CN111647588A

CN111647588A - 一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用

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Publication number: CN111647588A
Application number: CN202010441393.5A
Authority: CN
Inventors: 汤晓玲; 万欣雨; 郑仁朝; 郑裕国
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2020-05-22
Filing date: 2020-05-22
Publication date: 2020-09-11
Anticipated expiration: 2040-05-22
Also published as: CN111647588B; CN114317508A; CN114317508B

Abstract

本发明公开了一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第105位、第134位、第136位、第137位、第178位或第186位进行单突变或多突变获得。本发明利用水‑有机双相缓冲溶液体系(乙酸乙酯：磷酸钠缓冲液＝6:4)使得卤醇脱卤酶突变体的产物(S)‑环氧氯丙烷的e.e.值超过99％，湿细胞酶活分别从23.56U/mL提高至100‑600U/mL，产率达15.9％‑80.2％。

Description

一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用

(一)技术领域

本发明涉及一种卤醇脱卤酶突变体，以及其在制备(S)-环氧氯丙烷中的应用。

(二)背景技术

卤代醇化合物作为医药化工等领域的重要中间体，在有机合成与医药研发等方面具有广泛的应用，然而自然界中大部分卤化物因其降解能力较差、毒性大和潜在的致癌性等缺点，已成为主要的环境污染物之一，因此人们越来越重视对其的降解处理以期减轻该类有机卤化物对自然环境的污染和对人类潜在的威胁。利用传统的物理化学方法不仅反应条件苛刻，而且很有可能带来二次污染，而利用生物降解方法具有环境无污染、反应条件温和；常温、常压、中性、或者接近中性pH等、反应步骤简单、产物易分离并且在操作过程中对设备性能要求不高，投入资金相对较少，生产过程安全等突出优点，已成为目前卤代化合物降解的主要发展趋势。

在微生物中发现了一系列能降解这类有毒物质的酶，其中一种关键的酶就是卤醇脱卤酶。卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenase，EC 4.5.1.X，简称HHDH)是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶，可以高效高选择性的催化环氧化物和邻卤醇之间的转化，因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物，具有传统化学合成法无法比拟的优越感。

卤醇脱卤酶不仅可以催化碳-卤键的断裂，形成环氧化物，同时还可以进行相应的逆反应，并且在非自然亲核试剂的存在下，例如N3-、CN-、NO2-、SCN-、OCN-和HCOO-等，催化环氧化物的开环，形成一系列新的C-C、C-O和C-N键等，这为制备各类光学纯的β-取代醇和环氧化物提供了一个高效经济环保的方法，在药物研发和有机合成等方面具有较高的应用价值。自1968年Castro首次在以2,3-二溴丙醇作为唯一的碳源而生存的黄杆菌属(Flavobaterium sp.)菌株中发现后科学家们陆陆续续发现了多种卤醇脱卤酶。到目前为止，部分已知的卤醇脱卤酶已被克隆、测序及进行体外重组表达研究。近年来，随着生物信息学的发展，对卤醇脱卤酶的研究逐渐加深。在卤醇脱卤酶催化合成手性环氧氯丙烷(ECH)合成过程中，因其催化效率低、立体选择性不高，且当前在卤醇脱卤酶催化反应的过程中，由于手性ECH存在消旋或降解，导致产物光学纯度低，从而限制了其应用与工业化生产。

(三)发明内容

本发明所要解决的问题是克服现有方法中卤醇脱卤酶催化的e.e.值不高及产物消旋等问题，提供了一种来源于放射性农杆菌的卤醇脱卤酶突变体及以该突变体在双相缓冲溶液中制备高产率和e.e.值的(S)-ECH的应用。为了更好的实现卤醇脱卤酶工业化生产应用，本发明通过对酶活性中心及Loop环附近的关键氨基酸进行改造，获得了能够在双相缓冲溶液中(有机相：水相＝6:4)催化底物1,3-DCP得到高立体选择性和高产率的突变体。

本发明采用的技术方案是：

本发明提供一种卤醇脱卤酶突变体，所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第105位、第134位、第136位、第137位、第178位或第186位进行单突变或多突变获得。

