KR20170020722A - T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 - Google Patents

T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 Download PDF

Info

Publication number
KR20170020722A
KR20170020722A KR1020177002137A KR20177002137A KR20170020722A KR 20170020722 A KR20170020722 A KR 20170020722A KR 1020177002137 A KR1020177002137 A KR 1020177002137A KR 20177002137 A KR20177002137 A KR 20177002137A KR 20170020722 A KR20170020722 A KR 20170020722A
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
expression
plasmid
promoter
under
control
Prior art date
Application number
KR1020177002137A
Other languages
English (en)
Other versions
KR101951128B1 (ko
Inventor
안드레아 안톤
모니크 야노프스키-에글러
마커스 립스처
Original Assignee
와커 헤미 아게
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 와커 헤미 아게 filed Critical 와커 헤미 아게
Publication of KR20170020722A publication Critical patent/KR20170020722A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101951128B1 publication Critical patent/KR101951128B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/12—Transferases (2.) transferring phosphorus containing groups, e.g. kinases (2.7)
    • C12N9/1241—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12N9/1247—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/67—General methods for enhancing the expression
    • C12N15/68—Stabilisation of the vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/72—Expression systems using regulatory sequences derived from the lac-operon
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/70—Vectors or expression systems specially adapted for E. coli
    • C12N15/73—Expression systems using phage (lambda) regulatory sequences
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Y—ENZYMES
    • C12Y207/00—Transferases transferring phosphorus-containing groups (2.7)
    • C12Y207/07—Nucleotidyltransferases (2.7.7)
    • C12Y207/07006—DNA-directed RNA polymerase (2.7.7.6)

Abstract

본 발명은 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 폴리뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포를 포함하는 발현 시스템에 관한 것이다. 본 발명은 또한 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터로서, 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 벡터에 관한 것이다.

