KR20100003224A - 돼지의 베타 카제인 유전자, 그 프로모터 및 그의 용도 - Google Patents

돼지의 베타 카제인 유전자, 그 프로모터 및 그의 용도 Download PDF

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Abstract

본 발명은 돼지 베타 카제인 유전자, 돼지 베타 카제인 유전자 프로모터, 및 상기 프로모터를 이용한 발현 벡터, 상기 발현 벡터를 이용한 목적단백질의 제조방법을 제공한다. 본 발명의 프로모터는 목적 단백질의 유선특이적 발현을 촉진하므로, 본 발명의 프로모터를 이용하여 형질전환된 동물은 유즙 중에 목적단백질을 고농도로 분비하게 되어 유용단백질의 생산에 유용하게 사용될 수 있다는 장점을 갖는다.
돼지 베타 카제인, 프로모터, 벡터

Description

돼지의 베타 카제인 유전자, 그 프로모터 및 그의 용도{A Gene of porcine beta casein, a Promoter of the same and Use thereof}
본 발명은 돼지 베타 카제인 유전자, 돼지 베타 카제인 유전자 프로모터, 이를 포함하는 발현벡터, 및 이를 이용한 목적단백질의 제조방법에 관한 것이다.
의약 분야에서 경제적 부가가치가 높은 EPO등 유용단백질의 생산을 극대화하는 방법으로서 세포배양법에 의한 대량생산방법이 주로 사용되고 있다.
대한민국 특허출원 제94-12082호에는 변형된 재조합인간적혈구 조혈인자(rhEPO) 유전자를 포함하는 발현벡터가 개시되어 있으며, 이 발현벡터로 형질전환시킨 동물세포주 COS-7(ATCC CRL 1651, African Green Monkey Kidney Cell)에서는 EPO를 대량 생산 할 수 있었으나, 이 방법에서는 계속적으로 형질전환을 시켜야 한다는 번거로움으로 인하여 대량 생산에는 부적합한 문제가 있다. 대한민국 특허 공고 제10-0232640호, 제10-0434729호 등에서도 형질전환 세포주 배양법으로 EPO를 생산하는 방법이 개시되어 있으나, 이 세포배양방법은 동물의 혈액을 배양 배지로 이용하기 때문에 생산 비용이 높아지고, 배양기술에 있어서 전문적인 지식이 요구된다.
반면, 형질전환동물을 이용한 유용단백질 생산방법은, 동물이 분비하는 체액중에 목적단백질이 포함되므로 기존의 세포배양법에 비해 목적단백질의 생산, 분리, 정제가 용이하며, 활성 또한 우수하게 유지되므로 이 분야에 대한 관심이 급증하고 있다. 대한민국 특허 제10-0358754호에는 돼지의 유즙속에서 EPO를 생산하는 형질전환동물(새롬이)이 개시되어 있으나, 여기에 사용한 프로모터는 유즙의 구성성분 중 작은 부분을 차지하는 유청 성분의 프로모터(WAP)이었다.
본 발명자들은 유즙 내에서 목적단백질을 높은 효율로 발현하는 유선특이적 프로모터를 개발하기 위하여, 연구한 결과 베타 카제인 유전자 및 그 프로모터에 대한 염기서열을 규명하고 본 발명을 완성하였다.
본 발명에서는 돼지 베타 카제인 유전자 및 그 프로모터를 제공하고, 이를 이용하여 목적단백질을 대량 생산하는 방법을 제공하고자 한다.
본 발명은 돼지 베타 카제인 유전자를 제공한다.
본 발명의 베타 카제인 유전자는 구체적으로 프로모터, 및 3' UTR(untranslated region) 부위를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 포함한다.
본 발명은 또한 서열번호 1의 염기서열 중 1번째부터 5480번째까지 염기서열에 해당하는 서열번호 2의 프로모터를 제공하며, 상기 프로모터는 구조유전자의 5'쪽에 위치하여 구조유전자의 발현을 조절한다.
본 발명의 돼지 베타 카제인 유전자, 또는 프로모터는 서열번호 1 또는 서열번호 2의 염기서열에 하나 이상의 붕괴(disruption), 결실(deletion), 삽입(insertion), 점(point), 치환(substitution), 논센스(nonsense), 미스센스(misinse), 다형현상(polymorphism), 재배열 돌연변이(mutation)가 일어나 기능적 등가물 중 선택된 하나가 될 수 있다.
본 발명은 또한 서열번호 2의 프로모터 전체 또는 일부를 포함하는 발현벡터를 제공한다. 바람직하게, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 염기서열을 본 발명의 발현벡터는 포함한다. 상기 서열번호 2, 서열번호 3, 또는 서열번호 4의 염기서열은 벡터에 삽입되어 프로모터의 역할을 하며, 상기 서열을 프로모터 서열 또는 돼 지베타 카제인 유전자 프로모터 서열이라 한다. 본 발명에서 사용하는 '돼지 베타 카제인 유전자 프로모터'라는 용어는 돼지 베타 카제인 유전자로부터 유래한 프로모터를 의미한다.
서열번호 3, 서열번호 4는 서열번호 1의 돼지 베타 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 각각 67 번째부터 5299번째까지의 염기서열, 561번째부터 5480번째까지의 염기서열에 해당하며, 공통적으로 서열번호 1의 염기서열 중 561번째부터 5299번째까지의 염기서열을 포함하며, 엑손 1 영역을 포함한다.
본 발명의 발현 벡터는 필요에 따라 적절한 위치에 조절인자들, 즉 또 다른 프로모터, 인핸서(enhancer), 선택적 표지 유전자(selective marker), 5'-UTR(untranslated region), 3'-UTR, 폴리아데닐화 신호(polyadenylation signal), 리보솜결합서열, 게놈의 특정 부위로 삽입될 수 있는 염기서열, 인트론, 또는 WPRE(woodchuck hepatitus virus posttranscriptional regulatory element) 등을 추가로 포함함으로써, 형질전환 세포주의 구축을 용이하게 하며, 목적단백질 발현량의 극대화 및 발현의 안정성을 도모할 수 있다.
선택적 표지 유전자는 네오마이신 저항성 유전자(neomycin-resistant gene) 등을 사용하며, 시판하는 벡터로부터 해당 부분을 절단하여 사용할 수 있다. 네오마이신 저항성 유전자는 세포주 구축시 사용되는 G418 시약{(2R,3S,4R,5R,6S)-5-amino-6-[(1R,2S,3S,4R,6S)-4,6-diamino-3-[(2R,3R,4R,5R)-3,5-dihydroxy-5-methyl-4-methylaminooxan-2-yl]oxy-2-hydroxycyclohexyl]oxy-2-(1-hydroxyethyl)oxane-3,4-diol} 시약에 대해 저항성을 나타내는 유전자로, 프로모터 조절하에 단백질을 발현하는 동물세포주 구축시 효율적인 선택적 표지 유전자로 작용할 수 있다.
인슐레이터는 프로모터 부근에 존재하는 조절인자의 영향을 돕고, 위치 비의존적인(position-independent)발현을 도와주는 인자로, 프로모터의 조절하에 단백질을 안정적으로 발현할 수 있게 하며, 시판되는 벡터로부터 해당 부분을 절단한 것일 수 있다.
WPRE는 mRNA의 안정화에 기여하여 단백질 합성량을 증대시킬 수 있는 조절인자로, 프로모터의 조절하에 단백질을 대량으로 발현할 수 있게 한다. WPRE 역시 시판되는 벡터로부터 절단한 것일 수 있다.
본 발명의 발현벡터는 또한, 서열번호 5 염기서열을 추가로 포함한다. 상기 서열번호 5의 염기서열은 벡터의 3'arm을 형성하며, 형질전환 세포주의 구축을 용이하게 하며, 목적단백질 발현량의 극대화 및 발현 안정성을 도모할 수 있다.
서열번호 5는 서열번호 1의 돼지 베타 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 10474번째부터 15485번째까지의 염기서열에 해당하며, 엑손 9번 영역을 포함한다.
돼지 베타 카제인 유전자 전체 게놈 서열 중 서열번호 3, 4, 5의 염기서열 위치는 도 1에 나타낸 바와 같다.
본 발명의 벡터는 바람직하게는 서열번호 3의 염기서열, 및 서열번호 5의 염기서열을 포함하도록 제작된다.
구체적으로 본 발명의 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 것으로, pBC1-pig β casein벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11327BP로 기탁하였다. 본 발명의 발현벡터 pBC1-pig β casein벡터는 pBC1 벡터를 기본 골격으로 사용하며, 선택적 표지 유전자로 네오마이신 저항성 유전자가 융합되어 있다.
본 발명의 발현벡터는 프로모터 영역 염기서열의 3' 쪽으로 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 추가로 포함함으로써, 목적단백질을 발현할 수 있다.
상기 목적단백질은 산업상 이용가능한 유용단백질로, 일 예로 의약품의 유효성분으로 사용되는 모든 단백질, 즉 EPO(erythropoietin), 알도스테론(aldosterone), 아드레노코티코트로핀(adreno-corticotropin), 혈액응고인자(blood clotting factor), 고나도트로핀(gonado-tropin), 인슐린(insulin), 프로락틴(prolactin), 또는 바소프레신(vasopressin) 등일 수 있으며, 바람직하게는 hEPO(human erythropoietin)이다.
본 발명은 상기 네오마이신 저항성 유전자, 인슐레이터, WPRE 등을 포함하는 발현벡터의 바람직한 예로 도 3의 개열지도를 갖는 벡터를 제공하며, 구체적으로 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11328BP로 기탁하였다.
본 발명의 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터는 pBC1 벡터를 기본 골격으로 사용하며, 본 발명의 프로모터 영역의 3'쪽에 인간EPO를 암호화하는 유전자, 및 인간EPO 유전자의 3'쪽에 WPRE가 융합되어 있다.
본 발명의 발현벡터는 낙인벡터(knock-in vector)로 제조될 수 있다.
"낙인벡터"는 게놈의 특정 유전자 위치로 목적하는 유전자를 삽입할 수 있는 벡터로, 상동 재조합(homologous recombination)이 일어나도록 타겟팅하고자 하는 특정 유전자에 상동인 염기서열을 포함한다. 본 발명의 낙인벡터는 목적 단백질을 코딩하는 핵산서열이 게놈상의 베타 카제인 유전자에 삽입되는 베타 카제인 타겟팅 벡터이다.
본 발명의 낙인벡터는 바람직하게는 서열번호 4의 염기서열, 및 서열번호 5의 염기서열을 포함하도록 제작된다.
본 발명의 낙인벡터는 필요에 따라 포지티브 및/또는 네거티브 선별유전자를 사용하여 형질전환된 세포를 선별할 수 있다. 선별유전자란 벡터로 형질전환된 세포를 선별하기 위한 것으로, 약물내성, 영양요구성, 세포 독성제에 대한 내성 또는 표면단백질의 발현과 같은 선택가능 표현형을 부여하는 유전자들이 사용될 수 있고, 포지티브 선별유전자와 네거티브 선별유전자가 있다.
포지티브 선별유전자란 선택제가 처리된 환경에서 선택유전자를 발현하는 세포만 생존하도록 하여 포지티브 선택을 가능하게 하는 유전자로 네오마이신(Neomycin; Neo) 저항성 유전자, 하이그로마이신(Hygromycin; Hyg) 저항성 유전자 등이 있다.
네거티브 선별유전자는 무작위적 삽입이 일어난 세포를 선별하여 제거하는 네거티브 선택을 가능하게 하는 유전자로 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase; HSV-tk) 유전자, 하이포잔틴 포스포리보실 트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphoribosyl transferase; Hprt) 유전자, 싸이토신 디아미나제(cytosine deaminase) 유전자, 디프테리아 톡신(Diphtheria toxin) 유전자 등이 있다. 네가티브 선별유전자는 프로모터 영역의 5'말단 쪽 또는 3'arm의 3'말단 쪽에 위치한다.
