KR20130048562A

KR20130048562A - Ｍｉｓ18α 유전자 넉아웃 생쥐모델 및 그의 제조방법

Info

Publication number: KR20130048562A
Application number: KR1020110113474A
Authority: KR
Inventors: 김근일; 백성희; 김익수; 박국찬
Original assignee: 숙명여자대학교산학협력단
Priority date: 2011-11-02
Filing date: 2011-11-02
Publication date: 2013-05-10
Also published as: KR101348852B1

Abstract

본 발명은 Mis18α 유전자 넉아웃 생쥐 및 그 배아에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Mis18α 유전자 일부와 조건적 넉아웃(conditional knockout) 생쥐모델의 제작에 사용되는 서열들을 포함하는 적중벡터(targeting vector), 상기 적중벡터를 이용하여 생성된 배아간세포(Embryonic Stem Cell), 이를 이용하여 얻은 Mis18α 넉아웃 생쥐 배아, 그 제조방법 및 이용방법 등에 관한 것이다. Mis18α는 배아세포 분열시 염색체 분열과정에서 중요한 역할을 수행하며 특히 배아 세포의 발달과정에 있어서 매우 중요한 인자가 될 수 있다. 따라서 본 발명의 Mis18α 넉아웃 생쥐모델은 염색체 분열과정이 생체에 미치는 영향과 그 이상으로 암이 발생하는 기작 등을 밝힐 수 있는 좋은 실험모델이 될 수 있으며, 신약개발의 표적이 될 수 있는 염색체 분열과정에 관여하는 신규한 단백질들을 동정하는데 활용될 수 있다. 나아가 동원체의 형성과정에 관여하는 다수의 신규 유전자들을 확보하고, 동원체 형성과정에 이상이 생겼을 경우 나타날 수 있는 질환을 분석하는 기술을 개발하는데 이용될 수 있다.

Description

Ｍｉｓ18α 유전자 넉아웃 생쥐모델 및 그의 제조방법{Mis18α knockout mouse model and producing method thereof}

본 발명은 Mis18α 유전자 넉아웃 생쥐 및 그 배아에 관한 것으로서, 보다 상세하게는 Mis18α 유전자 일부와 조건적 넉아웃(conditional knockout) 생쥐모델의 제작에 사용되는 서열들을 포함하는 적중벡터(targeting vector), 상기 적중벡터를 이용하여 생성된 배아간세포(Embryonic Stem Cell), 이를 이용하여 얻은 Mis18α 넉아웃 생쥐 배아, 그 제조방법 및 이용방법 등에 관한 것이다.

세포분열시 세포가 저장하고 있는 유전정보를 한 치의 오차 없이 두 배로 복제하고, 복제된 유전정보를 유사분열 (mitosis) 과정을 거쳐 각각의 딸세포로 정확히 전달하는 것은 매우 중요한 일이다. 이 과정들에 오차가 있으면 세포의 항상성 유지에 문제가 생기고 여러 가지 질병의 원인이 될 수 있다. 유사분열기는 전기(prophase), 중기(metaphase), 후기(telophase), 말기(anaphase)로 나뉘는데 특히 중기에는 염색분체의 중앙에 위치한 동원체(centromere)에 방추사가 부착되며, 방추사에서 형성되는 장력에 의하여 모든 염색체들이 세포의 적도면에 배열된다. 이때 유사분열 체크포인트(mitotic checkpoint) 과정이 진행되어 모든 염색체들이 이상 없이 분열될 준비가 되었는지 점검하게 된다. 동원체 형성에 이상이 생기면 염색체에 카이네토코어가 부착되지 못하고 방추사의 연결점이 없기 때문에 유사분열시 비정상적인 염색체 분열을 초래한다.

따라서 동원체 형성의 이상은 여러 종류의 질병을 야기한다. 특히 자가면역질환의 환자혈청이 동원체 단백질들을 인지한다는 사실이 잘 알려져 있으며 이는 동원체와 자가면역질환 사이에 연관성이 있다는 사실을 시사한다. 또한, 세포분열과정 중 특히 유사분열 과정의 이상은 염색체 수의 이상(aneuploidy)을 초래하고, 암세포에서 흔히 발견되는 염색체 수의 이상은 암의 발생 또는 진행과정에 영향을 미치는 주요한 원인 중의 하나일 것이라는 주장들은 유사분열 체크포인트(mitotic checkpoint)를 담당하고 있는 여러 단백질들의 발현 양을 감소시킨 유전자 조작 생쥐들을 이용한 연구들에서 규명되고 있다(Holland AJ, Cleveland DW. Boveri revisited: chromosomal instability, aneuploidy and tumorigenesis. Nat Rev Mol Cell Biol. 2009 Jul;10(7):478-487).

유사분열 체크포인트 과정을 담당하는 단백질들의 종류와 기전에 관한 연구는 매우 심도 있게 진행되었고, 그 결과 유사분열 중기에서 후기로 진행되는 과정에서 checkpoint 단백질들이 어떤 역할을 수행하는지 자세히 연구 되었다. 또한 유전자 결손 생쥐모델을 이용한 연구들에서 체크포인트(checkpoint)를 구성하는 단백질들 (예를 들어, Mad1, Mad2, Bub1, Bub3, BubR1)의 발현 양이 줄어들면 염색체 수의 이상이 발생하고 장기적으로는 암 발생이 촉진되는 현상을 보인다는 사실이 밝혀졌다(Holland and Cleveland, 2009). 동원체에 있는 많은 단백질들은 유사분열기 과정 중에 선택적으로 로딩되고 분리되어 지므로 유사분열기 및 체크포인트 조절과 직접적인 관련성이 있을 것이나 아직까지 유사분열기에 의한 동원체의 기능적인 네트워크에 대해서는 거의 연구된 바 없다.

동원체(centromere) 부위는 염색체 분열시 kinetochore가 부착되는 부위로 유사분열과 감수분열 모두에서 없어서는 안 되는 중요한 부위이며, 동원체에 이상이 생기는 경우 염색체 수의 이상이 발생할 가능성이 매우 높아 새로운 암 발생 기전으로 주목받고 있다(Holland and Cleveland, 2009). 동원체 이상에 대한 대부분의 연구가 이루어진 효모에서는 유전자 서열이 동원체 부위를 결정짓는 중요한 요인으로 연구 되었으나, 포유류에서는 동원체가 형성되는데 유전자 서열이 중요하게 작용하지 않는다는 사실이 밝혀졌다.

사람의 경우 alpha satellite DNA라고 불리는 반복적인 DNA 염기서열이 일차적으로 동원체를 형성하는 위치로 작용할 것으로 생각되었으나, 특정 염색체에서 동원체 부위가 소실된 경우 염색체상의 다른 부위가 새로운 동원체(neocentromere)로 작용할 수 있다는 사실이 밝혀졌다. 원래의 동원체 위치가 아닌 제2의 위치에 동원체가 형성되는 경우 alpha satellite DNA 서열이 아닌 다른 서열에서 동원체가 형성될 수 있다는 사실이 관찰 되었다. 1993년에 최초의 neocentromere가 발견된 이래로 현재까지 사람의 염색체에서 원래의 동원체 이외의 위치에 새로운 동원체가 형성되어 있는 neocontromere가 90건 이상 발견되었다. 따라서 DNA 염기서열 이외의 다른 무엇인가가 동원체 부위를 지정하는 것으로 생각되었다(Marshall OJ 등, Am J Hum Genet. 2008 Feb;82(2):261-282). 최근까지 연구된 논문들에 의하면 포유류에서는 특정 DNA 염기서열 보다는 히스톤 단백질 H3의 유사단백질인 Cenp-A가 동원체 부위를 지정한다는 가설이 가장 널리 받아들여지고 있다(Zeitlin SG. Epigenetics. 2010 Jan 1;5(1):34-40).

즉, 일반적인 nucleosome이 H2A, H2B, H3, H4를 포함하는 octamer로 구성되어 있는 반면에 동원체 부위의 nucleosome은 히스톤 H3 대신에 Cenp-A가 들어가서 H2A, H2B, Cenp-A, H4를 포함하는 octamer 또는 tetramer의 구조를 가진다는 것이다. 최근 연구에서 CENP-A 단백질에 의한 동원체 위치 지정이 후생유전학적인 방법으로 다양하게 조절될 수 있다는 것이 밝혀졌다. 따라서 CENP-A는 그 기능에 이상이 있는 경우 염색체 이상을 가져오는 또 하나의 조절자로 밝혀짐과 동시에 염색체 이상으로 일어나는 질병의 표적 단백질로 생각되고 있다. Cenp-A가 동원체 부위를 지정하는데 중요한 역할을 한다는 사실은 밝혀졌으나 최근까지도 새롭게 합성된 Cenp-A가 어떻게 동원체 부위를 찾아 가는지, 이 과정에 관여하는 단백질들은 어떤 것이 있는지, 각각의 단백질들의 역할은 무엇일지 등에 대하여는 전혀 연구가 되어있지 않다.

본 발명과 관련된 선행문헌으로서, 2007년도에 발표된 Fujita Y 등, Priming of centromere for CENP-A recruitment by human hMis18α, hMis18β, and M18BP1. Dev Cell. 2007 Jan;12(1):17-30의 논문에서는 Mis18α와 Mis18β 단백질들이 없을 경우 Cenp-A가 동원체 부위로 이동하지 못한다는 사실이 처음으로 밝혔다. 그러나 이는 본 발명에서와 같이 Mis18α의 조건적 넉아웃 동물모델을 이용하여 Mis18α 유전자의 기능을 탐색한 것이 아니며, 더불어 Mis18α의 기능에 관해서도 구체적으로 규명하지 못하였다.