Description

T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도{T7 EXPRESSION SYSTEM, METHOD FOR ITS PRODUCTION AND USE THEREOF FOR PRODUCING RECOMBINANT PROTEINS}
본 발명은 T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질의 무항생제 제조를 위한 이의 용도에 관한 것이다.
T7 발현 시스템은 재조합 단백질의 발현을 위해 사용된다. 대체로 T7 프로모터 서열은 벡터 및 리보솜 결합 부위 후 이로부터 다운스트림의 재조합 단백질을 위한 코딩 영역 상에 위치한다. T7 중합효소가 발현 유기체에 의해 제조되지 않기 때문에, 이러한 발현 시스템은 T7 중합효소가 시스템 내로 인공 도입된 때에만 기능한다. 이를 위한 가장 보편적인 방법은 제조 유기체에서의 T7 발현 카세트의 유전체 앵커링(genomic anchoring)이다. BL21(DE3) 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 세포 중 단백질 발현을 위한 T7 중합효소 기초 원핵 시스템은 오랫동안 공지되어 있었다. 이 시스템에서, T7 중합효소의 E. 콜라이 게놈 내로의 통합은 E. 콜라이의 람다 부착 부위 내로의 DE3 람다 파지의 도움으로 이루어진다. 이 시스템에서, T7 파지 중합효소는 T7 파지 프로모터를 인식한다. 그러나, 이 시스템은 표적 유전자 발현에서 플라스미드 안정성이 낮다는 단점을 가진다. T7 발현 시스템의 발현 수준을 안정화시키기 위한 다수의 연구가 시도되었으나, 이제까지 주목할만한 성공은 없었다. 더 나아가, E. 콜라이는 약 40 kb 람다 파지 DNA를 포함한다. 이 파지 DNA는, 적어도 의약용 단백질의 발현을 위한 시스템에서는 바람직하지 않다. 추가로, T7 발현 시스템에서 발현 중의 클로닝 및 선택을 위한 선택 마커로서 항생제 내성 유전자를 포함하는 발현 벡터가 또한 지금까지 사용되어왔다.
그러나, 플라스미드의 선택을 위한 항생제의 사용은, 특히 치료 단백질의 제조에서, 치명적인 단점이다. 무항생제 방법은 규제 기관에 대해서 보다 허용적인데, 이는 그 생성물이 환자에게 보다 안전할 것이며 낮은(minor) 최종 생성물 분석(생성물 중 항생제의 제거)로 인해 현저히 보다 경제적인 공정이 구축될 수 있기 때문이다. 단백질의 무항생제 제조 방법을 가능하게 하는 발현 벡터는 예를 들어 EP1697523B1에 공지되어 있다. 그러나, 이 발현 벡터는 T7 발현 시스템에 적합하지 않다.
본 발명의 목적은, 공지된 T7 발현 시스템과 비교하여 증가된 발현 벡터 안정성을 나타내는 원핵 세포 및 발현 벡터로 이루어진 재조합 단백질의 무항생제 제조를 위한 T7 발현 시스템을 제공하는 것이다.
상기 목적은 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 및 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 재조합 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템으로서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템에 의해 해결된다.
플라스미드 안정화 시스템은 예를 들어 문헌[Sengupta and Austin, Infection and Immunity, July 2011, p.2502-2509]에 공지되어 있다. 바람직하게는, 이는 멀티머 분해 시스템(multimer resolution system, mrs), 분할 시스템(partitioning system, par) 및 분리 후 살해 시스템(postsegregational killing system, PSK)의 군으로부터 유래한 플라스미드 안정화 시스템이다. 특히 바람직하게는, 플라스미드 안정화 시스템은 멀티머 분해 시스템의 군으로부터 유래한 서열을 포함하며, 특별히 바람직하게는 이는 cer 서열이다.
유도성 프로모터는 바람직하게는 군 tac, lac, trp 및 phoA로부터의 프로모터이다. 특히 바람직하게는, 이는 유도성 프로모터 lacUV5이다.
뉴클레오티드 작제물은 바람직하게는 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 서열, E. 콜라이 유래 lacZ 유전자의 5' 말단을 포함하는 lacUV5 프로모터의 뉴클레오티드 서열 및 T7 프로모터 서열로 이루어진 뉴클레오티드 작제물이다. 이러한 뉴클레오티드 작제물은 서열 번호 1에 나타나 있다. 특히 바람직하게는, 뉴클레오티드 작제물은 본 발명에 따른 발현 시스템의 원핵 세포의 게놈 내로 통합된다.
원핵 세포는 바람직하게는 게놈 중에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 E. 콜라이 균주의 세포이다. 이러한 균주는 균주 수집물에서 이용 가능한 것과 같은 야생형 균주로부터 자체 공지된 방식으로 제조될 수 있다. 이러한 균주의 예로는 E. 콜라이 균주 BL21(미국 라 호야 소재 Stratagene사로부터 구입 가능) HMS174(DSM5932), 또는 C600(DSM426)(독일 38124 브라운슈바이히, 인호펜슈트라쎄 7B 소재 Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH(DSMZ)[German Collection of Microorganisms and Cell Cultures]사로부터 상기 DSM 번호 하에 입수 가능)가 있다.
바람직하게는, 본 발명에 따른 T7 발현 시스템은 본 발명의 내용에 따라 개발된 T7 발현 벡터를 상기 균주 내로 도입함으로써 제조된다.
이러한 본 발명에 따른 발현 벡터는 바람직하게는 하기 구성요소:
복제 원점(ori),
조절 서열로서의 T7 프로모터,
발현시키고자 하는 재조합 단백질을 코딩하는 서열,
클로닝에 대한 선택 마커로서의 항생제 내성 유전자,
터미네이터,
리프레서 유전자,
리프레서 유전자에 적합한 오퍼레이터 서열, 및
플라스미드 안정화 시스템
을 기능적 결합으로 포함한다.
바람직하게는, 이는 이미 언급된 플라스미드 안정화 시스템 중 하나이다. 특히 바람직하게는, 플라스미드 안정화 시스템은 cer 서열을 포함한다.
바람직하게는, 복제 원점은 pBR322-ori, pUC19-ori 또는 p15A-ori이고, 특히 바람직하게는 pBR322-ori이다.
특히 바람직하게는, 터미네이터는 t0, rrnB 또는 T7 터미네이터이다.
리프레서 유전자는, 프로모터 영역에서 결합시 유전자의 전사를 방지하는 단백질을 코딩하는 임의 유전자이다. 특히 바람직하게는, 리프레서 유전자는 lacI 유전자이다.
바람직하게는, 항생제 내성 유전자는 kan, tet, bla, cmR 또는 tetA이고, 특히 바람직하게는 kan이다.
본 발명에 따른 T7 발현 시스템은 이미 공지된 T7 발현 시스템과 같이 제조될 수 있으며, 본 발명에 따른 발현 벡터를 게놈 내에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 원핵 세포 내로 도입한다는 차이점을 가진다.
본 발명의 추가 목적은, 본 발명에 따른 T7 발현 시스템의 일부로서 원핵 세포의 바람직한 실시양태를 제조하는 방법으로서, 공정에서 발생하는 세포 내로의 파지 DNA의 통합 없이 원핵 세포 내로의 제어 영역을 포함하는 T7 RNA 중합효소의 통합을 이루는 방법을 제공하는 것이다.
이 방법은 제어 영역을 포함하는 T7 RNA 중합효소의 코딩 서열이 “부위 특이적” 재조합에 의해 원핵 세포의 게놈 내로 통합되는 것을 특징으로 한다.
이러한 “부위 특이적” 재조합은 예를 들어 박테리오파지 P1 유래 Cre-lox 시스템 및 효모 유래 FLP-FRT 시스템에 의해 실현 가능하다. 염색체 박테리아 DNA의 수식을 위한 “부위 특이적” 재조합의 이용은 예를 들어 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, June 6, 2000 no.12, p.6640-6645]에 기술되어 있다.
바람직하게는, T7 RNA 중합효소의 표적 통합은 E. 콜라이 게놈, 바람직하게는 E. 콜라이의 proBA 서열 중 정의된 위치 내로 유도성 프로모터의 제어 하에 이루어진다. 이러한 방법은 예를 들어 문헌[Datsenko and Wanner, PNAS, June 6, 2000 no.12, p.6640-6645]에 공지되어 있다.
이 방법에 의해 제조된, 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포는 람다 파지 DNA를 포함하지 않는다는 점에서 이러한 작제물을 포함하는 공지된 원핵 세포와 다르다. 아주 놀랍게도, 이러한 세포에서 종래 발현 벡터가 또한 증가된 안정성을 나타내지만, 본 발명에 따른 발현 벡터를 이용하면 여전히 추가로 증가된 안정성을 달성할 수 있다는 것이 밝혀졌다.
따라서 본 발명은 또한, 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 바람직하게는 E. 콜라이 세포로서, 람다 파지 DNA를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 세포에 관한 것이다.
이와 별도로, 본 발명의 장점은 복합 배지 중 무항생제 발효에서의 이의 이용이며, 이로써 대체적으로 EP1697523B1에 기술된 발현 시스템을 이용한 것과 같은 무기물 염 배지를 이용하는 것에 비해 제조하고자 하는 단백질의 보다 높은 발현 효율이 달성될 수 있다. 따라서 본 발명은 또한 본 발명에 따른 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법에 관한 것이다.
이 방법은, 본 발명에 따른 발현 벡터를, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 단백질의 발현 및 T7 RNA 중합효소의 발현에 적합한 무항생제 조건 하에 발효시키고, 이로써 재조합 폴리펩티드를 발현시키고 재조합 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서, 발효 공정, 즉 단백질 발현에 대한 실제적 과정은 완전 무항생제 환경에서 이루어진다. 그 결과, 플라스미드의 선택을 위한 항생제의 사용과 관련된 도입부에서 언급된 문제점들, 예를 들어 규제 기관의 제한, 생성물 안정성, 최종 생성물 분석(생성물 중 항생제의 제거) 및 이와 관련된 위험 및 비용이 방지된다.
본 발명의 관점에서, 단백질은 또한 펩티드 및 폴리펩티드를 의미하는 것으로 이해될 것이다.
본 발명에 따른 방법은 바람직하게는 생물 반응기에서 수행된다.
도 1에서는 BL21(DE3)(선행 기술) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따름)의 게놈 중 T7 뉴클레오티드 작제물을 비교하여 개략적으로 나타낸다:
a) DE3: 수식된 람다 파지를 이용하여 람다 부착 부위 내로 통합(선행 기술)
b) Scil-T7: proBA의 동시 결실에 의한 표적 통합(본 발명에 따름)
도 2에서는 lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역, T7 프로모터 및 T7 파지(T7 중합효소)의 유전자 1 및 2개의 FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자 kan으로 이루어진 T7 뉴클레오티드 작제물을 개략적으로 나타낸다 .
도 3에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, kan 및 lacI로 이루어진 발현 벡터 pSCIL006c를 개략적으로 나타낸다.
도 4에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, kan, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL122 및 pSCIL123를 개략적으로 나타낸다.
도 5에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, proBA, tetA, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL124 및 pSCIL125를 개략적으로 나타낸다.
도 6에서는 T7 프로모터, t0 터미네이터, pBR322-ori, kan, lacI 및 cer로 이루어진 발현 벡터 pSCIL129를 개략적으로 나타낸다.
하기 실시예는 본 발명의 추가 설명을 위한 것이다.
실시예 1: 본 발명에 따른 발현 벡터 및 플라스미드의 제조
발현 플라스미드 pSCIL006c 의 제조
발현 벡터 pSCIL006c(도 3)의 제조는 하기에 보다 상세히 기술되어 있다.
1. t0 터미네이터의 pUC19 내로의 삽입 = pSCIL001
시판 벡터 pUC19(SD0061, MBI Fermentas)를 발현 벡터의 제조를 위한 베이시스(basis)로서 사용하였다. pUC19를 엔도뉴클레아제 HindIII 및 AflIII로 절단하고, 이는 359 bp의 벡터 서열의 결실을 야기하였다. t0 전사 터미네이터를 프라이머 t0-OD-MCS-HindIII(서열 번호 2) 및 t0-UU-MCS-AflIII(서열 번호 3)를 이용하여 파지 람다(SD0011, MBI Fermentas)의 DNA로부터 증폭시켰다. 이후 형성된 단편을 엔도뉴클레아제 HindIII 및 AflIII로 절단하고 정제(Minielute Kit, Qiagen) 후 pUC19 Hin dIII/ Afl III 단편 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL101를 제한 분석(restriction analysis) 및 서열분석으로 확인하였다.
2. pSCIL001 중 항생제 내성 카세트의 교체 = pSCIL002
카나마이신 내성 카세트를 프라이머 Km-OD-ApaI(서열 번호 4) 및 Km-UU-NheI(서열 번호 5)로 PCR에 의해 pACYC177(E4151 S, NEB)로부터 증폭시켰다. 단편을 겔 추출 키트(Gel Extraction Kit)(Qiagen)로 정제하고 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 플라스미드 pSCIL101을 프라이머 pUC2541-OD-NheI(서열 번호 6) 및 pUC1496-UU-ApaI(서열 번호 7)을 이용하여 암피실린 내성 카세트 없이 증폭시키고 엔도뉴클레아제 ApaI 및 NheI로 절단하였다. 카나마이신 내성 카세트를 엔도뉴클레아제 ApaI 및 NheI로 pGEMT-T easy로부터 절단하고 pSCIL001(ΔAmp) Apa I/ Nhe I 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL002를 제한 분석으로 확인하였다.
3. 카나마이신 내성 카세트 배향의 변경 = pSCIL002b
pSCL 벡터 중 카나마이신 내성 카세트의 배향은 카나마이신 내성 유전자의 배경(background) 발현에서 결정적인 역할을 하며, 따라서 제2 벡터 세대에서 내성 카세트의 배향은 예를 들어 pSCIL008(EP1697523B1)에 비교하여 변경된다. 이를 위해, pSCIL002의 백본이 먼저 프라이머 MunI-Km term(서열 번호 8) 및 ApaI-pSCIL002(서열 번호 9)를 이용하여 카나마이신 내성 카세트 없이 증폭된 후, 뉴클레아제 MunI(MfeI) 및 ApaI로 절단된다. 카나마이신 내성 카세트를 pSCIL002로부터 프라이머 Km 5'-MunI(서열 번호 10) 및 Km 3' ApaI(서열 번호 11)로 증폭시키고 마찬가지로 엔도뉴클레아제 MunI(MfeI) 및 ApaI로 절단하였다. 두 단편 모두를 이후 결찰시켜, 플라스미드 pSCIL002b를 유도하였다. 올바른 통합을 서열분석으로 확인하였다.
4. pSCIL002b 내로의 제2 선택 마커의 삽입 = pSCIL003b
이후 E. 콜라이의 프롤린 합성 경로에 대한 유전자인 proBA를 제2 선택 마커로서 pSCIL002b 내에 통합시켰다. 이를 위해, 먼저 proBA 오페론을 E. 콜라이 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트(DNeasy Tissue Kit), Qiagen) 유래 사전 제조된 유전체 DNA로부터 프라이머 proBA-OD-ApaI(서열 번호 12) 및 proBA-UU-ApaI(서열 번호 13)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 ApaI로 절단하고, 마찬가지로 ApaI로 절단된 벡터 pSCIL002b 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL003b를 서열분석으로 확인하였다.
5. pSCIL003b 내로의 리프레서 유전자 lacI의 삽입 = pSCIL004b
고유 프로모터 영역을 포함하는 lacI 유전자를, 프라이머 lacI OD NheI(서열 번호 14) 및 lacI UU NheI(서열 번호 15)를 사용하여 E. 콜라이 균주 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트, Qiagen)의 염색체 DNA로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하고 서열분석으로 확인하였다. 엔도뉴클레아제 NheI로의 제한 후, lacI을 pSCIL003b 내로 결찰시켰다.
6. pSCIL004b 내로의 T7 프로모터의 삽입 = pSCIL006b
lac 오퍼레이터 서열을 포함하는 T7 프로모터를, 프라이머 PrT7-MunI5'(서열 번호 16) 및 PrT7-EcoRI3'(서열 번호 17)를 이용하여 플라스미드 pSCIL006(원래 pTYB2, #6710, NEB 유래)로부터 증폭시켰다. 추가로, 프라이머 PrT7-EcoRI3'를 이용하여 후자의 리보솜 결합 부위(AGGAGA)를 PCR 생성물를 통합시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 MunI ( MfeI )로 절단하고, EcoRI로 절단된 벡터 pSCIL004b 내로 클로닝하였다. 결과로 생성된 플라스미드 pSCIL006b를 서열분석으로 확인하였다.
7. pSCIL006b에서 1개 뉴클레오티드의 교체에 의한 복제 원점(복제의 원점)의 변경 = pSCIL006c
pUC19의 후손(descendant)으로서, 발현 플라스미드 pSCIL006b는 30℃에서보다 37℃에서 훨씬 더 큰 카피수를 나타낸다. 이에 대한 원인은 원래의 플라스미드 pBR322의 복제의 원점에서의 점 돌연변이(G→A)이다. 이러한 pSCIL006b에서의 돌연변이를 역전시키기 위해, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(Phusion Site Directed Mutagenesis Kit)(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 이를 위해, 전체 플라스미드를 프라이머 ori_mut_fwd(서열 번호 18) 및 ori_rev(서열 번호 19)로 증폭시킨 후 재결찰시켰다. 카피수가 온도와 관계 없이 약 60 카피/세포인, 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL006c로 명명하였다(도 3, 서열 번호 20 참조).
발현 벡터 pSCIL122 및 pSCIL123 의 제조
1. cer의 pSCIL006c 내로의 삽입 = pSCIL122 및 pSCIL123
cer 요소를 프라이머 5'cer_NdeI(서열 번호 21) 및 3'cer_NdeI(서열 번호 22)를 이용하여 PCR에 의해 플라스미드 ColE1(퀴아프렙 스핀 미니프렙(QIAprep Spin Miniprep)(Qiagen)을 이용하여 E. 콜라이 JC411(DSM3877)(DSMZ)로부터 단리됨)로부터 증폭시키고 pSCIL006c 중 독특한 NdeI 절단 부위 내로 통합시켰다. 여기서, 2가지 배향(정방향 및 역방향)이 모두 가능하다. 결과로 얻어진 cer을 정배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL122로 명명하고, cer을 역배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL123로 명명하고 서열분석으로 확인하였다(도 4, 서열 번호 23 참조).
발현 벡터 pSCIL124 및 pSCIL125 의 제조
1. kan 의 pSCIL006c에서의 결실 = pSCIL112
카나마이신 내성 카세트의 결실에 대하여, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 이를 위해, pSCIL006c의 백본을 프라이머 pSCIL_Nco_P(서열 번호 24) 및 pSCIL_Spe_P(서열 번호 25)로 증폭시키고 재결찰시켰으며, 이는 카나마이신 내성 카세트의 결실을 유도하였다. 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL112로 명명하였다.
2. pSCIL112 내로의 tetA의 삽입 = pSCIL105
테트라사이클린 내성 카세트를 프라이머 tetA_5'promo_NcoI(서열 번호 26) 및 tetA_3'_SpeI(서열 번호 27)로 pBR322(D1511, Promega)로부터 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 NcoI 및 SpeI로 절단하고, 마찬가지로 NcoI 및 SpeI로 절단된 벡터 pSCIL112 내로 클로닝하였다. 결과로 얻어진 플라스미드가 테트라사이클린 내성 카세트 1개 카피 대신 2개 카피를 갖기 때문에, 1개 카피를 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 이용하여 제거하였다. 이를 위해, 플라스미드를 프라이머 105_fwd_P(서열 번호 28) 및 105_rev_P(서열 번호 29)로 증폭시킨 후 재결찰시켰다. 결과로 얻어진 플라스미드를 서열분석으로 확인하고 pSCIL105로 명명하였다.
3. cer의 pSCIL105 내로의 삽입 = pSCIL124 및 pSCIL125
cer 요소를 프라이머 5'cer_NdeI(서열 번호 21) 및 3'cer_NdeI(서열 번호 22)를 이용하여 PCR에 의해 플라스미드 ColE1(퀴아프렙 스핀 미니프렙(Qiagen)을 이용하여 E. 콜라이 JC411(DSM3877)(DSMZ)로부터 단리됨)로부터 증폭시키고 pSCIL105 중 독특한 NdeI 절단 부위 내로 통합시켰다. 여기서, 2가지 배향(정방향 및 역방향)이 모두 가능하다. 결과로 얻어진 cer을 정배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL124로 명명하고, cer을 역배향으로 갖는 플라스미드를 pSCIL125로 명명하고 서열분석으로 확인하였다(도 5, 서열 번호 30 참조).
발현 벡터 pSCIL129 의 제조
1. pSCIL123에서 proBA의 결실 = pSCIL129
발현 벡터의 플라스미드 크기를 감소시키기 위해, 다시 proBA 카세트를 제거하였다. 이를 위해, 퓨전 부위 특이적 돌연변이 유발 키트(F-541, Finnzymes)를 사용하였다. 플라스미드 pSCIL123을 후속 재결찰 후 proBA 오페론이 결실되도록 프라이머 pSCIL-proBA_rev-P(서열 번호 31) 및 pSCIL-proBA_fwd-P(서열 번호 32)를 이용하여 증폭된다. 결과로 얻어진 발현 벡터를 pSCIL129로 명명하고 및 서열분석으로 확인하였다(도 6, 서열 번호 33 참조).
실시예 2: 본 발명에 따른 발현 시스템의 제조
E. 콜라이 균주 BL21(Stratagene), HMS174(DSM5932) 및 C600'(DSM426)을 Stratagene사 또는 DSMZ(Deutsche Stammsammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH, 독일 브라운슈바이히 소재)사로부터 입수하였다. 균주 BL21, HMS174 및 C600'을 각각 플라스미드 pKD46(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교(Yale University) 소재)으로 형질전환하고, 이는 람다 파지의 Red 재조합효소를 코딩한다. 이로써, E. 콜라이 게놈 내로의 T7 작제물의 표적 통합이 가능했다. 결과로 얻어진 균주 BL21 pKD46, HMS174 pKD46 및 C600' pKD46로부터, 다시 적격 세포(competent cell)를 제조하였다. pKD46의 선택은 한천 평판 상의 암피실린 또는 액체 배양에서의 카르베니실린으로 수행하였다.
lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역, T7 프로모터 및 T7 파지의 유전자 1(T7 중합효소) 및 2개의 FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자 kan으로 이루어진 도 2에 나타낸 DNA 작제물을 하기와 같이 제조하였다.
먼저, 성분들을 개별적으로 증폭시키고 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 함께 클로닝하였다. T7 RNA 중합효소에 대한 유전자(유전자 1)를 T7 파지(310005, Bioron GmbH)의 DNA로부터 프라이머 T7　5'_BamHI_Xho(서열 번호 34) 및 T7 3'_Hind(서열 번호 35)를 이용하여 증폭시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제(Qiaquick PCR Purification)(Qiagen)로 정제하고 오버행(overhanging) 아데닌 잔기를 이용하여 벡터 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::T7을 서열분석으로 확인하였다. lacI 유전자를, 프라이머 lacI　5'_BamHI_coli(서열 번호 36) 및 lacI 3'_UV5_Xho(서열 번호 37)를 사용하여 E. 콜라이 균주 K12(DSM 9037, Deutschen Sammlung fuer Mikroorganismen and Zellkulturen GmbH; DNeasy 조직 키트, Qiagen)의 유전체 DNA로부터 증폭시켰다. 또한, lacUV5 프로모터의 서열을 프라이머 lacI 3'_UV5_Xho(서열 번호 37)의 도움으로 PCR 생성물 내로 통합시켰다. PCR 생성물을 퀴아퀵 PCR 정제(Qiagen)로 정제하고 오버행 아데닌 잔기를 이용하여 벡터 pGEM-T easy(A1360, Promega) 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5를 서열분석으로 확인한 후 엔도뉴클레아제 BamHI 및 XhoI로 절단하였다. 형성된 단편을 퀴아퀵 겔 추출 키트(Qiagen)로 정제하고 마찬가지로 절단 및 정제된 플라스미드 pGEM::T7 내로 클로닝하였다. 형성된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5-T7을 서열분석으로 확인하였다. FRT 부위에 의해 플랭크된 카나마이신 내성 유전자를 플라스미드 pKD4(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교 소재)로부터 프라이머 Hind_pKD4 5'(서열 번호 38) 및 pKD4 3'_Hind_coli(서열 번호 39)로 증폭시켰다. PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 HindIII로 절단하고, 마찬가지로 HindIII로 절단된 플라스미드 pGEM::lacI-lacUV5-T7 내로 클로닝하였다. 최종 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 HindIII를 이용한 제한효소 처리로 확인하였다.
