CN109295044A

CN109295044A - 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

Info

Publication number: CN109295044A
Application number: CN201811254973.2A
Authority: CN
Inventors: 吴坚平; 王露; 徐刚; 杨立荣
Original assignee: Zhejiang University ZJU
Current assignee: Zhejiang University ZJU
Priority date: 2018-10-26
Filing date: 2018-10-26
Publication date: 2019-02-01

Abstract

本发明公开了一种卤醇脱卤酶突变体及其应用，该突变体为下列中的一种或多种；第84位精氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或天冬酰胺；第88位精氨酸替换为亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；第136位缬氨酸替换为苏氨酸或丝氨酸；第144位天冬酰胺替换为半胱氨酸、组氨酸或苏氨酸。本发明分别利用定向进化和半理性设计方法对卤醇脱卤酶HheA_AM进行改造，发现84位、88位、136位、144位影响酶活；利用迭代饱和突变策略对4个关键位点进行组合突变，以及组合活性位点饱和实验策略对4个关键位点进行随机组合突变，筛选得到最优突变体的比酶活为801.59U·g^‑1，是原始酶的12倍。

Description

一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

技术领域

本发明涉及分子生物学与生物技术领域，尤其涉及一种卤醇脱卤酶突变体及其应用。

背景技术

2017年，柳叶刀杂志公布了2016年造成最多死亡人数的三类死因，心脑血管疾病已成为导致人类死亡的首要原因。

他汀类药物过去多用于调节血脂治疗，而后发现它还具有抗炎、改善动脉内皮功能、抑制心肌重塑、稳定粥样硬化斑块等作用，可用于治疗和预防心脑血管疾病。其中，阿托伐他汀钙是一种比较经典且有效的他汀类药物，而(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯是阿托伐他汀钙合成过程中的关键手性砌块。

卤醇脱卤酶(Halohydrin dehalogenases，EC 4.5.1.X)，又名卤醇环氧化酶或卤代醇-卤化氢裂解酶。卤醇脱卤酶不仅能催化邻卤醇中碳卤键的断裂生成环氧化物并释放卤素离子，也能催化多种离子亲核试剂(如X-、N3^-、NO₂ ^-、CN^-、SCN^-、OCN^-、HCOO^-等)选择性进攻环氧化物的β-碳氧键开环生成一系列光学纯的β-取代醇。

(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯可由(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯经脱卤氰化反应制备，传统化学合成过程中的碱性环境会造成底物自发水解，导致产物收率低，而利用卤醇脱卤酶催化该反应，反应条件温和，副反应少，极具应用潜力。

现有研究存在的主要问题是卤醇脱卤酶种类少，针对底物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的酶活很低。2013年，陈少云等首先利用卤醇脱卤酶HHDH催化该反应，之后王金玉等对此HHDH进行分子改造得到一个最优突变酶Mut-HHDH(W86I)，其酶活为14.21U·L^-1(37℃，pH 7.0)。2017年，Luo Yu等对HheC2360进行分子改造得到突变酶Mut-HheC2360(V84G/W86F)，其对(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯的催化效率提高了15倍，比酶活约为0.02U·mg^-1(45℃，pH 7.0)。

为了得到酶活提高的卤醇脱卤酶突变体，同时尽可能提高工作效率，本发明运用定向进化和半理性设计方法确定影响酶活的关键位点，分别采用迭代饱和突变(ISM)和组合活性位点饱和实验(CASTing)策略对影响酶活的关键位点进行组合突变，以进一步提高酶活，获得了优势突变酶。

发明内容

本发明提供了一种卤醇脱卤酶突变体及其应用，该卤醇脱卤酶突变体具有高酶活的特点，可高效催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

具体技术方案如下：

本发明提供了一种卤醇脱卤酶突变体，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(1)～(4)中的一种或两种以上的组合；

(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或天冬酰胺；所得单点突变体分别命名为R84A、R84S、R84H、R84N；

(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；所得单点突变体分别命名为R88L、R88V、R88T、R88C、R88F、R88I、R88S；

(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第136位的缬氨酸替换为苏氨酸或丝氨酸；所得单点突变体分别命名为V136T、V136S；

(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸、组氨酸或苏氨酸；所得单点突变体分别命名为N144C、N144H、N144T。

如SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的野生型卤醇脱卤酶来源于壤霉菌(Agromycesmediolanus sp.,GenBank:AGL34059.1)；核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

本发明采用易错PCR方法构建定向进化的突变文库，筛选得到若干个酶活提高的突变体，测序后发现这些突变体均含第84位(R84A)或第88位(R88L)的突变，单点突变体R84A的酶活为36.98U·L^-1，是野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的2.84倍；单点突变体R88L的酶活为24.92U·L^-1，是野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.60倍。