포지티브 선별유전자 및 네거티브 선별유전자는 별개의 프로모터, 폴리A등을 가질 수 있으며, 사용되는 프로모터는 원숭이 바이러스 40(SV40), 마우스 유방 종양 바이러스(MMTV) 프로모터, HIV의 긴 말단 반복부(LTR) 프로모터, 몰로니 바이러스, 시토메갈로바이러스(CMV) 프로모터, 엡스타인 바 바이러스(EBV) 프로모터, 로우스 사코마 바이러스(RSV) 프로모터, 또는 포스포글리세레이트키나제(phosphoglycerate kinase;PGK) 프로모터 등이 있다.
본 발명의 낙인벡터와 게놈상의 베타 카제인 유전자가 상동 재조합이 일어나면 벡터상의 목적 단백질을 코딩하는 핵산이 숙주세포의 베타 카제인 게놈 유전자로 통합(integration)되어, 숙주세포의 베타 카제인 단백질 대신 발현된다.
본 발명은 포지티브 선별유전자로 네오마이신 저항성 유전자, 및 네거티브 선별유전자로 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk)를 사용하는 낙인벡터의 바람직한 예로 도 4의 개열지도를 갖는 벡터를 제공하며, 구체적으로 Pig β casein-hEPO knock in 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11329BP로 기탁하였다.
본 발명의 Pig β casein-hEPO knock in 벡터는 Lox A 벡터를 기본 골격으로 사용하며, 프로모터(도 4의 Pig β casein 5' arm 부분을 의미함)의 3'쪽에 hEPO, hEPO의 3' 쪽에 포지티브 선별유전자로 네오마이신 저항성 유전자, 네오마이신 저항성 유전자 3' 쪽에 3'arm(도 4의 Pig β casein 3' arm 부분을 의미함), 및 3'arm의 3' 쪽에 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk) 유전자(TK)가 융합되어 있다.
본 발명의 벡터제작은 당해 기술분야에서 잘 알려진 유전자 재조합 기술을 이용하여 제조할 수 있으며, 부위-특이적 DNA 절단 및 연결은 당해 기술분야에서 일반적으로 알려진 효소 등을 사용한다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포를 제공한다.
본 발명의 벡터가 도입되는 동물의 체세포는 돼지 등 유래로, 1차, 2차 또는 영구세포일 수 있다.
상기 세포 내로 본 발명의 벡터를 도입하는 방법은 핵산을 세포내로 도입하는 방법을 모두 사용할 수 있으며, 당 분야에서 공지된 기술 즉, 일렉트로포레이션(electroporation), 칼슘 포스페이트 공동-침전(calcium phosphate co-precipitation), 레트로바이러스 감염(retroviral infection), 미세주입법(microinjection), DEAE-덱스트란(diethylaminoethyl-dextran), 양이온 리포좀(cationic liposome) 법 등을 사용할 수 있다. 이 경우 벡터는 원형의 벡터를 적절한 제한효소로 절단하여 선형의 벡터 형태 또는 플라스미드를 제거한 선형의 벡터 형태로 도입할 수 있다.
본 발명의 프로모터 유전자는 유선조직에서만 특이적으로 단백질을 발현시킨다. 돼지의 유즙 중 단백질 구성성분은 카제인이 90%를 차지하고 있으며, 카제인은 다시 알파, 베타, 감마 카제인으로 나누어 진다. 그 중 베타 카제인이 27%로 상당 부분을 차지하므로, 돼지 베타 카제인 프로모터를 이용한 벡터는 유즙분비하는 동물, 특히 돼지에게서 유선특이적으로 외부에서 유래한 목적 단백질을 발현하도록 할 수 있다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포의 핵을 탈핵된 난자에 핵이식하여 만든 동물 수정란을 제공한다.
"핵이식"은 핵이 제거된 난자에 세포의 핵을 넣어 이식시키는 것을 의미하며, 이런 핵이식된 수정란을 착상시켜서 태어난 개체는 핵공여 세포의 유전적 물질이 핵수여 세포질로 그대로 전달되었기 때문에 유전적으로 완전히 동일한 복제 개체가 된다.
본 발명은 또한 본 발명의 발현 벡터를 주입시킨 동물 수정란을 제공한다.
상기 주입은 구체적으로, 수정직후 전핵단계에 있는 접합체의 웅성전핵 내에 미세조작기술로서 유전자를 주입하는 미세주입법(Microinjection technique), 배아 간세포(embryonic stem cells)에 유전자를 삽입시키고 이를 배반포기의 수정란 내에 이식하는 방법(Stem cell insertion technique), 레트로바이러스 벡터(Retroviral vector)를 이용하여 유전자를 수정란 내에 주입하는 방법(Retroviral insertion technique), 유전자를 수컷의 정소 내에 주입하여 유전자를 정자에 삽입시키고 이를 난자와 수정시키는 방법(Sperm-mediated gene transfer technique) 등에 의할 수 있으며, 바람직한 예는 미세주입법이다.
본 발명은 또한 본 발명의 동물 수정란을 이식시켜 얻은 형질전환동물을 제공한다.
본 발명의 발현벡터로 형질전환될 수 있는 동물은 유즙을 분비하는 모든 동물, 즉 돼지, 생쥐, 소, 양, 또는 염소 등이다.
본 발명의 발현 벡터를 이용한 형질전환동물의 생산 방법은 통상적인 방법에 의한다.
즉, 형질전환하고자 하는 동물 중 쥐 등의 건강한 개체로부터 수정란을 채취하고, 수정란에 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후, 정관결찰 생쥐 등을 이용하여 위임신 생쥐 등을 얻고, 이를 대리모로 하여 난관 내에 수정란을 이식한 후, 대리모로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정으로 이루어질 수 있다.
또한, 돼지 등의 건강한 개체로부터 난포란을 채취하고 체외성숙용 배양액에서 배양한다. 아울러 돼지 등의 태아로부터 채취, 배양한 공여체세포로 본 발명의 발현 벡터를 도입한 후 벡터가 도입된 체세포를 선별, 배양한다. 상기 체외성숙된 난자에서 핵을 제거하고, 이 공간에 공여세포를 주입한 다음, 전기 융합을 통해 핵이식이 완료된 난자의 공여세포와 세포질을 융합시킨 후 체외배양한다. 이 복제수정란을 과배란을 유도한 수란돈에 이식한 후, 수란돈으로부터 얻은 자손 중 형질전환된 개체를 선별하는 과정을 거친다.
이후 형질전환된 것으로 확인된 개체로부터 유즙을 수거한 후, 목적단백질을 분리, 정제함으로써 목적단백질을 제조하게 된다(A. Gokana, J.J. Winchenn, A. Ben-Ghanem, A. Ahaded, J.P. Cartron, P. Lambin(1997) Chromatographic separation of recombinant human erythropoietin isoforms, Journal of chromatography, 791, 109-118).
본 발명의 목적단백질 제조방법에서 분리, 정제 방법은 통상적으로 사용되는 방법을 사용할 수 있으며, 구체적으로는 여과법 또는 크로마토그래피법 등이 될 수 있다.
이렇게 하여 제조되는 본 발명의 형질전환동물은 유즙 중에 목적단백질을 발현할 수 있다.
따라서, 본 발명의 돼지 베타 카제인 유전자, 프로모터, 및 이를 이용한 발현벡터 및 형질전환동물은 목적단백질의 생산분야에 유용하게 사용될 수 있다.
본 발명에서 유전공학적 기술과 관련된 사항은 샘브룩 등의 문헌(Sambrook, et al. Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y., 2001) 및 프레드릭 등의 문헌 (Frederick M. Ausubel et al., Current protocols in Molecular Biology volume 1, 2, 3, John Wiley & Sons, Inc., 1994)에 개시되어 있는 내용을 참조할 수 있다.
돼지 베타 카제인 유전자 프로모터는 목적 단백질의 유선특이적 발현을 촉진하므로, 본 발명의 프로모터, 및 이를 이용한 발현벡터에 의해 형질전환된 동물은 유즙 중에 목적단백질을 고농도로 분비하게 되어 의약학적으로 중요한 가치를 갖는 유용단백질의 생산분야에 유용하게 사용될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 실시예 에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
< 실시예 1> 돼지 베타 카제인 유전자의 분리 및 클로닝
본 발명의 유선 특이적 벡터(vector)를 제작하기 위해 국립축산과학원(경기도 수원시 권선구 축산길 77 오목천동 564 국립축산과학원, 대한민국)에서 제공받은 BAC(bacterial artificial chromosome) clone을 가지고 돼지의 베타 카제인 유전자(pig β casein gene)의 염기서열(sequence)을 밝혔다.
1) BAC clone 을 이용한 돼지의 베타 카제인 염기서열 분석
돼지 베타 카제인 유전자의 염기서열을 밝히기 위하여 미국 국립생물공학정보센터(http://www.ncbi.nlm.nih.gov, AY452035)에 등록 되어져 있는 돼지 베타 카제인 프로모터 부분 5.5kb의 염기서열을 참조하여 한 쌍의 Forward primer 5- TCTTGAAAACCTACCAAGTGC - 3 (서열번호 6), Reverse primer 5- ATTCGTACAACACGGTCATTT 3(서열번호 7) 프라이머(primer)를 제작 하였다. 서열번호 6의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열 중 2719번째부터 2739번째까지 염기서열에 해당하고서열번호 7의 염기서열은 서열번호 1의 염기서열 중 3284번째부터 3304번째까지 염기서열에 해당하는 영역이다. 이 프라이머를 사용하여 PCR증폭 방법(94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 30초간 신장반응)으로 확인되는 4개(155F1, 188A9, 616B6, 874E5)의 클론(clone)을 국립축산과학원으로부터 입수하였다.
4개의 clone을 가지고 돼지의 베타 카제인 유전자를 찾기 위해 베타 카제인 염기서열이 밝혀진 사람, 소, 말과 생쥐의 베타 카제인 cDNA 염기서열을 비교하여 종 간에 높은 상동성과 보존된 부분을 참조하여, 돼지 베타 카제인 PCR 증폭에 사용될 프라이머 염기서열 (서열번호 8 ~ 서열번호 13)을 제작하였다.
이름 프라이머 서열번호
ATG up 정방향 5- AGAGAACTCTATCCAATCACTT 3 8
ATG up 역방향 5- GCAAGGATGAGGAGCTTCAT 3 9
ATG down 정방향 5- ATGAAGCTCCTCATCCTTGC 3 10
ATG down 역방향 5- TCTGCTGGAGATTTAGGGAAG 3 11
3 down 정방향 5- CTTCCCTAAATCTCCAGCAGA 3 12
3 down 역방향 5- GTTGTCACATTTCCAGTCACA 3 13
제작한 프라이머를 가지고 4개의 BAC clone중 616B6를 주형(Template)로 하여 PCR 증폭으로 0.5kb (서열번호 14), 4.0kb(서열번호 15), 1.7kb(서열번호 16)의 산물을 얻어 pGEM T 벡터에 클로닝(cloning) 하여 계속적인 염기서열 분석법(sequencing)을 통해 염기서열을 밝혔다.
염기서열 분석용 프라이머 서열번호
4.0kb에 사용 5- CCTGTGTCTATTGAACAGAGA 3 17
5- AGAAGGAAGAACTCAATGCAT 3 18
5- AATGGTACATCACTAAACTTTG 3 19
5- GGTGTGATCTGTTTTCTAGGA 3 20
5- GTGTGACAACTTGCATAGTTAT 3 21
1.7kb에 사용 5- GTCCAAGTTTATTCACTGTGC 3 22
상기 PCR 증폭으로 찾아낸 염기서열의 위치 구조는 도 1에 도시된 바와 같다.
분석한 염기서열을 이용하여 특이적인 프라이머를 제작 후 BAC clone 616B6를 주형으로 반복적인 염기 서열 분석법 (서열번호 23 ~ 서열번호 30)을 통하여 돼지 베타 카제인 3 쪽 6.5kb (서열번호 31)염기서열을 밝혔다.
