AT509050B1 - Hydrolase-aktivator aus trichoderma reesei - Google Patents

Abstract

Beschrieben wird ein isoliertes Hydrolase-Aktivator-Gen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Seq.ID.Nr.2 und Verfahren zur Kultivierung von Trichoderma unter Verwendung einer modifizierten Aktivität dieses Hydrolase-Aktivators.

Description

österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

Beschreibung [0001] Die Erfindung betrifft einen Hydrolasen-Aktivator aus Trichoderma reesei.

[0002] Zellulose und Xylan zählen zu den wichtigsten nachwachsenden Rohstoffen weltweit. Werden diese Biopolymere depolymerisiert, entstehen Zuckermonomere wie Glukose, Xylose oder Arabinose, die ihrerseits für eine Vielzahl von Industrieprozessen als Ausgangsstoffe dienen.

[0003] Trichoderma ist ein filamentöser Pilz, der in natürlichen Systemen die zuvor genannten Biopolymere abbaut und die entstandenen Monosaccharide anschließend als Nährquelle verwertet. Für diesen Abbau hat Trichoderma ein Spektrum an verschiedenen hydrolytischen Enzymen (Hydrolasen) zur Verfügung, welche unter entsprechend induzierenden Bedingungen gebildet werden.

[0004] Trichoderma nimmt auf Grund seiner extrem hohen sekretorischen Leistung bei der industriellen Enzymproduktion eine Sonderstellung ein, die ihn zu einem vielfach eingesetzten Mikroorganismus in der Biotechnologie-Industrie gemacht hat.

[0005] Der Einsatz von Enzymen aus Trichoderma erstreckt sich dabei von der Textilindustrie über die Nahrungsmittel- und Futtermittelindustrie, die Papierindustrie bis hin zur Gewinnung von Biotreibstoffen der zweiten Generation. Bei nahezu allen Anwendungen ist es nicht nur essentiell, hohe Enzymmengen produzieren zu können, sondern auch entsprechend auf die Zusammensetzung der Enzymcocktails einwirken zu können. Auch ziehen viele gentechnische Ansätze derzeit darauf ab, die Enzymproduktion in Trichoderma Nährstoffquellen-unabhängig anregen zu können.

[0006] Ein wichtiger Regulator für das hydrolytische Enzymsystem in Trichoderma ist der Xyla-nase Regulator 1 (Xyr1), welcher sowohl das hydrolytische Enzymsystem als auch den D-Xylose-Abbau reguliert (Stricker et al., Euk. Cell 5 (2006) 2128-2137). Xyr1 hat auch Homologe in anderen eukaryontischen Organismen, z.B. in Aspergillus.

[0007] Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist die Bereitstellung von geeigneten Mitteln zur Regulierung der Hydrolaseaktivität in Trichoderma. Derartige Mittel sollten vorzugsweise geeignet bzw. adaptierbar sein, die Hydrolaseaktivität in Trichoderma sowohl hinauf- als auch hinunterzuregulieren. Insbesondere sollten derartige Mittel geeignet sein, um in der industriellen Enzymproduktion eingesetzt werden zu können.

[0008] Demgemäß betrifft die vorliegende Erfindung einen Hydrolase-Aktivator mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.lD.Nr.1. Dieser Regulator kann beispielsweise durch das korrespondierende Gen aus Trichoderma reesei gemäß Seq.lD.Nr.2 kodiert werden, der Leserahmen der für die Aminosäuresequenz Seq.lD.Nr.1 kodierenden Region dieses Gens ist in Seq.lD.Nr.3 offenbart. Selbstverständlich sind alle Nukleinsäuren, die aufgrund der Degeneration des genetischen Codes die Aminosäuresequenz Seq.lD.Nr.1 kodieren, ebenfalls geeignet, beispielsweise in einem rekombinanten Expressionssystem den erfindungsgemäßen Hydrolase-Aktivator zu exprimieren. Obgleich das Genom von Trichoderma reesei vollständig sequenziert worden ist (Martinez et al., Nat. Biotech. 26 (2008), 553-560), konnte die kodierende Region gemäß der vorliegenden Erfindung bislang weder als offener Leserahmen (Seq.l-D.Nr.1) noch als Gen (Seq.ID.Nr. 2) aufgefunden werden, Demgemäß konnte dieser Genregion auch keine Funktion zugeordnet werden. Bislang blieb daher die erfindungsgemäße Genregion in der Trichoderma-Genannotierung unberücksichtigt.

[0009] Tatsächlich ist die erfindungsgemäße Genregion in ihrer Funktionalität der von Xyr1 ähnlich, im Gegensatz zu diesem zeigt die erfindungsgemäße Genregion jedoch keinerlei Homologie zu anderen Organismen. Aus den im Rahmen der vorliegenden Erfindung durchgeführten Tests ergibt sich ein enger funktioneller Zusammenhang des erfindungsgemäßen Gens mit Xyr1 und es konnte nachgewiesen werden, dass das erfindungsgemäße Gen (wird im Folgenden auch mit „hax1" bezeichnet) ein Schlüsselregulator im Hydrolase-System von Trichoderma ist. Auf Basis dieser Erkenntnisse wird mit der vorliegenden Erfindung nunmehr ein Hydrolase- 1/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

Regulationssystem in Trichoderma zur Verfügung gestellt, mit welchem unter Verwendung dieses Gens und dessen Transkriptions- bzw. Translationsprodukt die Hydrolaseaktivität in Trichoderma gezielt gesteuert und optimiert werden kann, wobei auch die Verwendung der bisher gebräuchlichen teuren Substanzen zur Induktion dieser Enzymaktivitäten vermieden werden kann.

[0010] Generell umfasst das Hydrolase-System das von (Wildtyp) Trichoderma reesei produziert wird u.a. zwei Haupt-Zellobiohydrolasen, CBHI und CBHII (EC 3.2.1.91); endo-ß-1,4-Glukanasen EGI bis EGV (EC 3.2.1.4), 1,4-ß-Glukosidasen BGLI und Bglll (EC 3.2.1.21), zwei spezifische Haupt-endo-ß-1,4-Xylanasen, XYNI und XYNII (EC 3.2.1.8), und eine ß-Xylosidase, BXLI (EC 3.2.1.37), um diejenigen zu nennen, die am besten charakterisiert sind.

[0011] Diese Hydrolasen arbeiten synergetisch zusammen, um für einen im Wesentlichen vollständigen Abbau der polymeren Biosubstrate, wie erwähnt, Zellulose und Xylan, zu sorgen.

[0012] Während in Aspergillus spp. die xylanolytischen und zellulolytischen Systeme streng über den Induktor Xylose co-reguliert sind, gilt dies nicht für die hydrolytischen Systeme in Trichoderma reesei (Stricker et al., 2006). Umso überraschender war daher die generelle Anwendbarkeit des erfindungsgemäßen Hydrolase-Aktivators.

[0013] Mit dem erfindungsgemäßen Hydrolase-Aktivator können veränderte Trichoderma-Kulturen zur Verfügung gestellt werden, die hinsichtlich ihrer Hydrolase-Aktivität gezielt beeinflussbar sind oder gezielt genetisch verändert wurden. Beispielsweise führt eine Inaktivierung des erfindungsgemäßen Gens in Trichoderma zur Abschaltung des Hydrolase-Systems. Auch eine Steuerung durch einen heterologen induzierbaren Promotor ist möglich, wobei die so erhaltenen Zellen so lange keine Hydrolasen produzieren, solange nicht eine Induktion über den heterologen Promotor erfolgt ist. Damit können Trichoderma-Zellen und -Kulturen zur Verfügung gestellt werden, die im wesentlichen keine Hydrolase-Aktivitäten mehr zeigen, insbesondere keine Xylanase-Aktivität. Eine derartige Inaktivierung kann durch Insertionen im erfindungsgemäßen Gen erreicht werden, wodurch kein funktionierendes Transkript mehr produziert werden kann. Selbstverständlich führen auch entsprechende Deletionen oder Punktmutationen zu diesem Ergebnis. Deletionen und Insertionen, die zu einem geänderten Leserahmen oder einem Stop-Codon (insbesondere zumindest in den ersten drei Viertel der c-DNS-Region) führen, sind dazu besonders geeignet. Insertionen mit 3 Basen (oder einem Vielfachen davon) sind in der Regel weniger geeignet (außer sie enthalten ein in-Frame Stop-Codon so dass kein funktionelles Genprodukt generiert werden kann (z.B. zumindest 5'-seitig vor dem letzten Viertel des offenen Leserahmens gemäß Seq.lD.Nr.3)), da hiermit allein oft keine wesentliche Verminderung der Aktivität einhergeht.

[0014] Auf der anderen Seite kann die Transkription bzw. die Translation des erfindungsgemäßen Gens durch Einbau heterologer Promotoren, Enhancer und anderer positiver Regulierungselemente gezielt geändert bzw. gesteuert werden. Natürlich kann auch die Nukleinsäure hinsichtlich ihrer Struktur optimiert werden (m-RNA-Faltung, Sekundärstruktur, Loop-Optimierung, etc.) ohne dass dabei notwendiger Weise die Aminosäuresequenz verändert wird.

[0015] Unter einer „isolierten" Nuklein- oder Aminosäuresequenz wird ein Nukleinsäuremolekül oder Polypeptid verstanden, das im wesentlichen frei ist von anderen Nukleinsäuren oder Polypeptiden, d.h. dass zumindest 50 %, vorzugsweise zumindest 80 Gew.%, insbesondere zumindest 90 Gew.% der in einer Präparation enthaltenen Moleküle die betreffenden „isolierten" Moleküle sind.

