KR20200108159A - 선천성 림프관 발달 이상 동물모델 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 선천성 림프관 발달 이상 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명의 Tmem100 녹아웃 마우스의 배아는 림프관 내피세포의 분화가 증가하고 주정맥과 림프관의 비정상적인 연결에 따라, 혈액이 찬 림프관 및 확장된 림프관, 림프낭 등 표현형이 나타나고, Tmem100 과발현 마우스의 배아는 반대로 림프관 내피세포의 분화가 감소하고, 림프관 신생이 감소하며, 심각한 피하 부종이 발생하며 림프관, 림프낭의 크기 및 수가 감소하는 등 표현형이 나타나는 바, Tmem100 녹아웃 마우스 및 Tmem100 과발현 마우스는 선천성 림프관 발달 이상에 대한 기초 연구 및 예방 또는 치료제 개발에 유용한 동물모델로 이용될 수 있다.
Description
본 발명은 선천성 림프관 발달 이상 동물모델 및 이의 용도에 관한 것이다.
림프관은 유동적 항상성(fluid homeostasis), 식이 지방 섭취, 및 면역 반응에 있어 필수적인 역할을 한다. 마우스의 발달 과정에서 E(embryonic day)9.5에는 주정맥의 내피세포에서 SOX18 및 PROX1과 같은 림프성 마커의 편향된 발현이 정맥 내피세포를 림프관 전구세포(lymphatic progenitor cells)로 분화시킨다(Francois M et al., Nature, 456(7222): 643-647, 2008). E10.5 내지 E12.5에는 주정맥(cardinal vein)으로부터 발아한 림프관 내피세포(lymphatic endothelial cells, LECs)가 VEGFC(Vascular endothelial growth factor C)를 발현하는 중배엽 세포(mesodermal cells)를 향하여 등, 옆쪽으로 이동하고, 림프 네트워크의 초기 구조인 경부(jugular)의 림프낭(lymphatic sacs)을 형성한다. E13.5에는 주정맥과 림프낭의 분리가 일어나며, 이 때 활성화된 혈소판들이 주정맥과 림프낭 사이에 혈전을 형성함으로써 그 분리에 주요 역할을 한다.
혈관 내피세포 및 림프관 내피세포의 정체성 유지 또한 적절한 림프관 신생(lymphangiogenesis)에 필수적인 요소이다. PROX1은 LECs의 운명을 결정하고 그 정체성을 유지하는 주요 전사인자이다. 다양한 발달 단계에서 PROX1의 결손은 LECs의 분화 저하를 나타내는 증상들로, 혈액이 찬(blood-filled) 림프관, LEC 마커들의 하향조절, 및 혈관 내피세포 마커들의 이소성(ectopic) 발현 등을 초래한다.
림프관의 발달 과정에 문제가 생기면 정맥과 림프관의 적절한 분리가 이루어지지 않음에 따라 림프관에 혈액이 차고, 림프관 내피세포 분화가 과도하게 일어나 림프관이 확장되고, 내부 출혈이 발생하는 등 증상을 초래한다. 따라서, 초기 발달 과정에 있어 림프관의 발달 이상을 억제할 수 있는 약물의 스크리닝 및 림프관의 발달 이상 과정에 대한 기초 연구를 위하여, 림프관 발달 이상의 표현형을 모두 나타낼 수 있는 모델의 개발이 필요하다.
TMEM100(Transmembrane protein 100)은 134 개 아미노산 및 2 개의 도메인으로 구성되는 트랜스멤브레인(transmembrane) 단백질로, 많은 혈장 멤브레인에 존재하며, N-말단 및 C-말단이 모두 세포 내에 있는 형태를 가진다. TMEM100은 척삭(notochord), 젖샘(mammary glands), 심 내막(endocardium), 방실계 쿠션(atrioventricular cushion), 척수 신경절(dorsal root ganglia)의 하위 집단(subset), 및 신경관(neural tube)의 배쪽 영역(ventral region)에 발현된다. 혈관계에서 Tmem100 발현은 Tmem100-lacZ 리포터(reporter)에 의해 주요 동맥의 내피세포에서 주로 검출되나, 역전사 중합효소 연쇄반응(reverse transcription polymerase chain reaction, RT-PCR) 분석에 의하면 Tmem100 전사체가 정맥의 내피세포에서도 검출된다.
본 발명자들은 Tmem100 발현이 억제되거나, 촉진되면 림프관 발달 이상의 표현형이 나타남을 확인하여, Tmem100 유전자가 녹아웃되거나 과발현된 선천성 림프관 발달 이상 동물모델을 제작하였다.
본 발명의 목적은 선천성 림프관 발달 이상 동물모델 및 이의 용도를 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 Tmem100(Transmembrane protein 100) 유전자가 녹아웃된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스를 제공한다.
또한 본 발명은 Tmem100 유전자가 과발현된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스 및 이의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 Tmem100 녹아웃 마우스의 배아는 림프관 내피세포의 분화가 증가하고 주정맥과 림프관의 비정상적인 연결에 따라, 혈액이 찬 림프관 및 확장된 림프관, 림프낭 등 표현형이 나타나고, Tmem100 과발현 마우스의 배아는 반대로 림프관 내피세포의 분화가 감소하고, 림프관 신생이 감소하며, 심각한 피하 부종이 발생하며 림프관, 림프낭의 크기 및 수가 감소하는 등 표현형이 나타나는 바, Tmem100 녹아웃 마우스 및 Tmem100 과발현 마우스는 선천성 림프관 발달 이상에 대한 기초 연구 및 예방 또는 치료제 개발에 유용한 동물모델로 이용될 수 있다.
도 1은 Tmem100 녹아웃(knockout) 배아의 제작 과정을 나타내는 모식도이다.
도 2는 E13.5 Tmem100 iKO 배아의 Tmem100 전사체 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 E14.5 및 E15.5 Tmem100 iKO 배아의 전체형태를 촬영한 사진(A), E14.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 염색한 사진(B), E14.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아의 림프낭 영역(C) 및 피부 림프관 영역(D)을 측정한 결과 그래프이다(CV: 주정맥; LS: 림프낭; 및 DL: 피부 림프관).
도 4는 E14.5 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진이다(D 내지 F는 각각 A 내지 C의 확대사진임; L: 림프관; 및 V: 정맥).
도 5는 E14.5 Tmem100 iKO 배아의 연속적 시상단면(sagittal sections) 조직 절편을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진이다(L: 림프관; 및 V: 정맥).
도 6은 E13.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-Ki-67 항체(A) 또는 항-cleaved caspase-3 항체(B)로 염색한 사진, 및 Ki-67-양성 LEC(림프관 내피세포)의 수를 측정한 결과 그래프(C)이다(V: 정맥; LV: 림프관).
