CN114736287B - 低致敏性α-乳白蛋白及其制备方法和应用 - Google Patents

低致敏性α-乳白蛋白及其制备方法和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一种低致敏性重组α‑乳白蛋白、编码该重组α‑乳白蛋白的基因、插入有该基因的重组表达载体、导入有该重组表达载体的转化体、制备该优质重组α‑乳白蛋白的方法以及一种人造乳应用。本发明得到了致敏性几乎消失的重组α‑乳白蛋白，可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。

Description

低致敏性α-乳白蛋白及其制备方法和应用
技术领域
本申请涉及生物技术领域，具体地，涉及一种低致敏性重组α-乳白蛋白、编码该重组α-乳白蛋白的基因、插入有该基因的重组表达载体、导入有该重组表达载体的转化体、制备该优质重组α-乳白蛋白的方法以及一种人造乳应用。
背景技术
目前，乳制品的需求量不断增加，天然动物奶及其乳制品是最理想的蛋白营养来源，其营养成分主要是乳蛋白，同时还含有生物活性肽、脂肪、乳糖、维生素和矿物质等。
但是，因含有各种致敏原，天然动物奶是婴幼儿群体中排在首位的致敏源食物。牛奶及其乳制品是FAO和WHO认定的导致人类食物过敏的主要食品之一。目前，牛奶中已知的主要致敏原包括αS1-酪蛋白、αS2-酪蛋白、β-酪蛋白、κ-酪蛋白、β乳球蛋白和α-乳白蛋白等。
α-乳白蛋白的单个多肽链包含123个氨基酸残基，并含有通过4个二硫键共价连接的8个半胱氨酸，全部分子质量为14186Da，等离子点(pI)为4.8。α-乳白蛋白发现于3个主要哺乳动物的分支中：真哺乳亚纲动物、有袋类动物、产卵单孔类动物。来源不同哺乳动物的α-乳白蛋白带有121-123个氨基酸残基的多肽链并在大小上相似，除含有17个氨基酸C端延伸和140个残基链长的鼠乳α-乳白蛋白外；所有阴离子蛋白质pI为4.4-5.1。
α-乳白蛋白是牛乳清中第二大丰富的蛋白质，在乳中浓度大约为1mg/mL。α-乳白蛋白不仅仅具有营养功能，而且也是乳糖合成酶(EC2.4.1.22)的重要成分，它催化乳中主要碳水化合物-乳糖的合成。
目前，野生型的α-乳白蛋白仍然具有较高的致过敏性。
发明内容
本发明的目的在于降低α-乳白蛋白的致过敏性。
本发明的发明人通过对α-乳白蛋白的序列和晶体结构进行分析，基于多序列比对和系统发育分析，利用同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化，实现基于应用属性的乳蛋白序列全局优化，得到了具有较低致过敏性的α-乳白蛋白。
为了实现上述目的，本发明提供了一种具有低致敏性的重组α-乳白蛋白，所述重组α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码如上所述的重组α-乳白蛋白的基因。
可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组α-乳白蛋白的表达框。
可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。
可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。
本发明还提供了一种制备如上所述重组α-乳白蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组α-乳白蛋白。
可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组α-乳白蛋白。
优选地，所述人造乳还含有SEQ ID NO.4所示的β-酪蛋白和/或SEQ ID NO.5所示的κ-酪蛋白。
通过上述技术方案，本发明得到了致敏性几乎消失的重组α-乳白蛋白，可以用于制备具有更高应用价值的人造乳制品。
本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式部分予以详细说明。
附图说明
附图是用来提供对本发明的进一步理解，并且构成说明书的一部分，与下面的具体实施方式一起用于解释本发明，但并不构成对本发明的限制。在附图中：
图1为α-乳白蛋白致敏表位分析。A，α-乳白蛋白的三级结构；B，α-乳白蛋白的二级结构；C，α-乳白蛋白致敏表位。
图2为乳蛋白表达载体的构建示意图。
图3为α-乳白蛋白的表达纯化结果。M，标准分子量；1，α-乳白蛋白LA；2，人工重组α-乳白蛋白AFLA。
图4为重组α-乳白蛋白的致敏性ELISA检测分析结果。
序列表说明
SEQ ID NO.1，人工优化α-乳白蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO.2，人工优化α-乳白蛋白的核酸序列；
SEQ ID NO.3，人工优化α-乳白蛋白的重组表达载体核酸序列；
SEQ ID NO.4，人工优化β-酪蛋白的氨基酸序列；
SEQ ID NO.5，人工优化κ-酪蛋白的氨基酸序列。
具体实施方式
以下对本发明的具体实施方式进行详细说明。应当理解的是，此处所描述的具体实施方式仅用于说明和解释本发明，并不用于限制本发明。
本发明提供了一种具有低致敏性的重组α-乳白蛋白，所述重组α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
本发明还提供了编码如上所述的重组α-乳白蛋白的基因。
可选地，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明还提供了一种重组表达载体，该重组表达载体插入有如上所述的基因并形成表达如上所述的重组α-乳白蛋白的表达框。
可选地，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。
本发明还提供了一种转化体，所述转化体导入有如上所述的重组表达载体。