[0016] Ein „biologisch funktionelles Fragment einer Sequenz" (z.B. ein biologisch funktionelles Fragment der Seq.ID.Nrn. 1 bis 3) ist ein aus diesen Basis-Sequenzen resultierendes DNS-, RNS-oder Polypeptid-Molekül das die erfindungsgemäße Hydrolase-Aktivator Eigenschaft noch aufweist bzw. dafür kodiert, bei welchem jedoch z.B. am 5'- und/oder 3'-Ende oder am N-und/oder C-Terminus Nukleinsäuren oder Aminosäuren fehlen können (z.B. bis zu 5, bis zu 10, bis zu 15, bis zu 20, bis zu 25 Aminosäuren bzw bis zu 15, bis zu 30, bis zu 45, bis zu 60, bis zu 75 Basen). 2/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 [0017] Ein „Vektor" ist ein Polynukleotid-Molekül, vorzugsweise ein DNS-Molekül, mit welchem Nukleinsäuren (z.B. die erfindungsgemäßen Nukleinsäuremoleküle) in Zellen (insbesondere Trichoderma-Zellen) eingeführt werden können. Ein „Expressionsvektor" ist ein DNS-Konstrukt, welches eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die operabel mit einer geeigneten Kontrollsequenz verknüpft ist, um die Nukleinsäuresequenz in einer Wirtszelle exprimieren zu können oder deren Expression in der Wirtszelle zu bewirken, also „exprimierbar" ist (wobei unter „exprimierbar" die prinzipielle Möglichkeit der Expression des Transkripts oder des kodierenden Proteins (z.B. in einer Trichoderma reesei-Zelle) gemeint ist, welche z.B. durch Anwendung üblicher, geeigneter Kultivierungsbedingungen für Trichoderma realisierbar ist; bei induzierbaren Promotoren setzt dies selbstverständlich ein vorheriges Induktionssignal voraus). Geeignete Kontrollsequenzen umfassen Promotoren, die eine Transkription bewirken, Operatorsequenzen, Sequenzen, die für geeignete Ribosomenbindungsstellen auf der mRNS kodieren, Enhancer und/oder Terminationssequenzen. Ein „Promotor" ist eine Regulationssequenz, die bei der Bindung der RNS-Polymerase beteiligt ist, um die Transkription eines Gens zu bewirken. „Operabel verknüpft" bedeutet, dass die so verknüpften Elemente funktionell aufeinander zugreifen können; beispielsweise ist ein Promotor mit einer kodierenden Sequenz operabel verknüpft, wenn dieser Promotor die Transkription dieser Sequenz kontrolliert. Ein „heterologer" Promotor ist ein Promotor, der nicht in natürlicherweise mit dem hax1-Gen verknüpft ist, d.h. ein Promotor, der ein anderes Gen steuert (entweder ein anderes Gen aus Trichoderma reesei oder ein anderes Gen aus einem anderen Organismus, insbesondere einem anderen Pilz, z.B. Aspergillus), oder ein artifizieller Promotor (d.h. ein Promotor, der in der Natur nicht vorkommt, sondern gezielt konstruiert worden ist (meist durch Optimierung natürlicher Promotoren). Wenn das hax1 Transkriptionsprodukt unter der Kontrolle eines heterologen Promotors steht, so bedeutet dies, dass dieses Transkriptionsprodukt nicht oder nicht nur unter der Kontrolle des natürlichen (des „Wildtyp"-) Promotors steht, sondern ein heterologer Promotor in einer im Hinblick auf das Genprodukt operablen Position in das hax1-Gen eingefügt wurde.

[0018] Das erfindungsgemäße Hydrolase-Aktivator-Gen ist in der Lage, die Hydrolasen aus Trichoderma reesei, jedenfalls die Xylanasen, bevorzugt jedoch die Xylanasen und die Zellula-sen, zu aktivieren bzw. deren Expression hinaufzuregulieren. Unter „Hydrolase-Aktivität" sind daher erfindungsgemäß jedenfalls die Xylanase-Aktivitäten zu verstehen, vorzugsweise die Xylanase-und die Zellulase-Aktivitäten.

[0019] Geeignete Verfahren zur Transformation von Trichoderma sind dem Fachmann an sich bekannt (z.B. WO 2006/060126 A2, Absätze [125] bis [134]), ebenso wie geeignete Kultivierungsbedingungen und -verfahren zur Kultivierung von Trichoderma reesei, insbesondere zur Expression von Hydrolasen im Zuge eines Hydrolasen-Herstellungsverfahrens. Diese können selbstverständlich im Rahmen der vorliegenden Erfindung zur Herstellung genetisch erfindungsgemäß veränderter Trichoderma-Zellen sowie zur Kultivierung der erfindungsgemäßen Zellen verwendet werden.

[0020] Zur Herstellung erfindungsgemäßer Trichoderma-Varianten können Trichoderma-Zellen erfindungsgemäß durch biotechnologische Methoden unter Verwendung spezifischer, mit der Lehre der vorliegenden Erfindung hergestellter Nukleinsäuremoleküle verändert werden. Gegenstand der vorliegenden Erfindung ist demgemäß auch ein isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus [0021] - (a) der Sequenz gemäß Seq.lD.Nr.2, [0022] - (b) einer Sequenz, die den offenen Leserahmen gemäß Seq.ID.Nr. 3 umfasst und nicht größer als 1 Mbp ("bp bezieht sich immer auf eine doppelsträngige DNS, wenn die nukleinsäure einzelsträngig vorliegt, entspricht dies natürlich „b"), vorzugsweise nicht größer als 100.000 bp, insbesondere nicht größer als 10.000 bp ist, und aus der ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.Nr. 1 exprimierbar ist, [0023] - (c) einer Sequenz, die nicht größer als 1 Mbp, vorzugsweise nicht größer als 100.000 bp, insbesondere nicht größer als 10.000 bp ist und aus der ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.Nr. 1 exprimierbar ist, 3/29 österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 [0024] - (d) einer Sequenz, bei welcher ein heterologer Promotor im 5'-Bereich zur Seq.lD.Nr.3 platziert ist und mit Seq.lD.Nr.3 bzw. dem Transkript, enthaltend Seq.lD.Nr.3, operabel verknüpft ist, [0025] - (e) einer Sequenz, die komplementär zu (a), (b), (c) oder (d) ist.

[0026] Mit der vorliegenden Erfindung werden auch Vektoren, insbesondere Expressionsvektoren, zur Verfügung gestellt, welche eine Nukleinsäuresequenz umfassen, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.lD.Nr.1 kodiert bzw. den offenen Leserahmen gemäß Seq.lD.Nr.1 (oder eine dazu komplementäre Sequenz) enthält. Erfindungsgemäße Vektoren enthalten vorzugsweise eine der oben angeführten Sequenzen (a) bis (e) oder ein biologisch funktionelles Fragment davon.

[0027] Die vorliegende Erfindung betrifft auch eine Trichoderma reesei Zelle (bzw. eine Kultur, enthaltend diese Zelle), deren DNS im Bereich der Sequenz gemäß Seq.lD.Nr.2 verändert worden ist. Bevorzugte erfindungsgemäße Veränderungen führen zu einer geänderten Hydrola-seaktivität in der Trichoderma-Zelle oder zu einer geänderten Regulierung oder Steuerbarkeit der Hydrolaseaktivität, welche industriell ausgenutzt werden kann. Beispielsweise kann eine Insertion, Deletion oder Punktmutation eingeführt werden, die zu einer verringerten Transkripti-ons-bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 führt oder sogar zu einem gänzlichen Verlust derselben. Weiters kann z.B. eine Insertion im 5'-Bereich des offenen Leserahmens der Seq.lD.Nr.2 eingeführt werden, wobei dieser offene Leserahmen eben Seq.ID.Nr. 3 entspricht, welche Insertion zu einer erhöhten Transkriptions- bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 führt, insbesondere dann, wenn die Insertion eine Transkripti-ons-Aktivator-Sequenz oder eine Promotorsequenz ist, insbesondere ein heterologer Promotor. Auch kann ein heterologer Promotor eingesetzt werden, der induzierbar ist, wodurch sich die (verringerte, vergrößerte oder auch eine - nach Induktion -prinzipiell dem Wildtyp vergleichbare) Hydrolaseaktivität der Trichoderma-Zelle gezielt an- oder ausschalten lässt. Die Promotor-Optimierung in Trichoderma ist für eine Fachperson unter Verwendung von üblichen Methoden möglich (z.B. US 5,989,870 A).

[0028] In einer bevorzugten Trichoderma reesei-Zelle gemäß der vorliegenden Erfindung ist im 5'-Bereich des offenen Leserahmens der Seq.lD.Nr.2 eine Sequenz eingesetzt, die ausgewählt ist aus T. reesei cbh1-, cbh2-, xyn1-, xyn2-, xyn3-, egl1-5-, gna3-, env1-, cDNA1-, bxl 1 -, pki1-, gpdA-, gpd1- oder hex1-Promotor oder biologisch funktionelle Fragmente davon, insbesondere cbh1, cbh2, xyn1, xyn2, bxl1 oder biologisch funktionelle Fragmente davon; optimierten Varianten davon, insbesondere von cbh1 und cbh2; bevorzugte Promotoren sind z.B. die Promotoren, die in den Dokumenten Nakari-Setäla et al. (Appl. Env. Microbiol. 61 (1995), 3650-3655; cDNA1-Promotor), Rahman et al. (Biosci. Biotechnol. Biochem. 73 (2009), 1083-1089; egl3-und xyn3-Promotor), WO 98/23764 A1 (verkürzter cbh1-Promotor), EP 0 952 223 A1 (cbh1-Promotor aus Trichoderma viridae), US 7,393,664 A (Konstrukte mit chb1-, cbh2-, egl1-, egl2-, egl3-, egl4-, egl5-, xyl1-, xyl2- und ß-Xylosidase-Promotoren aus Trichoderma reesei sowie andere Promotoren aus Aspergillus und Fusarium), US 7,517,685 (hex1-Promotor) oder Mach et al. (Curr. Genetics 25 (1994): 567-570; pki1) geoffenbart werden.

[0029] Geeignete Promotoren zur Verwendung in Trichoderma reesei können beispielsweise auch mit dem Verfahren gemäß dem US-Patent Nr. 5,989,870 zur Verfügung gestellt werden.

[0030] Besonders bevorzugte erfindungsgemäße Trichoderma reesei-Zellen sind solche, die mit einem erfindungsgemäßen Expressionsvektor transformiert worden sind und welche demgemäß dieses Konstrukt stabil und biologisch funktionell bzw. induzierbar beinhalten.

[0031] Die vorliegende Erfindung betrifft natürlich auch eine Kultur der erfindungsgemäßen Trichoderma reesei-Zellen. Die vorliegende Erfindung ist jedoch selbstverständlich auf andere Trichoderma-Stämme anwendbar, insbesondere auch auf T. atroviride und T. virens, wobei allerdings T. reesei am meisten bevorzugt ist.

[0032] Gemäß einem weiteren Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung einer Hydrolasen-Präparation, wobei eine erfindungsgemäße Zellkultur, mit Zellen 4/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 deren DNS einen heterologen Promotor im 5'-Bereich in operablen Verknüpfung mit der Seq.lD.Nr.3 enthält, wodurch vorzugsweise eine erhöhte Hydrolase-Expression gegenüber der Wildtyp-Sequenz Seq.lD.Nr.2 erfolgt, unter Bedingungen kultiviert wird, bei welcher Hydrolasen exprimiert werden, und Gewinnung der exprimierten Hydrolasen in an sich bekannterWeise. Mit diesem Verfahren lassen sich Hydrolasen unter Verwendung eines heterologen Promotors mit modifizierten Kontrollmechanismen steuern. Insbesondere kann damit auf die Verwendung von teuren Induktions-Verbindungen (wie α-Sophorose oder Xylobiose) verzichtet werden und auf billigere Substanzen zurückgegriffen werden. Beispielsweise kann der Stamm bei einer Temperatur von 10 bis 50 °C für mindestens 1 h unter Hydrolase-induzierenden Bedingungen inkubiert werden.