DE3와 유사한 T7 뉴클레오티드 작제물을 제조하기 위해, 먼저 lacI, lacUV5 프로모터, lacZ의 5' 영역 및 T7 파지의 유전자 1의 첫 2574 bp(내부 MfeI 절단 부위까지)로 이루어진 영역을 프라이머 T7_neu_BamHI_for01(서열 번호 40) 및 T7_neu_MfeI_rev02(서열 번호 41)를 이용하여 BL21(DE3)[Novagen 69387-3]로부터 사전 단리된 유전체 DNA(유전체 DNA 정제 키트, Fermentas)로부터 증폭시켰다. 정제(Wizard® SV Gel 및 PCR, Promega) 후, 상기 PCR 생성물을 엔도뉴클레아제 BamHI 및 MfeI로 절단하고 정제(Wizard® SV Gel 및 PCR, Promega) 후 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5-T7-kan-FRT Bam HI / Mfe I의 4647 bp 단편 내로 클로닝하였다. TOP10F'(Life Technologies) 내로의 형질전환 및 100 ㎍/ml 암피실린을 이용한 LB 플레이트상에서의 선택 후, 결과로 얻어진 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(서열 번호 42)를 제조하였다.
이후, 전체 작제물을 엔도뉴클레아제 EcoRI를 이용하여 플라스미드 pGEM-T easy::lacI-lacUV5_lacZ_T7-kan(서열 번호 42)로부터 절단해내었다. 이로써 형성된 6026　bp 단편을 Wizard® SV Gel 및 PCR-키트(Promega)를 이용하여 정제하였다. 균주 BL21 pKD46, HMS174 pKD46 및 C600' pKD46를 이후 이 DNA 단편으로 형질전환시키고 E. 콜라이 게놈 내로의 통합을 가능하게 하기 위해 실온에서 밤새 항온처리하였다.
proBA 오페론의 플랭킹 영역과 매칭되는 DNA 작제물의 플랭킹 영역(서열 번호 43: rec 부위 1 및 서열 번호 44: rec 부위 2)의 선택의 결과로서, proBA 오페론은 통합 중에 동시에 결실되었다. 도 2에 나타낸 T7 RNA 중합효소 작제물에 대한 선택은 배지 내 카나마이신을 이용하여 수행하였다. 헬퍼 플라스미드 pKD46의 소실은 암피실린 함유 또는 카르베니실린 함유 배지 상에서의 생장 능력의 소실을 통해 검출하였다.
적격 세포는 결과로 얻어진 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ::kan, HMS174 ΔproBA-T7lacZ::kan 및 C600'ΔproBA-T7lacZ::kan로부터 제조되고 헬퍼 플라스미드 pCP20(CGSC, E. coli Genetic Stock Center, 미국 뉴 헤이븐 예일 대학교 소재)로 형질전환되었다. 이 단계는, pCP20 상에 코딩된 FLP 재조합효소에 의해, 제1 단계에서 또한 게놈 내로 통합된 카나마이신 내성의 결실에 관해 작용한다. pCP20를 이용한 균주의 선택은 암피실린 함유 플레이트 상에서 수행하였다. 밤새 43℃에서 세포를 항온처리함으로써, 헬퍼 플라스미드 pCP20이 소실되었다. 결과로 얻어진 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ, HMS174 ΔproBA-T7lacZ 및 C600'ΔproBA-T7lacZ는 임의 항생제 내성을 갖지 않으며 게놈 내에 proBA 오페론 대신 도 1에 나타낸 T7 작제물을 포함하였다. 상기 방법으로부터의 “상흔(scar)”으로서 게놈 내에 남아 있는 1개의 FRT 부위는, FLP 재조합효소에 의해 카나마이신 내성 카세트의 결실을 통해 발생하였다. 균주를 서던 혼성화(Southern hybridization)로 검증하였다. 이 과정에서, T7 RNA 중합효소에 대한 코딩 서열의 통합 및 proBA의 결실을 검출하였다.
실시예 1 유래의 발현 플라스미드를 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ 내로 전기천공으로 도입하고 이로써 HMS174 ΔproBA-T7lacZ를 얻었다.
실시예 3: 본 발명에 따른 T7 발현 시스템 및 선행 기술에 따른 T7 발현 시스템의 플라스미드 안정성의 비교
BL21(DE3)(선행 기술로부터의 균주) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 균주)에서 선행 기술에 따른 T7 발현 플라스미드 및 본 발명에 따른 T7 발현 플라스미드의 안정성을 연구하기 위해, 진탕 플라스크 및 유가식(fed batch) 발효에서 실험을 수행하였다. 이를 위해, 유전자 합성(Geneart, 독일 레겐스부르크)으로부터 유래한 인간 생장 인자 proNGF에 대한 유전자를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 PstI를 이용하여 발현 벡터 내로 클로닝하였다. 진탕 플라스크에서의 플라스미드 안정성의 연구를 위해, 하기와 같은 절차를 이용하였다. 먼저, 연구하고자 하는 발현 균주들의 전배양물(preculture), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(선행 기술), 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(본 발명에 따른 발현 플라스미드), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(플라스미드 안정화 시스템이 없는 발현 플라스미드를 갖는 본 발명에 따른 발현 균주) 및 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 발현 시스템)을 50　㎍/ml 카나마이신을 갖는 복합 배지[34.5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 15 g/l 글루코스]에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 다음날 아침, 광학 밀도 OD600 = 0.2-0.3로 본 배양물(main culture)을 접종할 필요가 있는 세포를, 6500 rpm(5 분)에서 원심분리하여 무균 채취하였다. 이로써 접종된 본 배양물(100 ml 에를렌마이어 플라스크 중 20 ml 무항생제 복합 배지)을 OD600 = 0.8이 달성되기까지 210 rpm에서 진탕하면서 37℃에서 항온처리하였다. 이때, 표적 유전자 발현을 1　mM IPTG 첨가에 의해 유도하였다. 유도 물질 첨가 후 3시간(3 h pi(유도 후(post induction)) 및 24 h(24 h pi)에, 배양물의 무균 희석물을 제조하고 LB 배지[5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 10　g/l 소야 펩톤(Merck 1.07212.0500), 85.56　mM NaCl] 상에 플레이팅하였다. 이러한 플레이트를 37℃에서 밤새 항온처리하였다. 각 경우 생장한 콜로니로부터 100개의 콜로니를 LB 및 LB + 50 ㎍/ml 카나마이신 상에 평행하게 이식하였다(prick out). 따라서 예를 들어 10%의 플라스미드 안정성은 LB 상에서 생장한 콜로니의 10%만이 또한 LB + 카나마이신 상에서 생장한다는 것을 의미한다. LB + 카나마이신에서만 생장할 수 있는 콜로니는 여전히 발현 플라스미드를 보유하였다. LB에서만 생장할 수 있는 콜로니는 발현 플라스미드를 상실하였다. 각 경우, 플라스미드 안정성에 대한 결론을 도출하기 위해 4회의 독립적인 실험을 수행하였다. 결과는 평균값 및 표준 편차로서 하기 표 1에 나타내었다.
진탕 플라스크에서의 BL21(DE3)(선행 기술에 따른 균주) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 균주) 중 선행 기술에 따른 표준 발현 플라스미드(pSCIL006cΔproBA::proNGF) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL129::proNGF)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006cΔproBA::proNGF pSCIL129::proNGF pSCIL006cΔproBA::proNGF pSCIL129::proNGF
3 h pi 86% ± 4 100% 90% ± 7 100%
24 h pi 5% ± 6 88% ± 6 84% ± 18 99% ± 1
선행 기술에 따른 발현 시스템이 유도 후 3 h 86% 및 유도 후 24 h 5%뿐인 매우 낮은 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 본 발명에 따른 cer을 이용한 발현 플라스미드의 안정화를 통해, 유도 후 3 h 100% 및 유도 후 24 h 88%로의 플라스미드 안정성 증가가 BL21(DE3)에서 가능하였다. 유도 후 24 h 약 100%로의 플라스미드 안정성 증가는, 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ로 이루어진 본 발명에 따른 T7 발현 시스템의 사용을 통해서만 달성될 수 있었다. 그러나 놀랍게도, BL21 ΔproBA-T7lacZ 중의 표준 발현 플라스미드는 또한 유도 후 3 h 90% 및 유도 후 24 h 84%의 높은 플라스미드 안정성을 나타낸 반면, 동시에 BL21(DE3) 중 동일한 플라스미드는 이미 실질적으로 상실되었다(5% 24 h pi). 이러한 실험에서의 표적 유전자로서, 인간 생장 인자 proNGF가 발현된다. proNGF의 발현을 SDS-PAGE로 확인하였다.
이와 별도로, 본 발명에 따른 발현 시스템을 유가식 발효에서의 선행 기술과 비교하였다. 먼저, 연구하고자 하는 발현 균주들의 전배양물, 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(선행 기술), 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21(DE3)(본 발명에 따른 발현 플라스미드), 표준 발현 플라스미드 pSCIL006cΔproBA::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(플라스미드 안정화 시스템이 없는 발현 플라스미드를 갖는 본 발명에 따른 발현 균주) 및 안정한 발현 플라스미드 pSCIL129::proNGF를 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ(본 발명에 따른 발현 시스템)을 50　㎍/ml 카나마이신을 갖는 복합 배지[34.5 g/l 효모 추출물(Merck 1.03753.0500), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 15 g/l 글루코스]에서 진탕하면서 37℃에서 밤새 배양하였다. 발효를 위해, 각 경우 2 l 무항생제 복합 배지[50 g/l 효모 추출물(Biospringer 0206), 2.475　mM MgSO4, 9.347 mM NH4Cl, 62 mM K2HPO4, 10　g/l 글루코스, 0.2 ml/l 안티폼 신페로닉(antifoam Synperonic)(Croda ETK0879)]를 5　l 실험실용 발효기에 위치시키고 0.06의 출발 OD600(600 nm에서의 광학 밀도)가 도달되도록 발현 균주의 전배양물로 접종하였다. 6.5　h 후, 글루코스가 소모된 후, 기질을 첨가함으로써 유가식 상(fed batch phase)을 시작하였다. 기질 공급물 흐름은 여기서 공급물 흐름(feedflow) = const*exp(μ₁*t) 형태의 지수 함수에 따라 일어난다. 여기서 μ는 μ₁ = const < μmax가 적용되는 비생장속도이며, 즉 일시적으로 가능한 글루코스 농도는 항상 미생물의 최대 일시적 요구량보다 낮으며, 이의 결과로서 준최대 생장속도가 달성되고 글루코스의 축적이 방지된다. 예를 들어, 값 μ₁ = 0.25 h-1을 설정하였다. 정의된 광학 밀도, 예를 들어 OD600 = 50 ± 5에서, 단백질 발현은 예를 들어 1　mM의 IPTG의 첨가에 의해 유도되었다. 이때, 기질 공급물 흐름은 6 h에 걸쳐 선형적으로 70%를 감소된 후 일정하게 유지되었다. 공정은 정의된 유도 기간, 예를 들어 24 h 후에 정지되었다.
OD600 = 50 ± 5 달성시, 표적 유전자 발현을 1 mM IPTG 첨가에 의해 유도하였다. 이때 및 유도 후 6　h, 8 h 및 24 h에, 플라스미드 안정성을 상기 기술된 바와 같이 분석하고 인간 생장 인자 proNGF의 발현을 확인하였다. 데이터는 하기 표 2에 제시되어 있다.
유가식 발효에서 BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서의 표준 발현 플라스미드(pSCIL006cΔproBA::proNGF) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL129::proNGF)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006c
ΔproBA::proNGF		 pSCIL129::proNGF pSCIL006c
ΔproBA::proNGF		 pSCIL129::proNGF
유도 OD600 51.6 52.2 46.1 47.2
PS 100% 100% 100% 100%
6 h pi OD600 97.4 101.2 99.0 106.9
PS 11% 100% 94% 100%
8 h pi OD600 97.4 103.6 101.6 108.9
PS 13% 100% 89% 100%
24 h pi OD600 106.6 98.8 113.6 122.9
PS 2% 100% 95% 100%
(PS: 플라스미드 안정성)
유가식 발효에서, 선행 기술에 따른 발현 시스템은 유도 후 6 h 발현 플라스미드의 89%를 이미 상실하였고(PS 11%), 반면 본 발명에 따른 발현 시스템은 심지어 유도 후 24 h 100%의 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 여기서 플라스미드 안정화 시스템 cer(pSCIL129::proNGF)을 갖는 본 발명에 따른 발현 플라스미드 및 또한 본 발명에 따른 발현 균주 BL21 ΔproBA-T7lacZ 둘 모두는 선행 기술에 따른 발현 시스템에 비해 명백한 이점을 갖는데, 이는 여기서 각각 100% 및 95%인 유도 후 24 h의 플라스미드 안정성이 2%인 선행 기술에 따른 발현 시스템에서보다 현저히 높기 때문이다.
BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서 본 발명에 따른 T7 발현 플라스미드의 안정성을 추가 연구하기 위해, 진탕 플라스크에서 추가 실험을 수행하였다. 이를 위해, 유전자 합성(Geneart, 독일 레겐스부르크)으로부터 유래한 인간 프리트롬빈(prethrombin)에 대한 유전자를 엔도뉴클레아제 EcoRI 및 PstI를 이용하여 발현 벡터 pSCIL006c(통상 발현 플라스미드) 및 pSCIL123(안정한 발현 플라스미드) 내로 클로닝하였다. 진탕 플라스크에서의 플라스미드 안정성의 연구를 위해, 상기 기술된 것과 같은 절차를 이용하였다. 결과는 하기 표 3에 나타나 있다.
BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ에서 표준 발현 플라스미드(pSCIL006c::프리트롬빈) 및 본 발명에 따른 발현 플라스미드(pSCIL123::프리트롬빈)의 플라스미드 안정성
시간 BL21(DE3) BL21 ΔproBA-T7lacZ
pSCIL006c::프리트롬빈 pSCIL123::프리트롬빈 pSCIL006c::프리트롬빈 pSCIL123::프리트롬빈
3 h pi 5% ± 5 100% 6% ± 3 100%
24 h pi 1% ± 0 41% ± 1 1% ± 2 78% ± 5
선행 기술에 따른 발현 시스템이 극히 낮은 플라스미드 안정성을 나타낸다는 것이 밝혀졌다. 이미 유도 후 3 h째에, 5% 플라스미드 보유 균주만이 여전히 존재했으며, 24 h 후 거의 모든 세포는 플라스미드가 없었다.
발현 플라스미드 pSCIL123::프리트롬빈의 사용을 통해, 유도 후 3 h 100%의 플라스미드 안정성이 발현 균주 BL21(DE3) 및 BL21 ΔproBA-T7lacZ 둘 모두에서 달성될 수 있었다. 유도 후 24 h째에, 78%인 본 발명에 따른 발현 시스템(pSCIL123::프리트롬빈을 갖는 BL21 ΔproBA-T7lacZ)의 플라스미드 안정성은, 41%인 선행 기술에 따른 발현 균주(BL21(DE3) pSCIL123::프리트롬빈)에서보다 약 2배 높았다. 인간 프리트롬빈의 발현을 SDS-PAGE에 의해 확인하였다.
[발명의 효과]
본 발명의 발현 시스템은 종래 기술에 비해 플라스미드 안정성이 높으며, 파지 DNA를 포함하지 않아 의약용 단백질의 발현을 위한 시스템에 적합하고, 항생제 내성 유전자를 포함하지 않으므로 치료 단백질 제조에 적합하며 현저히 보다 경제적인 공정을 구축할 수 있다.
SEQUENCE LISTING <110> Wacker Chemie AG <120> T7 expression system, method for its production and use thereof for antibiotic-free production of recombinant proteins <130> Wa11363F <160> 44 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 5990 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> chromosomal T7 RNA polymerase construct <400> 1 acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga atggcgcaaa 60 acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc aattcagggt ggtgaatgtg 120 aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg tctcttatca gaccgtttcc 180 cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc gggaaaaagt ggaagcggcg 240 atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac aactggcggg caaacagtcg 300 ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg cgccgtcgca aattgtcgcg 360 gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg tggtgtcgat ggtagaacga 420 agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc tcgcgcaacg cgtcagtggg 480 ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg ctgtggaagc tgcctgcact 540 aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac ccatcaacag tattattttc 600 tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg tcgcattggg tcaccagcaa 660 atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc gtctgcgtct ggctggctgg 720 cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg aacgggaagg cgactggagt 780 gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg agggcatcgt tcccactgcg 840 atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc gcgccattac cgagtccggg 900 ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg ataccgaaga cagctcatgt 960 tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc tgctggggca aaccagcgtg 1020 gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg gcaatcagct gttgcccgtc 1080 tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc aaaccgcctc tccccgcgcg 1140 ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc gactggaaag cgggcagtga 1200 gcgcaacgca attaatgtaa gttagctcac tcattaggca ccccaggctt tacactttat 1260 gcttccggct cgtataatgt gtggaattgt gagcggataa caatttcaca caggaaacag 1320 ctatgaccat gattacggat tcactggccg tcgttttaca acgtcgtgac tgggaaaacc 1380 ctggcgttac ccaacttaat cgccttgcag cacatccccc tttcgccagc tggcgtaata 1440 gcgaagaggc ccgcaccgat cgcccttccc aacagttgcg cagcctgaat ggcgaatggc 1500 gctttgcctg gtttccggca ccagaagcgg tgccggaaag ctggctggag tgcgatcttc 1560 ctgaggccga tactgtcgtc gtcccctcaa actggcagat gcacggttac gatgcgccca 1620 tctacaccaa cgtgacctat cccattacgg tcaatccgcc gtttgttccc acggagaatc 1680 cgacgggttg ttactcgctc acatttaatg ttgatgaaag ctggctacag gaaggccaga 1740 cgcgaattat ttttgatggc gtcgggatct gatccggatt tactaactgg aagaggcact 1800 aaatgaacac gattaacatc gctaagaacg acttctctga catcgaactg gctgctatcc 1860 cgttcaacac tctggctgac cattacggtg agcgtttagc tcgcgaacag ttggcccttg 1920 agcatgagtc ttacgagatg ggtgaagcac gcttccgcaa gatgtttgag cgtcaactta 1980 aagctggtga ggttgcggat aacgctgccg ccaagcctct catcactacc ctactcccta 2040 agatgattgc acgcatcaac gactggtttg aggaagtgaa agctaagcgc ggcaagcgcc 2100 cgacagcctt ccagttcctg caagaaatca agccggaagc cgtagcgtac atcaccatta 2160 agaccactct ggcttgccta accagtgctg acaatacaac cgttcaggct gtagcaagcg 2220 caatcggtcg ggccattgag gacgaggctc gcttcggtcg tatccgtgac cttgaagcta 2280 agcacttcaa gaaaaacgtt gaggaacaac tcaacaagcg cgtagggcac gtctacaaga 2340 aagcatttat gcaagttgtc gaggctgaca tgctctctaa gggtctactc ggtggcgagg 2400 cgtggtcttc gtggcataag gaagactcta ttcatgtagg agtacgctgc atcgagatgc 2460 tcattgagtc aaccggaatg gttagcttac accgccaaaa tgctggcgta gtaggtcaag 2520 actctgagac tatcgaactc gcacctgaat acgctgaggc tatcgcaacc cgtgcaggtg 2580 cgctggctgg catctctccg atgttccaac cttgcgtagt tcctcctaag ccgtggactg 2640 gcattactgg tggtggctat tgggctaacg gtcgtcgtcc tctggcgctg gtgcgtactc 2700 acagtaagaa agcactgatg cgctacgaag acgtttacat gcctgaggtg tacaaagcga 2760 ttaacattgc gcaaaacacc gcatggaaaa tcaacaagaa agtcctagcg gtcgccaacg 2820 taatcaccaa gtggaagcat tgtccggtcg aggacatccc tgcgattgag cgtgaagaac 2880 tcccgatgaa accggaagac atcgacatga atcctgaggc tctcaccgcg tggaaacgtg 2940 ctgccgctgc tgtgtaccgc aaggacaagg ctcgcaagtc tcgccgtatc agccttgagt 3000 tcatgcttga gcaagccaat aagtttgcta accataaggc catctggttc ccttacaaca 3060 tggactggcg cggtcgtgtt tacgctgtgt caatgttcaa cccgcaaggt aacgatatga 3120 ccaaaggact gcttacgctg gcgaaaggta aaccaatcgg taaggaaggt tactactggc 3180 tgaaaatcca cggtgcaaac tgtgcgggtg tcgataaggt tccgttccct gagcgcatca 3240 agttcattga ggaaaaccac gagaacatca tggcttgcgc taagtctcca ctggagaaca 3300 cttggtgggc tgagcaagat tctccgttct gcttccttgc gttctgcttt gagtacgctg 3360 gggtacagca ccacggcctg agctataact gctcccttcc gctggcgttt gacgggtctt 3420 gctctggcat ccagcacttc tccgcgatgc tccgagatga ggtaggtggt cgcgcggtta 3480 acttgcttcc tagtgaaacc gttcaggaca tctacgggat tgttgctaag aaagtcaacg 3540 agattctaca agcagacgca atcaatggga ccgataacga agtagttacc gtgaccgatg 3600 agaacactgg tgaaatctct gagaaagtca agctgggcac taaggcactg gctggtcaat 3660 ggctggctta cggtgttact cgcagtgtga ctaagcgttc agtcatgacg ctggcttacg 3720 ggtccaaaga gttcggcttc cgtcaacaag tgctggaaga taccattcag ccagctattg 3780 attccggcaa gggtctgatg ttcactcagc cgaatcaggc tgctggatac atggctaagc 3840 tgatttggga atctgtgagc gtgacggtgg tagctgcggt tgaagcaatg aactggctta 3900 agtctgctgc taagctgctg gctgctgagg tcaaagataa gaagactgga gagattcttc 3960 gcaagcgttg cgctgtgcat tgggtaactc ctgatggttt ccctgtgtgg caggaataca 4020 agaagcctat tcagacgcgc ttgaacctga tgttcctcgg tcagttccgc ttacagccta 4080 ccattaacac caacaaagat agcgagattg atgcacacaa acaggagtct ggtatcgctc 4140 ctaactttgt acacagccaa gacggtagcc accttcgtaa gactgtagtg tgggcacacg 4200 agaagtacgg aatcgaatct tttgcactga ttcacgactc cttcggtacc attccggctg 4260 acgctgcgaa cctgttcaaa gcagtgcgcg aaactatggt tgacacatat gagtcttgtg 4320 atgtactggc tgatttctac gaccagttcg ctgaccagtt gcacgagtct caattggaca 4380 aaatgccagc acttccggct aaaggtaact tgaacctccg tgacatctta gagtcggact 4440 tcgcgttcgc gtaaaagctt gcgattgtgt aggctggagc tgcttcgaag ttcctatact 4500 ttctagagaa taggaacttc ggaataggaa cttcaagatc ccctcacgct gccgcaagca 4560 ctcagggcgc aagggctgct aaaggaagcg gaacacgtag aaagccagtc cgcagaaacg 4620 gtgctgaccc cggatgaatg tcagctactg ggctatctgg