CN107475279B - 苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体构建方法及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉属于基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体构建方法及应用。表达T载体为pAc19‑T，其序列如SEQ ID.1所示，构建成功的载体pAc19大小为3706bp，经Xcm I酶切而制成的pAc19‑T载体为3055bp，可广泛用于苏云金芽胞杆菌vip基因片段的TA克隆，同时，也有效解决了用于易错PCR方法研究苏云金芽胞杆菌Vip蛋白定向进化表达T载体的问题，大大简化了程序，提高了效率。
Description
技术领域：
本发明涉属于基因工程技术领域，具体涉及一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体构建方法及应用。
背景技术：
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis，简称Bt)是一种革兰氏阳性细菌，能产生多种具有杀虫活性的蛋白质，如杀虫晶体蛋白(insecticidal crystal proteins,ICPs)和营养期杀虫蛋白(vegetative insecticidal proteins,VIPs)。
目前，对于Cry蛋白的作用机制研究较为深入。以3d-Cry类蛋白对鳞翅目昆虫的杀虫过程为模型，首先，敏感幼虫摄入Cry原毒素，经过中肠液蛋白酶的作用，消化成60kDa左右的活性片段。活化的蛋白与昆虫中肠内不同的Cry蛋白受体结合，插入细胞膜，并在幼虫中肠细胞的顶膜上形成孔道(即离子通道)。离子通道使细胞膜内外渗透压改变，最终导致细胞肿胀、破裂，并导致昆虫死亡(Pardo-Lopez,et al.,2013)。
苏云金芽胞杆菌(Bacillus thuringiensis)Vip3蛋白是目前研究最多的营养期杀虫蛋白(Vegetative insecticidal protein，Vip)。2014年12月，先正达公司的MIR162转基因玉米(含vip3A基因)获得我国进口许可，因此寻找Vip蛋白杀虫活性关键位点，研究结构与功能的关系，继而通过分子设计途径，改良其杀虫活性，用于构建工程菌及转基因植物，获得专利，成为我国农业生产中面临的重要课题。
Vip蛋白在Bt菌株营养生长期分泌到胞外的培养基上，不产生晶体，具有热不稳定性。它对多种Cry蛋白不敏感的鳞翅目昆虫具有很好的杀虫活性，并且与Cry蛋白在进化上没有同源性，且杀虫机理也不尽相同。因此，Vip蛋白被认为是Bt的第二代杀虫蛋白，不仅扩大了Bt基因的应用范围，还延缓了害虫的抗性产生，具有广泛的应用前景。目前对于Vip蛋白的基因发掘、杀虫机制、活性区及蛋白结构等研究越来越深入，成为新的研究热点(Lee,et al.,2003)。
目前，Vip3蛋白各部分的功能还没有很透彻的解析，其三维结构没有被明确解析，但是个别氨基酸序列的变化可能就会影响到杀虫蛋白的活性止，各部分氨基酸与功能之间的关系仍在研究中。如Vip3Aa1和Vip3Aa16之间仅有两个氨基酸残基的差异(Mesrati,etal.,2005)，Vip3Aa11与Vip3Aa19之间存在19个氨基酸的差异(Liu,et al.,2007)，Vip3Aa10和Vip3Aa14之间有18个氨基酸的差异(Bhalla,et al.,2005)，Vip3Aa11与Vip3Aa39之间存在39个氨基酸的差异，然而这些蛋白在杀虫毒力和杀虫谱存在很大差别。
利用易错PCR的方法进行随机突变，是研究关键氨基酸位点最常用的方法。主要是利用Taq DNA聚合酶在进行PCR扩增目的基因时，通过调整反应条件，例如改变镁离子浓度，加入锰离子，改变体系中四种dNTP的浓度，改变PCR反应的循环数等，来增加错误碱基渗入的几率，导致目的基因随机突变，构建突变库，然后选择或筛选需要的突变体。
TA克隆技术是一种快速方便的基因克隆方法，能够在不受酶切位点限制的条件下进行粘性末端连接：Taq DNA聚合酶扩增产生的PCR产物的双链两端各带有1个3′端悬挂的A(腺苷酸)，与末端带有T(胸腺核苷酸)的载体进行直接连接[9]。但是，市售T载体只能作为中间载体，缺少基因表达元件，基因克隆成功后还得进行亚克隆，才能在表达载体中进行表达。新型表达T载体将蛋白表达与TA克隆技术结合起来，为研究工作提供了很大的方便。
传统的酶切、连接突变基因到表达载体，会损失部分突变体，并且需转化克隆宿主，再转化表达宿主，过程繁琐。该表达T载体，可以使突变基因直接连接，转化E.coliJM109中进行表达，并且省去添加化学诱导剂诱导的步骤，可以避免试剂对细胞的毒性作用，过程更为快速、高效及稳定。
发明内容：
本发明弥补和改善了上述现有技术的不足之处，针对传统苏云金芽胞杆菌Vip克隆、表达载体，提供了一种新的苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体，能够简化操作、提高连接率、一步完成基因克隆和表达质粒的构建。