도 7은 E13.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진(A), 이의 LYVE1-양성 내피세포의 수를 측정한 결과 그래프(B), E11.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-PROX1 항체로 염색한 사진(C), 및 이의 PROX1-양성 LEC 수를 측정한 결과 그래프(D)이다(L: 림프관; S: 체절(somite); 및 V: 주정맥).
도 8은 Tmem100 과발현(overexpression) 배아의 제작 과정을 나타내는 모식도(A) 및 표적 벡터를 J1 마우스 배아 줄기세포에 도입한 후, 퓨로마이신-저항성 콜로니들을 스크리닝한 서던 블롯 사진(B)이다.
도 9는 E10.5 및 E11.5 TMEM100-OE 배아의 Tmem100 전사체 양을 측정한 결과 그래프(A), HA-TMEM100 단백질 발현을 측정한 웨스턴 블롯 사진(B), E10.5 TMEM100-OE 배아의 머리(D) 및 꼬리(E)에서 GFP 발현을 확인한 라이브 형광 사진, E11.5 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 형광 염색한 사진(F 및 G), 대조군 및 TMEM100-OE 배아의 전체형태를 시기 별로 촬영한 사진(H)이다(CV: 주정맥; LV: 림프관, DA: 등대동맥(dorsal aorta)).
도 10은 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 H&E(hematoxylin & eosin) 염색한 사진(A), 및 E11.5(B), E12.5(C) 및 E13.5(D)의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체 및 항-EMCN 항체로 각각 염색한 사진이다(*: 부종 부분; LS: 림프낭; LV: 림프관; CV: 주정맥; DA: 등대동맥; 및 JV: 경정맥(jugular vein)).
도 11은 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 염색한 사진(A 및 B), 이의 LYVE1-양성 피부 림프관 수를 측정한 결과 그래프(C), E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 홀마운트(whole-mount) 형광 염색한 사진(D 및 E)이다(*: 부종 부분; LS: 림프낭; DL: 피부 림프관; 화살표: LYVE1-양성 피부 림프관; 및 화살표 머리: LYVE1-양성 대식세포(macrophage)).
도 12는 E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-Ki-67 항체로 염색한 사진(A 내지 D), E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 TUNEL 염색한 사진(E 및 F), E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 Ki-67-양성 세포 수를 측정한 결과 그래프(G 내지 I)이다(CV: 주정맥; 및 LS: 림프낭).
도 13은 E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-PROX1 항체(초록색) 및 항-VEGFR3 항체(붉은색)으로 형광 염색한 사진(A 내지 N), E11.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 PROX1-양성 내피세포 수를 측정한 결과 그래프(O), 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 세포 수를 측정한 결과 그래프(P)이다(파란색: DAPI, 세포 핵을 염색; D 및 H는 각각 A 및 E의 확대 사진임; CV: 주정맥; LS: 림프낭; 및 DA: 등대동맥).
도 14는 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-PROX1 항체(초록색) 및 항-VEGFR3 항체(붉은색)으로 형광 염색한 사진(A 내지 L), 정맥에서의 PROX1-양성 세포 수(M), PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 림프관 수(N), 및 PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 세포 수(O)를 측정한 결과 그래프이다(A 내지 F: 목 부위; G 내지 L: 가슴 부위; V: 정맥; 및 LV: 림프관).
도 2는 E13.5 Tmem100 iKO 배아의 Tmem100 전사체 양을 측정한 결과 그래프이다.
도 3은 E14.5 및 E15.5 Tmem100 iKO 배아의 전체형태를 촬영한 사진(A), E14.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 염색한 사진(B), E14.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아의 림프낭 영역(C) 및 피부 림프관 영역(D)을 측정한 결과 그래프이다(CV: 주정맥; LS: 림프낭; 및 DL: 피부 림프관).
도 4는 E14.5 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진이다(D 내지 F는 각각 A 내지 C의 확대사진임; L: 림프관; 및 V: 정맥).
도 5는 E14.5 Tmem100 iKO 배아의 연속적 시상단면(sagittal sections) 조직 절편을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진이다(L: 림프관; 및 V: 정맥).
도 6은 E13.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-Ki-67 항체(A) 또는 항-cleaved caspase-3 항체(B)로 염색한 사진, 및 Ki-67-양성 LEC(림프관 내피세포)의 수를 측정한 결과 그래프(C)이다(V: 정맥; LV: 림프관).
도 7은 E13.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-LYVE1 항체(붉은색) 및 항-EMCN 항체(갈색) 항체로 이중 염색한 사진(A), 이의 LYVE1-양성 내피세포의 수를 측정한 결과 그래프(B), E11.5의 대조군 및 Tmem100 iKO 배아 조직을 항-PROX1 항체로 염색한 사진(C), 및 이의 PROX1-양성 LEC 수를 측정한 결과 그래프(D)이다(L: 림프관; S: 체절(somite); 및 V: 주정맥).
도 8은 Tmem100 과발현(overexpression) 배아의 제작 과정을 나타내는 모식도(A) 및 표적 벡터를 J1 마우스 배아 줄기세포에 도입한 후, 퓨로마이신-저항성 콜로니들을 스크리닝한 서던 블롯 사진(B)이다.
도 9는 E10.5 및 E11.5 TMEM100-OE 배아의 Tmem100 전사체 양을 측정한 결과 그래프(A), HA-TMEM100 단백질 발현을 측정한 웨스턴 블롯 사진(B), E10.5 TMEM100-OE 배아의 머리(D) 및 꼬리(E)에서 GFP 발현을 확인한 라이브 형광 사진, E11.5 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 형광 염색한 사진(F 및 G), 대조군 및 TMEM100-OE 배아의 전체형태를 시기 별로 촬영한 사진(H)이다(CV: 주정맥; LV: 림프관, DA: 등대동맥(dorsal aorta)).
도 10은 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 H&E(hematoxylin & eosin) 염색한 사진(A), 및 E11.5(B), E12.5(C) 및 E13.5(D)의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체 및 항-EMCN 항체로 각각 염색한 사진이다(*: 부종 부분; LS: 림프낭; LV: 림프관; CV: 주정맥; DA: 등대동맥; 및 JV: 경정맥(jugular vein)).
도 11은 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 염색한 사진(A 및 B), 이의 LYVE1-양성 피부 림프관 수를 측정한 결과 그래프(C), E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-LYVE1 항체로 홀마운트(whole-mount) 형광 염색한 사진(D 및 E)이다(*: 부종 부분; LS: 림프낭; DL: 피부 림프관; 화살표: LYVE1-양성 피부 림프관; 및 화살표 머리: LYVE1-양성 대식세포(macrophage)).
도 12는 E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-Ki-67 항체로 염색한 사진(A 내지 D), E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 TUNEL 염색한 사진(E 및 F), E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 Ki-67-양성 세포 수를 측정한 결과 그래프(G 내지 I)이다(CV: 주정맥; 및 LS: 림프낭).
