CN106536740B - T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及包含原核细胞的表达系统，所述原核细胞含有多核苷酸构建物，该多核苷酸构建物编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶。本发明还涉及含有基因的表达载体，所述基因编码在T7启动子控制下的待表达蛋白，特征在于所述表达载体包含质粒稳定系统。

Description

T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途
本发明涉及T7表达系统、其生产方法以及其用于无抗生素生产重组蛋白的用途。
T7表达系统用于重组蛋白的表达。通常T7启动子序列位于载体上并且重组蛋白的编码区在其下游核糖体结合位点之后。由于表达生物体并不产生T7聚合酶，此种表达系统仅在T7聚合酶已被人工引入系统时才会发挥作用。对于此，最常见的方法是在生产生物体中对T7表达盒进行基因组锚定(genomic anchoring)。用于在BL21(DE3)大肠杆菌(Escherichia coli)细胞中表达蛋白的基于T7聚合酶的原核系统很早就已知了。在此系统中，将T7聚合酶整合至大肠杆菌(E.coli)基因组中是在DE3λ噬菌体进入大肠杆菌的λ附着位点的辅助下发生的。在此系统中，T7噬菌体聚合酶识别T7噬菌体启动子。然而，此系统具有的缺点是目标基因表达期间的质粒稳定性低。许多研究曾经尝试使T7表达系统的表达水平稳定，但是目前还未有明显的成功。此外，大肠杆菌含有大约40kb的λ噬菌体DNA。此噬菌体DNA是不期望的，至少在用于药物蛋白的表达系统中是不期望的。另外，在T7表达系统中，迄今为止总是会使用含有抗生素抗性基因作为表达期间用于克隆和筛选的选择标记物的表达载体。
然而，使用抗生素用于质粒的筛选是种关键的不足之处，特别是在生产治疗性蛋白时。监管机构更加接受无抗生素的方法，因为产物对于患者会更安全，以及由于较少的终产物分析(消除产物中的抗生素)从而可以构建明显更加经济的方法。使得无抗生素蛋白生产成为可能的表达载体例如在EP1697523B1中已知。然而，此表达载体并不适宜于T7表达系统。
本发明目的是提供T7表达系统用于无抗生素生产重组蛋白，其由原核细胞和表达载体构成，相比已知T7表达系统展现出提升的表达载体稳定性。
此问题通过包含原核细胞的表达系统而解决，所述原核细胞含有编码在T7启动子控制下以及在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶的核苷酸构建物，以及含有编码待表达重组蛋白的基因(在T7启动子的控制下)的表达载体，特征在于所述表达载体含有质粒稳定系统。
质粒稳定系统例如在Sengupta和Austin,Infection and Immunity,July 2011,p.2502-2509中已知。优选其是来自以下组的质粒稳定系统：多聚体分辨系统(multimerresolution system,mrs)、分离系统(partitioning system,par)、和解离后致死系统(postsegregational killing system,PSK)。特别优选所述质粒稳定系统含有来自多聚体分辨系统的组的序列，且尤其优选此为cer序列。
所述可诱导启动子优选为来自以下组的启动子：tac、lac、trp、和phoA。特别优选其是可诱导启动子lacUV5。
所述核苷酸构建物优选是由以下所构成的核苷酸构建物：编码T7 RNA聚合酶的核苷酸序列，lacUV5启动子的核苷酸序列(包括来自大肠杆菌的lacZ基因的5’末端和T7启动子序列)。此种核苷酸构建物在SEQ ID NO:1中再现。特别优选地，所述核苷酸构建物被整合至本发明表达系统原核细胞的基因组中。
所述原核细胞优选是在基因组中具有T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌菌株的细胞。此类菌株可以通过本身已知的方式从野生型菌株(如可得自菌株保藏)产生。此类菌株的实例有大肠杆菌菌株BL21(可以从Stratagene,La Jolla USA商业购买)HMS174(DSM5932)、或C600(DSM426)(可以说是DSM编号而得自Deutschen Sammlung für Mikroorganismen andZellkulturen GmbH(DSMZ)[德国微生物和细胞培养保藏中心],38124 Brauschweig,Inhoffenstraβe 7B)。
优选地，通过将本发明背景下开发的T7表达载体引入至这些菌株中来产生本发明的T7表达系统。
本发明的此种表达载体优选以功能性的连接而具有以下组分：
复制起点(ori),
作为调控序列的T7启动子,
编码要表达的重组蛋白的序列，
抗生素抗性基因作为克隆的选择标记物，
终止子，
阻遏基因，
适宜于所述阻遏基因的操纵基因序列，和
质粒稳定系统。
优选其是已经提到过的一种质粒稳定系统。特别优选所述质粒稳定系统含有cer序列。
优选复制起点是pBR322-ori、pUC19-ori或p15A-ori，特别优选pBR322-ori。
特别优选终止子为t0、rrnB或T7终止子。
阻遏基因是编码这样的蛋白的任何基因，所述蛋白在结合至启动子区域时启动子阻止基因的转录。特别优选地，所述阻遏基因是lacI基因。
优选地，抗生素抗性基因是kan、tet、bla、cmR、或tetA，特别优选kan。
本发明的T7表达系统可像已知T7表达系统那样产生，区别在于本发明的表达载体被引入至在基因组中具有T7 RNA聚合酶基因的原核细胞中。
本发明另外的目的是提供用于产生原核细胞(作为本发明T7表达系统的一部分，其实现T7 RNA聚合酶(包括控制区)整合至原核细胞内)的优选实施方案的方法，过程中没有发生噬菌体DNA整合至细胞内。
此方法的特征在于通过“位点特异性”重组的手段将T7 RNA聚合酶(包括控制区)的编码序列整合至原核细胞的基因组中.
