  • Example 8 Alzheimer's disease gene is introduced pTet retroviral multi-completion of the cyst ronik vector>
  • PTet-CKOS a vector of retroviruses, was used to remove the TRE minimal CMV promoter and CKOS gene cluster present in this vector.
  • the vector was modified with restriction enzyme sites such as SwaI, ClaI, PacI and NotI.
  • APP Alzheimer's disease mutant gene
  • PS-1 presenilin gene
  • Tau Tau gene
  • a site-directed mutagenesis kit (Stratagene) was used for this purpose.
  • APP the APP695 type gene expressed in cerebral neurons was used, and two double mutations were introduced at Nos. 595 and 596 where a family mutation of Alzheimer's disease was found. These mutations are known to produce more ⁇ -amyloid 42 forms.
  • the amino acid variation was named K595N, N596M, respectively.
  • Presenilin also introduced two amino acid mutations. Mutations of amino acids 146 and 286 were introduced and named M146L and P286L, respectively. In the case of Tau, only one amino acid number 243 was mutated and named P243L.
  • the three genes were transcribed into one mRNA, and then linked to each other in 2A sequences to separate them into independent peptides when they were translated into proteins.
  • Thy1 promoter was inserted into the retroviral vector using two restriction enzymes, SwaI and ClaI, followed by pTet-porcine TYH1 pro-APPsw with three mutant genes in tandem.
  • the completed recombinant expression vector was identified by DNA sequence of the total 13,874bp.
  • SEQ ID NO: 12 shows the nucleotide sequence (13,874 bp) of the completed recombinant expression vector.
  • FIG. 15 is a one-dimensional structure of a multi-cystronic vector of pTet retrovirus prepared to express hAPP, hTau and PSEN1 genes using the Thy1 promoter
  • FIG. 16 is a cyclic structure thereof.
  • cagggtgcag caactggagg cggcggcgtg tccggagcag tctgcggcgg cgagggaccg 420
  • gaggacccca aactagaggg aatctctgcc ctccgacctc gcgacaggct gggtgcgggg 840
  • caggtagccc cagccgaact ggagagcatc ctgctgcaac accccaacat cttcgacgcc 1500
  • gaacacggta aaaccatgac cgagaaggag atcgtggact atgtggccag ccaggttaca 1620
  • gagagccttc aacccagtca gctccttccg gtgggcgcgg ggcatgacta tcgtcgccgc 2100
  • atacattcaa atatgtatcc gctcatgaga caataaccct gataaatgct tcaataatat 2220
  • cagcaaccag gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc 2400
  • gacaaccacc tgagcaatac tgtacgtagc cagaatgaca atagagaacg gcaggagcac 7440

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Abstract

본 발명은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터에 관한 것으로서, 인간과 유사한 동물 모델을 제조함에 있어서 타겟 유전자의 발현 조절에 활용될 수 있다.

Description

신경세포 특이적으로 발현하는 돼지 THY1 유전자 프로모터
본 발명은 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터에 관한 것이다.
뇌신경 질환에 대한 새로운 치료법을 발견하기 위해 동물 모델을 이용하는 것은 새로운 치료 표적(therapeutic target)을 발견하고, 전임상 단계에서 약물 검사를 수행하기 위해 필수적인 요소이다. 이러한 동물모델의 연구는 비정상적인 뇌세포의 시공간적 변화과정 및 뇌의 기능장애 기전을 정확히 알아내고, 다양한 새로운 치료 표적들과 새로운 치료법의 효과 검증에 중요한 역할을 수행할 수 있다. 지금까지는 퇴행성 뇌신경 질환의 약물치료나 기전연구를 위한 질병모델로는 대부분 설치류를 이용해 왔으나, 동물 질환모델의 병리양상과 증상이 사람에서 관찰되는 것과 많은 차이를 보이고 있어 설치류질환모델에서 나온 결과를 토대로 임상시험을 시행할 경우 많은 문제점이 있었다. 따라서, 인간과 유사성이 높은 동물을 이용하여 각종 질환의 병리학적 기전과 치료를 위한 연구에 활용할 수 질환모델을 만드는 것이 매우 중요해지고 있다. 하지만, 영장류는 희소성이 높아 사육관리가 어렵고 비용이 많이 들기 때문에 극히 제한적인 분야에서만 질환연구에 활용될 수 있으므로, 비교적 저렴한 비용과 시설에서 보다 정확한 질환 연구를 할 수 있는 돼지를 새로운 모델 동물로서 활용하고자 하는 시도가 계속되고 있다.
뇌신경 질환 모델로서의 돼지를 제조하고자 하는 경우, 뇌신경 질환 관련 유전자가 돼지의 뇌 또는 신경에서 특이적으로 발현하는 것이 매우 중요하다. 이러한 조직 특이적 발현을 조절하는 것이 프로모터(promoter)이다. 프로모터는 구조유전자(gene)의 상부 쪽에 연결되어 있는 유전체(genome) 부위로서, 이에 연결된 구조유전자가 mRNA로 전사(transcription)되도록 조절하는 역할을 한다. 프로모터에는 여러 일반전사인자(general transcription factor)들이 결합함으로써 활성화(activation)되는데, 보편적으로 유전자 발현을 조절하는 TATA box, CAT box 등의 염기서열을 가지고 있다. 생체의 기본대사에 필요한 단백질들은 세포 내에서 일정 농도를 유지하여야 하므로 이들의 유전자에 연결된 프로모터는 일반전사인자의 작용만으로도 항시 활성화되어 있다. 이에 반하여 평시에는 역할이 없고 특수한 상황 하에서만 기능이 요구되는 단백질들은 해당 구조유전자의 발현을 유도하는 유도성 프로모터(inducible promoter)가 연결되어 있다. 유도성 프로모터에는 생물체의 발달과정에서, 또는 주변으로부터의 환경적 요인에서 오는 외부 자극에 의해 활성화된 특이 전사인자(specific transcription factor)가 결합함으로써 활성화된다. 즉, 뇌 질환 모델 돼지를 제조하는 경우, 질환 관련 유전자가 돼지의 뇌 또는 신경세포에서 특이적 발현하도록 유도할 수 있는 프로모터를 함께 도입해야 유전자 발현 시스템이 잘 작동할 수 있다.
본 발명의 목적은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터 및 이를 포함하는 재조합 벡터를 이용하여, 형질 전환된 세포주를 제공하는 것이다.
그러나, 본 발명이 해결하고자 하는 과제는 이상에서 언급한 과제로 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 해당 기술분야의 통상의 지식을 가진 자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함할 수 있다.
일실시예에 따르면, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고 제2항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터 및 알츠하이머 질환 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환시킨 포유동물의 체세포를 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물을 제공한다.
일실시예에 따르면, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계; 대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
본 발명의, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 프로모터는, 돼지에서 유래한 것으로서, 뇌 세포 또는 신경세포에서의 활성도가 높으므로 타겟 유전자의 발현 조절에 활용될 수 있다. 특히 설치류인 생쥐와 비교할 때, 돼지는 인간의 유전자와 유사성이 높고 대사 측면에서도 유사한 점이 많으므로, 재조합 벡터로 형질전환 되어 질환 모델로서 사용될 수 있는 바, 본 발명의 프로모터는 이러한 질환 모델 제조에서도 활용될 수 있다.
도 1은, ClustalV 방법을 통한 Thy-1 유전자의 계통발생학적 유사성을 나타낸 것이다.
도 2는, zPicture를 이용하여 인간과 돼지의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 3은, zPicture를 이용하여 돼지와 생쥐의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 4는, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자의 위치를 나타낸 것이다.
도 5는, luciferase reporter 벡터 제작을 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
도 6a은, Luciferase reporter 벡터에 삽입된 Thy1 프로모터 DNA의 위치를 나타낸 것이다.
도 6b는, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferace reporter 벡터의 모식도이다.
도 6b은, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferace reporter 벡터의 모식도이다.