도 13은 E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-PROX1 항체(초록색) 및 항-VEGFR3 항체(붉은색)으로 형광 염색한 사진(A 내지 N), E11.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 PROX1-양성 내피세포 수를 측정한 결과 그래프(O), 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직에서 PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 세포 수를 측정한 결과 그래프(P)이다(파란색: DAPI, 세포 핵을 염색; D 및 H는 각각 A 및 E의 확대 사진임; CV: 주정맥; LS: 림프낭; 및 DA: 등대동맥).
도 14는 E13.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아 조직을 항-PROX1 항체(초록색) 및 항-VEGFR3 항체(붉은색)으로 형광 염색한 사진(A 내지 L), 정맥에서의 PROX1-양성 세포 수(M), PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 림프관 수(N), 및 PROX1-양성 및 VEGFR3-양성 세포 수(O)를 측정한 결과 그래프이다(A 내지 F: 목 부위; G 내지 L: 가슴 부위; V: 정맥; 및 LV: 림프관).
이하 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 Tmem100(Transmembrane protein 100) 유전자가 녹아웃된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스를 제공한다.
상기 마우스는 부위-특이적 재조합효소의 작용에 의하여 Tmem100 유전자가 녹아웃된 것일 수 있다.
상기 부위-특이적 재조합효소는 Cre 재조합효소일 수 있다.
상기 부위-특이적 재조합효소인 Cre 재조합효소의 인식서열은 loxP이다.
상기 선천성 림프관 발달 이상은 확장된 림프관, 확장된 림프낭, 혈액이 찬(blood-filled) 림프관, 및 정맥과 림프관의 비정상적인 연결로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 수반하는 것일 수 있다.
상기 Tmem100 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 Tmem100 유전자가 과발현된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스를 제공한다.
상기 마우스는 Tmem100 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 것일 수 있다.
상기 선천성 림프관 발달 이상은 림프관 내피세포 수 감소, 림프관 수 감소, 림프관 크기 감소, 림프낭 수 감소, 림프낭의 크기 감소 및 피하 부종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 수반하는 것일 수 있다.
상기 Tmem100 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 프로모터, loxP 서열이 양 옆에 위치한 전사 중단 카세트(transcription stop cassette, tpA), Tmem100 유전자 및 폴리 A 서열(polyadenylation sequence)을 포함하는 벡터를 제작하는 단계; 2) 상기 단계 1)의 벡터를 마우스 배아줄기세포로 형질도입하여 상동 재조합체를 제조하는 단계; 3) 상기 단계 2)의 상동 재조합체를 마우스의 배반포에 주입하여 키메라 마우스를 제조하는 단계; 4) 상기 단계 3)의 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배시켜 이형접합성(heterozygote, ROSA26+/Tmem100) 마우스를 제조하는 단계; 5) 상기 단계 4)의 이형접합성 마우스를 서로 교배시켜 동형접합성(homozygote, ROSA26Tmem100/Tmem100) 마우스를 제조하는 단계; 및 6) 상기 단계 3) 또는 단계 4)의 마우스를 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스와 교배시켜 Tmem100 유전자가 과발현된 마우스를 제조하는 단계를 포함하는 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스의 제조방법을 제공할 수 있다.
상기 단계 1)의 프로모터는 CAGGS 프로모터일 수 있다.
상기 단계 1)의 벡터는 5'말단의 ROSA26 상동 염기서열(homology arm), 아데노바이러스(adenovirus) SA(splice acceptor) 서열, 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자(Puro), CAGGS 프로모터(promoter), loxP 서열이 양 옆에 위치한 전사 중단 카세트(transcription stop cassette, tpA), N-말단에 HA로 표지된 Tmem100 유전자, 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site), eGFP(enhanced green fluorescence protein) 유전자, 폴리 A 서열(polyadenylation sequence), 3' 말단의 ROSA26 상동 염기서열, 및 PGK-DTA(diphtheria toxin cassette)로 구성되는 것일 수 있다.
상기 eGFP는 상기 벡터에 이중 시스트론 삽입(bicistronic insertion) 방식으로 삽입된 것일 수 있다.
상기 벡터는 pBSApBpACAGftIGn 플라스미드 및 pROSA26PAS 플라스미드를 이용하여 제조된 것일 수 있다.
상기 Tmem100 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 것일 수 있다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명자들은 타목시펜 투여에 의해 조건적으로 Tmem100 유전자가 녹아웃되는 마우스를 제작한 후, E10.5에 타목시펜을 투여하여 Tmem100 유전자가 녹아웃된 배아를 제작하고, 이의 Tmem100 전사체 감소를 확인하였다(도 1 내지 2 참조).
또한, 본 발명자들은 상기 Tmem100 유전자 녹아웃 배아에서 출혈, 등쪽 부종, 성장 지연, 혈액이 찬 림프관, 주정맥 및 림프관 사이의 비정상적인 연결이 나타남을 확인하였고, 이러한 표현형들이 림프관 내피세포의 증식 증가 및/또는 사멸 감소에 의한 것이 아닌 림프관 내피세포로의 분화 증가에 의한 것임을 확인하였다(도 3 내지 7 참조).
또한, 본 발명자들은 Tmem100 유전자가 과발현된 배아를 제작하고, 상기 배아에서 Tmem100 유전자가 녹아웃된 배아와 반대되는 표현형으로 림프관 및 림프낭의 감소, 피하부종, 림프관 신생 감소, 림프관 내피세포로의 분화 감소가 나타남을 확인하였다(도 8 내지 14 참조).
따라서, 상기로부터 Tmem100 유전자가 림프관 발달에 중요한 역할을 함을 확인한 바, 본 발명의 Tmem100 녹아웃 마우스 및 Tmem100 과발현 마우스는 선천성 림프관 발달 이상에 대한 기초 연구 및 예방 또는 치료제 개발에 유용한 동물모델로 이용될 수 있다.
이하 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해서 한정되는 것은 아니다.
Tmem100
녹아웃(knockout) 배아의 제작
1-1.
Tmem100
표적 벡터의 제작
Tmem100을 포함하는 BAC 클론(bMQ-464G17, 129s7/AB2.2 library; Sanger Institute Resources, Geneservice, 영국) 및 유전자 재조합 시스템(http://web.ncifcrf.gov/research/brb/recombineeringInformation.aspx)을 이용하여 Tmem100-표적 벡터를 제작하였다(도 1). 구체적으로, 9.0 kb의 Tmem100 게놈 DNA 절편을 BAC DNA로부터 회수하여 HSV-TK(herpes simplex virus thymidine kinase) 유전자를 갖는 pLMJ235에 넣어 음성 선택 마커로 준비하였다. 리포터(LacZ) 및 양성 선택 마커(neomycin, Neo)를 포함하는 SIBN(frt-SD/SA-IRES-LacZ-Neo-frt-loxP) 카세트(cassette)를 Tmem100의 전체 암호화 영역을 포함하는 엑손 3에서 상류(upstream) 방향으로 239 bp만큼 떨어진 위치에 삽입하였다. loxP 서열은 엑손 3의 하류(downstream) 방향으로 125 bp만큼 떨어진 위치에 클로닝하였다.