本发明采用的技术方案为：一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的构建方法，该构建方法为:
第一步:构建Linker
合成2条互相配对的核苷酸Linker-F
(CACCACGATTCCTATGGAAGGGCCCGCTCGAGAGCCACCGCAATGGTGGG)和Linker-R
(GATCCCCACCATTGCGGTGGCTCTCGAGCGGGCCCTTCCAGAGGAATCGTGGTGGTAC)，分别用水溶解至终浓度为10μmol/L，各取20μL混合，于95℃变性5min，然后按照下述步骤进行复性：85℃3min，65℃3min，45℃3min，37℃3min，室25℃3min；
第二步：BamH I，KpnI双酶切pUC19质粒与Linker
反应体系：
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测，条带大小正确，进行测序分析；
第三步：DNA片段的连接、转化
将回收后的载体和PCR产物连接，体系如下：
载体DNA
目的片段DNA
Solution 1 5μL
加ddH2O至 10μL
载体DNA与外源DNA片段的摩尔比＝1：3
反应条件：16℃，4h
取5μL连接产物，转化大肠杆菌JM109；
第四步：重组质粒的鉴定
取转化E.coli JM109的后单克隆，接种液体LB培养基，37℃，220rpm，6h后的菌液为模板，以pUC19通用引物对为引物，PCR扩增插入基因的全长片段；pUC19F和pUC19R为pUC19的引物，
引物pUC19F序列为：GGGTTTTCCCAGTCACGACG，
引物pUC19R序列为：CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA；
反应体系：
扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min；
取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测(120V，30min)，阳性克隆大小为184bp(图1，泳道2)，阴性克隆大小为142bp；
第五步：Apa I酶切阳性克隆质粒
反应体系：
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测；
第六步：去磷酸化
反应体系50μl，37℃，4h，体系如下：
1)、等量的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次；
2)、氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次；
3)、1/10体积的3M NaCl，2倍体积的冷乙醇，-20℃下放置60min；
4)、12000rpm，10min；
5)、再加乙醇洗一遍沉淀
6)、用20μL TE Buffer溶解沉淀；
第七步：PCR扩增一段两端带Apa I酶切位点的cry基因片段(引物615F序列为：GGGCCCAGTGATAATAGACAGATTTGAATTTATTCC，引物615R序列为：GGGCCCTCGATTCGGCTCTCCACA)，凝胶回收后，通过T4DNA连接酶与去磷酸化的载体进行连接、转化大肠杆菌JM109，挑取单克隆进行PCR、测序鉴定；
第八步：PCR扩增cry1Ac启动子以苏云金芽胞杆菌LBH97基因组为模板，以pc1Ac-F、pc1Ac-R为为引物对，PCR扩增cry1Ac启动子基因片段；
pc1Ac-F序列为：CGGGATCCGCAGGTAAATGGTTCTAACATGTATAAGTGT
pc1Ac-R序列为：AACTGCAGAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTAAGATACC
反应体系：
反应条件：扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸10min，取5μl PCR产物电泳检测，正确大小为368bp(图2，泳道1)；
第九步：用限制性内切酶Bam HI和Pst I双酶切PCR扩增后的启动子，凝胶回收后，通过T4DNA连接酶与技术方案7中的载体进行连接，转化JM109，经PCR、酶切鉴定后，测序分析；经Apa I酶切后条带大小为619bp、3087bp(图3，泳道2)，经Xcm I酶切后条带大小为323bp、328bp、3055bp(图3泳道1)；
第十步：回收3055bp条带，即为新的表达T载体。
一种按照苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的构建方法可获得的苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体。
一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的应用，该应用为：
