WO2022114617A1 - 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도 - Google Patents

염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도 Download PDF

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성제경
이호
오승현
김민우
전윤
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국립암센터
서울대학교 산학협력단
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Definitions

  • the present invention relates to an inflammatory signal bioimaging mouse model, a method for preparing the same, and a use thereof.
  • Inflammation is a defense mechanism induced by infection or body damage, and is a complex biological response that is involved by various cells and is regulated by several cytokines and signaling pathways. The product of the inflammatory response also induces damage to surrounding tissues, and damage to these tissues is known to be associated with the onset of various diseases.
  • SAIDs steroidal anti-inflammatory drugs
  • NSAIDs/NAIDs non-steroidal anti-inflammatory drugs
  • Steroidal anti-inflammatory drugs act on glucocorticoid receptors to suppress inflammation-related gene expression, thereby exhibiting anti-inflammatory effects.
  • Nonsteroidal anti-inflammatory drugs exhibit antipyretic, analgesic and anti-inflammatory actions by inhibiting cyclooxygenase (COX) synthesizing prostaglandin, a mediator of inflammation. It has side effects such as disorders or ulcers.
  • COX cyclooxygenase
  • anti-cytokine drugs that inhibit the action of inflammatory cytokines such as TNF- ⁇ (Tumor necrosis factor- ⁇ ), IL-1 (Interleukin-1) or IL-6 (Interleukin-6) have been developed and used.
  • TNF- ⁇ Tumor necrosis factor- ⁇
  • IL-1 Interleukin-1
  • IL-6 Interleukin-6
  • Existing animal models of inflammatory disease basically evaluate the degree of infiltration of inflammatory cells or damage to the tissue by conducting histopathological evaluation in the tissue to evaluate the degree of inflammation, or the level of inflammation-related signal transduction proteins or inflammatory cytokines. The method of analyzing the expression level is used.
  • the present inventors tried to develop an inflammation bioimaging mouse model capable of evaluating the degree of inflammation in mice inducing inflammation in vitro at a desired time without autopsy.
  • the present inventors produced a mouse model expressing luciferase according to the activation of NF- ⁇ B inflammatory signal, and crossed the model with a mouse expressing Cre recombinase specifically for cells and tissues.
  • a mouse model capable of cell/tissue-specific bioimaging of inflammatory signals, and confirmed that the luciferase signal increased in vitro when inflammation was induced in the mouse model.
  • the present invention was completed.
  • An object of the present invention is to determine the degree of inflammation in vivo without autopsy of the mouse, by measuring cell- and tissue-specific inflammatory signals several times in vitro to enable bio-imaging of a mouse model of inflammation, a manufacturing method thereof, and anti-inflammatory using the same To provide a method for screening a substance.
  • One aspect of the present invention is 1) a nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) and a reporter gene at the mouse ROSA26 locus preparing a targeting vector by inserting a gene cassette comprising;
  • step 3 inserting the mouse embryonic stem cell clone prepared in step 2) into blastocytes isolated from wild-type mice;
  • heterozygous mouse by crossing the mouse born from the surrogate mother of step 4) with a wild-type mouse; provides a method for producing an inflammatory signal bioimaging mouse model comprising.
  • Another aspect of the present invention provides an inflammatory signal bioimaging mouse model, which is manufactured by the method for producing the inflammatory signal bioimaging mouse model.
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of 1) processing the test material in a mouse prepared by crossing the mouse model of claim 7 and a transgenic mouse expressing Cre recombinase specifically for cells or tissues;
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • In vitro inflammatory signals specific to specific tissues and cells desired by the researcher can be obtained in vitro through a mouse model created by crossing the mouse model of inflammation bioimaging of the present invention with a mouse that expresses Cre recombinase specifically for specific tissues and cells. Since it can be evaluated and the trend of inflammatory changes over time can be easily checked without autopsy of live animals, it can be used throughout life science research fields including experimental zoology and molecular biology, and development of new drugs or health functional foods It can also be used as a model for evaluating the efficacy of anti-inflammatory candidates in industrial fields such as
  • FIG. 1 is a diagram showing the structure of an inflammatory signal response cassette used for manufacturing an inflammatory signal bioimaging mouse model.
  • FIG. 1A is a schematic diagram illustrating a targeting vector prepared by inserting a tissue-specific nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF- ⁇ B) reporter cassette into a mouse ROSA26 locus.
  • NF- ⁇ B activated B cells
  • FIG. 1B is a diagram illustrating a nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells (NF- ⁇ B) reporter cassette inserted into a mouse ROSA26 locus.
  • 1c is a diagram showing the final gene structure prepared by inserting a NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) reporter cassette into a mouse ROSA26 locus.
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • Figure 1d is a diagram showing the result of performing a Southern blot (southern blot) to confirm the clone in which the inflammatory signal response cassette is correctly inserted into the ROSA26 locus.
  • Figure 2a shows an inflammatory signal bioimaging mouse model and myeloid lineage cells (Myeloid lineage cells)-specifically by crossing a Lyz2-Cre mouse expressing Cre recombinase (Myeloid lineage cells)-specific inflammation.
  • PMA Phorbol 12-myristate 13-acetate
  • FIG. 2B is a graph showing the fluorescence values of FIG. 2A.
  • Figure 3a is myeloid lineage cells (Myeloid lineage cells) in a mouse model capable of specifically imaging inflammatory signals, after inducing colitis by supplying dextran sulfate sodium salt (DSS) with drinking water, inflammation using luciferase activity
  • DSS dextran sulfate sodium salt
  • 3B is a graph showing the fluorescence measurement values of FIG. 3A.
  • FIG. 4 is myeloid lineage cells (Myeloid lineage cells) specific inflammatory signal imaging is possible from the bone marrow of a mouse model capable of differentiating monocyte-based cells, macrophages, and then treating LPS (lipopolysaccharide) to induce inflammation, and lucifer
  • LPS lipopolysaccharide
  • 4a is a graph confirming the degree of NF- ⁇ B activity in macrophages differentiated from inflammation-induced myeloid lineage cells-specific inflammatory signal imaging mouse model through luciferase activity evaluation.
  • Figure 4b is a diagram confirming the degree of NF- ⁇ B activity in the macrophages differentiated from the inflammation-induced myeloid lineage cells (Myeloid lineage cells)-specific inflammatory signal imaging mouse model through Western blot.
  • Figure 4c confirms the degree of NF-kB activity in macrophages differentiated from myeloid cell-specific inflammatory signal imaging mouse model induced by LPS inflammation through luciferase activity evaluation, and treatment with NF-kB inhibitor BAY 11-7082 It is a graph confirming that the activity is inhibited.
  • 5a is a cross-breeding of an inflammatory signal bioimaging mouse model and an Alb-Cre mouse expressing hepatocyte-specific Cre recombinase to obtain a mouse model capable of hepatocyte-specific inflammatory signal imaging, and LPS Hepatitis is induced by administration of (lipopolysaccharide) and D-galactosamine, and the inflammatory signal is imaged using luciferase activity.
  • 5B is a graph showing the fluorescence measurement values of FIG. 5A.