进一步，所述卤醇脱卤酶突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第105位的亮氨酸突变为天冬氨酸(L105N)、第134位丙氨酸突变为亮氨酸(A134L)、第136位脯氨酸突变为天冬酰胺(P136N)、第137位苯丙氨酸突变为丝氨酸(F137S)、第178位酪氨酸突变为蛋氨酸(Y178M)、第186位酪氨酸突变为天冬酰胺(Y186N)、第136位脯氨酸突变为天冬酰胺且第137位苯丙氨酸突变为丝氨酸(P136N/F137S)。

本发明还涉及所述卤醇脱卤酶突变体编码基因构建的重组载体及重组载体转化制备的重组基因工程菌。本发明的重组载体没有限制，只要其可以在原核和/或真核细胞的各种宿主细胞中保持其复制或自主复制，所述载体可为本领域常规的各种载体，如各种质粒、噬菌体或病毒载体等，优选以pET28a(+)质粒为表达载体，以大肠杆菌为表达宿主(大肠杆菌BL21细胞或大肠杆菌DH5α)。

本发明还提供一种所述卤醇脱卤酶突变体在催化1,3-二氯-2-丙醇(1,3-DCP)合成(S)-环氧氯丙烷((S)-ECH)中的应用，所述的应用方法为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 7.0-10.0(优选pH 8.0)的水-有机溶剂双相体系为反应介质构成反应体系，在300-700rpm(优选为600rpm)，37℃条件下进行反应，反应结束后，获得含(S)-环氧氯丙烷的反应液，将反应液分离纯化，获得(S)-环氧氯丙烷；所述水-有机溶剂双相体系是由体积比6:4的乙酸乙酯和200mM、pH 8.0磷酸钠缓冲液组成。

进一步，所述催化剂用量以湿菌体的重量计为10-40g/L缓冲液(优选20g/L)，所述底物初始加入浓度为10-80mM(优选20mM)。

进一步，所述湿菌体按如下方法制备：将含有卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组工程菌接种到含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养约1.5-2.5h，使得菌体浓度度OD₆₀₀为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1-1.0mM(优选0.1mM)的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，28℃诱导表达12h后，4℃、4000rpm离心10-20min，收集湿菌体；LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 8.0。

本发明所述的卤醇脱卤酶突变体可以以全细胞形式完成催化，也可以通过细胞破碎的粗酶液或者完全破碎的纯酶进行催化。此外，还可以利用特定的固定化技术将卤醇脱卤酶制备成固定化酶或者固定化细胞形式的酶。

与现有技术相比，本发明有益效果主要体现在：

本发明分别利用定向进化和半理性设计方法对来源于放射性农杆菌的卤醇脱卤酶HheC进行改造，发现第105位、第134位、第136位、第137位、第176位、第186位是影响酶活的关键位点：分别对这三个位点利用定点饱和技术，通过96孔板筛选的到6个单突变体，L105N、A134L、P136N、F137S、Y178M、Y186N的比酶活分别为251.19U/mL、176.86U/mL、507.19U/mL，613.45U/mL、478.63U/mL，109.37U/mL，是原始酶的10.7倍、7.5倍、21.5倍、26.0倍、20.3倍、4.6倍。

本发明还将所获得6个突变位点进行两两随机组合，筛选得到突变体P136N/F137S的比酶活为481.52U/mL，是原始酶活的20.4倍。

本发明利用水-有机双相缓冲溶液体系(乙酸乙酯：磷酸钠缓冲液＝6:4)使得卤醇脱卤酶突变体的产物(S)-环氧氯丙烷的e.e.值超过99％，湿细胞酶活分别从23.56U/mL提高至100-600U/mL，产率达15.9％-80.2％。

本发明卤醇脱卤酶突变体是在SEQ ID NO.2所示的野生型卤醇脱卤酶HheC的氨基酸基础上，通过定点饱和突变的方法进行改造的，从而改变其氨基酸序列，实现蛋白结构和功能的改变，再通过定向筛选的方法，得到其有上述突变的卤醇脱卤酶突变体，本发明的卤醇脱卤酶突变体具有酶活性大幅度提高的优势，其酶活相对于野生型卤醇脱卤酶HhecC提高了多倍，从而更有利于实现工业化生产。