국내에서는 세포주기의 간기 및 간기의 체크포인트 조절에 대해서는 지금까지 많은 연구들이 진행되어 왔으나 유사분열기 및 유사분열기 체크포인트 조절에 대해서는 일부 연구진에 국한되어 왔고, 최근 국제적으로 관심이 집중되고 있는 동원체의 형성 및 분리의 결손과 관련된 인간 질병과의 연계성 연구는 국내, 외에서도 아직 보고된 바 없다. 동원체 형성과 분리는 유사분열기 및 체크포인트 조절과 직접적으로 관련되어 있을 것이나 아직까지 유사분열기에 의한 동원체의 기능적인 네트워크에 대해서는 체계적으로 연구된 바 없고, 지금까지 동원체 단백질의 기능 연구는 효모나 세포주 수준에서 진행된 것이 대부분이었다.

이에 본 발명자들은 Cenp-A에 의해 동원체(centromere)가 형성되는 과정에서 Mis18α와 Mis18α 결합 단백질들의 역할 및 작용기전을 밝히고, 동원체 형성의 발생학적, 병리학적 중요성을 밝히기 위한 목적으로 Mis18α 넉아웃 동물모델에 관한 연구를 진행하던 중 본 발명을 완성하게 되었다.

따라서 본 발명의 목적은 생쥐 Mis18α 유전자를 넉아웃(knockout) 시킬 수 있는 적중 벡터(targeting vector)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터가 도입된 생쥐의 배아간세포(embryo stem cell)를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 적중 벡터가 도입된 배아간세포를 이용한 키메라(chimera) 생쥐를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 Mis18α 한쪽 유전자가 적중된 Mis18 α ^f/+ 형질전환 생쥐를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 Mis18α 한쪽 유전자가 제거된 Mis18α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 Mis18α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 제조하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 Mis18α 유전자가 넉아웃 된 Mis18α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아를 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 Mis18α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 및 Mis18α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아의 제조방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 Mis18α 한쪽 유전자가 결핍된 Mis18α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 비정상적 세포분열과 관련된 질환 동물 모델로서 이용하는 방법을 제공하는 것이다.

또한, 본 발명의 다른 목적은 상기 Mis18α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아를 이용하여 세포분열 이상과 관련된 질병 치료체 및 예방제의 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.

상기와 같은 본 발명의 목적을 달성하기 위해서, 본 발명은 LoxP (locus of X-over P1) 부위, 생쥐 Mis18a 게놈 유전자 1번째 엑손(exon)의 5'방향에서 두 번째로 가까운 EcoRI 절단부위에서부터 2번 엑손까지의 유전자 절편, 네오마이신 저항 유전자 및 EcoRI 절단부위의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터(targeting vector)를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 네오마이신 저항 유전자는 FRT (Flippase Recognition Target) 부위, LoxP 부위, 네오마이신 저항 유전자, FRT 부위 및 LoxP 부위의 순서로 이루어질 수 있다.

또한, 본 발명은 Mis18α 유전자 적중 벡터가 도입되어 상동재조합(homologous recombination) 된 생쥐의 세포주를 제공한다.

또한, 본 발명은 Mis18α 유전자 적중 벡터가 도입되어 상동재조합(homologous recombination) 된 생쥐의 배아간세포를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배(blastocyst)에 미세주입하고 이를 대리모에 착상시켜 제조한 키메라(chimera) 생쥐를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 제조한 Mis18 α ^f/+ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자가 플록스드된 형질전환 생쥐를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Mis18 α ^f/+ 유전자형 생쥐와 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐를 교배시켜 제조한 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 제공한다.

또한, 본 발명은 상기 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 제조되는 Mis18 α ^Δ/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐 배아를 제공한다.

또한, 본 발명은 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터를 제작하는 단계; 상기 적중 벡터를 배아간세포에 도입하여 상동재조합에 의해 Mis18α 유전자 적중 배아간세포 클론을 얻는 단계; 상기 Mis18α 유전자 적중 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배(blastocyte)의 내괴세포(inner cell mass)에 미세주입하고 이를 대리모 생쥐에 착상시켜 키메라(chimera) 생쥐를 얻는 단계; 상기 키메라 생쥐로부터 교배를 통해 Mis18 α ^f/+ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 적중 생쥐를 얻는 단계, Mis18 α ^f/+ 유전자형 생쥐와 Protamine-Cre 생쥐를 교배하여 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계를 포함하는 Mis18 α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터는 앞서 기재한 본 발명의 Mis18α 유전자 적중 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기의 경우 상기 방법에서 키메라 생쥐로부터 교배를 통해 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계는, 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배하여 Mis18 α ^f/+ 생쥐를 얻는 단계; Mis18 α ^f/+ 생쥐를 Flp 재조합 효소(Flippase)를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계; 상기 교배를 통해 얻은 자손 중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(floxed)(f/+) 유전형을 보이는 생쥐를 선별하는 단계; 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계; 상기 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계; 상기 교배를 통해 얻은 자손 중 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐들을 선별하는 단계; 및 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 Mis18α의 한쪽 유전자에서 1번 및 2번 엑손이 제거된 생쥐를 얻는 단계를 포함할 수 있다.

또한, 본 발명은 Mis18α 한쪽 유전자가 결핍된 Mis18 α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 비정상적 세포분열과 관련된 질환의 동물 모델로서 이용하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 Mis18α 유전자가 넉아웃(knock-out)된 Mis18 α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아에 있어서, 상기 배아는 세포분열시 염색체 분열 이상으로 인해 개체로 발달하지 못하고 사멸하는 특징을 나타낼 수 있다.

또한, 본 발명은 세포분열 이상과 관련된 질병 치료제 및 예방제 후보물질을 Mis18 α ^Δ/Δ 배아에 처리하는 단계; 및 상기 치료물질을 처리한 배아와 처리하지 않은 Mis18 α ^Δ/Δ 배아의 세포분열 과정을 비교하여 세포분열 능력을 회복시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포분열 이상과 관련된 질병 치료체 및 예방제의 스크리닝 방법을 제공한다.

본 발명의 일실시예에 있어서, 상기 질병은 암 또는 자가면역질환일 수 있다.

본 발명의 Mis18α 넉아웃 생쥐 배아의 분열중인 세포에서는 염색체가 제대로 배열되지 않는 등 세포분열이 정상적으로 진행되지 않아 결국 배아가 사멸하였다. 이는 Mis18α가 배아세포 분열시 염색체 분열과정에서 중요한 역할을 수행하며 특히 배아 세포의 발달과정에 있어서 매우 중요한 인자라는 점을 시사한다. 따라서 본 발명의 Mis18α 넉아웃 생쥐모델은 염색체 분열과정이 생체에 미치는 영향과 그 이상으로 암이 발생하는 기작 등을 밝힐 수 있는 좋은 실험모델이 될 수 있으며, 신약개발의 표적이 될 수 있는 염색체 분열과정에 관여하는 신규한 단백질들을 동정하는데 활용될 수 있다. 나아가 동원체의 형성과정에 관여하는 다수의 신규 유전자들을 확보하고, 동원체 형성과정에 이상이 생겼을 경우 나타날 수 있는 질환을 분석하는 기술을 개발하는데 이용될 수 있다.