  • One aspect of the present invention is 1) a nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) and a reporter gene at the mouse ROSA26 locus preparing a targeting vector by inserting a gene cassette comprising;
  • step 3 inserting the mouse embryonic stem cell clone prepared in step 2) into blastocytes isolated from wild-type mice;
  • heterozygous mouse by crossing the mouse born from the surrogate mother of step 4) with a wild-type mouse; provides a method for producing an inflammatory signal bioimaging mouse model comprising.
  • step 1) encodes NF- ⁇ B RE (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) at the mouse ROSA26 locus
  • step 2) encodes NF- ⁇ B RE (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) at the mouse ROSA26 locus
  • step 2) encodes NF- ⁇ B RE (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) at the mouse ROSA26 locus
  • the gene cassette may include a nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE and a reporter gene, preferably a nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE, TA promoter, luciferase.
  • a nucleotide sequence encoding a nucleotide sequence, a UBC promoter and a nucleotide sequence encoding a tdTomato may be sequentially included, but are not limited thereto.
  • the targeting vector comprises a CAG promoter, a gene segment in which a transcription stop codon site is located between two locus of X-over P1 (loxP) sites, a nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE, a TA promoter, and a luciferase
  • a nucleotide sequence encoding a nucleotide sequence a UBC promoter, a nucleotide sequence encoding a Tidi tomato, BGH poly A, and a neomycin resistance gene may be sequentially included.
  • the reporter gene is luciferase (Luciferase), ⁇ galactosidase, green fluorescent protein (Green Fluorescent Protein: GFP), enhanced green fluorescent protein (eGFP), emplum (mPlum), em cherry ( mCherry), tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus, YPet, enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire, egg It may be a gene encoding any one selected from the group consisting of calin phosphatase, and preferably, the reporter gene may be luciferase or Tidi tomato, but is not limited thereto.
  • step 2) is a step of preparing a mouse embryonic stem cell clone by inserting the targeting vector prepared in step 1) into mouse embryonic stem cells.
  • the step 2) may further include the step of selecting a mouse embryonic stem cell clone into which the targeting vector is inserted by treating the mouse embryonic stem cell clone with neomycin and performing Southern blot.
  • the clone into which the targeting vector is inserted can survive due to resistance to neomycin, but in the case of the clone into which the targeting vector is not inserted, resistance to neomycin can't survive without it
  • the Southern blot is an experimental method used in molecular biology for detecting a specific DNA sequence in a DNA sample. You can check the engraving band.
  • step 3) is a step of inserting the mouse embryonic stem cell clone prepared in step 2) into a blastocyte isolated from a wild-type mouse.
  • the blastocyst is a structure formed at an early stage of development in mammals, and constitutes an inner cell mass that forms an embryo and an outer layer of the blastocyst, and a trophoblast that becomes the placenta after implantation. is composed of When the blastocyst is inserted into the uterus, it is infiltrated into the uterine lining, and after the blastocyst is implanted in the uterus, late development, including gastrulation, proceeds.
  • step 4) is a step of implanting the blastocyst into which the clone of step 3) is inserted into the uterus of a surrogate mouse.
  • the gestation period of the surrogate mouse may be 10 to 25 days after implantation, preferably 15 to 20 days after implantation, and more preferably 17 days after implantation, but is not limited thereto.
  • step 5) is a step of producing a heterozygous mouse by crossing a mouse born from the surrogate mouse of step 4) with a wild-type mouse.
  • a wild-type mouse mating with a mouse born from the surrogate mother may be a C57BL/6 mouse, but is not limited thereto.
  • Another aspect of the present invention provides an inflammatory signal bioimaging mouse model, which is manufactured by the method for producing the inflammatory signal bioimaging mouse model.
  • the inflammatory signal bioimaging mouse model may be crossed with a cell- or tissue-specifically transgenic mouse expressing Cre recombinase, thereby producing a cell- or tissue-specifically expressing inflammatory signal.
  • the transgenic mouse expressing Cre recombinase specifically for the cell or tissue is MMTV (mouse mammary tumor virus promoter)-Cre mouse, Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre mouse, Foxp3 (forkhead box P3)-Cre mouse , CD4(cluster of differentiation 4)-Cre mouse, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre mouse, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre mouse, Vil(villin 1)-Cre mouse, Alb(albumin)-Cre mouse , AQ(adipoq)-Cre mice, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) mice, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre mice, Ins2(insulin 2) )-Cre mouse and DAT (dopamine transporter)-Cre mouse may be any one selected
  • Another aspect of the present invention comprises the steps of: 1) processing the test material in a mouse prepared by crossing the mouse model of claim 7 and a transgenic mouse expressing Cre recombinase specifically for cells or tissues;
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • step 1) is tested in a mouse prepared by crossing the inflammatory signal bioimaging mouse model with a cell- or tissue-specifically-modified mouse expressing Cre recombinase (Cre recombinase). This is the process of material processing.
  • the inflammatory signal bioimaging mouse model may be crossed with a cell- or tissue-specifically transgenic mouse expressing Cre recombinase, thereby producing a cell- or tissue-specifically expressing inflammatory signal.
  • the transgenic mouse expressing Cre recombinase specifically for the cell or tissue is MMTV (mouse mammary tumor virus promoter)-Cre mouse, Pdx1 (pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre mouse, Foxp3 (forkhead box P3)-Cre mouse , CD4(cluster of differentiation 4)-Cre mouse, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre mouse, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre mouse, Vil(villin 1)-Cre mouse, Alb(albumin)-Cre mouse , AQ(adipoq)-Cre mice, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) mice, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre mice, Ins2(insulin 2) )-Cre mouse and DAT (dopamine transporter)-Cre mouse may be any one selected
  • step 2) is a step of measuring the activity level of NF- ⁇ B (nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) of the mouse treated with the test substance.
  • NF- ⁇ B nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells
  • the degree of activity of the NF- ⁇ B is determined by luciferase, ⁇ -galactosidase, Green Fluorescent Protein (GFP), enhanced Green Fluorescent Protein (eGFP), and amplum (mPlum).
  • GFP Green Fluorescent Protein
  • eGFP enhanced Green Fluorescent Protein
  • amplum amplum
  • mCherry, tdTomato, mStrawberry, J-Red, DsRed, mOrange, mKO, mCitrine, Venus (Venus), YPet, enhanced yellow fluorescent protein (EYFP), Emerald, CyPet, cyan fluorescent protein (CFP), Cerulean, T-Sapphire (T-) Sapphire the expression level of any one reporter gene selected from the group consisting of alkaline phosphatase may be measured, and preferably, the expression level of luciferase or Tidi tomato, but is not limited thereto.
  • nucleotide sequence encoding NF- ⁇ B RE nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element
  • minimal TA promoter Luciferase encoding nucleotide sequence
  • UBC promoter UBC promoter
  • tdTomato encoding nucleotide sequence An inflammatory signal response cassette including the sequence was obtained ( FIG. 1B ).
  • a targeting vector capable of being inserted into the mouse ROSA26 locus was constructed using the cassette (FIG. 1c). Finally, the targeting vector was composed of a left nucleotide sequence of the ROSA26 locus, a tissue-specific inflammatory signal response cassette and a right nucleotide sequence of the ROSA26 locus.
