CN109182241B - 一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用 - Google Patents
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Abstract
本发明属于基因工程技术领域的一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。所述表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的。本发明中所构建的工程菌，采用重组红球菌作为宿主菌，相比于重组大肠杆菌，其表达的环氧化物水解酶的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物耐受性/产物耐受性都有明显的优势。利用本发明中的工程菌用于催化生产光学纯(R)‑ECH，相比于采用相同游离酶进行的催化，(R)‑ECH的浓度提高了46％，收率提高了31％。相对于游离酶或者重组大肠杆菌，重组红球菌的综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用。
背景技术
环氧化物水解酶(Epoxide hydrolases)是一类重要的工业酶，可选择性催化水解外消旋环氧化物而得到手性环氧化物和相应的邻位二醇，在医药、农药和香料等方面有广阔的应用前景。环氧化物水解酶广泛存在于细菌、真菌、动物、植物中，其催化过程不需要金属离子或者辅酶参与，具有底物谱宽、催化效率高、对映体选择性高等优点。
手性环氧氯丙烷(ECH)是一种重要的手性合成砌块，在医药、农药、精细化工等领域有广泛的应用，比如，(R)-ECH是合成治疗心绞痛类药物(如美托洛尔、阿普洛尔)的关键手性中间体，(S)-ECH是他汀类药物的起始原料之一。目前已有很多研究者利用环氧化物水解酶拆分制备手性环氧氯丙烷。Choi等利用黑曲霉(Aspergillus niger)在环己烷-水(体积比为98:2)的两相体系中拆分(S)-ECH，底物浓度60mM，ee值大于99％，收率20％(Choi,etal.,1999,J Biosci Bioeng,88:339-341)。Lee等使用毕赤酵母(Pichia pastoris)重组表达来自胶红酵母(Rhodotorula glutinis)的环氧化物水解酶制备(R)-ECH，底物浓度50mM，ee值100％，收率26％(Lee,et al.,2004,Biotechnology and Bioprocess Engineering,9:62-64)。Woo等利用来源于海洋新鞘氨醇杆菌(Novosphingobium aromaticivorans)的环氧化物水解酶制备(S)-ECH，ECH浓度500mM，ee值大于99％，收率20.7％(Woo,et al.,2010,Journal of Bioscience and Bioengineering,110:295-297)。
由于产环氧化物水解酶野生菌的活性、对映体选择性和稳定性等问题，反应的底物浓度或者收率通常较低，在一定程度上限制了环氧化物水解酶的工业应用，因此环氧化物水解酶的重组表达和分子改造受到很多研究者的关注。格罗宁根大学对来自放射形农杆菌(Agrobacterium radiobacter)的环氧化物水解酶进行克隆表达和突变改造，使其对多种底物的对映体选择性大幅提高(EP879890-A1；EP1013768-A1；Van,et al.,2004,CHEMISTRY&BIOLOGY,11:981-990)。浙江工业大学将该酶在大肠杆菌中进行克隆表达和定向进化，用于拆分环氧氯丙烷制备(R)-ECH，其活性、对映体选择性和热稳定性均有所提高(Jin,et al.,2013,ENGINEERING IN LIFE SCIENCES,13:385-392；CN105734028A)。虽然环氧化物水解酶已被广泛应用，但为了适应工业催化过程的需求，其稳定性仍有待提高(包括热稳定性、pH稳定性、底物/产物耐受性等)。
红球菌是一种革兰氏阳性菌，在生物转化、生物降解和生物表面活性剂等方面有重要的应用，具有很高的商业价值。红球菌已广泛应用于丙烯酰胺、丙烯酸、羟基乙酸和烟酰胺等化学品的生产，在工业生物催化过程中表现出优越的稳定性，包括热稳定性和对有毒化合物的耐受性。清华大学化工系首次利用重组红球菌高表达外源腈水解酶，获得了高腈水解酶活性及高丙烯酸(铵)合成效率(Sun et al.Journal of IndustrialMicrobiology&Biotechnology.2016,43(12):1631-1639；于慧敏等，双基因敲除重组红球菌、构建方法及其应用，中国发明专利，CN105420154A)。
为了解决环氧化物水解酶催化生产手性环氧氯丙烷过程中的底物/产物耐受性差、底物浓度不高、拆分效率低等问题，急需开发新的工程菌进行环氧化物水解酶性能的提高。
发明内容