1-2.
Tmem100
SIBN
대립 유전자(allele)를 갖는 마우스의 제작
상기 실시예 1-1에서 제작한 표적 벡터를 NotI로 선형화한 후, 4 × 107 개의 J1 배아 줄기세포(embryonic stem cells, ESCs)에 전기천공법(electroporation)으로 도입하였다. 약 300개의 G418- 및 FIAU(1-(2-deoxy-2-fluoro-1-b-D-arabinofuranosyl)-5-iodouracil)-저항성 콜로니들을 무작위로 선택하여, 5'-프로브(probe) 및 3'-프로브를 이용한 서던 블롯(southern blot) 분석으로 상동 재조합(homologous recombination) 스크리닝을 수행하였다. 선별된 표적 ESCs를 C57BL/6(B6) 스트레인(strain)의 배반포(blastocyst)에 주입하고, 수컷 키메라(chimera) 마우스를 B6 암컷 마우스와 교배하여 129/B6 혼성 백그라운드(background)를 갖는 Tmem100 +/SIBN 스트레인을 얻었다(도 1). 이후, 서던 블롯으로 표적 대립 유전자의 생식선 전이(Germ-line transmission)를 확인하였다.
1-3. 유도성
Tmem100
녹아웃 배아의 제작
Tmem100-결핍(null) 배아는 E10.5와 E11.5 사이에 죽는 것으로 알려져 있기 때문에, E10.5 이후에 타목시펜 투여에 의해 Tmem100 유전자가 결손되는 유도성 Tmem100 녹아웃(Tmem100-inducible knockout; Tmem100-iKO) 배아를 제작하였다. 구체적으로, Tmem100 2loxP/2loxP 마우스를 ROSA26+/CreER 마우스(Stock No: 008463, Jackson Laboratory, 미국)와 교배시킨 후, 10.5일째에 임신한 모체에 타목시펜(tamoxifen)을 0.1 mg/kg으로 복강에 단회 투여하여 Tmem100 결손을 유도하였다. 상기 ROSA26+/CreER 마우스는 Cre 재조합효소와 에스트로겐 수용체(estrogen receptor, ER)의 에스트로겐 결합 부위가 연결된 CreER 유전자를 갖는 마우스로, Tmem100 2loxP/2loxP 마우스를 ROSA26+/CreER 마우스와 교배시키면 CreER 단백질이 발현되나 세포질에 존재하므로 핵 내에서 Cre-loxP 재조합을 일으키지는 못하는 상태로 유지된다. 이후, 상기 마우스에 에스트로겐 유사체인 타목시펜이 투여되면, 타목시펜이 CreER 단백질의 에스트로겐 결합 부위에 결합하여 핵 내로 이동하게 되고, 비로소 Cre-loxP 재조합이 일어나게 되며, 그에 따라 Tmem100 유전자 결손이 유도된다.
비교예 1.
Tmem100
유전자 결손을 유도하지 않은 대조군 마우스의 준비
임신한 Tmem100 2loxP/2loxP 마우스에 E10.5에 타목시펜 0.1 mg/kg을 복강에 단회 투여하여 Tmem100 유전자 결손을 유도하지 않은 대조군 마우스를 준비하였다.
실험예 1. E13.5
Tmem100
iKO 배아의
Tmem100
전사체(transcripts) 감소 확인
상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아의 Tmem100 유전자 결손을 확인하기 위하여, 정량적 실시간 중합효소 연쇄반응(quantitative real-time polymerase chain reaction(PCR))을 수행하였다.
구체적으로, Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 타목시펜 투여 후 2일 뒤인 E13.5에 분리하고 뉴클레오스핀 RNA II 키트(NucleoSpin RNA II kit, Cat. #. 740955, MACHEREY-NAGEL GmbH & Co., 독일)를 이용하여 총 RNA를 분리 및 정제하였다. 정제한 RNA를 프라임스크립트 RT 마스터 믹스(Cat. #. RR036A, TAKARA, 일본)를 이용하여 단일 가닥 상보적 DNA(complementary DNA, cDNA)를 제작한 후, 하기 표 1의 프라이머들 및 PCR 기기(CFX384 Real Time System, Bio-Rad, 미국)을 이용하여 표 2의 반응 조건으로 정량적 실시간 PCR을 수행하였고, 측정된 Ct값을 이용하여 ΔΔCt 방법으로 Tmem100 전사체 양을 계산하였다.
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| Tmem100 forward | GACAATGGAGAAAAACCCCAAGA | 2 |
| Tmem100 reverse | GGTAGCAGGAGAGTTCGGC | 3 |
| 온도(℃) | 시간 | 사이클 수 |
| 95 | 10분 | 1 |
| 95 | 15초 | 40 |
| 60 | 1분 |
그 결과, Tmem100 iKO 배아에서 대조군에 비하여 Tmem100 전사체 농도가 약 3.8배 감소하였으며, 이는 상기 실시예에서 Tmem100 iKO 배아의 Tmem100 유전자 결손이 잘 유도되었음을 제시한다(도 2).
실험예 2.
Tmem100
iKO 배아의 비정상적인 림프관 발달 확인
2-1. E14.5 및 E15.5의
Tmem100
iKO 배아의 사망률 및 전체적인 형태(gross morphology) 확인
상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 E14.5, E15.5 및 E16.5에 분리하여 사망 여부를 확인하고, 전체적인 형태를 현미경으로 촬영하여 관찰하였다.
그 결과, Tmem100-iKO 배아는 E14.5에 39 개 중의 4 개, E15.5에 20 개 중의 9 개, E16.5에 5 개 중의 5 개 모두가 사망하였다. 대부분의 살아있거나 죽은 Tmem100-iKO 배아들은 피부 출혈(cutaneous hemorrhage), 부종(edema), 및 약한 성장 지연(mild growth retardation)을 나타냈으며, 특히 등 피부쪽에 심한 부종이 확인되었다(도 3A).