acaagggaaa acgcaagcgc 4680 aaagagaaag caggtagctt gcagtgggct tacatggcga tagctagact gggcggtttt 4740 atggacagca agcgaaccgg aattgccagc tggggcgccc tctggtaagg ttgggaagcc 4800 ctgcaaagta aactggatgg ctttcttgcc gccaaggatc tgatggcgca ggggatcaag 4860 atctgatcaa gagacaggat gaggatcgtt tcgcatgatt gaacaagatg gattgcacgc 4920 aggttctccg gccgcttggg tggagaggct attcggctat gactgggcac aacagacaat 4980 cggctgctct gatgccgccg tgttccggct gtcagcgcag gggcgcccgg ttctttttgt 5040 caagaccgac ctgtccggtg ccctgaatga actgcaggac gaggcagcgc ggctatcgtg 5100 gctggccacg acgggcgttc cttgcgcagc tgtgctcgac gttgtcactg aagcgggaag 5160 ggactggctg ctattgggcg aagtgccggg gcaggatctc ctgtcatctc accttgctcc 5220 tgccgagaaa gtatccatca tggctgatgc aatgcggcgg ctgcatacgc ttgatccggc 5280 tacctgccca ttcgaccacc aagcgaaaca tcgcatcgag cgagcacgta ctcggatgga 5340 agccggtctt gtcgatcagg atgatctgga cgaagagcat caggggctcg cgccagccga 5400 actgttcgcc aggctcaagg cgcgcatgcc cgacggcgag gatctcgtcg tgacccatgg 5460 cgatgcctgc ttgccgaata tcatggtgga aaatggccgc ttttctggat tcatcgactg 5520 tggccggctg ggtgtggcgg accgctatca ggacatagcg ttggctaccc gtgatattgc 5580 tgaagagctt ggcggcgaat gggctgaccg cttcctcgtg ctttacggta tcgccgctcc 5640 cgattcgcag cgcatcgcct tctatcgcct tcttgacgag ttcttctgag cgggactctg 5700 gggttcgaaa tgaccgacca agcgacgccc aacctgccat cacgagattt cgattccacc 5760 gccgccttct atgaaaggtt gggcttcgga atcgttttcc gggacgccgg ctggatgatc 5820 ctccagcgcg gggatctcat gctggagttc ttcgcccacc ccagcttcaa aagcgctctg 5880 aagttcctat actttctaga gaataggaac ttcggaatag gaactaagga ggatattcat 5940 atggaccatg ggattcacaa ggccattgac gcatcgcccg gttagtttta 5990 <210> 2 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 2 taaaaagctt gactcctgtt gatagatcca gtaa 34 <210> 3 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 3 aaaacatgta ttctcaccaa taaaaaacgc c 31 <210> 4 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 4 aagggcccgc cacgttgtgt gtctc 25 <210> 5 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 5 aaagctagcg atatcgccgt cccgtcaagt c 31 <210> 6 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 6 aaagctagcg ggaataaggg cgacacgg 28 <210> 7 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 7 aaagggccca cgtgagtttt cgttccactg 30 <210> 8 <211> 39 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 8 caatggtcag aaattggtta attggttgta acactggca 39 <210> 9 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 9 gggcccacgt gagttttcgt tcc 23 <210> 10 <211> 31 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 10 caattggcca cgttgtgtgt ctcaaaatct c 31 <210> 11 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 11 gggcccgata tcgccgtccc gtcaagtc 28 <210> 12 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 12 aaagggcccg caaccgacga cagtcctgc 29 <210> 13 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 13 aaagggcccc ggtggacaaa ggttaaaac 29 <210> 14 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 14 aaagctagcg acaccatcga atggcgc 27 <210> 15 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 15 aaagctagct cactgcccgc tttcc 25 <210> 16 <211> 33 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 16 aaacaattgg aaattaatac gactcactat agg 33 <210> 17 <211> 40 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 17 aaagaattct ctccttctta aagttaaaca aaattatttc 40 <210> 18 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 18 acggctacac tagaaggaca gtatttg 27 <210> 19 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 19 agttaggcca ccacttcaag 20 <210> 20 <211> 6357 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression vector <400> 20 gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120 ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180 agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240 gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggccgggc 960 ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020 tggcagagaa tcatgagtga cagccagacg ctggtggtaa aactcggcac cagtgtgcta 1080 acaggcggat cgcgccgtct gaaccgtgcc catatcgttg aacttgttcg ccagtgcgcg 1140 cagttacatg ccgccgggca tcggattgtt attgtgacgt cgggcgcgat cgccgccgga 1200 cgtgagcacc tgggttaccc ggaactgcca gcgaccatcg cctcgaaaca actgctggcg 1260 gcggtagggc agagtcgact gattcaactg tgggaacagc tgttttcgat ttatggcatt 1320 cacgtcgggc aaatgctgct gacccgtgct gatatggaag accgtgaacg cttcctgaac 1380 gcccgcgaca ccctgcgagc gttgctcgat aacaatatcg ttccggtaat caatgagaac 1440 gatgctgtcg ctacggcaga gattaaggtc ggcgataacg ataacctttc tgcgctggcg 1500 gcgattcttg cgggtgccga taaactgttg ctgctgaccg atcaaaaagg tttgtatacc 1560 gctgacccgc gcagcaatcc gcaggcagaa ctgattaaag atgtttacgg cattgatgac 1620 gcactgcgcg cgattgccgg tgacagcgtt tcaggcctcg gaactggcgg catgagtacc 1680 aaattgcagg ccgctgacgt ggcttgccgt gcgggtatcg acaccattat tgccgcgggc 1740 agcaagccgg gcgttattgg tgatgtgatg gaaggcattt ccgtcggtac gctgttccat 1800 gcccaggcga ctccgcttga aaaccgtaaa cgctggattt tcggtgcgcc gccggcgggt 1860 gaaatcacgg tagatgaagg ggcaactgcc gccattctgg aacgcggcag ctccctgttg 1920 ccgaaaggca ttaaaagcgt gactggcaat ttctcgcgtg gtgaagtcat ccgcatttgc 1980 aacctcgaag gccgcgatat cgcccacggc gtcagtcgtt acaacagcga tgcattacgc 2040 cgtattgccg gacaccactc gcaagaaatt gatgcaatac tgggatatga atacggcccg 2100 gttgccgttc accgtgatga catgattacc cgttaaggag caggctgatg ctggaacaaa 2160 tgggcattgc cgcgaagcaa gcctcgtata aattagcgca actctccagc cgcgaaaaaa 2220 atcgcgtgct ggaaaaaatc gccgatgaac tggaagcaca aagcgaaatc atcctcaacg 2280 ctaacgccca ggatgttgct gacgcgcgag ccaatggcct tagcgaagcg atgcttgacc 2340 gtctggcact gacgcccgca cggctgaaag gcattgccga cgatgtacgt caggtgtgca 2400 acctcgccga tccggtgggg caggtaatcg atggcggcgt actggacagc ggcctgcgtc 2460 ttgagcgtcg tcgcgtaccg ctgggggtta ttggcgtgat ttatgaagcg cgcccgaacg 2520 tgacggttga tgtcgcttcg ctgtgcctga aaaccggtaa tgcggtgatc ctgcgcggtg 2580 gcaaagaaac gtgtcgcact aacgctgcaa cggtggcggt gattcaggac gccctgaaat 2640 cctgcggctt accggcgggt gccgtgcagg cgattgataa tcctgaccgt gcgctggtca 2700 gtgaaatgct gcgtatggat aaatacatcg acatgctgat cccgcgtggt ggcgctggtt 2760 tgcataaact gtgccgtgaa cagtcgacaa tcccggtgat cacaggtggt ataggcgtat 2820 gccatattta cgttgatgaa agtgtagaga tcgctgaagc attaaaagtg atcgtcaacg 2880 cgaaaactca gcgtccgagc acatgtaata cggttgaaac gttgctggtg aataaaaaca 2940 tcgccgatag cttcctgccc gcattaagca aacaaatggc ggaaagcggc gtgacattac 3000 acgcagatgc agctgcactg gcgcagttgc aggcaggccc tgcgaaggtg gttgctgtta 3060 aagccgaaga gtatgacgat gagtttctgt cattagattt gaacgtcaaa atcgtcagcg 3120 atcttgacga tgccatcgcc catattcgtg aacacggcac acaacactcc gatgcgatcc 3180 tgacccgcga tatgcgcaac gcccagcgtt ttgttaacga agtggattcg tccgctgttt 3240 acgttaacgc ctctacgcgt tttaccgacg gcggccagtt tggtctgggt gcggaagtgg 3300 cggtaagcac acaaaaactc cacgcgcgtg gcccaatggg gctggaagca ctgaccactt 3360 acaagtggat cggcattggt gattacacca ttcgtgcgta aataaaaccg ggtgatgcaa 3420 aagtagccat ttgattcaca aggccattga cgcatcgccc ggttagtttt aaccttgtcc 3480 accggggccc gatatcgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc 3540 aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca 3600 tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 3660 caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc 3720 caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat 3780 caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga 3840 cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt 3900 tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat 3960 tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt 4020 cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg 4080 tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa 4140 attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt 4200 tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg 4260 cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt 4320 tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc 4380 ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt 4440 gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca cacaacgtgg ccaattgtca gaattggtta 4500 attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcgat atcgctagcg 4560 acaccatcga atggcgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc 4620 aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg 4680 tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc 4740 gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac 4800 aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg 4860 cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg 4920 tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc 4980 tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg 5040 ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac 5100 ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg 5160 tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc 5220 gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg 5280 aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg 5340 agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc 5400 gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg 5460 ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc 5520 tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg 5580 gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc 5640 aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 5700 gactggaaag cgggcagtga gctagcggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 5760 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 5820 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 5880 aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 5940 cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 6000 atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 6060 cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 6120 gagcagattg tactgagagt gcaccatatg cggtgtgaaa taccgcacag atgcgtaagg 6180 agaaaatacc gcatcaggcg ccattcgcca ttcaggctgc gcaactgttg ggaagggcga 6240 tcggtgcggg cctcttcgct attacgccag ctggcgaaag ggggatgtgc tgcaaggcga 6300 ttaagttggg taacgccagg gttttcccag tcacgacgtt gtaaaacgac ggccagt 6357 <210> 21 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 21 aaacatatgg tgaaaccatg aaaaatggca gc 32 <210> 22 <211> 28 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 22 aaacatatgc tcgatggcta cgagggca 28 <210> 23 <211> 6604 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression vector <400> 23 gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120 ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180 agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240 gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggccgggc 960 ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020 tggcagagaa tcatgagtga cagccagacg ctggtggtaa aactcggcac cagtgtgcta 1080 acaggcggat cgcgccgtct gaaccgtgcc catatcgttg aacttgttcg ccagtgcgcg 1140 cagttacatg ccgccgggca tcggattgtt attgtgacgt cgggcgcgat cgccgccgga 1200 cgtgagcacc tgggttaccc ggaactgcca gcgaccatcg cctcgaaaca actgctggcg 1260 gcggtagggc agagtcgact gattcaactg tgggaacagc tgttttcgat ttatggcatt 1320 cacgtcgggc aaatgctgct gacccgtgct gatatggaag accgtgaacg cttcctgaac 1380 gcccgcgaca ccctgcgagc gttgctcgat aacaatatcg ttccggtaat caatgagaac 1440 gatgctgtcg ctacggcaga gattaaggtc ggcgataacg ataacctttc tgcgctggcg 1500 gcgattcttg cgggtgccga taaactgttg ctgctgaccg atcaaaaagg tttgtatacc 1560 gctgacccgc gcagcaatcc gcaggcagaa ctgattaaag atgtttacgg cattgatgac 1620 gcactgcgcg cgattgccgg tgacagcgtt tcaggcctcg gaactggcgg catgagtacc 1680 aaattgcagg ccgctgacgt ggcttgccgt gcgggtatcg acaccattat tgccgcgggc 1740 agcaagccgg gcgttattgg tgatgtgatg gaaggcattt ccgtcggtac gctgttccat 1800 gcccaggcga ctccgcttga aaaccgtaaa cgctggattt tcggtgcgcc gccggcgggt 1860 gaaatcacgg tagatgaagg ggcaactgcc gccattctgg aacgcggcag ctccctgttg 1920 ccgaaaggca ttaaaagcgt gactggcaat ttctcgcgtg gtgaagtcat ccgcatttgc 1980 aacctcgaag gccgcgatat cgcccacggc gtcagtcgtt acaacagcga tgcattacgc 2040 cgtattgccg gacaccactc gcaagaaatt gatgcaatac tgggatatga atacggcccg 2100 gttgccgttc accgtgatga catgattacc cgttaaggag caggctgatg ctggaacaaa 2160 tgggcattgc cgcgaagcaa gcctcgtata aattagcgca actctccagc cgcgaaaaaa 2220 atcgcgtgct ggaaaaaatc gccgatgaac tggaagcaca aagcgaaatc atcctcaacg 2280 ctaacgccca ggatgttgct gacgcgcgag ccaatggcct tagcgaagcg atgcttgacc 2340 gtctggcact gacgcccgca cggctgaaag gcattgccga cgatgtacgt caggtgtgca 2400 acctcgccga tccggtgggg caggtaatcg atggcggcgt actggacagc ggcctgcgtc 2460 ttgagcgtcg tcgcgtaccg ctgggggtta ttggcgtgat ttatgaagcg cgcccgaacg 2520 tgacggttga tgtcgcttcg ctgtgcctga aaaccggtaa tgcggtgatc ctgcgcggtg 2580 gcaaagaaac gtgtcgcact aacgctgcaa cggtggcggt gattcaggac gccctgaaat 2640 cctgcggctt accggcgggt gccgtgcagg cgattgataa tcctgaccgt gcgctggtca 2700 gtgaaatgct gcgtatggat aaatacatcg acatgctgat cccgcgtggt ggcgctggtt 2760 tgcataaact gtgccgtgaa cagtcgacaa tcccggtgat cacaggtggt ataggcgtat 2820 gccatattta cgttgatgaa agtgtagaga tcgctgaagc attaaaagtg atcgtcaacg 2880 cgaaaactca gcgtccgagc acatgtaata cggttgaaac gttgctggtg aataaaaaca 2940 tcgccgatag cttcctgccc gcattaagca aacaaatggc ggaaagcggc gtgacattac 3000 acgcagatgc agctgcactg gcgcagttgc aggcaggccc tgcgaaggtg gttgctgtta 3060 aagccgaaga gtatgacgat gagtttctgt cattagattt gaacgtcaaa atcgtcagcg 3120 atcttgacga tgccatcgcc catattcgtg aacacggcac acaacactcc gatgcgatcc 3180 tgacccgcga tatgcgcaac gcccagcgtt ttgttaacga agtggattcg tccgctgttt 3240 acgttaacgc ctctacgcgt tttaccgacg gcggccagtt tggtctgggt gcggaagtgg 3300 cggtaagcac acaaaaactc cacgcgcgtg gcccaatggg gctggaagca ctgaccactt 3360 acaagtggat cggcattggt gattacacca ttcgtgcgta aataaaaccg ggtgatgcaa 3420 aagtagccat ttgattcaca aggccattga cgcatcgccc ggttagtttt aaccttgtcc 3480 accggggccc gatatcgccg tcccgtcaag tcagcgtaat gctctgccag tgttacaacc 3540 aattaaccaa ttctgattag aaaaactcat cgagcatcaa atgaaactgc aatttattca 3600 tatcaggatt atcaatacca tatttttgaa aaagccgttt ctgtaatgaa ggagaaaact 3660 caccgaggca gttccatagg atggcaagat cctggtatcg gtctgcgatt ccgactcgtc 3720 caacatcaat acaacctatt aatttcccct cgtcaaaaat aaggttatca agtgagaaat 3780 caccatgagt gacgactgaa tccggtgaga atggcaaaag cttatgcatt tctttccaga 3840 cttgttcaac aggccagcca ttacgctcgt catcaaaatc actcgcatca accaaaccgt 3900 tattcattcg tgattgcgcc tgagcgagac gaaatacgcg atcgctgtta aaaggacaat 3960 tacaaacagg aatcgaatgc aaccggcgca ggaacactgc cagcgcatca acaatatttt 4020 cacctgaatc aggatattct tctaatacct ggaatgctgt tttcccgggg atcgcagtgg 4080 tgagtaacca tgcatcatca ggagtacgga taaaatgctt gatggtcgga agaggcataa 4140 attccgtcag ccagtttagt ctgaccatct catctgtaac