此种“位点特异性”重组是例如通过来自噬菌体P1的Cre-lox系统和来自酵母的FLP-FRT系统而得以实现的。使用“位点特异性”重组用于染色体细菌DNA的改造例如在Datsenko和Wanner,PNAS,June 6,2000no.12,p.6640-6645中有描述。
优选地，在可诱导启动子的控制下实现T7 RNA聚合酶的靶向整合至大肠杆菌基因组中的指定位置，优选大肠杆菌的proBA序列。此类方法例如从Datsenko和Wanner,PNAS,June 6,2000no.12,p.6640-6645中已知。
此方法所产生的含有整合至基因组的核苷酸构建物(编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶)的原核细胞，与含有此种构建物的已知原核细胞的区别在于，其不含有λ噬菌体DNA。完全出乎意料的是，据发现在此种细胞中常规表达载体也展现出提升的稳定性，而本发明的表达载体还可以实现进一步提升的稳定性。
本发明因而涉及原核细胞，优选大肠杆菌细胞，其含有整合至基因组的核苷酸构建物(编码在T7启动子控制下以及在可诱导启动子控制下的T7RNA聚合酶)，特征在于其不含有λ噬菌体DNA。
除此之外，本发明的优点是其利用在复合培养基中的无抗生素发酵，其中待生产蛋白通常可实现更高的表达效力(相较于EP1697523B1中描述的表达系统中使用的无机盐培养基)。本发明因而还涉及通过本发明表达系统的手段来产生重组蛋白的方法。
此方法的特征在于本发明的表达载体被引入至含有核苷酸构建物的原核细胞内，所述核苷酸构建物编码在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶，这些细胞在无抗生素的条件(其适宜于T7 RNA聚合酶和从多核苷酸序列开始的重组蛋白的表达)下进行发酵，由此表达重组多肽并分离重组的多肽。
在本发明中，发酵过程(也即蛋白表达的实际过程)，在完全无抗生素的环境中进行。结果，避免了开始所提到的与使用抗生素筛选质粒相关联的问题，例如监管机构的保留意见、产物安全性、终产物分析(消除产物中的抗生素)以及与之相关联的风险和代价。
在本发明的意义上，蛋白也理解为是指肽和多肽。
本发明的方法优选在生物反应器中进行。
附图简述
图1示意性地显示出在BL21(DE3)(现有技术)和BL21ΔproBA-T7lacZ(根据本发明)的基因组中的T7核苷酸构建物相互比较；
a)DE3:通过改造的λ噬菌体的手段整合至λ附着位点中(现有技术)；
b)Scil-T7:通过proBA的同步缺失来靶向整合(根据本发明)。
图2示意性地显示出T7核苷酸构建物，其由lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、T7噬菌体(T7聚合酶)的T7启动子和基因1以及卡那霉素抗性基因kan(两侧有FRT位点)构成。
图3示意性地显示出表达载体pSCIL006c，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、kan和lacI构成。
图4示意性地显示出表达载体pSCIL122和pSCIL123，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、kan、lacI和cer构成。
图5示意性地显示出表达载体pSCIL124和pSCIL125，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、proBA、tetA、lacI和cer构成。
图6示意性地显示出表达载体pSCIL129，其由T7启动子、t0终止子、pBR322-ori、kan、lacI和cer构成。
以下实施例用于进一步说明本发明。
实施例1:本发明的表达载体和质粒的产生
表达质粒pSCIL006c的产生
下文中更详细地描述了表达载体pSCIL006c(图3)的产生。
1.将t0终止子插入至pUC19＝pSCIL001
商业可购买的载体pUC19(SD0061,MBI Fermentas)被用作产生表达载体的基础。用限制性内切酶HindIII和AflIII切割pUC19，其导致359bp的载体序列的缺失。通过引物t0-OD-MCS-HindIII(SEQ ID NO:2)和t0-UU-MCS-AflIII(SEQ ID NO:3)的手段从噬菌体λ(SD0011,MBI Fermentas)的DNA扩增t0转录终止子。继而用限制性内切酶HindIII和AflIII切割所形成的片段并在纯化后(Minielute Kit,Qiagen)克隆至pUC19HindIII/AflIII片段。所得的质粒pSCIL101通过限制性内切分析以及测序来进行检查。
2.pSCIL001中抗生素抗性盒的取代＝pSCIL002
通过用引物Km-OD-ApaI(SEQ ID NO:4)和Km-UU-NheI(SEQ ID NO:5)进行PCR来从pACYC177(E4151S,NEB)扩增卡那霉素抗性盒。用凝胶提取试剂盒(Qiagen)来纯化该片段并克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)中。通过引物pUC2541-OD-NheI(SEQ ID NO:6)和pUC1496-UU-ApaI(SEQ ID NO:7)的手段将质粒pSCIL101进行了无氨苄青霉素抗性盒扩增，并用限制性内切酶ApaI和NheI切割。用限制性内切酶ApaI和NheI从pGEMT-T easy切割卡那霉素抗性盒，并克隆至pSCIL001(ΔAmp)ApaI/NheI。所得的质粒pSCIL002通过限制性内切分析来进行检查。
3.卡那霉素抗性盒朝向的改变＝pSCIL002b
卡那霉素抗性盒在pSCL载体中的朝向对于卡那霉素抗性基因的背景表达具有决定性的作用，因此在第二载体生成中，该抗性盒的朝向相较于例如pSCIL008(EP1697523B1)发生了改变。为此，首先通过引物MunI-Km term(SEQ ID NO:8)和ApaI-pSCIL002(SEQ IDNO:9)的手段将pSCIL002的构架进行了无卡那霉素抗性盒得扩增，并继而用核酸酶MunI(MfeI)和ApaI进行了切割。使用引物Km 5’-MunI(SEQ ID NO:10)和Km 3’ApaI(SEQ ID NO:11)从pSCIL002扩增了卡那霉素抗性盒，并同样地用限制性内切酶MunI(MfeI)和ApaI进行了切割。继而将两个片段都进行连接，这导致了质粒pSCIL002b。通过测序来检查了正确的整合。
4.第二选择标记物插入至pSCIL002b内＝pSCIL003b
继而将大肠杆菌的脯氨酸合成通路的基因，proBA，整合至pSCIL002b内作为第二选择标记物。为此，首先通过proBA-OD-ApaI(SEQ ID NO:12)和proBA-UU-ApaI(SEQ ID NO:13)的手段从事先制备的来自大肠杆菌K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikro-organismen and Zellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的基因组DNA来扩增proBA操纵子。用限制性内切酶ApaI切割PCR产物，并克隆至载体pSCIL002b(同样经ApaI切割)之中。所得的质粒pSCIL003b经测序检查。
5.将阻遏基因lacI插入至pSCIL003b中＝pSCIL004b
通过引物lacI OD NheI(SEQ ID NO:14)和lacI UU NheI(SEQ ID NO:15)的手段从大肠杆菌菌株K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikroorganismen andZellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的染色体DNA扩增lacI基因(包括天然启动子区)。将PCR产物克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)并通过测序检查。在用限制性内切酶NheI限制性内切后，lacI被连接至pSCIL003b中。
6.将T7启动子插入至pSCIL004b中＝pSCIL006b
通过引物PrT7-MunI5’(SEQ ID No:16)和PrT7-EcoRI3’(SEQ ID NO:17)的手段从质粒pSCIL006(源自pTYB2,#6710,NEB)扩增T7启动子(包括lac操纵基因序列)。另外，通过引物PrT7-EcoRI3’的手段将后来的核糖体结合位点(AGGAGA)整合至PCR产物。用限制性内切酶EcoRI和MunI(MfeI)切割PCR产物，并克隆至载体pSCIL004b(经EcoRI切割)。所得的质粒pSCIL006b经测序检查。
7.通过替换pSCIL006b中的一个核苷酸而改变复制起点(复制的起点)＝pSCIL006c
作为pUC19的后代，表达质粒pSCIL006b在37℃显示出比在30℃高很多的拷贝数。其原因是原始质粒pBR322的复制起点中的点突变(G→A)。为了在pSCIL006b中保留此突变，使用了Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。为此，用引物ori_mut_fwd(SEQ ID NO:18)和ori_rev(SEQ ID NO:19)扩增了整个质粒并再连接。所得的质粒(其拷贝数无论何种温度均在大约60拷贝/细胞)经测序检查并命名为pSCIL006c(参见图3，SEQ ID NO:20)。
表达载体pSCIL122和pSCIL123的产生
1.将cer插入至pSCIL006c中＝pSCIL122和pSCIL123
使用引物5’cer_NdeI(SEQ ID NO:21)和3’cer_NdeI(SEQ ID NO:22)经PCR从质粒ColE1(分离自大肠杆菌JC411(DSM3877),DSMZ,通过QIAprep Spin Miniprep的手段,Qiagen)扩增了cer元件，并整合至pSCIL006c中独特的NdeI切割位点。其中，两种朝向(前向和反向)都是可能的。所得的具有前向朝向cer的质粒命名为pSCIL122，而具有反向朝向cer的质粒命名为pSCIL123，并经测序检查(参见图4，SEQ ID NO:23)。
表达载体pSCIL124和pSCIL125的产生
1.在pSCIL006c中缺失kan＝pSCIL112
为了缺失卡那霉素抗性盒，使用了Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。为此，使用引物pSCIL_Nco_P(SEQ ID No:24)和pSCIL_Spe_P(SEQ ID No:25)扩增了pSCIL006c的构架并重连接，其导致卡那霉素抗性盒的缺失。所得的质粒经测序检查并命名为pSCIL112。
2.将tetA插入至pSCIL112中＝pSCIL105
使用引物tetA_5’promo_NcoI(SEQ ID No:26)和tetA_3’_SpeI(SEQ ID No:27)从pBR322(D1511,Promega)扩增了四环素抗性盒。用限制性内切酶NcoI和SpeI切割PCR产物并克隆至载体pSCIL112(同样经NcoI和SpeI切割)。由于所得的质粒具有两个拷贝而不是一个拷贝的四环素抗性盒，通过Phusion Site Directed Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)的手段去除了一个拷贝。为此，使用引物105_fwd_P(SEQ ID No:28)和105_rev_P(SEQ IDNo:29)扩增了质粒并重连接。所得的质粒经测序检查并命名为pSCIL105。
3.将cer插入至pSCIL105中＝pSCIL124和pSCIL125
使用引物5’cer_NdeI(SEQ ID NO:21)和3’cer_NdeI(SEQ ID NO:22)经PCR从质粒ColE1(分离自大肠杆菌JC411(DSM3877),DSMZ,通过QIAprep Spin Miniprep的手段,Qiagen)扩增了cer元件，并整合至pSCIL105中独特的NdeI切割位点。其中，两种朝向(前向和反向)都是可能的。所得的具有前向朝向cer的质粒命名为pSCIL124，而具有反向朝向cer的质粒命名为pSCIL125，并经测序检查(参见图5，SEQ ID NO:30)。