(四)附图说明

图1是底物1,3-DCP的三维结构图。

图2是催化产物经气相检测之后的色谱图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：

LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH8.0。

LB平板是在LB液体培养基添加15g/L琼脂。

实施例1：对卤醇脱卤酶进行同源建模和分子动力学模拟

以GenBank AAK92099中来源于放射性农杆菌(AgrobacteriumradiobacterstrainAD1)的HheC(PDB ID:1ZO8)三维结构为模板，采用ChemDraw 8.1绘制了1,3-dcp的三维结构，通过分子对接程序按照AutoDock 4.6.2程序对HheC和底物1,3-dcp进行对接。以上所有结构均采用PyMOL程序进行可视化分析，发现第105位、第134位、第136位、第137位、第178位、第186位是影响酶活的关键位点(图1)。

实施例2：卤醇脱卤酶定点饱和文库的构建

根据实施例1结论，以GenBank中收录的野生型卤醇脱卤酶HheC的基因序列(核苷酸序列为SEQ ID NO.1所示，氨基酸序列为SEQ ID NO.2所示)为基础设计引物(见表1)。分别以引物L105X-F/L105X-R、A134X-F/A134X-R、P136X-F/P136X-R、F137X-F/F137X-R、Y178X-F/Y178X-R、T186X-F/T186X-R对亲本HheC基因(核苷酸序列为SEQ ID NO.1)，进行定点饱和突变，以pET-28b(+)为表达载体，分别获得带有目的基因的突变质粒，并将带有目的基因的突变质粒转化至E.coli BL21(DE3)中，分别获得含卤醇脱卤酶突变基因的重组菌的突变体，分别为E.coli BL21(DE3)-L105X(记为突变体L105X)、E.coli BL21(DE3)-A134X(记为突变体A134X)、E.coli BL21(DE3)-P136X(记为突变体P136X)、E.coli BL21(DE3)-F137X(记为突变体F137X)、E.coli BL21(DE3)-Y178X(记为突变体Y178X)、E.coliBL21(DE3)-Y186X(记为突变体Y186X)。

SEQ ID NO.2：

MASTAIVTNVKHFGGMGSALRLSEAGHTVACHDESFKQKDELEAFAETYPQLKPMSEQEPAELIEAVTSAYGQVDVLVSNDIFAPEFQPIDKYAVEDYRGAVEALQIRPFALVNAVASQMKKRKSGHIIFITSATPFGPWKELSTYTSARAGACTLANALSKELGEYNIPVFAIGSNYLHSEDSPYFYPTEPWKTNPEHVAHVKKVTALQRLGTQKELGELVAFLASGSCDYLTGQVFWLAGGFPMIERPPGMPELE。

表1：卤醇脱卤酶定点饱和突变文库构建的引物设计表

PCR扩增体系为：50μL反应体系：

2×phantamax Buffera:25μL；

dNTP Mix(10Mm each):1μL；

上游引物(50μM)：2μL；

下游引物(50μM)：2μL；

Phanta Max super-Fidelity DNA Polymerase:1μL；

模板DNA(质粒)：0.5μL；

ddH₂O：18.5μL；

PCR反应条件为：预变性95℃10min，随后进入温度循环95℃30s，55℃30s，72℃6min，共30个循环，最后72℃延伸10min，终止温度为4℃。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳分析验证后，在PCR产物中加入1μL DpnI、5μL buffer，37℃消化2h去除模板质粒DNA，在65℃灭活10min后采用PCR cleanup Kit对产物进行纯化后，转化至E.coli BL21(DE3)感受态细胞，涂布含卡那霉素(50μg/mL)的LB平板，37℃培养过夜，得到卤醇脱卤酶的突变文库，此时LB平板上呈现出许多不同突变的单菌落，这些单菌落用于后续的突变文库的筛选。

同样方法构建亲本菌株：E.coli BL21(DE3)-HheC。

实施例3：卤醇脱卤酶突变文库的筛选

1、卤醇脱卤酶突变文库的筛选以突变前野生型HheC为参考，挑取单菌落克隆子(由实施例2构建的突变文库)至2mL深96孔板中进行培养，事先加入含终浓度50μg/mL卡那霉素的600μL的LB培养液，同时挑取2个亲本菌株在96孔板的最后2个孔中作为对照。将2mL的96孔板置于37℃条件下培养8h作为种子液，然后取200μL种子液加入新的无菌的含有终浓度50μg/mL卡那霉素及0.1mM的IPTG的600μL的LB培养液中，含有种子液的28℃诱导表达12h后，4000rpm离心20min，弃上清，收集湿菌体，进行下一步的高通量筛选。