[0033] Die vorliegende Erfindung kann aber auch für ein Verfahren zur Kultivierung von Tricho-derma reesei verwendet werden, bei welchem ein Trichoderma reesei Stamm mit einer Insertion, Deletion oder Punktmutation in der Seq.lD.Nr.2, die zu einer verringerten oder keiner Transkriptions- bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 führt, in einem Kulturmedium vorgegeben wird und der Stamm bei einer Temperatur von 10 bis 50°C für mindestens 1 h inkubiert wird.

[0034] Die Kultivierungsverfahren gemäß der vorliegenden Erfindung können prinzipiell in an sich bekannter Weise durchgeführt wer- den (natürlich auch abhängig vom jeweils verwendeten Promotor und anderer Regulationssequenzen). Dabei können vorzugsweise Temperaturen von 10 bis 50°C, vorzugsweise 20 bis 40°C, insbesondere 25 bis 35°C angewendet werden. Je nach Status der Trichoderma-Kultur sollte für mindestens eine Stunde, vorzugsweise für mindestens 5 h, noch bevorzugter für mindestens 10 h, insbesondere für mindestens 24 h kultiviert werden. Für die industrielle Verfahrensführung können aber auch längere Kultivierungszeiten (= Inkubationszeiten) bevorzugt sein, z.B. mindestens 2 Tage, mindestens 5 Tage oder mindestens 10 Tage. Auch längere Inkubationszeiten sind üblich. Höhere Temperaturen können natürlich bei Bedarf ebenfalls bevorzugt sein, insbesondere wenn gleichzeitig die Kultivierung auch bei erhöhtem Druck durchgeführt wird (wie in der US 4,952,505 A beschrieben).

[0035] Die Erfindung wird anhand der nachfolgenden Beispiele sowie der Zeichnungsfiguren, auf die sie selbstverständlich nicht beschränkt ist, näher erläutert.

[0036] Es zeigen: [0037] Fig.1: einen Southern Blot der Insertions-Stämme [0038] Fig.2: die Enzymaktivitäten der Insertions-Stämme versus Ausgangsstamm; [0039] Fig.3: die Biolog-Messung nach 48 h; [0040] Fig.4: die Darstellung der Insertion, bestehend aus trp-C-Terminator, hph Gen, gpdA-

Promoter, pAN7-backbone und trp-C-Terminator, in hax1; dies liegt wiederum in einem nicht annotierten Bereich zwischen einer Isopropylmalatsynthase und einem unbekannten Protein.; und [0041] Fig. 5: die Sequenz des hax1-Gens, das für den erfmdungsgemäßen Hydrolase-

Aktivator kodiert; fett/unterstrichen: Bindungsstellen von Xyrl (Xylanaseregulator 1) bzw. TATA-Box. Kursiv: Strukturgen von hax1, fett: Startcodon ATG und Stop-codon TGA. Doppelt unterstrichen: Introns mit 5' und 3' Splice-Stellen. Dreieck schwarz: Stelle der Insertionsmutagenese. 5/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 BEISPIELE:

MATERIALIEN UND METHODEN STAMM

[0042] Der Stamm Trichoderma reesei (teleomorph Hypocrea jecorina) QM9414 wurde bei den Experimenten verwendet. Der Ausgangsstamm und die Insertionstransformanten-Stämme wurden auf Malzextraktagar kultiviert und bei 30°C inkubiert.

TRANSFORMATION MITTELS GENE GUN

[0043] Die Transformation von T. reesei Sporen wurde mittels Gene Gun (Bio-Rad, Herkules, US) als biolistische Transformation gemäß dem Protokoll von Gruber et al. (1990a) (Curr. Ge-net. 18 (1990), 71-76) durchgeführt. Für die Transformation wurde der Vektor pAN7 (Punt et al., Gene 56 (1987), 117-124), der das hph Gen (Hygromycin Phosphotransferase B) aus Escherichia coli trägt, verwendet.

SOUTHERN BLOT ANALYSE

[0044] Die genomische DNA der Insertionstransformanten-Stämme wurde gemäß dem Protokoll von Gruber etal. (1990b) (Curr. Genet. 18 (1990), 447-451) isoliert. Für die Southern Hybridisierung wurde der DIG High-Prime DNA Labeling and Detection Starter Kit II (Roche, Basel, Schweiz) verwendet. Die genomische DNA wurde mit Ncol verdaut, die Hybridisierung wurde mit einem DIG-markiertem Fragment (Sali und Xbal aus pAN7) durchgeführt.

ANZUCHT

[0045] Für Umtopfversuche wurden 250 mL Mandels-Andreotti (MA)-Medium (Mandels 1985) mit 1 % (wt/vol) Glyzerin als Kohlenstoffquelle in einem 1-L-Erlenmeyerkolben mit 108 Sporen pro Liter (Endkonzentration) inokuliert. Die Voranzucht wurde bei 30°C und 150 rpm für 18 Stunden inkubiert. Das vorgezüchtete Myzel wurde gewaschen und anschließend in äquivalenten Mengen in MA-Medium mit 1 % (wt/vol) Glukose oder 0,5 mM D-Xylose suspendiert.

[0046] Die Direktkultivierung wurde in einem 100-mL-Erlenmeyerkolben mit 30 mL MA-Medium mit 1 % (wt/vol) Xylan aus Birkenholz (Sigma, Steinheim, Deutschland) oder mit 1 % (wt/vol) Laktose (Sigma) durchgeführt. Es wurde mit 108 Sporen pro Liter (Endkonzentration) beimpft und die Kultivierung wurde bei 30°C und 150 rpm durchgeführt.

ENZYMAKTIVITÄTSMESSUNGEN

[0047] Für die Messung der Endo-ß-1,4-Xylanase Aktivität wurden die Xylazyme AX Tabletten (Megazyme, Wicklow, Irland) gemäß den Angaben des Herstellers verwendet. Eine Aktivitätseinheit ist definiert als die Menge an Enzym, die benötigt wird, um 1 μΜ von reduzierenden Xylose-Zucker-Äquivalenten pro Minute unter definierten Bedingungen (40°C, 10 min) umzusetzen.

[0048] Für die ß-Glukosidase-Aktvitätsmessung wurde das Substrat 4-p-Nitrophenyl-ß-D-Glucopyranosid in 50 mM Natriumzitrat-Puffer (pH 5,0) gelöst. Die Messung wurde bei 50°C durchgeführt und erfolgte laut Protokoll von Kristufek et al. (1995) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 42(1995),713-717).

PCR

[0049] Um die Insertionsstelle des pAN7-Vektors im Genom festzustellen wurden folgende PCR-Reaktionen durchgeführt. Als Templat wurde genomische DNA der Insertions-Stämme verwendet. Beim ersten PCR-Ansatz wurde die Primer (siehe Tabelle 1) „locus for" und „hph inv for", beim zweiten PCRAnsatz wurden die Primer „locus rev" und „hph inv rev" kombiniert. Die 6/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 PCR wurde im iCycler (Bio-Rad) durchgeführt und folgendes Temperaturprogramm verwendet: Initiale Dentaturierung 94°C 3 min, 30 Zyklen mit jeweils 30 sec bei 94°C, 30 sec bei 56°C, 3 min bei 72°C und schließlich eine finale Elongation für 5 min bei 72°C.

[0050] Die Sequenzierung der erhaltenen DNA-Fragmente wurde von MWG Biotech (Ebersberg, Deutschland) durchgeführt.

Primer Name locus for locus rev hph inv for hph inv rev Tabelle 1:

Sequenz 5'-3' cgcgctctcttttcctccttgg (Seq.ID.Nr.6) gcagaacccaggacacaaagagc (Seq.ID.Nr.7) cgtctggaccgatggctgtgtagaagtactcg (Seq.ID.Nr.8) gggatgggaaggatggagtatggatgtagcaaag (Seq.ID.Nr.9) verwendete Primer

RNA ISOLATION UND QUANTITATIVE PCR

[0051] Das geerntete Myzel wurde in 1 mL peqGOLD TriFast DNA/RNA/Protein Isolierungssystem (PEQLAB Biotechnologie, Erlangen, Deutschland) mittels FastPrep FP120 BIO101 Ther-moSavant cell disrupter (Qbiogene, Carlsbad, US) aufgeschlossen. Die RNA wurde laut Protokoll des Herstellers isoliert.

[0052] Die Synthese der cDNA aus RNA wurde mithilfe des H Minus First-Strand cDNA Synthesis Kit (Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland) laut Angaben des Herstellers durchgeführt.

[0053] Das Mastercycler® ep Realplex 2.2 System (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) wurde für die quantitativen PCR-Reaktionen verwendet. Die Erstellung der PCR-Protokolle wurde mit der Mastercycler® ep realplex 2.2 Software durchgeführt. Die Reaktionen wurden in Triplikaten durchgeführt. Der 25-pl-Reaktionsansatz enthielt 1 xiQ Sybr Green Supermix (Bio-Rad), 0,1 pM Vorwärts-Primer, 0,1 μΜ Rückwärts-Primer und als Templat 1:100 verdünnte cDNA. Die verwendeten Primer wurden in Tabelle 2 zusammengefasst. Bei jedem PCR-Durchgang wurde eine Blindkontrolle (steriles, bi-destilliertes Wasser anstelle von cDNA) und eine Negativkontrolle (Zugabe von Natriumdodecylsulfat (Endkonzentration 0,01 %) zum Reaktionsansatz) inkludiert. Das Protokoll für die Analyse des xyr1-Transkripts: 3 min initiale Denaturierung bei 94 °C, gefolgt von 50 Zyklen 15 sec bei 94 °C, 15 sec bei 60°C, 15 sec bei 72°C. Das Protokoll für das Transkripts des „unknown Protein": 3 min initiale Denaturierung bei 95°C, gefolgt von 50 Zyklen 15 sec bei 95°C, 15 sec bei 60°C, 30 sec bei 72°C. Das Protokoll für die Analyse des hax1-Transkripts: 3 min initiale Denaturierung bei 94°C, gefolgt von 50 Zyklen 20 sec bei 94°C, 20 sec bei 58°C, 30 sec bei 72°C.