도 7은, Luciferase assay를 통하여 측정된 돼지의 Thy1 프로모터의 뇌세포 특이적 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 8a는, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 reporter 벡터(pThy1-EGFP 벡터)의 모식도이다.
도 8b는, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 reporter 벡터(pThy1-EGFP 벡터)의 모식도이다.
도 9는, 세포 내 Thy1 프로모터와 CMV 프로모터 활성을 나타낸 형광현미경사진이다.
도 10a는, PC12 신경세포주에서의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10b는, NIH3T3 섬유아세포에서의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10c는, 293T 배아신장세포에서의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 11a는, PC12 세포 내 GFP의 발현 정도를 분석한 그래프이다.
도 11b는, PC12 세포 내 GFP의 발현 정도를 나타내는 사진이다.
도 12는, Luciferase reporter 벡터의 Thy1 프로모터 부위를 나타낸 것이다.
도 13은, 각각의 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 14는, 각각의 벡터를 PC12 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 15는, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조를 나타낸 모식도이다.
도 16은, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 고리형 구조를 나타낸 모식도이다.
이하에서, 첨부된 도면을 참조하여 실시예들을 상세하게 설명한다. 각 도면에 제시된 동일한 참조 부호는 동일한 부재를 나타낸다.
아래 설명하는 실시예들에는 다양한 변경이 가해질 수 있다. 아래 설명하는 실시예들은 실시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니며, 이들에 대한 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.
실시예에서 사용한 용어는 단지 특정한 실시예를 설명하기 위해 사용된 것으로, 실시예를 한정하려는 의도가 아니다. 단수의 표현은 문맥상 명백하게 다르게 뜻하지 않는 한, 복수의 표현을 포함한다. 본 명세서에서, "포함하다" 또는 "가지다" 등의 용어는 명세서 상에 기재된 특징, 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것이 존재함을 지정하려는 것이지, 하나 또는 그 이상의 다른 특징들이나 숫자, 단계, 동작, 구성 요소, 부품 또는 이들을 조합한 것들의 존재 또는 부가 가능성을 미리 배제하지 않는 것으로 이해되어야 한다.
다르게 정의되지 않는 한, 기술적이거나 과학적인 용어를 포함해서 여기서 사용되는 모든 용어들은 실시예가 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자에 의해 일반적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 가지고 있다. 일반적으로 사용되는 사전에 정의되어 있는 것과 같은 용어들은 관련 기술의 문맥 상 가지는 의미와 일치하는 의미를 가지는 것으로 해석되어야 하며, 본 출원에서 명백하게 정의하지 않는 한, 이상적이거나 과도하게 형식적인 의미로 해석되지 않는다.
또한, 첨부 도면을 참조하여 설명함에 있어, 도면 부호에 관계없이 동일한 구성 요소는 동일한 참조 부호를 부여하고 이에 대한 중복되는 설명은 생략하기로 한다. 실시예를 설명함에 있어서 관련된 공지 기술에 대한 구체적인 설명이 실시예의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우 그 상세한 설명을 생략한다.
용어 "재조합"은 세포가 이종의 핵산을 복제하거나, 상기 핵산을 발현하거나 또는 펩티드, 이종의 펩티드 또는 이종의 핵산에 의해 암호된 단백질을 발현하는 세포를 지칭하는 것이다. 재조합 세포는 상기 세포의 천연 형태에서는 발견되지 않는 유전자 또는 유전자 절편을, 센스 또는 안티센스 형태 중 하나로 발현할 수 있다. 또한 재조합 세포는 천연 상태의 세포에서 발견되는 유전자를 발현할 수 있으며, 그러나 상기 유전자는 변형된 것으로써 인위적인 수단에 의해 세포 내 재도입된 것이다.
용어 "벡터"는 세포 내로 전달하는 DNA 단편(들), 핵산 분자를 지칭할 때 사용된다. 벡터는 DNA를 복제시키고, 숙주세포에서 독립적으로 재생산될 수 있다. 용어 "전달체"는 흔히 "벡터"와 호환하여 사용된다. 용어 "발현 벡터"는 목적한 코딩 서열과, 특정 숙주 생물에서 작동가능하게 연결된 코딩 서열을 발현하는데 필수적인 적정 핵산 서열을 포함하는 재조합 DNA 분자를 의미한다. 진핵세포에서 이용가능한 프로모터, 인핸서, 종결신호 및 폴리아데닐레이션 신호는 공지되어 있다.
종래에 주로 사용되었던 생쥐의 Thy1 프로모터는 돼지 또는 인간의 Thy1 프로모터의 유사도가 현저하게 떨어지는 반면에, 돼지의 Thy1 프로모터와 인간의 Thy1 프로모터는 유사도가 매우 높으므로, (실시예 1 참조) 인간 질환 연구에 있어서 돼지의 Thy1 프로모터는 향후 활용될 가능성이 높다. 예를 들면, 뇌 질환 또는 신경질환 모델 돼지를 제조함에 있어서, 뇌세포 또는 신경세포 특이적 발현을 보장할 수 있는 프로모터를 제조하는 것이 매우 중요하며, 특히, 재조합 발현 벡터에 사용될 수 있을 정도의 크기를 가지면서도 활성도가 높은 프로모터 단편은 필수적이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터를 제공한다. 서열번호 1의 염기서열 크기는 500 bp 이지만, 이를 포함하는 염기서열이면 제한 없이 사용될 수 있다. 바람직하게는 500 bp 내지 2579bp 크기의 염기서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있다. 일실시예로, 서열번호 4 는, -4858 내지 -2279 위치의 2579bp 크기를 갖는 프로모터의 염기서열을 나타낸 것이다. 서열번호 1과 서열번호 4를 참고하여, 500 bp 내지 2579bp 크기의 염기서열을 갖는 프로모터가 사용될 수 있다.
또한, 상기 프로모터 서열의 변이체가 본 발명의 범위 내에 포함된다. 변이체는 염기 서열은 변화되지만, 서열번호 1의 염기 서열과 유사한 기능적 특성을 갖는 염기 서열이다. 구체적으로, 상기 프로모터는 서열번호 1 의 염기 서열과 각각 70% 이상, 80% 이상 또는 90% 이상이거나, 95% 이상의 서열 상동성을 가지는 염기 서열을 포함할 수 있다. 폴리뉴클레오티드에 대한 "서열 상동성의 %"는 두 개의 최적으로 배열된 서열과 비교 영역을 비교함으로써 확인되며, 비교 영역에서의 폴리뉴클레오티드 서열의 일부는 두 서열의 최적 배열에 대한 참고 서열(추가 또는 삭제를 포함하지 않음)에 비해 추가 또는 삭제(즉, 갭)를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함할 수 있다. 상기 PBX 및 CREB 전사조절인자는 뇌질환과 관련성이 알려져 있는 전사인자들이다.
일실시예에 따르면, 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트를 제공한다.
또한, 일측에 따르면, 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고, 서열번호 4의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트가 제공된다.
일실시예에 따르면, 서열번호 1의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터 및 알츠하이머 관련 유전자를 포함하는 재조합 발현 벡터를 제공한다.
일측에 따르면, 상기 발현 벡터는, 신경세포에 특이적으로 상기 알츠하이머 관련 단백질을 효율적으로 발현을 유도 하고자 할 때 이용 될 수 있는 것이면 종류에 제한 없이 사용가능하나, 바람직하게는 레트로바이러스 벡터를 사용할 수 있다. 예를 들면, pTet-CKOS가 사용될 수 있다. 또한, 상기 발현 벡터는, 유전자의 발현을 보다 향상시키기 위하여 인핸서를 더 포함할 수 있으며, 예를 들면, CMV (Cytomegalo virus) 인핸서를 포함할 수 있다.