서열번호 염기서열 분석용 프라이머
23 5'-TGGTGCTGTATAAGTTAGGCT-3'
24 5'-TAAGTCCTTGACATTGCTGAG-3'
25 5'-CTTTGCATCGTCTCTTCTGG-3'
26 5'-ACCCAATACTCCTAACAATGC-3'
27 5'-CCTCAGAAACTGTAATAGTTG-3'
28 5'-CCTTTCTGCTGTATCCTCAC-3'
29 5'-CAGGATGTCGCTTGAACAAG-3'
30 5'-GGAGACTAGTGTCACCAAAC-3'
2) 버크샤(Berkshire)종의 돼지로부터 베타 카제인 염기서열 분석
Bac clone으로부터 얻은 돼지의 베타 카제인의 DNA 염기서열을 바탕으로 버크샤 종 돼지의 genomic DNA로부터 베타 카제인의 염기서열을 분석하였다. genomic DNA는 첨단양돈연구소(경상남도, 대한민국)에서 분양 받은 돼지 체세포로부터 intron사(한국)의 Genomic DNA Extraction kit(cat. No. 17231)를 사용하여 분리한 것을 사용하였다. 찾아낸 베타 카제인 12.6kb와 이미 밝혀진 5.5kb의 염기서열을 부쳐 총 17.7kb의 염기서열을 5부분(3.6kb, 3.9kb, 4.2kb, 3.3kb, 3.8kb)으로 나눈 프라이머 (서열번호 32 ~ 서열번호 41)로 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 4분간 신장반응)한 후, 각각의 pGEM-T 벡터에 클로닝 한 후 염기서열을 분석했다. 염기서열 분석은 솔젠트 (solgent, 한국)에 의뢰하였다.
프라이머 서열번호
정방향 3.6kb 5'-ATCAGATGTTATTTTATGTGGCTAATC-3' 32
역방향 3.6kb 5'-ATTTTTAGAAGAAGAGCATATTTGTCA-3' 33
정방향 3.9kb 5'-AGGGTATTTGTGGGTATTTAAGATAGT-3' 34
역방향 3.9kb 5'-AATGGTACATCACTAAACTTTGACTCT-3' 35
정방향 4.2kb 5'-TCTCTCTCTATATTAACCTCATTCACTG-3' 36
역방향 4.2kb 5'-CCTTTTGTGATCATGATATAGTAAACA-3' 37
정방향 3.3kb 5'-CAGTTGCCTATACACTTACACTTGAT-3' 38
역방향 3.3kb 5'-AGTCATGGTCTAAAGTGGAATGGGA-3' 39
정방향 3.8kb 5'-AACTAACATTTCTTCTCTTAGGTATAC-3' 40
역방향 3.8kb 5'-AAAGGATTATATGCTATCTAATATAGAGT-3' 41
그 결과 버크샤 종의 돼지 베타 카제인 genomic DNA 염기서열(서열번호 1) 및 염기서열 정보를 알아내었다.
서열번호 1의 염기서열은 돼지 베타 카제인 유전자의 전체 게놈서열이며, 크기는 17660bp이다. 서열번호 1의 염기서열 중 구조 유전자(gene) 부위는 3067번째부터 11460번째까지의 염기서열이며, 시작코돈은 5501번째부터 5503번째까지 염기서열이고, 종결코돈은 10381번째부터 10383번째까지 염기서열이다. 또한 5'UTR부위는 3067번째부터 3087번째까지의 염기서열, 및 5489번째부터 5500번째까지 염기서열이고, 3'UTR부위는 10384번째부터 10419번째까지 염기서열, 및 11154번째부터 11460번째까지 염기서열, 폴리에이시그널부위는 11440번째부터 11445번째까지 염기서열이다. 엑손부위는 3074번째부터 3087번째까지 염기서열, 5489번째부터 5551번째까지 염기서열, 6287번째부터 6313번째까지 염기서열, 6432번째부터 6458번째까지 염기서열, 7784번째부터 7807번째까지 염기서열, 7902번째부터 7946번째까지 염기서열, 9253번째부터 9771번째까지 염기서열, 10378번째부터 10419번째까지 염기서열, 11154번째부터 11460번째까지 염기서열 부분이고, 인트론 부위는 3088번째부터 5488번째까지 염기서열, 5552번째부터 6286번째까지 염기서열, 6314번째부터 6431번째까지 염기서열, 6459번째부터 7783번째까지 염기서열, 7808번째부터 7901번째까지 염기서열, 7947번째부터 9252번째까지 염기서열, 9772번째부터 10377번째까지 염기서열, 및 10420번째부터 11153번째까지 염기서열이며, CDS(coding sequence)는 5501번째부터 5551번째까지 염기서열, 6287번째부터 6313번째까지 염기서열, 6432번째부터 6458번째까지 염기서열, 7784번째부터 7807번째까지 염기서열, 7902번째부터 7946번째까지 염기서열, 9253번째부터 9771번째까지 염기서열, 및 10378번째부터 10383번째까지 염기서열이다.
또한, 베타 카제인 아미노산 염기서열(서열번호 42)를 분석하였다.
도 1의 63/12-ATG-48은 돼지 베타 카제인 2번째 엑손의 염기서열 63개중 12개의 염기서열 다음 ATG (시작코돈)가 존재하며 이후로 48개의 엑손 2번째 염기서열을 갖는 것을 의미한다. 42/3-TAA-36 은 돼지 베타 카제인 8번째 엑손의 염기서열 42개중 3개의 염기서열 다음 TAA (종결코돈)가 존재 하며 이후로 36개의 엑손 염기서열을 갖는 것을 의미한다.
분석한 돼지 베타 카제인 염기서열과 정보는 미국 국립생물공학정보센터에 등록 (EU025876)하였다.
< 실시예 2> pBC1 - pig beta casein 클로닝 벡터 구축
pBC1 벡터(Invitrogen, 미국)의 앰피실린(Ampicillin) 저항성을 가진 유전자를 네오마이신(Neomycin) 저항성 유전자로 치환한 벡터{G418 drug에 저항할 수 있는 neo' 유전자는 pEGFP-N1 벡터(Clontech, 미국)로부터 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3'(서열번호 43)와 역방향 프라이머인 5'- CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3'(서열번호 44)을 이용하여 1.9 kb PCR 산물(서열번호 45)을 증폭하여 수득하였으며, 이 후 pGEM T-easy 벡터(promega, 미국)에 클로닝하였다. T-벡터에 클로닝된 1.9 kb neo 유전자는 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 삽입 부위를 준비하였다. 또한, pBC1 벡터의 amp 유전자 (ampicillin-resistance gene) 부위를 NotI과 PvuI 제한효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 절단하여 제거한 후 벡터 부위를 준비하였다. 이렇게 준비된 두 삽입조각 및 벡터 부위를 라이게이션을 통해, neo 유전자(neomycin-resistance gene)가 삽입된 pBC1 벡터를 구축하였다.}에 유산양(Goat) 베타카제인(beta casein) 프로모터(promoter) 부위와 3'genomic DNA 부위를 각각 프로모터 염기서열과 3'arm 염기서열로 치환시킨 클로닝 벡터를 구축하였다.
프로모터 염기서열 5.3kb(서열번호 3)와 3'arm 염기서열 5.0kb(서열번호 5)를 프라이머 염기서열(서열번호 46 ~ 서열번호 49)을 이용한 PCR증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 5분간 신장반응)으로 산물을 얻은 뒤 각각 pGEM-T벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다.
프라이머 서열번호
프로모터 증폭용 정방향 프라이머 5'-GGATCCGCTATGCAATCTCATGGAAAG -3' 46
프로모터 증폭용 역방향 프라이머 5'-CTCGAGTGACCAGGGTCAACATCTACT-3' 47
3'arm 증폭용 정방향 프라이머 5'-CTCGAGCTGCACTTCATTCTCCTGGATAA-3' 48
3'arm 증폭용 역방향 프라이머 5'-GCGGCCGCTTACAGTAAGACCTTCAGGAGCA-3' 49
돼지의 베타 카제인 프로모터 염기서열에 존재하는 BamHI site(GGATCC) 2곳을 하기와 같이 반복적인 point mutation을 통해 BamHI 제한 효소로 잘리지 않게 하였다. point mutation을 위해 2곳 중 먼저 한 곳을 정해 프라이머를 제작하였다.
돼지 베타 카제인 5' 프로모터 부위가 포함된 pGEM-T 벡터 DNA를 정제 후 주형으로 사용될 DNA 20 ng 과 한 쌍의 point mutation 프라이머를 사용하여 95℃ 30 초 (1반복), 95℃ 30초, 55℃ 1분, 72℃ 8분 30초 (15 반복) 의 조건으로 PCR 증폭하였다. 주형으로 사용된(point mutation 이 안된) DNA를 제거하기 위해 MutazymeTM 효소(iNtRON Biotechnology, 대한민국)를 1 ul 첨가 후 37 ℃ 에서 1시간 반응시켰다. 상기 반응물 10 ul를 DH10B competent cell(Invitrogen, 미국)에 형질전환(Transfomation)시키고 LB+Ampicillin 고체 배지(sigma, 미국.)에 plating 후 37℃에서 20시간 배양 시켰다. LB+Ampicillin 고체 배지에서 자란 콜로니를 LB+Ampicillin 액체 배지(sigma, 미국)에 키운 후 DNA를 정제하여 염기서열 분석 방법으로 BamHI site가 point mutation(GGATCC -> GGACCC) 되었는지 확인하였다. 한 곳에 Point mutation된 콜로니의 DNA를 사용하여 남은 한 곳의 BamHI site도 상기와 같은 방법으로 point mutation 시켰다. 여기서 사용된 point mutation 방법은 인트론사의 제품 Site Direct Mutagenesis kit를 사용하였다.
프로모터 염기서열 point mutation에 사용된 프라이머 염기서열은 이하의 표와 같다.
프라이머 서열번호
1차 포인트 뮤테이션용 정방향 프라이머 5'-ACAGCCACGCAGGGTCCTATCTGCATG-3' 50
1차 포인트 뮤테이션용 역방향 프라이머 5'-CATGCAGATAGGACCCTGCGTGGCTGT-3' 51
2차 포인트 뮤테이션용 정방향 프라이머 5'-CTCAGTGGGTTAAGGGTCCAGCATTGCTGTG-3' 52
2차 포인트 뮤테이션용 역방향 프라이머 5'-CACAGCAATGCTGGACCCTTAACCCACTGAG-3' 53
3arm 염기서열에도 BamHI site가 한곳이 존재 하는데 상기의 프로모터 부위를 point mutation 시키는 방법과 동일하게 point mutation을 시켰다.
3 arm 염기서열 point mutation에 사용된 프라이머 염기서열은 이하의 표와 같다.
프라이머 서열번호
1차 포인트 뮤테이션용 정방향 프라이머 5'-GGACAAGAGTGTGGGTCCACTGTGGGAAG-3' 54
1차 포인트 뮤테이션용 역방향 프라이머 5'-CTTCCCACAGTGGACCCACACTCTTGTCC-3' 55
pGEM-T 벡터에 들어 있는 돼지 베타 카제인 프로모터 염기서열을 BamHI과 XhoI(New England Biolabs (NEB), 미국)으로 잘라 8.3kb의 벡터를 준비하였다. 또한, 3'arm 염기서열을 XhoI과 NotI(New England Biolabs (NEB), 미국.)으로 잘라 5.0kb의 삽입물(insert)(서열번호 5)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션(ligation)하여 pGEM-T-pig β casein 5'+3'을 클로닝하였다.
pBC1 벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 10kb의 벡터를 준비하였고 pGEM-T-pig β casein 5'+3'벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 10.3kb의 삽입물을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션하여 pBC1-pig β casein 클로닝 벡터를 구축하였다.