도 1은 Mis18α (NAP1)의 동정 및 발현양상을 보여주는 그림으로, (A) NcoR과 Mis18α를 효모에서 함께 발현시키면 리포터인 β-gal의 발현이 증가하는 것을 통해 서로의 결합 여부를 확인할 수 있다. (B) Mis18α 단백질이 204개의 아미노산과 Zinc finger 및 coiled-coil 도메인로 구성됨을 보여주는 그림이다. (C) Mis18α의 DNA 염기서열과 아미노산 서열이다. (D) 생쥐 조직에서 RNA를 정제한 후 Mis18α mRNA의 발현을 살펴본 결과를 나타낸 사진이다. (E) Mis18α와 NcoR의 세포내 결합 여부를 확인한 결과이다.
도 2A 및 2B는 Mis18α (NAP1)의 특성을 분석한 것으로 도 2A는 NcoR의 어느 부위에 Mis18α가 결합하는지 알아보기 위하여 여러 가지 NcoR deletion mutant들과 GST-Mis18α와의 결합을 살펴본 결과이다. 도 2B는 전사와 관련하여 Mis18α의 기능을 알아보기 위한 실험 결과이다.
도 3A 및 3B는 발생 단계별 Mis18α mRNA의 발현 양상을 보다 자세히 분석하기 위하여 in situ hybridization을 수행한 결과를 나타낸 사진으로, 도 3A는 배아상태에서의 모습이고, 도 3B는 새끼로 태어난 이후의 모습니다.
도 4는 성체 생쥐에서 Mis18α의 발현 양상을 나타낸 모습이다.
도 5A 및 5B는 Mis18β (OIP5) 상의 PEST sequence와 세포내 안정성을 나타내는 사진으로, 도 5A는 Mis18β (OIP5)의 N-말단 부위에 세포내에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해서 분해되는 단백질들에서 많이 발견되는 PEST sequence가 존재하는 것을 나타낸 그림이며, 도 5B는 세포에서의 Mis18β (OIP5)의 독립적 발현 양상과 Mis18α와 함께 발현시킬 경우 발현양의 변화를 나타낸 그림이다.
도 6은 본 발명의 일실시예에 따른 Mis18α 유전자 적중 벡터 및 Mis18α 유전자 결핍 생쥐를 얻는 방법을 유전자적 측면에서 살펴본 그림이다.
도 7은 본 발명의 Mis18α 유전자 플록스드(floxed) 배아간세포의 제조 후 배아간세포에 도입한 적중벡터의 상동재조합 여부를 검증하기 위하여 써던블러팅을 수행한 결과이다
도 8 내지 도 11은 Mis18α 유전자결손이 초기 배아형성 단계에서 미치는 영향을 분석한 결과로, 도 8은 게놈에서 Mis18α의 한쪽 유전자가 제거된 생쥐의, 정상생쥐, Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 생쥐(Mis18 α ^Δ/Δ )의 배아형성 단계별 유전자형을 나타낸 표이다.
도 9는 Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 새끼(79마리)를 얻었을 경우의 새끼들의 유전자형을 분석한 결과이다.
도 10은 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형을 보이는 생쥐 배아의 임신 3.5일째 생존여부를 확인한 실험 결과이다.
도 11은 배아의 사망 시기를 보다 정밀하게 분석하기 위하여 Mis18α 유전자 한쪽이 결손된 생쥐들을 서로 교배시킨 후 임신 3.5일에 배아를 추출한 후 인공적으로 배양하면서 성장을 분석한 것이다.
도 12A 내지 도 15는 Mis18α 유전자결손이 염색체 분열과 세포사멸에 미치는 영향을 분석한 결과로, 도 12A는 정상생쥐의 배아에서의 염색체와 방추사의 모습이며, 도 12B는 Mis18α 유전자결손 생쥐배아에서 비정상적으로 정렬되어 있는 염색체와 방추사의 모습을 나타낸 사진이다.
도 13A는 정상 생쥐의 내아에서의 세포분열 과정을 나타낸 사진이다.
도 13B는 Mis18α 유전자결손 생쥐배아에서의 세포분열 과정을 나타낸 사진이다.
도 14는 동원체에만 위치하는 CENP-A 단백질의 Mis18α 유전자결손 생쥐배아 및 정상생쥐 배아의 핵 내에서의 분포 양상을 나타낸 사진이다.
도 15는 Mis18α 유전자결손 생쥐배아와 정상생쥐 배아 세포들간의 세포사멸 차이를 TUNEL 방법으로 조사한 결과이다.

본 발명은 Mis18α(alpha) 유전자 넉아웃 동물모델 및 Mis18α 유전자 넉아웃 동물 배아를 처음으로 제작하여 제공하였으며, 이를 이용하여 Mis18α의 동원체 형성과정을 비롯한 세포분열 과정과의 관련성 및 세포사멸에 미치는 영향을 밝힌 점에 특징이 있다.

본 발명의 일실시예에서 본 발명의 Mis18α 유전자 넉아웃 생쥐 배아는 상대적으로 염색체와 방추사가 비정상적으로 정렬되어 있는 경우가 많이 발견되었으며(도 12), 분열중인 세포에서 염색체가 제대로 배열되지 않은 경우와 잘라져서 떨어져나간 염색체(satellite chromosome) 등이 관찰되었고(도 13), 방추사가 염색체에 부착되어 있지 않거나, 유사분열 전기에 염색체가 중심으로 모여드는 문제가 있었고, 말기에 염색체 분열시 염색체가 잘라지는 현상이 발견되었다. 이는 Mis18α가 배아세포 분열시 염색체 분열과정에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 의미하며 특히 배아 세포의 발달과정에 있어서 매우 중요한 인자라는 점을 시사한다.

또한, 히스톤 H3의 유사체인 CENP-A가 새로 합성된 후 동원체에 위치하는 과정에 Mis18α 유전자가 미치는 영향을 실험한 결과, 정상 배아의 세포들에서는 대부분의 세포핵에서 CENP-A가 강하게 점 모양으로 염색되는 것을 관찰하였으나, Mis18α 유전자 결손 생쥐 배아의 세포들에서는 핵에서 점 모양으로 염색되는 양상을 보이지 않았고(도 14), 결론적으로 Mis18α 유전자의 결손으로 인해 CENP-A가 동원체에 위치하지 못하게 되었다. 이는 세포분열시 염색체 분열의 이상을 초래하며 결국 세포사멸에 이른다는 것을 의미한다. 이에 따라 Mis18α 유전자가 결손된 배아는 세포사멸로 인하여 더 이상 개체로 발달하지 못한다는 것을 알 수 있었다.

따라서 본 발명의 Mis18α 넉아웃 동물모델은 동원체 이상이나 염색체 분열 이상 등을 포함한 세포분열 과정의 이상과 관련된 기작을 규명하거나, 그와 관련된 질병의 예방제 또는 치료제를 스크리닝하기 위한 동물 모델로서 이용될 수 있다.

그러나, 상기에서 밝힌 바와 같이, 본 발명의 대상이 되는 Mis18α 유전자는 배아발생 단계에서 매우 중요한 역할을 담당하므로, 기존 방법에 따른 넉아웃 동물모델 제조시, 상기 유전자의 넉아웃으로 인해 정상적 배아 성장 및 개체 발생이 불가능 하여, 배아의 제조는 가능하나 결과적으로 유전자 넉아웃 게놈을 가진 개체는 얻을 수 없다는 문제점이 있으며, 따라서 생체 내에서 상기 유전자가 어떠한 매커니즘을 통해 특정 역할을 하는지 정확히 분석할 수 없다.

이에, 본 발명자들은 상기와 같은 문제점을 보완하고자, 본 발명에 따른 조건적 넉아웃 마우스(동물) 모델(Conditional Knockout mouse model)을 고안하게 되었다. 이 방법은 제거하고자 하는 유전자의 중요한 엑손 부위의 양쪽에 loxP 라는 특정 염기서열이 위치한 생쥐를 제작하고, Cre 라는 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시켜 Cre 효소의 작용에 의하여 loxP 사이의 엑손을 제거함으로써 특정 유전자의 넉아웃을 유도한다. 이러한 조건적 넉아웃 동물모델 제조 방법의 장점은, 특정 유전자가 발생단계에 중요한 역할을 하여 일반적인 넉아웃 동물모델을 얻을 수 없는 경우에, 특정한 조직에서만 Cre를 발현하는 생쥐를 이용(교배)하여 생체 전 조직에서가 아닌 그 특정 조직에서만 선택적으로 유전자가 넉아웃된 생쥐(동물)를 얻을 수 있다는 점이다. 즉, 본 발명에 따른 조건적 넉아웃 동물모델은 다양한 조직 특이적, 또는 약물 유도성 Cre 발현 생쥐와의 교배를 통해, 선택적이며 조건적인 개체 내 유전자의 한정적 넉아웃을 유도하여 궁극적으로 해당 유전자의 생체내 생리학적 기능을 온전히 연구할 수 있다는 큰 장점이 있다.

본 발명에 따른 상기 Mis18α 넉아웃 동물모델은 인간을 제외한 포유동물을 이용하여 제조될 수 있으며, 상기 인간을 제외한 포유동물은 원숭이, 랫트, 생쥐, 토끼, 개, 영장류 등일 수 있으며, 이에 제한되지는 않는다. 바람직하게는 쥐과(Muridae) 동물 일 수 있다. 또한, 본 발명에 따른 상기 Mis18α 유전자는 서열번호 1의 cDNA 염기서열을 가지는 유전자이며, Mis18α 유전자로부터 코딩되는 Mis18α 단백질은 서열번호 2의 아미노산 서열을 가지는 단백질이다.

본 발명에 따른 Mis18α 넉아웃 동물모델은 LoxP (locus of X-over P1) 부위, 생쥐 Mis18α 게놈 유전자 1번째 엑손(exon)의 5’ 방향에서 두 번째로 가까운 EcoRI 절단부위에서부터 2번 엑손까지의 유전자 절편, 네오마이신 저항 유전자 및 EcoRI 절단부위의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터(targeting vector)를 이용하여 제조할 수 있다.

상기 네오마이신 저항 유전자는, 바람직하게는 FRT (Flippase Recognition Target) 부위, LoxP 부위, 네오마이신 저항 유전자, FRT 부위 및 LoxP 부위의 순서로 이루어질 수 있다.

이에 제한되지는 않으나, 상기 Mis18α 유전자 적중 벡터는 서열번호 3의 염기서열을 가지거나 도 6에 나타난 적중 벡터의 구성을 가진 벡터일 수 있다.

본 발명의 일실시예에서 본 발명의 Mis18α 유전자가 넉아웃된 Mis18 α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아는 다음의 단계를 포함하는 방법에 의해 제조될 수 있다.