2、根据卤醇脱卤酶催化反应的特点，高通量筛选的方法可通过检测反应体系中H+的浓度来对酶的活性进行测定，卤醇脱卤酶在催化邻卤醇形成环氧化物的同时，会释放1分子的H+，可以在反应缓冲液体系中加入pH指示剂，根据pH指示剂的颜色的变化，因定性或定量卤醇脱卤酶的活性。另外一种方法是对卤醇脱卤酶反应中生成的氯离子进行定量分析。

优选的，本实施例根据pH指标为基础的比色反应在水-有机缓冲体系中更易筛选出高活性和对映体选择性的阳性菌，具体为：

步骤1中的96孔板离心收集的湿菌体在每孔中加入200μL的PB缓冲液(pH＝8.0、200mM)制成细胞悬浮液。比色反应在96孔石英板中进行，反应体系为200μL：80μL的细胞悬浮液，终浓度20mM 1,3-DCP及终浓度0.09mg/ml溴百里香酚蓝，以体积比6:4的乙酸乙酯和磷酸钠缓冲液(200mM、pH＝8.0)补足至200μL，混合后，在37℃条件下保温20min，反应相同时间，根据反应液的颜色(由蓝色到黄色)的变化速度确定卤醇脱卤酶的酶活。在步骤1筛菌过程中，每个突变位点构成的突变文库共筛约400个单菌落，在6个突变位点构成的突变文库中通过高通量筛选的方法共筛选2400个单菌落，在相同时间内，根据pH指示剂的颜色变化快慢及深浅，与亲本HheC对照组进行比较发现，酶活比亲本酶活高的反应液的颜色比亲本反应液所呈现的颜色更黄，从而初筛获得7个活性较高的含卤醇脱卤酶突变基因的重组菌的突变体，经过测序得到分别为E.coli BL21(DE3)-L105N(记为突变体L105N，核苷酸序列为SEQ ID NO.3所示)、E.coli BL21(DE3)-A134L(记为突变体A134L，核苷酸序列为SEQID NO.4所示)、E.coli BL21(DE3)-P136N(记为突变体P136N，核苷酸序列为SEQ ID NO.5所示)、E.coli BL21(DE3)-F137S(记为突变体F137S，核苷酸序列为SEQ ID NO.6所示)、E.coli BL21(DE3)-Y178M(记为突变体Y178M，核苷酸序列为SEQ ID NO.7所示)、E.coliBL21(DE3)-Y186N(记为突变体Y186N，核苷酸序列为SEQ ID NO.8所示)。

实施例4：卤醇脱卤酶双突变体的构建

将通过高通量筛选获得的6个卤醇脱卤酶突变体L105N、突变体A134L、突变体P136N、突变体F137S、突变体Y178M、突变体Y186N进行两两组合构建卤醇脱卤酶双突变文库，两两组合共构建15种可能的双突变文库，PCR反应条件及构建方法同实施例2，双突变文库的初筛方法同实施例3，在实施例3的筛菌过程中，每个双突变文库共筛约400个单菌落，在构建的15种可能的双突变文库中共筛约6000个单菌落，在相同时间内，根据pH指示剂的颜色变化快慢及深浅，与亲本HheC对照组进行比较发现，酶活比亲本酶活高的反应液的颜色比亲本反应液所呈现的颜色更黄，从而获得1个活性较高的双突变体，经过测序得到E.coli BL21(DE3)-P136N/F137S(记为突变体P136N/F137S，核苷酸序列为SEQ ID NO.9所示)。

实施例5：含卤醇脱卤酶及其突变体的重组菌菌体的制备

分别将实施例3和实施例4筛选的突变体菌株接种到含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养12h，获得种子液；在以体积浓度为2％的接种量将新鲜的种子液接种到新鲜的含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养约1.5-2.5h，使得菌体浓度度OD₆₀₀为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)，在28℃诱导表达12h后，4℃、8000rpm离心10min，收集重组细胞湿菌体，用于催化1,3-DCP不对称脱卤反应所需要的湿菌体。

