CN117223676A - 面中部发育畸形动物选育方法、辅助选育试剂和预防药物 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种面中部发育畸形动物选育方法、辅助选育试剂和预防药物，该面中部发育畸形动物选育方法包括：使ca‑Acvr1flox动物和P0‑Cre动物分别自交，获得F1代动物；使F1代动物中ca‑Acvr1flox阳性表达的个体和P0‑Cre阳性表达的个体杂交，选育出面中部发育畸形动物；面中部发育畸形动物的基因型为ca‑Acvr1flox和P0‑Cre双阳性。基于此，本发明还提供了辅助选育面中部发育畸形动物的试剂。本发明的选育方法可为面中部发育畸形研究提供稳定有效的模型动物，基于该模型动物开发出早期诊断试剂盒、诊断仪器和靶向治疗药物。
Description
技术领域
本发明涉及动物发育畸形预防技术领域，特别涉及一种面中部发育畸形动物的选育方法、诊断试剂盒和仪器。
背景技术
面中部发育畸形是颅面部最常见的先天性缺陷之一，其中面中裂是最严重的缺陷，会增加患者的死亡率。面中部发育畸形损害患者的颅颌面外观、功能，严重影响患儿的身心健康。目前并无胚胎发育早期预测面中部发育畸形的方法，且其需要全生命周期的多次手术、正畸、语音及心理治疗，给家庭和社会带来严重的负担。因此，系统研究面中部发育畸形的发病机制、早期诊断指标、预防策略等显得尤为重要。
面中部的主体结构，包括骨、软骨等，均由来自神经管背侧的颅神经嵴细胞(cranial neural crest cells，CNCCs)衍化发育而来。在胚胎早期发育过程中，CNCCs与上皮细胞和间充质细胞组合构成面部突起结构，包括额鼻突、中鼻突、侧鼻突、上颌突和下颌突。中鼻突、侧鼻突及上颌突进一步发育形成面中部结构。BMP(骨形成蛋白)信号通路在胚胎发育过程中起关键作用。BMPs的功能主要是通过结合并磷酸化I型BMP受体介导。I型BMP受体包括BMPR1A、BMPR1B和ACVR1，它们和II型BMP受体形成异源受体复合物并与BMP配体结合，之后I型BMP受体的GS区磷酸化，致使细胞质中的Smad-1,-5,-8磷酸化并入核，进而调节下游信号。研究发现BMP配体及I型BMP受体在不同时期颅颌面组织呈现特异的时空表达模式,且BMP信号通路在下颌骨及颚发育过程中起重要作用。然而，BMP信号在面中部发育中的作用仍不清楚。目前尚未发现与ACVR1基因有关的面中部发育畸形的报道，相应的治疗方法也未展开过系统研究。
发明内容
本发明提供一种面中部发育畸形动物选育方法、辅助选育试剂和预防药物，本发明将ca-Acvr1flox小鼠和P0-Cre小鼠自交之后的显性子代杂交，获得ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性的面中部发育畸形动物，该选育方法可为面中部发育畸形研究提供稳定有效的模型动物，基于该模型动物可开发出早期诊断试剂盒、诊断仪器和靶向治疗药物。
第一方面，本发明提供一种面中部发育畸形动物选育方法，包括：
使ca-Acvr1flox动物和P0-Cre动物分别自交，获得F1代动物；
使F1代动物中ca-Acvr1flox阳性表达的个体和P0-Cre阳性表达的个体杂交，选育出面中部发育畸形动物；所述面中部发育畸形动物的基因型为ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性。
在上述技术方案的基础上，所述ca-Acvr1flox动物的基因型为ca-Acvr1flox/+；所述P0-Cre动物的基因型为P0-Cre(+)/(-)。
在上述技术方案的基础上，所述ca-Acvr1flox动物为Acvr1基因中插入条件激活ACVR1片段条件性过表达ca-Acvr1flox/+杂合动物；所述P0-Cre小鼠为P0基因启动子区域携带Cre元件的P0-Cre(+)/(-)杂合动物。
在上述技术方案的基础上，F1代动物中ca-Acvr1flox阳性表达的个体的基因型为ca-Acvr1flox/+或ca-Acvr1flox/flox；F1代动物中P0-Cre阳性表达的个体的基因型为P0-Cre(+)/(-)或P0-Cre(+)/(+)。
在上述技术方案的基础上，所述动物为哺乳动物，优选为鼠科动物，进一步优选为小白鼠。
在上述技术方案的基础上，所述面中部发育畸形动物选育方法还包括：
分别利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的检测引物去检测F1代动物的基因型，筛选出ca-Acvr1flox阳性表达的个体和P0-Cre阳性表达的个体。