일측에 따르면, 상기 상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자일 수 있다. 알츠하이머병의 대표적인 원인유전자로 알려진 APP, Tau 및 PS1이 알츠하이머병을 일으키는 병인기전인 이러한 β-아밀로이드의 과발현과 Tau 단백질의 응집에 기여 한다는 것이 알려져 있다. β-아밀로이드는 아밀로이드 전구단백질(amyloid precursor protein; APP)로부터 프로테올리시스(proteolysis) 과정을 통해 만들어진다. 전구단백질인 APP는 하나의 트랜스맴브레인 도메인(transmembrane domain)을 가지고 있는 단백질로 교번 스플리싱(alternative splicing)에 의해 몇 가지 이소타입으로 발현되며 세포 내에서 두 가지 대사경로를 거치는 것으로 알려져 있다. 가족성 알츠하이머병 환자들에서 이 APP 단백질에 돌연변이가 발견된다. 지금까지 발견된 돌연변이는 APP670/671(Swedish), APP672(Flemish), APP716(Florida), APP717 (London) 등이 있으며 이들 돌연변이에서 β-아밀로이드의 형성이 증가하는 것이 밝혀져 있다. 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이를 나타내는 또 다른 한가지의 유전자는 프리세닐린 1(PS1)이다. PS1은 8개의 트랜스맴브레인 도메인을 가진 단백질로서 발생 과정에서 중요한 역할을 하며 γ- 시크리테아제 자체 또는 복합체의 일원으로 작용하는 것으로 알려져 있다. PS1은 단백질 전체에 걸쳐 가족성 알츠하이머병을 유발하는 돌연변이들이 45가지 이상이 보고되어 있으며 이들 돌연변이들 역시 β-아밀로이드의 형성량을 증가시키는 것으로 밝혀져 있다. 생성된 β-아밀로이드에 의한 알츠하이머병의 발병은 Tau 단백질의 과인산화에 의한 신경세포손상의 과정을 동반하며, 이러한 Tau 단백질의 과인산화에는 몇 가지 인산화효소가 작용하는 것으로 알려져 있다. Tau의 과인산화와 더불어 Tau의 tangle 형성 또한 신경세포를 손상시키는 역할을 하며, 다발 (tangle)이 잘 형성되는 Tau의 돌연변이가 발견되었다.
상기 재조합 발현 벡터는, 상기 APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 및 PS1 돌연변이 유전자 각각의 사이에 2A 서열을 더 포함할 수 있다. 일 실시예로, 상기 APP 돌연변이 유전자와 상기 타우 돌연변이 유전자 사이에 2A 서열을 더 포함하고, 상기 타우 돌연변이 유전자와 상기 PS1 돌연변이 유전자 사이에 2A 유전자를 더 포함할 수 있다.
상기 2A 유전자서열은 18 내지 22개 아미노산을 코딩하고 있으며 그 중에서 말단에 위치하는 4개의 아미노산 Asparagine (N), Proline (P), Glycine (G), Proline (P)은 종간에 중요하게 보존되어 있는 아미노산이다. 상기 서열은 펩티드로 합성될 때, 자기-분열 (self-cleavage)이 일어나는 경향을 보인다. 이러한 성질로 인하여 리보좀(Ribosome)이 단백질 전사를 진행할 때 2A 서열 말단에 위치한 N, P, G를 암호화한 유전자 코드 (genetic code)에 도달하면, NPG를 차례로 인지하여 펩티드 결합을 만들고 다음 아미노산인 proline 암호화 코드에 Proline 이 결합된 prolyl-tRNA을 가져오는 대신에 방출 요소 (releasing factor: RF) 인자를 가져온다. RF 인자가 결합하고 난 다음에는 앞에서 이미 형성된 펩티드는 더 이상 펩티드 결합을 이어가지 못하고 리보좀에서 방출된다. 그리고 2A 서열 이후에 암호화된 코드는 정상적으로 작동하여 다음 단백질 전사를 진행하게 된다. 결론적으로 2A 서열을 삽입함으로써 하나의 프로모터를 이용하여 여러 유전자를 발현시킬 수 있다. 본 발명의 재조합 발현 벡터는 이러한 2A 서열을 세 유전자들 사이 각각에 삽입함으로써, 상기 유전자들을 동시에 발현할 수 있다.
상기 APP 돌연변이 유전자는, 595번 아미노산, 596번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는, 243번 아미노산이 돌연변이된 것일 수 있다. 또한, 상기 PS1 돌연변이 유전자는, 146번 아미노산, 286번 아미노산, 또는 이 둘 모두가 돌연변이된 것일 수 있다. 이러한 돌연변이된 아미노산의 일실시예로서, 상기 APP 돌연변이 유전자는 APP695의 595번 아미노산 Lys 이 Asn 으로 596번 아미노산 Met 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있으며, 상기 타우 돌연변이 유전자는 243번 아미노산 Phe 이 Lys 으로 돌연변이 되어있는 유전자일 수 있다. 또한 상기 PS1 돌연변이 유전자는 146번 아미노산 Met 에서 Leu 으로, 286번 아미노산 Pro 이 Leu 으로 돌연변이된 유전자일 수 있다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환시킨 포유동물의 체세포를 제공한다. 상기 세포는 포유류에서 비롯된 것이면 인간을 제외하고 제한 없이 사용 가능하다. 하지만 기존에 주로 사용되는 마우스의 경우, 대사가 매우 빠르며 일생의 변화가 인간과 매우 다르기 때문에 정확한 질병모델로 사용하기에 어려운 점이 있다. 따라서 인간의 몸집과 유사한 크기를 갖고 있으며 대사 측면에서 유사한 형태를 가지는 동물이 바람직하며, 그 중에서도 돼지가 가장 바람직하다. 일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란을 제공한다. 일실시예에 따르면, 상기 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물을 제공한다.
일실시예에 따르면, 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계; 제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계; 상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및 상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는, 재조합 발현 벡터 제조방법을 제공한다.
일실시예에 따르면, 상기 재조합 발현벡터를 제조하는 단계; 돼지로부터 체세포를 분리하는 단계; 상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계; 상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계; 대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계; 상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법을 제공한다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세히 설명하기로 한다. 하기 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 목적으로 기술된 것으로서, 본 발명의 범위가 이에 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1: 계통발생학적 분석 및 zPicture 분석을 이용한 인간, 생쥐, 돼지의 Thy1 유전자 유사성 조사>
Thy1 유전자의 서열을 분석하기 위하여 인간(GeneID: 7070), 생쥐(GeneID: 21838), 돼지(GeneID: 100109488)의 전체 유전자와 프로모터(첫번째 exon에서부터 앞쪽으로 약 2.2~2.6 kb) DNA 서열을 National Center for Biothechnology Information (NCBI)에서 다운로드하였다. DNASTAR Lasergene Megalign 소프트웨어를 사용하여 각 DNA 서열의 계통발생학적 유사성을 조사하였다. Align 방법은 Clustal V 방법을 사용하였다.
도 1은, ClustalV 방법을 통한 Thy-1 유전자의 계통발생학적 유사성을 나타낸 것이다.
도 1을 참고하면, 생쥐의 Thy1 유전자에 비해 사람과 돼지의 Thy1 유저자가 계통수에서 매우 가까운 위치에 있음을 알 수 있다.
Thy1의 종간 유전자의 유사성을 조사하고 유사성이 높은 프로모터의 위치를 파악함으로써 돼지 Thy1의 프로모터 범위와 후보서열을 결정하기 위하여, 인간 대 돼지, 또는 돼지 대 생쥐의 Thy1 유전자 유사성을 상호 비교하였다. 비교도구는 pairwise sequence aligner에 기초한 zPicture 분석 tool을 사용하였다. 인간, 돼지, 생쥐의 Thy1 유전자는 4개의 엑손(exon)으로 구성되어 있고 단백질을 발현을 시작하는 ATG codon은 두 번째 엑손에 위치한다. ATG의 A를 +1위치로 명명하고 그 앞쪽에 위치하는 뉴클레오타이드는 "-번호"로 으로 A의 뒤쪽은 "+번호"로 명명하였다. 사람의 경우, Thy1 유전자가 뇌조직에서 특이적으로 발현할 수 있도록 조절하는 유전자서열이 첫 번째 엑손 앞쪽에서부터 두 번째 엑손 앞(-3463 ~ -1)까지 중요하다.