1、对vip3Aa11基因的克隆
根据已知vip3Aa11基因的序列，设计全长引物V3F、V3R，以含vip3Aa11基因的质粒为模板，Taq DNA聚合酶扩增全长序列，
反应体系：
扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min，取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测(120V，30min)，正确PCR产物大小为2370bp；
2、连接转化大肠杆菌
琼脂糖凝胶回收vip3Aa11基因的PCR产物，与苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体以摩尔比3:1的比例连接4h，转化大肠杆菌JM109，涂布氨苄抗性LB平板，37℃培养过夜后，随机挑取10个单克隆进行测序分析，均含有vip3Aa11基因，转化率达到100％。
本发明的有益效果：提供了一种苏云金芽胞杆菌vip基因表达型T载体，表达T载体为pAc19-T，其序列如SEQ ID.1所示，构建成功的载体pAc19大小为3706bp，经Xcm I酶切而制成的pAc19-T载体为3055bp，可广泛用于苏云金芽胞杆菌vip基因片段的TA克隆，同时，也有效解决了用于易错PCR方法研究苏云金芽胞杆菌Vip蛋白定向进化表达T载体的问题，大大简化了程序，提高了效率；能够简化操作、提高连接率、一步完成基因克隆和表达质粒的构建；质粒小，有利于通过反向PCR技术对目标基因进行随机、定点诱变和修饰。
附图说明：
图1是PCR扩增结果图。
图2是PCR扩增cry1Ac启动子结果图。
图3是酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定结果图。
具体实施方式：
一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的构建方法，该构建方法为:
第一步:构建Linker
合成2条互相配对的核苷酸Linker-F
(CACCACGATTCCTATGGAAGGGCCCGCTCGAGAGCCACCGCAATGGTGGG)和Linker-R
(GATCCCCACCATTGCGGTGGCTCTCGAGCGGGCCCTTCCAGAGGAATCGTGGTGGTAC)，分别用水溶解至终浓度为10μmol/L，各取20μL混合，于95℃变性5min，然后按照下述步骤进行复性：85℃3min，65℃3min，45℃3min，37℃3min，室25℃3min；
第二步：BamH I，KpnI双酶切pUC19质粒与Linker
反应体系：
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测，条带大小正确，进行测序分析；
第三步：DNA片段的连接、转化
将回收后的载体和PCR产物连接，体系如下：
载体DNA
目的片段DNA
Solution 1 5μL
加ddH2O至 10μL
载体DNA与外源DNA片段的摩尔比＝1：3
反应条件：16℃，4h
取5μL连接产物，转化大肠杆菌JM109；
第四步：重组质粒的鉴定
取转化E.coli JM109的后单克隆，接种液体LB培养基，37℃，220rpm，6h后的菌液为模板，以pUC19通用引物对为引物，PCR扩增插入基因的全长片段；pUC19F和pUC19R为pUC19的引物，
引物pUC19F序列为：GGGTTTTCCCAGTCACGACG，
引物pUC19R序列为：CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA；
反应体系：
扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min；
取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测(120V，30min)，阳性克隆大小为184bp(图1，泳道2)，阴性克隆大小为142bp；
第五步：Apa I酶切阳性克隆质粒
反应体系：
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测；
第六步：去磷酸化
反应体系50μl，37℃，4h，体系如下：
1)、等量的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:1)抽提2次；
2)、氯仿/异戊醇(24:1)抽提1次；
3)、1/10体积的3M NaCl，2倍体积的冷乙醇，-20℃下放置60min；
4)、12000rpm，10min；
5)、再加乙醇洗一遍沉淀
6)、用20μL TE Buffer溶解沉淀；
第七步：PCR扩增一段两端带Apa I酶切位点的cry基因片段(引物615F序列为：GGGCCCAGTGATAATAGACAGATTTGAATTTATTCC，引物615R序列为：GGGCCCTCGATTCGGCTCTCCACA)，凝胶回收后，通过T4DNA连接酶与去磷酸化的载体进行连接、转化大肠杆菌JM109，挑取单克隆进行PCR、测序鉴定；