2-2. E14.5의
Tmem100
iKO 배아의 확장되고 혈액이 찬(blood-filled) 림프관 확인
Tmem100 iKO 배아의 림프관 형태를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 E14.5에 분리하여 면역조직화학염색(immunohistochemistry)을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아를 4% PFA(paraformaldehyde)로 고정시킨 후, 농도별 에탄올을 이용하여 탈수하였다. 이후, 자일렌(xylene)을 처리한 후, 조직편에 파라핀(paraffin)을 침투시켜 파라핀 블록을 제작하였다. 상기 파라핀 블럭에서 경정맥(jugular) 부위를 5 ㎛ 두께의 절편으로 제작하였다. 이후, 상기 절편에 자일렌 처리를 하여 남아있는 파라핀을 제거하고, 농도별 에탄올을 이용하여 수화시켰다. 수화된 조직 절편을 림프관 내피세포(lymphatic endothelial cell, LEC)를 검출하는 항-LYVE1 1차 항체와 반응시킨 후, 세척하고, 폴린크-2 플러스 AP 래빗 키트(Polink-2 Plus AP rabbit Kit, Cat. #. D70-6, GBI Labs, 미국)를 이용하여 2차 항체 반응을 수행하였다. 염색이 종료된 조직은 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였으며, 대조군 배아의 조직과 Tmem100 iKO 배아의 조직 중 유사한 부위의 사진에서 림프낭(lymphatic sacs)의 내강 영역(luminal area) 및 피부의 림프관 영역의 면적을 측정하여 비교하였다.
그 결과, Tmem100-iKO 배아의 LYVE1-양성인 림프관에서 혈구세포(blood cells)가 관찰되었고, 대조군에 비하여 림프낭의 내강 영역은 2.4 배 더 커졌고, 피부의 림프관 영역은 3.8 배 더 확장되었다(도 3B 내지 3D). 상기 결과는 Tmem100-iKO 배아의 피부 출혈이 혈액의 혈관 외 유출(extravasation)에 의한 것이 아니라 림프관에 찬 혈액에 의한 것임을 제시한다.
2-3. E14.5의
Tmem100
iKO 배아에서 주정맥(cardinal vein) 및 림프관 사이의 비정상적인 연결 확인
상기 실험예 2-2에서 확인된 Tmem100-iKO 배아의 혈액이 찬 림프관이 혈관 및 림프관 구조 간의 잘못된 연결(misconnection)에 의해 나타난 것인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 E14.5에 분리하여 이중 면역조직화학염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 각 배아의 연속적인 시상단면(sagittal sections) 조직 절편을 제작하였고, 1차 항체로 LECs를 검출하기 위한 항-LYVE1 항체 및 정맥의 내피세포를 검출하기 위한 항-EMCN 항체를 동시에 사용하고, 2차 항체 반응을 폴린크 DS-RRt-Hu/Ms A 키트(Polink DS-RRt-Hu/Ms A Kit, Cat. #. DS211A-6, GBI Labs)를 이용하여 수행한 것을 제외하고는 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 이중 면역조직화학염색을 수행하였다.
그 결과, 총 8 개 중 5 개의 Tmem100-iKO 배아에서 주정맥 및 림프낭 사이의 비정상적인 연결이 관찰된 반면, 총 3 개의 대조군 배아에서는 이러한 연결이 전혀 나타나지 않았다(도 4 및 5).
실험예 3. E13.5의
Tmem100
iKO 배아의 LECs 증식 및 세포사멸 정도 확인
상기 실험예 2-2에서 확인한 Tmem100-iKO 배아의 확장된 림프관이 LECs의 증식 증가 및/또는 세포사멸 감소에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 E13.5에 분리하여 면역조직화학염색을 수행하였다.
구체적으로, 1차 항체로 증식하는 세포를 검출하기 위한 항-Ki-67 항체 및 사멸 중인 세포를 검출하기 위한 항-cleaved caspase-3 항체를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색된 조직을 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였고, 전체 LEC 중 Ki-67-양성인 LEC의 수를 세어 그 비율을 계산하였다.
그 결과, E13.5의 대조군 및 Tmem100-iKO 배아에서 림프낭 LECs의 증식 및 세포사멸 정도는 유의한 차이를 보이지 않았다(도 6).
실험예 4.
Tmem100
iKO 배아의 주정맥에서 내피세포 분화 감소 확인
실험예 2-2에서 확인한 Tmem100-iKO 배아의 확장된 림프관이 주정맥 내피세포의 비정상적인 분화에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 상기 실시예 1에서 제작한 Tmem100 iKO 배아 및 비교예 1의 대조군 마우스의 배아를 분리하여 면역조직화학염색 및 이중 면역조직화학염색을 수행하였다.
4-1. E13.5
Tmem100
iKO 배아의 주정맥에서 림프관 내피세포의 증가 확인
E13.5에 분리한 Tmem100-iKO 및 대조군 배아들로부터 제작한 조직 절편에서 항-LYVE1 항체 및 항-EMCN 항체를 이용하여 상기 실험예 2-3에 기재된 것과 동일한 방법으로 이중 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색된 조직을 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였고, 주정맥 내의 전체 내피세포 중 LYVE1-양성 세포의 수를 세어 그 비율을 계산하였다.
그 결과, Tmem100-iKO 배아의 정맥에서 LYVE1-양성의 림프관 내피세포가 증가하여, 대조군 배아에서는 주정맥 내피의 26%가 LYVE1-양성인 반면, Tmem100-iKO 배아에서는 주정맥 내피의 58%가 LYVE1-양성인 것으로 나타났다(도 7A 및 7B). 이는, 상대적으로 림프관 내피세포로의 분화가 많이 일어나고, 주정맥 내피세포로의 분화가 감소되었음을 제시한다.
4-2. E11.5
Tmem100
iKO 배아의 주정맥에서 림프관 내피세포의 증가 확인
E11.5에 분리한 Tmem100-iKO 및 대조군 배아들로부터 제작한 조직 절편에서 1차 항체로 주정맥에서 LECs로 분화되어 림프낭이 될 부위로 이동 중인 세포를 검출하기 위한 항-PROX1 항체를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색된 조직을 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였고, 전체 LEC 중 PROX1-양성인 LEC의 수를 세어 그 비율을 계산하였다.
그 결과, E11.5의 Tmem100-iKO 배아에서는 PROX1-양성인 이동 중인 LECs가 대조군에 비하여 1.9 배 높게 나타났고, 상기 LECs들은 주정맥으로부터 등 및 측면쪽(dorsolateral) 방향으로 이동 중인 것으로 나타났다(도 7C 및 7D). 이는, Tmem100-iKO의 주정맥에서 비정상적으로 증가된 LEC 분화가 LEC의 발아(budding-off)를 증가시킴에 따라 확장된 림프관 및 주정맥과 림프관의 비정상적인 연결을 초래하는 것일 수도 있음을 제시한다.
Tmem100
과발현(overexpression, OE)이 유도된 마우스의 제작
상기 실험예 1 내지 4에서 확인한 결과와 반대로 Tmem100 유전자를 과발현시켰을 때 반대의 표현형이 나타나는지 확인하기 위하여, Cre 활성에 의해 Tmem100 과발현을 유도하는 마우스 대립 유전자(ROSA26Tmem100)를 제작하였다.