  • the prepared targeting vector was inserted into mouse embryonic stem cells and selected with neomycin, and a clone in which the inflammatory signal response cassette was correctly inserted into the ROSA26 locus was obtained by Southern blot of Example ⁇ 1-2> below. (southern blot) method (Fig. 1d), the clone containing the targeting vector correctly showed a DNA fragment band corresponding to 7.8 kb in Southern blot, and a DNA fragment band corresponding to 11.5 kb in the case of the wild-type vector.
  • the mouse embryonic stem cell clone obtained using the Southern blot was inserted into a blastocyst isolated from a wild-type C57BL/6 female and transplanted into the uterus of a surrogate mother. About 17 days after transplantation, pups were born, and pups born by the inserted mouse embryonic stem cells had a chimeric hair color. The obtained chimeric mice were crossed with wild-type C57BL/6 mice to obtain heterozygous/heterozygotes.
  • genomic DNA was extracted from mouse embryonic stem cells, and the DNA was cut using EcoRV restriction enzyme. After electrophoresis of 10 to 20 ⁇ g of DNA on a 0.8% agarose gel, the agarose gel was transferred to a transfer vessel for Southern blot. A nylon membrane was placed on the agarose gel, Whatman 3MM paper was placed on it again, a sufficient amount of towel paper was placed on it again, and 0.5M NaOH solution was poured on the bottom. After 12 hours of transfer (transfer), the nylon membrane was separated, and DNA was crosslinked on the surface of the nylon membrane using a UV transilluminator (254 nm wavelength).
  • a DNA fragment of 300 to 400 bp that can be attached to the mouse ROSA26 locus was prepared, and a probe for Southern blotting was prepared using an isotope and a random priming kit.
  • a nylon membrane, a DNA probe, and a hybridization solution were placed in a hybridization bottle, and then incubated in a hybridization oven at 65° C. for 12 hours. After attaching the DNA probe to the nylon membrane for a sufficient time, using a washing solution, the probe not attached to the nylon membrane was wiped off. made it After exposure, the plates were scanned using a Phosphoimager (GE FLA7000).
  • the mouse Since the inflammatory signal bioimaging mouse prepared in Example ⁇ 1-1> contains a transcription stop sequence labeled by the loxP point on the gene cassette structure, the mouse expresses Cre recombinase.
  • Cre recombinase In order to express luciferase according to the activity of NF- ⁇ B, an inflammation-related factor, only when the transcription stop sequence is removed by crossing with Accordingly, by crossing the mouse with a Lyz2 (lysozyme 2)-Cre mouse that specifically expresses Cre recombinase in bone marrow cells, a mouse capable of imaging an inflammatory signal specifically in bone marrow cells was established.
  • Colitis was induced in the mouse established in Example ⁇ 2-1> with dextran sulfate sodium salt (DSS), and it was confirmed whether bioimaging of the inflammatory signal over time was possible.
  • DSS dextran sulfate sodium salt
  • the mouse was euthanized with CO 2 and the femur and tibia were obtained to expose the intramedullary cavity, and the RPMI 1640 medium (10% FBS, 1% penicillin, stretptomycin) containing M-CSF was passed through a 1 ml syringe. was collected to make 6 ml of the culture solution. Thereafter, it was transferred to a Petri dish and cultured for 3 days at 37° C., 5% CO 2 condition, and then exchanged with fresh RPMI 1640 culture medium. After 3 days have elapsed, the culture medium is removed, washed with PBS (phosphate buffered saline), and the cells are removed using a cell dissociation kit.
  • PBS phosphate buffered saline
  • RPMI 1640 culture medium so that 60,000 cells per cell are placed in a white 96 well plate. It was diluted, aliquoted, and incubated. After 24 hours of incubation, the experimental group was treated with LPS (lipopolysaccharide) at a concentration of 10ng/ml and 100ng/ml, and after 6 hours, the culture medium was removed and HBSS (Hanks' Balanced) containing D-luciferin Salt solution) 100 ⁇ l each was treated to evaluate the luciferase activity.
  • LPS lipopolysaccharide
  • the detached cells were diluted in RPMI 1640 culture medium so that 70,000 cells per cell were placed in a 6 well plate, aliquoted, and cultured. Treated for 6 hours.
  • the culture medium was then removed and homogenized with a buffer containing 20 mM Tris-HCl (pH 7.4), 1% Triton X-100, 15 mM NaCl, and a protease inhibitor cocktail, 4° C., 13,000 g for 20 min.
  • SDS-PAGE sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis
  • the separated protein was transferred to a polyvinylidene fluoride (PVDF) membrane and blocked with TBST buffer (Tris-Buffered Saline, 0.1% TWEEN 20) containing 5% skim milk, and the primary antibody was incubated at 4°C for 12 hours. After reacting in , the secondary antibody containing horseradish peroxidase was reacted for 1 hour, and the signal was detected by treatment with ECL.
  • PVDF polyvinylidene fluoride
  • Example 3 Establishment and confirmation of hepatocyte-specific inflammatory signal in vivo imaging mouse
  • hepatocyte-specific hepatocyte-specific mice were crossed with the mouse prepared in Example 1-1 to express Cre recombinase. to establish a mouse capable of in vivo imaging.
  • Example ⁇ 3-1> In order to check whether bioimaging of inflammatory signals in the mouse established in Example ⁇ 3-1> is possible, hepatitis was induced by using LPS (lipopolysaccharide) and D-galactosamine in combination, and luciferase signal was evaluated.
  • LPS lipopolysaccharide
  • D-galactosamine D-galactosamine

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  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

본 발명은 염증 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것으로, 구체적으로, 상기 마우스 모델과 특정 조직·세포 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 마우스와 교배하여 만들어진 마우스 모델을 통해 체외에서 연구자가 원하는 특정 조직·세포에 특이적인 염증 신호를 평가할 수 있고, 살아있는 동물을 부검하지 않고도 시간에 따른 염증 변화의 추이를 간편하게 확인할 수 있으므로, 실험동물학, 분자생물학 등을 포함한 생명과학 연구 분야 전반에 거쳐 활용될 수 있으며, 신약 또는 건강기능식품의 개발 등과 같은 산업적 영역에 있어서도 항염 후보 물질의 효능 평가 모델로 사용할 수 있다.

Description

염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도
본 발명은 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도에 관한 것이다.
염증(Inflammation)은 감염이나 신체 손상 등에 의해 유도되는 방어 기전으로, 다양한 세포들에 의해 관여되고, 여러 사이토카인과 신호전달 경로에 의해 조절되는 복합적 생체 반응이다. 염증 반응의 산물은 주변 조직의 손상을 유도하기도 하고, 이러한 조직의 손상은 다양한 질환의 발병과 연관이 있는 것으로 알려져 있다.
최근에는 국내뿐만 아니라 전세계적으로도 만성 염증(Chronic inflammation)이 동반되는 질환들의 발병이 증가하고 있으며, 대부분의 경우 염증을 억제시키는 방법을 통해 상기 질환을 치료하고 있다. 그러나, 각 질환이 발병하는 장기, 조직의 특징과 병인론에 따라 염증이 유도되는 메커니즘이 다르고, 약물이 도달하는 정도에도 차이가 있으므로, 각 질환마다 염증을 통제하는 전략도 다르게 고려되어야 한다.
염증을 치료하기 위한 약물은 크게 스테로이드성 항염제(Steroidal anti-inflammatory drugs, SAIDs)와 비스테로이드성 항염제(Non-steroidal anti-inflammatory drugs, NSAIDs/NAIDs)로 나뉜다.
