CN105734028A - 一种环氧化物水解酶突变体及其应用 - Google Patents

一种环氧化物水解酶突变体及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一种环氧化物水解酶突变体及其应用，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第108位异亮氨酸或第131位天冬氨酸或247位苏氨酸进行单突变、双突变或三突变获得的；本发明所述的环氧化物水解酶突变体与未突变的环氧化物水解酶相比，其酶活性、立体选择性及稳定性显著提高；其中，突变体较原始酶比酶活提高了5.4倍，达到315.2U/mg，半衰期提高了12.8倍，对映体选择性E值提高了2.1倍，环氧化物水解酶突变体在两相体系中，可催化拆分800mM外消旋环氧氯丙烷，R?环氧氯丙烷收率达到理论收率的90％以上，对映体选择性大于99％。

Description

一种环氧化物水解酶突变体及其应用
(一)技术领域
本发明涉及一种环氧化物水解酶，特别涉及一种突变环氧化物水解酶及其在R-环氧氯丙烷合成中的应用。
(二)背景技术
环氧化物水解酶(EC 3.3.2.3)是一类重要的工业用酶。环氧化物水解酶能立体选择性不对称水解外消旋环氧化物制备光学纯的环氧化物和邻二醇，能生产重要的医药中间体。环氧化物水解酶来源十分广泛，在细菌，丝状真菌，酵母，植物，动物等中均有发现。环氧化物水解酶催化过程不需要辅基和辅酶参与，且具有底物谱宽，催化效率高，对映体选择性高等优点，是目前研究和应用最为广泛的生物催化剂之一。大多数环氧化物水解酶属于α/β折叠型的酶，含有两个功能性的结构域(核心结构域和帽子结构域)，由α螺旋和β折叠组成。活性位点为亲核残基Asp、His和羧酸残基(Asp或Glu)，帽子结构域中至少存在一个Tyr在催化过程中提供质子。其催化反应机制为：第一步，天冬氨酸残基亲核攻击环氧化物上的环碳原子，形成共价酯中间体；第二步，另一天冬氨酸残基辅助组氨酸活化水分子，使酯中间体水解，释放出产物(如图1)。
环氧化物水解酶已被广泛应用，但许多催化反应特性需要进一步改进，从而建立可行的工业过程。蛋白质工程的目的是改变对底物特异性、活性、底物耐受性以及立体选择性。底物结构的变化会影响反应的立体和化学选择性。如果在应用过程中和其他的酶以及化学催化剂相结合，并且没有昂贵的分离费用，可以得到更广泛的应用。
手性环氧氯丙烷是非常重要的三碳手性合成砌块，在医药、农药、化工、材料等领域有非常广泛的应用。例如R-环氧氯丙烷是合成治疗心绞痛类药物，如美托洛尔、阿普洛尔等的关键手性中间体。S-环氧氯丙烷是目前临床上用量最大的降血脂药物、全球销售额达200亿美元的他汀类药物的起始原料之一。
近年来，随着生物柴油副产物甘油合成环氧氯丙烷技术的日益成熟及规模化应用，环氧氯丙烷市场价格持续走低。因此，以外消旋环氧氯丙烷为原料制备手性环氧氯丙烷已成为非常经济有效的制备途径之一。同时，由于生物拆分法具有立体选择性高和反应条件温和等优点，迄今，有不少研究者报道了利用生物催化拆分法制备光学纯的环氧氯丙烷。Choi等采用来自黑曲霉(Aspergillus niger)的环氧化物水解酶催化拆分ECH制备S-环氧氯丙烷，底物浓度60mmol/L，产率为20％，对映体过量值为100％。Kim等利用胶红酵母(Rhodotorula glutinis)的重组环氧化物水解酶催化拆分ECH制备R-环氧氯丙烷，底物浓度50mmol/L，R-环氧氯丙烷产率为26％，对映体过量值为100％。Woo等利用来自海洋新鞘氨醇杆菌(Novosphingobiumaromaticivorans)的环氧化物水解酶催化拆分ECH制备S-环氧氯丙烷，底物浓度500mmol/L，S-环氧氯丙烷产率为20.7％，对映体过量值大于99％。虽在利用环氧化物水解酶催化生产手性环氧氯丙烷方面已有一定的进展，由于已报道的环氧化物水解酶普遍活性较低，底物浓度不高，产率低，离实际应用尚有距离。因此，为达到工业应用的要求，在酶的催化活力和底物耐受性方面还需进一步提高。
(三)发明内容
本发明目的是通过定点突变和饱和突变的方法对环氧化物水解酶基因进行改造，使改造后的基因工程环氧化物水解酶在酶活性以及底物耐受性方面有所提高，使其符合在催化生产R-环氧氯丙烷工业化应用的需求。
本发明采用的技术方案是：
本发明提供一种环氧化物水解酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第108位异亮氨酸或第131位天冬氨酸或247位苏氨酸进行单突变、双突变或三突变获得的。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第131位天冬氨酸突变为丝氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。
进一步，所述突变体是将SEQ ID NO.6所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸或丝氨酸。
更进一步，本发明所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示；(2)将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示；(3)将SEQ ID NO.6所示氨基酸序列第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示；(4)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第247位苏氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQ IDNO.10所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示；(5)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示；(6)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示；(7)将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第247位苏氨酸突变为赖氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示，核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示。