为了解决现有技术中环氧化物水解酶催化生产手性环氧氯丙烷过程中的底物/产物耐受性差、底物浓度不高、拆分效率低等问题，本发明提供一种表达环氧化物水解酶的工程菌，其可以生产特定来源的环氧化物水解酶，实现高表达及高稳定性水相催化，从而实现手性环氧氯丙烷的高效制备。
所述表达环氧化物水解酶的工程菌，其是将环氧化物水解酶基因转入红球菌(Rhodococcus ruber)而得到的。
上述工程菌中，所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌(Agrobacteriumradiobacter AD1)。
上述工程菌中，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
上述工程菌中，所述红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的红球菌。
上述工程菌中，优选的，所述赤红球菌为Rhodococcus ruber THdAdN(公开于中国专利文献CN105420154 A)
上述工程菌的构建方法，包括如下步骤：
优化环氧化物水解酶基因并合成，将环氧化物水解酶基因接入质粒构建环氧化物水解酶的表达载体；
将环氧化物水解酶的表达载体转化到赤红球菌中。
上述构建方法中，所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌。
上述构建方法中，优选的，所述环氧化物水解酶基因的核酸序列如序列表SEQ IDNO.1所示。
上述构建方法中，所述红球菌为赤红球菌(Rhodococcus ruber)，优选的，所述赤红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的赤红球菌。
上述构建方法中，优选的，所述赤红球菌为Rhodococcus ruber THdAdN(公开于中国专利文献CN105420154A)
上述构建方法中，所述质粒为大肠杆菌-赤红球菌穿梭质粒或者pET28a。
上述构建方法中，所述大肠杆菌-赤红球菌穿梭质粒为能够在大肠杆菌和红球菌中存活和复制。根据本发明的实施例，穿梭质粒为大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒，选自pNV18、pNV18.1、pNV19或其衍生质粒中的一种。
上述构建方法中，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒的启动子选自红球菌的酰胺酶启动子和红球菌的酰胺酶启动子的突变体中的一种。
上述构建方法中，所述大肠杆菌-红球菌穿梭质粒可以选择大肠杆菌-诺卡氏菌/红球菌穿梭质粒pNV18.1-Pa2(公开于中国专利文献CN105420154A)。
本发明还提供了上述工程菌在制备手性环氧氯丙烷中的应用。
本发明也提供了一种制备手性环氧氯丙烷的方法，所述方法包括如下步骤：
将包含上述工程菌的菌液加入反应器中，加入环氧氯丙烷，进行外消旋拆分。
本发明的有益效果
本发明中所构建的表达环氧化物水解酶的工程菌，采用重组红球菌作为宿主菌，相比于重组大肠杆菌，其表达的环氧化物水解酶的酶活、热稳定性、pH稳定性、底物耐受性/产物耐受性都有明显的优势：工程菌(重组红球菌)的酶活达到5.4U/mL，比重组大肠杆菌高5倍；重组红球菌环氧化物水解酶的55℃半衰期是重组大肠杆菌的10倍；在pH＝12.0缓冲液中浸泡30min，重组红球菌的剩余酶活为75％，而重组大肠杆菌基本完全失活；256mM ECH浸泡30min，重组红球菌的酶活没有损失，而重组大肠杆菌的剩余酶活只有26％。
利用本发明中的工程菌用于催化生产光学纯(R)-ECH，在底物浓度为512mM，可得到182mM的(R)-ECH，ee值98.5％，收率35.5％；相比于采用相同游离酶进行的催化，(R)-ECH的浓度提高了46％，收率提高了31％。相对于游离酶或者重组大肠杆菌，重组红球菌的综合性能优势明显，具有良好的工业应用前景。
附图说明
图1为不同环氧化物水解酶重组赤红球菌的全细胞蛋白电泳图。
图2为重组大肠杆菌生长曲线和酶活曲线。
图3为重组红球菌的生长曲线和酶活曲线。
图4为重组大肠杆菌和重组红球菌的稳定性比较。
图5为重组红球菌拆分环氧氯丙烷过程的底物浓度变化和ee值变化。
具体实施方式
下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明。如未特别指明，实施例中所用的生化试剂均为市售试剂，如无特殊说明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员书中的常规手段。
实施例1环氧化物水解酶基因的合成
为了使环氧化物水解酶在赤红球菌中实现高表达，对分别来自于放射农杆菌(Agrobacterium radiobacter)、胶红酵母(Rhodotorula glutinis)和黑曲霉(Aspergillus niger)的3个环氧化物水解酶基因(GenBank NO:Y18204、NO:AF172998、NO:AJ238460)进行密码子优化和基因合成。