완성된 pBC1-pig β casein 클로닝 벡터의 구조는 도 2와 같다.
도 2의 P β- casein은 엑손 1(E1)을 포함하는 프로모터 염기서열(서열번호 2)이다. 엑손 1은 서열번호 1의 염기서열 중 5'-3'방향으로 가장 먼저 배열되는 엑손을 의미한다.
도 2의 β-casein 3'genomic DNA는 엑손 9(E9)를 포함하는 3'arm 염기서열 (서열번호 5)이다. 엑손 9는 각각 서열번호 1의 염기서열 중 5'-3'방향으로 9번째 엑손을 의미한다.
XhoI 제한효소 자리를 갖게 되므로, 목적단백질의 유전자를 벡터에 삽입할 수 있다.
2Xβ-globin insulator, 및 pBR322는 pBC1벡터로부터 기원하는 인슐레이터와 벡터구성요소이며, Neomycin은 네오마이신저항성유전자로 pEGFP-N1 벡터 (Clontech, 미국) 로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 pBC1-pig β casein 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행에 기탁번호 KCTC 11327BP로 기탁하였다.
< 실시예 3> pBC1 - pig beta casein + hEPO - WPRE 벡터 구축
pBC1 벡터(Invitrogen, 미국)의 엠피실린(Ampicillin) 저항성을 가진 유전자를 네오마이신(Neomycin) 저항성 유전자로 치환한 벡터(G418 drug에 저항할 수 있는 neo' 유전자는 pEGFP-N1 벡터(Clontech, 미국)로부터 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGCGCGTCAGGTGGCAC-3'(서열번호 43)와 역방향 프라이머인 5'-CGATCGGACGCTCAGTGGAACGAAAACTC-3'(서열번호 44)을 이용하여 1.9 kb PCR 산물(서열번호 45)을 증폭하여 수득하였으며, 이 후 pGEM T-easy 벡터에 클로닝하였다. T-벡터에 클로닝된 1.9 kb neo 유전자는 NotI과 PvuI 제한효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 절단하여 삽입 부위를 준비하였다. 또한, pBC1 벡터의 amp 유전자 (ampicillin-resistance gene) 부위를 NotI과 PvuI 제한효소로 절단하여 제거한 후 벡터 부위를 준비하였다. 이렇게 준비된 두 삽입조각 및 벡터 부위를 라이게이션을 통해, neo 유전자(neomycin-resistance gene)가 삽입된 pBC1 벡터를 구축하였다.)에 에리트로포이에틴(hEPO)을 클로닝 하고 벡터에 존재하는 유산양(Goat) 베타카제인 (beta casein) 프로모터 (promoter) 부위와 3' genomic DNA 부위를 프로모터 염기서열(서열번호 3) 및 3' arm 염기서열(서열번호 5)로 치환시켰다. 또한 mRNA를 안정화하여 단백질 발현을 증대시킨다고 알려진 WPRE(woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element)를 hEPO 3' 쪽에 추가함으로써 hEPO 단백질의 발현을 극대화시키도록 하였다.
hEPO와 WPRE 각각을 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 hEPO는 2분 30초, WPRE는 30초간 신장반응)으로 2.3kb(서열번호 60)와 0.6kb(서열번호 61)의 산물을 얻어 pGEM-T 벡터에 클로닝 후 염기서열을 확인하였다. hEPO가 들어있는pGEM-T벡터를 EcoRV와 NotI(New England Biolabs (NEB), 미국)으로 자르고 WPRE가 들어있는 pGEM-T 벡터를 EcoRV와 NotI으로 잘라 각각의 조각을 라이게이션 하였다.
hEPO와 WPRE PCR 증폭을 위해 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표와 같다.
프라이머 서열번호
hEPO증폭용 정방향 프라이머 5'-GGATCCTGTGGTCACCCGGCGCGC-3' 56
hEPO증폭용 역방향 프라이머 5'-GATATCCCATGGGACAGGCTGGCGCT-3' 57
WPRE증폭용 정방향 프라이머 5'-GATATCTCTGTTCCTGTTAATCAACCTC -3' 58
WPRE증폭용 역방향 프라이머 5'-GCGGCCGCGAGCCCGAGGCGAAACAG-3' 59
pBC1 벡터를 BamHI과 NotI으로 잘라 유산양의 베타 카제인 프로모터와 3'genomic DAN부분을 각각 잘라내어 벡터를 준비하였고, pGEM-T 벡터에 클로닝된 hEPO+WPRE를 BamHI과 NotI으로 잘라 2.9kb의 삽입물을 준비하였다. 준비된 벡터와 삽입물을 라이게이션하여 pBC1+hEPO-WPRE를 구축하였다. pBC1+hEPO-WPRE에 프로모터와 3'arm 부분을 클로닝 하기 위해 PCR 증폭으로 프로모터 염기서열 5.3kb(서열번호 3)와 3'arm 염기서열 5.0kb(서열번호 5)를 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝하였다.
프로모터 염기서열과 3'arm 염기서열을 PCR증폭 시키기 위해 사용한 프라이머 염기서열은 하기 표와 같다.
프라이머 서열번호
프로모터증폭용 정방향 프라이머 5'-GGATCCGCTATGCAATCTCATGGAAAG-3' 62
프로모터증폭용 역방향 프라이머 5'-GGATCCTGACCAGGGTCAACATCTACT-3' 63
3'arm증폭용 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCCTGCACTTCATTCTCCTGGATAA-3' 64
3'arm증폭용 역방향 프라이머 5'-GCGGCCGCTTACAGTAAGACCTTCAGGAGCA-3' 65
돼지의 베타 카제인 프로모터 염기서열에 존재하는 BamHI site(GGATCC) 2곳을 프라이머(서열번호 50 ~ 서열번호 53)를 이용하여, 인트론 제품 Site Direct Mutagenesis로 <실시예 2> 와 동일한 방법으로 point mutation을 시켰다. pBC1 + hEPO-WPRE벡터를 BamHI으로 자르고 Alkaline Phosphatase(CIP)를 30분간 처리하여 벡터를 준비하고 point mutatation된 돼지 베타 카제인 5' 프로모터 DNA가 들어 있는 pGEM-T 벡터를 BamHI으로 잘라 5.4kb의 삽입물(서열번호 3)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션 하여 pBC1 pig β casein 5'+EPO-WPRE벡터를 클로닝하였다. pBC pig β casein 5'+hEPO-WPRE벡터를 NotI으로 잘라 CIP를 30분간 처리하여 벡터를 준비하고 돼지 베타 카제인 3'arm DNA가 들어 있는 pGEM-T 벡터를 NotI으로 잘라 5.0kb의 삽입물(서열번호 5)을 준비하였다. 각각의 조각을 라이게이션 하여 pBC1-pig β casein +hEPO-WPRE 벡터를 구축하였다.
완성된 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터의 구조는 도 3과 같다.
도 3의 P β- casein은 돼지 베타 카제인 프로모터 염기서열(서열번호 3)을 의미하며, beta-casein 3'genomic DNA는 3'arm 염기서열(서열번호 5)을 의미한다.
hEPO는 인간EPO유전자이며, WPRE는 woodchuck hepatitus virus post-transcriptional regulatory element 유전자이다.
2Xβ-globin insulator, 및 pBR322는 pBC1벡터로 부터 기원하는 인슐레이터와 벡터구성요소이며, Neomycin은 네오마이신저항성유전자로 pEGFP-N1 벡터 (Clontech, 미국)로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11328BP로 기탁하였다.
< 실시예 4> 돼지 베타 카제인 유전자를 이용한 낙인벡터( Knock - in vector ) Pig β casein - hEPO knock - in 벡터의 구축
1) pGEM -T- hEPO 벡터의 클로닝
TK유전자 선별 방법을 이용하여 특정 부위에 올바른 유전자도입 여부를 확인 할 수 있는 돼지 베타 카제인 hEPO knock-in 벡터의 구축을 위해, 먼저, 돼지 베타 카제인 유전자에 엑손 2번 영역의 시작부터 시작 코돈까지를 포함하고 시작 코돈 이후 부터는 hEPO 유전자의 염기서열이 증폭 될 수 있도록 하는 특이적인 프라이머 2쌍(서열번호 66 ~ 68)을 준비하였다. 상기에서 준비한 돼지 베타 카제인의 엑손 2 번 영역을 포함하는 프라이머를 가지고 인간의 genomic DNA(조아제약, 대한민국 특허 제 10-0769291호의 pBC1-hEPO벡터)로부터 일차 PCR증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 30 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 2분 30초간 신장반응)하고, 여기서 나온 PCR산물을 다시 주형으로 하여 이차 PCR 증폭(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 30 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 2분 30초간 신장반응)을 하였다. 돼지 베타 카제인 엑손 2번 영역부터 시작 코돈까지의 염기서열을 포함하는 PCR증폭 산물 2.3kb hEPO 유전자(서열번호 60)를 pGEM-T 벡터(Promega, 미국)에 클로닝(pGEM-T-hEPO) 하였다.
hEPO PCR 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 다음의 표와 같다.
프라이머 서열번호
hEPO 증폭용 일차 정방향 프라이머 5'-GACTTGATCGCCATGGGGGTGCACGGTGAGTACTC-3' 66
hEPO 증폭용 이차 정방향 프라이머 5'-GATATCATTCACAGGACTTGATCGCCATGGGGG-3' 67
hEPO 증폭용 역방향 프라이머 5'-GAATTCATGGGACAGGCTGGCGCTGA-3' 68
2) pGEM -T- pig β casein 5' arm , pGEM -T- pig β casein 3' arm 의 구축
돼지 베타 카제인 유전자의 프로모터 염기서열(5' arm)과 3'arm 염기서열(3' arm)을 클로닝하기 위해, 서열번호 69 ~ 서열번호 72의 프라이머를 제작하여 돼지 genomic DNA로부터 PCR 증폭으로 산물 4.9kb(서열번호 4)와 5.0kb(서열번호 5)를 얻어 pGEM-T 벡터에 클로닝(pGEM-T-pig β casein 5'arm, pGEM-T-pig β casein 3'arm)하였다.
프라이머 서열번호
프로모터 증폭용 정방향 프라이머 5'-GTCGACAGTTGTAGCTGCTGACCTACAC-3' 69
프로모터 증폭용 역방향 프라이머 5'-GATATCGGGGAAATGAGGGAAAAAATGTAT-3' 70
3'arm 증폭용 정방향 프라이머 5'-GCGGCCGCCTGCACTTCATTCTCCTGGATAA-3' 71
3'arm 증폭용 역방향 프라이머 5'-CCGCGGTTACAGTAAGACCTTCAGGAGCA-3' 72
3) Lox A neo - hEPO 벡터 구축
Lox A neo 벡터(Gerard Karsenty's, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)를 EcoR V, EcoR I 제한 효소로(New England Biolabs (NEB), 미국) 잘라 벡터를 준비하였고 클로닝된 pGEM-T-hEPO 를 EcoR V, EcoR I 제한 효소로 잘라 2.3kb의 삽입물(서열번호 60)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO 벡터를 구축하였다.
4) Lox A neo - hEPO - poly A 벡터 구축
Lox A neo-hEPO 벡터 3'쪽으로 RNA 안정화를 위한 poly A 염기 서열을 삽입 하기 위해 Lox A neo-hEPO 벡터를 EcoR I 제한 효소로 자르고, Alkaline phosphatase를 30분간 처리하여 벡터를 준비하였다. 또한, pcDNA3 벡터(Invitrogen, 미국)에서 유래된 BGH(Bovine Growth Hormone) poly A를 EcoR I 제한 효소로 잘라 0.3kb의 삽입물을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A 벡터를 구축하였다.