本发明还涉及一种环氧化物水解酶突变体编码基因，及由所述环氧化物水解酶突变体编码基因构建的重组载体。
本发明提供一种由所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
此外，本发明还提供一种所述环氧化物水解酶突变体在立体选择性水解外消旋环氧氯丙烷制备R-环氧氯丙烷中的应用，以含环氧化物水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH 4-10的Tris-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，以外消旋环氧氯丙烷为底物，以pH为4-10的Tris-HCl缓冲液(优选pH为8.5、0.1M的Tris-HCl缓冲液)为反应介质，以异辛烷为助溶剂构成反应体系，在20-65℃、200-400rpm(优选35℃、200rpm)条件下反应，反应完全后，获得含R-环氧氯丙烷的混合液，将混合液分离纯化，获得R-环氧氯丙烷；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-10g/L(优选1-2g/L)，所述助溶剂体积终浓度为10-80％(优选30％)，所述底物用量以反应体系总体积计为50-1000mmol/L(优选600-800mmol/L)。
本发明所述湿菌体按如下方法制备：将含环氧化物水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：本发明所述的环氧化物水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.6、SEQ ID NO.8、SEQ ID NO.10、SEQ ID NO.12、SEQ ID NO.14、SEQ ID NO.16所示)与未突变的环氧化物水解酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)相比，其酶活性、立体选择性及稳定性显著提高。其中，突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示)较原始酶(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)比酶活提高了5.4倍，达到315.2U/mg，半衰期提高了12.8倍，对映体选择性E值提高了2.1倍，环氧化物水解酶突变体(氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示)在两相体系中(异辛烷：水＝3:7)，可催化拆分800mM外消旋环氧氯丙烷，R-环氧氯丙烷收率达到理论收率的90％以上，对映体选择性大于99％。
(四)附图说明
图1环氧化物水解酶催化机理。
图2为重组大肠杆菌原始菌和含突变体IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys的突变菌株的蛋白电泳图，泳道1为超声破碎后的混悬液，泳道2为纯蛋白，泳道3为标准蛋白。泳道1、2、3、4分别为IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys突变菌超声破碎后的混悬液、杂蛋白、纯蛋白(透析前)、纯蛋白(透析后)；泳道5、6、7分别为原始菌超声破碎后的混悬液、纯蛋白(透析前)、纯蛋白(透析后)。
图3为温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响。
图4为pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响。
图5为金属离子对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响。
图6为水相体系中底物浓度对BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响。
图7为有机溶剂含量对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys两相体系催化的影响。
图8为两相体系中底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响。
(五)具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
实施例1亲本环氧化物水解酶的基因合成
为了使亲本环氧化物水解酶的基因(GenBank:Y12804.1)连接到载体pET-28b后可以表达带有His-tag的蛋白，切除其终止密码子，并以E.coli的密码子偏好性为参照对其序列进行序列优化，并且在起始密码子处引入NcoI，从而在甲硫氨酸后插入甘氨酸。新设计的环氧化物水解酶基因的序列如SEQ ID NO.1所示(氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)，基因合成工作委托上海旭冠生物科技发展有限公司完成，基因合成后连接到表达载体pET-28b中。
实施例2突变体库的构建
以实施例1获得的SEQ ID NO.1所示核苷酸序列的亲本序列为模板，分别以下列三对核苷酸序列为引物进行PCR扩增，分别获得将108位异亮氨酸突变为亮氨酸的单突变体IIe108-Leu(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)、247位苏氨酸突变为赖氨酸的单突变体Thr247-Lys(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和131位天冬氨酸突变为丝氨酸的单突变体Asp131-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)。
七对寡聚核苷酸引物如下(5’-3’)：
Forward primer(108IIe)：GTAGGCCATGATNNKGCAGCGATCGTCC
Reverse primer(108IIe)：GGACGATCGCTGCNNKATCATGGCCTAC
Forward primer(247Thr)：ATCTGGGGTCTGGGCGACNNKTGCGTTCCATA
Reverse primer(247Thr)：TATGGAACGCANNKGTCGCCCAGACCCCAGAT
Forward primer(131Asp)：AGCTGCGATCTTTNNKCCGATCCAGCCG
Reverse primer(131Asp)：CGGCTGGATCGGNNKAAAGATCGCAGCT
表1 PCR反应体系