스테로이드성 항염제는 글루코코르티코이드 수용체(Glucocorticoid receptor)에 작용하여 염증 관련 유전자 발현을 억제시킴으로써 항염 효과를 나타내며, 비스테로이드성 항염제에 비해 효과가 강력하지만 부작용도 강하기 때문에 장기 투약이 어려운 단점이 있다.
비스테로이드성 소염제는 염증의 매개체인 프로스타글란딘(Prostaglandin)을 합성하는 COX(Cyclooxygenase)를 억제하여 해열, 진통 및 항염 작용을 나타내며, 세계적으로 가장 많이 처방되는 약물 중 하나이지만, 혈액 응고 장애, 출혈, 위장관 장애 또는 궤양 등의 부작용을 지닌다.
이에, 최근에는 TNF-α(Tumor necrosis factor-α), IL-1(Interleukin-1) 또는 IL-6(Interleukin-6) 등과 같은 염증성 사이토카인의 작용을 억제하는 항사이토카인 약물이 개발되어 사용되고 있으나, 이는 항체 기반의 단백질 약물이므로 경구 투여가 불가능하고, 염증 부위 외에 전신에 해당 사이토카인의 작용을 억제하는 부작용이 있으며, 지나치게 가격이 비싸다는 등의 단점이 있다. 따라서, 상기와 같은 부작용 및 단점을 극복한 항염제의 개발이 필요한 실정이며, 이에 따라, 항염제 스크리닝 및 항염 효능 평가를 보다 효과적으로 할 수 있는 동물 모델 수요도 증가하고 있다.
현존하는 염증 질환 동물 모델들은 기본적으로 염증 정도를 평가하기 위하여 해당 조직에서 조직병리학적 평가를 실시하여 염증 세포의 침윤 정도 또는 해당 조직의 손상 정도를 평가하거나, 염증 관련 신호 전달 단백질 또는 염증성 사이토카인의 발현량을 분석하는 방법을 활용한다.
그러나, 염증의 조직병리학적 평가의 경우, 동물을 부검해서 조직을 채취를 해야하기 때문에 상기 평가에는 부검 시점에서의 염증 정도만이 반영되고, 이를 통해서는 부검 시점 이전에 염증 반응의 변화 추이를 전혀 알 수 없다는 한계가 있다. 상기 평가와 더불어, 염증 질환 모델에 따라서 활용 가능한 혈액학적 염증 마커가 존재하거나 체중 증감, 행동학적 변화가 동반되는 경우에 이러한 지표들을 추가적으로 염증 평가에 사용하기도 하는데, 이러한 지표들은 염증 유도 시점부터 부검 시까지 수 차례에 거쳐 측정할 수 있다는 점에서 시간에 따른 조직의 염증 변화 추이를 간접적으로 확인할 수 있다는 장점이 있으나, 혈액학적 지표나 체중의 증감, 행동학적 변화 등은 조직에 염증이 발생하고 나서 영향을 받아 변화하는 후행적인 지표이므로 매 시점의 염증 정도가 항상 반영되는 것이 아니라는 단점이 있다.
이에 착안하여, 본 발명자들은 부검하지 않고도 염증을 유도한 마우스의 염증 정도를 원하는 시점에 체외에서 평가할 수 있는 염증 생체 영상화 마우스 모델을 개발하고자 하였다.
이에, 본 발명자들은 NF-κB 염증 신호 활성화에 따라 루시퍼레이즈(Luciferase)를 발현하는 마우스 모델을 제작하여, 상기 모델을 세포·조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 마우스와 교배시켜 세포·조직 특이적으로 염증 신호 생체 영상화가 가능한 마우스 모델을 확립하였고, 그 마우스 모델에 염증을 유발시켰을 때 루시퍼레이즈에 의한 신호가 체외에서 증가하는 것을 확인하여 염증 생체 영상화 마우스 모델로서 효용성이 있음을 확인함으로써, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 염증 정도를 확인하기 위해 마우스를 부검하지 않고도, 체외에서 세포·조직 특이적으로 염증 신호를 수 차례 측정하여 생체 영상화가 가능한 염증 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 이를 이용한 항염증 물질 스크리닝 방법을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위해,
본 발명의 일 측면은 1) 마우스 ROSA26 유전좌위(locus)에 NF-κB RE(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 유전자 카세트를 삽입하여 타겟팅 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 삽입하여 마우스 배아줄기세포 클론을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 제조된 마우스 배아줄기세포 클론을 야생형 마우스에서 분리된 배반포(blastocyte)에 삽입하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 클론이 삽입된 배반포를 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 착상시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 대리모 마우스에서 태어난 마우스를 야생형 마우스와 교배하여 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 제조하는 단계;를 포함하는 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 다른 측면은 상기 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법으로 제조되는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델을 제공한다.
본 발명의 또 다른 측면은 1) 제7항의 마우스 모델과 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스를 교배하여 제조된 마우스에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 피검물질을 처리한 마우스의 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 대조군와 비교하여, 상기 측정된 NF-κB의 활성 정도가 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
본 발명의 염증 생체 영상화 마우스 모델과 특정 조직·세포 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 마우스와 교배하여 만들어진 마우스 모델을 통해 체외에서 연구자가 원하는 특정 조직·세포에 특이적인 염증 신호를 평가할 수 있고, 살아있는 동물을 부검하지 않고도 시간에 따른 염증 변화의 추이를 간편하게 확인할 수 있으므로, 실험동물학, 분자생물학 등을 포함한 생명과학 연구 분야 전반에 거쳐 활용될 수 있으며, 신약 또는 건강기능식품의 개발 등과 같은 산업적 영역에 있어서도 항염 후보 물질의 효능 평가 모델로 사용할 수 있다.
도 1은 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델에 제작에 사용된 염증신호 반응 카세트의 구조를 나타낸 도이다.
도 1a는 조직 특이적(tissue-specific) NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 리포터 카세트를 마우스 ROSA26 locus에 삽입하여 제조되는 타겟팅 벡터를 나타내는 개략도이다.
도 1b는 마우스 ROSA26 locus에 삽입되는 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 리포터 카세트를 나타낸 도이다.
도 1c는 마우스 ROSA26 locus에 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells) 리포터 카세트를 삽입하여 제조된 최종 유전자구조를 나타낸 도이다.
도 1d는 염증신호 반응 카세트가 ROSA26 locus에 정확하게 삽입된 클론을 확인하기 위해 서던 블롯(southern blot)을 수행한 결과를 나타낸 도이다.
도 2a는 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델과 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 Lyz2-Cre 마우스를 교배하여 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적으로 염증 신호 영상화가 가능한 마우스를 확보하고, 그 마우스의 좌측 귀에 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate)를 처리한 후, 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 이용하여 염증 신호를 영상화한 도이다.
도 2b는 도 2a의 형광측정값을 나타낸 그래프이다.
도 3a은 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적으로 염증 신호 영상화가 가능한 마우스 모델에 DSS(Dextran sulfate sodium salt)를 음용수로 급수하여 대장염을 유도한 후, 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 이용하여 염증 신호를 영상화한 도이다.
도 3b는 도 3a의 형광측정값을 나타낸 그래프이다.