可选地，其中，所述转化体的宿主为毕赤酵母。
本发明还提供了一种制备如上所述重组α-乳白蛋白的方法，该方法包括：将如上所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组α-乳白蛋白。
可选地，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20g/L的酵母提取物、1-2g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6mg/L的生物素和2-10mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90小时。
本发明还提供了一种人造乳，其中，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括如上所述的重组α-乳白蛋白。
优选地，所述人造乳还含有SEQ ID NO.4所示的β-酪蛋白和/或SEQ ID NO.5所示的κ-酪蛋白。
以下通过实施例进一步详细说明本发明。实施例中所用到的原材料均可通过商购途径获得。表达载体pPIC9K-His：为淼灵生物公司市售产品；酵母表达菌株GS115：为淼灵生物公司市售产品。
实施例1乳蛋白致敏原的删除与结构优化
数据库获取牦牛、水牛、山羊、骆驼等不同物种α-乳白蛋白序列。通过Emini-Surface Probability方法进行分析乳蛋白的表面可及性；通过Jameson-Wolf的方法计算抗原指数氨基酸区域。
利用全序列比对法比较等致敏性乳蛋白与致敏原序列相似性，比对牦牛、水牛、山羊、骆驼乳蛋白的致敏原与构象性表位的结构基序组成与定位，获得乳蛋白致敏原的保守结构域。
结合分子生物学Swissprot数据库中乳蛋白的晶体数据进行结构分析。基于多序列比对和系统发育分析，利用Schema同源结构元件交叉重组策略对乳蛋白按功能域分割与创建重组蛋白文库，替换或消除致敏序列和表观位点，计算蛋白分子自由能稳定系数，完成乳蛋白进行理性设计与定向进化。
基于乳蛋白的性质特征，选择亲水性好、表面可及性和可塑性较高且抗原指数较高的区域作为DNAStar预测的结构，所以通过DNAstar Protean软件预测高原牦牛α-乳白蛋白(图1)的残基表位。研究结果显示，高原牦牛α-乳白蛋白的抗原表位为7-18、37-46、62-72、93-102。利用同源结构交叉重组策略对乳蛋白进行优化，去除乳蛋白致敏性线性表位，完成人工优化α-乳白蛋白的理性设计与定向进化，得到SEQ ID NO.1所示的重组α-乳白蛋白。
实施例2重组α-乳白蛋白在酵母中的高效生物合成
针对酵母细胞工厂表达特性对优化乳蛋白的DNA编码序列进行密码子优化。利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因AF-LA。
将人工优化的乳蛋白基因两端添加限制性内切酶EcoRI与NotI序列连接酵母表达载体pPIC9K-His多克隆位点中。将连接产物热激转化大肠杆菌感受态细胞并涂布含氨苄青霉素抗性的LB平板，筛选含有重组表达质粒的菌株。
利用限制性内切酶SacI切割将验证正确的阳性重组表达载体，制备线性化质粒DNA，电击转化毕赤酵母GS115中。利用遗传霉素抗性平板筛选阳性重组酵母菌株，并利用PCR进行鉴定。研究结果显示，成功构建了优化α-乳白蛋白酵母表达菌株GS-AFLA。同样方法获得天然α-乳白蛋白表达菌株。
挑取乳蛋白表达菌株至种子液培养基中，30℃培养20小时，以2％浓度转接与100mL发酵培养基中，30℃转速220rpm摇瓶发酵72小时，每隔24h补加一次甲醇。离心收集发酵上清液，利用人工乳蛋白的His-Tag，Ni-NTA-resin纯化柱纯化乳蛋白，通过SDS-PAGE蛋白电泳检测靶标乳蛋白的表达情况。
本实施例中，利用化学合成法合成优化后乳蛋白编码基因AF-LA(序列如SEQ IDNO.2)。通过表达载体构建与酵母转化(图2)，成功构建优化的α球乳白蛋白酵母表达菌株GS-LA。通过摇瓶发酵诱导α-乳白蛋白异源表达。结果显示，重组α-乳白蛋白在胞外大量表达(图3)。
实施例3重组α-乳白蛋白的ELISA致敏性分析
用CBS溶液将重组α-乳白蛋白样品稀释至5μg/mL，将每种样品100μL置于96孔板中，并在4℃下包被过夜。
用Tween 20/PBS(PBS-T)洗涤4次后，添加350μL 5％脱脂奶粉，并在37℃下孵育1小时。再次洗涤，然后添加BSA稀释的变应原血清(1：500)，并在室温下孵育3小时。洗涤后，将100μL过氧化物酶标记的山羊抗人/大鼠IgE抗体(1：5000)添加到孔中，然后在室温下孵育板1h。
用PBS-T洗涤5次并用PBS洗涤3次后，将200μL TMB溶液添加至孔中30分钟，然后使用50μL 2M H2SO4终止反应。
用分光光度计在450nm下测量值。对非过敏性血清进行相同的步骤，以确定非特异性结合的程度，将其从测试血清数据中减去。对每个样品进行三个平行实验，并将平均值作为最终数据。
通过ELISA体外免疫实验对构建表达的人工优化乳蛋白进行致敏性表征。利用乳蛋白抗体血清对野生型乳蛋白与人工优化乳蛋白进行致敏性分析。研究结果显示，原始α-乳白蛋白具有强的IgE结合能力，而经过结构序列人工优化乳蛋白的结合能力显著降低或几近消失(图4)。其中，人工优化的重组α-乳白蛋白AF-LA的IgE结合能力降低了98.68％，应变反应与阴性空白对照相似，蛋白致敏性几近消失。研究结果显示，人工优化α-乳白蛋白成功地降低了变应原性。
本发明利用合成生物学方法人工设计构建了低致敏性的优化的重组α-乳白蛋白，提高乳蛋白的应用性能，实现靶标乳蛋白全局优化与生物合成，能够用于食品、保健品、医疗、饲料及蛋白产品等领域。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合。为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