(a) Mis18α 유전자를 포함하는 Mis18α 게놈 DNA 클론을 얻는 단계; (b) 상기 Mis18α 게놈 DNA 클론과 공지의 서열들을 이용하여 Mis18α 조건적 넉아웃 카세트를 제조하는 단계; (c) 상기 조건적 넉아웃 카세트를 배아간세포에 트랜스펙션(transfection)시키는 단계; (d) 상기 배아간세포를 낭배(blastocyst)에 주입하는 단계; (e) 상기 배아간세포가 주입된 낭배를 대리모의 자궁에 착상시켜 키메라 생쥐를 얻는 단계; (f) 상기 키메라 생쥐를 교배시켜 Mis18 α ^f/+ 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 생쥐를 얻는 단계; (g) Mis18 α ^f/+ 생쥐를 Flp 재조합 효소(Flippase)를 발현하는 생쥐와 교배시켜 얻은 자손 중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(floxed)(f/+) 유전형을 보이는 생쥐를 선별하는 단계; (h) 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계; (i) 상기 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시켜얻은 자손 중 Mis18 α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐들을 선별하는 단계; (j) 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 Mis18α의 한쪽 유전자에서 1번 및 2번 엑손이 제거된 Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐를 얻는 단계; (k) Mis18 α ^+/Δ 생쥐를 교배시켜 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형질을 갖는 동형접합체 형질전환 마우스 배아를 얻는 단계가 그것이다.

상기 (a) 단계에서 Mis18α 게놈 DNA 클론은 화학적인 합성법, PCR 증폭법, 목적으로 하는 뉴클레오타이드 서열을 포함하는 진핵세포 또는 플라스미드, 파지미드, YACs, 코스미드, 박테리오파지와 같은 타겟 클로닝 벡터로부터 정제하는 방법 등과 같은 당업계에 공지된 방법으로 수득할 수 있다. 본 발명의 일실시예에 있어서 생쥐의 Mis18α 유전자를 특이적으로 인식하는 프라이머를 사용하여 PCR 증폭함으로써 Mis18α 유전자 단편을 수득할 수 있었다.

상기 (b) 단계에서 Mis18α 유전자의 조건적 넉아웃은 제거하고자 하는 Mis18α 엑손(exon)의 양쪽에 loxP 서열을 삽입함으로써 생성될 수 있다. 삽입 위치는 원형(native) 유전자의 발현을 방해하지 않도록 인트론(intron) 부위로 한다. 본 발명자들은 상기에서 제조한 Mis18α 조건적 넉아웃 카세트를 배아간세포에 도입함으로써 동형 재조합에 의해 Mis18α 유전자의 결실을 유도할 수 있다.

상기 (c) 단계의 배아상태의 간세포(embryonic stem cell, ES cell)는 일반적으로 시험관내에서 배양한 착상 전 초기배아(pre-implantation embryos)로부터 수득될 수 있다(Evans et al., Nature, 292:154-156, 1981; Bradley, et al., Nature, 309:225-258, 1984; Gossler et al., Proc. Natl. Acad. Sci USA, 83:9065-9069, 1986). 상기 ES 세포는 당업계에 공지된 방법을 이용하여 배양될 수 있다(Robertson, "Teratocarcinomas and Embryonic Stem Cells, a Practical Approach ", IRL Press, Washington D. C., 1987; Bradley et al., Current Topics in Devel. Biol. 20:357-371, 1986; Hogan et al., "Manipulating the Mouse Embryo":A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, 1986).

상기 Mis18α 녹아웃 카세트의 배아간세포로의 도입은 당업계에 공지된 방법으로 수행할 수 있다. 예를 들면, 전핵주입법(pronuclear microinjection), 레트로바이러스 매개 유전자 트랜스퍼(retrovirus mediated gene transfer), 유전자 적중(gene targeting), 전기충격(electroporation), 정액 매개 유전자 트랜스퍼, 칼슘 포스페이트/DNA 공-침전법 및 미세주입법(microinjection) 등이 있다. 본 발명의 일실시예에서는 Mis18α 녹아웃 카세트를 전기충격법에 의해 배아간세포로 도입하였다. 배아간세포를 트랜스펙션시킨 후 특정 항생물질을 포함하는 선택 배지에서 배양하여 내성을 나타내는 배아간세포 클론을 선별함으로써 동형재조합이 이루어진 세포만을 선별한다.

상기 (d) 단계에서는 상기 (c) 단계의 배아간세포를 낭배의 포배강에 주입하고 상기 (e) 단계에서 상기 배아간세포가 주입된 낭배를 대리모의 자궁에 이식하여 키메라 생쥐를 수득한다.

상기 (f) 단계에서는 상기 키메라 생쥐로부터 Mis18 α ^f/+ 유전형질을 갖는 이형접합체 F1 형질전환 생쥐를 유도하고, (g) 단계에서 Mis18 α ^f/+ 생쥐를 Flp 재조합 효소(Flippase)를 발현하는 생쥐와 교배시켜 얻은 자손중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(floxed)(f/+) 유전형을 보이는 생쥐를 선별하고 (h) 단계에서 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 네오마이신 저항 유전자가 제거된 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐를 얻는다.

상기 (i) 단계에서는 네오마이신 저항 유전자가 제거된 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐를 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시켜 얻은 자손 중 Mis18 α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐들을 선별하고 (j) 단계에서 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 Mis18α의 한쪽 유전자에서 1번 및 2번 엑손이 제거된 Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐를 얻는다.

상기 (k) 단계에서는 Mis18 α ^+/Δ 생쥐를 상호 교배하여 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형질을 갖는 동형접합체 형질전환 마우스 배아를 수득할 수 있으나, 사용된 넉아웃 카세트의 유형에 따라 생식선 전이(germline transmission)의 다른 방법이 사용될 수 있다.

본 발명의 일실시예에 따르면 상기의 Mis18α 유전자가 넉아웃된 Mis18 α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아는 세포분열시 염색체 분열 이상으로 정상 개체로 발달하지 못하고 사멸하는 특징을 나타낸다.

따라서, 본 발명은 Mis18α 유전자 결핍 생쥐를 제조하기 위한 제조방법으로, 생쥐의 Mis18α 유전자의 1번 및 2번 엑손(exon)을 선택적으로 제거할 수 있는 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터를 제작하는 단계; 상기 적중 벡터를 배아간세포에 도입하여 상동재조합에 의해 Mis18α 유전자의 일부가 제거된 배아간세포 클론을 얻는 단계; 상기 Mis18α 유전자 결핍 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배(blastocyte)의 내괴세포(inner cell mass)에 미세주입하고 이를 대리모 생쥐에 착상시켜 키메라(chimera) 생쥐를 얻는 단계; 및 상기 키메라 생쥐로부터 교배를 통해 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계를 제공한다.

본 발명의 일실시예에서는 상기 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터에 FRT (Flippase Recognition Target) 부위 및 LoxP 부위를 포함시킬 경우, 상기 방법에서 상기 키메라 생쥐로부터 Mis18α 한쪽 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계는, 상기 키메라 생쥐를 Flp 재조합 효소(Flippase)를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계; 상기 교배를 통해 얻은 자손 중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(floxed)(f/+) 유전형을 보이는 생쥐를 선별하는 단계; 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계; 상기 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계; 상기 교배를 통해 얻은 자손 중 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐들을 선별하는 단계; 및 상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 Mis18α의 한쪽 유전자에서 1번 및 2번 엑손이 제거된 생쥐를 얻는 단계를 포함할 수 있다.

상기 “플록스드(flocxed)"란 유전학에서 두 개의 LoxP 사이트 사이에 샌드위치적으로 위치된 DNA 시퀀스(sequence) 상태를 의미하여, "flanked by LoxP”이란 말의 축약형이다. LoxP 사이트 사이에 재조합은 Cre 재조합효소(recombinase)에 의해 촉매되어 진다(catalysed). 유전자 플록싱(floxing)은 유전자를 녹아웃(deleted, knocked out)시키거나, 전위(translocated) 또는 삽입(inverted)시킬 있고, 플록싱된 유전자는 기관-특지적 녹아웃(organ-specific knockouts) 목적을 위해 사용된다.

또한, 상기 “Cre 재조합효소(recombinase)”는 “Cre”이라고도 불리며, P1 박테리오파지(bacteriophage)에서 유래한 타입(Type) I 토포아이소머레이즈(topoisomerase)로, LoxP 사이트 사이의 사이트-특이적 DNA 재조합를 촉매한다. Cre 재조합효소는 유전자 및 염색체를 변형하는 툴로서 유용하며, 실험 동물의 LoxP 사이트에 둘러싸인 DNA 세그먼트(일명, ‘플록스트(floxed)')를 제거하는데 사용된다.

따라서 본 발명은 상기의 방법들을 통해 Mis18α 유전자 결핍 생쥐를 제조할 수 있으며, 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터가 도입되어 상동재조합 된 생쥐의 배아간세포 또는 생쥐세포주, 상기 생쥐의 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배에 미세주입하고 이를 대리모에서 착상시켜 제조한 키메라 생쥐를 제공할 수 있다.

또한, 상기 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 제조한 한쪽 유전자가 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 Mis18 α ^f/+ 유전자형의 Mis18α 한쪽 유전자 적중 생쥐를 비롯하여, 상기 Mis18 α ^f/+ 유전자형 생쥐와 Cre 재조합효소를 발현하는 생쥐를 교배하여 Mis18 α ^+/Δ 유전자형의 형질전환 생쥐를 제공할 수 있다. 상기 Cre 재조합효소를 발현하는 생쥐는 프로타민 프로모터에 의하여 발현이 조절되는 Cre 재조합 효소를 가지고 있는 Protamine-Cre 생쥐일 수 있다. 더불어, 상기 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 교배하여 제조된 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐 배아를 제공할 수 있다.

한편, 본 발명은 동원체 이상이나 염색체 분열 이상 등을 포함한 세포분열 과정의 이상과 관련된 질병의 치료제 또는 예방제를 스크리닝하기 위한 시험관내(in vitro) 분석방법에 사용될 수 있다.