第二方面，本发明提供辅助选育面中部发育畸形动物的试剂，包括如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的检测引物。
在上述技术方案的基础上，所述试剂还包括水、dNTP、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。
第三方面，本发明提供一种面中部发育畸形动物选育方法获得的面中部发育畸形动物在筛选预防或缓解动物面中部发育畸形药物中的应用。
第四方面，本发明提供BMP信号抑制剂在制备预防或缓解动物面中部发育畸形药物中的应用。
在上述技术方案的基础上，所述BMP信号抑制剂为LDN193189，优选的，预防或缓解动物面中部发育畸形药物为注射剂，用于检测出胎儿ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性的母体孕期腹腔注射。
本发明具有以下优点和有益效果：
本发明能选育出稳定的面中裂病理表型的动物模型，该动物模型及其子代可用于研究ACVR1基因在动物遗传性面中裂的作用机制，基于此模型可开发早期诊断试剂盒和仪器、筛选靶向预防药物以及进行疗效评价。
附图说明
图1为本发明实施例提供的面中部发育畸形动物选育方法的策略示意图；
图2为本发明实施例提供的PCR检测筛选结果图：包括单阳性的对照小鼠ca-Acvr1+/+和P0-Cre(+)/(-)的PCR基因鉴定结果和模型小鼠ca-Acvr1flox/+和P0-Cre(+)/(-)的PCR基因鉴定结果；
图3为本发明实施例提供的模型小鼠表型结果图，其中(A)为新生(NB)、胚胎发育第11.5天(E11.5)、E10.5小鼠大体正面图，(B)为E16.5腭部大体形态图，(C)为E15.5面中部组织学切片染色图；
图4为本发明实施例提供的模型小鼠BMP信号活性水平检测结果图，其中(A)为E11.5鼻突组织Acvr1 RNA Scope荧光染色结果，(B)为E11.5鼻突组织pSmad1/5/9免疫荧光染色结果，(C)为E11.5鼻突组织WesternBlot及定量结果；
图5为本发明实施例提供的孕期母鼠腹腔注射BMP信号抑制剂LDN193189挽救面中部发育畸形结果图，其中(A)为LDN193189孕鼠腹腔注射示意图，(B)为LDN193189挽救模型小鼠面中部表型结果图，(C)为LDN193189挽救模型小鼠效果分析结果图，(D)为LDN193189处理组模型小鼠鼻孔间距显著变小的结果图。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明的一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
需要说明的是：本发明中，“测量”、“测定”、“检测”或“检查”是指评价临床中给定物质或者对象衍生样品(包含这种物质的定性或定量浓度水平的衍生)的存在、不存在、数量或量(其能是有效量)，或另外评估对象的非分析物临床参数或临床-决定因素的值或分类。
本发明上下文中的“样本”是从对象中分离的生物样品，例如，包括但不限于，鼠尾、组织活检物、细胞学样品等。
本发明所述“治疗”表示减缓、中断、阻止、控制、停止、减轻、或逆转一种体征、症状、失调、病症、或疾病的进展或严重性，但不一定涉及所有疾病相关体征、症状、病症、或失调的完全消除。
本发明上下文中的数据均满足统计学要求(统计学显著)，所谓“统计学显著”指改变大于单独偶然发生可预期(可以是“假阳性”)。统计学显著能用本领域已知的任何方法测定。常用的显著性量度包括p值，其表示至少极限值在给定数据点获得结果的概率，假定该数据点是单独偶然结果。p值是0.05或更小时，通常认为结果具有显著性差异。
需要说明的是，以下实施例中未注明具体技术或者条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买获得的常规产品。
实施例1面中部发育畸形小鼠模型的构建
请参见图1，依据论文Generation ofanewmouse line with conditionallyactivated signaling through the BMPreceptor,ACVR1:Atool to characterizepleiotropic roles ofBMP functions在Acvr1基因中插入条件激活ACVR1片段(ACVR1-Q207D,ca-AVCR1)条件性过表达，获得ca-Acvr1flox/+小鼠；ca-Acvr1flox/+小鼠进行自交后获得ca-Acvr1flox-F1代小鼠(基因型为ca-Acvr1flox/+或ca-Acvr1flox/flox)。区分ca-Acvr1flox/+或ca-Acvr1flox/flox基因型所用到的检测引物如表1中SEQ ID NO.1至SEQ ID NO.4所示。