此外，本发明的各种不同的实施方式之间也可以进行任意组合，只要其不违背本发明的思想，其同样应当视为本发明所公开的内容。
序列表
<110> 中国农业科学院生物技术研究所
<120> 低致敏性α-乳白蛋白及其制备方法和应用
<130> 26009CAAS-B-ZW
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 123
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Glu Gln Leu Thr Lys Cys Glu Leu Ser Gln Leu Leu Lys Asp Ile Asp
1 5 10 15
Gly Tyr Gly Gly Val Ser Leu Pro Glu Trp Val Cys Thr Thr Phe His
20 25 30
Thr Ser Gly Tyr Asp Thr Gln Ala Ile Val Glu Asn Asn Glu Ser Thr
35 40 45
Glu Tyr Gly Leu Phe Gln Ile Asn Asn Lys Ile Trp Cys Lys Ser Ser
50 55 60
Gln Val Pro Gln Ser Arg Asn Ile Cys Asn Ile Ser Cys Asp Lys Phe
65 70 75 80
Leu Asp Asp Asp Leu Thr Asp Asp Ile Met Cys Val Lys Lys Ile Leu
85 90 95
Asp Ile Lys Gly Ile Asp Tyr Trp Leu Ala His Lys Ala Leu Cys Ser
100 105 110
Glu Lys Leu Asp Gln Trp Leu Cys Glu Lys Leu
115 120
<210> 2
<211> 387
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
gaacaactga cgaaatgcga attgtctcaa ctgctgaaag acatagatgg ttatggtggt 60
gtttccctgc cagaatgggt ctgtactacc tttcatacat ccggttacga cacccaagct 120
attgtggaga acaatgagag taccgagtac ggattgttcc aaatcaataa caagatttgg 180
tgcaaatctt ctcaagtacc acagtccaga aacatctgta acattagttg cgacaaattc 240
ctggatgacg atctgaccga tgacatcatg tgtgttaaga agatcttaga tattaaggga 300
attgactact ggttggccca caaggccttg tgttccgaaa aacttgatca atggctttgc 360
gagaagctgc atcatcacca tcaccat 387
<210> 3
<211> 9675
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
agatctaaca tccaaagacg aaaggttgaa tgaaaccttt ttgccatccg acatccacag 60
gtccattctc acacataagt gccaaacgca acaggagggg atacactagc agcagaccgt 120
tgcaaacgca ggacctccac tcctcttctc ctcaacaccc acttttgcca tcgaaaaacc 180
agcccagtta ttgggcttga ttggagctcg ctcattccaa ttccttctat taggctacta 240
acaccatgac tttattagcc tgtctatcct ggcccccctg gcgaggttca tgtttgttta 300
tttccgaatg caacaagctc cgcattacac ccgaacatca ctccagatga gggctttctg 360
agtgtggggt caaatagttt catgttcccc aaatggccca aaactgacag tttaaacgct 420
gtcttggaac ctaatatgac aaaagcgtga tctcatccaa gatgaactaa gtttggttcg 480
ttgaaatgct aacggccagt tggtcaaaaa gaaacttcca aaagtcgcca taccgtttgt 540
cttgtttggt attgattgac gaatgctcaa aaataatctc attaatgctt agcgcagtct 600
ctctatcgct tctgaacccc ggtgcacctg tgccgaaacg caaatgggga aacacccgct 660
ttttggatga ttatgcattg tctccacatt gtatgcttcc aagattctgg tgggaatact 720
gctgatagcc taacgttcat gatcaaaatt taactgttct aacccctact tgacagcaat 780
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actttcataa ttgcgactgg ttccaattga caagcttttg attttaacga cttttaacga 900
caacttgaga agatcaaaaa acaactaatt attcgaagga tccaaacgat gagatttcct 960