表达载体pSCIL129的产生
1.pSCIL123中proBA的缺失＝pSCIL129
为了减小表达载体的质粒大小，又再去除proBA盒。为此，使用Phusion SiteDirected Mutagenesis Kit(F-541,Finnzymes)。通过引物pSCIL-proBA_rev-P(SEQ IDNO:31)和pSCIL-proBA_fwd-P(SEQ ID NO:32)的手段扩增质粒pSCIL123，从而在随后重连接之后将proBA操纵子缺失。所得的表达载体命名为pSCIL129并经测序检查(参见图6，SEQID NO:33)。实施例2:本发明表达系统的产生
大肠杆菌菌株BL21(Stratagene)、HMS174(DSM5932)和C600’(DSM426)得自Stratagene或者DSMZ(Deutsche Stammsammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH,Braunschweig)。菌株BL21、HMS174和C600’每个均转化有质粒pKD46(CGSC,E.coli Genetic Stock Center,Yale University,New Haven,USA)，其编码λ噬菌体的Red重组酶。由此，可以将T7构建物靶向整合至大肠杆菌基因组。从所得的菌株BL21pKD46、HMS174pKD46和C600’pKD46，又再产生了感受态细胞。用琼脂平板上的氨苄青霉素或液体培养中的羧苄青霉素来实现pKD46的筛选。
图2中所示的DNA构建物(由lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、T7噬菌体(T7聚合酶)的T7启动子和基因1以及两侧有FRT位点的卡那霉素抗性基因kan构成)经如下产生。
首先，将所述组分分别扩增并一起克隆至pGEM-T easy(A1360,Promega)。使用引物T7 5’_BamHI_Xho(SEQ ID NO:34)和T7 3’_Hind(SEQ ID NO:35)从T7噬菌体(310005,Bioron GmbH)的DNA扩增了T7 RNA聚合酶的基因(基因1)。通过Qiaquick PCRPurification(Qiagen)纯化了PCR产物，并通过悬垂腺嘌呤残基(overhanging adenineresidue)的手段克隆至载体pGEM-T easy(A1360,Promega)。所形成的质粒pGEM::T7经测序检查。通过引物lacI 5’_BamHI_coli(SEQ ID NO:36)和lacI 3’_UV5_Xho(SEQ ID NO:37)的手段从大肠杆菌菌株K12(DSM 9037,Deutschen Sammlung für Mikroorganismen undZellkulturen GmbH；DNeasy Tissue Kit,Qiagen)的基因组DNA扩增了lacI基因。还有，借助于引物lacI 3’_UV5_Xho(SEQ ID NO:37)而将lacUV5启动子的序列整合至PCR产物中。通过Qiaquick PCR Purification(Qiagen)纯化了PCR产物，并通过悬垂腺嘌呤残基的手段克隆至载体pGEM-T easy(A1360,Promega)。所形成的质粒pGEM::lacI-lacUV5经测序检查，并继而用限制性内切酶BamHI和XhoI切割。所形成的片段通过QIAquick Gel Extraction Kit(Qiagen)纯化，并克隆至经同样切割和纯化的质粒pGEM::T7中。所形成的质粒pGEM::lacI-lacUV5-T7经测序检查。使用引物Hind_pKD45’(SEQ ID NO:38)和pKD43’_Hind_coli(SEQID NO:39)从质粒pKD4(CGSC,E.coli Genetic Stock Center,Yale University,NewHaven,USA)扩增了两侧有FRT位点的卡那霉素抗性基因。用限制性内切酶HindIII切割PCR产物，并克隆至同样经HindIII切割的质粒pGEM::lacI-lacUV5-T7中。最终的质粒pGEM-Teasy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT经限制性内切酶EcoRI和HindIII的限制性消化来检查。
为了产生类似于DE3的T7核苷酸构建物，首先通过引物T7_neu_BamHI_for01(SEQID NO:40)和T7_neu_MfeI_rev02(SEQ ID NO:41)的手段，从事先分离自BL21(DE3)[Novagen 69387-3]的基因组DNA(Genomic DNA Purification Kit,Fermentas)，扩增了由以下所构成的区域：lacI、lacUV5启动子、lacZ的5’区、和T7噬菌体的基因1的前2574bp(直至内部的MfeI切割位点)。在纯化后(
Figure BDA0001198418260000091
SV Gel and PCR,Promega)，用限制性内切酶BamHI和MfeI切割此PCR产物，并在纯化后(
Figure BDA0001198418260000092
SV Gel and PCR,Promega)克隆至质粒pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRTBamHI/MfeI的4647bp片段。在转化至TOP10F’(Life Technologies)中并在具有100μg/ml氨苄青霉素的LB平板上筛选之后，所得的质粒pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(SEQ ID NO:42)已制备好。
接着，通过限制性内切酶EcoRI的手段将整个构建物从质粒pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(SEQ ID NO:42)中切除下来。由此形成的6026bp片段通过SV Gel and PCR-Kit(Promega)的手段进行纯化。继而用此DNA片段转化菌株BL21pKD46、HMS174pKD46和C600’pKD46，并在室温温育过夜以便使得可以整合至大肠杆菌基因组。
由于选择了与proBA操纵子的侧翼区匹配的DNA构建物的侧翼区(SEQ ID NO:43:rec位点1和SEQ ID NO:44:rec位点2)，在整合期间proBA操纵子同时被缺失掉。对图2中所示的T7 RNA聚合酶构建物的筛选，是通过培养基中卡那霉素的手段来实现的。通过在含有氨苄青霉素或羧苄青霉素的培养基中生长能力的丢失，而检测出辅助质粒pKD46的丢失。
从所得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ::kan、HMS174ΔproBA-T7lacZ::kan、和C600’ΔproBA-T7lacZ::kan制备感受态细胞，并用辅助质粒pCP20(CGSC,E.coli Genetic StockCenter,Yale University,New Haven,USA)进行转化。此步骤用于去除卡那霉素抗性(其通过pCP20上编码的FLP重组酶在第一步中也被整合至基因组中)。对于具有pCP20的菌株的筛选，在含有氨苄青霉素的平板上实现。
通过在43℃将细胞温育过夜，辅助质粒pCP20丢失。所得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ、HMS174ΔproBA-T7lacZ、和C600’ΔproBA-T7lacZ不具有抗生素抗性，且含有如图1所示的T7构建物(而非基因组中的proBA操纵子)。保留在基因组中作为此方法“痕迹”的那一个FRT位点，是由FLP重组酶去除卡那霉素抗性盒时所造成的。通过Southern杂交来验证菌株。在该过程中，检测到T7 RNA聚合酶的编码序列的整合以及proBA的缺失。
通过电穿孔将来自实施例1的表达质粒引入至由此获得的菌株BL21ΔproBA-T7lacZ和HMS174ΔproBA-T7lacZ中。
实施例3:本发明T7表达系统与现有技术的T7表达系统对于质粒稳定性的比较
为了研究现有技术的T7表达质粒和本发明的T7表达质粒在BL21(DE3)(来自现有技术的菌株)和BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的菌株)中的稳定性，在摇瓶和分批补料发酵中进行了实验。为此，通过限制性内切酶EcoRI和PstI的手段，将得自基因合成(Geneart,Regensburg)的人生长因子proNGF克隆至表达载体。对于摇瓶中质粒稳定性的研究，程序如下。首先，将待研究表达菌株的预培养物：具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF(现有技术)的BL21(DE3)、具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF(本发明的表达质粒)的BL21(DE3)、具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(具有不含质粒稳定系统的表达质粒的本发明表达菌株)、和具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的表达系统)，在具有50μg/ml卡那霉素的复合培养基[34.5g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)、2.475mM MgSO4、9.347mM NH4Cl、62mMK2HPO4、15g/l glucose]中培养过夜(37℃，摇摆)。第二天早上，通过在6500rpm离心(5分钟)，来无菌收集细胞(其对于接种主培养物至最佳光吸收OD600＝0.2-0.3是必须的)。由此接种的主培养物(在100ml的锥形瓶中，20ml复合培养基，无抗生素)在37℃以210rpm摇摆直至达到OD600＝0.8。此时，通过添加1mM IPTG来诱导目标基因的表达。添加诱导物之后3小时(3h pi(诱导后))和24h(24h pi)，产生培养物的无菌稀释并铺板至LB培养基[5g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)、10g/l大豆蛋白胨(Merck 1.07212.0500)、85.56mM NaCl]。将这些平板在37℃温育过夜。在每个情形中从生长的菌落平行挑取100个菌落至LB和LB+50μg/ml卡那霉素。例如10％的质粒稳定性意味着在LB上生长得菌落只有10％也在LB+卡那霉素上生长。能够在LB+卡那霉素上生长的菌落依然具有表达质粒。仅能在LB上生长的菌落已经丢失了表达质粒。在每种情形中，都进行了四个独立的实验以得到质粒稳定性的结论。结果在表1中表示为具有标准偏差的平均值。
表1:摇瓶中现有技术标准表达质粒的(pSCIL006cΔproBA::proNGF)和本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)在BL21(DE3)(现有技术的菌株)和BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的菌株)内的质粒稳定性
据发现，现有技术的表达系统展现出很低的质粒稳定性：诱导后3小时86％以及诱导后24小时仅有5％。通过本发明的cer手段的表达质粒来进行稳定化，在BL21(DE3)中可以将质粒稳定性提高至诱导后3小时100％3h以及诱导后24小时88％。质粒稳定性提升至诱导后24小时大约100％，仅能通过使用本发明的T7表达系统来实现，该表达系统由具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ构成。然而出乎意料的是，在BL21ΔproBA-T7lacZ中的标准表达质粒也显示出高质粒稳定性：诱导后3小时90％3h以及诱导后24小时84％，而同时同样的质粒在BL21(DE3)中已经基本上丢失了(5％24h pi)。作为这些实验中的目标基因，表达出了人生长因子proNGF。proNGF的表达是通过SDS-PAGE来检查的.