表1检测引物
| 引物编号 | 名称 | 引物 | 序列 |
| SEQ ID NO.1 | WT | F(5’to3’) | GAGGACGCAGTCCAGTACCT |
| SEQ ID NO.2 | WT | R(5’to3’) | TAGCCTCTGCCTCACGCCCTGC |
| SEQ ID NO.3 | ca-Acvr1 | F(5’to3’) | GTGCTGGTTATTGTGCTGTCTC |
| SEQ ID NO.4 | ca-Acvr1 | R(5’to3’) | GACGACAGTATCGGCCTCAGGAA |
依据论文Anovel transgenic technique that allows specific markingofthe neural crest cell lineage in mice用P0基因启动子区域携带Cre元件的P0-Cre(+)/(-)杂合小鼠，P0-Cre(+)/(-)杂合小鼠进行自交后获得P0-Cre-F1代小鼠(基因型为P0-Cre(+)/(-)或P0-Cre(+)/(+))，区分P0-Cre(+)/(-)和P0-Cre(+)/(+)基因型的检测引物如表2中SEQ ID NO.5至SEQ ID NO.8所示。
表2检测引物
| 引物编号 | 名称 | 引物 | 序列 |
| SEQ ID NO.5 | Control | F(5’to3’) | ATGCTAGACCTGGGCAGCCATA |
| SEQ ID NO.6 | Control | R(5’to3’) | CATGCTAGCAGCTCGGAGAAAC |
| SEQ ID NO.7 | Cre | F(5’to3’) | GAGTGATGAGGTTCGCAAGA |
| SEQ ID NO.8 | Cre | R(5’to3’) | CTACACCAGAGACGGAAATC |
将ca-Acvr1flox-F1代小鼠和P0-Cre-F1代小鼠进行杂交，得到F2代小鼠，包括以下四种基因型：ca-Acvr1flox/+和P0-Cre(+)/(-)，ca-Acvr1flox/+和P0-Cre(-)/(-)，ca-Acvr1+/+和P0-Cre(+)/(-)，Acvr1+/+和P0-Cre(-)/(-)。其中，ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性(基因型为ca-Acvr1flox/+和P0-Cre(+)/(-))的小鼠为面中部发育畸形小鼠，即模型小鼠。
本实施例中，所用的构建ca-Acvr1flox/+小鼠和P0-Cre(+)/(-)小鼠的技术为目前成熟的技术，在此不详细说明；同时，本发明对ca-Acvr1flox小鼠和P0-Cre小鼠的构建方法不做严格限制，在其他未示出的实施例中，还可以采用其他本领域技术人员所知晓的构建方法对ca-Acvr1flox小鼠和P0-Cre小鼠进行构建。
实施例2小鼠基因型分型检测
为获得ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性的模型小鼠，对ca-Acvr1flox-F1代小鼠和P0-Cre-F1代小鼠杂交后产生的F2代小鼠(包括胎鼠)进行剪尾，提取基因组DNA后进行PCR验证，目的条带应包括ca-Acvr1flox和Cre双条带，即包含引物序列如SEQ ID NO.3、SEQ IDNO.4及SEQ ID NO.7、SEQ ID NO.8中所示验证出的两条，即为模型小鼠，检测结果请参见图2。ca-Acvr1flox/+：PCR产物大小为580bp；WT：PCR产物大小为334bp。此外，P0-cre：PCR产物大小为696bp；Control：PCR产物大小为371bp。
在本实施例中，PCR的反应体系和反应条件分别如表3和表4所示，表3中的4种检测引物指的是表1中的4种检测引物或表2中的检测引物。
表3PCR反应体系
| 反应组分 | 体积(μL) |
| ddH2O | 13.9 |
| 10×TaqPCR缓冲液 | 2 |
| 2.5mMdNTP | 1 |
| 4种检测引物，均为10pmol/μL | 0.5 |
| TaqDNA聚合酶 | 0.1 |
| 基因组DNA | 1 |
| 总计 | 20 |