이에 제한되는 것은 아니나, 상기 질병은 염색체 분열 이상 및 비정상적 세포분열로 인해 유래되는 것으로 당업계에 널리 알려진 암 또는 자가면역질환일 수 있다.

상기 치료물질은 Mis18α의 발현을 증가시키는 것뿐만 아니라 경우에 따라서는 개체 내에서 Mis18α의 기능을 억제하거나 Mis18α의 발현을 감소시키는 것일 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 분석방법은 (a) Mis18 α ^Δ/Δ 넉아웃 생쥐 배아와 Mis18 α ^+/+ 야생형 생쥐 배아의 분열 초기 시간에 따른 세포분열 과정을 관찰하는 단계; (b) 상기 Mis18 α ^Δ/Δ 생쥐 배아와 Mis18 α ^+/+ 야생형 생쥐 배아에 치료물질을 투여하고, 같은 시간 동안의 세포분열 양상을 관찰하는 단계; 및 (d) 상기 치료물질을 투여하기 전과 투여한 후의 세포분열 양상의 변화 정도를 비교하여 Mis18 α ^+/+ 야생형 생쥐 배아에서의 세포분열 과정 진행 촉진율에 비해 Mis18 α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아에서의 촉진율을 증가시키는 물질을 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 "치료제 또는 예방제"는 임의의 물질(substance), 분자(molecule), 원소(element), 화합물(compound), 실재물(entity) 또는 이들의 조합을 포함한다. 예컨대, 이에 제한되지는 않으나, 단백질, 폴리펩티드, 소 유기 물질(small organic molecule), 다당류(polysaccharide), 폴리뉴클레오티드 등을 포함한다. 또한 자연 산물(natural product), 합성 화합물 또는 화학 화합물 또는 2개 이상의 물질의 조합일 수도 있다.

또한, 본 발명은 동원체 이상이나 염색체 분열 이상 등을 포함한 세포분열 과정의 이상과 관련된 질병의 치료제 또는 예방제를 스크리닝하기 위한 생체내(in vivo) 분석방법을 제공한다. 상기 물질은 개체 내에서 Mis18α의 기능을 촉진하거나 Mis18α의 발현을 증가시키는 것일 수 있다.

보다 구체적으로 본 발명의 분석방법은 (a) 리포터 유전자에 작동가능하게 연결된 Mis18α 유전자 및/또는 Mis18α 유전자의 프로모터를 코딩하는 핵산을 포함하는 DNA 컨스트럭트(construct)를 제조하는 단계; (b) 상기 DNA 컨스트럭트를 치료물질에 접촉시키는 단계; 및 (c) 리포터 유전자의 발현정도를 측정하여 리포터 유전자의 발현을 억제하는 제제를 선별하는 단계를 포함할 수 있다.

상기에서 "리포터 유전자"는 목적으로 하는 유전자의 발현을 고감도로 용이하게 관찰하는데 사용되는 유전자를 말한다. 보다 구체적으로 리포터 유전자는 목적유전자의 발현 정도에 따라 그 발현이나 생산 정도가 조절되어 목적 유전자의 발현을 직접적으로 검출하는 것을 대신하여 사용되며, 직접적으로 또는 간접적으로 표준방법에 의해 용이하게 이의 활성 또는 생산 정도를 검출할 수 있는 특징이 있다. 이러한 유전자는 당업계에 공지되어 있으며 이에 한정되지는 않으나, 예를 들면, 클로람페니콜 아세틸 트랜스퍼라아제(CAT), β-갈락토시다아제 및 루시퍼라아제 등이 있다. 또한 이들의 활성 또는 생산 정도를 측정하는 방법도 당업계에 공지되어 있다.

상기에서 "DNA 컨스트럭트"는 타겟 조직, 세포주 또는 동물에 형질전환될 수 있도록 인공적으로 조립된 DNA 단편을 말한다. 바람직하게는, 상기 DNA 컨스트럭트는 목적 유전자 서열, 조절 서열 및 리포터 유전자 서열을 포함한다. 상기에서 "작동 가능하게 연결(operably linked)"된다는 것은 적절한 핵산이 발현 조절 서열에 결합될 때 유전자 발현을 가능하게 하는 방식으로 연결된다는 것을 의미한다.

그리하여 상기에서 치료물질의 존재로 인해 리포터 유전자의 발현이 증가되는 것은 후보물질이 Mis18α의 발현을 증가시켜 정상적인 세포분열을 일으키는데 유용할 수 있음을 의미한다.

따라서 본 발명은 Mis18α 한쪽 유전자가 결핍된 Mis18 α ^+/Δ 형질전환 동물 및 그 세포주, 동물 배아를 이용하여, 비정상적인 세포분열과 관련된 질환의 동물 모델, 실험 세포주로서 이용하는 방법을 제공할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명하기로 한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

<실시예 1>

Mis18 α ( NAP1 ) 단백질의 동정 및 특성 분석

본 발명자들은 NcoR의 억제성 도메인(repressor domain)을 베이트(bait)로 사용하여 효모 이중 중합 스크리닝(yeast two hybrid screening) 방법으로 새로운 ORF를 찾아내었고 NcoR-Associated Protein (NAP) 1 으로 명명하였다. 기능이 밝혀지지 않은 새로운 유전자로 동정되었으나 연구를 진행하는 동안 Mis18α라는 이름으로 보고되었다. 이에 본 발명자들은 Mis18α라는 이름을 따르고자 한다.

Mis18α는 204개의 아미노산으로 이루어진 단백질로서 아연 핑거(Zinc finger)와 꼬인 코일(coiled-coil) 도메인을 갖고 있으며(도 1의 B), Mis18α의 DNA 염기서열과 아미노산 서열은 각 서열번호 1 및 서열번호 2에서 확인할 수 있다.

생쥐의 각 조직에서 RNA를 정제한 후 Mis18α mRNA의 발현을 관찰한 결과 고환에서 발현이 가장 높았고, 비장, 폐 등에서도 발현되는 것을 확인하였다(도 1의 D).

Mis18α 유전자의 특성을 분석하기 위하여, NcoR과 Mis18α를 효모에서 함께 발현시킨 결과, 도 1의 A에서 볼 수 있듯 리포터 유전자인 β-gal의 발현이 증가하는 것으로 서로의 결합을 확인되었다.

또한, Mis18α와 NcoR이 세포내에서 결합하는지를 확인하기 위하여 HeLa 세포주에 Myc-Mis18α를 발현시킨 후 NcoR에 대한 항체로 면역침강을 수행한 후 Myc-tag에 대한 항체를 이용하여 면역염색을 수행한 결과, 도 1의 E에서와 같이 NcoR과 Mis18α가 세포내에서 결합하고 있음을 확인할 수 있었다.

이어서 본 발명자들은 NcoR의 어느 부위에 Mis18α가 결합하는지 알아보기 위하여 여러 가지 NcoR deletion mutant들과 GST-Mis18α와의 결합을 살펴보았다. 그 결과 도 2A에서 보이듯이 NcoR의 억제성 도메인(repressor domain) I을 포함하는 부위에 Mis18α가 결합한다는 사실을 알아냈었다. 또한 전사와 관련하여 Mis18α의 기능을 알아보기 위하여, Mis18α를 GAL4의 DNA 결합부위(binding domain)에 연결하여 발현시킨 결과, Mis18α가 β-gal 리포터의 전사를 억제하는 기능이 있다는 것을 알아내었다(도 2B).

< 실시예 2>

In situ hybridization 방법을 이용한 생쥐 발달과정과 성체에서 Mis18 α의 발현 양상 분석

본 발명자들은 Mis18α의 발현 양상을 보다 자세히 분석하기 위하여 in situ hybridization을 수행하였다(도 3). Mis18α mRNA는 배아 일령 9.5 (e9.5)와 e12.5에서는 몸 전체의 조직들에서 비교적 고른 발현 양상을 보이나, 발생이 진행되어 e15.5에 이르면 전체적인 발현은 줄어들고 피부, 흉선, 신장 등 몇몇 조직에 특이적인 발현 양상을 보인다(도 3A). 이러한 특징은 새끼가 태어난 후에도 지속되었다(도 3B).

또한 성체에서는 Mis18α mRNA가 전체적으로 발현되기는 하지만 태아에 비하여 발현양이 현저히 낮은 것으로 보이고 몇몇 조직에서만 Mis18α의 발현이 높게 나타났다(도 4). Mis18α의 발현이 높은 조직으로는 난소(특히 난모세포), 고환, 피부, 흉선, 비장, 신장 등으로 세포의 분열이 많이 일어나는 부위에서 Mis18α의 발현이 많이 나타났다. 이러한 Mis18α의 발현 양상에 대한 정보들은 Mis18α 조건부 유전자 결손 생쥐를 분석할 때 어느 조직에서 유전자를 제거할 것인지를 결정할 때 중요한 정보를 제공하였다.

< 실시예 3>

Mis18 α 결합 단백질들의 동정

본 발명자들은 Mis18α와 결합하는 단백질을 찾기 위해서 다음의 실험을 수행하였다. 3x플래그 태그(Flag tag)을 가지고 있는 Mis18α를 HEK293T 세포주에 발현시키고 세포분획을 얻었다. 항플래그 항체(Anti-Flag antibody) (M2)-아가로즈(agarose)를 이용하여 플래그 태그(Flag-tag)을 가지고 있는 단백질들을 풀다운(pull-down) 한 후 3x플래그 펩티드(Flag peptide)를 이용하여 결합단백질을 순수하게 분리하였다. 얻어진 단백질들을 질량분석법(mass spectrometry)를 이용하여 동정하였다. 동일한 실험을 총 4회 반복 수행하여 4회 모두 반복적으로 동정된 단백질들을 Mis18α와 결합할 가능성이 높은 단백질로 분류하였다(표 1 참조).