도 4는 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적으로 염증 신호 영상화가 가능한 마우스 모델의 골수로부터 단핵구 계열 세포인 대식세포(macrophage)를 분화시킨 후 LPS(lipopolysaccharide)를 처리하여 염증을 유도하고, 루시퍼레이즈(luciferase) 활성 평가와 웨스턴 블롯(western blot)으로 염증 신호를 평가한 도이다.
도 4a는 염증이 유도된 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적 염증 신호 영상화 마우스 모델로부터 분화시킨 대식세포에서 NF-κB 활성 정도를 루시퍼레이즈 활성 평가를 통해 확인한 그래프이다.
도 4b는 염증이 유도된 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적 염증 신호 영상화 마우스 모델로부터 분화시킨 대식세포에서 NF-κB 활성 정도를 웨스턴 블롯을 통해 확인한 도이다.
도 4c는 LPS로 염증이 유도된 골수 계열 세포 특이적 염증 신호 영상화 마우스 모델로부터 분화시킨 대식세포에서 NF-kB 활성 정도를 루시퍼레이즈 활성 평가를 통해 확인하고, NF-kB 억제제인 BAY 11-7082 처리 시 활성이 억제되는 것을 확인한 그래프이다.
도 5a는 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델과 간세포(hepatocyte) 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 Alb-Cre 마우스를 교배하여 간세포 특이적으로 염증 신호 영상화가 가능한 마우스 모델을 확보하고, LPS(lipopolysaccharide)와 D-갈락토사민(D-galactosamine)을 투여하여 간염을 유도하고 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 이용하여 염증 신호를 영상화한 도이다.
도 5b는 도 5a의 형광측정값을 나타낸 그래프이다.
이하, 본 발명을 상세하게 설명한다.
본 발명의 일 측면은 1) 마우스 ROSA26 유전좌위(locus)에 NF-κB RE(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 유전자 카세트를 삽입하여 타겟팅 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 삽입하여 마우스 배아줄기세포 클론을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 제조된 마우스 배아줄기세포 클론을 야생형 마우스에서 분리된 배반포(blastocyte)에 삽입하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 클론이 삽입된 배반포를 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 착상시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 대리모 마우스에서 태어난 마우스를 야생형 마우스와 교배하여 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 제조하는 단계;를 포함하는 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법을 제공한다.
이하, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법에 있어서, 단계 1)은 마우스 ROSA26 유전좌위(locus)에 NF-κB RE(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 유전자 카세트를 삽입하여 타겟팅 벡터를 제조하는 단계이다.
상기 유전자 카세트는 NF-κB RE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함할 수 있고, 바람직하게는 NF-κB RE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, TA 프로모터(promoter), 루시퍼레이즈(Luciferase)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, UBC 프로모터 및 티디토마토(tdTomato)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열를 순차적으로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 타겟팅 벡터는 CAG 프로모터, 두 개의 loxP(locus of X-over P1) 부위 사이에 전사 종결 코돈(transcription stop codon) 부위가 위치한 유전자 절편, NF-κB RE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, TA 프로모터, 루시퍼레이즈를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, UBC 프로모터, 티디토마토를 암호화하는 뉴클레오티드 서열, BGH poly A 및 네오마이신(Neomycin) 내성 유전자를 순차적으로 포함할 수 있다.
상기 리포터 유전자는 루시퍼레이즈(Luciferase), β갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP), 엠플럼(mPlum), 엠체리(mCherry), 티디토마토(tdTomato), 엠스트로베리(mStrawberry), 제이-레드(J-Red), 디에스레드(DsRed), 엠오렌지(mOrange), mKO, 엠시트린(mCitrine), 비너스(Venus), YPet, 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein: EYFP), 에메랄드(Emerald), CyPet, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 세루리안(Cerulean), 티-사파이어(T-Sapphire), 알칼린 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 암호화하는 유전자일 수 있고, 바람직하게는 상기 리포터 유전자는 루시퍼레이즈 또는 티디토마토일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법에 있어서, 단계 2)는 상기 단계 1)에서 제조된 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 삽입하여 마우스 배아줄기세포 클론을 제조하는 단계이다.
상기 단계 2)는 마우스 배아줄기세포 클론에 네오마이신 처리하고 서던 블롯(southern blot)을 수행하여 타겟팅 벡터가 삽입된 마우스 배아줄기세포 클론을 선별하는 단계를 더 포함할 수 있다.
상기 마우스 배아줄기세포 클론에 항생제인 네오마이신을 처리할 경우, 타겟팅 벡터가 삽입된 클론은 네오마이신에 대한 내성을 가져 생존할 수 있으나, 타겟팅 벡터가 삽입되지 않은 클론의 경우에는 네오마이신에 대한 저항성이 없어 생존할 수 없다.
상기 서던 블롯은 DNA 샘플에서 특정 DNA 서열을 검출하기 위해 분자생물학에서 사용되는 실험 방법으로, 전기영동으로 DNA 조각을 분자량 순으로 분리할 경우, 타겟팅 벡터가 정확하게 삽입된 클론은 7.8kb에 해당하는 DNA 조각 밴드를 확인할 수 있다.
본 발명의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법에 있어서, 단계 3)은 상기 단계 2)에서 제조된 마우스 배아줄기세포 클론을 야생형 마우스에서 분리된 배반포(blastocyte)에 삽입하는 단계이다.
상기 배반포는 포유동물의 발생과정 중 초기 발생 단계에서 형성되는 구조로, 배아(embryo)를 형성하는 내세포집단(inner cell mass)과 배반포의 외층을 구성하며, 착상 후에 태반이 되는 영양막(trophoblast)로 구성된다. 상기 배반포가 자궁에 삽입되면 자궁 내벽으로 함입되어, 배반포가 자궁에 착상된 후에 낭배기를 포함한 후기 발생이 진행된다.
본 발명의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법에 있어서, 단계 4)는 상기 단계 3)의 클론이 삽입된 배반포를 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 착상시키는 단계이다.
상기 대리모 마우스의 임신 기간은 착상 후 10 내지 25일일 수 있고, 바람직하게는 착상 후 15 내지 20일일 수 있고, 더욱 바람직하게는 착상 후 17일일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법에 있어서, 단계 5)는 상기 단계 4)의 대리모 마우스에서 태어난 마우스를 야생형 마우스와 교배하여 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 제조하는 단계이다.
상기 대리모 마우스에서 태어난 마우스와 교배하는 야생형 마우스는 C57BL/6 마우스일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 상기 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법으로 제조되는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델을 제공한다.
상기 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델은 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스와 교배하여 세포 또는 조직 특이적으로 염증 신호가 발현되는 마우스를 제조할 수 있다.
상기 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 유전자변형마우스는 MMTV(mouse mammary tumor virus promoter)-Cre 마우스, Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre 마우스, Foxp3(forkhead box P3)-Cre 마우스, CD4(cluster of differentiation 4)-Cre 마우스, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre 마우스, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre 마우스, Vil(villin 1)-Cre 마우스, Alb(albumin)-Cre 마우스, AQ(adipoq)-Cre 마우스, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) 마우스, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre 마우스, Ins2(insulin 2)-Cre 마우스 및 DAT(dopamine transporter)-Cre 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 염증 신호 생체화 마우스 모델을 Lyz2-Cre 마우스 및 Alb-Cre 마우스와 교배하여 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적 및 간세포 특이적 마우스를 제조하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 다른 측면은 1) 제7항의 마우스 모델과 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스를 교배하여 제조된 마우스에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 피검물질을 처리한 마우스의 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 대조군와 비교하여, 상기 측정된 NF-κB의 활성 정도가 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 물질 스크리닝 방법을 제공한다.