以红球菌的密码子偏好性为参照对其进行序列优化，优化后打的3个环氧化物水解酶基因ArEH、RgEH和AnEH的核苷酸序列如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示，基因合成工作委托无锡青兰生物科技有限公司合成，基因合成后连接到pMV质粒，得到pMV-ArEH、pMV-RgEH和pMV-AnEH质粒；所述pMV质粒是pUC19载体的衍生载体，去除了pUC19载体上的LacZa基因及其中的多克隆位点，其质粒骨架序列如SEQ ID NO.4所示。
实施例2含环氧化物水解酶基因的表达载体的构建
以环氧化物水解酶基因ArEH为例，RgEH、AnEH的表达载体构建过程类似。
(1)环氧化物水解酶表达载体的构建
使用限制酶BamHI、EcoRI双酶切质粒pNV18.1-Pa2(公开于中国专利文献CN105420154A)得到质粒骨架；使用BamHI、EcoRI双酶切pMV-ArEH(由无锡青兰生物科技有限公司合成，实施例1中制备)得到ArEH基因片段。经DNA琼脂糖凝胶电泳分离后，切胶纯化回收后测定DNA浓度，按质粒骨架与片段的摩尔比为1:3～1:5，使用T4DNA连接酶连接过夜后得到pNV18.1-Pa2-ArEH，转化E.coli DH5α中，涂布于含卡那霉素50μg/mL的LB平板上，长出菌落后使用引物pNV-tests(gcgggcctcttcgctatt)和pNV-testa(cagagtcccgctcagaagaac)进行PCR验证，选取出现目标条带的菌落测序，测序正确的菌株使用甘油管保藏，存于-70℃冰箱。
LB培养基组成为：蛋白胨10g/L，酵母粉5g/L，氯化钠10g/L，琼脂粉15g/L。
(2)环氧化物水解酶在大肠杆菌中的表达载体的构建
以质粒pMV-ArEH为模板，使用引物BamHI-ArEH-sense(序列为CGGGATCCATGACCATCCGCCGCC)和HindIII-ArEH-anti(序列为CCCAAGCTTTCAGCGGAAGGCGGTCTT)PCR扩增，经DNA琼脂糖凝胶电泳后纯化回收得到ArEH的基因片段，两端带有BamHI、HindIII的酶切位点。PCR扩增反应体系为：
热循环条件为
用限制酶BamHI和HindIII双酶切ArEH片段和质粒pET28a，纯化回收后用T4DNA连接酶连接，将连接液转化到E.coli DH5α中，涂布于含卡那霉素50μg/mL的LB平板培养基上。待长出菌落，使用通用引物T7/T7ter做菌落PCR验证是否转化成功，挑取正确的菌落送测序，甘油管保藏测序结果正确的菌落，存于-70℃。
实施例3含环氧化物水解酶转化体的构建及环氧化物水解酶在转化体中的表达
(1)将实施例2获得含环氧化物水解酶基因的质粒采用电穿孔的方式(Jiao,etal.,2018,New Biotechnology,44:41-49)转入宿主菌赤红球菌R.ruber THdAdN(Sun etal.Journal of Industrial Microbiology&Biotechnology.2016,43(12):1631-1639；CN105420154A)。转化体采用含卡那霉素浓度为25mg/L的红球菌平板培养基进行筛选，从而得到重组赤红球菌。
得到的重组赤红球菌进行摇瓶发酵培养。首先在含有25mg/L卡那霉素的红球菌种子培养基中接种，于28℃、200rpm培养48h。从培养得到的种子液中接种10％至红球菌发酵培养基中，于28℃、200rpm培养48h，获得菌体保藏于-20℃。
红球菌平板培养基组成为：葡萄糖10g/L，酵母膏3g/L，NaCl 1g/L，K2HPO4·3H2O2g/L，MgSO4·7H2O 0.2g/L，琼脂15g/L。
红球菌种子培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母膏1g/L，蛋白胨7g/L，K2HPO4·3H2O0.5g/L，KH2PO4 0.5g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L。
红球菌发酵培养基组成为：葡萄糖30g/L，酵母膏7.5g/L，尿素10g/L，K2HPO4·3H2O2.28g/L，KH2PO4 0.866g/L，MgSO4·7H2O 1g/L，谷氨酸钠1g/L。
取3个环氧化物水解酶基因(ArEH、RgEH和AnEH)的重组赤红球菌发酵培养48小时的菌液进行SDS-PAGE分析，各环氧化物水解酶的表达效果如图1所示，其中来自于放射农杆菌的环氧化物水解酶基因ArEH在重组红球菌中实现了高表达，而另外两个基因的表达量很低，没有明显的蛋白条带。后续优选环氧化物水解酶ArEH重组红球菌作为全细胞催化剂。
(2)将实施例2获得的含环氧化物水解酶的质粒pET28a-ArEH采用化学转化法转入宿主菌E.coli BL21(DE3)。转化体采用含卡那霉素浓度为50mg/L的LB平板培养基进行筛选，从而得到转化体E.coli BL21(DE3)(ArEH)。