Mis18α 결합단백질

Gene Symbol	Protein Name
CCDC144A	coiled-coil domain containing 144A
OIP5	Opa interacting protein 5 (Mis18β)
YEATS4	YEATS domain containing 4 (GAS41)
MLSTD1	Male sterility domain containing 1
MLSTD2	Male sterility domain containing 2

또한 본 발명자들은 Mis18α와 결합하는 단백질들을 알아내기 위하여 생쥐의 Mis18α를 베이트(bait)로 사용하여 생쥐 배아 17 일령 라이브러리(library)를 스크리닝 하였다. 최초의 84개 clone들 중에서 여러 단계의 검증과정을 거쳐 활성전사인자(activating transcription factor) 5 (Atf5), var1,3-like 1 억제자(Supv3l1), DNA 메틸전이효소1 연관 단백질1(Dmap1), 중심체 단백질(centrosomal protein) 27 (Cep27) 등 4개의 유전자가 최종 선택되었다.

Mis18α와 결합하는 단백질로 동정된 OIP5는 Cenp-A 로딩(loading) 과정에 Mis18α와 함께 작용한다 해서 Mis18β라는 이름으로 보고된 바 있다. 이에 본 발명자들은 본 발명에서 OIP5의 일차구조를 분석하는 과정에서 OIP5의 N-말단 부위에 세포내에서 유비퀴틴-프로테아좀 시스템에 의해서 분해되는 단백질들에서 많이 발견되는 PEST 서열(sequence)이 존재하는 것을 발견하였다(도 5A).

또한 OIP5를 세포에 독립적으로 발현을 시키면 발현이 잘 되지 않는다는 사실을 발견하였고, Mis18α와 함께 발현시킬 경우 발현양이 현저히 증가하는 것을 확인하였다(도 5B). 상기 결과를 통해 본 발명자들은 OIP5가 매우 불안정한 단백질이며, Mis18 복합체의 기능을 조절하는 중요한 표적이 됨을 알 수 있었다.

< 실시예 4>

Mis18 α 유전자결손 적중벡터 제조

본 발명자들은 Mis18α 유전자를 구성하는 5개의 엑손 중 전사시작코돈(ATG)이 포함되어 있는 1번 엑손과 2번 엑손을 동시에 제거할 수 있도록 적중벡터를 설계하고자 하였다. 우선 Mis18α 유전자결손 적중벡터를 제조하기 위해 C57BL/6 종(strain) 생쥐의 게놈 DNA로부터 약 10.5 kb 정도 크기의 해당부위를 얻어내어 pSP72 벡터(프로메가)에 도입하였다. 1번과 2번 엑손을 포함하는 표적부위는 약 2.5 kb의 크기로서 양쪽 끝 부위에 LoxP 서열을 삽입하여(플록스드, floxed) Cre 재조합 효소의 작용에 의하여 1, 2번 엑손을 제거할 수 있도록 하였다. 약 1.2 kb 크기의 짧은 상동재조합 부위(homology arm)를 2번 엑손의 3’쪽에 위치 시켰고, 약 6.5 kb 크기의 긴 상동재조합 부위를 1번 엑손의 5’쪽에 위치 시켰다. LoxP 서열과 FRT 서열에 의해 이중으로 둘러싸인 네오마이신 저항 유전자(Neo gene)는 pGK-gb2 LoxP/FRT-Neo에서 잘라내어 2번 엑손의 3’쪽에 위치 시켰다. 이렇게 제작된 적중벡터의 총 크기는 14.7 kb이며, 그 염기서열은 서열번호 3에 기재된 바와 같았다(도 6 참조).

< 실시예 5>

Mis18 α 유전자 플록스드 ( floxed ) 배아간세포의 제조

본 발명자들은 Mis18α 유전자 플록스드 배아간세포를 제조하기 위하여 상기에서 제조한 적중벡터 10μg을 제한효소 ClaI으로 절단하여 선형화 한 후, C57BL/6 종 생쥐의 배아간세포에 전기충격법으로 도입하였다. G418을 처리하여 살아남은 배아간세포 클론을 확보한 후 써던블러팅(southern blotting)으로 적중벡터가 상동 재조합된 것을 확인하였다.

게놈 DNA에 적중벡터가 도입된 배아간세포의 경우 네오마이신 저항성 유전자가 포함되어 있기 때문에 G418을 포함하는 배지에서도 살아남게 된다. 상기 배아간세포에 도입한 적중벡터의 상동재조합 여부를 검증하기 위하여 각각의 배아간세포에서 게놈 DNA를 추출한 후, EcoRI 제한효소로 절단하고, 도 1에 표시된 프로브(probe)를 이용하여 써던블러팅을 수행하였다.

적중벡터의 네오마이신 저항성 유전자의 3’ 부위에 인위적으로 EcoRI 인지서열을 포함시켜 EcoRI 제한효소로 절단 시 절편의 크기 차이를 써던블러팅으로 분석 가능하게 하였다. 그 결과 정상적인 Mis18α 게놈 유전자는 EcoRI 제한효소에 의해 약 8.4 kb 크기의 절편으로 나타났고, 적중벡터가 상동재조합에 의해 게놈 내에 삽입된 경우에는 EcoRI 제한효소에 의해 약 6.6 kb 크기의 절편으로 나타났다(도 7). 따라서 본 발명자들은 본 발명의 배아간세포가 적중벡터가 도입되어 상동재조합이 일어난 것을 알 수 있었다.

< 실시예 6>

배아간세포를 이용한 Mis18 α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+)의 생산

본 발명자들은 상기에서 얻은 Mis18α 유전자 플록스드 배아간세포를 Balb/c 생쥐의 낭배(blastocyst) 내괴세포(inner cell mass)에 미세주입하고 이를 가임신된 대리모 생쥐에 착상시켜 키메라 생쥐를 제조하였다. 키메라 생쥐들 중에서 검은 털 색깔의 비중이 높은 수컷 생쥐들을 골라 C57BL/6 암컷 생쥐들과 교배하여 F1 자손을 생산하였다. 이렇게 생산된 생후 3주령 F1 자손들의 꼬리를 약 0.5 cm 정도 잘라낸 후 절편에서 게놈 DNA를 추출하여 PCR 방법으로 적중벡터가 전달된 자손들을 선별하였다. 이때 사용된 PCR 프라이머는 다음과 같다.

SDL1: 5’-CTCCGTTCCGTCTTGGCACAC-3’(서열번호 4),

LOX1: 5’-CCTAAGTCGTTGACCTGACCGAGG-3’ (서열번호 5).

적중벡터가 전달된 자손들의 경우는 LoxP 서열이 추가되어 있기 때문에 380 bp의 PCR 산물이 만들어졌고, 정상적인 Mis18α 게놈 유전자의 경우는 320 bp의 PCR 산물이 만들어졌다.

< 실시예 7>

네오마이신 저항성 유전자가 제거된 Mis18 α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+)의 생산

네오마이신 저항성 유전자가 생쥐에 남아 있을 경우 주변 유전자의 발현을 저해하는 경우들이 알려져 있어 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+)에서 네오마이신 저항성 유전자를 제거하였다. Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+) 암컷과 Flp 재조합 효소를 발현하는 FLPeR 생쥐(잭슨 래버러토리, The Jackson Laboratory) 수컷을 교배하여 새끼를 얻었다. 새끼들 중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 보이는 수컷을 C57BL/6 종의 암컷과 교배하여 네오마이신 저항성 유전자가 제거된 새끼들을 얻었다. 네오마이신 저항성 유전자가 정확히 제거된 것은 생쥐의 꼬리에서 추출한 게놈 DNA에 대하여 PCR을 실시하여 확인하였다. 또한 PCR로 얻어진 DNA를 시퀀싱 하여 네오마이신 유전자가 정확히 제거된 것을 확실하게 하였다. 이때 사용된 프라이머는 다음과 같다.

Exon2: 5’-GTCCAAGTGCAGAGATGAAGACGG-3’(서열번호 6),

AT2RV: 5’-CTCCCACTTTCCGATCTTAAGGGG-3’(서열번호 7).

< 실시예 8>

Mis18 α 엑손 1과 2의 제거된 Mis18 α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+)의 생산

생쥐에서 Mis18α 유전자의 기능을 없애기 위하여 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+)에서 Mis18α 유전자의 엑손 1과 2를 제거하였다. 네오마이신 저항성 유전자가 제거된 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드 생쥐(f/+) 수컷과 프로타민 프로모터에 의하여 발현이 조절되는 Cre 재조합 효소를 가지고 있는 암컷 생쥐 (protamine-Cre, 잭슨 래버러토리)를 교배하여 새끼를 얻었다. 이 경우 수컷의 정자가 성숙되는 단계에서 Cre 재조합 효소가 발현되기 때문에 후대의 모든 조직과 세포들에서 Mis18α 유전자의 엑손 1과 2를 영구히 제거할 수 있다.