tcaattttta ctgcagtttt attcgcagca tcctccgcat tagctgctcc agtcaacact 1020
acaacagaag atgaaacggc acaaattccg gctgaagctg tcatcggtta ctcagattta 1080
gaaggggatt tcgatgttgc tgttttgcca ttttccaaca gcacaaataa cgggttattg 1140
tttataaata ctactattgc cagcattgct gctaaagaag aaggggtatc tctcgagaaa 1200
agagaggctg aagcttacgt agaattcgaa caactgacga aatgcgaatt gtctcaactg 1260
ctgaaagaca tagatggtta tggtggtgtt tccctgccag aatgggtctg tactaccttt 1320
catacatccg gttacgacac ccaagctatt gtggagaaca atgagagtac cgagtacgga 1380
ttgttccaaa tcaataacaa gatttggtgc aaatcttctc aagtaccaca gtccagaaac 1440
atctgtaaca ttagttgcga caaattcctg gatgacgatc tgaccgatga catcatgtgt 1500
gttaagaaga tcttagatat taagggaatt gactactggt tggcccacaa ggccttgtgt 1560
tccgaaaaac ttgatcaatg gctttgcgag aagctgcatc atcaccatca ccatgcggcc 1620
gcgaatcatc atcaccatca ccattaattc gccttagaca tgactgttcc tcagttcaag 1680
ttgggcactt acgagaagac cggtcttgct agattctaat caagaggatg tcagaatgcc 1740
atttgcctga gagatgcagg cttcattttt gatacttttt tatttgtaac ctatatagta 1800
taggattttt tttgtcattt tgtttcttct cgtacgagct tgctcctgat cagcctatct 1860
cgcagctgat gaatatcttg tggtaggggt ttgggaaaat cattcgagtt tgatgttttt 1920
cttggtattt cccactcctc ttcagagtac agaagattaa gtgagaagtt cgtttgtgca 1980
agcttatcga taagctttaa tgcggtagtt tatcacagtt aaattgctaa cgcagtcagg 2040
caccgtgtat gaaatctaac aatgcgctca tcgtcatcct cggcaccgtc accctggatg 2100
ctgtaggcat aggcttggtt atgccggtac tgccgggcct cttgcgggat atcgtccatt 2160
ccgacagcat cgccagtcac tatggcgtgc tgctagcgct atatgcgttg atgcaatttc 2220
tatgcgcacc cgttctcgga gcactgtccg accgctttgg ccgccgccca gtcctgctcg 2280
cttcgctact tggagccact atcgactacg cgatcatggc gaccacaccc gtcctgtgga 2340
tctatcgaat ctaaatgtaa gttaaaatct ctaaataatt aaataagtcc cagtttctcc 2400
atacgaacct taacagcatt gcggtgagca tctagacctt caacagcagc cagatccatc 2460
actgcttggc caatatgttt cagtccctca ggagttacgt cttgtgaagt gatgaacttc 2520
tggaaggttg cagtgttaac tccgctgtat tgacgggcat atccgtacgt tggcaaagtg 2580
tggttggtac cggaggagta atctccacaa ctctctggag agtaggcacc aacaaacaca 2640
gatccagcgt gttgtacttg atcaacataa gaagaagcat tctcgatttg caggatcaag 2700
tgttcaggag cgtactgatt ggacatttcc aaagcctgct cgtaggttgc aaccgatagg 2760
gttgtagagt gtgcaataca cttgcgtaca atttcaaccc ttggcaactg cacagcttgg 2820
ttgtgaacag catcttcaat tctggcaagc tccttgtctg tcatatcgac agccaacaga 2880
atcacctggg aatcaatacc atgttcagct tgagacagaa ggtctgaggc aacgaaatct 2940
ggatcagcgt atttatcagc aataactaga acttcagaag gcccagcagg catgtcaata 3000
ctacacaggg ctgatgtgtc attttgaacc atcatcttgg cagcagtaac gaactggttt 3060
cctggaccaa atattttgtc acacttagga acagtttctg ttccgtaagc catagcagct 3120