2-1.
Tmem100
표적 녹인(knock-in) 벡터의 제작
5'말단의 ROSA26 상동 염기서열(homology arm), 아데노바이러스(adenovirus) SA(splice acceptor) 서열, 퓨로마이신(puromycin) 저항성 유전자(Puro), CAGGS 프로모터(promoter), loxP 서열이 양 옆에 위치한 전사 중단 카세트(transcription stop cassette, tpA), N-말단에 HA로 표지된 Tmem100 유전자, 내부 리보솜 유입점(internal ribosome entry site), eGFP(enhanced green fluorescence protein) 유전자, 폴리 A 서열(polyadenylation sequence), 3' 말단의 ROSA26 상동 염기서열, 및 PGK-DTA(diphtheria toxin cassette)로 구성되도록 pROSA-CAGGS-HA-Tmem100-GFP 녹인(knock-in) 벡터를 디자인하였다. 이를 통하여 HA로 표지된 Tmem100(HA-TMEM100) 발현은 Cre 재조합효소가 loxP 서열의 옆에 있는 상류(upstream)의 폴리 A 서열을 잘라낼 때 CAGGS 서열에 의해 조절되도록 하였고, GFP의 이중 시스트론 삽입(bicistronic insertion)으로 Cre 재조합효소의 활성을 모니터링하여 HA-TMEM100이 발현된 세포를 확인할 수 있도록 하였다. N-말단에 HA로 표지된 Tmem100 cDNA를 pBSApBpACAGftIGn 플라스미드의 EcoRV 및 PstI 제한효소 부위로 삽입하여 CAGGS-HA-Tmem100-GFP로 명명하였고, PacI 및 AscI 제한효소로 절단된 CAGGS-HA-Tmem100-GFP 절편을 동일한 제한효소로 절단된 pROSA26PAS 플라스미드에 삽입하여 최종 녹인 벡터를 제작하였다(도 8A).
2-2.
Tmem100
과발현 마우스의 제작
J1 마우스 배아 줄기세포(ESCs)에 상기 실시예 2-1에서 제작한 선형의 녹인 벡터를 전기천공법으로 도입한 후, 퓨로마이신-저항성 콜로니들을 선별하였다. 5'-프로브를 이용한 서던 블롯을 통하여 약 280 개의 퓨로마이신-저항성 콜로니들을 스크리닝하였다(도 8B). 이후, 표적 배아 줄기세포로부터 수득한 수컷 키메라(chimera) 마우스를 C57BL/6 암컷 마우스와 교배하여 ROSA26+/Tmem100 마우스 스트레인(strain)을 얻었다. 이후, 하기 표 3의 서열번호 4 및 5의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하여 ROSA26Tmem100-on 대립 유전자의 유전형을 확인하고, 표 3의 서열번호 6 및 5의 프라이머 세트를 이용한 PCR을 수행하여 ROSA26Tmem100-off 대립 유전자의 유전형을 확인하였다(도 8A).
| 프라이머명 | 서열(5'→3') | 서열번호 |
| ROSA-GT2 | catcaagctgatccggaaccctta | 4 |
| Tmem100-GT9 | cgtggtgaccacaacttccctctt | 5 |
| ROSA-GT4 | tcattttggcaaagaattcctcga | 6 |
ROSA26+/Tmem100 또는 ROSA26Tmem100/Tmem100 마우스를 Tie2-Cre 마우스(Tek-Cre; Stock No: 008863, Jackson Laboratory)와 교배하여 Tmem100 과발현(TMEM100-OE) 마우스를 제작하였다.
실험예 5. TMEM100-OE 배아의
Tmem100
과발현 확인
상기 실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아의 Tmem100 유전자 과발현 및 GFP 발현 등 유전자 도입 성공 여부를 검증하기 위하여, 정량적 실시간 PCR, 웨스턴 블롯(western blot) 분석, 및 면역형광염색을 수행하였다.
5-1. E10.5 및 E11.5의 TMEM100-OE 배아에서
Tmem100
전사체 증가 확인
TMEM100-OE 배아 및 대조군으로 정상 마우스의 배아를 E10.5 및 E11.5에 분리한 것을 제외하고는 상기 실험예 1에 기재된 것과 동일하게 정량적 실시간 PCR을 수행하였다.
그 결과, E10.5 및 E11.5의 TMEM100-OE 배아의 Tmem100 전사체가 대조군에 비하여 각각 약 17.2 배 및 5.6 배씩 증가하였다(도 9A)
5-2. E10.5 및 E11.5의 TMEM100-OE 배아에서 Tmem100 단백질 발현 증가 확인
상기 실험예 5-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 TMEM100-OE 배아 및 대조군 마우스의 배아를 E10.5 및 E11.5에 분리한 후, 리파 버퍼(RIPA buffer; 50 mM Tris-HCl(pH 8.0), 150 mM NaCl, 1% Nonidet P-40, 0.5% Deoxycholate, 0.1% SDS, 2 mM EDTA, 1X Complete EDTA-free protease inhibitor cocktail(Cat. #. 11 836 153 001, Roche, 스위스), 및 1X Phosphatase inhibitor cocktail 3(Cat. #. P0044, Sigma-Aldrich Co., 미국))로 용해시켰다. 용해액에서 로우리법(Lowry assay)을 기반으로 한 단백질 정량 시약(DC Protein Assay Reagents Package, Cat. #. 5000116, Bio-Rad)을 이용하여 제조사의 설명서에 따라 단백질 양을 측정하였다. 정량한 단백질 시료를 SDS-PAGE(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis) 젤에서 전기영동하고, 분리된 단백질을 NC(nitrocellulose) 멤브레인(Cat. #. 1620112, Bio-Rad)에 전기적으로 이동시켰다. 이후, 상기 멤브레인을 1차 항체인 항-베타-액틴(β-actin) 항체(310 ng/mL, Cat. #. A5441, Sigma-Aldrich Co.) 및 항-HA 항체(1:1,000, Abcam, 영국)와 반응시킨 후, HRP(horseradish peroxidase)가 결합된 2차 항체와 반응시켰다. 이후, ECL(enhanced chemiluminescence) 반응 시약(Pierce, 미국)으로 HRP 접합체를 검출하여 블롯 이미지를 분석하였다.
그 결과, TMEM100-OE 배아에서 HA로 표지된 TMEM100 단백질의 강한 발현이 유도되었다(도 9B 및 9C).
5-3. E10.5의 TMEM100-OE 배아에서 GFP 발현의 확인
상기 실험예 5-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 TMEM100-OE 배아를 E10.5에 분리하여 스테레오 형광 형미경(stereo fluorescence microscope)으로 사진을 촬영하였다.