도 2는, zPicture를 이용하여 인간과 돼지의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이며, 도 3은, zPicture를 이용하여 돼지와 생쥐의 Thy-1 유전자 유사성을 분석한 것이다.
도 2를 참고하여, 돼지와 인간의 Thy1 유전자 유사성을 분석해 볼 때, 첫 번째 exon앞쪽으로는 DNA 서열 유사성이 높고 첫 번째 인트론(intro) 서열은 유사성이 떨어진다. 반면에, 도 3을 참고하여, 돼지와 생쥐의 DNA서열을 비교하면, 단백질을 발현하는 coding 서열과 첫 번째 엑손 앞쪽을 제외하고, 전체적으로 DNA 서열 유사성이 떨어진다. 즉, 돼지와 인간의 Thy1 유전자의 유사도가 매우 높으며, 그 중에서도 Thy1의 -4858 ~ -2278 에 위치한 유전자서열이 Thy1 발현조절에 관여할 가능성이 높다.
< 실시예 2: 인간과 돼지 Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 예상 전사조절인자 목록>
인간과 돼지 Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 예상 전사조절인자를 조사하기 위하여 rVista 2.0를 분석도구로 사용하였다.
아래의 표 1은, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자를 나타낸 것이다.
-4858 내지 -3858 -3858 내지 -2858 -2858 내지 -1858
SMAD4 NKX25B EGR2
MAZR TBX5 EGR3
SP1 ARP1 SRF
MAZ CDP LRF
RORA CLOX NFY
HTF PBX CAAT
ER NFY ZIC3
XBP1 AREB6 CHCH
RUSH1 AP2A MTF
LFA1 AP2G ETF
ELK1 CREB
TEF1 HNF4
RBPJK SZF11
STAF
E2F1
HSF1
HSF2
SMAD4
EGR1
도 4는, Thy1 유전자 프로모터에 결합하는 전사조절인자의 위치를 나타낸 것이다.
상기 표 1과 도 4를 참고하면, 돼지 Thy1 유전자의 첫 번째 엑손 앞쪽으로 약 1kb안에 TBX5, PBX, CREB, AREB6, AP2, E2F1, HSF1, SMAD4, EGR1, EGR2, EGR3 등의 전사조절인자가 결합할 수 있는 DNA 서열이 존재한다. 이 중에서도, 특히 PBX 및 CREB 전사조절인자는 뇌질환과 관련성이 알려져 있는 인자들이다. 따라서 -3858 ~ -2858, 특히 -3380부터 -2880의 돼지 Thy1의 프로모터 부위가 뇌조직 특이적으로 Thy1이 발현하는 데 중요하다.
< 실시예 3: 돼지의 Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 luciferase reporter 벡터와 luciferase 분석>
실시예 1 및 2의 분석을 기반으로 실제 세포 내에서 조직특이적인 발현을 유도하는 돼지의 Thy1 프로모터 DNA 서열을 찾기 위하여 Luciferase reporter 벡터를 제작하였다. Thy1 유전자 -4858 ~ -2279을 luciferase cDNA 앞에 삽입한 -4858/-2279_Luc 벡터와 -2578 ~ -40을 삽입한 -2578/-40_Luc 벡터를 만들기 위하여 프라이머를 디자인하였다.
서열번호 7은, Thy1 프로모터 -4858 내지 -2279 위치의 염기서열(2579 bp)을 나타낸 것이며, 서열번호 8은, Thy1 프로모터 -2578 내지 -40 위치의 염기서열(2538 bp)을 나타낸 것이다.
도 5는, luciferase reporter 벡터 제작을 위한 프라이머를 나타낸 것이다.
돼지에서부터 염색체를 분리한 후, 상기 프라이머를 사용하여 돼지 염색체를 주형으로 PCR하여 -4858 ~ -2279 염기서열 및 -2578 ~ -40 염기서열을 갖는 Thy1 프로모터 DNA를 합성하였고, pTOP TA V2 벡터에 TA 클로닝하였다. 합성한 DNA 서열은 시퀀싱을 통하여 정확하게 합성되었음을 확인하였다.
도 6a를 참고하면, Luciferase reporter 벡터에 삽입된 Thy1 프로모터 DNA의 위치를 개략적으로 알 수 있다. -4858/-2279_Luc 벡터를 클로닝하기 위해 SacI/NheI 제한효소를, -2578/-40_Luc 벡터는 KpnI/XhoI의 제한효소를 사용하여 각 Thy1 프로모터를 pTOP에서 잘라 pGL4.10[luc2] 벡터에 삽입하였다. 서열번호 9는, pGL4.10[luc2] 벡터의 염기서열 (4242 bp)을 나타낸 것이다.
도 6b와 도 6c는 각각의 벡터와 사용된 제한효소를 나타낸 모식도이다.
합성한 두 개의 Thy1 프로모터가 실제 신경세포 특이적 발현패턴을 보이는 지 조사하기 위하여 luciferase assay를 실행하였다. 대표적인 신경세포주 SH-SY5Y와 PC12에 500 ng의 -4858/-2279_Luc 혹은 -2578/-40_Luc 벡터를 50 ng의 pRL-TK 벡터와 함께 Lipofectamine 2000사용하여 transfection하였다. 대조군으로는 500 ng의 기본 pGL4.10[luc2]를 transfection하였다. 또한 293T 세포를 신경세포에 대한 음성대조군 세포주로 사용하여 프로모터의 활성을 조사하였다.
도 7은, Luciferase assay를 통하여 측정된 돼지의 Thy1 프로모터의 뇌세포 특이적 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 7을 참고하면, 비 신경세포주인 293T 세포는 두 가지 Thy1 프로모터의 활성이 낮은 반면, SH-SY5Y와 PC12 신경세포주에서는 -4858/-2279_Luc의 프로모터 활성이 매우 높았다. -2578/-40_Luc의 경우, 프로모터 활성이 신경세포주에 특이적으로 보이지 않는 것으로 보아, 신경세포 특이적 Thy1 발현은 Thy1 프로모터의 -4858~-2279 부위에 존재하는 DNA 서열이 중요하다.
< 실시예 4: 세포 내 돼지의 Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 형광 reporter 벡터와 형광분석>
이미지분석을 통한 Thy1 프로모터의 활성을 측정하기 위하여 Thy1 프로모터 -4858/-2279의 전사조절을 받는 EGFP 발현벡터 및 DsRed2 발현벡터를 제조하였다.
도 8a 및 도 8b는, Thy1 프로모터의 활성도 측정을 위한 reporter 벡터의 모식도이다.
우선, -4858/-2279_Luc을 주형으로 플라스미드 PCR을 통해 -4858 ~ -2279의 Thy1 프로모터를 합성하였고, AseI과 NheI제한효소로 pEGFP1와 pDsRed2의 CMV 프로모터를 제거한 후, -4858 ~ -2279의 Thy1 프로모터를 삽입하여 pThy1-EGFP 벡터(도 8a)와 pThy1-DsRed2 벡터 (도 8b)를 제조하였다.
서열번호 10은, pThy1-EGFP 벡터의 염기서열 (4733 bp)을 나타낸 것이고, 서열번호 11은, pThy1-DsRed2 벡터의 염기서열(4689 bp)을 나타낸 것이다.
상기 EGFP 발현벡터 및 DsRed2 발현벡터를 제조하기 위하여 사용된 프라이머는 다음과 같다.
Figure PCTKR2017003750-appb-I000001
293T 세포에 pEGFP1, pThy1-EGFP, pDsRed2, pThy1-DsRed2, 각각의 벡터를 Lipofectamin2000을 사용하여 transfection하고 이틀 후 형광현미경으로 관찰하였다.