얻어진 새끼들 중에서 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖으며 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 수컷들을 선별하여 C57BL/6 종의 암컷과 교배하였다. 이때 얻어진 새끼들의 일부는 Mis18α의 한쪽 유전자에서 엑손 1과 2가 제거된 형태(Δ/+)를 보인다. Mis18α 유전자에서 엑손 1과 2가 정확히 제거되었는지는 생쥐의 꼬리에서 추출한 게놈 DNA를 대상으로 PCR을 수행하여 확인하였다.

또한 PCR로 얻어진 DNA를 시퀀싱 하여 엑손 1과 2가 정확히 제거된 것을 확실하게 하였다. 이때 사용된 프라이머는 상기에 기술된 Exon2(서열번호 6)와 AT2RV(서열번호 7)이며, 엑손 1과 2가 제거된 경우 약 200 bp 크기의 PCR 산물이 만들어 진다. 최종적으로 게놈에서 Mis18α의 한쪽 유전자에서 엑손 1과 2가 제거된 생쥐의 유전형을 Mis18 α ^+/Δ 로 표기한다.

< 실시예 9>

Mis18 α 유전자결손이 초기 배아형성 단계에서 미치는 영향분석

게놈에서 Mis18α의 한쪽 유전자에서 엑손 1과 2가 제거된 생쥐의 경우는 외형상 정상생쥐와 아무런 차이가 없고, 성장과 생식기능에도 전혀 문제가 없는 것으로 나타났다. 그러나 Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 경우(Mis18 α ^Δ/Δ 유전형)에는 정상적으로 출생되지 못하는 것으로 나타났다. Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐 암컷과 수컷을 교배하여 새끼를 얻었을 경우 분석한 79마리의 새끼 중에서 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형을 보이는 새끼는 한 마리도 발견할 수 없었다(도 8과9). 이는 Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 경우 생쥐들은 태어나기 이전에 죽는다는 사실을 제시하는 것이었다.

발생단계의 어느 시기에 배아가 죽는지 확인하기 위하여 Mis18α 유전자 한쪽이 결손된 생쥐들을 서로 교배시킨 후, 임신된 암컷으로부터 발생 시기별로 배아를 분리하여 Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 배아가 죽는 시기를 알아보았다. 임신 12.5일 째와 9.5일째에는 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형을 보이는 새끼가 살아있는 것을 한 마리도 발견하지 못하였다. 그러나 임신 3.5일째의 배아들에서는 총 67마리 중 20마리가 Mis18 α ^Δ/Δ 유전형을 보이는 것으로 확인되었다(도 8과 10).

따라서 Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 경우 배아들이 적어도 임신 3.5일 까지는 생존하는 것으로 확인되었다. 배아의 사망 시기를 보다 정밀하게 분석하기 위하여 Mis18α 유전자 한쪽이 결손된 생쥐들을 서로 교배시킨 후 임신 3.5일에 배아를 추출한 후 인공적으로 배양하면서 성장을 분석하였다.

Mis18α 유전자가 정상(Mis18 α ^+/+ )이거나 한쪽이 결손된(Mis18 α ^+/Δ ) 배아들은 배양 후 48시간 정도에 배아의 껍질이 벗겨지고 내괴세포와 트로포브라스트(trophoblast)들이 배양접시에 정착하여 자라기 시작하였다. 약 72시간 후에는 내괴세포들이 분열하여 덩어리를 형성하는 것이 명확히 관찰되었고, 약 92시간 정도까지 정상적으로 자라는 것을 확인하였다 (도 11). 그러나 Mis18α 유전자 양쪽이 모두 결손된 배아들의 경우에는 배아의 껍질이 벗겨지고 내괴세포와 트로포브라스트(trophoblast)들이 배양접시에 정착하여 자라기 시작하는 단계에는 문제가 없으나, 약 72시간 정도에 내괴세포의 덩어리가 형성되지 않는다는 사실을 확인하였다(도 11). 결국 세포들은 퇴화하여 92시간에는 배양접시에 남아있지 않았다.

따라서 본 발명자들은 Mis18α 유전자가 양쪽 다 결손된 경우 배아는 임신 3.5일 까지는 생존해 있으니 가까운 시기에 사멸하게 된다는 결론을 도출하였다.

< 실시예 10>

Mis18 α 유전자결손이 염색체 분열과 세포사멸에 미치는 영향분석

본 발명자들은 Mis18α 유전자결손 생쥐가 배아상태에서 죽는 원인을 좀 더 자세히 알아보기 위하여 Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐 암컷과 수컷을 교배한 후 임신 3.5일에 배아를 추출하여 24시간 동안 인공배양 한 후 배아의 유사분열 과정을 면역염색법으로 분석하였다.

배아 내에서 유사분열기에 있는 세포들을 히스톤 H3의 10번 세린잔기가 인산화 된 것(H3S10 phosphorylation, 유사분열기의 DNA에서만 특이적으로 발견되는 현상)을 면역염색으로 확인하여 찾아내었고, DAPI(4’, 6’-diamidino-2 -phenylindole)를 이용하여 염색체를 염색하였고, 알파-튜블린(α-tubulin)에 대한 면역염색을 수행하여 방추사를 염색하였다.

정상생쥐 배아의 경우 유사분열 과정인, 전기, 중기, 후기, 말기에서 염색체와 미세소관으로 구성된 방추사들이 정상적으로 배열되고 분리되데 비해, Mis18α 유전자결손 배아의 경우 이 과정에서 다음과 같은 문제들이 관찰되었다. 정상생쥐의 배아에서 보이는 바와 비교하여(도 12A), Mis18α 유전자결손 생쥐배아의 경우에는 염색체와 방추사가 비정상적으로 정렬되어 있는 경우가 많이 발견되었다(도 12B). Mis18α 유전자가 정상인 배아의 세포에서는 염색체가 세포의 적도면에 잘 정렬되어 있었고, 방추사가 염색체에 오차 없이 연결되어 있는 모양을 관찰할 수 있었다(도 13A). 그러나 Mis18α 유전자결손 생쥐배아의 경우에는 분열중인 세포에서 염색체가 제대로 배열되지 않은 경우와 잘라져서 떨어져나간 염색체(satellite chromosome) 등이 관찰되었다(도 13B).

또한 방추사가 염색체에 부착되어 있지 않은 경우도 많이 발견되었으며, 유사분열 전기에 염색체가 중심으로 모여드는데 문제가 있었고, 말기에 염색체 분열시 염색체가 잘라지는 현상이 발견되었다. 이에 본 발명자들은 Mis18α가 배아세포 분열시 염색체 분열과정에서 중요한 역할을 수행한다는 사실을 알 수 있었고 특히 배아 세포의 발달과정에 있어서 매우 중요한 인자라는 사실을 확인할 수 있었다.

또한 본 발명자들은 히스톤 H3의 유사체인 CENP-A가 새로 합성된 후 동원체에 위치하는 과정에 Mis18α가 중요한 역할을 수행하는지를 확인하기 위하여 Mis18 α ^+/Δ 유전형을 갖는 생쥐 암컷과 수컷을 교배한 후 임신 3.5일에 배아를 추출하여 24시간 동안 인공배양 한 후 CENP-A 단백질에 대한 면역염색을 수행하고, DAPI로 염색체를 염색하였다.

CENP-A 단백질은 동원체에만 위치하므로 항체를 이용해서 염색했을 때 세포핵 내에서 점으로 분포되는 것을 확인할 수 있는데, 정상 배아의 세포들에서는 DAPI로 염색된 대부분의 세포핵에서 CENP-A가 강하게 점 모양으로 염색되는 것을 관찰하였으나, Mis18α 유전자결손 생쥐배아의 세포들에서는 핵은 DAPI로 염색되나 CENP-A가 핵에서 점 모양으로 염색되는 양상을 보이지 않았다 (도 14).

CENP-A는 염색체 분열시 방추사가 부착되는 동원체 부위를 형성하는데 중요한 역할을 하는 히스톤 유사체로서, CENP-A가 동원체에 제대로 위치하지 못하면 방추사가 염색체에 부착되지 못하여 염색체 분열이 정상적으로 일어날 수 없으며, 세포는 사멸에 이르게 될 것으로 예상되어 Mis18α 유전자결손 생쥐배아의 세포들에 대하여 TUNEL(Terminal deoxynucleotidyltransferase-mediated dUTP-biotin nick end labeling) 방법으로 세포사멸을 조사하였다.

그 결과, 정상생쥐 배아 세포들에서는 세포사멸이 매우 적은 반면 (1.8 ± 0.3 per embryo) Mis18α 유전자결손 생쥐배아의 세포들에서는 정상생쥐 배아 세포들에 비하여 세포사멸이 통계적으로 매우 높게 (7.8 ± 1.5 per embryo) 나타났다(도 15). 결론적으로, Mis18α 유전자의 결손으로 인해 CENP-A가 동원체에 위치하지 못하게 되고, 이는 세포분열시 염색체 분열의 이상을 초래하며 결국 세포사멸에 이른다는 사실이 증명되었다. 이에 본 발명자들은 Mis18α 유전자가 결손된 배아는 세포사멸로 인하여 더 이상 개체로 발달하지 못한다는 것을 알아낼 수 있었다.

이제까지 본 발명에 대하여 그 바람직한 실시예들을 중심으로 살펴보았다. 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 본 발명이 본 발명의 본질적인 특성에서 벗어나지 않는 범위에서 변형된 형태로 구현될 수 있음을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 개시된 실시예들은 한정적인 관점이 아니라 설명적인 관점에서 고려되어야 한다. 본 발명의 범위는 전술한 설명이 아니라 특허청구범위에 나타나 있으며, 그와 동등한 범위 내에 있는 모든 차이점은 본 발명에 포함된 것으로 해석되어야 할 것이다.