从LB平板培养基上挑取重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)(ArEH)的单菌落接种到10mL含卡纳霉素50μg/mL的LB培养基中，在37℃摇床中200rpm培养12h。按1％接种量转接到50mL含卡那霉素50mg/L的LB培养基中，在37℃摇床中200rpm培养2.5h，至菌液OD600为0.6～1.0，加入0.5mM IPTG诱导表达目标蛋白，于28℃中培养7～20h，菌液离心后去上清液保存于-20℃。
酶活测定以环氧氯丙烷为底物，采用气相色谱法。取0.36mL用磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 8.0)适当稀释的菌体，恒温至30℃，加入0.04mL 2.5％v/v的环氧氯丙烷溶液，在恒温金属浴振荡器中1000rpm反应5min，往反应液中加入0.8mL正己烷(含0.1％v/v内标1-氯己烷)，涡旋振荡1min，10000×g离心2min，取上层有机相经无水硫酸钠干燥后，采用气相色谱仪Trace1300(Thermo，美国)内标法测量环氧氯丙烷的浓度。
气相色谱操作条件为：Astec Chiraldex G-TA colum(30m×0.25mm×0.12μm)，进样口为SPL，温度180℃；FID检测器，温度180℃；柱温60℃；载气为氮气，分压为108kPa；分流进样，进样量1.0μL，分流比为50:1。
重组大肠杆菌和重组赤红球菌的生长曲线和酶活曲线见图2和图3，重组赤红球菌的最高酶活达到5.4U/mL，是重组大肠杆菌的5倍。
实施例4含环氧化物水解酶的转化体的稳定性评价
热稳定性：重组细胞使用磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 8.0)重悬，在55℃水浴中热激，在不同时间点取样测定剩余酶活，使用一级失活动力学拟合计算半衰期。
pH稳定性：重组细胞使用不同pH的磷酸盐缓冲液重悬，浸泡30min，离心后用pH8.0的磷酸盐缓冲液重悬菌体，测定剩余酶活。
底物/产物耐受性实验：重组细胞使用不同浓度的ECH或3-MCPD溶液浸泡30min，离心后用pH＝8.0的磷酸盐缓冲液重悬细胞并清洗一次，测定剩余酶活。
如图4所示，重组赤红球菌的热稳定性、pH稳定性和底物/产物耐受性，均优于重组大肠杆菌。重组赤红球菌在55℃的酶活半衰期为50min，是重组大肠杆菌的10倍。55℃热激30min，重组赤红球菌的剩余酶活为90％，而重组大肠杆菌基本完全失活。pH 12的条件下浸泡30min，重组赤红球菌的剩余酶活为75％，而重组大肠杆菌只有4％。256mM ECH浸泡30min，重组赤红球菌活性没有损失，而重组大肠杆菌的剩余酶活只有26％。
实施例5利用含环氧化物水解酶的转化体拆分制备光学纯的(R)-ECH
使用磷酸盐缓冲液(0.2M，pH 9.0)重悬重组赤红球菌，菌浓度为7.5gdcw/L，取30mL菌液放置于100mL三口瓶中，30℃水浴条件下拆分外消旋ECH制备光学纯的(R)-ECH。ECH的初始浓度为192mM，流加速度为10.67mM/min，流加时间为30min。间隔取样测定反应液中的(S)-ECH、(R)-ECH浓度，计算ee值和(R)-ECH的收率。
反应40min，累计加入512mM ECH，得到182mM的(R)-ECH，ee值为98.5％，收率为35.5％，如图5所示。相比于文献报道的使用游离酶催化(Jin,et al.,2013,ENGINEERINGIN LIFE SCIENCES,13:385-392)，类似的条件下，使用重组红球菌催化，产物(R)-ECH的终浓度提高了46％，收率提高31％。
以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。
序列表
<110> 清华大学
<120> 一种表达环氧化物水解酶的工程菌及其构建方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 885
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
atgaccatcc gccgcccgga ggacttcaag cactacgagg tccagctgcc ggacgtcaag 60
atccactacg tccgcgaggg cgccggcccg accctgctgc tgctgcacgg ctggccgggc 120
ttctggtggg agtggtcgaa ggtcatcggc ccgctggccg agcactacga cgtcatcgtc 180
ccggacctgc gcggcttcgg cgactcggag aagccggacc tgaacgacct gtcgaagtac 240
tcgctggaca aggccgccga cgaccaggcc gccctgctgg acgccctggg catcgagaag 300
gcctacgtcg tcggccacga catcgccgcc atcgtcctgc acaagttcat ccgcaagtac 360
tcggaccgcg tcatcaaggc cgccatcttc gacccgatcc agccggactt cggcccggtc 420