atcattggca acgctacctt 4200 tgccatgttt cagaaacaac tctggcgcat cgggcttccc atacaatcga tagattgtcg 4260 cacctgattg cccgacatta tcgcgagccc atttataccc atataaatca gcatccatgt 4320 tggaatttaa tcgcggcctc gagcaagacg tttcccgttg aatatggctc ataacacccc 4380 ttgtattact gtttatgtaa gcagacagtt ttattgttca tgatgatata tttttatctt 4440 gtgcaatgta acatcagaga ttttgagaca cacaacgtgg ccaattgtca gaattggtta 4500 attggttgta acactggcag agcattacgc tgacttgacg ggacggcgat atcgctagcg 4560 acaccatcga atggcgcaaa acctttcgcg gtatggcatg atagcgcccg gaagagagtc 4620 aattcagggt ggtgaatgtg aaaccagtaa cgttatacga tgtcgcagag tatgccggtg 4680 tctcttatca gaccgtttcc cgcgtggtga accaggccag ccacgtttct gcgaaaacgc 4740 gggaaaaagt ggaagcggcg atggcggagc tgaattacat tcccaaccgc gtggcacaac 4800 aactggcggg caaacagtcg ttgctgattg gcgttgccac ctccagtctg gccctgcacg 4860 cgccgtcgca aattgtcgcg gcgattaaat ctcgcgccga tcaactgggt gccagcgtgg 4920 tggtgtcgat ggtagaacga agcggcgtcg aagcctgtaa agcggcggtg cacaatcttc 4980 tcgcgcaacg cgtcagtggg ctgatcatta actatccgct ggatgaccag gatgccattg 5040 ctgtggaagc tgcctgcact aatgttccgg cgttatttct tgatgtctct gaccagacac 5100 ccatcaacag tattattttc tcccatgaag acggtacgcg actgggcgtg gagcatctgg 5160 tcgcattggg tcaccagcaa atcgcgctgt tagcgggccc attaagttct gtctcggcgc 5220 gtctgcgtct ggctggctgg cataaatatc tcactcgcaa tcaaattcag ccgatagcgg 5280 aacgggaagg cgactggagt gccatgtccg gttttcaaca aaccatgcaa atgctgaatg 5340 agggcatcgt tcccactgcg atgctggttg ccaacgatca gatggcgctg ggcgcaatgc 5400 gcgccattac cgagtccggg ctgcgcgttg gtgcggatat ctcggtagtg ggatacgacg 5460 ataccgaaga cagctcatgt tatatcccgc cgttaaccac catcaaacag gattttcgcc 5520 tgctggggca aaccagcgtg gaccgcttgc tgcaactctc tcagggccag gcggtgaagg 5580 gcaatcagct gttgcccgtc tcactggtga aaagaaaaac caccctggcg cccaatacgc 5640 aaaccgcctc tccccgcgcg ttggccgatt cattaatgca gctggcacga caggtttccc 5700 gactggaaag cgggcagtga gctagcggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc 5760 atactcttcc tttttcaata ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgagcgga 5820 tacatatttg aatgtattta gaaaaataaa caaatagggg ttccgcgcac atttccccga 5880 aaagtgccac ctgacgtcta agaaaccatt attatcatga cattaaccta taaaaatagg 5940 cgtatcacga ggccctttcg tctcgcgcgt ttcggtgatg acggtgaaaa cctctgacac 6000 atgcagctcc cggagacggt cacagcttgt ctgtaagcgg atgccgggag cagacaagcc 6060 cgtcagggcg cgtcagcggg tgttggcggg tgtcggggct ggcttaacta tgcggcatca 6120 gagcagattg tactgagagt gcaccatatg ctcgatggct acgagggcag acagtaagtg 6180 gatttaccat aatcccttaa ttgtacgcac cgctaaaacg cgttcagcgc gatcacggca 6240 gcagacaggt aaaaatggca acaaaccacc cgaaaaactg ccgcgatcgc gcctgataaa 6300 ttttaaccgt atgaatacct atgcaaccag agggtacagg ccacattacc cccacttaat 6360 ccactgaagc tgccattttt catggtttca ccatatgcgg tgtgaaatac cgcacagatg 6420 cgtaaggaga aaataccgca tcaggcgcca ttcgccattc aggctgcgca actgttggga 6480 agggcgatcg gtgcgggcct cttcgctatt acgccagctg gcgaaagggg gatgtgctgc 6540 aaggcgatta agttgggtaa cgccagggtt ttcccagtca cgacgttgta aaacgacggc 6600 cagt 6604 <210> 24 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 24 aaaccatggg atatcgctag cgacaccatc 30 <210> 25 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 25 actagtcggt ggacaaggtt aaaactaacc 30 <210> 26 <211> 34 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 26 aaaccatggt ctcatgtttg acagcttatc atcg 34 <210> 27 <211> 29 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 27 aaaactagtc tgtcagacca agtttactc 29 <210> 28 <211> 27 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 28 ccatgggata tcgctagcga caccatc 27 <210> 29 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 29 tctcatgttt gacagcttat catcg 25 <210> 30 <211> 6920 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression vector <400> 30 gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120 ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180 agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240 gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggccgggc 960 ccgcaaccga cgacagtcct gctaaaacgt tcgtttgata tcatttttcc taaaattgaa 1020 tggcagagaa tcatgagtga cagccagacg ctggtggtaa aactcggcac cagtgtgcta 1080 acaggcggat cgcgccgtct gaaccgtgcc catatcgttg aacttgttcg ccagtgcgcg 1140 cagttacatg ccgccgggca tcggattgtt attgtgacgt cgggcgcgat cgccgccgga 1200 cgtgagcacc tgggttaccc ggaactgcca gcgaccatcg cctcgaaaca actgctggcg 1260 gcggtagggc agagtcgact gattcaactg tgggaacagc tgttttcgat ttatggcatt 1320 cacgtcgggc aaatgctgct gacccgtgct gatatggaag accgtgaacg cttcctgaac 1380 gcccgcgaca ccctgcgagc gttgctcgat aacaatatcg ttccggtaat caatgagaac 1440 gatgctgtcg ctacggcaga gattaaggtc ggcgataacg ataacctttc tgcgctggcg 1500 gcgattcttg cgggtgccga taaactgttg ctgctgaccg atcaaaaagg tttgtatacc 1560 gctgacccgc gcagcaatcc gcaggcagaa ctgattaaag atgtttacgg cattgatgac 1620 gcactgcgcg cgattgccgg tgacagcgtt tcaggcctcg gaactggcgg catgagtacc 1680 aaattgcagg ccgctgacgt ggcttgccgt gcgggtatcg acaccattat tgccgcgggc 1740 agcaagccgg gcgttattgg tgatgtgatg gaaggcattt ccgtcggtac gctgttccat 1800 gcccaggcga ctccgcttga aaaccgtaaa cgctggattt tcggtgcgcc gccggcgggt 1860 gaaatcacgg tagatgaagg ggcaactgcc gccattctgg aacgcggcag ctccctgttg 1920 ccgaaaggca ttaaaagcgt gactggcaat ttctcgcgtg gtgaagtcat ccgcatttgc 1980 aacctcgaag gccgcgatat cgcccacggc gtcagtcgtt acaacagcga tgcattacgc 2040 cgtattgccg gacaccactc gcaagaaatt gatgcaatac tgggatatga atacggcccg 2100 gttgccgttc accgtgatga catgattacc cgttaaggag caggctgatg ctggaacaaa 2160 tgggcattgc cgcgaagcaa gcctcgtata aattagcgca actctccagc cgcgaaaaaa 2220 atcgcgtgct ggaaaaaatc gccgatgaac tggaagcaca aagcgaaatc atcctcaacg 2280 ctaacgccca ggatgttgct gacgcgcgag ccaatggcct tagcgaagcg atgcttgacc 2340 gtctggcact gacgcccgca cggctgaaag gcattgccga cgatgtacgt caggtgtgca 2400 acctcgccga tccggtgggg caggtaatcg atggcggcgt actggacagc ggcctgcgtc 2460 ttgagcgtcg tcgcgtaccg ctgggggtta ttggcgtgat ttatgaagcg cgcccgaacg 2520 tgacggttga tgtcgcttcg ctgtgcctga aaaccggtaa tgcggtgatc ctgcgcggtg 2580 gcaaagaaac gtgtcgcact aacgctgcaa cggtggcggt gattcaggac gccctgaaat 2640 cctgcggctt accggcgggt gccgtgcagg cgattgataa tcctgaccgt gcgctggtca 2700 gtgaaatgct gcgtatggat aaatacatcg acatgctgat cccgcgtggt ggcgctggtt 2760 tgcataaact gtgccgtgaa cagtcgacaa tcccggtgat cacaggtggt ataggcgtat 2820 gccatattta cgttgatgaa agtgtagaga tcgctgaagc attaaaagtg atcgtcaacg 2880 cgaaaactca gcgtccgagc acatgtaata cggttgaaac gttgctggtg aataaaaaca 2940 tcgccgatag cttcctgccc gcattaagca aacaaatggc ggaaagcggc gtgacattac 3000 acgcagatgc agctgcactg gcgcagttgc aggcaggccc tgcgaaggtg gttgctgtta 3060 aagccgaaga gtatgacgat gagtttctgt cattagattt gaacgtcaaa atcgtcagcg 3120 atcttgacga tgccatcgcc catattcgtg aacacggcac acaacactcc gatgcgatcc 3180 tgacccgcga tatgcgcaac gcccagcgtt ttgttaacga agtggattcg tccgctgttt 3240 acgttaacgc ctctacgcgt tttaccgacg gcggccagtt tggtctgggt gcggaagtgg 3300 cggtaagcac acaaaaactc cacgcgcgtg gcccaatggg gctggaagca ctgaccactt 3360 acaagtggat cggcattggt gattacacca ttcgtgcgta aataaaaccg ggtgatgcaa 3420 aagtagccat ttgattcaca aggccattga cgcatcgccc ggttagtttt aaccttgtcc 3480 accgactagt gttggtttgc gcattcacag ttctccgcaa gaattgattg gctccaattc 3540 ttggagtggt gaatccgtta gcgaggtgcc gccggcttcc attcaggtcg aggtggcccg 3600 gctccatgca ccgcgacgca acgcggggag gcagacaagg tatagggcgg cgcctacaat 3660 ccatgccaac ccgttccatg tgctcgccga ggcggcataa atcgccgtga cgatcagcgg 3720 tccaatgatc gaagttaggc tggtaagagc cgcgagcgat ccttgaagct gtccctgatg 3780 gtcgtcatct acctgcctgg acagcatggc ctgcaacgcg ggcatcccga tgccgccgga 3840 agcgagaaga atcataatgg ggaaggccat ccagcctcgc gtcgcgaacg ccagcaagac 3900 gtagcccagc gcgtcggccg ccatgccggc gataatggcc tgcttctcgc cgaaacgttt 3960 ggtggcggga ccagtgacga aggcttgagc gagggcgtgc aagattccga ataccgcaag 4020 cgacaggccg atcatcgtcg cgctccagcg aaagcggtcc tcgccgaaaa tgacccagag 4080 cgctgccggc acctgtccta cgagttgcat gataaagaag acagtcataa gtgcggcgac 4140 gatagtcatg ccccgcgccc accggaagga gctgactggg ttgaaggctc tcaagggcat 4200 cggtcgacgc tctcccttat gcgactcctg cattaggaag cagcccagta gtaggttgag 4260 gccgttgagc accgccgccg caaggaatgg tgcatgcaag gagatggcgc ccaacagtcc 4320 cccggccacg gggcctgcca ccatacccac gccgaaacaa gcgctcatga gcccgaagtg 4380 gcgagcccga tcttccccat cggtgatgtc ggcgatatag gcgccagcaa ccgcacctgt 4440 ggcgccggtg atgccggcca cgatgcgtcc ggcgtagagg atccacagga cgggtgtggt 4500 cgccatgatc gcgtagtcga tagtggctcc aagtagcgaa gcgagcagga ctgggcggcg 4560 gccaaagcgg tcggacagtg ctccgagaac gggtgcgcat agaaattgca tcaacgcata 4620 tagcgctagc agcacgccat agtgactggc gatgctgtcg gaatggacga tatcccgcaa 4680 gaggcccggc agtaccggca taaccaagcc tatgcctaca gcatccaggg tgacggtgcc 4740 gaggatgacg atgagcgcat tgttagattt catacacggt gcctgactgc gttagcaatt 4800 taactgtgat aaactaccgc attaaagctt atcgatgata agctgtcaaa catgagacca 4860 tgggatatcg ctagcgacac catcgaatgg cgcaaaacct ttcgcggtat ggcatgatag 4920 cgcccggaag agagtcaatt cagggtggtg aatgtgaaac cagtaacgtt atacgatgtc 4980 gcagagtatg ccggtgtctc ttatcagacc gtttcccgcg tggtgaacca ggccagccac 5040 gtttctgcga aaacgcggga aaaagtggaa gcggcgatgg cggagctgaa ttacattccc 5100 aaccgcgtgg cacaacaact ggcgggcaaa cagtcgttgc tgattggcgt tgccacctcc 5160 agtctggccc tgcacgcgcc gtcgcaaatt gtcgcggcga ttaaatctcg cgccgatcaa 5220 ctgggtgcca gcgtggtggt gtcgatggta gaacgaagcg gcgtcgaagc ctgtaaagcg 5280 gcggtgcaca atcttctcgc gcaacgcgtc agtgggctga tcattaacta tccgctggat 5340 gaccaggatg ccattgctgt ggaagctgcc tgcactaatg ttccggcgtt atttcttgat 5400 gtctctgacc agacacccat caacagtatt attttctccc atgaagacgg tacgcgactg 5460 ggcgtggagc atctggtcgc attgggtcac cagcaaatcg cgctgttagc gggcccatta 5520 agttctgtct cggcgcgtct gcgtctggct ggctggcata aatatctcac tcgcaatcaa 5580 attcagccga tagcggaacg ggaaggcgac tggagtgcca tgtccggttt tcaacaaacc 5640 atgcaaatgc tgaatgaggg catcgttccc actgcgatgc tggttgccaa cgatcagatg 5700 gcgctgggcg caatgcgcgc cattaccgag tccgggctgc gcgttggtgc ggatatctcg 5760 gtagtgggat acgacgatac cgaagacagc tcatgttata tcccgccgtt aaccaccatc 5820 aaacaggatt ttcgcctgct ggggcaaacc agcgtggacc gcttgctgca actctctcag 5880 ggccaggcgg tgaagggcaa tcagctgttg cccgtctcac tggtgaaaag aaaaaccacc 5940 ctggcgccca atacgcaaac cgcctctccc cgcgcgttgg ccgattcatt aatgcagctg 6000 gcacgacagg tttcccgact ggaaagcggg cagtgagcta gcgggaataa gggcgacacg 6060 gaaatgttga atactcatac tcttcctttt tcaatattat tgaagcattt atcagggtta 6120 ttgtctcatg agcggataca tatttgaatg tatttagaaa aataaacaaa taggggttcc 6180 gcgcacattt ccccgaaaag tgccacctga cgtctaagaa accattatta tcatgacatt 6240 aacctataaa aataggcgta tcacgaggcc ctttcgtctc gcgcgtttcg gtgatgacgg 6300 tgaaaacctc tgacacatgc agctcccgga gacggtcaca gcttgtctgt aagcggatgc 6360 cgggagcaga caagcccgtc agggcgcgtc agcgggtgtt ggcgggtgtc ggggctggct 6420 taactatgcg gcatcagagc agattgtact gagagtgcac catatgctcg atggctacga 6480 gggcagacag taagtggatt taccataatc ccttaattgt acgcaccgct aaaacgcgtt 6540 cagcgcgatc acggcagcag acaggtaaaa atggcaacaa accacccgaa aaactgcgcc 6600 gatcgcgcct gataaatttt aaccgtatga atacctatgc aaccagaggg tacaggccac 6660 attaccccca cttaatccac tgaagctgcc atttttcatg gtttcaccat atgcggtgtg 6720 aaataccgca cagatgcgta aggagaaaat accgcatcag gcgccattcg ccattcaggc 6780 tgcgcaactg ttgggaaggg cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga 6840 aagggggatg tgctgcaagg cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac 6900 gttgtaaaac gacggccagt 6920 <210> 31 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 31 acgtgagttt tcgttccact gagcg 25 <210> 32 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 32 gggcccgata tcgccgtccc 20 <210> 33 <211> 4071 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Expression vector <400> 33 gaattggaaa ttaatacgac tcactatagg ggaattgtga gcggataaca attcccctct 60 agaaataatt ttgtttaact ttaagaagga gagaattcga gctcggtacc cggggatcct 120 ctagagtcga cctgcaggca tgcaagcttg actcctgttg atagatccag taatgacctc 180 agaactccat ctggatttgt tcagaacgct cggttgccgc cgggcgtttt ttattggtga 240 gaatacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg 300 gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag 360 aggtggcgaa acccgacagg actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc 420 gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg 480 ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt 540 cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc 600 ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc 660 actggtaaca ggattagcag agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg 720 tggcctaact acggctacac tagaaggaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca 780 gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc 840 ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat 900 cctttgatct tttctacggg gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg tgggcccgat 960 atcgccgtcc cgtcaagtca gcgtaatgct ctgccagtgt tacaaccaat taaccaattc 1020 tgattagaaa aactcatcga gcatcaaatg aaactgcaat ttattcatat caggattatc 1080 aataccatat ttttgaaaaa gccgtttctg taatgaagga gaaaactcac cgaggcagtt 1140 ccataggatg gcaagatcct ggtatcggtc tgcgattccg actcgtccaa catcaataca 1200 acctattaat ttcccctcgt caaaaataag gttatcaagt gagaaatcac catgagtgac 1260 gactgaatcc ggtgagaatg gcaaaagctt atgcatttct ttccagactt gttcaacagg 1320 ccagccatta cgctcgtcat caaaatcact cgcatcaacc aaaccgttat tcattcgtga 1380 ttgcgcctga gcgagacgaa atacgcgatc gctgttaaaa ggacaattac aaacaggaat 1440 cgaatgcaac cggcgcagga acactgccag cgcatcaaca atattttcac ctgaatcagg 1500 atattcttct aatacctgga atgctgtttt cccggggatc gcagtggtga gtaaccatgc 1560 atcatcagga gtacggataa aatgcttgat ggtcggaaga ggcataaatt ccgtcagcca 1620 gtttagtctg accatctcat ctgtaacatc attggcaacg ctacctttgc catgtttcag 1680 aaacaactct ggcgcatcgg gcttcccata caatcgatag attgtcgcac ctgattgccc 1740 gacattatcg cgagcccatt tatacccata taaatcagca tccatgttgg aatttaatcg 1800 cggcctcgag caagacgttt cccgttgaat atggctcata acaccccttg tattactgtt 1860 tatgtaagca gacagtttta ttgttcatga tgatatattt ttatcttgtg caatgtaaca 1920 tcagagattt tgagacacac aacgtggcca attgtcagaa ttggttaatt ggttgtaaca 1980 ctggcagagc attacgctga cttgacggga cggcgatatc gctagcgaca ccatcgaatg 2040 gcgcaaaacc tttcgcggta tggcatgata gcgcccggaa gagagtcaat tcagggtggt 2100 gaatgtgaaa ccagtaacgt tatacgatgt cgcagagtat gccggtgtct cttatcagac 2160 cgtttcccgc gtggtgaacc aggccagcca cgtttctgcg aaaacgcggg aaaaagtgga 2220 agcggcgatg gcggagctga attacattcc caaccgcgtg gcacaacaac tggcgggcaa 2280 acagtcgttg ctgattggcg ttgccacctc cagtctggcc ctgcacgcgc cgtcgcaaat 2340 tgtcgcggcg attaaatctc gcgccgatca actgggtgcc agcgtggtgg tgtcgatggt 2400 agaacgaagc ggcgtcgaag cctgtaaagc ggcggtgcac aatcttctcg cgcaacgcgt 2460 cagtgggctg