도 9는, 세포 내 Thy1 프로모터와 CMV 프로모터 활성을 나타낸 형광현미경사진이다.
도 9를 참고하면, 293T 세포에서 CMV 프로모터의 조절을 받는 GFP와 DsRed 단백질의 발현이 매우 높은 반면, Thy1 프로모터 영향아래에 있는 GFP와 DsRed 단백질은 상대적으로 낮은 발현률을 나타내었다. 이는 Thy1발현이 없는 293T 세포에는 Thy1 프로모터의 활성화를 위한 전사조절인자가 결핍되어 있기 때문이다.
<실시예 5: 여러 가지 세포 내 존재하는 Thy1 발현정도 FACS분석>
293T 배아신장세포, NIH3T3 섬유아세포, PC12 신경세포주에서 기본적으로 발현하는 Thy1 단백질의 정도를 관찰하기 위하여 배양된 세포에 0.25% trypsin-EDTA를 처리하고 단일세포로 떼어낸 후, Thy1에 대한 일차항체(생쥐에서 생산)을 세포에 반응시켰다. FITC가 결합되어 있는 항-생쥐 항체를 반응시키고 flow cytometry 분석을 실시하였다.
도 10a는 PC12 신경세포주, 도 10b는 NIH3T3 섬유아세포, 도 10c는 293T 배아신장세포에서 각각의 Thy1 발현 정도를 나타낸 그래프이다.
도 10b 및 도 10c을 참고하면, NIH3T3, 293T에서는 Thy1 단백질의 발현이 거의 없었으나, 도 10a의 PC12 신경세포에는 Thy1발현이 굉장히 높았다. 즉, PC12 세포에서 Thy1 발현을 위한 전사조절인자의 활성이 높기 때문인 것으로 판단되며, 이는 본 발명의 프로모터가 신경세포 특이적인 발현에 매우 큰 역할을 수행한다는 점을 나타낸다.
< 실시예 6: PC12 세포에 Thy1 프로모터와 EGFP를 결합시킨 벡터를 transfection 후 발현분석>
Thy1 단백질의 발현을 위한 전사조절인자가 풍부한 PC12세포에 pEGFP1 (cmv프로모터)과 pThy1-EGFP (Thy1 프로모터)을 transfection시키고 400 μg/ml의 G418을 약 3주 처리하여 stable 세포를 제작하였다. Flow cytometry 및 형광현미경으로 PC12 세포 내 GFP의 발현을 조사하였다.
도 11a는, PC12 세포 내 GFP의 발현 정도를 분석한 그래프이고, 도 11b는 PC12 세포 내 GFP 발현 정도를 나타내는 사진이다.
도 11a을 참고하면, CMV 프로모터의 조절을 받는 GFP 발현 보다 Thy1 프로모터의 조절을 받는 GFP의 발현이 현저히 높음을 확인할 수 있다.
< 실시예 7: Thy1 프로모터의 활성에 있어 중요부위 분석을 위한 Luciferase reporter 분석>
-4858~-2279 Thy1 프로모터의 서열 중 신경세포 특이적 발현을 유도하는 서열이 어느 곳인지 알아보기 위하여 -4858에 가까운 부위부터 절제하여 -3880/-2279, -3380/-2279, -2880/-2279 Thy1 프로모터 부위를 PCR 합성하여 SacI/NheI 제한효소로 자른 후 pGL4.10[luc2]에 클로닝 하였다.
도 12는, Luciferase reporter 벡터의 Thy1 프로모터 부위를 나타낸 것이다.
293T와 PC12 세포에 각각의 luciferase reporter 벡터(500 ng)와 pRL-TK(50 ng)을 lipofectamin2000으로 transfection한 후, luciferase assay를 실행하였다.
도 13은, 각각의 벡터를 293T 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이며, 도 14는, 각각의 벡터를 PC12 세포에 트랜스펙션 후 활성도를 나타낸 그래프이다.
도 13을 참고하면, 293T 세포에서는 프로모터의 활성이 낮는 것으로 분석되었다. 반면에 도 14를 참고하면, PC12 신경세포주에서는 -4858/-2279-Luc, -3880/-2279-Luc, -3380/-2279-Luc의 경우는 Thy1 프로모터의 활성이 매우 높았으나, -2880/-2279-Luc의 경우에는 프로모터의 활성이 현저히 저하되었다. 즉, 이는 신경세포 특이적 발현을 유도하는 Thy1 프로모터의 -3380부터 -2880까지 약 500 bp의 DNA 서열이 중요하다는 것을 나타낸다.
<실시예 8: 알츠하이머병 유전자가 도입된 pTet 레트로바이러스 멀티- 시스트로닉 벡터의 완성>
레트로바이러스의 벡터인 pTet-CKOS 를 이용하여 이 벡터에 존재하는 TRE 미니멀 CMV 프로모터와 CKOS 유전자 클러스터를 제거하였다. 유전자 클로닝에 유리하도록 SwaI, ClaI, PacI 및 NotI 등의 제한효소부위를 갖는 벡터로 수정하였다.
알츠하이머병 돌연변이 유전자 β-아밀로이드의 전구단백질(APP) 유전자(NM_201414.2), 프리세닐린(PS-1) 유전자(NM_000021.3), 타우(Tau) 유전자(NM_016834.4)의 아미노산 변이를 유도하기 위하여 위치선택적 돌연변이 키트 (site-directed mutagenesis kit: Stratagene)를 이용하였다. APP 의 경우에는 뇌신경세포에 발현되는 APP695 타입의 유전자를 이용하였으며 유전자의 알츠하이머병의 가족적 변이 (familial mutation)가 발견된 595번 및 596번 두 군데 이중 돌연변이를 도입하였다. 이들 돌연변이는 β-아밀로이드 42 형태를 더 많이 만들어 내는 것으로 알려져 있다. 상기 아미노산 변이는 각각 K595N, N596M 으로 명명하였다. 프리세닐린 역시 두 개의 아미노산 돌연변이가 도입되었다. 146번과 286번 아미노산의 돌연변이가 도입되었으며, 각각 M146L, P286L 로 명명되었다. Tau의 경우에는 243번 아미노산 한 개만 변이되었으며 P243L 로 명명되었다.
3개의 유전자는 하나의 mRNA 로 전사가 된 후에, 각각 단백질로 번역이 될때 독립적인 펩타이드로 분리되도록 하기 위해서 2A서열로 서로 연결되도록 하였다.
*최종적으로 레트로바이러스 벡터에 SwaI와 ClaI 2개의 제한효소를 이용하여 그 자리에 1079bp 크기의 Thy1 프로모터를 삽입하고, 그 다음으로 세 개의 돌연변이 유전자가 일렬로(tandem) 연결된 pTet-porcine TYH1 pro-APPsw-2A-TAU-2A-PS1-SV40 pA인 최종 재조합 발현벡터를 완성하였다. 완성된 재조합 발현벡터는 염기서열 결정을 통해 전체 13,874bp 의 DNA 서열을 확인하였다.
서열번호 12는, 상기의 완성된 재조합 발현벡터의 염기서열 (13,874bp)을 나타낸 것이다.
도 15는, Thy1 프로모터를 이용하여 hAPP, hTau 및 PSEN1 유전자가 발현되도록 제조된 pTet 레트로바이러스의 멀티-시스트로닉 벡터의 일차원적 구조 이며, 도 16은, 이의 고리형 구조이다.
이상과 같이 실시예들이 비록 한정된 실시예와 도면에 의해 설명되었으나, 해당 기술분야에서 통상의 지식을 가진 자라면 상기의 기재로부터 다양한 수정 및 변형이 가능하다. 예를 들어, 설명된 기술들이 설명된 방법과 다른 순서로 수행되거나, 및/또는 설명된 구성요소들이 설명된 방법과 다른 형태로 결합 또는 조합되거나, 다른 구성요소 또는 균등물에 의하여 대치되거나 치환되더라도 적절한 결과가 달성될 수 있다.