第八步：PCR扩增cry1Ac启动子
以苏云金芽胞杆菌LBH97基因组为模板，以pc1Ac-F、pc1Ac-R为为引物对，PCR扩增cry1Ac启动子基因片段；
pc1Ac-F序列为：CGGGATCCGCAGGTAAATGGTTCTAACATGTATAAGTGT
pc1Ac-R序列为：AACTGCAGAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTAAGATACC
反应体系：
反应条件：扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸10min，取5μl PCR产物电泳检测，正确大小为368bp(图2，泳道1)；
第九步：用限制性内切酶Bam HI和Pst I双酶切PCR扩增后的启动子，凝胶回收后，通过T4DNA连接酶与技术方案7中的载体进行连接，转化JM109，经PCR、酶切鉴定后，测序分析；经Apa I酶切后条带大小为619bp、3087bp(图3，泳道2)，经Xcm I酶切后条带大小为323bp、328bp、3055bp(图3泳道1)；
第十步：回收3055bp条带，即为新的表达T载体。
一种按照苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的构建方法可获得的苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体。
一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体的应用，该应用为：
1、对vip3Aa11基因的克隆
根据已知vip3Aa11基因的序列，设计全长引物V3F、V3R，以含vip3Aa11基因的质粒为模板，Taq DNA聚合酶扩增全长序列，
反应体系：
扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min，取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测(120V，30min)，正确PCR产物大小为2370bp；
2、连接转化大肠杆菌
琼脂糖凝胶回收vip3Aa11基因的PCR产物，与苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体以摩尔比3:1的比例连接4h，转化大肠杆菌JM109，涂布氨苄抗性LB平板，37℃培养过夜后，随机挑取10个单克隆进行测序分析，均含有vip3Aa11基因，转化率达到100％。
表1.本发明中所用引物
| 引物名称 | 序列 |
| pUC19F | GGGTTTTCCCAGTCACGACG |
| pUC19R | CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA |
| 615F | GGGCCCAGTGATAATAGACAGATTTGAATTTATTCC |
| 615R | GGGCCCTCGATTCGGCTCTCCACA |
| pc1Ac-F | CGGGATCCGCAGGTAAATGGTTCTAACATGTATAAGTGT |
| pc1Ac-R | AACTGCAGAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTAAGATACC |
SEQ ID.1
pAc19-T序列
载体大小(bp)：3055
克隆位点(bp)：422
LacZ(bp)：146-843
氨苄抗性(bp)：1995～2855
pUC复制区(bp)：1236-1824
cry1Ac启动子(bp)：436-803
序列表
<110> 黑龙江八一农垦大学
<120> 一种苏云金芽胞杆菌Vip基因的表达T载体及其构建方法和应用
<130> B001
<140> 2017106105119
<141> 2017-07-25
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 3055
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
tcgcgcgttt cggtgatgac ggtgaaaacc tctgacacat gcagctcccg gagacggtca 60
cagcttgtct gtaagcggat gccgggagca gacaagcccg tcagggcgcg tcagcgggtg 120
ttggcgggtg tcggggctgg cttaactatg cggcatcaga gcagattgta ctgagagtgc 180
accatatgcg gtgtgaaata ccgcacagat gcgtaaggag aaaataccgc atcaggcgcc 240
attcgccatt caggctgcgc aactgttggg aagggcgatc ggtgcgggcc tcttcgctat 300