然后，再对84位和88位进行定点饱和突变筛选得到9个酶活提高的突变体，酶活分别为野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.32-3.46倍。接着，以与HheA_AM序列同源性为97.54％的HheA酶晶体结构模型(PDB code:4z9f.1.A)为模板，用Swiss-Model对HheA_AM进行同源建模，选择合理的蛋白结构模型与底物分子((3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯)进行预处理，再用Discovery Studio4.0软件的CDOCKER工具进行分子对接。经分子对接发现，以底物为中心范围内一共有9个氨基酸残基(F12，N87，S134，V136，L141，N144，Y147，P177，N178)。其中，S134和Y147是卤醇脱卤酶的催化中心，故对其他7个位点进行定点饱和突变(NNS/NNK密码子)，筛选约700个转化子后得到4个阳性突变体(V136T，N144C，N144H和N144T)，酶活分别为野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.78-3.13倍。

最后，利用ISM策略对HheA_AM的4个关键位点(84位、88位、136位、144位)进行组合突变；其中，最优突变体M4-1(84S/88L/136T/144C)的比酶活为887.80U·g^-1，是Wt-HheA_AM(69.06U·g^-1)的13倍。

更进一步地，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(A)～(E)中的一种；

(A)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；所得两点突变体命名为R88L/V136T；

(B)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；所得三点突变体命名为R88L/V136T/N144C；

(C)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；所得三点突变体命名为R84S/R88L/V136T；

(D)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；所得四点突变体命名为R84S/R88L/V136T/N144C；

(E)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为苯丙氨酸，第136位的缬氨酸替换为丝氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；所得三点突变体命名为R88F/V136S/N144C。

本发明提供了一种所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的表达载体。

本发明还提供了一种包含所述编码基因的基因工程菌。

本发明还提供了所述卤醇脱卤酶突变体或所述基因工程菌在催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

具体地，所述应用，包括：以卤醇脱卤酶突变体或基因工程菌为催化剂，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行脱卤氰化反应，反应结束后，经分离纯化，得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

作为优选，所述脱卤氰化反应的温度为30～60℃，pH为5.5～10。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明分别利用定向进化和半理性设计方法对来源于壤霉菌的卤醇脱卤酶HheA_AM进行改造，发现84位、88位、136位、144位是影响酶活的关键位点；利用迭代饱和突变(ISM)策略对4个关键位点进行组合突变，筛选得到突变体84S/88L/136T/144C的比酶活为887.80U·g^-1，是原始酶的13倍。

(2)本发明利用组合活性位点饱和实验(CASTing)策略对4个关键位点进行随机组合突变，筛选得到突变体88F/136S/144C的比酶活为801.59U·g^-1，是原始酶的12倍。

附图说明

图1为实施例1中96孔板中野生型HheA_AM的位置示意图。

图2为底物(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和产物(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的液相图谱。

图3为以底物为中心范围内的氨基酸残基示意图。

图4为一步PCR法构建CASTing文库的示意图。

具体实施方式

下面结合具体实施方式对本发明做进一步描述。其中，下列实施例涉及的部分实验方法如下：

1、卤醇脱卤酶的诱导表达与分离纯化

将甘油管中保藏的菌种采用平板划线培养法活化得到单菌落，从平板上挑取单菌落接种于含50μg·mL^-1卡那霉素的5mL LB培养基中(1％蛋白胨，0.5％酵母提取物，1％氯化钠，pH 7.0)，培养8h(37℃，200rpm)，然后按1-2％(v/v)接种量转接到50mL LB液体培养基(50μg·mL^-1Kan)中，培养至OD₆₀₀为0.8-1.0，添加异丙基硫代-β-D-半乳糖苷(IPTG)至终浓度0.5mM，诱导12-14h(18℃，200rpm)。将成功诱导表达的菌液于4℃，8000rpm离心得湿菌体，用HEPES缓冲液(100mM，pH 7.5)清洗2遍，再用适宜体积的HEPES重悬。将重悬液置于冰水浴中超声破碎(设定功率400W，每超声破碎3s停7s，约30次)即得破胞液，离心(4℃，12000rpm)所得上清液即为粗酶液。取上清液用镍柱进行亲和层析，先用洗杂缓冲液(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mM NaCl，50mM咪唑，pH 7.5)洗去杂蛋白，再用洗脱缓冲液(20mMNa₂HPO₄-NaH₂PO₄，500mM NaCl，250mM咪唑，pH 7.5)洗脱目的蛋白，将分离出来的目标蛋白置于超滤离心管中进行脱盐浓缩，得到电泳纯的目标蛋白。