atcattaact atccgctgga tgaccaggat gccattgctg tggaagctgc 2520 ctgcactaat gttccggcgt tatttcttga tgtctctgac cagacaccca tcaacagtat 2580 tattttctcc catgaagacg gtacgcgact gggcgtggag catctggtcg cattgggtca 2640 ccagcaaatc gcgctgttag cgggcccatt aagttctgtc tcggcgcgtc tgcgtctggc 2700 tggctggcat aaatatctca ctcgcaatca aattcagccg atagcggaac gggaaggcga 2760 ctggagtgcc atgtccggtt ttcaacaaac catgcaaatg ctgaatgagg gcatcgttcc 2820 cactgcgatg ctggttgcca acgatcagat ggcgctgggc gcaatgcgcg ccattaccga 2880 gtccgggctg cgcgttggtg cggatatctc ggtagtggga tacgacgata ccgaagacag 2940 ctcatgttat atcccgccgt taaccaccat caaacaggat tttcgcctgc tggggcaaac 3000 cagcgtggac cgcttgctgc aactctctca gggccaggcg gtgaagggca atcagctgtt 3060 gcccgtctca ctggtgaaaa gaaaaaccac cctggcgccc aatacgcaaa ccgcctctcc 3120 ccgcgcgttg gccgattcat taatgcagct ggcacgacag gtttcccgac tggaaagcgg 3180 gcagtgagct agcgggaata agggcgacac ggaaatgttg aatactcata ctcttccttt 3240 ttcaatatta ttgaagcatt tatcagggtt attgtctcat gagcggatac atatttgaat 3300 gtatttagaa aaataaacaa ataggggttc cgcgcacatt tccccgaaaa gtgccacctg 3360 acgtctaaga aaccattatt atcatgacat taacctataa aaataggcgt atcacgaggc 3420 cctttcgtct cgcgcgtttc ggtgatgacg gtgaaaacct ctgacacatg cagctcccgg 3480 agacggtcac agcttgtctg taagcggatg ccgggagcag acaagcccgt cagggcgcgt 3540 cagcgggtgt tggcgggtgt cggggctggc ttaactatgc ggcatcagag cagattgtac 3600 tgagagtgca ccatatgctc gatggctacg agggcagaca gtaagtggat ttaccataat 3660 cccttaattg tacgcaccgc taaaacgcgt tcagcgcgat cacggcagca gacaggtaaa 3720 aatggcaaca aaccacccga aaaactgccg cgatcgcgcc tgataaattt taaccgtatg 3780 aatacctatg caaccagagg gtacaggcca cattaccccc acttaatcca ctgaagctgc 3840 catttttcat ggtttcacca tatgcggtgt gaaataccgc acagatgcgt aaggagaaaa 3900 taccgcatca ggcgccattc gccattcagg ctgcgcaact gttgggaagg gcgatcggtg 3960 cgggcctctt cgctattacg ccagctggcg aaagggggat gtgctgcaag gcgattaagt 4020 tgggtaacgc cagggttttc ccagtcacga cgttgtaaaa cgacggccag t 4071 <210> 34 <211> 50 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 34 aaaggatcca aactcgagag gtacgattta ctaactggaa gaggcactaa 50 <210> 35 <211> 26 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 35 aaaaagcttt acgcgaacgc gaagtc 26 <210> 36 <211> 66 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 36 aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60 tggcgc 66 <210> 37 <211> 77 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 37 aaactcgagt tcctgtgtga aattgttatc cgctcacaat tccacacatt atacgagccg 60 tcactgcccg ctttcca 77 <210> 38 <211> 30 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 38 aaaaagcttg cgattgtgta ggctggagct 30 <210> 39 <211> 72 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 39 aaaaagcttt aaaactaacc gggcgatgcg tcaatggcct tgtgaatccc atggtccata 60 tgaatatcct cc 72 <210> 40 <211> 73 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 40 aattggatcc acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcctg acaccatcga 60 atggcgcaaa acc 73 <210> 41 <211> 32 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer <400> 41 aattcaattg agactcgtgc aactggtcag cg 32 <210> 42 <211> 9023 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DNA plasmid with T7 expression construct <400> 42 aaaggatcca cagtcctgct aaaacgttcg tttgatatca tttttcctga caccatcgaa 60 tggcgcaaaa cctttcgcgg tatggcatga tagcgcccgg aagagagtca attcagggtg 120 gtgaatgtga aaccagtaac gttatacgat gtcgcagagt atgccggtgt ctcttatcag 180 accgtttccc gcgtggtgaa ccaggccagc cacgtttctg cgaaaacgcg ggaaaaagtg 240 gaagcggcga tggcggagct gaattacatt cccaaccgcg tggcacaaca actggcgggc 300 aaacagtcgt tgctgattgg cgttgccacc tccagtctgg ccctgcacgc gccgtcgcaa 360 attgtcgcgg cgattaaatc tcgcgccgat caactgggtg ccagcgtggt ggtgtcgatg 420 gtagaacgaa gcggcgtcga agcctgtaaa gcggcggtgc acaatcttct cgcgcaacgc 480 gtcagtgggc tgatcattaa ctatccgctg gatgaccagg atgccattgc tgtggaagct 540 gcctgcacta atgttccggc gttatttctt gatgtctctg accagacacc catcaacagt 600 attattttct cccatgaaga cggtacgcga ctgggcgtgg agcatctggt cgcattgggt 660 caccagcaaa tcgcgctgtt agcgggccca ttaagttctg tctcggcgcg tctgcgtctg 720 gctggctggc ataaatatct cactcgcaat caaattcagc cgatagcgga acgggaaggc 780 gactggagtg ccatgtccgg ttttcaacaa accatgcaaa tgctgaatga gggcatcgtt 840 cccactgcga tgctggttgc caacgatcag atggcgctgg gcgcaatgcg cgccattacc 900 gagtccgggc tgcgcgttgg tgcggatatc tcggtagtgg gatacgacga taccgaagac 960 agctcatgtt atatcccgcc gttaaccacc atcaaacagg attttcgcct gctggggcaa 1020 accagcgtgg accgcttgct gcaactctct cagggccagg cggtgaaggg caatcagctg 1080 ttgcccgtct cactggtgaa aagaaaaacc accctggcgc ccaatacgca aaccgcctct 1140 ccccgcgcgt tggccgattc attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc 1200 gggcagtgag cgcaacgcaa ttaatgtaag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt 1260 acactttatg cttccggctc gtataatgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac 1320 aggaaacagc tatgaccatg attacggatt cactggccgt cgttttacaa cgtcgtgact 1380 gggaaaaccc tggcgttacc caacttaatc gccttgcagc acatccccct ttcgccagct 1440 ggcgtaatag cgaagaggcc cgcaccgatc gcccttccca acagttgcgc agcctgaatg 1500 gcgaatggcg ctttgcctgg tttccggcac cagaagcggt gccggaaagc tggctggagt 1560 gcgatcttcc tgaggccgat actgtcgtcg tcccctcaaa ctggcagatg cacggttacg 1620 atgcgcccat ctacaccaac gtgacctatc ccattacggt caatccgccg tttgttccca 1680 cggagaatcc gacgggttgt tactcgctca catttaatgt tgatgaaagc tggctacagg 1740 aaggccagac gcgaattatt tttgatggcg tcgggatctg atccggattt actaactgga 1800 agaggcacta aatgaacacg attaacatcg ctaagaacga cttctctgac atcgaactgg 1860 ctgctatccc gttcaacact ctggctgacc attacggtga gcgtttagct cgcgaacagt 1920 tggcccttga gcatgagtct tacgagatgg gtgaagcacg cttccgcaag atgtttgagc 1980 gtcaacttaa agctggtgag gttgcggata acgctgccgc caagcctctc atcactaccc 2040 tactccctaa gatgattgca cgcatcaacg actggtttga ggaagtgaaa gctaagcgcg 2100 gcaagcgccc gacagccttc cagttcctgc aagaaatcaa gccggaagcc gtagcgtaca 2160 tcaccattaa gaccactctg gcttgcctaa ccagtgctga caatacaacc gttcaggctg 2220 tagcaagcgc aatcggtcgg gccattgagg acgaggctcg cttcggtcgt atccgtgacc 2280 ttgaagctaa gcacttcaag aaaaacgttg aggaacaact caacaagcgc gtagggcacg 2340 tctacaagaa agcatttatg caagttgtcg aggctgacat gctctctaag ggtctactcg 2400 gtggcgaggc gtggtcttcg tggcataagg aagactctat tcatgtagga gtacgctgca 2460 tcgagatgct cattgagtca accggaatgg ttagcttaca ccgccaaaat gctggcgtag 2520 taggtcaaga ctctgagact atcgaactcg cacctgaata cgctgaggct atcgcaaccc 2580 gtgcaggtgc gctggctggc atctctccga tgttccaacc ttgcgtagtt cctcctaagc 2640 cgtggactgg cattactggt ggtggctatt gggctaacgg tcgtcgtcct ctggcgctgg 2700 tgcgtactca cagtaagaaa gcactgatgc gctacgaaga cgtttacatg cctgaggtgt 2760 acaaagcgat taacattgcg caaaacaccg catggaaaat caacaagaaa gtcctagcgg 2820 tcgccaacgt aatcaccaag tggaagcatt gtccggtcga ggacatccct gcgattgagc 2880 gtgaagaact cccgatgaaa ccggaagaca tcgacatgaa tcctgaggct ctcaccgcgt 2940 ggaaacgtgc tgccgctgct gtgtaccgca aggacaaggc tcgcaagtct cgccgtatca 3000 gccttgagtt catgcttgag caagccaata agtttgctaa ccataaggcc atctggttcc 3060 cttacaacat ggactggcgc ggtcgtgttt acgctgtgtc aatgttcaac ccgcaaggta 3120 acgatatgac caaaggactg cttacgctgg cgaaaggtaa accaatcggt aaggaaggtt 3180 actactggct gaaaatccac ggtgcaaact gtgcgggtgt cgataaggtt ccgttccctg 3240 agcgcatcaa gttcattgag gaaaaccacg agaacatcat ggcttgcgct aagtctccac 3300 tggagaacac ttggtgggct gagcaagatt ctccgttctg cttccttgcg ttctgctttg 3360 agtacgctgg ggtacagcac cacggcctga gctataactg ctcccttccg ctggcgtttg 3420 acgggtcttg ctctggcatc cagcacttct ccgcgatgct ccgagatgag gtaggtggtc 3480 gcgcggttaa cttgcttcct agtgaaaccg ttcaggacat ctacgggatt gttgctaaga 3540 aagtcaacga gattctacaa gcagacgcaa tcaatgggac cgataacgaa gtagttaccg 3600 tgaccgatga gaacactggt gaaatctctg agaaagtcaa gctgggcact aaggcactgg 3660 ctggtcaatg gctggcttac ggtgttactc gcagtgtgac taagcgttca gtcatgacgc 3720 tggcttacgg gtccaaagag ttcggcttcc gtcaacaagt gctggaagat accattcagc 3780 cagctattga ttccggcaag ggtctgatgt tcactcagcc gaatcaggct gctggataca 3840 tggctaagct gatttgggaa tctgtgagcg tgacggtggt agctgcggtt gaagcaatga 3900 actggcttaa gtctgctgct aagctgctgg ctgctgaggt caaagataag aagactggag 3960 agattcttcg caagcgttgc gctgtgcatt gggtaactcc tgatggtttc cctgtgtggc 4020 aggaatacaa gaagcctatt cagacgcgct tgaacctgat gttcctcggt cagttccgct 4080 tacagcctac cattaacacc aacaaagata gcgagattga tgcacacaaa caggagtctg 4140 gtatcgctcc taactttgta cacagccaag acggtagcca ccttcgtaag actgtagtgt 4200 gggcacacga gaagtacgga atcgaatctt ttgcactgat tcacgactcc ttcggtacca 4260 ttccggctga cgctgcgaac ctgttcaaag cagtgcgcga aactatggtt gacacatatg 4320 agtcttgtga tgtactggct gatttctacg accagttcgc tgaccagttg cacgagtctc 4380 aattggacaa aatgccagca cttccggcta aaggtaactt gaacctccgt gacatcttag 4440 agtcggactt cgcgttcgcg taaaagcttg cgattgtgta ggctggagct gcttcgaagt 4500 tcctatactt tctagagaat aggaacttcg gaataggaac ttcaagatcc cctcacgctg 4560 ccgcaagcac tcagggcgca agggctgcta aaggaagcgg aacacgtaga aagccagtcc 4620 gcagaaacgg tgctgacccc ggatgaatgt cagctactgg gctatctgga caagggaaaa 4680 cgcaagcgca aagagaaagc aggtagcttg cagtgggctt acatggcgat agctagactg 4740 ggcggtttta tggacagcaa gcgaaccgga attgccagct ggggcgccct ctggtaaggt 4800 tgggaagccc tgcaaagtaa actggatggc tttcttgccg ccaaggatct gatggcgcag 4860 gggatcaaga tctgatcaag agacaggatg aggatcgttt cgcatgattg aacaagatgg 4920 attgcacgca ggttctccgg ccgcttgggt ggagaggcta ttcggctatg actgggcaca 4980 acagacaatc ggctgctctg atgccgccgt gttccggctg tcagcgcagg ggcgcccggt 5040 tctttttgtc aagaccgacc tgtccggtgc cctgaatgaa ctgcaggacg aggcagcgcg 5100 gctatcgtgg ctggccacga cgggcgttcc ttgcgcagct gtgctcgacg ttgtcactga 5160 agcgggaagg gactggctgc tattgggcga agtgccgggg caggatctcc tgtcatctca 5220 ccttgctcct gccgagaaag tatccatcat ggctgatgca atgcggcggc tgcatacgct 5280 tgatccggct acctgcccat tcgaccacca agcgaaacat cgcatcgagc gagcacgtac 5340 tcggatggaa gccggtcttg tcgatcagga tgatctggac gaagagcatc aggggctcgc 5400 gccagccgaa ctgttcgcca ggctcaaggc gcgcatgccc gacggcgagg atctcgtcgt 5460 gacccatggc gatgcctgct tgccgaatat catggtggaa aatggccgct tttctggatt 5520 catcgactgt ggccggctgg gtgtggcgga ccgctatcag gacatagcgt tggctacccg 5580 tgatattgct gaagagcttg gcggcgaatg ggctgaccgc ttcctcgtgc tttacggtat 5640 cgccgctccc gattcgcagc gcatcgcctt ctatcgcctt cttgacgagt tcttctgagc 5700 gggactctgg ggttcgaaat gaccgaccaa gcgacgccca acctgccatc acgagatttc 5760 gattccaccg ccgccttcta tgaaaggttg ggcttcggaa tcgttttccg ggacgccggc 5820 tggatgatcc tccagcgcgg ggatctcatg ctggagttct tcgcccaccc cagcttcaaa 5880 agcgctctga agttcctata ctttctagag aataggaact tcggaatagg aactaaggag 5940 gatattcata tggaccatgg gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagttttaa 6000 agctttttat cactagtgaa ttcgcggccg cctgcaggtc gaccatatgg gagagctccc 6060 aacgcgttgg atgcatagct tgagtattct atagtgtcac ctaaatagct tggcgtaatc 6120 atggtcatag ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg 6180 agccggaagc ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat 6240 tgcgttgcgc tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg 6300 aatcggccaa cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct 6360 cactgactcg ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc 6420 ggtaatacgg ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg 6480 ccagcaaaag gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg 6540 cccccctgac gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg 6600 actataaaga taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac 6660 cctgccgctt accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca 6720 tagctcacgc tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt 6780 gcacgaaccc cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc 6840 caacccggta agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag 6900 agcgaggtat gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac 6960 tagaagaaca gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt 7020 tggtagctct tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa 7080 gcagcagatt acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg 7140 gtctgacgct cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa 7200 aaggatcttc acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat 7260 atatgagtaa acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc 7320 gatctgtcta tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat 7380 acgggagggc ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc 7440 ggctccagat ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc 7500 tgcaacttta tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag 7560 ttcgccagtt aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg 7620 ctcgtcgttt ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg 7680 atcccccatg ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag 7740 taagttggcc gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt 7800 catgccatcc gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga 7860 atagtgtatg cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc 7920 acatagcaga actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc 7980 aaggatctta ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc 8040 ttcagcatct tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc 8100 cgcaaaaaag ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca 8160 atattattga agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat 8220 ttagaaaaat aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgatgc 8280 ggtgtgaaat accgcacaga tgcgtaagga gaaaataccg catcaggaaa ttgtaagcgt 8340 taatattttg ttaaaattcg cgttaaattt ttgttaaatc agctcatttt ttaaccaata 8400 ggccgaaatc ggcaaaatcc cttataaatc aaaagaatag accgagatag ggttgagtgt 8460 tgttccagtt tggaacaaga gtccactatt aaagaacgtg gactccaacg tcaaagggcg 8520 aaaaaccgtc tatcagggcg atggcccact acgtgaacca tcaccctaat caagtttttt 8580 ggggtcgagg tgccgtaaag cactaaatcg gaaccctaaa gggagccccc gatttagagc 8640 ttgacgggga aagccggcga acgtggcgag aaaggaaggg aagaaagcga aaggagcggg 8700 cgctagggcg ctggcaagtg tagcggtcac gctgcgcgta accaccacac ccgccgcgct 8760 taatgcgccg ctacagggcg cgtccattcg ccattcaggc tgcgcaactg ttgggaaggg 8820 cgatcggtgc gggcctcttc gctattacgc cagctggcga aagggggatg tgctgcaagg 8880 cgattaagtt gggtaacgcc agggttttcc cagtcacgac gttgtaaaac gacggccagt 8940 gaattgtaat acgactcact atagggcgaa ttgggcccga cgtcgcatgc tcccggccgc 9000 catggcggcc gcgggaattc gat 9023 <210> 43 <211> 39 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 43 acagtcctgc taaaacgttc gtttgatatc atttttcct 39 <210> 44 <211> 39 <212> DNA <213> Escherichia coli <400> 44 gattcacaag gccattgacg catcgcccgg ttagtttta 39