Primer Name xyrlf xyrlr unknown Protein forward unknown Protein reverse haxl for kurz haxl rev Tabelle 2: verwendete Primer

Sequenz 5 '-3 ' cccattcggcggaggatcag (Seq.ID.Nr.10} cgaattctatacaatgggcacatggg (Seq.ID.Nr.11) cgccgtattggggttcattgc (Seq.ID.Nr.12) ggctaaacgttgtctcggaggg (Seq.ID.Nr.13) agtacttgcagtagcccctcgactc (Seq.ID.Nr.14) tccgcaaaacgaaccgaacc (Seq.ID.Nr.15) für Transkriptionsanalysen 7/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

BIOLOG-MESSUNG

[0054] Zur Untersuchung der Wachstumsraten wurde eine Biolog FF MicroPlate Platte (Biolog Inc. Flayward, CA) verwendet. Diese Platte enthält 95 Probenkammern mit unterschiedlichen Kohlenstoffquellen und zur Kontrolle eine Probenkammer mit Wasser. Die Sporen der Tricho-derma Stämme wurden laut Protokoll von Druzhinina et al. (2006) (Appl. Microbiol. Biotechnol. 72 (2006), 2126-2133) geerntet. Die inokulierten Mikrotiterplatten wurden in Dunkelheit bei 30°C inkubiert. Die OD bei 750 nm wurde mittels Microplate Reader (Biolog) gemessen. Die Analysen wurden als Triplikate durchgeführt. ERGEBNISSE : [0055] In Fig. 1 ist der Southern Blot, der das Integrationsmuster der Insertion zeigt, dargestellt. Als Sonde wurden Teile des pAN7-Vektors, mit dem die Insertion erfolgte, verwendet (siehe Materialien und Methoden). Der rot markierte QHR5 entspricht als einziger der Insertions-Stämme sowohl laut Southern-Analyse als auch phänotypisch dem Ausgangsstamm QM9414. Die restlichen Stämme zeigen dasselbe, veränderte- Insertionsmuster des pAN7-Vektors.

[0056] Fig.2 zeigt die Xylanaseaktivitäten der Insertions-Stämme im Vergleich zum Ausgangsstamm. Dabei verhält sich derT. reesei Insertions-Stamm QHR5 in Bezug aufseine Xylanase-und ß-Glukosidase-Aktivität ähnlich dem Ausgangsstamm (QM9414); die T. reesei Insertions-Stämme QHR 1-4 und 6-7 zeigen dagegen keine oder stark reduzierte Aktivitäten, vergleichbar mit einem xyr1-Deletions-Stamm.

[0057] In Fig. 3 sind die Ergebnisse der Biolog-Messung nach 48 h dargestellt. Diese zeigen, dass die Insertions-Stämme (Bsp. QHR1) einen ähnlichen Metabolismus wie ein xyr1-Deletions-Stamm (delta xyr1) haben, der sich deutlich vom Metabolismus des Ausgangsstammes (QM9414) unterscheidet; zB ist besonders augenfällig die reduzierte Umsetzung/Wachstum auf D-Xylose und L-Arabinose (in Fig.3 orange markiert) in QHR1 und delta xyr1.

[0058] Eine Analyse des nicht annotierten Teil im T. reesei Genom (aktuelle Version des Tri-choderma reesei Genoms (v2.0) zeigt, dass die erfindungsgemäße Sequenz in einer intergenen Region liegt und die Insertion benachbart von einem "unknown Protein" und einer Isopropylma-latsynthase erfolgt ist. Dies wurde durch inverse PCR gefolgt von Sequenzierung und Blast gegen das T. reesei Genom festgestellt (siehe Materialien und Methoden). Demgemäß kann das erfindungsgemäße Gen auch nicht durch die für automatisierte Annotierung von Genomen verwendeten Algorithmen (z.B. „fgenesh" oder „genewise") aufgefunden bzw. detektiert werden.

[0059] Die genomische Sequenz des Ausgangsstammes QM9414 und der Insertions-Stämme im Bereich zwischen "unknown Protein" und Isopropylmalatsynthase wurden wie folgt ermittelt: 8/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 [0060] QM9414 (Seq.lD.Nr.4) ggtcgcgcct gtgatggtcg agtaacttgt gagagatggt ggtactatcg ccaaggcagc 60 accaaggctg ggctcqagac caactcagcg caüasqgaga cgatgcttag ccgtaggctg 120 gaggccgagc scggcaaggt gaggr.gtatg attccgt.gat gggagctccc aagaaaggta 180 ttatcgaaac tcgat.tgccc aaaagaaggc cgaaaggcga gagaagtagg gcggagatgt 240 acggggggag attgcctccg gtcagctgct gcgggctcct gcagctgica acctctgttc 300 tccaaggcaa tgcagaagcg cgcagcctac caactgcggg cagatgctgt cgttgctggt 360 gctattactt cgtctgaaca gaaccgncgg gacaacggaa gagagcagag taggaaagaa 420 aatatttccg ccggtiaggt aag-ggcaga aactccaagt gctcaaaagg gcctcctccg 480 caaaacgaac cgaaccgggg qggtttgcga agctgcctct gctccaccgg ccttgggctg 540 aatgatgccg igactgaaaa ggccccaagt ccaaqctgr.g atlggagccc: aattgagcga 60 0 gcggttgggac gaattcagcgc agqgcctqcq atcaggcgas agaggcggic gggagcr.gca 660 ggtcgaggtg gaggagcgac cgggggggag gcagtggagg cgagccgccg gcgagcgata 720 ar.actgggtg gctcgaggqt. ttgat.gcccg agcagcqgr.a cgatgcaaqg caccgcgcga 780 gagaggccgc gcatgcigctg eggctgagga gccggggagt gcaacggggc ggagctqagc 840 gtgctggatg agtcgagggg ctactgcaag tactLtgagq agagcggcag gaqgatggat 900