그러므로, 다른 구현들, 다른 실시예들 및 특허청구범위와 균등한 것들도 후술하는 특허청구범위의 범위에 속한다.
서열번호 1
gaagccacaa ggatgcaaat caatcaaata aacctttgtt caaaaaaatt tatctcacct 60
gtgagtggga gagacaagtc accccagggc ttctggtgac ttcaaattga tagggagaaa 120
atggttgccc caggggatta aaagcttggt atctgctact cctttagagt tggcctgtct 180
cctccacttt cccacaattc caccatttcc ccctcccact gggctgggat gcagctgtgg 240
agtggctcag ctccaaggac taggggctcc acagcccagg tccggcggcc agccctccca 300
cttccagcct ggaagtggga tggggagtgg gatgagatga acccggcaga ttgtagccac 360
agatgtggat gtgcagggtc cagcacaggg cttgggtgag gagggcggca ccccatccct 420
tgtctgaaga ccaagcagac agtactcagg acttgggagg gggttggggg aggaggagtg 480
catgaaactg agaagaacct
서열번호 2
gaagccacaa ggatgcaaat
서열번호 3
aggttcttct cagtttcatg
서열번호 4
tctagatggg gcaactggag atgatgggag aagaaagcct aagggactaa gaggaaagcc 60
acaatctgtc ggtaaatcct gccttgggta gaatcttcta aacctttccc gctttcagca 120
ctcttatcct gtcccacagg caaaggggag tttttaaatc tcctctccat caccatcttg 180
tgttccgccc tggttcctaa ttgtcttact tgagccattc actccatcca gccgagacct 240
tgttttagca gacacacaac tgcctagagt ctacacgccc ctccctttcc caaactaaag 300
tgcttaggga cccagaaaat aggccaggtc ctcgtaacct tatcgaaata gcacagctag 360
gccttccacc caacaacact cagagactgg gccatagggt aggaaacagc atccagagtc 420
ttgtccagac agagcccaga catcttctgt agttaagagc cctctgggta ttctcacgtc 480
ctgccccaaa aaaaggaacc aagcttatct gggggcggtg gggagaaggg ggtgtaagcc 540
aaagctaaag caactaaagc aactgtgttc tgataggaaa gatccctgga ctgagaacaa 600
gaaagctgtt ccgcaggaaa gaacacactg cgtggagtgt cagggaggag gccagcacct 660
ctggaatgcg gcaggaagat gaatgggaaa gatgaggtgg tggtggaggg cagcagccag 720
ggccttcaaa atcatcctcc agacaatgac aagcccggtc acctgatctg tgaagaggga 780
tggtctgcaa tctccaggcc ctcgagcctg tgcaaagggc aggctcaggc agctctgctg 840
ctagactaag gacatcccag gtgggcacgg agagctgcat ttctcgtaaa gcgccctagg 900
agcttctgtt gttcaccaga accacgagcc cctggactgg accgttcaca aggctcgttc 960
cagttagaaa attccatcac tctaagagct gggaggcacc taacctccaa gggagggaga 1020
gggaagtgga tctcccactt gccagcccag ggatgacttc caacagtgcc attacagtaa 1080
tggaaactgc agtgaaggtg ccagggctga cttctgtgaa gaaagaggag gacaggagtt 1140
cccctagtgg ctcatcagaa atgaatctga ctagcatcca tgaggatgca ggttcaatcc 1200
ctggcctcat tcagtggctt aaggatccag cgttgccgag agctgtgatg taggtcacag 1260
acgcggctca gatcccgtgt tgctgttgct gtggctgtgg cataggtcag aagcgacagc 1320
tctgatttga cccctaacct gggaacctcc atatcccgct agtgcggccc ttaaaagaca 1380
aaaagaagga aaagagaaga aaagacatag gcgaacagaa aggcagatga cagggtggca 1440
gggccagcct acacgatggc ccgaccagaa ttcacaaaga agccacaagg atgcaaatca 1500
atcaaataaa cctttgttca aaaaaattta tctcacctgt gagtgggaga gacaagtcac 1560
cccagggctt ctggtgactt caaattgata gggagaaaat ggttgcccca ggggattaaa 1620
agcttggtat ctgctactcc tttagagttg gcctgtctcc tccactttcc cacaattcca 1680
ccatttcccc ctcccactgg gctgggatgc agctgtggag tggctcagct ccaaggacta 1740
ggggctccac agcccaggtc cggcggccag ccctcccact tccagcctgg aagtgggatg 1800
gggagtggga tgagatgaac ccggcagatt gtagccacag atgtggatgt gcagggtcca 1860
gcacagggct tgggtgagga gggcggcacc ccatcccttg tctgaagacc aagcagacag 1920
tactcaggac ttgggagggg gttgggggag gaggagtgca tgaaactgag aagaaccttc 1980
tagctgcctg cgccaggagg tacccgggag ctgaaggaga tggagtgccc cagagcagaa 2040
agcccctgca ggtctggatg ttctaggctg gatgaggggg cgaggcaggc ctggggacct 2100
gggaagacca ggcgcagtac ctgccttgct tctgaaaatg ctgctccaac gtggaaaaac 2160
actcccacca tctttctttg gagaaagcct gtaatattcc aacaccaaaa cctctcacta 2220
gaggttcccg tggagatggg ttccagatga aaagggaagg aggaggcatg ggcgctgcct 2280
aacctccatc ctccattcct tacccctctc ccaccggctt ctgaagccgg ggtcagaaga 2340
aagggttaaa gccttaaaag gggaccgatt ttgcggggct ctgggggtcg gctggcacac 2400
cctgagcggc cccgcccttc tctctagtgt ccagaaccct ccctgccctg cccaggccta 2460
acggccacag ggggagggcc cccctttact gcagaccgcc actctcccac accaatatcg 2520
gaccgcctcc tcctccctct gccacccctt ctcgctcccc actcagcctc tgattggcc
서열번호 5
tctagatggg gcaactggag
서열번호 6
ggccaatcag aggctgagtg
서열번호 7
tctagatggg gcaactggag atgatgggag aagaaagcct aagggactaa gaggaaagcc 60
acaatctgtc ggtaaatcct gccttgggta gaatcttcta aacctttccc gctttcagca 120
ctcttatcct gtcccacagg caaaggggag tttttaaatc tcctctccat caccatcttg 180
tgttccgccc tggttcctaa ttgtcttact tgagccattc actccatcca gccgagacct 240
tgttttagca gacacacaac tgcctagagt ctacacgccc ctccctttcc caaactaaag 300
tgcttaggga cccagaaaat aggccaggtc ctcgtaacct tatcgaaata gcacagctag 360
gccttccacc caacaacact cagagactgg gccatagggt aggaaacagc atccagagtc 420
ttgtccagac agagcccaga catcttctgt agttaagagc cctctgggta ttctcacgtc 480
ctgccccaaa aaaaggaacc aagcttatct gggggcggtg gggagaaggg ggtgtaagcc 540
aaagctaaag caactaaagc aactgtgttc tgataggaaa gatccctgga ctgagaacaa 600
gaaagctgtt ccgcaggaaa gaacacactg cgtggagtgt cagggaggag gccagcacct 660
ctggaatgcg gcaggaagat gaatgggaaa gatgaggtgg tggtggaggg cagcagccag 720
ggccttcaaa atcatcctcc agacaatgac aagcccggtc acctgatctg tgaagaggga 780
tggtctgcaa tctccaggcc ctcgagcctg tgcaaagggc aggctcaggc agctctgctg 840
ctagactaag gacatcccag gtgggcacgg agagctgcat ttctcgtaaa gcgccctagg 900
agcttctgtt gttcaccaga accacgagcc cctggactgg accgttcaca aggctcgttc 960
cagttagaaa attccatcac tctaagagct gggaggcacc taacctccaa gggagggaga 1020
gggaagtgga tctcccactt gccagcccag ggatgacttc caacagtgcc attacagtaa 1080
tggaaactgc agtgaaggtg ccagggctga cttctgtgaa gaaagaggag gacaggagtt 1140
cccctagtgg ctcatcagaa atgaatctga ctagcatcca tgaggatgca ggttcaatcc 1200
ctggcctcat tcagtggctt aaggatccag cgttgccgag agctgtgatg taggtcacag 1260
acgcggctca gatcccgtgt tgctgttgct gtggctgtgg cataggtcag aagcgacagc 1320
tctgatttga cccctaacct gggaacctcc atatcccgct agtgcggccc ttaaaagaca 1380
aaaagaagga aaagagaaga aaagacatag gcgaacagaa aggcagatga cagggtggca 1440
gggccagcct acacgatggc ccgaccagaa ttcacaaaga agccacaagg atgcaaatca 1500
atcaaataaa cctttgttca aaaaaattta tctcacctgt gagtgggaga gacaagtcac 1560
cccagggctt ctggtgactt caaattgata gggagaaaat ggttgcccca ggggattaaa 1620
agcttggtat ctgctactcc tttagagttg gcctgtctcc tccactttcc cacaattcca 1680
ccatttcccc ctcccactgg gctgggatgc agctgtggag tggctcagct ccaaggacta 1740
ggggctccac agcccaggtc cggcggccag ccctcccact tccagcctgg aagtgggatg 1800
gggagtggga tgagatgaac ccggcagatt gtagccacag atgtggatgt gcagggtcca 1860
gcacagggct tgggtgagga gggcggcacc ccatcccttg tctgaagacc aagcagacag 1920