Claims (10)

  1. T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포, 및 T7 프로모터의 제어 하에 발현시키고자 하는 단백질을 코딩하는 유전자를 포함하는 발현 벡터를 포함하는 발현 시스템으로서, 상기 발현 벡터는 플라스미드 안정화 시스템을 포함하는 것을 특징으로 하는 발현 시스템.
  2. 제1항에 있어서, 플라스미드 안정화 시스템은 멀티머 분해 시스템(multimer resolution system, mrs), 분할 시스템(partitioning system, par) 및 분리 후 살해 시스템(postsegregational killing system, PSK)의 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 것인 발현 시스템.
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서, 원핵 세포는 게놈 내에 T7 RNA 중합효소 유전자를 갖는 에스케리키아 콜라이(Escherichia coli) 균주의 세포인 것을 특징으로 하는 것인 발현 시스템.
  4. 제1항 내지 제3항 중 어느 하나의 항에 있어서, 서열 번호 1을 갖는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 것인 발현 시스템.
  5. 하기 구성요소:
    복제 원점(ori),
    조절 서열로서의 T7 프로모터,
    발현시키고자 하는 단백질 또는 펩티드를 코딩하는 서열,
    클로닝에 대한 선택 마커로서의 항생제 내성 유전자,
    터미네이터,
    리프레서 유전자,
    리프레서 유전자에 적합한 오퍼레이터 서열, 및
    플라스미드 안정화 시스템
    을 기능적 결합으로 포함하는 발현 벡터.
  6. 제5항에 있어서, 플라스미드 안정화 시스템은 cer 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 것인 발현 벡터.
  7. 제1항 내지 제4항 중 어느 하나의 항의 T7 발현 시스템에 대한 원핵 세포의 제조 방법으로서, T7 RNA 중합효소가 “부위 특이적” 재조합에 의해 T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 원핵 세포의 게놈 내로 특이적으로 통합되는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
  8. 제7항에 있어서, 유도성 프로모터의 제어 하의 T7 RNA 중합효소의 표적 통합은 E. 콜라이의 proBA 서열 내로 이루어지는 것을 특징으로 하는 것인 제조 방법.
  9. 게놈 내로 통합된, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는, 제7항 또는 제8항의 방법에 의해 제조된 원핵 세포로서, 람다 파지 DNA를 포함하지 않는 것을 특징으로 하는 원핵 세포.
  10. 제1항 내지 제5항 중 어느 하나의 항의 발현 시스템을 이용하여 재조합 단백질을 제조하는 방법으로서, 제5항 또는 제6항의 발현 벡터를, T7 프로모터의 제어 하 및 유도성 프로모터의 제어 하에 T7 RNA 중합효소를 코딩하는 뉴클레오티드 작제물을 포함하는 원핵 세포 내로 도입하고, 상기 세포를 폴리뉴클레오티드 서열로부터의 재조합 단백질의 발현 및 T7 RNA 중합효소의 발현에 적합한 무항생제 조건 하에 발효시키고, 이로써 재조합 폴리펩티드를 발현시키고 재조합 폴리펩티드를 단리하는 것을 특징으로 하는 제조 방법.
KR1020177002137A 2014-07-01 2015-06-17 T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도 KR101951128B1 (ko)