zcctggttct gttggagctg gagtat.ggag taataataat ggaggaqtac aggttcgatg 96C aggctggtgt tgacctagtg gtggtgcgag ytgcgccgcg aatctigcttc ccagcgccgg 1020 tgcctggcga cattgcacca cagcctaagg tacggaaata tgtaatcatt tacacgcatt 1080 tcatctggcc attgagtatc tacgatacac cgacttcttg gtattgtcgt caccttatgg 1140 ttctcgactt cttctctccc agccatccat tcagttttag cacctgcggg ctgggccgaa 1200 caggagctgc gtccccacaa tagccatgag ccgttcgaog ccatctcggc tttgtctgac 1260 tgctaagtag ctcccacctc tgattaagcc gcgggcgtca gccaccagcc accgtttagc 1320 cacctgccgg qgggtttgga cgggcttgaa cgggcttgaa cgggcctgac catcaccaag 1380 gaacagcttc gggctctggt tgtaaatctt gttgttacag ctacctaggt agaaaacgtg 1440 tggaacaagg atgacgccca atctcctgca tgttgtgtct ctgtatccgt gtggaacttc 1500 ttactatctg tacgcagccc tgagctacgc atgataagtc atgttcgtcg tccacttctc 1560 tgaaatgaag gaaaactgcc ccatgecagt tgatctgctt ggggtgatgc aacgaagaac 1620 ttttagatat acgaaggggg aataaccaat gcctctgctt tgagtttcag cacc 1674 [0061] Insertions-Stämme (siehe auch Fig.4) 9/29 österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 ggtcgcgcct gtgatggtcg agtaacttgt gagagatggt ggtactatcg ccaaggcagc 60 accaaggctg ggctcgagac caactcagcg caaaaggaga cgatgcttag ccgtaggctg 120 gaggccgagc acggcaaggt gaggtgtatg attccgtgat gggagctccc aagaaaggta 180 ttatcgaaac tcgattgccc aaaagaaggc cgaaaggcgt gagaagtagg gcggagatgt 240 acggggggag attgcctccg gtcagatgct gggggctcct gcagctgtca acctctgttc 300 tccaaggcaa tacagaagcg cgcagcctac caagtgcggg cagatgctgt cgttgctggt 360 gctattactt cgtctgaaca gaaccgtcgg gacaagggaa gagagcagag taggaaagaa 420 aatatttccg ccggttaggt aactggcaga agctccaagt gctcaaaagg gcctcgtccg 480 caaaacgaac cgaaccgggg gggtttgcga agctgcctct gctcgaccgg ccttgggctg 540 aatgatgccg tgactgaaaa ggccccaagt ccaagctgcg attggagccc aattgagcga 600 gcggtgggac gaatcagcgc agggcctgcg atcgggcgaa agaggcggtc gggagctaca 660 ggtcgaggtg gaggagcgac cgggggggag gcagtggagg cgagcagccg gcgaacgata 720 atattgggtg gctggaggtt ttgatgctcg agcagcggta cgatgcaagg caccgcgcga 780 gagaggccgc gcatgtgctg cggctgagga gccggggagt gcaacggggc ggagctgagc 840 gtgctggatg agtcgagggg ctactgcaag tactttgagc agagcggcag gaggatggat 900 tcctggttct gttggagctg gagtarggag taataataat agaggagtac aggttcgatg 960 aggctggtgt tgacctagtg gtggtgcgag gtgcgccgcg aatctgcttc ccagcgccgg 1020 tgcctggcga cattgcacca cagcctaagg tacggaagta tgtaatcatt tacacgcatt 1080 tcatctggcc attgagtatc tacgatacac cgacttcttg gtattgtcgt caccttatgg 1140 ttctcgactt cttctctccc agccatccat tcagttttag cacctgcggg ctgggccgaa 1200 caggattcct cagtctcgta ggtctcttga cgaccgttga tctgcttgat ctcgtctccc 126C gaaaatgaaa atagctctgc taagctattc ttctcttcgc cggagcctgn aaggcgttac 1320 taggttgcag tcaatgcatt aatgcattgc agatgagctg tatctggaag aggtaaaccc 1380 gaaaacgcgt tttattcttg ttgacatgga gctattaaat cactagaagg cactctttgc 1440 tgcttggaca aatgaacgta tcrtatcgag atcctgaaca ccatttgtct caactccgga 1500 gctaacatcg acaccaacga tcttatatcc agattcgtca agctgttrga rgatttcagt 1560 aacgttaagt ggatcccgcg gtcggcatct actctattcc tttgccctcg gacgagtgct 1620 ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc 1680 gcrtctgcgg gcgacttgtg Lacgcccgac agtcccggct ccggatcgga cgattgcgtc 1740 gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgccg tcaaccaagc tctgatagag 1800 ttggtcaaga ccaatgcgga gcatatacgc ccgaagccgc ggcgatcctg caagctccgg 1860 atgcctccgc tcgaagtagc gcgtctgctg ct-ccatacaa gccaaccacg gcctccagaa 1S20 gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc gcctcgc.tcc agtcaatgac 1980 cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attattggag ccgaaatccg cgtgcacgag 2040 qtgccggact tcggggcagt cctcqgccca aagcatcagc tcatcgagag cotgcgcgac 21CC ggacgcacta acggtgGcgt ccancacagt tzgccagtga tacacatggg gatcagcaat 2160 cgcgcatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaccgatt ccttgcggtc cgaatgggcc 2220 gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agcgatcgca tccatggcct ccgcgaccqq 2280 ctccagaaca gcgggcagtt cggtttcagg caggtcctgc aacgtgacac cctgtgcacg 2340 gcgggagatq caataqgtca ggctctcgct gaattcccca atgtcaagca cztccggaat 2400 cgggagcgcq gccgatgcaa agtgccgata aacazaacga txrttgtaga aaccatcggc 2460 gcagctattt acccgqagga caqatccacg ccctcctaca tcgaagctga aagcacgaga 2520 ztcttvgccc tccgagagct gcatcaggtc ggagacgctg tcgaacrttt. cgatcagaaa 2560 cttctcgaca gacgtcgcgg !_gagtr.cagg catgergatg tctgctcaag cggggtagct 2640 gataqtcaag ctgcgatgaa gtgggaaagc tcgaactgaa aggttcaaag gaataaggga 27CC tgggaaqgat qgagtatqga tgcagcaaag tacttectta qgggaaataa aggttcttgg 27 60 10/29 österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 atgggaagat gaatatactg aagatgggaa aagaaagaga aaagaaaaga gcagctggtg 2820 gggagagcag gaaaatatcg caacaaatgt tggactgacg caacgacctt ctcaaccccg 2880 ccgacacacc gggcggacag acggggcaaa gctgcctacc agggaetgag ggacctcagc 2940 aggtegagtg cagagcaccg gatgggtcga ctgccagctt gtgttcccgg tctgcgccgc 3000 tgaccagcto ctgagcggcc tttccggttt catacaccgg gcaaagcagg agaggeaega 3060 tatttggaeg ccctacagat gccggatggg ecaattaggg agettaegeg ccgggtactc 3120 gctctaccta cttcggaaaa ggtactatct egtgaatett ttaccagatc ggaagcaatt 3180 ggaettetgt acctaggtta atggcatact atttegeega cggctataca cccctggctt 3240 cacattctcc ttegettaet geeggtgatt egatgaaget ccatattctc egatgatgea 3300 atagattett ggteaaegag gggcacacca gcctttccac ctcggggcgg aggggcggcc 3360 ggteeeggat taataatcat ecactgcaec tcagagccgc eagagetgte tggccagtgg 3420 cttattactc agcccttctc tctgcgtccg tccgtctctc cgcatgccag aaagagteae 3480 cggtcactgt acagagctca egagttegte acatttttct acaaatggtg gaggeggegg 3540 attttagget caagtcatga ccctctgggt cactccagaa teagetaggt caacgaataa 3600 ggatgattet ataggaagat ccaggcaccg gtcaaccatg atctggacag atttgggagc 3660 teggtataag ctctccacct atettattet gtatagttta ggcttaaagt ttatccagga 3720 gatgttgctg aagtcgattt gagtccactt cctcactggt agetataega etttgatggt 3780 cgttgtaggg getgtattag gtetegatea aacacaaata gaattaaatg gtactcgagt 3840 ccactgaagg tggcttctcc atetteegta gccgtgccga aatccttaca gcttgtgttg 3900 tgtgactttt ggttacgccg tetgaetttt gtggtgagct aactagagat catgctatat 3960 ctcctgattt aatacaatgc tcatcataac attccacctg gaactgctag caacgtttga 4020 ettgeattgt gcaacgccct ttgeagaget ateggatgat caatagtgcc acgttctaaa 4080 ttcaaccaac gcaggtgccc caagcettcg acatccggat gtatttcgaa aacctcatgg 4140 egattgeagt cctcagattc atgttcattc caatgctcat tggtgaataa aaggtteaca 4200 qggaataagt tcaaactcga gataettgag aatattgaaa gccaaaggac cctctatgct 4260 ccaagctaga gtctcagcct ggaaagcaaa tccaaatgaa gcnatgctac ctccaattcc 4320 tcatcatctt atetataata eagagtegaa gaatatcctc ntgacaccgc tccgtcctcc 4380 gacttcaata aggagcttac tcctccttga caccacccct ccagttette teggegttet 4440 ggagggaggc ettgteggte ttgggctggc cctggctgag aaaactgttg gcagccttaa 4500 agggacgctg gaggteacca gtcgctggct tcccgaagac atggatctta accagattcg 4560 aaagegeett eageggatga tcgactggat eagaagageg ttggtgtact tgaagtacag 4620 atgeatgaeg gccatcatgc caacgcccat gaactggetc ttaatgaget ggcagaactg 4680 gcccttatcg tactccatgt tggtagttgt gacaggacga ggctcctcgc cgcttccaag 4740 cggagcaggc tegaegtatt teagtgtega aagatctgca gagattaett caagtcagcc 4800 aactgcaaac agaatatccc gccaatagct “tgggacgat gcaagatata aacgaaaaag 4860 aegaaeegtt ettettattg atttgagcct gtgtgtagag atacaaagga attegtaate 4920 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaa'tccac acaacatacg 4980 ageeggaage ataaagtgta aagcctgagg tgcctaatga gtgagetaae tcacattaat 5040 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccaatc gccaaacczg tcgtgccagc zgcattaätg 5100 aatcggccaa cgegcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 5160 cactgactcg ctgcgctcgg tcgr.tcggct geggegageg gtatcacctc aezeaaagge 5220 ggtaataegg ttatccacag aatcagggga taaegeagga aagaacatgt gagcaaaagg 5280 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaagc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggeteeg 5340 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgaeg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5400 actataaaga taccaggegt ttccccctgg aagccccctc gtgcgctctc ctgltccgae 5460 cctgccgctt accggatacc tgnccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5520 tagctcacac tgtaggratc tcagtt:cggt gtaggtcgtt cgctccaagc icqgctgtgt 550C gcacaaaccc cccgttcagc ccgaecgctg cgccttarcc ggtaactatc gtettgagte 5640 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actgataaca ggattagcag 5700 agegaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tqgcctaact acggctacac 576C tagaaggaca gtatttggr.a tctgcgctct gr.tgaagcca gttaccttcg gsaaaagagt 5820 tggtagetet tgatccggca aacaaaccac cgctcgtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 5860 gcagcagatt aegegeagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctctgatct tttctacggg 5940 ctctgacgct cagtggaacg aaaactcaeg ctaaqqgatt rtggtcatga gattatcaaa 6000 aaggatette acctagatcc tlttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa ictaaagtst 6060 aratgactaa acttggictg acagtracca atgettaate sgegaggeae etateteage 6120 gatetgteta tttcgttcat ccatagttqc ctgactecee gr.cgtgtaga taact.acgat 6130 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgsta ccgcgagacc cacgctcacc 624C ggctccacat ttaicaacaa taaaccagcc ageeggaagg gccgagcqca gaagtggtcc 6300 tccaacttta Lccgcctcca tccagterat taattgttge egggaageta gagtaagtag 6360 -tcaccagtt aatagtrtgc geeaegttgt tgccattgct acagccatcg tggtqtcacg 6420 ctcg-cgttt ggqatggcct cavtcagctc cggtLcccaa cgatcaaggc gacttacatg 6480 11 /29

österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 atcccccatg taagttggcc catgccatcc atagtgtatg acatagcaga aaggatetta ttcagcatct cgcaaaaaag atattattga ttagaaaaat ctaagaaacc tegtetegeg ggtcacagct gggtgttggc agtgcaccat gcgccattcg getattaege agggttttcc ggtcgagtgg attacctcta aaaagtttcg actattgtat gtcctgtagg tggtgacgga aattagagac tettgaegae etattettet cattgeagat catggagcta atcgagatcc. cgtccccaca gctcccacct atgggtttgg cgggctctgg gatgacgccc gtacgcagcc ggaaaactgc tacgaagggg ttgtgcaaaa gcagtgttat gtaagatget cggcgaccga actttaaaag ccgctgttga tttaetttea ggaataaggg agcatttatc aaacaaatag attattatca cgtttcggtg tgtetgtaag gggtgtcggg atgcggtgtg ccattcaggc eagetggega cagtcacgac agatgtggag aacaagtgta geeggegtat accatcttag ettgagagtt attttcatag aaatatatag cgttgatctg cttcgccgga gagetgtate ttaaatcact tgaacaccat atagccatga ergattaagc aegagettga rtgtaaatct aatctcctgc ctgaactacg cccatgccag gaataaccaa aagcggttag cactcatggt tttctgtgac gttgctcttg tgctcatcat gatccagttc ccagcgtttc egacaeggaa agggttattg gggttccgcg tgacattaac atgacggtga eggatgeegg gctggcttaa aaataccgca tgcgcaactg aagggggatg gttgtaaaac tgggcgctta cctgtgcatt tgggtgttac taggaantga caaggaagaa teaagetate tcgcgtggag ettgateteg gcctgnaagg tggaagaggt agaaggcact ttgtctcaac gccgttcgac cgcgggcgrc acgggcttga tgttgttaca atgttgtgtc catgataagt ttgatetget tgcctctgct ctccttcggt tatggcagca tggtgagtac cccggcgtca tggaaaacgt gatgtaaccc tgggtgagca atgttgaata tctcataagc cacatttccc ctataaaaat aaacctctga gagcagacaa etatgeggea eagatgegta ttgggaaggg tgetgeaagg gacggccagt cacagtacac ctgggtaaac ggagcattca tttcgaggtt acatgcaatt agagtaaaga ccaagagegg tctcccgaaa cgttactagg aaacccgaaa etttgetget teeggagetg gccatctcgg agcoaccagc acgggcctga gctacctagg tetgtateeg catgttcgtc tggggtgatg ttcagt ttca cctccgatcg ctgcataatt tcaaccaagt ataegagata tcttcggggc actcgtgcac aaaacaggaa ctcatactct ggatacatat cgaaaagtgc aggegtatea cacatgcagc gcccgtcagg tcagagcaga aggagaaaat egateggtge egattaagtt gccaagcttg gaggaettet gaetcatagg ctaggcaacc tatacctacg atetttgega agaggagcat attcctcagt atgaaaatag ttgcagtcaa aegegrttts tggacaaatg acatcaacac etttgtetga caccgtttag ccatcaccaa tagaaaacgt tgtggaactt gtccacttct caaegaagaa gcacc ttgteagaag ctcttactgt cattctgaga ataccgcgcc gaaaactctc ccaactgatc ggcaaaatgc teetttttea ttgaatgtat cacctgacgt cgaggccctt tcccggagac gcgcgtcagc ttgtactgag accgcatcag gggcctcttc gggtaaegee catgcctgca agaaagaagg agagttgtaa atgcatggtt atgaatgtgt acccaggngc gtcaaagtac etegtaggte etetgetaag tgcattaatg ttcttgttga aaegtatett caacgagcgg ctgctaagta ccacctgccg ggaacagctt gtggaacaag cttactatct ctgaaatgaa ettttagata 6540 6600 6660 6720 6780 6840 6900 6960 7020 7080 7140 7200 7260 7320 7380 7440 7500 7560 7620 7 680 7740 7800 7860 7920 7980 8040 8100 8160 8220 8280 8340 8400 8460 8520 8580 8 64 0 8700 8745 [0062] Daraus geht sowohl die erfindungsgemäße Nukleotidsequenz (hax1 Nukleotidsequenz (Seq.lD.Nr.2)), die cDNA (Transkript (Seq.lD.Nr.3))- und Proteinsequenz (Seq.lD.Nr.1) sowie verschiedene Merkmale der Sequenz hervor. Der 633 bp lange offene Leserahmen des erfindungsgemäßen Gens wird von zwei Introns unterbrochen. Das Hax1-Expressionsprodukt ist 211 Aminosäuren lang und das berechnete Molekulargewicht beträgt 55,5 kDa.