라이브(live) 형광 이미지 촬영 결과, E10.5 TMEM100-OE 배아의 발달 중인 혈관에서 GFP 발현이 나타났으며(도 9D 및 9E), 이는 TMEM100-OE 배아에 실시예 2-1에서 제작한 벡터가 잘 도입되었음을 제시한다.
5-4. E11.5의 TMEM100-OE 배아에서 GFP 발현의 확인
상기 실험예 5-1에 기재된 것과 동일한 방법으로 TMEM100-OE 배아를 E11.5에 분리하여 면역형광염색을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아들로부터 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 조직 절편을 제작한 후, 1차 항체 반응 후 2차 항체 반응 시, 형광이 붙은 알렉사(Alexa)594 항체(Cat. #. A-11012, Invitrogen, 미국) 또는 알렉사488 항체(Cat. #. A-11008, Invitrogen)를 사용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, GFP가 발현된 세포에서 LYVE1-양성인 림프관 내피세포들이 관찰되었고, GFP는 주정맥의 내피세포 부위에서도 많이 발현되었다(도 9F 및 9G). 이는, TMEM100-OE 배아에 실시예 2-1에서 제작한 벡터가 잘 도입되어 림프관 내피세포 및 주정맥의 내피세포에서도 잘 발현됨을 제시한다.
실험예 6. TMEM100-OE에서 림프관 구조의 비정상적인 발달 확인
Tmem100의 과발현에 의한 림프관 구조의 비정상적인 발달 여부를 확인하기 위해, TMEM100-OE 배아의 전체적인 형태를 관찰하고, 면역조직화학염색을 수행하였다.
6-1. E11.5 내지 E14.5의 TMEM100-OE 배아에서 림프관 구조의 비정상적인 발달 확인
실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 시기별로 분리하여 전체적인 형태를 현미경으로 촬영하여 관찰하였다.
그 결과, E11.5 및 그보다 이전의 TMEM100-OE 배아에서는 대조군에 비하여 유의적인 차이가 관찰되지 않았으나, E12.5에는 TMEM100-OE 배아에서 피부 진피의 작은 부종 부위가 나타났고, E13.5 및 E14.5에는 총 피하부종(gross subcutaneous edema)이 나타났으며, E15.5 이후에도 상기 증상들이 회복되지 않았다(도 9H).
6-2. E13.5의 TMEM100-OE 배아에서 부종 확인
실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 E13.5에 분리하여, 헤마톡실린 & 에오신(hematoxylin & eosin, H&E) 염색을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아들로부터 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 조직 절편을 제작, 파라핀 제거 및 에탄올로 수화시킨 후, 헤마톡실린을 처리하였다. 증류수로 이를 세척한 후, 에오신을 처리하고, 에탄올로 세척하였다. 이후, 염색된 조직 절편에 자일렌을 처리한 후, 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였다.
그 결과, E13.5 TMEM100-OE 배아의 목 및 가슴 부위의 피부에서 림프 배출(lymphatic drainage) 감소를 동반하는 심각한 피하부종이 확인되었다(도 10A).
6-3. E11.5 내지 E13.5의 TMEM100-OE 배아에서 림프관 내피세포 수, 림프낭 및 림프관의 크기 감소 확인
실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 E11.5, E12.5 및 E13.5에 분리하여 면역조직화학염색을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아들로부터 1차 항체로 LECs를 검출하기 위한 항-LYVE1 항체 및 정맥의 내피세포를 검출하기 위한 항-EMCN 항체를 각각 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역조직화학염색을 수행하였다. 염색된 조직을 현미경으로 사진을 찍어 관찰하였고, 촬영한 사진 부위에서 LYVE1-양성인 림프관의 수를 세어 비교하였다.
그 결과, 실험예 6-2의 결과에 따르면 TMEM100-OE 배아의 부종은 E12.5에서 처음 확인되었으나, 면역조직화학염색 결과, E11.5에서 이미 주정맥의 LYVE1-양성 LECs의 수가 대조군에 비해 감소한 것으로 나타났다(도 10B). 또한, E12.5 및 E13.5의 TMEM100-OE 배아의 LYVE1-양성 LECs 수 및 LYVE1-양성 피부 림프관의 수가 감소되었고, 림프낭 및 림프관의 수 및 크기도 현저히 감소되었다(도 10C, 10D, 11A 내지 11C).
6-4. E13.5의 TMEM100-OE 배아에서 림프관 신생(lymphangiogenesis) 감소 확인
실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 E13.5에 분리하여 홀마운트(whole-mount) 면역형광염색을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아 조직을 4% PFA(paraformaldehyde)로 4℃에서 밤새 고정시킨 후, PBS(phosphate-buffered saline)로 3회 세척하였다. 이후, 조직들을 5% 염소 세럼(goat-serum)이 포함된 PBS/0.3% 트리톤 X-100(Triton X-100) 용액에서 투과화(permeabilized)시키고 블로킹(blocking)시켰다. 이후, PBS로 세척한 후, 조직들을 항-LYVE1 항체와 함께 4℃에서 밤새 반응시키고, 상온에서 알렉사594가 접합된 항-토끼-IgG와 1시간 동안 반응시켰다. PBS로 세척한 후, 조직들을 플루오로마운트 G(Fluoromount G, SouthernBiotech, 미국)로 마운팅 후 BX31 현미경(Olympus, 일본)으로 사진을 찍었다.
그 결과, E13.5의 TMEM100-OE 배아에서 피부 림프관 수가 대조군에 비하여 현저히 감소하였으며(도 11D 및 11E), 이는 Tmem100의 과발현에 의해 림프관 신생이 억제되었음을 제시한다.
실험예 7. E11.5 및 E12.5의 TMEM100-OE에서 LECs 증식 및 세포사멸 정도 확인
상기 실험예 6에서 확인한 TMEM100-OE 배아의 림프관 발달장애가 LECs의 증식 감소 및/또는 세포사멸 증가에 의한 것인지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 E11.5 및 12.5에 분리하여 면역조직화학염색을 수행하고, E12.5에 분리한 배아에 대하여 TUNEL(terminal deoxynucleotidyl transferase dUTP nick end labeling) 염색을 수행하였다.
구체적으로, 상기 배아들로부터 1차 항체로 증식하는 세포를 검출하기 위한 항-Ki-67 항체를 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 2-2에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역조직화학염색을 수행하고, 주정맥 또는 림프낭에서 전체 세포 중 Ki-67-양성인 세포 수를 세어 그 비율을 계산하였다. 또한, E12.5에 분리한 배아들로부터 제작한 조직 절편에서 세포 사멸 검출 키트(In Situ Cell Death Detection Kit, Cat. #. 11684795910, Roche)를 이용하여 TUNEL 염색을 수행하였다.