tacttcggcc tgggccacgt ccacgagtcg tggtactcgc agttccacca gctggacatg 480
gccgtcgagg tcgtcggctc gtcgcgcgag gtctgcaaga agtacttcaa gcacttcttc 540
gaccactggt cgtaccgcga cgagctgctg accgaggagg agctggaggt ccacgtcgac 600
aactgcatga agcacgacaa catccacggc ggcttcaact accaccgcgc caacatccgc 660
ccggacgccg ccctgtggac cgacctggac cacaccatgt cggacctgcc ggtcaccatg 720
atctggggcc tgggcgacac ctgcgtcccg tacgccccgc tgatcgagtt cgtcccgaag 780
tactactcga actacaccat ggagaccatc gtcgactgcg gccacttcct gatggtcgag 840
aagccggaga tcgccatcga ccgcatcaag accgccttcc gctga 885
<210> 2
<211> 1230
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
atggccaccc acacctttgc atcgccgccg acccgcttca cagtcgacat cccgcagtcg 60
gagctggacg agctgcactc gcgcctggac aaaacccgtt ggccggccac cgaaatcgtc 120
ccggaggacg gcaccgatga cccgaccgcc tttggcttag gtgccggccc gaccctgcca 180
ctgatgaagg agctggccaa gggctggcgc gagttcgact ggaagaaggc ccaggaccac 240
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caccgctcga cccgcccgaa tgccgttccg ctgatcctgt gccatggctg gccgggccat 360
ttcggcgagt tcctgaacgt catcccgctg ctgaccgaac cgagtgaccc gtcggcccaa 420
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tcgctgcaca aggaccactg caaggccgtc cacctgaact tcctgccggt cttcccgcca 660
gtcccgatgt ggctgatcaa cccgcacacc ctgttggcct gggccccacg ctttctggtc 720
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tactacgtca tgcagcagct gaccccacgc accccagcct atggcctgac cgattcgccg 840
gtcggcctgt tggcctggat cggcgagaag ttcgagccga ccatccagga ggcctcgaag 900
caggcccaac cgaccctgac acgcgacgag ctgtacttca cctgctcgct gtactggttc 960
acccgctcga tcggcacctc gttcctgccg tactcgctga acccgcactt caccaccttc 1020
ctgaccgact cgaagtacca cctgccgaac ttcgccctgt cgctgtaccc gggcgagatc 1080
tactgtccgg ccgagcgcga tgcaaaacgc accggcaacc tgaagtggat caaggacgcc 1140
ccagagggcg gccattttgc cgccctggag aagccggacg tcttcgtcga gcacctgcgc 1200
gaagccttcg gcgtcatgtg ggagaagtga 1230
<210> 3
<211> 1197
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
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<210> 4
<211> 2134
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
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aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt 600
tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt 660
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tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg 1080
ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta 1140
aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa acttggtctg acagttacca 1200
atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc 1260
ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc 1320
tgcaataata ccgcgggacc cacgctcacc ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc 1380
agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat 1440
taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt 1500
tgccatcgct acaggcatcg tggtatcacg ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc 1560
cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg ttgcgcaaaa aagcggttag 1620
ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc gccgtgttat cactcatggt 1680
tatggcagca ctacataatt ctcttactgt catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac 1740
tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg 1800
cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga actttaaaag tgctcatcat 1860
tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta ccgctgttga gatccagttc 1920
gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc 1980
tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa 2040
atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga agcatttatc agggttattg 2100
tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttag 2134
Claims (5)
1.一种表达环氧化物水解酶的工程菌，其特征在于，所述工程菌是将环氧化物水解酶基因转入红球菌而得到的；其中所述环氧化物水解酶基因来源于放射农杆菌，所述环氧化物水解酶基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO.1所示；所述红球菌为敲除酰胺酶基因和腈水合酶基因的赤红球菌。
2.根据权利要求1所述的工程菌的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
合成所述环氧化物水解酶基因，将所述环氧化物水解酶基因接入质粒构建环氧化物水解酶的表达载体；
将所述环氧化物水解酶的表达载体转化到赤红球菌中。
3.根据权利要求2所述的工程菌的构建方法，其特征在于，所述质粒为大肠杆菌-赤红球菌穿梭质粒或者pET28a。
4.根据权利要求1所述的工程菌在制备手性环氧氯丙烷中的应用。
5.一种制备手性环氧氯丙烷的方法，其特征在于，包括如下步骤： 将包含有根据权利要求1所述的工程菌的菌液加入反应器中，加入环氧氯丙烷，进行外消旋拆分。
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| 产顺式环氧琥珀酸水解酶的红球菌M1菌株的分离鉴定及其产酶条件优化;潘克侠等;《微生物学报》;20040630;第44卷(第3期);第276-280页，参见全文 * |
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