tacgccagct ggcgaaaggg ggatgtgctg caaggcgatt aagttgggta acgccagggt 360
tttcccagtc acgacgttgt aaaacgacgg ccagtgaatt cgagctcggt accaccagga 420
ttatcctggg gatccgcagg taaatggttc taacatgtat aagtgtaagt atttctacat 480
taccacaaat tctcaatttg tatatgtaaa ataggaaaag tggattttat atataagtat 540
aaaaagtaat aagactttaa aataagttaa cggaatacaa acccttaatg cattggttaa 600
acattgtaaa gtctaaagca tggataatgg gcgagaagta agtagattgt taacaccctg 660
ggtcaaaaat tgatatttag taaaattagt tgcactttgt gcattttttc ataagatgag 720
tcatatgttt taaattgtag taatgaaaaa cagtattata tcataatgaa ttggtatctt 780
aataaaagag atggaggtaa cttctgcagg catgcaagct tggcgtaatc atggtcatag 840
ctgtttcctg tgtgaaattg ttatccgctc acaattccac acaacatacg agccggaagc 900
ataaagtgta aagcctgggg tgcctaatga gtgagctaac tcacattaat tgcgttgcgc 960
tcactgcccg ctttccagtc gggaaacctg tcgtgccagc tgcattaatg aatcggccaa 1020
cgcgcgggga gaggcggttt gcgtattggg cgctcttccg cttcctcgct cactgactcg 1080
ctgcgctcgg tcgttcggct gcggcgagcg gtatcagctc actcaaaggc ggtaatacgg 1140
ttatccacag aatcagggga taacgcagga aagaacatgt gagcaaaagg ccagcaaaag 1200
gccaggaacc gtaaaaaggc cgcgttgctg gcgtttttcc ataggctccg cccccctgac 1260
gagcatcaca aaaatcgacg ctcaagtcag aggtggcgaa acccgacagg actataaaga 1320
taccaggcgt ttccccctgg aagctccctc gtgcgctctc ctgttccgac cctgccgctt 1380
accggatacc tgtccgcctt tctcccttcg ggaagcgtgg cgctttctca tagctcacgc 1440
tgtaggtatc tcagttcggt gtaggtcgtt cgctccaagc tgggctgtgt gcacgaaccc 1500
cccgttcagc ccgaccgctg cgccttatcc ggtaactatc gtcttgagtc caacccggta 1560
agacacgact tatcgccact ggcagcagcc actggtaaca ggattagcag agcgaggtat 1620
gtaggcggtg ctacagagtt cttgaagtgg tggcctaact acggctacac tagaaggaca 1680
gtatttggta tctgcgctct gctgaagcca gttaccttcg gaaaaagagt tggtagctct 1740
tgatccggca aacaaaccac cgctggtagc ggtggttttt ttgtttgcaa gcagcagatt 1800
acgcgcagaa aaaaaggatc tcaagaagat cctttgatct tttctacggg gtctgacgct 1860
cagtggaacg aaaactcacg ttaagggatt ttggtcatga gattatcaaa aaggatcttc 1920
acctagatcc ttttaaatta aaaatgaagt tttaaatcaa tctaaagtat atatgagtaa 1980
acttggtctg acagttacca atgcttaatc agtgaggcac ctatctcagc gatctgtcta 2040
tttcgttcat ccatagttgc ctgactcccc gtcgtgtaga taactacgat acgggagggc 2100
ttaccatctg gccccagtgc tgcaatgata ccgcgagacc cacgctcacc ggctccagat 2160