表4PCR反应条件
实施例3模型小鼠面中部形态及组织学分析
请参见图3，上述筛选出的模型小鼠具有明显的面中部裂表型，与单阳性的对照小鼠相比，模型小鼠呈现面中部裂隙贯通整个上唇、鼻孔间距增加(图3A)；组织学切片阿尔新兰染色和Safronin O染色显示鼻中隔分开(图3B)、颅骨整体茜素红阿尔新兰染色显示上颌骨长度变短(上颌发育不足)(图3C)等多方面异常，与已报道的人类面中裂有许多的相似之处，说明该模型小鼠是面中裂畸形的适用模型。
实施例4模型小鼠Acvr1基因及BMP信号激活水平分析
请参见图4，进一步利用组织学和分子生物学实验检测模型小鼠鼻突组织中Acvr1基因及BMP信号激活水平。
(1)RNA Scope检测结果提示，与单阳性的对照小鼠相比，模型小鼠鼻突组织中Acvr1基因表达显著增加(图4A)。
(2)免疫荧光检测结果提示，与单阳性的对照小鼠相比，模型小鼠鼻突组织中BMP信号下游pSmad1/5/9阳性细胞显著增加(图4B)。
(3)提取E11.5胎鼠鼻突组织，WesternBlot检测结果提示，与单阳性的对照小鼠相比，模型小鼠鼻突组织中Smad1/5/9磷酸化水平增加1倍左右，且有显著性差异(图4C)。
实施例5孕鼠腹腔注射BMP信号抑制剂对模型小鼠面中部畸形的预防作用分析
请参见图5，在面中部形态发生的关键时期E8.5-E11.5，向孕鼠腹腔注射BMP信号抑制剂LDN193189(图5A)，检测胎鼠面中部畸形的挽救情况。结果显示，LDN193189处理可挽救大部分的模型小鼠面中部畸形(图5B，5C)。与未处理组的模型小鼠相比，LDN193189处理组模型小鼠的鼻孔间距显著变小(图5D)。这些结果提示，在孕鼠体内注射药物可预防面中部畸形的发生。
以上所述仅是本发明的具体实施方式，使本领域技术人员能够理解或实现本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所申请的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
Claims (10)
1.一种面中部发育畸形动物选育方法，其特征在于，包括：
使ca-Acvr1flox动物和P0-Cre动物分别自交，获得F1代动物；
使F1代动物中ca-Acvr1flox阳性表达的个体和P0-Cre阳性表达的个体杂交，选育出面中部发育畸形动物；所述面中部发育畸形动物的基因型为ca-Acvr1flox和P0-Cre双阳性。
2.根据权利要求1所述的面中部发育畸形动物选育方法，其特征在于：所述ca-Acvr1flox动物为Acvr1基因中插入条件激活ACVR1片段条件性过表达ca-Acvr1flox/+杂合动物；所述P0-Cre小鼠为P0基因启动子区域携带Cre元件的P0-Cre(+)/(-)杂合动物。
3.根据权利要求1或2所述的面中部发育畸形动物选育方法，其特征在于：所述动物为鼠科动物。
4.根据权利要求1或2所述的面中部发育畸形动物选育方法，其特征在于：F1代动物中ca-Acvr1flox阳性表达的个体的基因型为ca-Acvr1flox/+或ca-Acvr1flox/flox；F1代动物中P0-Cre阳性表达的个体的基因型为P0-Cre(+)/(-)或P0-Cre(+)/(+)。
5.根据权利要求1所述的面中部发育畸形动物选育方法，其特征在于：所述面中部发育畸形动物选育方法还包括：
分别利用SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的检测引物去检测F1代动物的基因型，筛选出ca-Acvr1flox阳性表达的个体和P0-Cre阳性表达的个体。
6.一种辅助选育面中部发育畸形动物的试剂，其特征在于：包括如SEQ ID NO.1～SEQID NO.4或SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.5所示的检测引物。
7.根据权利要求6所述的辅助选育面中部发育畸形动物的试剂，其特征在于：所述试剂还包括水、dNTP、Taq DNA聚合酶和PCR缓冲液。
8.权利要求1～4任一项所述的面中部发育畸形动物选育方法获得的面中部发育畸形动物在筛选预防或缓解动物面中部发育畸形药物中的应用。
9.BMP信号抑制剂在制备预防或缓解动物面中部发育畸形药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于：所述BMP信号抑制剂为LDN193189。
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