그 결과, E11.5 및 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아에서 Ki-67-양성인 증식하는 세포 수는 유의한 차이를 보이지 않았고, TUNEL 염색 결과에서도 E12.5의 대조군 및 TMEM100-OE 배아에서 사멸 중인 세포 수에 유의한 차이가 나타나지 않았다(도 12). 이는, Tmem100 과발현에 의한 림프관 발달장애가 LECs의 증식 감소 또는 사멸 증가에 의한 것이 아님을 제시한다.
실험예 8. TMEM100-OE에서 LEC 전구세포(progenitors) 수의 감소 및 초기 LEC 분화의 억제 확인
상기 실험예 6에서 확인한 TMEM100-OE 배아의 림프관 발달장애가 LEC의 분화와 관련있는지 여부를 확인하기 위하여, 실시예 2에서 제작한 TMEM100-OE 배아 및 대조군 배아를 E11.5, 12.5 및 E13.5에 분리하여 면역형광염색을 수행하였다.
구체적으로, 분리한 배아들로부터 제작한 조직 절편에서 LEC 분화 및 유지의 주요 인자인 PROX1 및 VEGFR3에 대한 항체를 1차 항체로 이용한 것을 제외하고는 상기 실험예 5-4에 기재된 것과 동일한 방법으로 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, E11.5 TMEM100-OE 배아의 주정맥에서 PROX1-양성인 세포 수가 대조군에 비하여 유의하게 감소하였고, E12.5 TMEM100-OE 배아의 PROX1 및 VEGFR3 양성인 세포 수가 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 13). 또한, E13.5 TMEM100-OE 배아에서도 정맥의 PROX1-양성인 세포 수, PROX1 및 VEGFR3 양성인 림프관 수, PROX1 및 VEGFR3 양성인 세포 수가 대조군에 비하여 유의하게 감소하였다(도 14). 이는, 내피세포의 Tmem100 과발현이 정맥에서 림프관 전구세포 및 LEC의 분화를 억제함으로써, 림프관 발달장애를 초래함을 제시한다.
<110> Gachon University of Industry-Academic cooperation Foundation
<120> An animal model of congenital lymphatic malformation and use
thereof
<130> 2019P-01-008
<160> 6
<170> KoPatentIn 3.0
<210> 1
<211> 405
<212> DNA
<213> Mus musculus
<400> 1
atgaccgaag aatccacaaa agagaacctg ggagctccaa aatctcccac acctgtgaca 60
atggagaaaa accccaagag ggaagttgtg gtcaccacgg gacccttggt cagcgaggtt 120
cagctgatgg ccgccaccgg gggtgccgaa ctctcctgct accgctgcat catccccttt 180
gccgtggtgg tcttcatcac tgggattgtg gtcaccgctg tggcttacag cttcaattcc 240
catggttcca tcatctccat cttcggcctg gtccttctgt cctccggact gtttttacta 300
gcctccagtg ccttgtgctg gaaggtgaga caaaggaaca agaaagtcaa gagacgcgag 360
agtcagaccg ctcttgtggt aaatcagagg tgcttgtttg cttaa 405
<210> 2
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tmem100 forward
<400> 2
gacaatggag aaaaacccca aga 23
<210> 3
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tmem100 reverse
<400> 3
gacaatggag aaaaacccca aga 23
<210> 4
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ROSA-GT2
<400> 4
catcaagctg atccggaacc ctta 24
<210> 5
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Tmem100-GT9
<400> 5
cgtggtgacc acaacttccc tctt 24
<210> 6
<211> 24
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> ROSA-GT4
<400> 6
tcattttggc aaagaattcc tcga 24
Claims (10)
- Tmem100(Transmembrane protein 100) 유전자가 녹아웃된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 마우스는 부위-특이적 재조합효소의 작용에 의하여 Tmem100 유전자가 녹아웃된 것인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제2항에 있어서, 상기 부위-특이적 재조합효소는 Cre 재조합효소인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 선천성 림프관 발달 이상은 확장된 림프관, 확장된 림프낭, 혈액이 찬(blood-filled) 림프관, 및 정맥과 림프관의 비정상적인 연결로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 수반하는 것인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제1항에 있어서, 상기 Tmem100 유전자는 서열번호 1로 기재되는 염기서열을 포함하는 것인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- Tmem100(Transmembrane protein 100) 유전자가 과발현된, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제6항에 있어서, 상기 마우스는 Tmem100 유전자를 포함하는 발현 벡터로 형질전환된 것인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 제6항에 있어서, 상기 선천성 림프관 발달 이상은 림프관 내피세포 수 감소, 림프관 수 감소, 림프관 크기 감소, 림프낭 수 감소, 림프낭의 크기 감소 및 피하 부종으로 구성되는 군으로부터 선택되는 어느 하나 이상의 증상을 수반하는 것인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스.
- 1) 프로모터, loxP 서열이 양 옆에 위치한 전사 중단 카세트(transcription stop cassette, tpA), Tmem100 유전자 및 폴리 A 서열(polyadenylation sequence)을 포함하는 벡터를 제작하는 단계;
2) 상기 단계 1)의 벡터를 마우스 배아줄기세포로 형질도입하여 상동 재조합체를 제조하는 단계;
3) 상기 단계 2)의 상동 재조합체를 마우스의 배반포에 주입하여 키메라 마우스를 제조하는 단계;
4) 상기 단계 3)의 키메라 마우스를 C57BL/6 마우스와 교배시켜 이형접합성(heterozygote, ROSA26+/Tmem100) 마우스를 제조하는 단계;
5) 상기 단계 4)의 이형접합성 마우스를 서로 교배시켜 동형접합성(homozygote, ROSA26Tmem100/Tmem100) 마우스를 제조하는 단계; 및
6) 상기 단계 3) 또는 단계 4)의 마우스를 Cre 재조합효소를 발현하는 마우스와 교배시켜 Tmem100 유전자가 과발현된 마우스를 제조하는 단계를 포함하는 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스의 제조방법.
- 제9항에 있어서, 상기 단계 1)의 프로모터는 CAGGS 프로모터인, 선천성 림프관 발달 이상 모델 마우스의 제조방법.
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| KR (1) | KR20200108159A (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022114617A1 (ko) * | 2020-11-27 | 2022-06-02 | 재단법인 국가마우스표현형분석사업단 | 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도 |
| CN117223676A (zh) * | 2023-09-25 | 2023-12-15 | 武汉大学 | 面中部发育畸形动物选育方法、辅助选育试剂和预防药物 |
-
2019
- 2019-03-06 KR KR1020190025962A patent/KR20200108159A/ko unknown
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| WO2022114617A1 (ko) * | 2020-11-27 | 2022-06-02 | 재단법인 국가마우스표현형분석사업단 | 염증 신호 생체 영상화 마우스 모델, 이의 제조방법 및 용도 |
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