亲本湿菌体制备方法及条件同突变体湿菌体。

实施例6：卤醇脱卤酶不对称催化合成(S)-ECH的活性比较

卤醇脱卤酶酶活单位(U)定义：在37℃、pH 8.0条件下，1min内催化底物(1,3-DCP)生成1mmoL产物手性环氧氯丙烷所需要的菌体量定义为1U。

反应体系：终浓度20mM 1,3-DCP，终浓度20g/L的实施例5制备的湿菌体，0.2M、pH8.0磷酸盐缓冲液与乙酸乙酯以体积比6:4混合液为反应介质10mL构成反应体系。在37℃，600rpm反应30min，取500μL反应液加入1mL乙酸乙酯的进行萃取，12000rpm离心1min，取有机相用无水硫酸钠干燥后，气相检测手性环氧氯丙烷产物峰面积以及残留底物1,3-dcp峰面积(图2)，通过产物和底物的标准曲线计算产物生产量和底物消耗量，根据酶活定义，进行酶活的计算。产物(S)-ECH标准曲线方程为：Y＝15.103X-0.5779(R²＝0.9993)；(R)-ECH标准曲线方程为：Y＝15.334X-0.9597(R²＝0.9984)；底物1,3-dcp标准曲线方程为：Y＝14.869X+9.6286(R²＝0.9919)。

手性环氧氯丙烷的检测方法：采用Agilent GC-7890A系统，色谱柱类型：BGB-175毛细管柱，色谱条件：柱温90℃，进样室温度220℃，FID检测器220℃。

计算(S)-ECH的对映体过剩(e.e.)为[e.e.(％)＝(S-R)/(S+R)×100]，其中S为(S)-ECH的产率，R为(R)-ECH的产率。所有实验数据均来自三次重复实验。

结果见表2，其酶活分别从23.56U/mL提高至100-600U/mL，(S)-ECH的e.e.值从70％提高至>99％。

表2：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的酶活及e.e.值比较

实施例7：卤醇脱卤酶不对称催化合成(S)-ECH

由于卤醇脱卤酶在水相中催化反应易发生消旋和水解反应，本实施例采用乙酸乙酯和磷酸钠缓冲液(200mM、pH＝8.0)体积比为6:4的两相体系作为反应介质，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以实施例5方法制备的湿菌体为催化剂进行(S)-ECH生物合成的不对称反应，具体如下：

1)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为10mM的底物，终浓度10g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min，取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表3。

表3：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

2)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为20mM的底物，终浓度10g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min；取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表4。

表4：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

3)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为20mM的底物，终浓度20g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min；取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表5。

表5：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

4)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为30mM的底物，终浓度20g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min；取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表6。

表6：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

5)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为40mM的底物，终浓度20g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min；取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表7。

表7：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

6)反应体系：反应介质10mL，加入终浓度为80mM的底物，终浓度40g/L催化剂组成反应体系，在37℃，600rpm的条件下反应30min；取500μL反应液加1mL乙酸乙酯稀释，12000rpm离心3min，收集上清，经无水硫酸钠干燥后气相分析(检测方法同实施例6)，结果见表8。

表8：卤醇脱卤酶突变体催化合成(S)-ECH的产率比较

最终，优选的底物浓度为20mM，催化剂用量为20g/L湿菌体，优选突变株为P136N，F137S，Y178M，P136N/F137S。

由于在水相中，卤醇脱卤酶催化合成(S)-ECH过程中，易发生产物自身降解和HHDH的外消旋问题，考虑到工业化生产应用，所以经过筛选得到的突变体，采用水-有机双相缓冲溶液作为反映介质，一方面解决产物在水相中发生自水解问题，另一方面通过改造设计的酶在水-有机双相缓冲溶液以消除外消旋化副反应。