5) Lox A neo - hEPO - poly A-5' arm 벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A 벡터 5'쪽으로 돼지 베타 카제인 5' arm을 삽입 하기위해 Lox A neo-hEPO-poly A 벡터를 Sal I, EcoR V 제한 효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 잘라 벡터를 준비하고, 클로닝된 pGEM-T-pig β casein 5'arm 벡터를 Sal I, EcoR V 제한 효소로 잘라 4.9kb의 삽입물(서열번호 4)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터를 구축하였다.
6) Lox A neo - hEPO - poly A-5' arm -3' arm 벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터 3'쪽으로 돼지 베타 카제인 3'arm을 삽입하기 위해 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm 벡터를 Not I 제한효소로 자르고 alkaline phosphatase를 30분간 처리하여 벡터를 준비하였다. 클로닝된 pGEM-T-pig β casein 3'arm 벡터를 Not I 제한 효소로 잘라 5.0kb의 삽입물(서열번호 5)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터를 구축하였다.
7) Lox A neo - hEPO - poly A-5' arm -3' arm - TK 벡터 구축
Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터 3' 쪽으로 세포 사멸 유전자인 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk) 유전자를 삽입 하기 위해 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm 벡터를 Sac II제한 효소(New England Biolabs (NEB), 미국)로 자르고 alkaline phosphatase를 30분간 처리하여 벡터를 준비하였다. pBS-TK 벡터(Gerard Karsenty's, Department of Genetics and Development, College of Physicians and Surgeons, Columbia University, New York, New York 10032)를 Not I 제한 효소로 잘라 2.3kb의 삽입물(허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제 유전자 암호화 부분)을 준비하였다. 각각의 조각을 ligation 하여 Lox A neo-hEPO-poly A-5'arm-3'arm-TK 벡터(Pig beta casein-hEPO knock-in 벡터)를 구축하였다.
완성된 Pig beta casein-hEPO knock-in 벡터의 구조는 도 4와 같다.
도 4의 Pig β casein 5' arm은 돼지 beta 카제인 프로모터(서열번호 4)를 의미하며, Pig β casein 3' arm은 3'arm(서열번호 5)을 의미한다.
hEPO는 인간EPO유전자이고, poly A는 폴리 A 시그널을 코딩하는 유전자이며, Neo cassette는 네오마이신 저항성 유전자로 포지티브 선별 유전자이며, PGK promoter는 포스포글리세레이트키나제(phosphoglycerate kinase;PGK) 프로모터이며, TK는 허피스 심플렉스 바이러스-싸이미딘 키나제(Herpes simplex virus-thymidine kinase: HSV-tk) 유전자로 네거티브 선별 유전자로, pBS-TK벡터로부터 기원한다.
상기 방법으로 제조된 Pig β casein-hEPO knock-in벡터를 한국생명공학연구원 유전자은행(대전, 대한민국)에 기탁번호 KCTC 11329BP로 기탁하였다.
< 실시예 5> 형질전환 세포주 제조 및 hEPO 발현 확인
1) 외래 유전자 도입 ( Transfection )
생쥐 유선 세포 (HC11, 국립축산과학원 대한민국), 생쥐 근육 세포 (C2C12, ATCC, 미국), 인간 간세포 (HepG2, ATCC, 미국), 인간 신장 세포 (Caki, ATCC, 미국), 인간 혈액 세포 (U937, ATCC, 미국), 랫트 뇌 세포 (C6, ATCC, 미국) 등을 아래와 같은 배양 조건으로 배양기에서 배양하였다.
HC11 - RPMI 1640 (Gibco, 미국), 10% Fetal Bovine Serum(FBS, HyClone, 미국), 1 % penicillin streptomycin (HyClone, 미국), insulin (sigma, 미국)5 ug/ml, 39℃, CO2 5%
C2C12, HepG2 - DMEM (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
Caki - McCoy's 5A (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1% penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
U937 - RPMI 1640 (Gibco, 미국), 10 % FBS, 1 % penicillin streptomycin, 37℃, CO2 5%
80~90 % 정도 자란 세포주를 trypsin (HyClone) 을 이용하여 세포배양접시에서 떼어낸 후 1500 rpm에서 5분간 원심 분리 후 상층액을 제거하였다. Hemocytometer(Reichert, 미국)를 이용하여 세포수를 계수한 후 60 mm 세포배양 접시에 5 x 105 cells/dish로 세포를 16 시간~20 시간 배양기에서 배양하였다. 외래 유전자 도입은 lipofectamine (invitrogen, 미국)을 사용하였으며 60 mm 세포배양 접시당 실시예 2 와 3에서 제조한 벡터 4 ug을 도입함으로써, 외래유전자를 도입하였다. HC 11 세포주에 외래 유전자 도입 4 시간 후 insulin (sigma, 미국) 5 ug/ml, prolactin (sigma, 미국)5 ug/ml, hydrocortisone (sigma, 미국) 5 ug/ml을 첨가하였다.
2) 역전사 ( Reverse Transcription , RT )
외래유전자 도입 후 24 시간 후에 easy-BLUE total RNA Extraction Solution(iNtRON Biotechnology, 대한민국)을 이용하여 RNA를 정제 하였다. 정제된 RNA 4 ug 과 역전사 효소인 superscript III reverse transcriptase (invitrogen, 미국) 을 이용하여 역전사 (reverse transcription)를 수행하였다. 이때 외래유전자의 오염을 막기 위해 DNase I (invitrogen, 미국) 을 처리하였다. 역전사는 10 pM oligo dT 1 ul와 10 mM dNTPs 1 ul를 넣은 후 65℃에서 5분간 반응 후 얼음 안에서 1분간 반응하였다. 다음으로 5X buffer 4 ul 와 0.1 M DTT 1 ul, reverse transcriptase 1 ul 를 넣은 후 50℃에서 60분 반응 후 70℃에서 15분간 반응 시켜 cDNA를 합성하였다.
3) 실시간 PCR ( Real Time - PCR )
민감도가 우수한 실시간 PCR 방법을 이용하여 각 세포주에 도입 시킨 EPO 발현을 확인하였다. 실시간 PCR은 역전사 효소를 이용하여 만든 cDNA를 주형으로 SYBR Green qPCR kit (FINNZYMES, 핀란드)와 DNA engine Opticon 2 (BIO-RAD)를 이용하여 실시간 PCR (94℃에서 5분간 변성 과정을 거친 후, 다음의 50 cycle을 수행하였다. 94℃에서 30초간 변성 후, 56℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 60초간 신장반응을 수행한 후 형광 값 측정을 하였다. 형광 값 보정을 위하여 벡터내의 Neo 유전자와 세포내의 beta actin 유전자를 기준으로 하였다. 결과 분석은 GeneExMacro 3.0 (BIO-RAD) 프로그램을 사용하였다. PCR에 사용한 프라이머(서열번호 73 ~ 80)는 하기 표와 같다.
프라이머 서열번호
EPO 증폭용 정방향 5'-CAAGGAGGCCGAGAATATCA-3' 73
EPO 증폭용 역방향 5'-AAGTGTCAGCAGTGATTGTTCG-3' 74
Neo 증폭용 정방향 5'-GCTACCCGTGATATTGCTGAA-3' 75
Neo 증폭용 역방향 5'-CAACACCGTGCGTTTTATTCT-3' 76
인간 beta actin 증폭용 정방향 5'-CGTGGGCCGCCCTAGGCACCA-3' 77
인간 beta actin 증폭용 역방향 5'-TTGGCCTTAGGGTTCAGGGGGG-3' 78
생쥐 beta actin 증폭용 정방향 5'-TGTGATGGTGGGAATGGGTCAG-3' 79
생쥐 beta actin 증폭용 역방향 5'-TTTGATGTCACGCACGATTTTCC-3' 80
실시간 PCR 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 pBC1-pig β casein 벡터와 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터를 도입 시킨 유선세포 및 유선세포 이외의 조직세포에서의 hEPO 발현결과를 나타내며, 같은 세포주에 대조군으로 pBC1 벡터 (invitrogen) 와 pBC1-hEPO-WPRE (대한민국 특허 제 10-0769291 호) 벡터를 도입시켰다. x 축은 각각의 세포주를 나타내고, y 축은 pBC1-pig β casein 벡터와 pBC1 벡터의 결과 값을 1로 하였을 경우 각 세포주에서 발현되는 hEPO의 상대적 비율을 나타낸다. 도 5에서 pPBC는 실시예 2의 pBC1-pig β casein 벡터를 의미하고 pPBC-hEPO는 실시예 3의 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE를 의미한다. pBC1은 염소 프로모터를 갖고 유선특이적으로 발현하도록 만들어 판매되는 invitrogen 사의 벡터이고, pBC1-hEPO는 pBC1-hEPO-WPRE를 의미한다.
도 5에서 보는 바와 같이 hEPO는 생쥐 유선세포 HC11 세포에서 가장 많이 발현하고, 인간 간세포 HepG2와 생쥐 근육세포 C2C12 세포에서는 약하게 발현 하였으며 다른 조직의 세포에서는 발현되지 않음을 확인하였다.
따라서, 본 발명의 벡터로 형질전환된 유선세포에서 목적하는 단백질을 생산 할 수 있음을 알 수 있다.
< 실시예 6> 미세주입법에 의한 동물수정란과 그를 이용한 형질전환동물 구축 및 EPO 제조
1) 유전자의 정제
실시예 3에서 제조한 벡터를 Sal 1 (NEB, R0138)을 이용하여 선형으로 만든 후, Qiagen사의 QIAquick Gel Extraction kit(Q-28706)를 이용하여 정제하여 주입용 버퍼(10mM Tris-HCl, 0.1mM EDTA, pH 7.4)에 용리시켜 최종 농도를 2ng/ul로 5ul씩 분주하여 -20℃에 보관하였다.
2) 과배란 암컷 쥐로부터 수정란의 회수
8주령의 C57BL/6 암컷 쥐(오리엔트 바이오, 대한민국.)를 5 IU의 pregnant mare serum gonadotropin (PMSG; Intervet, Netherlands)의 주사 후 46시간 뒤에 5 IU의 human chorionic gonadotropin (hCG, Intervet)을 주사하여 과배란을 유도하였다. 12시간마다 빛 조절(7 a.m. to 7 p.m.)이 되며, PMSG는 11 a.m에 hCG는 9 a.m에 복강투여 방법으로 주입되었다. hCG 주입 후 같은 종의 수컷 쥐와 교미를 시켜 다음날 암컷 쥐의 질입구(vaginal plugs)를 확인하여 정상적으로 교미가 진행되었음을 확인한 후 난관을 적출하였다. 난자-난구세포 복합체를 분리시키기 위해 적출된 난관을 0.1% hyaluronidase (Sigma, H3884)가 포함된 M2 (Sigma, M7167) 배양액으로 옮긴 후 팽대부 부분을 찢었다. 잠시 후 난구세포가 분리된 수정란만을 회수하여 깨끗한 M2 배양액에 씻어서 M16 (Sigma, M7292) 배양액으로 옮겨 미세주입 실험 전까지 37℃, 5% CO 2 인큐베이터에 배양하였다.
3) 유전자의 미세주입
챔버 슬라이드(Nunclon, Denmark)에 M2 배양액을 소량 떨어뜨린 후 증발을 막기 위해 오일로 덮어 미세주입용 디쉬를 준비한 후 회수된 수정란을 올려놓았다. 수정란의 미세주입은 수정란의 미세조작을 위한 장비인 OLYMPUS 1X71 TH4-200 inverted microscope (Narishige, Tokyo, Japan)에서 수행하였다. Microloader (Eppendorf, Hamburg, Germany)를 이용하여 femtojet automatic injector (Eppendorf)에 연결된 femtotip injection pipette (Eppendorf)에 미리 준비된 1)의 정제 유전자를 로딩하였다. holding pipette으로 난자를 잡고 수정란의 전핵에 현미경의 초점을 맞춘 후 femtotip injection pipette을 이용하여 난자의 투명대를 뚫고 전핵까지 들어간 후 femtojet automatic injector를 이용하여 상기 유전자를 전핵에 주입하여 전핵의 팽창을 확인하면 난자로부터 injection pipette을 빼냈다. 미세주입 후 살아남은 난자는 M16 배양액으로 옮겨 37℃, 5% CO 2 인큐베이터에서 배양하였다.