[0063] In Fig.5 und in den nachfolgenden Tabellen 3 a), b), c) und d) ist schließlich die Transkriptanalyse eines Insertions-Stammes (QHR1) versus Ausgangsstamm (QM9414) gezeigt, aus welcher sich ergibt, dass es sich bei hax1 jedenfalls um eine transkribierbare RNA handelt.

[0064] Tab. 3 a): Transkription hax1

Stamm Kultivierungsbedingung et QM9414 1 % Glukose, 3 h 37,51 0,5 mM Xylose, 3 h 36,32

[0065] Tab. 3b): Vergleich Transkript hax1 mRNA mit cDNA

Stamm Templat et QM9414 mRNA 32,27 cDNA 26,09 12/29 österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 [0066] Tab. 3 c): Transkription xyr1

Stamm Kultivierungsbedingung ct QM9414 1% Glukose, 3 h 30,52 0, 5 mM Xylose, 3 h 27,42 QHR1 1 % Glukose, 3 h 32,05 0,5 mM Xylose, 3 h 31,44 [0067] Tab. 3 d) Transkription des Gens kodierend für das „unknown Protein"

Stamm Kultivierungsbedingung ct QM9414 1% Glukose, 3 h 32,26 0,5 mM Xylose 3h 32,24 QHR1 1% Glukose, 3 h 31,46 0, 5 mM Xylose 3 h 32,62

Legende: ct bedeutet Thresholdcycle und ist in der quantitativen PCR ein Maß für die Menge an vorhandenem Ausgangstemplat; je höher dieser Wert desto niedriger die Ausgangsmenge und vice versa [0068] Diese Daten zeigen, [0069] - dass hax1 kein Pseudogen ist, sondern tatsächlich ein Transkript liefert (Tab. 3a)), [0070] - dass eine Kontamination dieses Nachweises durch DNA ausgeschlossen werden kann, da auch direkte Amplifikation von mRNA ausgehend ein Transkript liefert (Tab. 3b)), [0071] - dass die Transkription von xyr1 (kodierend für den allgemeinen Hydrolaseaktivator

Xyrl) in einem Insertionstransformanten-Stamm (bsp. QHR1) stark reduziert ist, auch unter induzierenden Bedingungen (Xylose) (Tab. 3c)), [0072] - dass die Transkription des dem hax1 direkt benachbarten Gens, kodierend für ein „unknown Protein", unbeeinflusst ist (Tab. 3 d)). 13/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

SEQUENZPROTOKOLL <110> Technische Universität Wien <12Q> Hydrolase-Aktivator <130> R 55484 <160> 15 <170> Patentin version 3.4

<210> 1 <211> 211 <212> PRT <213> Trichoderma reesei <400> 1

Met Ala Ser Asn Gly ser Trp Leu Leu Trp Gly Arg Ser ser cys ser 1 5 10 15 Ala Gin Pro Ala Gly Ala Lys Thr Glu Trp Met Ala Gly Arg Glu Glu 20 25 30 val Glu Asn Hi s Lys Ala val val Gin Cys Arg Gl n Ala Pro Ala Leu 35 40 45 Gly ser Arg Phe Ala Ala His Leu Ala Pro Pro Leu Ala pro Thr Glu 50 55 60 Pro 65 Giy Ile Hi s Pro Pro 70 Ala Ala Leu Leu Lys 75 Val Leu Ala val Ala 80 Pro Arg Leu Ile Gin 85 His Ala Gin Leu Arg 90 Pro val Ala Leu pro 95 Gly Ser Ser Ala Ala Ala His Ala Arg Pro Leu ser Arg Gly Ala Leu His 100 105 110 Arg Thr Ala 115 Ala Arg Ala s er Lys 120 Pro pro Ala Thr Gin 125 Tyr Tyr Arg Ser pro Ala Al a Arg Leu His Cys Leu pro pro Gly Arg 5er ser Thr 130 135 140 Ser 145 Thr cys Ser Ser Arg 150 Pro Pro Leu ser Pro 155 Asp Arg Arg pro cys 160 Ala ASP ser Ser His 165 Arg Ser Leu Asn Trp 170 Ala pro Ile Ala Ala 175 Trp Thr Trp Gly Leu 180 Phe Ser His Gly Ile 185 Ile Gin pro Lys Ala 190 Gly Arg Ala Glu Al a 195 Ala ser Gin Thr Pro 200 Pro Val Arg Phe val 205 Leu Arg Thr 14/29 2 2 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

Arg Pro Phe 210

<210> 2 <211> 1674 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 2 ggtgctgaaa ctcaaagcag aggcattggt tattccccct tcgtatatct aaaagttctt 60 cgttgcatca ccccaagcag atcaactggc atggggcagt tttccttcat ttcagagaag 120 tggacgacga acatgactta tcatgcgtag ctcagggctg cgtacagata gtaagaagtt 180 ccacacggat acagagacac aacatgcagg agattgggcg tcatccttgt tccacacgtt 240 ttctacctag gtagctgtaa caacaagatt tacaaccaga gcccgaagct gttccttggt 300 gatggtcagg cccgttcaag cccgttcaag cccgtccaaa cccaccggca ggtggctaaa 360 cggtggctgg tggctgacgc ccgcggctta atcagaggtg ggagctactt agcagtcaga 420 caaagccgag atggcgtcga acggctcatg gctattgtgg ggacgcagct cctgttcggc 480 ccagcccgca ggtgctaaaa ctgaatggat ggctgggaga gaagaagtcg agaaccataa 540 ggtgacgaca ataccaagaa gtcggtgtat cgtagatact caatggccag atgaaatgcg 600 tgtaaatgat tacatacttc cgtaccttag gctgtggtgc aatgtcgcca ggcaccggcg 660 ctgggaagca gattcgcggc gcacctcgca ccaccactag gtcaacacca gcctcatcga 720 acctgtactc ctccattatt attactccat actccagctc caacagaacc aggaatccat 780 cctcctgccg ctctgctcaa agtacttgca gtagcccctc gactcatcca gcacgctcag 840 ctccgccccg ttgcactccc cggctcctta gccgcagcac atgcgcggcc tctctcgcgc 900 ggtgccttgc atcgtaccgc tgctcgagca tcaaaacctc cagccaccca atattatcgc 960 tcgccggccg ctcgcctcca ctgcctcccc cccggtcgct cctccacctc gacctgcagc 1020 tcccgaccgc ctctttcgcc cgatcgcagg ccctgcgctg attcgtccca ccgctcgctc 1080 aattgggctc caatcgcagc ttggacttgg ggccttttca gtcacggcat cattcagccc 1140 aaggccggtc gagcagaggc agcttcgcaa acccccccgg ttcggttcgt tttgcggacg 1200 aggccctttt gagcacttgg agcttctgcc agttacctaa ccggcggaaa tattttcttt 1260 cctactctgc tctcttccct tgtcccgacg gttctgttca gacgaagtaa tagcaccagc 1320 aacgacagca tctgcccgca cttggtaggc tgcgcgcttc tgcattgcct tggagaacag 1380 aggttgacag ctgcaggagc ccccagcagc tgaccggagg caatctcccc ccgtacatct 1440 ccgccctact tctcacgcct ttcggccttc ttttgggcaa tcgagtttcg ataatacctt 1500 tcttgggagc tcccatcacg gaatcataca cctcaccttg ccgtgctcgg cctccagcct 1560 acggctaagc atcgtctcct tttgcgctga gttggtctcg agcccagcct tggtgctgcc 1620 ttggcgatag taccaccatc tctcacaagt tactcgacca tcacaggcgc gacc 1674 <210> 3 <211> 636 15/29 3 3 österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15