本发明不受上述具体文字描述的限制。本发明可在权利要求书所概括的范围内作各种改变，这些改变均在本发明的范围之内。

序列表

<110> 浙江工业大学

<120> 一种卤醇脱卤酶突变体及其在合成手性环氧氯丙烷中的应用

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 1

atggcttcta ccgctattgt gactaacgta aagcatttcg gtggcatggg ctctgcgctg 60

cgtctgtctg aagctggtca cactgttgct tgccatgacg aaagcttcaa acagaaagat 120

gaactggaag ctttcgcgga aacttatcct cagctgaaac cgatgtctga acaggaaccg 180

gctgaactga ttgaagctgt gacctctgcc tacggccaag ttgacgtcct ggtgtccaac 240

gatattttcg cgccggaatt ccagccgatc gataaatatg ctgtggaaga ttaccgtggt 300

gctgtcgaag ctctgcagat ccgcccattt gcactggtta acgcggtggc ttcccagatg 360

aagaaacgta aatctggcca catcatcttc attacctctg caactccatt cggtccgtgg 420

aaagaactgt ccacttatac ttccgcccgt gctggcgctt gcactctggc aaacgcgctg 480

tccaaagagc tgggcgaata caacattccg gttttcgcga tcggttcgaa ctacctgcac 540

tctgaagaca gcccgtactt ctacccgacc gaaccgtgga aaactaaccc ggaacacgtg 600

gcgcacgtaa aaaaggttac cgcactgcag cgtctgggta cccaaaaaga actgggcgaa 660

ctggttgcgt tcctggcatc tggttcctgt gattacctga ccggtcaagt cttttggctg 720

gcaggtggct tcccgatgat cgaacgtccg ccgggtatgc cggaactcga gtga 774

<210> 2

<211> 257

<212> PRT

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 2

Met Ala Ser Thr Ala Ile Val Thr Asn Val Lys His Phe Gly Gly Met

1 5 10 15

Gly Ser Ala Leu Arg Leu Ser Glu Ala Gly His Thr Val Ala Cys His

20 25 30

Asp Glu Ser Phe Lys Gln Lys Asp Glu Leu Glu Ala Phe Ala Glu Thr

35 40 45

Tyr Pro Gln Leu Lys Pro Met Ser Glu Gln Glu Pro Ala Glu Leu Ile

50 55 60

Glu Ala Val Thr Ser Ala Tyr Gly Gln Val Asp Val Leu Val Ser Asn

65 70 75 80

Asp Ile Phe Ala Pro Glu Phe Gln Pro Ile Asp Lys Tyr Ala Val Glu

85 90 95

Asp Tyr Arg Gly Ala Val Glu Ala Leu Gln Ile Arg Pro Phe Ala Leu

100 105 110

Val Asn Ala Val Ala Ser Gln Met Lys Lys Arg Lys Ser Gly His Ile

115 120 125

Ile Phe Ile Thr Ser Ala Thr Pro Phe Gly Pro Trp Lys Glu Leu Ser

130 135 140

Thr Tyr Thr Ser Ala Arg Ala Gly Ala Cys Thr Leu Ala Asn Ala Leu

145 150 155 160

Ser Lys Glu Leu Gly Glu Tyr Asn Ile Pro Val Phe Ala Ile Gly Ser

165 170 175

Asn Tyr Leu His Ser Glu Asp Ser Pro Tyr Phe Tyr Pro Thr Glu Pro

180 185 190

Trp Lys Thr Asn Pro Glu His Val Ala His Val Lys Lys Val Thr Ala

195 200 205

Leu Gln Arg Leu Gly Thr Gln Lys Glu Leu Gly Glu Leu Val Ala Phe

210 215 220

Leu Ala Ser Gly Ser Cys Asp Tyr Leu Thr Gly Gln Val Phe Trp Leu

225 230 235 240

Ala Gly Gly Phe Pro Met Ile Glu Arg Pro Pro Gly Met Pro Glu Leu

245 250 255

Glu

<210> 3

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 3

atggcttcta ccgctattgt gactaacgta aagcatttcg gtggcatggg ctctgcgctg 60

cgtctgtctg aagctggtca cactgttgct tgccatgacg aaagcttcaa acagaaagat 120

gaactggaag ctttcgcgga aacttatcct cagctgaaac cgatgtctga acaggaaccg 180

gctgaactga ttgaagctgt gacctctgcc tacggccaag ttgacgtcct ggtgtccaac 240

gatattttcg cgccggaatt ccagccgatc gataaatatg ctgtggaaga ttaccgtggt 300

gctgtcgaag ctaatcagat ccgcccattt gcactggtta acgcggtggc ttcccagatg 360

aagaaacgta aatctggcca catcatcttc attacctctg caactccatt cggtccgtgg 420

aaagaactgt ccacttatac ttccgcccgt gctggcgctt gcactctggc aaacgcgctg 480