除此之外，还在分批补料发酵中将本发明的表达系统与现有技术进行了比较。首先，将待研究表达菌株的预培养物：具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF(现有技术)的BL21(DE3)、具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF(本发明的表达质粒)的BL21(DE3)、具有标准表达质粒pSCIL006cΔproBA::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(具有不含质粒稳定系统的表达质粒的本发明表达菌株)、和具有稳定表达质粒pSCIL129::proNGF的BL21ΔproBA-T7lacZ(本发明的表达系统)，在具有50μg/ml卡那霉素的复合培养基[34.5g/l酵母提取物(Merck 1.03753.0500)、2.475mM MgSO4、9.347mM NH4Cl、62mM K2HPO4、15g/l葡萄糖]中培养过夜(37℃，摇摆)。在发酵中，对每种情形，将2l的无抗生素复合培养基[50g/l酵母提取物(Biospringer 0206)、2.475mM MgSO4、9.347mM NH4Cl、62mM K2HPO4、10g/l葡萄糖、0.2ml/l消泡剂Synperonic(Croda ETK0879)]置于5l的实验室发酵罐中，并用表达菌株的预培养物接种，从而达到0.06的起始OD600(600nm光吸收)。6.5h后，在已消耗掉葡萄糖后，通过添加底物而起始分批补料阶段。此处的底物补料流根据指数函数的形式进行：补料流＝const*exp(μ1*t)。其中μ是适用μ1＝const<μmax的比生长速率，也即即时可用的葡萄糖浓度总是低于微生物的最大即时需求，其结果是实现次最大生长率并防止葡萄糖的累积。例如，设定值μ1＝0.25h-1。在指定的光吸收，例如OD600＝50±5，通过添加IPTG(例如1mM)来诱导蛋白的表达。此时，底物补料流在6小时线性减少70％并继而保持恒定。该过程在指定的诱导期(例如24h)之后结束。
在达到OD600＝50±5时，通过添加1mM IPTG来诱导目标基因的表达。此时以及诱导后6h、8h和24h，如上文所述分析质粒的稳定性，并检查人生长因子proNGF的表达。数据在表2中示出。
Figure BDA0001198418260000131
(PS:质粒稳定性)
表2标准表达质粒(pSCIL006cΔproBA::proNGF)和本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)在分批补料发酵中的BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ内的质粒稳定性
据发现，在分批补料发酵中，现有技术的表达系统在诱导后6小时已经丢失了89％的表达质粒(PS 11％)，而本发明的表达系统即使在诱导后24小时依然展现出100％的质粒稳定性。此处具有质粒稳定系统cer的本发明的表达质粒(pSCIL129::proNGF)和以及还有本发明的表达菌株BL21ΔproBA-T7lacZ相对于现有技术的表达系统都具有明显优势，因为诱导后24小时质粒稳定性分别为100％和95％，显著高于现有技术的表达系统(2％)。
为了进一步研究本发明T7表达质粒在BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ中的稳定性，在摇瓶中进行了进一步的实验。为此，通过限制性内切酶EcoRI和PstI的手段，将得自基因合成的人凝血酶原基因(Geneart,Regensburg)克隆至表达载体pSCIL006c(常规表达质粒)和pSCIL123(稳定表达质粒)。对于在摇瓶中的质粒稳定性研究，使用了上文所述的程序。结果在表3中示出。
Figure BDA0001198418260000132
表3:标准表达质粒(pSCIL006c::凝血酶原)和本发明的表达质粒(pSCIL123::prethrombin)在BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ中的质粒稳定性。
据发现，现有技术的表达系统展现出极低的质粒稳定性。在诱导后3小时，就已经仅存在5％的携质粒菌株，而24小时后几乎所有细胞都是无质粒的。
通过使用表达质粒pSCIL123::preThrombin，在表达菌株BL21(DE3)和BL21ΔproBA-T7lacZ都可以实现诱导后3小时100％的质粒稳定性。在诱导后24小时的时间，本发明的表达系统(具有pSCIL123::preThrombin的BL21ΔproBA-T7lacZ)的质粒稳定性，为78％，几乎是现有技术表达菌株(BL21(DE3)pSCIL123::preThrombin)中(41％)的两倍。人凝血酶原的表达通过SDS-PAGE检查。
序列表
<110> 瓦克化学股份公司
<120> T7表达系统，其生产方法以及其用于生产重组蛋白的用途
<130> Wa11363F
<160> 44
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 5990
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> chromosomal T7 RNA polymerase construct
<400> 1
acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga atggcgcaaa 60
acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 120
aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 180
cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 240
atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 300
ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 360
gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 420
agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 480
ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 540
aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 600
tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 660
atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 720
cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 780
gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 840
atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 900
ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 960
tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 1020
gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 1080
tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 1140
ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 1200
gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 1260
gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 1320
ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380
ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440
gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 1500
gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 1560
ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 1620
tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 1680
cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 1740
cgcgaattat ttttgatggc gtcgggatct gatccggatt tactaactgg aagaggcact 1800
aaatgaacac gattaacatc gctaagaacg acttctctga catcgaactg gctgctatcc 1860
cgttcaacac tctggctgac cattacggtg agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg 1920
agcatgagtc ttacgagatg ggtgaagcac gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta 1980
aagctggtga ggttgcggat aacgctgccg ccaagcctct catcactacc ctactcccta 2040
agatgattgc acgcatcaac gactggtttg aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc 2100
cgacagcctt ccagttcctg caagaaatca agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta 2160
agaccactct ggcttgccta accagtgctg acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg 2220
caatcggtcg ggccattgag gacgaggctc gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta 2280
agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga 2340
aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg 2400
cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc 2460
tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag 2520