2、高通量筛选方法

在96浅孔板(母板)每孔中加200μL LB液体培养基(50μg·mL^-1Kan)，用灭菌牙签从野生型HheA_AM平板上挑取单菌落接种到图1中黑色位置，将突变菌株接种到图1中空白位置，37℃，200rpm培养8h得到种子液。

在96深孔板(子板)每孔中加400μL LB液体培养基(50μg·mL^-1Kan)，再将母板中的种子液按对应位置转接到子板中(接种量为50μL)，37℃，200rpm培养3h左右，添加IPTG至终浓度0.5mM，18℃诱导过夜。转接后母板的每个孔中加入50μL的50％甘油，-80℃保藏，以用于复筛。

将上述经过诱导表达的子板发酵液离心(4℃，4000rpm，10min)弃上清，用HEPES缓冲液(100mM，pH 7.5)洗两遍后重悬细胞。在新的96浅孔板(反应板)每个孔中加入250μLHEPES缓冲液，从子板中取50μL细胞重悬液按照对应位置加入反应板中，加底物至终浓度10mM，反应30min(37℃，200rpm)。反应结束后离心(4℃，4000rpm，10min)，取40μL反应上清液，加60μL饱和Hg(SCN)₂-乙醇溶液和150μL 60g·L^-1FeNH₄(SO₄)₂-1M硝酸溶液进行显色反应，用酶标仪测定460nm处吸光值，挑取吸光值相对于原始酶的吸光值增大的突变体进行复筛检测。

3、卤醇脱卤酶的酶活测定

反应在10ml小试管中进行(1ml反应体系)，加入适宜体积(补至1ml)的HEPES缓冲液(100mM，pH 7.5)，再加入30μL 5％NaCN(终浓度30mM)和10μL(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯(终浓度10mM)，最后加入适宜体积的细胞重悬液或者酶液，磁力搅拌，37℃反应1h，加入1mL乙腈终止反应，离心、过滤即得待测样品。

通过液相检测产物(3R,5S)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的峰面积，根据产物峰面积和产物浓度标准曲线计算酶活。色谱柱采用PntulipsTM QS-C18(5μm×4.6mm×250mm)，流动相为乙腈:10mM乙酸钠溶液(pH 5.5)＝1:2(v/v)，流速为1.0mL·min^-1，进样量为5μL，检测波长为210nm，柱温为37℃。底物D3保留时间为11.1min，产物A7保留时间为7.1min(如图2)。

实施例1

1、野生型卤醇脱卤酶重组菌的构建

根据卤醇脱卤酶的基因序列设计引物，以上游引物F_HheA_AM-CGCGGATCCATGCGTATCGCTCTGGTGACG(带下划线的碱基为限制性内切酶BamH I的识别位点)和下游引物R_HheA_AM-CCCAAGCTTTTACGGCAGATAGCCGCCAG(带下划线的碱基为限制性内切酶Hind III的识别位点)对质粒pUC57-HheA_AM(由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，针对E.coli内表达密码子优化)进行PCR扩增，来获得目的基因。

其中，PCR的反应体系为：

PCR程序为：98℃2min；98℃10s，58℃15s，72℃10s(一般5s/kb)，30个循环；72℃5min；4℃保温。

PCR产物的大小通过1％琼脂糖凝胶电泳的验证后，用PCR纯化试剂盒进行纯化回收。将纯化后的PCR产物和质粒pET28a(+)分别用限制性内切酶Bam H I与Hind III进行双酶切。酶切结束后，样品经核酸琼脂糖凝胶电泳分离纯化后切胶回收，测定各自的浓度后进行酶连反应。

采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DH5α)感受态细胞中并送去铂尚生物技术(上海)有限公司-杭州测序部测序。从测序验证正确的阳性转化子中提取重组质粒转化到大肠杆菌BL21(DE3)中，最后得到重组菌。

2、卤醇脱卤酶HheA_AM的定向进化

以连接有野生型卤醇脱卤酶基因的重组质粒pET-28a(+)为模板(所用引物以及重组质粒的构建方法与第一部分相同)，通过易错PCR方法构建定向进化的突变文库。

易错PCR反应体系为：

PCR程序为：95℃2min；94℃30s，55℃30s，72℃60s，35个循环；72℃5min；4℃保温。

PCR产物的大小通过1％琼脂糖凝胶电泳的验证后，纯化回收。纯化后的PCR产物和pET28a(+)质粒分别用限制性内切酶BamH I和Hind III进行双酶切。酶切体系(40μL)为：DNA34μL、10×K Buffer 4μL、BamH I 1μL、Hind III 1μL，于37℃水浴中酶切3h。