actgcctggg cgcctcctgc tagcacgata cacttagcac caaccttgtg ggcaacgtag 3180
atgacttctg gggtaagggt accatccttc ttaggtggag atgcaaaaac aatttctttg 3240
caaccagcaa ctttggcagg aacacccagc atcagggaag tggaaggcag aattgcggtt 3300
ccaccaggaa tatagaggcc aactttctca ataggtcttg caaaacgaga gcagactaca 3360
ccagggcaag tctcaacttg caacgtctcc gttagttgag cttcatggaa tttcctgacg 3420
ttatctatag agagatcaat ggctctctta acgttatctg gcaattgcat aagttcctct 3480
gggaaaggag cttctaacac aggtgtcttc aaagcgactc catcaaactt ggcagttagt 3540
tctaaaaggg ctttgtcacc attttgacga acattgtcga caattggttt gactaattcc 3600
ataatctgtt ccgttttctg gataggacga cgaagggcat cttcaatttc ttgtgaggag 3660
gccttagaaa cgtcaatttt gcacaattca atacgacctt cagaagggac ttctttaggt 3720
ttggattctt ctttaggttg ttccttggtg tatcctggct tggcatctcc tttccttcta 3780
gtgaccttta gggacttcat atccaggttt ctctccacct cgtccaacgt cacaccgtac 3840
ttggcacatc taactaatgc aaaataaaat aagtcagcac attcccaggc tatatcttcc 3900
ttggatttag cttctgcaag ttcatcagct tcctccctaa ttttagcgtt caacaaaact 3960
tcgtcgtcaa ataaccgttt ggtataagaa ccttctggag cattgctctt acgatcccac 4020
aaggtggctt ccatggctct aagacccttt gattggccaa aacaggaagt gcgttccaag 4080
tgacagaaac caacacctgt ttgttcaacc acaaatttca agcagtctcc atcacaatcc 4140
aattcgatac ccagcaactt ttgagttgct ccagatgtag cacctttata ccacaaaccg 4200
tgacgacgag attggtagac tccagtttgt gtccttatag cctccggaat agactttttg 4260
gacgagtaca ccaggcccaa cgagtaatta gaagagtcag ccaccaaagt agtgaataga 4320
ccatcggggc ggtcagtagt caaagacgcc aacaaaattt cactgacagg gaactttttg 4380
acatcttcag aaagttcgta ttcagtagtc aattgccgag catcaataat ggggattata 4440
ccagaagcaa cagtggaagt cacatctacc aactttgcgg tctcagaaaa agcataaaca 4500
gttctactac cgccattagt gaaacttttc aaatcgccca gtggagaaga aaaaggcaca 4560
gcgatactag cattagcggg caaggatgca actttatcaa ccagggtcct atagataacc 4620
ctagcgcctg ggatcatcct ttggacaact ctttctgcca aatctaggtc caaaatcact 4680
tcattgatac cattattgta caacttgagc aagttgtcga tcagctcctc aaattggtcc 4740
tctgtaacgg atgactcaac ttgcacatta acttgaagct cagtcgattg agtgaacttg 4800
atcaggttgt gcagctggtc agcagcatag ggaaacacgg cttttcctac caaactcaag 4860
gaattatcaa actctgcaac acttgcgtat gcaggtagca agggaaatgt catacttgaa 4920
gtcggacagt gagtgtagtc ttgagaaatt ctgaagccgt atttttatta tcagtgagtc 4980
agtcatcagg agatcctcta cgccggacgc atcgtggccg acctgcaggg gggggggggg 5040
cgctgaggtc tgcctcgtga agaaggtgtt gctgactcat accaggcctg aatcgcccca 5100
tcatccagcc agaaagtgag ggagccacgg ttgatgagag ctttgttgta ggtggaccag 5160
ttggtgattt tgaacttttg ctttgccacg gaacggtctg cgttgtcggg aagatgcgtg 5220
atctgatcct tcaactcagc aaaagttcga tttattcaac aaagccgccg tcccgtcaag 5280
tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat 5340
cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa 5400
aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact caccgaggca gttccatagg atggcaagat 5460
cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc caacatcaat acaacctatt aatttcccct 5520
cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga 5580
atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt 5640
catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac 5700
gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca 5760
ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt cacctgaatc aggatattct tctaatacct 5820
ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga 5880
taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct 5940
catctgtaac atcattggca acgctacctt tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat 6000
cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc 6060
atttataccc atataaatca gcatccatgt tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg 6120
tttcccgttg aatatggctc ataacacccc ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt 6180
ttattgttca tgatgatata tttttatctt gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca 6240
caacgtggct ttcccccccc cccctgcagg tcggcatcac cggcgccaca ggtgcggttg 6300
ctggcgccta tatcgccgac atcaccgatg gggaagatcg ggctcgccac ttcgggctca 6360
tgagcgcttg tttcggcgtg ggtatggtgg caggccccgt ggccggggga ctgttgggcg 6420
ccatctcctt gcatgcacca ttccttgcgg cggcggtgct caacggcctc aacctactac 6480
tgggctgctt cctaatgcag gagtcgcata agggagagcg tcgagtatct atgattggaa 6540
gtatgggaat ggtgataccc gcattcttca gtgtcttgag gtctcctatc agattatgcc 6600
caactaaagc aaccggagga ggagatttca tggtaaattt ctctgacttt tggtcatcag 6660
tagactcgaa ctgtgagact atctcggtta tgacagcaga aatgtccttc ttggagacag 6720
taaatgaagt cccaccaata aagaaatcct tgttatcagg aacaaacttc ttgtttcgaa 6780
ctttttcggt gccttgaact ataaaatgta gagtggatat gtcgggtagg aatggagcgg 6840
gcaaatgctt accttctgga ccttcaagag gtatgtaggg tttgtagata ctgatgccaa 6900
cttcagtgac aacgttgcta tttcgttcaa accattccga atccagagaa atcaaagttg 6960
tttgtctact attgatccaa gccagtgcgg tcttgaaact gacaatagtg tgctcgtgtt 7020
ttgaggtcat ctttgtatga ataaatctag tctttgatct aaataatctt gacgagccaa 7080
ggcgataaat acccaaatct aaaactcttt taaaacgtta aaaggacaag tatgtctgcc 7140
tgtattaaac cccaaatcag ctcgtagtct gatcctcatc aacttgaggg gcactatctt 7200
gttttagaga aatttgcgga gatgcgatat cgagaaaaag gtacgctgat tttaaacgtg 7260
aaatttatct caagatctct gcctcgcgcg tttcggtgat gacggtgaaa acctctgaca 7320
catgcagctc ccggagacgg tcacagcttg tctgtaagcg gatgccggga gcagacaagc 7380