actctgagac tatcgaactc gcacctgaat acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg 2580
cgctggctgg catctctccg atgttccaac cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg 2640
gcattactgg tggtggctat tgggctaacg gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc 2700
acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga 2760
ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg 2820
taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac 2880
tcccgatgaa accggaagac atcgacatga atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg 2940
ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt 3000
tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta accataaggc catctggttc ccttacaaca 3060
tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga 3120
ccaaaggact gcttacgctg gcgaaaggta aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc 3180
tgaaaatcca cggtgcaaac tgtgcgggtg tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca 3240
agttcattga ggaaaaccac gagaacatca tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca 3300
cttggtgggc tgagcaagat tctccgttct gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg 3360
gggtacagca ccacggcctg agctataact gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt 3420
gctctggcat ccagcacttc tccgcgatgc tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta 3480
acttgcttcc tagtgaaacc gttcaggaca tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg 3540
agattctaca agcagacgca atcaatggga ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg 3600
agaacactgg tgaaatctct gagaaagtca agctgggcac taaggcactg gctggtcaat 3660
ggctggctta cggtgttact cgcagtgtga ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg 3720
ggtccaaaga gttcggcttc cgtcaacaag tgctggaaga taccattcag ccagctattg 3780
attccggcaa gggtctgatg ttcactcagc cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc 3840
tgatttggga atctgtgagc gtgacggtgg tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta 3900
agtctgctgc taagctgctg gctgctgagg tcaaagataa gaagactgga gagattcttc 3960
gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca 4020
agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta 4080
ccattaacac caacaaagat agcgagattg atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc 4140
ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg 4200
agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga ttcacgactc cttcggtacc attccggctg 4260
acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg 4320
atgtactggc tgatttctac gaccagttcg ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca 4380
aaatgccagc acttccggct aaaggtaact tgaacctccg tgacatctta gagtcggact 4440
tcgcgttcgc gtaaaagctt gcgattgtgt aggctggagc tgcttcgaag ttcctatact 4500
ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcaagatc ccctcacgct gccgcaagca 4560
ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg 4620
gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc 4680
aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt 4740
atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 4800
ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 4860
atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4920
aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4980
cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 5040
caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5100
gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5160
ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5220
tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 5280
tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 5340
agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 5400
actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 5460
cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 5520
tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 5580
tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 5640
cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 5700
gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc 5760
gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc 5820
ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccagcttcaa aagcgctctg 5880
aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaactaagga ggatattcat 5940
atggaccatg ggattcacaa ggccattgac gcatcgcccg gttagtttta 5990
<210> 2
<211> 34
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 2
taaaaagctt gactcctgtt gatagatcca gtaa 34
<210> 3
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 3
aaaacatgta ttctcaccaa taaaaaacgc c 31
<210> 4
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 4
aagggcccgc cacgttgtgt gtctc 25
<210> 5
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 5
aaagctagcg atatcgccgt cccgtcaagt c 31
<210> 6
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 6
aaagctagcg ggaataaggg cgacacgg 28
<210> 7
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 7
aaagggccca cgtgagtttt cgttccactg 30
<210> 8
<211> 39
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 8
caatggtcag aaattggtta attggttgta acactggca 39
<210> 9
<211> 23
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 9
gggcccacgt gagttttcgt tcc 23
<210> 10
<211> 31
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 10
caattggcca cgttgtgtgt ctcaaaatct c 31
<210> 11
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 11