이하, 항염증 물질 스크리닝 방법을 단계별로 상세히 설명한다.
본 발명의 항염증 물질 스크리닝 방법에 있어서, 단계 1)은 상기 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델과 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스를 교배하여 제조된 마우스에 피검물질을 처리하는 단계이다.
상기 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델은 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스와 교배하여 세포 또는 조직 특이적으로 염증 신호가 발현되는 마우스를 제조할 수 있다.
상기 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 유전자변형마우스는 MMTV(mouse mammary tumor virus promoter)-Cre 마우스, Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre 마우스, Foxp3(forkhead box P3)-Cre 마우스, CD4(cluster of differentiation 4)-Cre 마우스, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre 마우스, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre 마우스, Vil(villin 1)-Cre 마우스, Alb(albumin)-Cre 마우스, AQ(adipoq)-Cre 마우스, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) 마우스, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre 마우스, Ins2(insulin 2)-Cre 마우스 및 DAT(dopamine transporter)-Cre 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나일 수 있고, 본 발명의 구체적인 실시예에서는 상기 염증 신호 생체화 마우스 모델을 Lyz2-Cre 마우스 및 Alb-Cre 마우스와 교배하여 골수 계열 세포(Myeloid lineage cells) 특이적 및 간세포 특이적 마우스를 제조하였으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 항염증 물질 스크리닝 방법에 있어서, 단계 2)는 상기 피검물질을 처리한 마우스의 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성 정도를 측정하는 단계이다.
상기 NF-κB의 활성 정도는 루시퍼레이즈(luciferase), β갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP), 엠플럼(mPlum), 엠체리(mCherry), 티디토마토(tdTomato), 엠스트로베리(mStrawberry), 제이-레드(J-Red), 디에스레드(DsRed), 엠오렌지(mOrange), mKO, 엠시트린(mCitrine), 비너스(Venus), YPet, 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein: EYFP), 에메랄드(Emerald), CyPet, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 세루리안(Cerulean), 티-사파이어(T-Sapphire), 알칼린 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 리포터 유전자의 발현 정도로 측정할 수 있고, 바람직하게는 루시퍼레이즈 또는 티디토마토의 발현 정도로 측정할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다.
단, 후술하는 실시예 및 실험예는 본 발명을 일 측면에서 구체적으로 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이에 제한되는 것은 아니다.
<실시예 1> 염증 신호 생체 영상화 마우스 제조 및 이의 확인
<1-1> 염증 신호 생체 영상화 마우스 제조
염증 신호 생체 영상화 마우스를 제작하기 위해, NF-κB RE(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element) 암호화 뉴클레오티드 서열, minimal TA promoter, Luciferase 암호화 뉴클레오티드 서열, UBC promoter 및 tdTomato 암호화 뉴클레오티드 서열을 순차적으로 포함하는 염증 신호 반응 카세트를 확보하였다(도 1b). 상기 카세트를 이용하여 마우스 ROSA26 locus에 삽입할 수 있는 타겟팅 벡터를 제작하였다(도 1c). 최종적으로 상기 타겟팅 벡터는 ROSA26 locus 왼쪽 염기서열, 조직 특이적 염증신호 반응 카세트 및 ROSA26 locus 오른쪽 염기서열로 구성되었다.
그 후, 상기 제작된 타겟팅 벡터를 마우스 배아줄기세포에 삽입하고 네오마이신(Neomycin)으로 선별한 후, 염증 신호 반응 카세트가 ROSA26 locus에 정확하게 삽입된 클론을 하기 실시예 <1-2>의 서던 블롯(southern blot) 방법으로 확인하였고(도 1d), 타겟팅 벡터가 정확하게 들어간 클론은 서던 블롯에서 7.8kb에 해당하는 DNA 조각 밴드가 나타났고, 야생형 벡터의 경우 11.5kb에 해당하는 DNA 조각 밴드가 나타났다.
상기 서던 블롯을 이용하여 확보된 마우스 배아줄기세포 클론을 야생형 C57BL/6 female에서 분리된 배반포(blastocyst)에 삽입하고 대리모 자궁에 이식하였다. 이식한지 17여 일 후에 새끼가 태어났고, 삽입된 마우스 배아줄기세포에 의해 태어난 새끼는 키메라 털색을 가졌다. 확보된 키메라 마우스를 야생형 C57BL/6 마우스와 교배하여 이형접합성/헤테로 마우스(heterozygote)를 확보하였다.
<1-2> 서던 블롯을 통한 마우스의 유전자 확인
상기 실시예 <1-1>에서 확보한 이형접합성 마우스의 유전자를 확인하기 위해 서던 블롯(southern blot) 분석을 실시하였다.
구체적으로, 마우스 배아줄기세포에서 유전체 DNA(genomic DNA)를 추출하고, EcoRV 제한효소를 이용하여 DNA를 절단하였다. 10 내지 20㎍의 DNA를 0.8% 아가로스 겔(agarose gel)에서 전기영동한 후, 아가로스 겔을 서던 블롯용 이동(transfer) 용기로 옮겼다. 아가로스 겔 위에 나일론 막(nylon membrane)을 두고, 다시 그 위에 Whatman 3MM paper를 올리고, 다시 그 위에 충분한 양의 타올 용지를 올리고, 아래 쪽에 0.5M NaOH 용액을 부었다. 12시간 이동(transfer) 후, 나일론 막을 분리하고, UV transilluminator(254nm wavelength)를 이용하여 DNA를 나일론 막 표면에 가교(crosslink)되도록 하였다. 그 후, 마우스 ROSA26 locus에 붙을 수 있는 300 내지 400bp의 DNA 조각을 준비하고, 동위원소와 random priming kit를 이용하여 서던 블롯용 프로브를 준비하였다. 혼성화 용기(hybridization bottle)에 나일론 막, DNA 프로브, 혼성화 용액을 넣은 다음, 65℃ hybridization oven에서 12시간 배양(incubation)하였다. DNA 프로브를 나일론 막에 충분한 시간을 가지고 붙인 다음, 세척(washing) 용액을 이용하여, 나일론 막에 붙지 않은 프로브를 닦아 냈고, 세척 작업이 완료 후, Phosphoimager(GE FLA7000) 플레이트에 24 내지 48시간 노출시켰다. 노출이 끝난 후, 플레이트를 Phosphoimager(GE FLA7000)를 이용하여 스캔하였다.
그 결과, 야생형 마우스에서는 11.5kb 크기의 DNA 단편만이 확인되었고, 이형접합성 마우스에서는 11.5kb 및 7.8kb 크기의 DNA 단편이 모두 나타나는 것을 확인하였다(도 1d).