ccgtcagggc gcgtcagcgg gtgttggcgg gtgtcggggc gcagccatga cccagtcacg 7440
tagcgatagc ggagtgtata ctggcttaac tatgcggcat cagagcagat tgtactgaga 7500
gtgcaccata tgcggtgtga aataccgcac agatgcgtaa ggagaaaata ccgcatcagg 7560
cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg 7620
gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga 7680
aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 7740
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 7800
aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 7860
gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 7920
ggaagcgtgg cgctttctca atgctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 7980
cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 8040
ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 8100
actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 8160
tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 8220
gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 8280
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 8340
cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt 8400
ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt 8460
tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc 8520
agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc 8580
gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata 8640
ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg 8700
gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc 8760
cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct 8820
gcaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa 8880
cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt 8940
cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca 9000
ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac 9060
tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca 9120
acacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt 9180
tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc 9240
actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca 9300
aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata 9360
ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc 9420
ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc 9480
cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat 9540
aggcgtatca cgaggccctt tcgtcttcaa gaattaattc tcatgtttga cagcttatca 9600
tcgataagct gactcatgtt ggtattgtga aatagacgca gatcgggaac actgaaaaat 9660
aacagttatt attcg 9675
<210> 4
<211> 211
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Arg Glu Thr Ile Glu Ser Leu Ser Ser Ser Glu Glu Ser Ile Thr Arg
1 5 10 15