tactcaggac ttgggagggg gttgggggag gaggagtgca tgaaactgag aagaaccttc 1980
tagctgcctg cgccaggagg tacccgggag ctgaaggaga tggagtgccc cagagcagaa 2040
agcccctgca ggtctggatg ttctaggctg gatgaggggg cgaggcaggc ctggggacct 2100
gggaagacca ggcgcagtac ctgccttgct tctgaaaatg ctgctccaac gtggaaaaac 2160
actcccacca tctttctttg gagaaagcct gtaatattcc aacaccaaaa cctctcacta 2220
gaggttcccg tggagatggg ttccagatga aaagggaagg aggaggcatg ggcgctgcct 2280
aacctccatc ctccattcct tacccctctc ccaccggctt ctgaagccgg ggtcagaaga 2340
aagggttaaa gccttaaaag gggaccgatt ttgcggggct ctgggggtcg gctggcacac 2400
cctgagcggc cccgcccttc tctctagtgt ccagaaccct ccctgccctg cccaggccta 2460
acggccacag ggggagggcc cccctttact gcagaccgcc actctcccac accaatatcg 2520
gaccgcctcc tcctccctct gccacccctt ctcgctcccc actcagcctc tgattggcc
서열번호 8
aacctccatc ctccattcct tacccctctc ccaccggctt ctgaagccgg ggtcagaaga 60
aagggttaaa gccttaaaag gggaccgatt ttgcggggct ctgggggtcg gctggcacac 120
cctgagcggc cccgcccttc tctctagtgt ccagaaccct ccctgccctg cccaggccta 180
acggccacag ggggagggcc cccctttact gcagaccgcc actctcccac accaatatcg 240
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gaacccaggt gggaactgga gccagggcgg ggcccggagc gccctcggtg cccctgcaag 480
ctctccagac cccaagcttc agaaaaccat ccgagggcgc tcagggaagg agcagtgcag 540
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ttacagtgcc aaatgtttgt catttttctt aatctccatc acggccccgt gttatgtatc 1860
taaagcccag tttcgttcag tatctttcag gcatctgtta tctgccagaa aggtctggcc 1920
atcggggatt ttcttctgaa tacgaaatag gaagtctttg tttaacaggt agagcgtttt 1980
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cacttctgaa ctgtacactt aaaaatggtt taggagagga gttccctggt ggcctgggag 2100
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actgagaggt gggaggggag agggctacag agaggggctt ggatgccccc catggccatt 2460
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tcttggctga ttcccacc
서열번호 9
ggcctaactg gccggtacct gagctcgcta gcctcgagga tatcaagatc tggcctcggc 60
ggccaagctt ggcaatccgg tactgttggt aaagccacca tggaagatgc caaaaacatt 120
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aaagccatga agcgctacgc cctggtgccc ggcaccatcg cctttaccga cgcacatatc 240
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atctacaacg agcgcgagct gctgaacagc atgggcatca gccagcccac cgtcgtattc 480
gtgagcaaga aagggctgca aaagatcctc aacgtgcaaa agaagctacc gatcatacaa 540
aagatcatca tcatggatag caagaccgac taccagggct tccaaagcat gtacaccttc 600
gtgacttccc atttgccacc cggcttcaac gagtacgact tcgtgcccga gagcttcgac 660
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gtagccctac cgcaccgcac cgcttgtgtc cgattcagtc atgcccgcga ccccatcttc 780
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ggcatgttca ccacgctggg ctacttgatc tgcggctttc gggtcgtgct catgtaccgc 900
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gggttactag tacgtctctc aaggataagt aagtaatatt aaggtacggg aggtattgga 4080
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aggctgtccc cagtgcaagt gcaggtgcca gaacatttct ct
서열번호 10
tagttattaa tagtaatcaa ttacggggtc attagttcat agcccatata tggagttccg 60
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ggactttcca aaatgtcgta acaactccgc cccattgacg caaatgggcg gtaggcgtgt 540
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atcctggtcg agctggacgg cgacgtaaac ggccacaagt tcagcgtgtc cggcgagggc 780
gagggcgatg ccacctacgg caagctgacc ctgaagttca tctgcaccac cggcaagctg 840
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ccttataaat caaaagaata gaccgagata gggttgagtg ttgttccagt ttggaacaag 1800
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tctttcctgc gttatcccct gattctgtgg ataaccgtat taccgccatg cat
서열번호 11
tctagatggg gcaactggag atgatgggag aagaaagcct aagggactaa gaggaaagcc 60
acaatctgtc ggtaaatcct gccttgggta gaatcttcta aacctttccc gctttcagca 120
ctcttatcct gtcccacagg caaaggggag tttttaaatc tcctctccat caccatcttg 180
tgttccgccc tggttcctaa ttgtcttact tgagccattc actccatcca gccgagacct 240
tgttttagca gacacacaac tgcctagagt ctacacgccc ctccctttcc caaactaaag 300
tgcttaggga cccagaaaat aggccaggtc ctcgtaacct tatcgaaata gcacagctag 360
gccttccacc caacaacact cagagactgg gccatagggt aggaaacagc atccagagtc 420
ttgtccagac agagcccaga catcttctgt agttaagagc cctctgggta ttctcacgtc 480
ctgccccaaa aaaaggaacc aagcttatct gggggcggtg gggagaaggg ggtgtaagcc 540
aaagctaaag caactaaagc aactgtgttc tgataggaaa gatccctgga ctgagaacaa 600
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ctagactaag gacatcccag gtgggcacgg agagctgcat ttctcgtaaa gcgccctagg 900
agcttctgtt gttcaccaga accacgagcc cctggactgg accgttcaca aggctcgttc 960
cagttagaaa attccatcac tctaagagct gggaggcacc taacctccaa gggagggaga 1020
gggaagtgga tctcccactt gccagcccag ggatgacttc caacagtgcc attacagtaa 1080
tggaaactgc agtgaaggtg ccagggctga cttctgtgaa gaaagaggag gacaggagtt 1140
cccctagtgg ctcatcagaa atgaatctga ctagcatcca tgaggatgca ggttcaatcc 1200
ctggcctcat tcagtggctt aaggatccag cgttgccgag agctgtgatg taggtcacag 1260
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tctgatttga cccctaacct gggaacctcc atatcccgct agtgcggccc ttaaaagaca 1380
aaaagaagga aaagagaaga aaagacatag gcgaacagaa aggcagatga cagggtggca 1440
gggccagcct acacgatggc ccgaccagaa ttcacaaaga agccacaagg atgcaaatca 1500
atcaaataaa cctttgttca aaaaaattta tctcacctgt gagtgggaga gacaagtcac 1560
cccagggctt ctggtgactt caaattgata gggagaaaat ggttgcccca ggggattaaa 1620
agcttggtat ctgctactcc tttagagttg gcctgtctcc tccactttcc cacaattcca 1680
ccatttcccc ctcccactgg gctgggatgc agctgtggag tggctcagct ccaaggacta 1740
ggggctccac agcccaggtc cggcggccag ccctcccact tccagcctgg aagtgggatg 1800
gggagtggga tgagatgaac ccggcagatt gtagccacag atgtggatgt gcagggtcca 1860
gcacagggct tgggtgagga gggcggcacc ccatcccttg tctgaagacc aagcagacag 1920
tactcaggac ttgggagggg gttgggggag gaggagtgca tgaaactgag aagaaccttc 1980
tagctgcctg cgccaggagg tacccgggag ctgaaggaga tggagtgccc cagagcagaa 2040
agcccctgca ggtctggatg ttctaggctg gatgaggggg cgaggcaggc ctggggacct 2100
gggaagacca ggcgcagtac ctgccttgct tctgaaaatg ctgctccaac gtggaaaaac 2160
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gaggttcccg tggagatggg ttccagatga aaagggaagg aggaggcatg ggcgctgcct 2280