<실시예 2> 골수 계열 세포 특이적 염증 신호 생체 영상화 마우스 확립 및 이의 확인
<2-1> 골수 계열 세포 특이적 염증 신호 생체 영상화 마우스 확립
상기 실시예 <1-1>에서 제작한 염증 신호 생체 영상화 마우스는 유전자 카세트 구조 상 loxP 지점에 의해 표지되어 있는 전사 중지 서열(stop codon)을 포함하고 있으므로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 마우스와 교배하여 전사 중지 서열이 제거되어야 염증관련 인자인 NF-κB 활성에 따라 루시퍼레이즈(luciferase)를 발현할 수 있다. 이에, 골수 계열 세포 특이적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 Lyz2(lysozyme 2)-Cre 마우스와 상기 마우스를 교배하여 골수 계열 세포 특이적으로 염증 신호 생체 영상화가 가능한 마우스를 확립하였다.
<2-2> PMA 유도 귀 부종 모델
상기 실시예 <2-1>에서 확립한 마우스 모델에서 염증 신호 영상화를 확인하기 위하여 염증 유발 인자인 PMA(Phorbol 12-myristate 13-acetate) 유도 귀 부종을 유도하였다.
구체적으로, 해당 마우스의 좌측 귀에 마이크로피펫을 이용하여 에탄올에 희석된 PMA 2㎍/40㎕을 처리하고, 우측 귀에는 동량의 에탄올 40㎕를 처리하였다. 24시간 후, 다시 좌측 귀에 PMA 2㎍을 처리하고, 우측 귀에 동량의 에탄올 40㎕를 처리하였다. 다시 24시간이 경과한 후, 1ml 주사기를 이용하여 D-루시페린(D-luciferin; 15mg/ml in PBS) 100㎕를 복강 투여하였으며 이소플루란(isoflurane)에 의한 호흡 마취 하에 마우스의 귀에서 루시퍼레이즈(luciferase) 신호를 측정하였다.
그 결과, 에탄올만 처리한 우측 귀에 대비하여, PMA에 의해 염증을 유도한 좌측 귀에서는 특이적으로 루시퍼레이즈 신호가 강하게 나타나는 것을 확인하였다(도 2a 및 도 2b).
<2-3> DSS 유도 대장염 모델
상기 실시예 <2-1>에서 확립한 마우스에 DSS(Dextran sulfate sodium salt)로 대장염을 유도하고 시간에 따른 염증 신호 생체 영상화가 가능한지 확인하였다.
구체적으로, 멸균된 3차 증류수에 DSS 6g을 넣고 60분 동안 교반하여 3% DSS 수용액을 확보하였다. 3% DSS를 급수하기 전, 각각의 마우스에 1㎖ 주사기를 이용하여 D-루시페린(D-luciferin; 15mg/㎖ in PBS) 100㎕를 복강 투여하였으며 이소플루란(isoflurane)에 의한 호흡 마취 하에 복부에서 루시퍼레이즈(luciferase) 신호를 측정하였다. 측정 후, 3% DSS 수용액을 마우스 음용수로 급수하였다. 급수를 유지하면서 급수 3일 후와 급수 5일 후가 되는 날에 이전 방법과 동일하게 1㎖ 주사기를 이용하여 D-루시페린(15mg/㎖ in PBS) 100㎕를 복강투여하고 복부에서 루시퍼레이즈 신호를 측정하였다.
그 결과, DSS 급수를 시작하고 시간이 지남에 따라서 복부의 대장 부위에서 루시퍼레이즈 신호가 강하게 발현되는 것을 확인하였다(도 3a 및 도 3b).
<2-4> 골수 유래 대식세포 분화 및 LPS 처리
상기 실시예 <2-1>에서 확립한 마우스의 골수로부터 단핵구 계열 세포인 대식세포(macrophage)를 분화시키고 루시퍼레이즈(luciferase) 활성을 확인하고 웨스턴 블롯(western blot)으로 NF-κB 활성 및 루시퍼레이즈 단백질 발현을 확인하였다. 또한, 상기와 동일한 방법으로 20uM의 BAY 11-7082 (NF-kB 억제제)를 LPS와 동시에 처리하여 루시퍼레이즈 활성을 평가하였다.
구체적으로, CO2로 마우스를 안락사하고 대퇴골과 경골을 획득하여 골수강을 노출시켰으며, 1ml 주사기로 M-CSF를 함유한 RPMI 1640 배양액(10% FBS, 1% penicillin, stretptomycin)을 통과시켜 내용물을 배양액 6ml가 되도록 모았다. 이후 페트리 접시에 옮겨 37℃, 5% CO2 조건에서 3일 간 배양한 후 신선한 RPMI 1640 배양액으로 교환하였다. 다시 3일이 지나고, 배양액을 제거하고 PBS(phosphate buffered saline)를 이용하여 세척한 후 Cell dissociation kit을 이용하여 세포를 떼어낸 후 white 96 well plate에 세포가 칸 당 60,000개씩 들어가도록 RPMI 1640 배양액에 희석하여 분주하고 배양하였다. 배양 후 24시간이 경과하고 실험군에 LPS(lipopolysaccharide)를 10ng/ml, 100ng/ml 농도로 처리하였으며, 6시간이 지나고 배양액을 제거하고 D-루시페린(D-luciferin)을 함유한 HBSS(Hanks' Balanced Salt solution) 100㎕ 씩을 처리하여 루시퍼레이즈 활성을 평가하였다.
웨스턴 블롯 분석을 위해서는 떼어낸 세포를 6 well plate에 칸 당 70,000개씩 들어가도록 RPMI 1640 배양액에 희석하여 분주하고 배양하였고, 배양 후 24시간이 경과하고 실험군에 LPS를 10ng/ml, 100ng/ml 농도로 6시간 처리하였다. 이후 배양액을 제거하고 20 mM Tris-HCl(pH 7.4), 1% Triton X-100, 15mM NaCl, 및 프로테아제 저해 칵테일(protease inhibitor cocktail)을 함유하는 버퍼로 균질화하고, 4℃, 13,000g에서 20분 동안 원심분리하여, 그 상등액을 이용하여 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis)를 수행하여 분리하였다. 이후, 분리된 단백질을 Polyvinylidene fluoride(PVDF) 막으로 옮기고 5% 탈지분유를 함유한 TBST 버퍼(Tris-Buffered Saline, 0.1% TWEEN 20)로 블락킹(blocking)하여, 일차 항체를 12시간동안 4℃에서 반응시킨 다음, horseradish peroxidase를 포함하는 이차 항체로 1시간 동안 반응시키고 ECL을 처리하여 신호를 검출하였다.
그 결과, 안락사한 마우스의 대식세포에서 LPS 농도 의존적으로 루시퍼레이즈 신호 활성이 증가하는 것을 확인하였고(도 4a), 웨스턴 블롯으로도 체외 염증 신호 측정 결과와 마찬가지로 루시퍼레이즈의 발현이 증가하는 것을 확인할 수 있었다(도 4b). 또한, LPS 농도 의존적으로 증가된 루시퍼레이즈 신호 활성은 NF-kB 억제제인 BAY 11-7082을 처리하면 억제된다는 것을 확인할 수 있었다(도 4c).
<실시예 3> 간세포 특이적 염증 신호 생체 영상화 마우스 확립 및 이의 확인
<3-1> 간세포 특이적 염증 신호 생체 영상화 마우스 확립
상기 실시예 <2-1>에서 확립한 마우스와 마찬가지로, 간세포(hepatocyte) 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 마우스와 상기 실시예 1-1에서 제작한 마우스를 교배하여 간세포 특이적으로 생체 영상화가 가능한 마우스를 확립하였다.