酶切后回收目的条带，然后将酶切纯化的PCR产物与载体pET28a(+)进行连接。采用热激法将连接产物转化到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到定向进化突变文库。

通过定向进化筛选得到若干个酶活提高的突变体，测序后发现这些突变体均含第84位(R84A)或第88位(R88L)的突变。单点突变体R84A(R84A的碱基变化为CGT→GCG)的酶活为36.98U·L^-1，是野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheAAM)的2.84倍；单点突变体R88L(R88L的碱基变化为CGC→CTG)的酶活为24.92U·L^-1，是野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.60倍。

3、卤醇脱卤酶HheA_AM的半理性设计

(1)84位和88位的定点饱和突变

以连接有野生型卤醇脱卤酶HheA_AM基因的重组质粒pET-28a(+)-HheA_AM(重组质粒的构建方法与第一部分相同)为模板，针对84位和88位分别设计一对包含突变位点(采用NNS密码子)的正反向引物，对84位和88位进行定点饱和突变。

引物名称	序列(5’-3’)
		F_R84X	GACTACATCCCG<u>NNS</u>CCAATGAACCGCCTGCC
R_R84X	GCGGTTCATTGG<u>SNN</u>CGGGATGTAGTCGTTGC
		F_R88X	CGTCCAATGAAC<u>NNS</u>CTGCCAATCGAAGGC
R_R88X	CTTCGATTGGCAG<u>SNN</u>GTTCATTGGACGCGG

定点饱和突变PCR反应体系为：

PCR反应程序如下：98℃2min；98℃10s，58℃15s，72℃60s，30个循环；72℃5min；4℃保温。

表1 84位和88位定点饱和突变得到的阳性突变体及其相对酶活

PCR产物经过琼脂糖凝胶电泳的验证后正确后进行纯化回收，然后用Dpn I酶对纯化后的PCR产物进行消化，除去甲基化的模板质粒。消化体系为：DNA 17μL、10×T Buffer 2μL、Dpn I 1μL，于37℃水浴锅中消化2h。将上述经Dpn I酶消化后的产物采用热激法转化大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，构建突变体库。

通过对84位和88位进行定点饱和突变，筛选得到9个酶活提高的突变体，酶活分别为野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.32-3.46倍(如表1)。

(2)基于结构信息的设计与改造

以与HheA_AM序列同源性为97.54％的HheA酶晶体结构模型(PDB code:4z9f.1.A)为模板，用Swiss-Model对HheA_AM进行同源建模，选择合理的蛋白结构模型与底物分子((3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯)进行预处理，再用Discovery Studio 4.0软件的CDOCKER工具进行分子对接。

经分子对接发现，以底物为中心范围内一共有9个氨基酸残基(F12，N87，S134，V136，L141，N144，Y147，P177，N178)(如图2)。其中，S134和Y147是卤醇脱卤酶的催化中心，故对其他7个位点设计引物进行定点饱和突变，引物如下：

引物名称	序列(5’-3’)
		F_F12X	CACGCACGTCAC<u>NNS</u>GCAGGTCCTGCAGCTGTAG
R_F12X	GCAGGACCTGC<u>SNN</u>GTGACGTGCGTGCGTCAC
		F_N87X	CCGCGTCCAATG<u>NNS</u>CGCCTGCCAATCGAAGGC
R_N87X	CTTCGATTGGCAGGCG<u>SNN</u>CATTGGACGCGG
		F_V136X	CATCACCTCCTCT<u>NNS</u>GGTAAAAAACCGCTG
R_V136X	CGGTTTTTTACC<u>SNN</u>AGAGGAGGTGATG
		F_L141X	GGTAAAAAACCG<u>NNS</u>GCCTACAACCCGCTG
R_L141X	CGGGTTGTAGGC<u>SNN</u>CGGTTTTTTACCCAC
		F_N144X	CCGCTGGCCTAC<u>NNS</u>CCGCTGTACGGTCCGGC
R_N144X	GACCGTACAGCGG<u>SNN</u>GTAGGCCAGCGGTTTTTTAC
		F_P177X	CTGTATGCGATTGCT<u>NNS</u>AATTTCTTCAACAACC
R_P177X	GTTGAAGAAATT<u>SNN</u>AGCAATCGCATACAGC
		F_N178X	GCGATTGGTCCG<u>NNS</u>TTCTTCAACAACCCG
R_N178X	GTTGTTGAAGAA<u>SNN</u>CGGACCAATCGCATAC