4) 수정란 이식
미세주입 실험 하루 전날 6주령의 BDF-1 암컷 쥐(오리엔트 바이오, 대한민국)를 같은 종의 거세된 수컷과 교미를 시켜 가임신을 유도하였다. 실험전 암컷 쥐의 질입구(vaginal plugs)를 확인하여 정상적으로 교미가 진행되어 가임신이 유도된 암컷쥐에 avertin (Sigma, T48402)을 복강 주입하여 마취시킨 후 쥐 등의 옆구 리와 흉각 사이의 중간부분을 절개하여 난소 지방을 당겨 난소 및 난관을 꺼냈다. 난소 지방을 수술용 집게로 고정시키고 난소와 난관 사이를 둘러싸고 있는 포낭을 찢어 난관 입구를 확인 한 후 미리 준비된 이식용 파이펫을 난관 입구에 삽입하여 난자를 이식하였다. 수정란 이식은 양쪽의 난관 모두에 수행되어 졌다. 이식 후 확인을 위한 마커 버블 4개와 15개의 미세주입 수정란 및 최종 마커 버블 한 개로 이루어진 이식용 파이펫을 이용하였다.
5) 유전자 도입 확인
수정란 이식 3주 후 새끼가 태어나면 새끼의 꼬리를 잘라 Dneasy Blood&Tissue kit (Qiagen, Q-69506)를 이용하여 genomic DNA를 추출한다. 돼지 베타 카제인 유전자가 도입된 형질전환 쥐의 확인을 위하여 추출된 DNA에서 EPO-WPRE 유전자 부위와 5‘arm-EPO 유전자 부위를 증폭 시키는 프라이머를 이용하여 PCR 증폭실험(PT-200, BIO-RAD, 94℃에서 5분간 변성 과정을 거친후, 다음의 35 cycle을 수행하였다: 94℃에서 30초간 변성 후, 55℃에서 30초간 프라이머 결합, 72℃에서 30초간 신장반응)을 실시하여 유전자의 도입을 확인하였다.
PCR 증폭에 사용된 프라이머 염기서열은 다음의 표와 같다.
프라이머 서열번호
hEPO-WPRE 증폭용 정방향 프라이머 5'-AACTCTTCCGAGTCTACTCCA-3' 81
hEPO-WPRE 증폭용 역방향 프라이머 5'-CTCCTCATAAAGAGACAGCAAC-3' 82
5'arm-EPO 증폭용 정방향 프라이머 5'-GGATAAGGCTGTTAGTGGAAA-3 83
5'arm-EPO 증폭용 역방향 프라이머 5'-TTATCAGCTTCCTCTCCACTG-3 84
그 결과를 도 6에 나타내었다. 도 6은 실시예 3의 발현벡터 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸다. 도 6의 EPO-WPRE는 EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이고, Beta casein-EPO는 β casein 5’arm-EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이다. M은 크기마커(size marker), V는 pBC1-pig-β casein-EPO-WPRE 벡터, N은 음성대조를 위한 정상 마우스 genomic DNA, 각각의 숫자는 유전자가 도입된 개체를 의미한다.
그 결과로부터 유전자 도입 여부를 확인하여 형질전환된 쥐를 선발하였다.
6)형질전환 실험동물의 번식 및 유전자 전이 확인
돼지 베타 카제인 유전자 도입이 확인된 형질전환 쥐 중 암컷은 성성숙 시기인 6주령이 지난 후 정상 수컷과 교배하여 새끼를 생산한 후, 새끼에 대하여 상기 5)와 동일한 방법으로 외래 유전자의 도입을 확인하였다.
도 7은 실시예 3의 발현벡터 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸다. 도 7의 EPO-WPRE는 EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이고, Beta casein-EPO는 β casein 5’arm-EPO-WPRE 유전자 부위에 대한 결과이다. M은 크기마커(size marker), V는 pBC1-pig-β casein-EPO-WPRE 벡터, N은 음성대조를 위한 정상 마우스 genomic DNA, , 5-1 ~ 6-6은 형질전환 쥐의 새끼를 의미한다.
7) 형질전환 어미쥐의 유즙에서 EPO 의 존재여부 및 함량확인
어미쥐를 수유 7일 후 새끼쥐를 격리시키고, 2시간 후 옥시토신 10 IU를 복강 주사함과 동시에 유선을 맛사지 하면서 유즙을 채취하였다. 유즙을 이용하여 Western blot assay를 수행하였다. 12% SDS-PAGE한 젤을 PVDF막(millipore, 미국)에 transfer 한 후 5% Skim milk blocking solution에서 항온처리 하였다. 막에 항-인간 EPO 항체( 1:1,000, hEPO anti-rabbit antibody, R&D systems Cat. No. AB- 286-NA, Lot No. HX01, 미국)를 제조사의 프로토콜에 따라 첨가하여 1시간 동안 상온에서 항온처리 하였다. 30분 동안 TBST buffer(tris buffered saline buffer, 0,01% tween-20)로 막을 씻어준 다음 퍼옥시다제로 레이블 된 항 토끼 항체(1: 3,000, peroxidase labeled anti-rabbit antibody, GE healthcare, Cat. No. NA9340V, Lot No. 348424, 영국)를 첨가하고 1시간 동안 상온에서 항온처리 한 후 TBST buffer로 세정한 후 필름에 노출하였다. 그 결과를 도 8에 나타내었다. 도 8은 형질전환된 어미쥐의 유즙을 이용하여 웨스텃블럿 어세이한 결과를 나타낸다. 도 8의 1~4는 EPO 스탠다드(calbiochem, 미국), 5 ~ 6은 시료를 나타낸다.
그 결과 유즙에서 32 KDa 분자량을 가진 단백질이 발현됨을 확인하였다.
또한, 어미쥐의 유즙내 hEPO의 농도를 확인하기 위하여 ELISA kit(Stem Cell Technology)를 이용하여 사용설명서에 따라 ELISA(Enzyme-linked immunosorbent assay)를 수행하였다. 그 결과 유즙내 hEPO가 70,000-250,000 IU/ml이 발현됨을 확인하였다.
도 1은 본 발명의 돼지 베타카제인의 염기서열을 밝히는 중, PCR 증폭으로 찾아낸 염기서열의 위치를 돼지 베타 카제인 전체 염기서열 중에 나타낸 도이다.
도 2는 본 발명의 일 실시예인 발현벡터 pBC1-pig β casein벡터의 구조를 나타낸다.
도 3은 본 발명의 일 실시예인 발현벡터 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE벡터의 구조를 나타낸다.
도 4는 본 발명의 일 실시예인 발현벡터 Pig β casein-hEPO knock-in 벡터의 구조를 나타낸다.
도 5는 본 발명의 일 실시예인 Pig β casein+hEPO-WPRE 벡터를 도입시킨 세포주에서 hEPO발현 결과를 나타낸 그래프이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예인 발현벡터 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐를 선별하기 위한 PCR 결과를 나타낸다.
도 7은 본 발명의 일 실시예인 발현벡터 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE 벡터로 형질전환된 생쥐의 새끼에게서 형질전환 여부를 확인한 PCR 결과를 나타낸다.
도 8은 본 발명의 일 실시예인 형질전환된 어미쥐의 유즙을 이용하여 Western blot assay 한 결과를 나타낸다.
<110> CHO-A PHARM Co., LTD. <120> A Gene of porcine beta casein, a promoter of the same and use thereof <130> P09-054-CHOA <150> KR10-2008-0062767 <151> 2008-06-30 <160> 84 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 17660 <212> DNA <213> pig <220> <221> gene <222> (1)..(17660) <223> gene of porcine beta casein <400> 1 atcagatgtt attttatgtg gctaatctta tggaaagaat taaaatattc catctatata 60 aataatgcta tgcaatctca tggaaagaat taaaatatta catctatata aataatgcta 120 tgctacctat tcttaactaa taatttggtg gaattaacaa attttgtttt acattgttgc 180 catatctgaa tcattatata aacttcactc tttttttatc ctatttccac ccccgcccat 240 gttttggaag ttattaaaca gagtctcaaa tattatttag aaaaatgaag tttttagtaa 300 cagctctatt tctaaagagc tgcagtctcc tgaaaaaaaa caatgcaaat tcacaggccc 360 tctgtttctt tgcctctaaa atatatttaa aacatcatat ggatgatatc tagggtctct 420 tctagtcctt attttctgaa caatttttgg tccttttatt gtacttttta tccagctttt 480 ctttctttct ttctttcttt ttttttcttt ttaggcccac acttgtggca tatggaggtt 540 caggctaggg atcaaatcag agttgtagct gctgacctac accacagcca 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tacagcacag agaactctat ccaatcactt gtgataaaac atgatagaag ataatatgag 4980 aaaaagaatg tttacatatg tatgactggg tcactttgct gtagagcaga aatcgacaga 5040 acattgtaaa tcaactgtac ttcaatttta aaaaatttta aaaggtgcca aataaatatt 5100 tttgaatcta ttaattaagc tttctgtcaa tatttgtagc ttctgtattt caaaagaaaa 5160 aactaatatg tactgtgaaa tgagatgaaa aagattgaag taggataagg ctgttagtgg 5220 aaaaaatctg aatggctggc aatgaaatag gaacttgaca tgtaagatta aggagtcata 5280 gtagatgttg accctggtc 5299 <210> 4 <211> 4920 <212> DNA <213> pig <220> <221> promoter <222> (1)..(4920) <223> Pig beta casein promoter 4.9kb <400> 4 agttgtagct gctgacctac accacagcca cagccacgca ggatcctatc tgcatgggtg 60 ctggtcagat ttgctaacca ctgagtcacg acaggaactc ccttatcagc ttttctatta 120 ctctatttct tgagggtgtt attcacatgg tttcagctat tacctttttg ctttacctat 180 atctcatgcc tgcatatttc agattcatca tccaatattg gaaaaagctt tgactgaaca 240 aattctgctt ataacaaata gtactagaac actttgcata gatcatatat tactcctcac 300 ccagggttgt cttataaaat ttctgtggat gaaattctca ctttgatata taaaaatggc 360 aacgcttggg ttattcattg caaaagcttg gtttgcccat atggcacttt gctccttact 420 ggtcattatg ctctgaggct tacctggcca gtggcacctg atgttatctt aaatctctgg 480 cttttcaact ctcccttggg caagtctttt tctctggtgt attgttagtg atttccttga 540 tcaaggtttt acctactttt ctggcccaat caagtccata actgtatcta ttcatataat 600 tcaaaattgg tgagcgatag tcataaggga atgttgtatt tattgcacaa taggtaaagc 660 atcttgctga gaaaacacaa aggaagtatc aaatggttag ggcacacttg cttttgtatt 720 ccttttctta gaaattatac tcttttgcct atggccttgg caaccaagag ctaacacata 780 aaggcacagt gaacagccaa gaccttttct agttatacct atgacactgg ggtcatttca 840 tcatttcttt tcatggcttc ctcctggctc catatgaaca ctcttagaat taatattagc 900 tgaataattt gaatacacag tagacactga gttgggtttc tgaggaatac aaaacctata 960 tgacagtcag gaatattctc ctcccacata catctagcat gatatgaatg caaggtatct 1020 tatgaagaaa aatcattaat tatgccgata ctctacttgc ttacttcata acagcatcta 1080 tctatctata cttaagtact gaatatatct ttacaggcaa tgaatagaag aaataaagat 1140 aaaaatgagt agtctaatac aatcagccaa ttacatttat gaacatctat cactaaagag 1200 gcaaagaaac 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ccctcttggc ctgcaggtgc ctgcctttct gctgtatcct 4680 cacaaggcag aaagatagac aagctctctc ctagcttttc ttagaggggc actaatccca 4740 ctcatagata tcccactcac atgacctatt tgcctccaaa gatgccacct ccaagtgcat 4800 cacatggggg agttagggct tcaacatatg aattcgggag ggcatgcaaa atctaatcta 4860 tagtgattaa tatgacatga atccataaaa tggatagttc ttgtgaaagt taggacaata 4920 ggaacccaac tattgaaagt ggaatatatg ggaaggtatg gaaaatttac agaaccgcct 4980 gctcccaagt gctcctgaag gtcttactgt aa 5012 <210> 6 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> 6 pig beta casein 586 bp forward primer <400> 6 tcttgaaaac ctaccaagtg c 21 <210> 7 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 586 bp reverse primer <400> 7 attcgtacaa cacggtcatt t 21 <210> 8 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG UP forward primer <400> 8 agagaactct atccaatcac tt 22 <210> 9 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG UP reverse primer <400> 9 gcaaggatga ggagcttcat 20 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> 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tcatatgaca aaatttctat cagacatttt tattacacct ttggtttctt 420 ttagaggaaa taaaataaga aatatattag attgaccagt catatacatt ttttccctca 480 tttccccatt cacaggactt gatcgccatg aagctcctca tccttgc 527 <210> 15 <211> 3976 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ATG down 4kb sequence <400> 15 atgaagctcc tcatccttgc ctgcttcgtg gctcttgccc ttgcaagagc ggtaagtaca 60 gaaaaaaaat ctctgaataa ataaggaata gtactacctg cctatgggta gaaaatggta 120 ttaccaacac tgtaaaggta taaataatgc agaagagcag gtttgttttt