<110> Industry Academic Cooperation Foundation of Sookmyung Women's University <120> Mis18-alpha knockout mouse model and producing method thereof <130> np11-1194 <160> 7 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 615 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Mis18-alpha gene cDNA <400> 1 atgtcgagcg agtcccccct gctggagaag cgtctgtcgg aagactcgag ccgctacctg 60 cggctgcaga agtgggcaaa catgtcgagc gcagacgcgt tagggctaga gaaggaacgg 120 cctgaggaga aggcggccgc ggcggagaac ccgctggtgt tcctttgtgc ccgctgtcgc 180 cggccactgg gcgactcgct cacctgggtg gccagccagg aggacaccaa ctgcatcctg 240 ttgcgcagcg tctcctgtaa cgtctctgtg gataaggaac cgaaactgtc caagtgcaga 300 gatgaagacg gttgcatcct tgaggcgctg tactgcacgg gctgctccct cagccttggc 360 tatgtgtaca gatgcactcc taagaacctg gactacaagc gcgacttgtt ctgcctcagc 420 gttgaagccg ttgaaagtta caccttaggg tcctctgaga agcaaatcgt gtcagaagac 480 aaggagcttt tcaaccttga aagccgagtt gaaatagaga agtctataaa gcagatggaa 540 gaagtcctga cagccctgca aaagaagcta cgggaagttg aatctaaact gtccttggcc 600 agccggggca gctga 615 <210> 2 <211> 204 <212> PRT <213> Artificial Sequence <220> <223> mouse Mis18-alpha protein <400> 2 Met Ser Ser Glu Ser Pro Leu Leu Glu Lys Arg Leu Ser Glu Asp Ser 1 5 10 15 Ser Arg Tyr Leu Arg Leu Gln Lys Trp Ala Asn Met Ser Ser Ala Asp 20 25 30 Ala Leu Gly Leu Glu Lys Glu Arg Pro Glu Glu Lys Ala Ala Ala Ala 35 40 45 Glu Asn Pro Leu Val Phe Leu Cys Ala Arg Cys Arg Arg Pro Leu Gly 50 55 60 Asp Ser Leu Thr Trp Val Ala Ser Gln Glu Asp Thr Asn Cys Ile Leu 65 70 75 80 Leu Arg Ser Val Ser Cys Asn Val Ser Val Asp Lys Glu Pro Lys Leu 85 90 95 Ser Lys Cys Arg Asp Glu Asp Gly Cys Ile Leu Glu Ala Leu Tyr Cys 100 105 110 Thr Gly Cys Ser Leu Ser Leu Gly Tyr Val Tyr Arg Cys Thr Pro Lys 115 120 125 Asn Leu Asp Tyr Lys Arg Asp Leu Phe Cys Leu Ser Val Glu Ala Val 130 135 140 Glu Ser Tyr Thr Leu Gly Ser Ser Glu Lys Gln Ile Val Ser Glu Asp 145 150 155 160 Lys Glu Leu Phe Asn Leu Glu Ser Arg Val Glu Ile Glu Lys Ser Ile 165 170 175 Lys Gln Met Glu Glu Val Leu Thr Ala Leu Gln Lys Lys Leu Arg Glu 180 185 190 Val Glu Ser Lys Leu Ser Leu Ala Ser Arg Gly Ser 195 200 <210> 3 <211> 2462 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Cloning vector pSP72 from Promega <400> 3 gaactcgagc agctgaagct tgcatgcctg caggtcgact ctagaggatc cccgggtacc 60 gagctcgaat tcatcgatga tatcagatct gccggtctcc ctatagtgag tcgtattaat 120 ttcgataagc caggttaacc tgcattaatg aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt 180 gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct 240 gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga 300 taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc 360 cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg 420 ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg 480 aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 540 tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 600 gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg 660 cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact 720 ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt 780 cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct 840 gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac 900 cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc 960 tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1020 ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 1080 aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 1140 atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 1200 ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 1260 tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 1320 agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 1380 taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 1440 tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 1500 cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag 1560 ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt 1620 tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 1680 tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 1740 cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 1800 tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 1860 gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 1920 tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 1980 atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 2040 tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg 2100 cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac 2160 ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga 2220 aaacctctga cacatgcagc tcccggagac ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg 2280 gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa 2340 ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag agtgcaccat atggacatat tgtcgttaga 2400 acgcggctac aattaataca taaccttatg tatcatacac atacgattta ggtgacacta 2460 ta 2462 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SDL1 primer <400> 4 ctccgttccg tcttggcaca c 21 <210> 5 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> LOX1 primer <400> 5 cctaagtcgt tgacctgacc gagg 24 <210> 6 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Exon2 primer <400> 6 gtccaagtgc agagatgaag acgg 24 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> AT2RV primer <400> 7 ctcccacttt ccgatcttaa gggg 24

Claims

LoxP (locus of X-over P1) 부위, 생쥐 Mis8α 게놈 유전자 1번째 엑손(exon)의 5'방향에서 두 번째로 가까운 EcoRI 절단부위에서부터 2번 엑손까지의 유전자 절편, 네오마이신 저항 유전자 및 EcoRI 절단부위의 순서로 이루어진 DNA 서열을 포함하는 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터(targeting vector).
상기 네오마이신 저항 유전자는,
FRT (Flippase Recognition Target) 부위, LoxP 부위, 네오마이신 저항 유전자, FRT 부위 및 LoxP 부위의 순서로 이루어진 것을 특징으로 하는 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터.
제1항의 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터가 도입되어 상동재조합(homologous recombination) 된 생쥐의 배아간세포(embryo stem cell).
제3항의 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배(blastocyst)에 미세주입하고 이를 대리모에 착상시켜 제조한 키메라(chimera) 생쥐.
제4항의 키메라 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 제조한 Mis18 α ^f/+ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자가 플록스드(floxed)된 생쥐.
제5항의 Mis18 α ^f/+ 유전자형 생쥐와 Cre 재조합효소를 발현하는 생쥐를 교배하여 제조한 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐.
제6항의 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 교배시켜 제조되는 Mis18 α ^Δ/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐 배아.
유전체(genome) 상의 Mis18α 한쪽 유전자가 제거된 Mis18 α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 제조하는 방법에 있어서,
생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터를 제작하는 단계;
상기 적중 벡터를 배아간세포에 도입하여 상동재조합에 의해 Mis18α 유전자의 일부가 제거된 배아간세포 클론을 얻는 단계;
상기 Mis18α 유전자 결핍 배아간세포를 정상 생쥐의 낭배(blastocyte)의 내괴세포(inner cell mass)에 미세주입하고 이를 대리모 생쥐에 착상시켜 키메라(chimera) 생쥐를 얻는 단계; 및
상기 키메라 생쥐로부터 교배를 통해 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계를 포함하는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐의 제조방법.
제8항에 있어서,
상기 생쥐 Mis18α 유전자 적중 벡터는 제1항의 벡터인 것을 특징으로 하는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐의 제조방법.
제9항에 있어서,
상기 키메라 생쥐로부터 교배를 통해 Mis18 α ^+/Δ 유전자형을 갖는 Mis18α 한쪽 유전자 결핍 생쥐를 얻는 단계는,
상기 키메라 생쥐를 Flp 재조합 효소(Flippase)를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계;
상기 교배를 통해 얻은 자손 중에서 Flp 재조합 효소를 발현하면서 동시에 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(floxed)(f/+) 유전형을 보이는 생쥐를 선별하는 단계;
상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 얻는 단계;
상기 네오마이신 저항 유전자가 제거된 생쥐를 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐와 교배시키는 단계;
상기 교배를 통해 얻은 자손 중 Mis18α 한쪽 유전자 플록스드(f/+) 유전형을 갖는 동시에 Cre 재조합 효소를 발현하는 생쥐들을 선별하는 단계; 및
상기 선별된 생쥐를 정상 생쥐와 교배시켜 Mis18α의 한쪽 유전자에서 1번 및 2번 엑손이 제거된 생쥐를 얻는 단계를 포함하는 것을 특징으로 하는 Mis18α 유전자 결핍 생쥐의 제조방법.
Mis18α 한쪽 유전자가 결핍된 Mis18 α ^+/Δ 형질전환 생쥐를 비정상적 세포분열 과 관련된 질환 동물 모델로서 이용하는 방법.
Mis18α 유전자가 넉아웃(knock-out)된 Mis18 α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아에 있어서, 상기 배아는 세포분열시 염색체 분열 이상으로 인해 개체로 발달하지 못하고 사멸하는 것을 특징으로 하는 Mis18α ^Δ/Δ 형질전환 생쥐 배아.
세포분열 이상과 관련된 질병 치료제 및 예방제 후보물질을 제12항의 Mis18 α ^Δ/Δ 배아에 처리하는 단계; 및
상기 치료물질을 처리한 배아와 처리하지 않은 Mis18 α ^Δ/Δ 배아의 세포분열 과정을 비교하여 세포분열 능력을 회복시킨 물질을 선별하는 단계를 포함하는 세포분열 이상과 관련된 질병 치료체 및 예방제의 스크리닝 방법.
제13항에 있어서,
상기 질병은 암 또는 자가면역질환인 것을 특징으로 하는 세포분열 이상과 관련된 질병 치료체 및 예방제의 스크리닝 방법.