<3-2> LPS/D-galactosamine 유도 간염 모델
상기 실시예 <3-1>에서 확립한 마우스에서 염증 신호 생체 영상화가 가능한지 확인하기 위하여 LPS(lipopolysaccharide)와 D-갈락토사민(D-galactosamine)을 병용하여 간염을 유도하고 루시퍼레이즈(luciferase) 신호를 평가하였다.
구체적으로, 마우스에 1ml 주사기를 이용하여 D-루시페린(D-luciferin; 15mg/ml in PBS) 100ul를 복강 투여하였으며, 이소플루란(isoflurane)에 의한 호흡 마취 하에 복부에서 루시퍼레이즈 신호를 측정하였고, 이후 PBS(phosphate buffered saline)에 희석된 LPS 및 D-갈락토사민을 각각 15㎍/kg 및 350mg/kg 용량으로 마우스에 복강 투여하였다. 4시간 경과 후 앞선 방법과 동일하게 D-루시페린(15mg/ml in PBS) 100㎕l를 복강 투여하고 루시퍼레이즈 신호를 측정하였다.
그 결과, LPS/D-갈락토사민 투여 후 간에서의 염증 신호가 증가하는 것이 확인되었다(도 5a 및 도 5b).

Claims (12)

1) 마우스 ROSA26 유전좌위(locus)에 NF-κB RE(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells response element)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열 및 리포터 유전자(reporter gene)를 포함하는 유전자 카세트를 삽입하여 타겟팅 벡터를 제조하는 단계;
2) 상기 단계 1)에서 제조된 타겟팅 벡터를 마우스의 배아줄기세포에 삽입하여 마우스 배아줄기세포 클론을 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)에서 제조된 마우스 배아줄기세포 클론을 야생형 마우스에서 분리된 배반포(blastocyte)에 삽입하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 클론이 삽입된 배반포를 대리모 마우스의 자궁에 이식하여 착상시키는 단계; 및
5) 상기 단계 4)의 대리모 마우스에서 태어난 마우스를 야생형 마우스와 교배하여 이형접합성 마우스(heterozygous mouse)를 제조하는 단계;를 포함하는 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 타겟팅 벡터는 하기의 뉴클레오티드 서열을 순차적으로 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법:
(a) CAG 프로모터(promoter);
(b) 두 개의 loxP(locus of X-over P1) 부위 사이에 전사 종결 코돈(transcription stop codon) 부위가 위치한 유전자 절편;
(c) NF-κB RE를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(d) TA 프로모터;
(e) 루시퍼레이즈(Luciferase)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(f) UBC 프로모터;
(g) 티디토마토(tdTomato)를 암호화하는 뉴클레오티드 서열;
(h) BGH poly A; 및
(i) 네오마이신(Neomycin) 내성 유전자.
제1항에 있어서,
상기 단계 1)의 리포터 유전자는 루시퍼레이즈(Luciferase), β갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP), 엠플럼(mPlum), 엠체리(mCherry), 티디토마토(tdTomato), 엠스트로베리(mStrawberry), 제이-레드(J-Red), 디에스레드(DsRed), 엠오렌지(mOrange), mKO, 엠시트린(mCitrine), 비너스(Venus), YPet, 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein: EYFP), 에메랄드(Emerald), CyPet, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 세루리안(Cerulean), 티-사파이어(T-Sapphire), 알칼린 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나를 암호화하는 유전자인 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 2)는 마우스 배아줄기세포 클론에 네오마이신(Neomycin) 처리하고 서던 블롯(southern blot)을 수행하여 타겟팅 벡터가 삽입된 마우스 배아줄기세포 클론을 선별하는 단계;를 더 포함하는 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 4)의 대리모 마우스의 임신 기간은 착상 후 15 내지 20일인 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법.
제1항에 있어서,
상기 단계 5)의 야생형 마우스는 C57BL/6 마우스인 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법.
제1항의 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델의 제조방법으로 제조되는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델.
제7항에 있어서,
상기 마우스 모델은 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스와 교배하여 세포 또는 조직 특이적으로 염증 신호가 발현되는 마우스를 제조하는 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델.
제8항에 있어서,
상기 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 유전자변형마우스는 MMTV(mouse mammary tumor virus promoter)-Cre 마우스, Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre 마우스, Foxp3(forkhead box P3)-Cre 마우스, CD4(cluster of differentiation 4)-Cre 마우스, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre 마우스, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre 마우스, Vil(villin 1)-Cre 마우스, Alb(albumin)-Cre 마우스, AQ(adipoq)-Cre 마우스, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) 마우스, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre 마우스, Ins2(insulin 2)-Cre 마우스 및 DAT(dopamine transporter)-Cre 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델.
1) 제7항의 마우스 모델과 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소(Cre recombinase)를 발현하는 유전자변형마우스를 교배하여 제조된 마우스에 피검물질을 처리하는 단계;
2) 상기 피검물질을 처리한 마우스의 NF-κB(nuclear factor kappa-light-chain-enhancer of activated B cells)의 활성 정도를 측정하는 단계; 및
3) 대조군와 비교하여, 상기 측정된 NF-κB의 활성 정도가 감소한 피검물질을 선별하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 하는, 항염증 물질 스크리닝 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 1)의 세포 또는 조직 특이적으로 Cre 재조합효소를 발현하는 유전자변형마우스는 MMTV(mouse mammary tumor virus promoter)-Cre 마우스, Pdx1(pancreatic and duodenal homeobox 1)-Cre 마우스, Foxp3(forkhead box P3)-Cre 마우스, CD4(cluster of differentiation 4)-Cre 마우스, CD8(cluster of differentiation 8)-Cre 마우스, CD11c(cluster of differentiation 11c)-Cre 마우스, Vil(villin 1)-Cre 마우스, Alb(albumin)-Cre 마우스, AQ(adipoq)-Cre 마우스, AP2(adipocyte protein 2)-CreERT2(Cre recombinase fused to a mutant estrogen ligand-binding domain(ERT2)) 마우스, Lyz2(lysozyme 2, LysM)-Cre 마우스, Ins2(insulin 2)-Cre 마우스 및 DAT(dopamine transporter)-Cre 마우스로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는, 항염증 물질 스크리닝 방법.
제10항에 있어서,
상기 단계 2)에서, NF-κB의 활성 정도는,
루시퍼레이즈(luciferase), β갈락토시다제, 녹색 형광 단백질(Green Fluorescent Protein: GFP), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced Green Fluorescent Protein: eGFP), 엠플럼(mPlum), 엠체리(mCherry), 티디토마토(tdTomato), 엠스트로베리(mStrawberry), 제이-레드(J-Red), 디에스레드(DsRed), 엠오렌지(mOrange), mKO, 엠시트린(mCitrine), 비너스(Venus), YPet, 증강된 황색 형광 단백질(enhanced yellow fluorescent protein: EYFP), 에메랄드(Emerald), CyPet, 시안 형광 단백질(cyan fluorescent protein: CFP), 세루리안(Cerulean), 티-사파이어(T-Sapphire), 알칼린 포스파타제로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나의 리포터 유전자의 발현 정도로 측정하는 것을 특징으로 하는, 항염증 물질 스크리닝 방법.
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