gtttgtttat 180 tttttcactt ctaagaaaat tccttgtatt cacccaccat ctcaacaata tccactgggg 240 ccacacatct ggatcaaatg ctttctgtag tattgtgcca ccagtgccta aggtaaacaa 300 gcaaaccaat aagcaacaga taaacaagaa gaaacacata tgagaacaat aaaaagagta 360 atattacaca aatacacttc catcttcttc cagtgatgaa atgtatgatc tctagggcac 420 ccagttaaat cctacctgtg tctattgaac agagaatgat actccagaag atggggtatc 480 agacaataat cacaaacata ttcataatca taatgaaagt attcaataca aatgaaaata 540 actttttttt ctgttatcca taaaaaactc ctcattaagg aaaaataaaa atataccagt 600 aaaaagttaa tacatttaaa taatgtaaaa gcaattacaa gtctctcaaa agacatagaa 660 catatttttt cagtttgtga aatagatagc tctgcataag gaaggtaaaa ttcagatagg 720 aaaaatgttt aataatgagt caactatggg gactaaaatg ctggtttttc ttttttttct 780 ctatagaagg aagaactcaa tgcatctggt gaggtaagat atttttattc agagaaaaat 840 tcccaagcat aaaatagtaa aactttctga tgatctagca gatttagctg gaggttgaat 900 ttcaactttt cctttctttt ttccttttca gactgtggaa agcctttcaa gcagtgaggt 960 aagccaatgt ttattcatag gtaatttccc aaatttagaa ccattaaaaa aactgcacta 1020 tccttctttt agtgtgaaca cgaacatgca ttgatgaagc tatcatatct atattctgac 1080 acttaagttc taatgtaaat ttccattgta tatatttaaa gagagaatac atgtccggag 1140 gatttaacgt tctagccatt tctgagttga ctggctactt gaaattgtgg cactgtgctc 1200 cgcttcttct tctttttttt taatgaactg tacagtcttt ttttctatct tgatctctct 1260 ctatattaac ctcattcact gttttgacat ttattgatac atttatgtat cagactttaa 1320 ctagagctgc ggtacaaact ggaaagaggg aagcccataa gaaagatctc gcagtgtagt 1380 cagggggcgg atgtgcaaat ggacacattt tgtcattata atagcataat agcagtctag 1440 taaataagag gtagttagac 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forward primer <400> 34 agggtatttg tgggtattta agatagt 27 <210> 35 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3.9kb reverse primer <400> 35 aatggtacat cactaaactt tgactct 27 <210> 36 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 4.2kb forward primer <400> 36 tctctctcta tattaacctc attcactg 28 <210> 37 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 4.2kb reverse primer <400> 37 ccttttgtga tcatgatata gtaaaca 27 <210> 38 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3.3kb forward primer <400> 38 cagttgccta tacacttaca cttgat 26 <210> 39 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3.3kb reverse primer <400> 39 agtcatggtc taaagtggaa tggga 25 <210> 40 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3.8kb forward primer <400> 40 aactaacatt tcttctctta ggtatac 27 <210> 41 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3.8kb reverse primer <400> 41 aaaggattat atgctatcta atatagagt 29 <210> 42 <211> 232 <212> PRT <213> pig <220> <221> PEPTIDE <222> (1)..(232) <223> amino acid of porcine beta casein <400> 42 Met Lys Leu Leu Ile Leu Ala Cys Phe Val Ala Leu Ala Leu Ala Arg 1 5 10 15 Ala Lys Glu Glu Leu Asn Ala Ser Gly Glu Thr Val Glu Ser Leu Ser 20 25 30 Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr His Ile Ser Lys Glu Lys Ile Glu Lys 35 40 45 Leu Lys Arg Glu Glu Gln Gln Gln Thr Glu Asn Glu Arg Gln Asn Lys 50 55 60 Ile His Gln Phe Pro Gln Pro Gln Pro Leu Ala His Pro Tyr Thr Glu 65 70 75 80 Pro Ile Pro Tyr Pro Ile Leu Pro Gln Asn Ile Leu Pro Leu Ala Gln 85 90 95 Val Pro Val Val Val Pro Leu Leu His Pro Glu Val Met Lys Asp Ser 100 105 110 Lys Ala Lys Glu Thr Ile Val Pro Lys Arg Lys Gly Met Pro Phe Pro 115 120 125 Lys Ser Pro Ala Glu Pro Phe Val Glu Gly Gln Ser Leu Thr Leu Thr 130 135 140 Asp Phe Glu Val Leu Ser Leu Pro Leu Leu Gln Ser Leu Met His Gln 145 150 155 160 Ile Pro Gln Pro Val Pro Gln Thr Pro Met Phe Ala Pro Gln Pro Leu 165 170 175 Leu Ser Leu Pro Gln Ala Lys Val Leu Pro Val Pro Gln Gln Val Val 180 185 190 Pro Phe Pro Gln Arg Asp Met Pro Phe Gln Ala Leu Leu Leu Tyr Gln 195 200 205 Asp Pro Leu Leu Gly Pro Leu Gln Gly Phe Tyr Pro Val Pro Gln Pro 210 215 220 Val Ala Pro Val Tyr Asn Pro Val 225 230 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neo forward primer <400> 43 gcggccgcgc gcgtcaggtg gcac 24 <210> 44 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neo reverse primer <400> 44 cgatcggacg ctcagtggaa cgaaaactc 29 <210> 45 <211> 1902 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> neo gene sequence <400> 45 gcgcgtcagg tggcactttt cggggaaatg tgcgcggaac ccctatttgt ttatttttct 60 aaatacattc aaatatgtat ccgctcatga gacaataacc ctgataaatg cttcaataat 120 attgaaaaag gaagagtcct gaggcggaaa gaaccagctg tggaatgtgt gtcagttagg 180 gtgtggaaag tccccaggct ccccagcagg cagaagtatg caaagcatgc atctcaatta 240 gtcagcaacc aggtgtggaa agtccccagg ctccccagca ggcagaagta tgcaaagcat 300 gcatctcaat tagtcagcaa ccatagtccc gcccctaact ccgcccatcc cgcccctaac 360 tccgcccagt tccgcccatt ctccgcccca tggctgacta atttttttta tttatgcaga 420 ggccgaggcc gcctcggcct ctgagctatt ccagaagtag tgaggaggct tttttggagg 480 cctaggcttt tgcaaagatc gatcaagaga caggatgagg atcgtttcgc atgattgaac 540 aagatggatt gcacgcaggt tctccggccg cttgggtgga gaggctattc ggctatgact 600 gggcacaaca gacaatcggc tgctctgatg ccgccgtgtt ccggctgtca gcgcaggggc 660 gcccggttct ttttgtcaag accgacctgt ccggtgccct gaatgaactg caagacgagg 720 cagcgcggct atcgtggctg gccacgacgg gcgttccttg cgcagctgtg ctcgacgttg 780 tcactgaagc gggaagggac tggctgctat tgggcgaagt gccggggcag gatctcctgt 840 catctcacct tgctcctgcc gagaaagtat ccatcatggc tgatgcaatg cggcggctgc 900 atacgcttga tccggctacc tgcccattcg accaccaagc gaaacatcgc atcgagcgag 960 cacgtactcg gatggaagcc ggtcttgtcg atcaggatga tctggacgaa gagcatcagg 1020 ggctcgcgcc agccgaactg ttcgccaggc tcaaggcgag catgcccgac ggcgaggatc 1080 tcgtcgtgac ccatggcgat gcctgcttgc cgaatatcat ggtggaaaat ggccgctttt 1140 ctggattcat cgactgtggc cggctgggtg tggcggaccg ctatcaggac atagcgttgg 1200 ctacccgtga tattgctgaa gagcttggcg gcgaatgggc tgaccgcttc ctcgtgcttt 1260 acggtatcgc cgctcccgat tcgcagcgca tcgccttcta tcgccttctt gacgagttct 1320 tctgagcggg actctggggt tcgaaatgac cgaccaagcg acgcccaacc tgccatcacg 1380 agatttcgat tccaccgccg ccttctatga aaggttgggc ttcggaatcg ttttccggga 1440 cgccggctgg atgatcctcc agcgcgggga tctcatgctg gagttcttcg cccaccctag 1500 ggggaggcta actgaaacac ggaaggagac aataccggaa ggaacccgcg ctatgacggc 1560 aataaaaaga cagaataaaa cgcacggtgt tgggtcgttt gttcataaac gcggggttcg 1620 gtcccagggc tggcactctg tcgatacccc accgagaccc cattggggcc aatacgcccg 1680 cgtttcttcc ttttccccac cccacccccc aagttcgggt gaaggcccag ggctcgcagc 1740 caacgtcggg gcggcaggcc ctgccatagc ctcaggttac tcatatatac tttagattga 1800 tttaaaactt catttttaat ttaaaaggat ctaggtgaag atcctttttg ataatctcat 1860 gaccaaaatc ccttaacgtg agttttcgtt ccactgagcg tc 1902 <210> 46 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein promoter 5.3kb forward primer <400> 46 ggatccgcta tgcaatctca tggaaag 27 <210> 47 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein promoter 5.3kb reverse primer <400> 47 ctcgagtgac cagggtcaac atctact 27 <210> 48 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3' arm 5.0kb forward primer <400> 48 ctcgagctgc acttcattct cctggataa 29 <210> 49 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3' arm 5.0kb reverse primer <400> 49 gcggccgctt acagtaagac cttcaggagc a 31 <210> 50 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for first point mutation <400> 50 acagccacgc agggtcctat ctgcatg 27 <210> 51 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for first point mutation <400> 51 catgcagata ggaccctgcg tggctgt 27 <210> 52 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for second point mutation <400> 52 ctcagtgggt taagggtcca gcattgctgt g 31 <210> 53 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for second point mutation <400> 53 cacagcaatg ctggaccctt aacccactga g 31 <210> 54 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for first point mutation <400> 54 ggacaagagt gtgggtccac tgtgggaag 29 <210> 55 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for first point mutation <400> 55 cttcccacag tggacccaca ctcttgtcc 29 <210> 56 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for hEPO <400> 56 ggatcctgtg gtcacccggc gcgc 24 <210> 57 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for hEPO <400> 57 gatatcccat gggacaggct ggcgct 26 <210> 58 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for WPRE <400> 58 gatatctctg ttcctgttaa tcaacctc 28 <210> 59 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for WPRE <400> 59 gcggccgcga gcccgaggcg aaacag 26 <210> 60 <211> 2331 <212> DNA <213> Homo sapiens <220> <221> gene <222> (1)..