tccaaagagc tgggcgaata caacattccg gttttcgcga tcggttcgaa ctacctgcac 540

tctgaagaca gcccgtactt ctacccgacc gaaccgtgga aaactaaccc ggaacacgtg 600

gcgcacgtaa aaaaggttac cgcactgcag cgtctgggta cccaaaaaga actgggcgaa 660

ctggttgcgt tcctggcatc tggttcctgt gattacctga ccggtcaagt cttttggctg 720

gcaggtggct tcccgatgat cgaacgtccg ccgggtatgc cggaactcga gtga 774

<210> 4

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 4

atggcttcta ccgctattgt gactaacgta aagcatttcg gtggcatggg ctctgcgctg 60

cgtctgtctg aagctggtca cactgttgct tgccatgacg aaagcttcaa acagaaagat 120

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<210> 5

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 5

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tctgaagaca gcccgtactt ctacccgacc gaaccgtgga aaactaaccc ggaacacgtg 600

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gcaggtggct tcccgatgat cgaacgtccg ccgggtatgc cggaactcga gtga 774

<210> 6

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 6

atggcttcta ccgctattgt gactaacgta aagcatttcg gtggcatggg ctctgcgctg 60

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<210> 7

<211> 774

<212> DNA

<213> 放射性农杆菌(Agrobacterium radiobacter)

<400> 7

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<210> 8

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<212> DNA

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<400> 8

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<210> 9

<211> 774

<212> DNA

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<400> 9

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tctgaagaca gcccgtactt ctacccgacc gaaccgtgga aaactaaccc ggaacacgtg 600

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ctggttgcgt tcctggcatc tggttcctgt gattacctga ccggtcaagt cttttggctg 720

gcaggtggct tcccgatgat cgaacgtccg ccgggtatgc cggaactcga gtga 774

Claims

1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于所述突变体是将SEQ ID NO.2所示氨基酸序列第105位、第134位、第136位、第137位、第178位或第186位进行单突变或多突变获得。

2.如权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体，其特征在于所述卤醇脱卤酶突变体是将SEQID NO.2所示氨基酸序列第105位的亮氨酸突变为天冬氨酸、第134位丙氨酸突变为亮氨酸、第136位脯氨酸突变为天冬酰胺、第137位苯丙氨酸突变为丝氨酸、第178位酪氨酸突变为蛋氨酸、第186位酪氨酸突变为天冬酰胺或者第136位脯氨酸突变为天冬酰胺且第137位苯丙氨酸突变为丝氨酸。

3.一种权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因构建的重组基因工程菌。

4.一种权利要求1所述卤醇脱卤酶突变体在催化1,3-二氯-2-丙醇合成(S)-环氧氯丙烷中的应用。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用的方法为：以含卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组基因工程菌经发酵培养获得的湿菌体作为催化剂，以1,3-二氯-2-丙醇为底物，以pH 7.0-10.0的水-有机溶剂双相体系为反应介质构成反应体系，在300-700rpm，37℃条件下进行反应，反应结束后，获得含(S)-环氧氯丙烷的反应液，将反应液分离纯化，获得(S)-环氧氯丙烷；所述水-有机溶剂双相体系是由体积比6:4的乙酸乙酯和200mM、pH 8.0磷酸钠缓冲液组成。

6.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述催化剂用量以湿菌体的重量计为10-40g/L缓冲液，所述底物初始加入浓度为10-80mM。

7.如权利要求5所述的应用，其特征在于所述湿菌体按如下方法制备：将含有卤醇脱卤酶突变体编码基因的重组工程菌接种到含有终浓度为50μg/mL卡那霉素的LB培养液中，在37℃条件下培养8h，获得种子液；然后将种子液以体积浓度2％的接种量接种至无菌的含有终浓度50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，在37℃条件下培养约1.5-2.5h，使得菌体浓度度OD₆₀₀为0.4-0.8，再向培养液中加入终浓度为0.1-1.0mM的异丙基硫代-β-D-半乳糖苷，28℃诱导表达12h后，4℃、4000rpm离心10-20min，收集湿菌体；LB液体培养基：蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，氯化钠10g/L，溶剂为去离子水，pH 8.0。