Ile Asn Lys Lys Ile Glu Lys Phe Gln Ser Glu Glu Gln Gln Gln Thr
20 25 30
Glu Asp Gly Leu Gln Asp Lys Ile His Pro Phe Ala Gln Pro Gln Pro
35 40 45
Leu Ile Tyr Pro Phe Val Glu Pro Ile Pro Tyr Gly Phe Leu Pro Gln
50 55 60
Asn Ile Pro Pro Leu Thr Gln Pro Ala Val Val Leu Pro Val Pro Gln
65 70 75 80
Pro Glu Ile Met Gly Val Ser Lys Val Lys Glu Ala Met Ala Pro Lys
85 90 95
His Arg Val Met Pro Val Leu Lys Ser Pro Thr Ile Pro Phe Phe Glu
100 105 110
Ser Gln Ser Leu Thr Leu Thr Asp Val Glu Asn Leu His Leu Pro Leu
115 120 125
Pro Leu Leu Gln Ser Trp Met His Gln Pro His Gln Pro Leu Pro Pro
130 135 140
Thr Val Met Phe Pro Pro Gln Ser Val Leu Ser Leu Ser Gln Ser Lys
145 150 155 160
Val Leu Pro Val Pro Gln Lys Ala Val Pro Tyr Pro Gln Arg Asp Val
165 170 175
Pro Val Gln Ala Leu Leu Leu Asn Gln Glu Leu Leu Leu Asn Pro Thr
180 185 190
His Gln Ile Tyr Pro Val Thr Gln Pro Leu Ala Pro Val His Asn Pro
195 200 205
Ile Ser Val
210
<210> 5
<211> 161
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Gln Glu Gln Asn Gln Glu Gln Pro Ala Cys His Glu Asn Asp Glu Arg
1 5 10 15
Pro Phe Tyr Gln Lys Thr Ala Pro Tyr Ile Pro Ile Gln Tyr Val Leu
20 25 30
Ser Arg Tyr Pro Tyr Tyr Gly Thr Asn Leu Tyr Gln Arg Arg Pro Val
35 40 45
Ala Leu Ile Asn Asn Gln Phe Leu Pro Arg Thr Tyr Tyr Ala Asn Pro
50 55 60
Ala Val Val Arg Pro His Ala Gln Ile Pro Gln Arg Gln Tyr Leu Ser
65 70 75 80
Asn Ser His Pro Pro Thr Val Val Arg Arg Pro His Pro His Leu Ser
85 90 95
Phe Met Ala Ile Pro Pro Lys Lys Asn Gln Asp Lys Thr Glu Ile Pro
100 105 110
Thr Ile Asn Thr Ile Ala Ser Gly Glu Pro Thr Ser Thr Pro Thr Thr
115 120 125
Glu Pro Thr Val Asp Ser Val Val Thr Pro Glu Ala Phe Ser Glu Ser
130 135 140
Ile Ile Thr Ser Pro Glu Ile Asn Thr Val Gln Val Thr Ser Thr Ala
145 150 155 160
Val

Claims (11)

1.一种具有低致敏性的重组α-乳白蛋白，其特征在于，所述重组α-乳白蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO. 1所示。
2.编码权利要求1所述的重组α-乳白蛋白的基因。
3.根据权利要求2所述的基因，其中，所述基因的核苷酸序列如SEQ ID NO. 2所示。
4.一种重组表达载体，其特征在于，该重组表达载体插入有权利要求2或3所述的基因并形成表达权利要求1所述的重组α-乳白蛋白的表达框。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其中，所述重组表达载体的核苷酸序列如SEQID NO. 3所示。
6.一种转化体，其特征在于，所述转化体导入有权利要求4或5所述的重组表达载体。
7.根据权利要求6所述的转化体，其中，所述转化体为毕赤酵母。
8.一种制备权利要求1所述重组α-乳白蛋白的方法，其特征在于，该方法包括：将权利要求6或7所述的转化体进行培养，得到培养后的物料，并且从所述培养后的物料中纯化所述重组α-乳白蛋白。
9.根据权利要求8所述的方法，其中，所述培养的条件包括：培养基的成分包括10-30g/L的蛋白胨、5-20 g/L的酵母提取物、1-2 g/L的无氨基酵母氮源、0.2-0.6 mg/L的生物素和2-10 mL/L的甲醇；培养的温度为25-35℃、时间为60-90 小时。
10.一种人造乳，其特征在于，所述人造乳含有蛋白质和水，所述蛋白质包括权利要求1所述的重组α-乳白蛋白。
11.根据权利要求10所述人造乳，其中，所述人造乳含有的蛋白质还有SEQ ID NO.4所示的β-酪蛋白和/或SEQ ID NO.5所示的κ-酪蛋白。
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