PCR程序设定为：95℃预变性5min；94℃变性30s，62℃退火30s，72℃延伸6min 30s，30个循环；72℃终延伸10min，4℃保藏。
PCR结束后，取20μL PCR产物经0.9％琼脂糖凝胶电泳检测。对检测结果为阳性的PCR产物，加入Dpn I，37℃酶切3h。
表2酶切反应体系
Dpn I 1μL
10×Buffer 2μL
DNA 10μL
ddH2O 7μL
Total 20μL
酶切结束后，酶切产物在恒温金属浴65℃灭活10min。转化大肠杆菌感受态BL 21(DE3)中，涂布于含50μg/mL Kan的LB平板上，37℃培养10～12h。
实施例3：突变体库的筛选
(1)突变体库的初筛
挑取实施例2培养的单菌落于含1mL LB培养液的96孔板中，加入Kan(终浓度50μg/mL)，37℃培养至OD600达到0.6～0.8，添加IPTG(终浓度0.1mM)，28℃诱导12h。9000rpm离心10min，去上清，获得菌体。挑取湿菌体，用1mL(pH 8.5、0.1M)的磷酸缓冲液重悬，制得菌悬液。反应于Ep管中进行，1mL体系中：900μl(pH 8.5、0.1M)的Tris-HCl缓冲液、100μL上述菌悬液、终浓度100mM环氧氯丙烷，温度35℃，转数1000rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，利用气相检测测定静息细胞的酶活性。初步获得具有潜力的突变菌株，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
(2)突变体库的复筛
将步骤(1)甘油管中保藏的突变菌株接种到50mL的LB液体培养基中(含50g/mL卡那霉素)，放入37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养过夜，再取1mL种子液转接到50mL的LB液体培养基(含50g/mL卡那霉素)中，在37℃、摇床转速为150rpm的条件下培养，当菌体的浓度OD600达到0.6-0.8的时候加入终浓度为0.5mM的IPTG。然后放入28℃，150rpm的摇床上培养8小时，离心收集菌体，再用0.85％的生理盐水洗菌体两次。利用气相色谱测定静息细胞的酶活性，获得单突变体。
(3)酶活的测定及酶活定义
称取按步骤(1)方法制备的静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mLTris-HCl缓冲液(pH 8.5、0.1M)中，获得菌悬液。反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系中：19mL(pH 8.5、0.1M)的Tris-HCl缓冲液、1mL菌悬液、终浓度100mM环氧氯丙烷，温度35℃，转数200rpm，反应5min，10μl(6M)HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。确定具有正向突变的重组大肠杆菌，保藏于甘油管中(甘油终浓度15％)。
环氧化物水解酶酶活是指样品在环氧氯丙烷浓度为100mM、反应介质为pH 8.5，0.1M Tris-HCl缓冲液，反应温度为35℃的条件下，每分钟从反应体系中消耗1μmol外消旋环氧氯丙烷所需的酶量，即为一个酶活单位，以U表示。
(4)气相检测方法
环氧氯丙烷气相检测方法：采用日本岛津气相色谱仪GC-14A，手性色谱柱BGB-175(30m×0.25mm×0.25μm)，氢离子火焰检测器。检测条件：进样器温度220℃，检测器温度220℃，柱温90℃，保留7min，载气为He，流量为1.6mL/min，分流比1:40。保留时间：S-ECH 5.04min，R-ECH 5.24min。
最终获得单突变体IIe108-Leu(核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示)，单突变体Thr247-Lys(核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示)和单突变体Asp131-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示)。
表3单突变体活力或稳定性参数测定结果
实施例4双/三突变体的获得
1.以SEQ ID No.3为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(247Thr)：GGGGTTTGGGAGATAAATGCGTGCCCTATGC
Reverse primer(247Thr)：GCATAGGGCACGCATTTATCTCCCAAACCCC
2.以SEQ ID No.3为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(131Asp)：CAAAGCAGCGATCTTTCCTATCCAGCCCGAC
Reverse primer(131Asp)：GTCGGGCTGGATAGGAAAGATCGCTGCTTTG
3.以SEQ ID No.5为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(131Asp)：CAAAGCAGCGATCTTTCCTATCCAGCCCGAC
Reverse primer(131Asp)：GTCGGGCTGGATAGGAAAGATCGCTGCTTTG
4.以SEQ ID No.9为突变模版，引物如下(5’-3’)：
Forward primer(131Asp)：CAAAGCAGCGATCTTTCCTATCCAGCCCGAC
Reverse primer(131Asp)：GTCGGGCTGGATAGGAAAGATCGCTGCTTTG
分别按照实施例2，3，获得双突变体IIe108-Leu/Thr247-Lys(核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.10所示)、双突变体IIe108-Leu/Asp131-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.11所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示)、双突变体Thr247-Lys/Asp131-Ser(核苷酸序列为SEQ ID NO.13所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示)、三突变体IIe108-Leu/Asp131-Ser/Thr247-Lys(核苷酸序列为SEQ ID NO.15所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示)，并将双/三突变体与pET-28b连接，转化大肠杆菌BL21(DE3)，获得相应的重组大肠杆菌。