ttatcagcaa taaaccagcc agccggaagg gccgagcgca gaagtggtcc tgcaacttta 2220
tccgcctcca tccagtctat taattgttgc cgggaagcta gagtaagtag ttcgccagtt 2280
aatagtttgc gcaacgttgt tgccattgct acaggcatcg tggtgtcacg ctcgtcgttt 2340
ggtatggctt cattcagctc cggttcccaa cgatcaaggc gagttacatg atcccccatg 2400
ttgtgcaaaa aagcggttag ctccttcggt cctccgatcg ttgtcagaag taagttggcc 2460
gcagtgttat cactcatggt tatggcagca ctgcataatt ctcttactgt catgccatcc 2520
gtaagatgct tttctgtgac tggtgagtac tcaaccaagt cattctgaga atagtgtatg 2580
cggcgaccga gttgctcttg cccggcgtca atacgggata ataccgcgcc acatagcaga 2640
actttaaaag tgctcatcat tggaaaacgt tcttcggggc gaaaactctc aaggatctta 2700
ccgctgttga gatccagttc gatgtaaccc actcgtgcac ccaactgatc ttcagcatct 2760
tttactttca ccagcgtttc tgggtgagca aaaacaggaa ggcaaaatgc cgcaaaaaag 2820
ggaataaggg cgacacggaa atgttgaata ctcatactct tcctttttca atattattga 2880
agcatttatc agggttattg tctcatgagc ggatacatat ttgaatgtat ttagaaaaat 2940
aaacaaatag gggttccgcg cacatttccc cgaaaagtgc cacctgacgt ctaagaaacc 3000
attattatca tgacattaac ctataaaaat aggcgtatca cgaggccctt tcgtc 3055
Claims (3)
1.一种苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体的构建方法，其特征在于：该构建方法为:
第一步:构建Linker
合成2条互相配对的核苷酸Linker-F：CACCACGATTCCTATGGAAGGGCCCGCTCGAGAGCCACCGCAATGGTGGG和Linker-R：GATCCCCACCATTGCGGTGGCTCTCGAGCGGGCCCTTCCAGAGGAATCGTGGTGGTAC，分别用水溶解至终浓度为10μmol/L，各取20μL混合，于95℃变性5min，然后按照下述步骤进行复性：85℃3min，65℃3min，45℃3min，37℃3min，25℃3min；
第二步：BamH I，KpnI双酶切pUC19质粒与Linker
反应体系：DNA 3μL、10×酶切buffer 2μL、BamH I 1μL、KpnI 1μL、加ddH2O至20μL；
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测，条带大小正确，进行测序分析；
第三步：DNA片段的连接、转化
将回收后的载体和PCR产物连接，载体DNA与外源DNA片段的摩尔比＝1：3，反应条件：16℃，4h
取5μL连接产物，转化大肠杆菌JM109；
第四步：重组质粒的鉴定
取转化E.coli JM109的后单克隆，接种液体LB培养基，37℃，220rpm，6h后的菌液为模板，以pUC19通用引物对为引物，PCR扩增插入基因的全长片段；pUC19F和pUC19R为pUC19的引物，
引物pUC19F序列为：GGGTTTTCCCAGTCACGACG，
引物pUC19R序列为：CTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCA；
反应体系：2×Taq DNA polymerase Mix 10μL、pUC19F 10μM 1μL、pUC19R 10μM 1μL、菌液1μL加ddH2O至20μL；
扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸3min，30个循环，最后72℃延伸10min；
取3μL扩增产物进行琼脂糖电泳检测120V，30min，阳性克隆大小为184bp，阴性克隆大小为142bp；
第五步：Apa I酶切阳性克隆质粒
反应体系：重组质粒DNA 3μL、10×酶切buffer 2μL、ApaI 1μL、加ddH2O至20μL；