Applications Claiming Priority (3)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DE102014212675.4A DE102014212675A1 (de) 2014-07-01 2014-07-01 T7-Expressionssystem, Verfahren zu seiner Herstellung und seine Verwendung zur Herstellung von rekombinanten Proteinen
DE102014212675.4 2014-07-01
PCT/EP2015/063575 WO2016000961A1 (de) 2014-07-01 2015-06-17 T7-expressionssystem, verfahren zu seiner herstellung und seine verwendung zur herstellung von rekombinanten proteinen

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20170020722A true KR20170020722A (ko) 2017-02-23
KR101951128B1 KR101951128B1 (ko) 2019-02-21

Family

ID=53434342

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020177002137A KR101951128B1 (ko) 2014-07-01 2015-06-17 T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도

Country Status (8)

Country Link
US (1) US9822348B2 (ko)
EP (1) EP3164494B1 (ko)
JP (1) JP6306221B2 (ko)
KR (1) KR101951128B1 (ko)
CN (1) CN106536740B (ko)
DE (1) DE102014212675A1 (ko)
DK (1) DK3164494T3 (ko)
WO (1) WO2016000961A1 (ko)

Families Citing this family (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
GB201704659D0 (en) 2017-03-24 2017-05-10 Fujifilm Diosynth Biotechnologies Uk Ltd Expression system
JP2020530267A (ja) 2017-06-30 2020-10-22 コデクシス， インコーポレイテッド Ｔ７ ｒｎａポリメラーゼバリアント
EP3645711A4 (en) 2017-06-30 2021-04-21 Codexis, Inc. T7 RNA POLYMERASE VARIANTS
CN110218734B (zh) * 2018-03-02 2021-07-30 清华大学 一种基于t7表达系统的表达组件
CN110904102A (zh) * 2018-09-18 2020-03-24 中国科学院上海生命科学研究院 一种用于重组蛋白质表达的启动子
CN115197954A (zh) * 2021-04-14 2022-10-18 上海凯赛生物技术股份有限公司 用于发酵生产1,5-戊二胺的重组dna、菌株及其用途

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824528A (en) * 1992-05-01 1998-10-20 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of autogenes encoding RNA poly,erases of T7-like bacteriophages

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
ATE358135T1 (de) * 2000-08-15 2007-04-15 Phage Biotechnology Corp Phagen-abhängige superproduktion biologisch aktiver proteine und peptide
DE10360483B4 (de) 2003-12-22 2007-11-15 Scil Proteins Gmbh Expressionsvektor und dessen Verwendung
JP5837747B2 (ja) * 2007-05-17 2015-12-24 ベーリンガー インゲルハイム エルツェーファウ ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ウント コンパニー コマンディトゲゼルシャフト 組換えタンパク質を工業規模で製造する方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5824528A (en) * 1992-05-01 1998-10-20 Associated Universities, Inc. Cloning and expression of autogenes encoding RNA poly,erases of T7-like bacteriophages

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
GenBank Accession Number AM946981 (2013.08.16.) *

Also Published As

Publication number Publication date
CN106536740B (zh) 2020-01-21
DK3164494T3 (en) 2018-08-06
EP3164494A1 (de) 2017-05-10
US9822348B2 (en) 2017-11-21
JP2017520256A (ja) 2017-07-27
EP3164494B1 (de) 2018-05-02
DE102014212675A1 (de) 2016-01-07
KR101951128B1 (ko) 2019-02-21
WO2016000961A1 (de) 2016-01-07
CN106536740A (zh) 2017-03-22
US20170152491A1 (en) 2017-06-01
JP6306221B2 (ja) 2018-04-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
KR101951128B1 (ko) T7 발현 시스템, 이의 제조 방법 및 재조합 단백질을 제조하기 위한 이의 용도
KR20210044795A (ko) 고 처리량 대사 공학에서 CRISPRi의 응용
DK2432884T3 (en) Antibiotic-free PLASMID
KR20190116282A (ko) 복수의 숙주를 위한 다중 dna 구조체의 조립 및 편집을 위한 모듈식 범용 플라스미드 디자인 전략
CN104694452B (zh) 一种高产普鲁兰酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法
CN111088176B (zh) 产β-胡萝卜素的基因工程菌及其应用
CN111139259B (zh) 一种提高基因编辑中同源重组效率的方法
CN115197967B (zh) 制备重组腺相关病毒的辅助质粒及其应用
CN111635907B (zh) 一种构建虾青素生产菌的方法
CN113462712A (zh) 一种温控自剪切单质粒同源重组系统及其在基因编辑中的应用
CN110446782B (zh) 一种改变细胞所具有的dna的靶向部位的方法以及用于该方法的复合体
KR20130078265A (ko) 감염력이 있는 구제역바이러스 Ｏ형 ｃＤＮＡ 클론 및 클론의 전체염기서열
CN109957551B (zh) 表达人β-防御素2的重组痘苗病毒及其应用
CN113846019B (zh) 一种海洋微拟球藻靶向表观基因组遗传调控方法
CN112522205B (zh) 一种过表达血管紧张素转换酶2的细胞系及其制备方法与应用
CN109337851B (zh) 一种在枯草芽孢杆菌的芽孢表面高效展示海藻糖合酶的方法
CN116848237A (zh) 病毒样颗粒及其生产方法
KR102422842B1 (ko) 크리스퍼 간섭을 이용한 rna 번역 조절용 조성물
CN108728466A (zh) 一种能够快速获得牙鲆稳转细胞系的载体
KR20220116173A (ko) 밀의 게놈에의 dna 또는 돌연변이의 정확한 도입
AT509050B1 (de) Hydrolase-aktivator aus trichoderma reesei
KR102664852B1 (ko) 광 유도 유전자 발현 조절용 벡터 시스템 및 이의 용도
CN113528450B (zh) 一种水稻原生质体高效生物素标记体系的建立及应用
CN116987686A (zh) 一种工程优化的核酸酶、向导rna、编辑系统和应用
CN117280036A (zh) 质粒的制备方法及质粒

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right