(2331) <223> sequence of hEPO <400> 60 tgtggtcacc cggcgcgccc caggtcgctg agggaccccg gccaggcgcg gagatggggg 60 tgcacggtga gtactcgcgg gctgggcgct cccgcccgcc cgggtccctg tttgagcggg 120 gatttagcgc cccggctatt ggccaggagg tggctgggtt caaggaccgg cgacttgtca 180 aggaccccgg aagggggagg ggggtggggc agcctccacg tgccagcggg gacttggggg 240 agtccttggg gatggcaaaa acctgacctg tgaaggggac acagtttggg ggttgagggg 300 aagaaggttt ggggggttct gctgtgccag tggagaggaa gctgataagc tgataacctg 360 ggcgctggag ccaccactta tctgccagag gggaagcctc tgtcacacca ggattgaagt 420 ttggccggag aagtggatgc tggtagcctg ggggtggggt gtgcacacgg cagcaggatt 480 gaatgaaggc cagggaggca gcacctgagt gcttgcatgg ttggggacag gaaggacgag 540 ctggggcaga gacgtgggga tgaaggaagc tgtccttcca cagccaccct tctccctccc 600 cgcctgactc tcagcctggc tatctgttct agaatgtcct gcctggctgt ggcttctcct 660 gtccctgctg tcgctccctc tgggcctccc agtcctgggc gccccaccac gcctcatctg 720 tgacagccga gtcctggaga ggtacctctt ggaggccaag gaggccgaga atatcacggt 780 gagacccctt ccccagcaca ttccacagaa ctcacgctca gggcttcagg gaactcctcc 840 cagatccagg aacctggcac ttggtttggg gtggagttgg gaagctagac actgcccccc 900 tacataagaa taagtctggt ggccccaaac catacctgga aactaggcaa ggagcaaagc 960 cagcagatcc tacgcctgtg gccagggcca gagccttcag ggacccttga ctccccgggc 1020 tgtgtgcatt tcagacgggc tgtgctgaac actgcagctt gaatgagaat atcactgtcc 1080 cagacaccaa agttaatttc tatgcctgga agaggatgga ggtgagttcc tttttttttt 1140 tttttccttt cttttggaga atctcatttg cgagcctgat tttggatgaa agggagaatg 1200 atcgagggaa aggtaaaatg gagcagcaga gatgaggctg cctgggcgca gaggctcacg 1260 tctataatcc caggctgaga tggccgagat gggagaattg cttgagccct ggagtttcag 1320 accaacctag gcagcatagt gagatccccc atctctacaa acatttaaaa aaattagtca 1380 ggtgaagtgg tgcatggtgg tagtcccaga tatttggaag gctgaggcgg gaggatcgct 1440 tgagcccagg aatttgaggc tgcagtgagc tgtgatcaca ccactgcact ccagcctcag 1500 tgacagagtg aggccctgtc tcaaaaaaga aaagaaaaaa gaaaaataat gagggctgta 1560 tggaatacgt tcattattca ttcactcact cactcactca ttcattcatt cattcattca 1620 acaagtctta ttgcatacct tctgtttgct cagcttggtg cttggggctg ctgaggggca 1680 ggagggagag ggtgacatgg gtcagctgac tcccagagtc cactccctgt aggtcgggca 1740 gcaggccgta gaagtctggc agggcctggc cctgctgtcg gaagctgtcc tgcggggcca 1800 ggccctgttg gtcaactctt cccagccgtg ggagcccctg cagctgcatg tggataaagc 1860 cgtcagtggc cttcgcagcc tcaccactct gcttcgggct ctgggagccc aggtgagtag 1920 gagcggacac ttctgcttgc cctttctgta agaaggggag aagggtcttg ctaaggagta 1980 caggaactgt ccgtattcct tccctttctg tggcactgca gcgacctcct gttttctcct 2040 tggcagaagg aagccatctc ccctccagat gcggcctcag ctgctccact ccgaacaatc 2100 actgctgaca ctttccgcaa actcttccga gtctactcca atttcctccg gggaaagctg 2160 aagctgtaca caggggaggc ctgcaggaca ggggacagat gaccaggtgt gtccacctgg 2220 gcatatccac cacctccctc accaacattg cttgtgccac accctccccc gccactcctg 2280 aaccccgtcg aggggctctc agctcagcgc cagcctgtcc catggctcga g 2331 <210> 61 <211> 619 <212> DNA <213> Woodchuck hepatitis B virus <220> <221> misc_signal <222> (1)..(619) <223> sequence of WPRE <400> 61 tctgttcctg ttaatcaacc tctggattac aaaatttgtg aaagattgac tggtattctt 60 aactatgttg ctccttttac gctatgtgga tacgctgctt taatgccttt gtatcatgct 120 attgcttccc gtatggcttt cattttctcc tccttgtata aatcctggtt gctgtctctt 180 tatgaggagt tgtggcccgt tgtcaggcaa cgtggcgtgg tgtgcactgt gtttgctgac 240 gcaaccccca ctggttgggg cattgccacc acctgtcagc tcctttccgg gactttcgct 300 ttccccctcc ctattgccac ggcggaactc atcgccgcct gccttgcccg ctgctggaca 360 ggggctcggc tgttgggcac tgacaattcc gtggtgttgt cggggaagct gacgtccttt 420 ccatggctgc tcgcctgtgt tgccacctgg attctgcgcg ggacgtcctt ctgctacgtc 480 ccttcggccc tcaatccagc ggaccttcct tcccgcggcc tgctgccggc tctgcggcct 540 cttccgcgtc ttcgccttcg ccctcagacg agtcggatct ccctttgggc cgcctccccg 600 cctgtttcgc ctcgggctc 619 <210> 62 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein promoter 5.3kb forward primer <400> 62 ggatccgcta tgcaatctca tggaaag 27 <210> 63 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein promoter 5.3kb reverse primer <400> 63 ggatcctgac cagggtcaac atctact 27 <210> 64 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3' arm 5.0kb forward primer <400> 64 gcggccgcct gcacttcatt ctcctggata a 31 <210> 65 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> pig beta casein 3' arm 5.0kb reverse primer <400> 65 gcggccgctt acagtaagac cttcaggagc a 31 <210> 66 <211> 35 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> first forward primer for beta hEPO <400> 66 gacttgatcg ccatgggggt gcacggtgag tactc 35 <210> 67 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> second forward primer for beta hEPO <400> 67 gatatcattc acaggacttg atcgccatgg ggg 33 <210> 68 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for beta hEPO <400> 68 gaattcatgg gacaggctgg cgctga 26 <210> 69 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for promoter <400> 69 gtcgacagtt gtagctgctg acctacac 28 <210> 70 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for promoter <400> 70 gatatcgggg aaatgaggga aaaaatgtat 30 <210> 71 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for 3' arm <400> 71 gcggccgcct gcacttcatt ctcctggata a 31 <210> 72 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for 3' arm <400> 72 ccgcggttac agtaagacct tcaggagca 29 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for EPO <400> 73 caaggaggcc gagaatatca 20 <210> 74 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for EPO <400> 74 aagtgtcagc agtgattgtt cg 22 <210> 75 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for Neo <400> 75 gctacccgtg atattgctga a 21 <210> 76 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for Neo <400> 76 caacaccgtg cgttttattc t 21 <210> 77 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for human beta actin <400> 77 cgtgggccgc cctaggcacc a 21 <210> 78 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for human beta actin <400> 78 ttggccttag ggttcagggg gg 22 <210> 79 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for mouse beta actin <400> 79 tgtgatggtg ggaatgggtc ag 22 <210> 80 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for mouse beta actin <400> 80 tttgatgtca cgcacgattt tcc 23 <210> 81 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for EPO-WPRE <400> 81 aactcttccg agtctactcc a 21 <210> 82 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for EPO-WPRE <400> 82 ctcctcataa agagacagca ac 22 <210> 83 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> forward primer for 5'arm-EPO <400> 83 ggataaggct gttagtggaa a 21 <210> 84 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> reverse primer for 5'arm-EPO <400> 84 ttatcagctt cctctccact g 21

Claims (25)

  1. 프로모터, 및 3' UTR 부위를 포함하는 서열번호 1의 염기서열을 갖는 돼지 베타 카제인 유전자.
  2. 서열번호 2의 염기서열을 포함하는 돼지 베타 카제인 유전자 프로모터.
  3. 서열번호 2의 염기서열, 서열번호 3의 염기서열, 및 서열번호 4의 염기서열 중에서 선택된 하나 이상의 염기서열을 포함하는 발현 벡터.
  4. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 서열번호 5의 염기서열을 추가로 갖는 것인 발현벡터.
  5. 제3항에 있어서, 상기 벡터는 선택적 표지 유전자, 인슐레이터, 및 WPRE(woodchuck hepatitus virus posttranscriptional regulatory element) 중에서 선택된 하나 이상이 추가된 것인 발현벡터.
  6. 제5항에 있어서, 상기 벡터는 도 2의 개열지도를 갖는 것인 발현 벡터.
  7. 제6항에 있어서, 상기 벡터는 기탁번호 KCTC 11327BP로 기탁된 pBC1-pig β casein인 발현 벡터.
  8. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항에 있어서, 프로모터 염기서열의 3' 쪽으로 목적단백질을 암호화하는 염기서열을 추가로 갖는 발현 벡터.
  9. 제8항에 있어서, 상기 목적단백질은 인간EPO(erythropoietin)인 발현 벡터.
  10. 제9항에 있어서, 상기 벡터는 도 3의 개열지도를 갖는 것인 발현 벡터.
  11. 제10항에 있어서, 상기 벡터는 기탁번호 KCTC 11328BP로 기탁된 pBC1-pig β casein+hEPO-WPRE인 발현 벡터.
  12. 제4항에 있어서, 상기 발현벡터는 낙인벡터(knock-in vector)인 발현벡터.
  13. 제12항에 있어서, 상기 낙인벡터는 선별유전자가 추가된 것인 발현 벡터.
  14. 제13항에 있어서, 상기 낙인벡터는 도 4의 개열지도를 갖는 것인 발현 벡터.
  15. 제14항에 있어서, 상기 낙인벡터는 기탁번호 KCTC 11329BP로 기탁된 Pig β casein-hEPO knock in인 발현 벡터.
  16. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포.
  17. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 벡터가 주입된 동물 수정란.
  18. 제17항에 있어서, 상기 주입은 미세주입법에 의한 것인 동물 수정란.
  19. 제17항의 동물 수정란을 이식시켜 얻은 형질전환동물.
  20. 제19항에 있어서, 상기 형질전환동물은 돼지, 생쥐, 소, 양, 및 염소 중에서 선택된 하나인 형질전환동물.
  21. 제17항의 동물수정란을 대리모의 난관 내에 이식한 후, 대리모로부터 형질전환동물을 얻고, 상기 형질전환동물의 유즙으로부터 목적단백질을 제조하는 제조방법.
  22. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환시킨 동물의 체세포를 탈핵된 난자에 핵이식하여 만든 동물 수정란.
  23. 제22항의 수정란을 이식시켜 얻은 형질전환동물.
  24. 제22항에 있어서, 상기 형질전환동물은 돼지, 생쥐, 소, 양, 및 염소 중에서 선택된 하나인 형질전환동물.
  25. 제3항 내지 제5항 중 어느 한 항의 발현 벡터를 도입시켜 형질전환된 동물의 체세포를 탈핵된 난자에 핵이식하여 만든 동물 수정란을 대리모 동물에 이식하고, 상기 대리모 동물로부터 형질전환동물을 얻고, 상기 형질전환동물의 유즙으로부터 목적단백질을 제조하는 제조방법.
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