<212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 3 atggcgtcga acggctcatg gctattgtgg ggacgcagct cctgttcggc ccagcccgca 60 ggtgctaaaa ctgaatggat ggctgggaga gaagaagtcg agaaccataa ggctgtggtg 120 caatgtcgcc aggcaccggc gctgggaagc agattcgcgg cgcacctcgc accaccacta 180 gctccaacag aaccaggaat ccatcctcct gccgctctgc tcaaagtact tgcagtagcc 240 cctcgactca tccagcacgc tcagctccgc cccgttgcac tccccggctc ctcagccgca 300 gcacatgcgc ggcctctctc gcgcggtgcc ttgcatcgta ccgctgctcg agcatcaaaa 360 cctccagcca cccaatatta tcgctcgccg gccgctcgcc tccactgcct cccccccggt 420 cgctcttcca cctcgacctg cagctcccga ccgcctcttt cgcccgatcg caggccctgc 480 gctgattcgt cccaccgctc gctcaattgg gctccaatcg cagcttggac ttggggcctt 540 ttcagtcacg ra gcccaaggcc ggtcgagcag aggcagcttc gcaaaccccc 600 ccggttcggt tcgttttgcg gacgaggccc ttttga 636 <210> 4 <211> 1674 <212> DNA <213> Trichoderma reesei <400> 4 ggtcgcgcct gtgatggtcg agtaacttgt gagagatggt ggtactatcg ccaaggcagc 60 accaaggctg ggctcgagac caactcagcg caaaaggaga cgatgcttag ccgtaggctg 120 gaggccgagc acggcaaggt gaggtgtatg attccgtgat gggagctccc aagaaaggta 180 ttatcgaaac tcgattgccc aaaagaaggc cgaaaggcgt gagaagtagg gcggagatgt 240 acggggggag attgcctccg gtcagctgct gggggctcct gcagctgtca acctctgttc 300 tccaaggcaa tgcagaagcg cgcagcctac caagtgcggg cagatgctgt cgttgctggt 360 gctattactt cgtctgaaca gaaccgtcgg gacaagggaa gagagcagag taggaaagaa 420 aatatttccg ccggttaggt aactggcaga agctccaagt gctcaaaagg gcctcgtccg 480 caaaacgaac cgaaccgggg gggtttgcga agctgcctct gctcgaccgg ccttgggctg 540 aatgatgccg tgactgaaaa ggccccaagt ccaagctgcg attggagccc aattgagcga 600 gcggtgggac gaatcagcgc agggcctgcg atcgggcgaa agaggcggtc gggagctgca 660 ggtcgaggtg gaggagcgac cgggggggag gcagtggagg cgagcggccg gcgagcgata 720 atattgggtg gctggaggtt ttgatgctcg agcagcggta cgatgcaagg caccgcgcga 780 gagaggccgc gcatgtgctg cggctgagga gccggggagt gcaacggggc ggagctgagc 840 gtgctggatg agtcgagggg ctactgcaag tactttgagc agagcggcag gaggatggat 900 tcctggttct gttggagctg gagtatggag taataataat ggaggagtac aggttcgatg 960 aggctggtgt tgacctagtg gtggtgcgag gtgcgccgcg aatctgcttc ccagcgccgg 1020 tgcctggcga cattgcacca cagcctaagg tacggaagta tgtaatcatt tacacgcatt 1080 tcatctggcc attgagtatc tacgatacac cgacttcttg gtattgtcgt caccttatgg 1140 16/29 4 4 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 ttctcgactt cttctctccc agccatccat caggagctgc gtccccacaa tagccatgag tgctaagtag ctcccacctc tgattaagcc cacctgccgg tgggtttgga cgggcttgaa gaacagcttc gggctctggt tgtaaatctt tggaacaagg atgacgccca atctcctgca ttactatctg tacgcagccc tgagctacgc tgaaatgaag gaaaactgcc ccatgccagt ttttagatat acgaaggggg aataaccaat tcagttttag cacctgcggg ctgggccgaa ccgttcgacg ccatctcggc tttgtctgac gcgggcgtca gccaccagcc accgtttagc cgggcttgaa cgggcctgac catcaccaag gttgttacag ctacctaggt agaaaacgtg tgttgtgtct ctgtatccgt gtggaacttc atgataagtc atgttcgtcg tccacttctc tgatctgctt ggggtgatgc aacgaagaac gcctctgctt tgagtttcag cacc 1200 1260 1320 1380 1440 1500 1560 1620 1674 <210> 5 <211> 8745

<212> DNA <213> Trichoderma reesei <220> <221> misc_feature <22 2> ¢1310)..(1310) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> ¢7767)..(7767) <223> n is a, c, g, or t <220> <221> misc_feature <222> ¢7858)..(7858) <223> n i s a, c, g, or t <220> <221> nrisc„feature <222> (8066)..(8066) <223> n is a, c, g, or t <400> 5 ggtcgcgcct gtgatggtcg agtaacttgt accaaggctg ggctcgagac caactcagcg gaggccgagc acggcaaggt gaggtgtatg ttatcgaaac tcgattgccc aaaagaaggc acggggggag attgcctccg gtcagctgct tccaaggcaa tgcagaagcg cgcagcctac gctattactt cgtctgaaca gaaccgtcgg aatatttccg ccggttaggt aactggcaga caaaacgaac cgaaccgggg gggtttgcga aatgatgccg tgactgaaaa ggccccaagt gcggtgggac gaatcagcgc agggcctgcg ggtcgaggtg gaggagcgac cgggggggag gagagatggt ggtactatcg ccaaggcagc caaaaggaga cgatgcttag ccgtaggctg attccgtgat gggagctccc aagaaaggta cgaaaggcgt gagaagtagg gcggagatgt gggggctcct gcagctgtca acctctgttc caagtgcggg cagatgctgt cgttgctggt gacaagggaa gagagcagag taggaaagaa agctccaagt gctcaaaagg gcctcgtccg agctgcctct gctcgaccgg ccttgggctg ccaagctgcg attggagccc aattgagcga atcgggcgaa agaggcggtc gggagctgca gcagtggagg cgagcggccg gcgagcgata 60 120 180 240 300 360 420 480 540 600 660 17/29 720 5 5 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 atattgggtg gctggaggtt ttgatgeteg ageageggta egatgeaagg caccgcgcga 780 gagaggeege gcatgtgctg eggetgagga gccggggagt gcaacggggc ggagetgage 840 gtgctggatg agtcgagggg ctactgcaag taetttgage agageggeag gaggatggat 900 tcctggttct gttggagctg gagtatggag taataataat ggaggagtac aggttcgatg 960 aggctggtgt tgacctagtg gtggtgcgag gtgcgccgcg aatetgette ccagcgccgg 1020 tgcctggcga cattgcacca cagcctaagg taeggaagta tgtaatcatt tacacgcatt 1080 tcatctggcc attgagtatc tacgatacac egaettettg gtattgtegt caccttatgg 1140 ttetegaett cttctctccc agccatccat tcagttttag cacctgcggg ctgggccgaa 1200 caggattcct eagtetegta ggtctcttga cgaccgttga tetgettgat ctcgtctccc 1260 gaaaatgaaa atagetetge taagetatte ttctcttcgc cggagcctgn aaggcgttac 1320 taggttgcag teaatgeatt aatgeattge agatgagctg tatetggaag aggtaaaccc 1380 gaaaacgcgt tttattcttg ttgacatgga getattaaat cactagaagg cactctttgc 1440 tgcttggaca aatgaacgta tettategag atcctgaaca ccatttgtct caactccgga 1500 gctgacatcg acaccaacga tcttatatcc agattegtea agctgtttga tgatttcagt 1560 aaegttaagt ggatcccgcg gteggeatet actctattcc tttgccctcg gaegagtget 1620 ggggcgtcgg tttccactat cggcgagtac ttctacacag ccatcggtcc agacggccgc 1680 gettetgegg gegatttgtg tacgcccgac agtcccggct eeggategga egattgegte 1740 gcatcgaccc tgcgcccaag ctgcatcatc gaaattgeeg tcaaccaagc tetgatagag 1800 ttggtcaaga ccaatgcgga geatataege ccggagccgc ggcgatcctg caagctccgg 1860 atgcctccgc tegaagtage gegtetgetg ctccatacaa gccaaccacg gcctccagaa 1920 gaagatgttg gcgacctcgt attgggaatc cccgaacatc gcctcgctcc agteaatgae 1980 cgctgttatg cggccattgt ccgtcaggac attgttggag ccgaaatccg egtgeaegag 2040 gtgccggact tcggggcagt cctcggccca aagcatcagc teategagag cctgcgcgac 2100 ggacgcactg aeggtgtegt ccatcacagt ttgccagtga tacacatggg gatcagcaat 2160 egegeatatg aaatcacgcc atgtagtgta ttgaeegatt ccttgcggtc cgaatgggcc 2220 gaacccgctc gtctggctaa gatcggccgc agegategea tccatggcct ccgcgaccgg 2280 ctgcagaaca gcgggcagtt cggtttcagg eaggtettge aacgtgacac cctgtgcacg 2340 gcgggagatg caataggtea ggctctcgct gaattcccca atgtcaagca etteeggaat 2400 cgggagcgcg geegatgeaa agtgeegata aacataacga tetttgtaga aaccatcggc 2460 geagetattt acccgcagga catatccacg ccctcctaca tegaagetga aagcacgaga 2520 ttcttcgccc teegagaget gcatcaggtc ggagacgctg tegaaetttt cgatcagaaa 2580 cttctcgaca gaegtegegg tgagttcagg catggtgatg tctgctcaag cggggtagct 2640 gttagteaag ctgcgatgaa gtgggaaagc tcgaactgaa aggttcaaag gaataaggga 2700 tgggaaggat ggagtatgga tgtagcaaag taettaetta ggggaaataa aggttcttgg 2760 atgggaagat gaatatactg aagatgggaa aagaaagaga aaagaaaaga gcagctggtg 2820 18/29

österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 6 gggagagcag gaaaatatgg caacaaatgt tggactgacg caacgacctt gtcaaccccg 2880 ccgacacacc gggcggacag acggggcaaa gctgcctacc agggactgag ggacctcagc 2940 aggtcgagtg cagagcaccg gatgggtcga ctgccagctt gtgttcccgg tctgcgccgc 3000 tggccagctc ctgagcggcc tttccggttt catacaccgg gcaaagcagg agaggcacga 3060 tatttggacg ccctacagat gccggatggg ccaattaggg agcttacgcg ccgggtactc 3120 gctctaccta cttcggagaa ggtactatct cgtgaatctt ttaccagatc ggaagcaatt 3180 ggacttctgt acctaggtta atggcatgct atttcgccga cggctataca cccctggctt 3240 cacattctcc ttcgcttact gccggtgatt cgatgaagct ccatattctc cgatgatgca 3300 atagattctt ggtcaacgag gggcacacca gcctttccac ttcggggcgg aggggcggcc 3360 ggtcccggat taataatcat ccactgcacc tcagagccgc cagagctgtc tggccagtgg 3420 cttattactc agcccttctc tctgcgtccg tccgtctctc cgcatgccag aaagagtcac 3480 cggtcactgt acagagctca cgagttcgtc acatttttct acaaatggtg gaggcggcgg 3540 attttaggct caagtcatga ccctctgggt cactccagaa tcagctaggt caacgaataa 3600 ggatgattct ataggaagat ccaggcaccg gtcaaccatg atctggacag atttgggagc 3660 tcggtataag ctctccacct atcttattct gtatagttta ggcttaaagt ttatccagga 3720 gatgttgctg aagtcgattt gagtccactt cctcactggt agctatacga ctttgatggt 3780 cgttgtaggg gctgtattag gtctcgatca aacacaaata gaattaaatg gtactcgagt 3840 ccactgaagg tggcttctcc gtcttccgta gccgtgccga aatccttaca gcttgtgttg 3900 tgtgactttt ggttacgccg tctgactttt gtggtgagct aactagagat catgctatat 3960 ctcctgattt aatacaatgc tcatcataac attccacctg gaactgctag caacgtttga 4020 cttgcattgt gcaacgccct ttgcagagct atcggatgat caatagtgcc acgttctaaa 4080 ttcaaccaac gcaggtgccc caagccttcg acatccggat gtatttcgaa aacctcatgg 4140 cgattgcagt cctcagattc atgttcattc caatgctcat tggtgaataa aaggttcaca 4200 gggaataagt tcaaactcga gatacttgag aatattgaaa gccaaaggac cctctatgct 4260 ccaagetaga gtctcagcct ggaaagcaaa tccaaatgaa gctatgctac ctccaattcc 4320 tcatcatctt atctataata cagagtcgaa gaatatcctc ttgacaccgc tccgtcctcc 4380 gacttcaata aggagcttac tcctccttga caccacccct ccagttcttc tcggcgttct 4440 ggagggaggc cttgtcggtc ttgggctggc cctggctgag aaagctgttg gcagccttaa 4500 agggacgctg gaggtcacca gtcgctggct tcccgaagac gtggatctta accagattcg 4560 aaagcgcctt cagcggatga tcgactggat cagaagagcg ttggtgtact tgaagtacag 4620 atgcatgacg gccatcatgc caacgcccat gaactggctc ttaatgagct ggcggaactg 4680 gcccttatcg tactccatgt tggtagttgt gacaggacga ggctcctcgc cgcttccaag 4740 cggagcaggc tcgacgtatt tcagtgtcga aagatctgca gagattactt caagtcagcc 4800 aactgcaaac agaatatccc gccaatagct ttgggacgat gcaagatata aacgaaaaag 4860 acgaaccgtt cttcttattg atttgagcct gtgtgtagag atacaaggga attcgtaatc 4920 19/29

österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 7 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 4980 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 5040 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 5100 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 5160 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 5220 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 5280 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 5340 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 5400 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 5460 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 5520 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 5580 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 5640 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 5700 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 5760 tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 5820 tggtagctct tgatccggca aacaaactac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 5880 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 5940 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 6000 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 6060 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 6120 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 6180 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 6240 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 6300 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 6360 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 6420 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 6480 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 6540 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 6600 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 6660 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 6720 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 6780 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 6840 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 6900 cgcaaaaaag ggaaraaggg cgacacggaa argttgaata ctcatactct tcctttttca 6960 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 7020 20/29

österreichisches Patentamt AT509 050 B1 2011-06-15 8 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt 7080 ctaagaaacc attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt 7140 tcgtctcgcg cgtttcggtg atgacggtga aaacctctga cacatgcagc tcccggagac 7200 ggtcacagct tgtctgtaag cggatgccgg gagcagacaa gcccgtcagg gcgcgtcagc 7260 gggtgttggc gggtgtcggg gctggcttaa ctatgcggca tcagagcaga ttgtactgag 7320 agtgcaccat atgcggtgtg aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag 7380 gcgccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc 7440 gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc 7500 agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt gccaagcttg catgcctgca 7560 ggtcgagtgg agatgtggag tgggcgctta cacagtacac gaggacttct agaaagaagg 7620 attacctcta aacaagtgta cctgtgcatt ctgggtaaac gactcatagg agagttgtaa 7680 aaaagtttcg gccggcgtat tgggtgttac ggagcattca ctaggcaacc atgcatggtt 7740 actattgtat accatcttag taggaantga tttcgaggtt tatacctacg atgaatgtgt 7800 gtcctgtagg cttgagagtt caaggaagaa acatgcaatt atctttgcga acccaggngc 7860 tggtgacgga attttcatag tcaagctatc agagtaaaga agaggagcat gtcaaagtac 7920 aattagagac aaatatatag tcgcgtggag ccaagagcgg attcctcagt ctcgtaggtc 7980 tcttgacgac cgttgatctg cttgatctcg tctcccgaaa atgaaaatag ctctgctaag 8040 ctattcttct cttcgccgga gcctgnaagg cgttactagg ttgcagtcaa tgcattaatg 8100 cattgcagat gagctgtatc tggaagaggt aaacccgaaa acgcgtttta ttcttgttga 8160 catggagcta ttaaatcact agaaggcact ctttgctgct tggacaaatg aacgtatctt 8220 atcgagatcc tgaacaccat ttgtctcaac tccggagctg acatcgacac caacgagcgg 8280 cgtccccaca atagccatga gccgttcgac gccatctcgg ctttgtctga ctgctaagta 8340 gctcccacct ctgattaagc cgcgggcgtc agccaccagc caccgtttag ccacctgccg 8400 gtgggtttgg acgggcttga acgggcttga acgggcctga ccatcaccaa ggaacagctt 8460 cgggctctgg ttgtaaatct tgttgttaca gctacctagg tagaaaacgt gtggaacaag 8520 gatgacgccc aatctcctgc atgttgtgtc tctgtatccg tgtggaactt cttactatct 8580 gtacgcagcc ctgagctacg catgataagt catgttcgtc gtccacttct ctgaaatgaa 8640 ggaaaactgc cccatgccag ttgatctgct tggggtgatg caacgaagaa cttttagata 8700 tacgaagggg gaataaccaa tgcctctgct ttgagtttca gcacc 8745

<210> 6 <211> 22 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 6 cgcgctctct tttcctcctt gg 22 <210> 7 21 /29

österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 9

<211> 23 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 7 gcagaaccca ggacacaaag agc 23 <210> 8 <211> 32 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 8 cgtctggacc gatggctgtg tagaagtact cg 32

<210> 9 <211> 34 <212> DNA <213> artifizielle DNS <40Q> 9 gggatgggaa ggatggagta tggatgtagc aaag 34 <210> 10 <211> 20 <212> DNA <213> artifizielle dns <400> 10 cccattcggc ggaggatcag 20 <210> 11 <211> 26 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 11 cgaattctat acaatgggca catggg 26

<210> 12 <211> 21 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 12 cgccgtattg gggttcattg c 21 <210> 13 <211> 22 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 13 ggctaaacgt tgtctcggag gg 22

<210> 14 <211> 25 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 14 agtacttgca gtagcccctc gactc 22/29 25

Claims (14)

10 10 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15 <210> 15 <211> 20 <212> DNA <213> artifizielle DNS <400> 15 tccgcaaaac gaaccgaacc Patentansprüche 1. Isolierter Hydrolase-Aktivator mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.lD.Nr.1.

2. Isoliertes Hydrolase-Aktivator-Gen mit der Nukleinsäuresequenz gemäß Seq.lD.Nr.2.

3. Isoliertes Nukleinsäuremolekül mit einer Sequenz, die ausgewählt ist aus - (a) der Sequenz gemäß Seq.lD.Nr.2, - (b) einer Sequenz, die den offenen Leserahmen gemäß Seq.ID.Nr. 3 umfasst und nicht größer als 1 Mbp, vorzugsweise nicht größer als 100.000 bp, insbesondere nicht größer als 10.000 bp ist, und aus der ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.Nr. 1 exprimierbar ist, - (c) einer Sequenz, die nicht größer als 1 Mbp, vorzugsweise nicht größer als 100.000 bp, insbesondere nicht größer als 10.000 bp ist und aus der ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.ID.Nr. 1 exprimierbar ist, - (d) einer Sequenz, bei welcher ein heterologer Promotor im 5'-Bereich zur Seq.lD.Nr.3 platziert ist und mit Seq.lD.Nr.3 bzw. dem Transkript, enthaltend Seq.lD.Nr.3, operabel verknüpft ist, - (e) einer Sequenz, die komplementär zu (a), (b), (c) oder (d) ist.

4. Vektor, insbesondere Expressionsvektor, dadurch gekennzeichnet, dass er eine Nukleinsäuresequenz umfasst, die für ein Protein mit der Aminosäuresequenz gemäß Seq.lD.Nr.1 kodiert, oder eine dazu komplementäre Sequenz, insbesondere ein Vektor, der ein Nukleinsäuremolekül gemäß Anspruch 3 umfasst.

5. Trichoderma reesei Zelle, deren DNS in der Sequenz gemäß Seq.lD.Nr.2 verändert worden ist.

6. Trichoderma reesei Zelle gemäß Anspruch 5, wobei die Änderung ausgewählt ist aus - einer Insertion, Deletion oder Punktmutation, die zu einer verringerten Transkriptions-bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 oder einem Verlust derselben führt; - einer Insertion im 5' -Bereich des offenen Leserahmens der Seq.lD.Nr.2, wobei der Leserahmen Seq.lD Nr. 3 entspricht, welche Insertion zu einer erhöhten Transkriptions-bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 führt, und wobei die Insertion eine Transkriptions-Aktivator-Sequenz oder eine Promotorsequenz ist, insbesondere ein heterologer Promotor.

7. Trichoderma reesei-Zelle gemäß Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, dass im 5'-Bereich des offenen Leserahmens der Seq.lD.Nr.2 eine Sequenz eingesetzt ist, die ausgewählt ist aus cbh1-, cbh2-, xyn1-, xyn2-, xyn3-, egl1-5-, gna3-, env1-, cDNA1-, bxl1-, pki1-, gpdA-, gpd1- oder hex1-Promotor aus Trichoderma reesei oder biologisch funktionelle Fragmente davon.

8. Trichoderma reesei-Zelle, welche mit einem Expressionsvektor gemäß Anspruch 4 transformiert worden ist.

9. Zellkultur, umfassend Trichoderma reesei-Zellen nach einem der Ansprüche 5 bis 8. 23/29 österreichisches Patentamt AT509 050B1 2011-06-15

10. Verfahren zur Herstellung einer Hydrolasen-Präparation, wobei eine Zellkultur gemäß Anspruch 9, mit Zellen deren DNS einen heterologen Promotor im 5'-Bereich in operabler Verknüpfung mit Seq.lD.Nr.3 enthält, wodurch vorzugsweise eine erhöhte Hydrolase-Expression gegenüber der Wildtyp Sequenz Seq.lD..Nr.2 erfolgt, unter Bedingungen kultiviert wird, bei welcher Hydrolasen exprimiert werden, und Gewinnung der exprimierten Hydrolasen in an sich bekannterWeise.

11. Verfahren zur Kultivierung von Trichoderma reesei, dadurch gekennzeichnet, dass ein Trichoderma reesei Stamm mit einer Insertion, Deletion oder Punktmutation in der Seq.lD.Nr.2, die zu einer verringerten oder keiner Transkriptions- bzw. Expressionsfähigkeit des Genproduktes der Seq.lD.Nr.2 führt, in einem Kulturmedium vorgegeben wird und der Stamm bei einer Temperatur von 10 bis 50°C für mindestens 1 h inkubiert wird.

12. Verfahren nach Anspruch 10 oder 11, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur bei 20 bis 40°C, vorzugsweise bei 25 bis 35°C, inkubiert wird.

13. Verfahren nach einem der Ansprüche 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur für mindestens 5 h, vorzugsweise für mindestens 10 h, insbesondere für mindestens 24 h, inkubiert wird.

14. Verfahren nach einem der Ansprüche 9 bis 13, dadurch gekennzeichnet, dass die Zellkultur für mindestens 2 Tage, vorzugsweise für mindestens 5 Tage, insbesondere für mindestens 10 Tage inkubiert wird. Hierzu 5 Blatt Zeichnungen 24/29