gggcccgata tcgccgtccc gtcaagtc 28
<210> 12
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 12
aaagggcccg caaccgacga cagtcctgc 29
<210> 13
<211> 29
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 13
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<210> 14
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 14
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<210> 15
<211> 25
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aaagctagct cactgcccgc tttcc 25
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<211> 33
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aaacaattgg aaattaatac gactcactat agg 33
<210> 17
<211> 40
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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aaagaattct ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 40
<210> 18
<211> 27
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 18
acggctacac tagaaggaca gtatttg 27
<210> 19
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 19
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<210> 20
<211> 6357
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Expression vector
<400> 20
gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60
agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120
ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180
agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240
gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300
gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360
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cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600
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gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840
ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900
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ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020
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<210> 21
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 21
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<210> 22
<211> 28
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 22
aaacatatgc tcgatggcta cgagggca 28
<210> 23
<211> 6604
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Expression vector
<400> 23
gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60
agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120
ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
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<223> Primer
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<212> DNA
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<223> Primer
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<212> DNA
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<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
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<212> DNA
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<220>
<223> Primer
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<212> DNA
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<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 34
aaaggatcca aactcgagag gtacgattta ctaactggaa gaggcactaa 50
<210> 35
<211> 26
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 35
aaaaagcttt acgcgaacgc gaagtc 26
<210> 36
<211> 66
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 36
aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60
tggcgc 66
<210> 37
<211> 77
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 37
aaactcgagt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg 60
tcactgcccg ctttcca 77
<210> 38
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 38
aaaaagcttg cgattgtgta ggctggagct 30
<210> 39
<211> 72
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 39
aaaaagcttt aaaactaacc gggcgatgcg tcaatggcct tgtgaatccc atggtccata 60
tgaatatcct cc 72
<210> 40
<211> 73
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 40
aattggatcc acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga 60
atggcgcaaa acc 73
<210> 41
<211> 32
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Primer
<400> 41
aattcaattg agactcgtgc aactggtcag cg 32
<210> 42
<211> 9023
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> DNA plasmid with T7 expression construct
<400> 42
aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60
tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg 120
gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag 180
accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg 240
gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc 300
aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa 360
attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg 420
gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc 480
gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 540
gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt 600
attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt 660
caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg 720
gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc 780
gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt 840
cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 900
gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 960
agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 1020
accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 1080
ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct 1140
ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 1200
gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt 1260
acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 1320
aggaaacagc tatgaccatg attacggatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 1380
gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 1440
ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 1500
gcgaatggcg ctttgcctgg tttccggcac cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt 1560
gcgatcttcc tgaggccgat actgtcgtcg tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg 1620
atgcgcccat ctacaccaac gtgacctatc ccattacggt caatccgccg tttgttccca 1680
cggagaatcc gacgggttgt tactcgctca catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg 1740
aaggccagac gcgaattatt tttgatggcg tcgggatctg atccggattt actaactgga 1800
agaggcacta aatgaacacg attaacatcg ctaagaacga cttctctgac atcgaactgg 1860
ctgctatccc gttcaacact ctggctgacc attacggtga gcgtttagct cgcgaacagt 1920
tggcccttga gcatgagtct tacgagatgg gtgaagcacg cttccgcaag atgtttgagc 1980
gtcaacttaa agctggtgag gttgcggata acgctgccgc caagcctctc atcactaccc 2040
tactccctaa gatgattgca cgcatcaacg actggtttga ggaagtgaaa gctaagcgcg 2100
gcaagcgccc gacagccttc cagttcctgc aagaaatcaa gccggaagcc gtagcgtaca 2160
tcaccattaa gaccactctg gcttgcctaa ccagtgctga caatacaacc gttcaggctg 2220
tagcaagcgc aatcggtcgg gccattgagg acgaggctcg cttcggtcgt atccgtgacc 2280
ttgaagctaa gcacttcaag aaaaacgttg aggaacaact caacaagcgc gtagggcacg 2340
tctacaagaa agcatttatg caagttgtcg aggctgacat gctctctaag ggtctactcg 2400
gtggcgaggc gtggtcttcg tggcataagg aagactctat tcatgtagga gtacgctgca 2460
tcgagatgct cattgagtca accggaatgg ttagcttaca ccgccaaaat gctggcgtag 2520
taggtcaaga ctctgagact atcgaactcg cacctgaata cgctgaggct atcgcaaccc 2580
gtgcaggtgc gctggctggc atctctccga tgttccaacc ttgcgtagtt cctcctaagc 2640
cgtggactgg cattactggt ggtggctatt gggctaacgg tcgtcgtcct ctggcgctgg 2700
tgcgtactca cagtaagaaa gcactgatgc gctacgaaga cgtttacatg cctgaggtgt 2760
acaaagcgat taacattgcg caaaacaccg catggaaaat caacaagaaa gtcctagcgg 2820
tcgccaacgt aatcaccaag tggaagcatt gtccggtcga ggacatccct gcgattgagc 2880
gtgaagaact cccgatgaaa ccggaagaca tcgacatgaa tcctgaggct ctcaccgcgt 2940
ggaaacgtgc tgccgctgct gtgtaccgca aggacaaggc tcgcaagtct cgccgtatca 3000
gccttgagtt catgcttgag caagccaata agtttgctaa ccataaggcc atctggttcc 3060
cttacaacat ggactggcgc ggtcgtgttt acgctgtgtc aatgttcaac ccgcaaggta 3120
acgatatgac caaaggactg cttacgctgg cgaaaggtaa accaatcggt aaggaaggtt 3180
actactggct gaaaatccac ggtgcaaact gtgcgggtgt cgataaggtt ccgttccctg 3240
agcgcatcaa gttcattgag gaaaaccacg agaacatcat ggcttgcgct aagtctccac 3300
tggagaacac ttggtgggct gagcaagatt ctccgttctg cttccttgcg ttctgctttg 3360
agtacgctgg ggtacagcac cacggcctga gctataactg ctcccttccg ctggcgtttg 3420
acgggtcttg ctctggcatc cagcacttct ccgcgatgct ccgagatgag gtaggtggtc 3480
gcgcggttaa cttgcttcct agtgaaaccg ttcaggacat ctacgggatt gttgctaaga 3540
aagtcaacga gattctacaa gcagacgcaa tcaatgggac cgataacgaa gtagttaccg 3600
tgaccgatga gaacactggt gaaatctctg agaaagtcaa gctgggcact aaggcactgg 3660
ctggtcaatg gctggcttac ggtgttactc gcagtgtgac taagcgttca gtcatgacgc 3720
tggcttacgg gtccaaagag ttcggcttcc gtcaacaagt gctggaagat accattcagc 3780
cagctattga ttccggcaag ggtctgatgt tcactcagcc gaatcaggct gctggataca 3840
tggctaagct gatttgggaa tctgtgagcg tgacggtggt agctgcggtt gaagcaatga 3900
actggcttaa gtctgctgct aagctgctgg ctgctgaggt caaagataag aagactggag 3960
agattcttcg caagcgttgc gctgtgcatt gggtaactcc tgatggtttc cctgtgtggc 4020
aggaatacaa gaagcctatt cagacgcgct tgaacctgat gttcctcggt cagttccgct 4080
tacagcctac cattaacacc aacaaagata gcgagattga tgcacacaaa caggagtctg 4140
gtatcgctcc taactttgta cacagccaag acggtagcca ccttcgtaag actgtagtgt 4200
gggcacacga gaagtacgga atcgaatctt ttgcactgat tcacgactcc ttcggtacca 4260
ttccggctga cgctgcgaac ctgttcaaag cagtgcgcga aactatggtt gacacatatg 4320
agtcttgtga tgtactggct gatttctacg accagttcgc tgaccagttg cacgagtctc 4380
aattggacaa aatgccagca cttccggcta aaggtaactt gaacctccgt gacatcttag 4440
agtcggactt cgcgttcgcg taaaagcttg cgattgtgta ggctggagct gcttcgaagt 4500
tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaagatcc cctcacgctg 4560
ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc 4620
gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa 4680
cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg 4740
ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt 4800
tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag 4860
gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 4920
attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 4980
acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 5040
tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg 5100
gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 5160
agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 5220
ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 5280
tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 5340
tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 5400
gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 5460
gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 5520
catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 5580
tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 5640
cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 5700
gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 5760
gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 5820
tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc cagcttcaaa 5880
agcgctctga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aactaaggag 5940
gatattcata tggaccatgg gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagttttaa 6000
agctttttat cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc 6060
aacgcgttgg atgcatagct tgagtattct atagtgtcac ctaaatagct tggcgtaatc 6120
atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 6180
agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 6240
tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 6300
aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 6360
cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 6420
ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 6480
ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 6540
cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6600
actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6660
cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6720
tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6780
gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6840
caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6900
agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6960
tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 7020
tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 7080
gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 7140
gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 7200
aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 7260
atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 7320
gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 7380
acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 7440
ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 7500
tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 7560
ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 7620
ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 7680
atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 7740
taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7800
catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7860
atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7920
acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7980
aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 8040
ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 8100
cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 8160
atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 8220
ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgatgc 8280
ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa ttgtaagcgt 8340
taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 8400
ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 8460
tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 8520
aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt 8580
ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 8640
ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 8700
cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct 8760
taatgcgccg ctacagggcg cgtccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg 8820
cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg 8880
cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 8940
gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggcccga cgtcgcatgc tcccggccgc 9000
catggcggcc gcgggaattc gat 9023
<210> 43
<211> 39
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 43
acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcct 39
<210> 44
<211> 39
<212> DNA
<213> Escherichia coli
<400> 44
gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagtttta 39

Claims (7)

1.包含原核细胞的表达系统，所述原核细胞含有编码在T7启动子控制下以及在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶的核苷酸构建物，以及含有在T7启动子的控制下编码待表达蛋白的基因的表达载体，
特征在于所述原核细胞不含有λ噬菌体DNA，并且在T7启动子控制下和在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶通过“位点特异性”重组的手段特异性地整合至原核细胞的基因组，并且所述表达载体含有质粒稳定系统。
2.权利要求1的表达系统，特征在于所述质粒稳定系统选自以下组：多聚体分辨系统(mrs)、分离系统(par)、和解离后致死系统(PSK)。
3.权利要求1或2的表达系统，特征在于所述原核细胞是在基因组中具有T7 RNA聚合酶基因的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的细胞。
4.权利要求1或2的表达系统，其包含具有SEQ ID NO:1的核苷酸构建物。
5.权利要求3的表达系统，特征在于在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶的靶向整合在大肠杆菌的proBA序列中实现。
6.权利要求4的表达系统，特征在于在可诱导启动子控制下的T7 RNA聚合酶的靶向整合在大肠杆菌的proBA序列中实现。
7.用于通过权利要求1-6任一项的表达系统的手段制备重组蛋白的方法，特征在于将所述表达系统在无抗生素的条件下发酵，所述条件适宜于T7 RNA聚合酶的表达以及从多核苷酸序列起始的重组蛋白的表达，由此表达重组蛋白并分离重组蛋白。
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One-step inactivation of chromosomal genes in Escherichia coli K-12 using PCR products;Kirill A. Datsenko等;《PNAS》;20000606;第97卷(第12期);6640-6645 *
Prevalence and Significance of Plasmid Maintenance Functions in the Virulence Plasmids of Pathogenic Bacteria;Manjistha Sengupta等;《Infection and Immunity》;20110509;第79卷(第7期);2502-2509 *
proBA complementation of an auxotrophic E.coli strain improves plasmid stability and expression yield during fermenter production of a recombinant antibody fragment;Markus Fiedler等;《Gene》;20011231;第274卷;111-118 *
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