表4双/三突变体菌株的酶活和稳定性参数
实施例5出发菌株和突变株催化环氧氯丙烷对比
将实施例3、4中构建的重组大肠杆菌、出发菌株(即含SEQ ID No.1的大肠杆菌BL21(DE3))、含pET-28b空载质粒的BL21(DE3)菌株和不含质粒的BL21(DE3)菌株，接种至50mL LB液体培养基中(含有卡那霉素40μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有40μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h。诱导培养10h后，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体(即静息细胞)作为转化用酶。
以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL、pH 8.5、0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：15mL、pH 8.5、0.1M的Tris-HCl缓冲液、5mL菌悬液、终浓度100mM外消旋环氧氯丙烷，温度35℃，转数200rpm，5min分钟后取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，用10μl 6M HCl终止反应，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。
表5原始菌株和突变株催化外消旋环氧氯丙烷的结果对比
实施例6重组大肠杆菌IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys的蛋白纯化及电泳
将实施例4中构建的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K，接种至50mL LB液体培养基中(含有卡那霉素40μg/mL)，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以2％(v/v)接种量接种到新鲜的含有40μg/mL卡那霉素的100mL LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h。诱导培养10h后，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。采用超声破碎方法对湿菌体进行超声破碎，制备获得无细胞抽提液(即超声破碎后的混悬液)，使用Ni-NTA琼脂糖凝胶柱进行纯化，使用洗脱液(50mM NaH2PO4·2H2O、300mM NaCl、300mM咪唑，pH 8.0)进行洗脱，收集纯蛋白，取20μL纯蛋白，加20μL SDS缓冲液混合，沸水浴加热5min，取8μL进行SDS-PAGE电泳分析。由图2可知目的蛋白大小在35KDa左右。
实施例7温度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响
将实施例6中诱导表达后的重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL、pH 8.5、0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL、pH8.5、0.1M的Tris-HCl缓冲液，1mL菌悬液、终浓度100mM外消旋环氧氯丙烷，温度20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图3可知，表达的环氧化物水解酶在35℃条件下具有最高催化效率。
实施例8pH对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH 8.5、0.1M Tris-HCl缓冲液中，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL 0.1M缓冲液(6.0柠檬酸缓冲液；pH 6.5、7.0磷酸缓冲液；pH 7.5、8.0、8.5Tris-HCl缓冲液；pH 9.0甘氨酸–氢氧化钠缓冲液)、1mL菌悬液、终浓度100mM环氧氯丙烷，温度35℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图4可知，表达的环氧化物水解酶在0.1M Tris-HCl缓冲液(pH 8.5)的条件下具有最高催化效率。
实施例9金属离子对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL、pH 8.5、0.1M Tris-HCl缓冲液，制成菌悬液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：18mL、pH 8.5、0.1M的Tris-HCl缓冲液、1mL菌悬液、1mL各种离子溶液(离子终浓度1mM，溶剂为去离子水，离子分别为：空白、Fe3+、Cu+、Ba2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、Mn2+、Al3+、EDTA、Ca2+、Cu2+、Zn2+、Fe2+)，终浓度100mM环氧氯丙烷，温度35℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应。取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图5可知，大部分金属离子对酶的催化能力没有促进作用，其中Co+，Ni+，Mn2+，Cu2+，Zn2+有较大的抑制作用，且环氧化物水解酶非金属依赖型。
实施例10底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys单水相系催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：静息细胞0.2g(湿重)，悬浮于10mL pH8.5 0.1M Tris-HCl缓冲液，反应于150mL规格的摇瓶中进行，20mL体系：19mL pH 8.5 0.1M的Tris-HCl缓冲液，1mL菌悬液，终浓度分别为50mM、100mM、200mM、250mM、300mM、370mM、400mM、450mM、500mM、550mM、600mM环氧氯丙烷，温度35℃，转数200rpm，反应5min，10μl 6M HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图6可知，表达的环氧化物水解酶在500mM底物浓度下具有最高的催化效率，当底物超过600mM将会受到较大的抑制。