反应条件：反应体系混匀后置于37℃酶切4h，取5μl酶切产物电泳检测；
第六步：去磷酸化
反应体系50μl，37℃，4h，体系如下：DNA Fragment in TE Buffer 1-20pmol、10×Alkaline Phosphatase Buffer 5μL、CIAP 2μL、Sterilized distilled water Up to 50μL；
1)、苯酚/氯仿/异戊醇25:24:1抽提2次；
2)、氯仿/异戊醇24:1抽提1次；
3)、1/10体积的3M NaCl，2倍体积的冷乙醇，-20℃下放置60min；
4)、12000rpm，10min；
5)、再加乙醇洗一遍沉淀
6)、用20μL TE Buffer溶解沉淀；
第七步：PCR扩增一段两端带Apa I酶切位点的cry基因片段，引物615F序列为：GGGCCCAGTGATAATAGACAGATTTGAATTTATTCC，引物615R序列为：GGGCCCTCGATTCGGCTCTCCACA，凝胶回收后，通过T4 DNA连接酶与去磷酸化的载体进行连接、转化大肠杆菌JM109，挑取单克隆进行PCR、测序鉴定；
第八步：PCR扩增cry1Ac启动子
以苏云金芽胞杆菌LBH97基因组为模板，以pc1Ac-F、pc1Ac-R为引物对，PCR扩增cry1Ac启动子基因片段；
pc1Ac-F序列为：CGGGATCCGCAGGTAAATGGTTCTAACATGTATAAGTGT
pc1Ac-R序列为：AACTGCAGAAGTTACCTCCATCTCTTTTATTAAGATACC
反应体系：KOD plus 1μl、KOD buffer 5μl、dNTPs 5μl、MgSO4 2μl、pc1Ac-F 10μM 1μl、pc1Ac-R 10μM 1μl、Template 1μl、加ddH2O至50μL；
反应条件：扩增循环：94℃预变性2min；94℃变性20s，55℃退火20s，68℃延伸30s，30个循环，最后68℃延伸10min，取5μl PCR产物电泳检测，正确大小为368bp；
第九步：用限制性内切酶Bam HI和Pst I双酶切PCR扩增后的启动子，凝胶回收后，通过T4 DNA连接酶与第七步中的载体进行连接，转化JM109，经PCR、酶切鉴定后，测序分析；经Apa I酶切后条带大小为619bp、3087bp，经Xcm I酶切后条带大小为323bp、328bp、3055bp；
第十步：回收3055bp条带，即为苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体。
2.一种按照权利要求1所述构建方法获得的载体，其特征在于：该载体为苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体。
3.一种权利要求2所述的一种苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体的应用，其特征在于：该应用为：
1)、对vip3Aa11基因的克隆；
2)、连接转化大肠杆菌；
琼脂糖凝胶回收vip3Aa11基因的PCR产物，与权利要求1所述的苏云金芽胞杆菌vip3Aa11基因的表达T载体以摩尔比3:1的比例连接4h，转化大肠杆菌JM109，涂布氨苄抗性LB平板，37℃培养过夜后，随机挑取10个单克隆进行测序分析，均含有vip3Aa11基因，转化率达到100％。
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Patent Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN106243199A (zh) * | 2016-09-21 | 2016-12-21 | 东北农业大学 | 对甜菜夜蛾具有高活性的Vip3Aa11蛋白突变体 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 苏云金芽胞杆菌新型vip3Aa基因的克隆、表达与活性分析;何晓明等;《农业生物技术学报》;20111028;第19 卷(第5期);第932-937 页 * |
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| CN107475279A (zh) | 2017-12-15 |
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| PB01 | Publication | ||
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| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
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| GR01 | Patent grant | ||
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