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aagggttaaa gccttaaaag gggaccgatt ttgcggggct ctgggggtcg gctggcacac 2400
cctgagcggc cccgcccttc tctctagtgt ccagaaccct ccctgccctg cccaggccta 2460
acggccacag ggggagggcc cccctttact gcagaccgcc actctcccac accaatatcg 2520
gaccgcctcc tcctccctct gccacccctt ctcgctcccc actcagcctc tgattggcc
서열번호 12
tttgaaagac cccacccgta ggtggcaagc tagcttaagt aacgccactt tgcaaggcat 60
ggaaaaatac ataactgaga atagaaaagt tcagatcaag gtcaggaaca aagaaacagc 120
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cttccagcct ggaagtggga tggggagtgg gatgagatga acccggcaga ttgtagccac 3180
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ctgccctgcg gaattgacaa gttccgaggg gtagagtttg tgtgttgccc actggctgaa 4500
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ggagcagaca cagactatgc agatgggagt gaagacaaag tagtagaagt agcagaggag 4620
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cttgcccgct gctggacagg ggctcggctg ttgggcactg acaattccgt ggtgttgtcg 10500
gggaagctga cgtcctttcc atggctgctc gcctgtgttg ccacctggat tctgcgcggg 10560
acgtccttct gctacgtccc ttcggccctc aatccagcgg accttccttc ccgcggcctg 10620
ctgccggctc tgcggcctct tccgcgtctt cgccttcgcc ctcagacgag tcggatctcc 10680
ctttgggccg cctccccgcc tgtttcgcct cgggctcaat cactagtgaa ttcgataaaa 10740
taaaagattt tatttagtct ccagaaaaag gggggaatga aagaccccac ctgtaggttt 10800
ggcaagctag cttaagtaac gccattttgc aaggcatgga aaaatacata actgagaata 10860
gagaagttca gatcaaggtc aggaacagat ggaacagctg aatatgggcc aaacaggata 10920
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ggtccccaga tgcggtccag ccctcagcag tttctagaga accatcagat gtttccaggg 11100
tgccccaagg acctgaaatg accctgtgcc ttatttgaac taaccaatca gttcgcttct 11160
cgcttctgtt cgcgcgcttc tgctccccga gctcaataaa agagcccaca acccctcact 11220
cggggcgcca gtcctccgat tgactgagtc gcccgggtac ccgtgtatcc aataaaccct 11280
cttgcagttg catccgactt gtggtctcgc tgttccttgg gagggtctcc tctgagtgat 11340
tgactacccg tcagcggggg tctttcattt gggggctcgt ccgggatcgg gagacccctg 11400
cccagggacc accgacccac caccgggagg taagctggct gcctcgcgcg tttcggtgat 11460
gacggtgaaa acctctgaca catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg 11520
gatgccggga gcagacaagc ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc 11580
gcagccatga cccagtcacg tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat 11640
cagagcagat tgtactgaga gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa 11700
ggagaaaata ccgcatcagg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg 11760
tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag 11820
aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc 11880
gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca 11940
aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt 12000
ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc 12060
tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc 12120
tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc 12180
ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact 12240
tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg 12300
ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta 12360
tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca 12420
aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa 12480
aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg 12540
aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc 12600
ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg 12660
acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat 12720
ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg 12780
gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa 12840
taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca 12900
tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc 12960
gcaacgttgt tgccattgct gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt 13020
cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa 13080
aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat 13140
cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct 13200
tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga 13260
gttgctcttg cccggcgtca acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag 13320
tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga 13380
gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca 13440
ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg 13500
cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc 13560
agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag 13620
gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca 13680
tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattcatac 13740
cagatcaccg aaaactgtcc tccaaatgtg tccccctcac actcccaaat tcgcgggctt 13800
ctgcctctta gaccactcta ccctattccc cacactcacc ggagccaaag ccgcggccct 13860
tccgtttctt tgct

Claims (13)

  1. 서열번호 1의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터.
  2. 서열번호 4의 염기서열을 포함하는, 신경세포에서 특이적으로 발현하는 Thy1 유전자 프로모터.
  3. 제 1항에 있어서,
    상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함하는 것인, Thy1 유전자 프로모터.
  4. 제2 항에 있어서,
    상기 프로모터는 PBX 및 CREB 전사인자의 결합부위를 포함하는 것인, Thy1 유전자 프로모터.
  5. 서열번호 2 및 서열번호 3의 서열로 이루어지고 제1항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  6. 서열번호 5 및 서열번호 6의 서열로 이루어지고 제2항의 프로모터를 증폭하기 위한 프라이머 세트.
  7. 서열번호 1 또는 서열번호 4의 염기서열을 갖는 Thy1 유전자 프로모터; 및 알츠하이머 질환 관련 유전자;를 포함하는, 재조합 발현 벡터.
  8. 제 7항에 있어서,
    상기 알츠하이머 질환 관련 유전자는, APP 돌연변이 유전자, 타우 (Tau) 돌연변이 유전자 또는 PS1 돌연변이 유전자인, 재조합 발현 벡터.
  9. 제 7항의 재조합 발현 벡터를 도입시켜 형질 전환 시킨 포유동물의 체세포.
  10. 제 7항의 재조합 발현 벡터가 주입된 포유동물 수정란.
  11. 제10항의 수정란을 대리모의 자궁에 착상시켜 얻은 형질전환 포유동물.
  12. 제한효소부위를 포함하고 프로모터 및 유전자 클러스터가 제거된 제1 벡터를 구축하는 단계;
    제2 벡터 내에 제1항의 프로모터, APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자를 각각 삽입하여 재조합 제2 벡터를 제조하는 단계;
    상기 재조합 제2 벡터 상의 APP 유전자, PS1 유전자 및 Tau 유전자 각각에 돌연변이를 유도하는 단계; 및
    상기 제1 벡터 내에 상기 재조합 제2 벡터를 삽입하는 단계:를 포함하는,
    재조합 발현 벡터 제조방법.
  13. 제 12항에 있어서,
    돼지로부터 체세포를 분리하는 단계;
    상기 발현벡터를 상기 체세포에 도입시키는 단계;
    상기 발현 벡터가 도입된 클론 체세포를 선별하여 배양하는 단계;
    대리모로부터 채취한 난자의 핵을 제거하고, 상기 클론 체세포와 융합시키는 단계;
    상기 융합된 복제란을 대리모에 이식하는 단계;를 더 포함하는, 형질전환 돼지의 제조 방법.
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