实施例11有机溶剂含量对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys两相体系催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。具体操作如下：称取上述菌体1g(湿重)，在250mL反应釜中依次加入100mL、pH 8.5、0.1M Tris-HCl，异辛烷含量分别为10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％，终浓度100mM环氧氯丙烷，温度35℃，800rpm条件下反应3min，10μl 6M HCl终止反应，取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图7可知，表达的环氧化物水解酶在30％异辛烷的条件下具有最高的比活力。
实施例12底物浓度对重组大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-IIe108Leu/Asp131Ser/Thr247Lys两相体系催化的影响
将实施例6中诱导表达后的大肠杆菌BL21(DE3)/pET-28b-I108L/D131S/T247K湿菌体作为转化用酶，以外消旋环氧氯丙烷为底物，进行转化反应生产R-环氧氯丙烷。称取上述菌体1g(湿重)，在250mL反应釜中依次加入80mL、pH 8.5、0.1M Tris-HCl，终浓度分别为600mM、800mM、850mM、900mM、1000mM环氧氯丙烷，30mL异辛烷(体积终浓度30％)，温度35℃，800rpm条件下反应15min，每隔3分钟取200μl反应液于800μl乙酸乙酯中萃取，8000rpm离心5min，取上层萃取液600μl加入少量无水硫酸钠去除可能存在水分，气液相色谱仪检测R-环氧氯丙烷的浓度。由图8可知，表达的环氧化物水解酶最高可以耐受800mM的底物浓度，此时R-环氧氯丙烷对映体过量值>99％。

Claims (10)

1.一种环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的第108位异亮氨酸或第131位天冬氨酸或247位苏氨酸进行单突变、双突变或三突变获得的。
2.如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸、丙氨酸或缬氨酸。
3.如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第131位天冬氨酸突变为丝氨酸、谷氨酸或谷氨酰胺。
4.如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.6所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸或丝氨酸。
5.如权利要求1所述环氧化物水解酶突变体，其特征在于所述突变体为下列之一：(1)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.4所示；(2)将SEQ ID NO.4所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.6所示；(3)将SEQ ID NO.6所示氨基酸序列第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.8所示；(4)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第247位苏氨酸突变为赖氨酸，氨基酸序列为SEQID NO.10所示；(5)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.12所示；(6)将SEQ IDNO.2所示氨基酸序列第247位苏氨酸突变为赖氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.14所示；(7)将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第108位异亮氨酸突变为亮氨酸，同时将第247位苏氨酸突变为赖氨酸，同时将第131位天冬氨酸突变为丝氨酸，氨基酸序列为SEQ ID NO.16所示。
6.一种由权利要求1-5之一所述环氧化物水解酶突变体编码基因构建的重组载体。
7.一种由权利要求6所述重组载体转化制备的重组基因工程菌。
8.一种权利要求1-5之一所述环氧化物水解酶突变体在拆分外消旋环氧氯丙烷制备R-环氧氯丙烷中的应用。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于所述的应用为：以含环氧化物水解酶突变体编码基因的重组工程菌经诱变培养获得的湿菌体用pH 4-10的Tris-HCl缓冲液悬浮制成的菌悬液为酶源，以环氧氯丙烷为底物，以pH为4-10的Tris-HCl缓冲液为反应介质，以异辛烷为助溶剂构成反应体系，在20-65℃、200-400rpm条件下反应，反应完全后，获得含R-环氧氯丙烷的混合液，将混合液分离纯化获得R-环氧氯丙烷；所述湿菌体的用量以反应体系总体积计为1-10g/L，所述助溶剂体积终浓度为10-80％，所述底物用量以反应体系总体积计为50-1000mmol/L。
10.如权利要求9所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含环氧化物水解酶突变体编码基因的重组工程菌接种至含终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养到OD600＝0.6～0.8；培养液以体积浓度2％接种量接种到新鲜的含有终浓度40μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃、150rpm/min振荡培养至菌体浓OD600＝0.6～0.8，加入终浓度0.5mM的IPTG，28℃、150rpm/min诱导培养10h，于4℃、9000rpm/min离心10min，收集湿菌体。
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