筛选约700个转化子后得到4个阳性突变体(V136T，N144C，N144H和N144T)，酶活分别为野生型卤醇脱卤酶(Wt-HheA_AM)的1.78-3.13倍(如表2)。

表2 136位和144位定点饱和突变得到的阳性突变体及其相对酶活

4、组合突变

(1)迭代饱和突变(ISM)

利用ISM策略对HheA_AM的4个关键位点(84位、88位、136位、144位)进行组合突变。采用的引物如下：

引物名称	序列(5’-3’)
		F_M1-R88X	同F_R88X
R_M1-R88X	同R_R88X
		F_M2-1-R84X	GACTACATCCCG<u>NNS</u>CCAATGAACC<u>T</u>CCTGCC
R_M2-1-R84X	GGTTCATTGG<u>SNN</u>CGGGATGTAGTCGTTG
		F_M2-1-N144X	同F_N144X
R_M2-1-N144X	同R_N144X
		F_M3-1-R84X	同F_M2-1-R84X
R_M3-1-R84X	同R_M2-1-R84X
		F_M3-2-N144X	同F_N144X
R_M3-2-N144X	同R_N144X

由于对136位进行定点饱和突变只筛得一个阳性突变体M1(V136T)，故以其为第一轮最优突变体，逐级往上叠加突变位点。而88位处在一个与136位相似的空间位置，靠近底物叔丁基的另一个甲基，所以首先在M1上引入88位的饱和突变，得到第二轮最优突变体M2-1(88L/136T)，然后在M2-1上分别引入144位和84位饱和突变，得到最优突变体M3-1(88L/136T/144C)和M3-2(84S/88L/136T)。最后在M3-1和M3-2上分别引入84位和144位饱和突变，得到同一个最优突变体M4-1(84S/88L/136T/144C)，其比酶活为887.80U·g^-1，是Wt-HheA_AM(69.06U·g^-1)的13倍(如表3)。

表3 ISM策略得到的阳性突变体及其酶活

注：N144C的碱基变化为AAC→TGT；R84S的碱基变化为CGT→TCT；其它碱基变化同表1和表2。

(2)组合活性位点饱和实验(CASTing)

利用CASTing策略对4个关键位点(84位、88位、136位、144位)进行随机组合突变。

如图4，以质粒pET-28a(+)-HheA_AM为模板，设计引物F_84/88-CAACGACT ACATCCCGNDTCCAATGAACNDTCTGCCAATCGAAGGCACC和R_136/144-GGACCGTACAGCGGAHNGTAGGCCAGCGGTTTTTTACCAHNAGAGGAGGTGATGAAAATAAC，通过一步PCR同时引入四个位点的突变。

PCR体系如实施例1第一部分所示。

PCR程序：98℃2min；98℃10s，58℃15s，72℃10s，20个循环；98℃10s，68℃15s，72℃10s，10个循环；72℃10min，4℃保温。

PCR扩增结束后可通过核酸凝胶电泳回收PCR产物，经DpnⅠ消化模板质粒后直接转化大肠杆菌感受态细胞构建CASTing文库。筛选约2000个转化子得到最优突变体88F/136S/144C(R88F的碱基变化为CGC→TTT；V136S的碱基变化为GTG→AGC；N144C的碱基变化为AAC→TGC)，其比酶活为801.59U·g^-1，是Wt-HheA_AM(69.06U·g^-1)的12倍。

序列表

<110> 浙江大学

<120> 一种卤醇脱卤酶突变体及其应用

<160> 26

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 244

<212> PRT

<213> 壤霉菌(Agromyces mediolanus)

<400> 1

Met Arg Ile Ala Leu Val Thr His Ala Arg His Phe Ala Gly Pro Ala

1 5 10 15

Ala Val Glu Ala Leu Thr Arg Asp Gly Tyr Thr Val Val Cys His Asp

20 25 30

Ala Ser Phe Ala Asp Ala Ala Glu Arg Gln Arg Phe Glu Ser Glu Asn

35 40 45

Pro Gly Thr Ile Ala Leu Ala Glu Gln Lys Pro Glu Arg Leu Val Asp

50 55 60

Ala Thr Leu Gln Tyr Gly Glu Ala Ile Asp Thr Ile Val Ser Asn Asp

65 70 75 80

Tyr Ile Pro Arg Pro Met Asn Arg Leu Pro Ile Glu Gly Thr Ser Glu

85 90 95

Ala Asp Ile Arg Gln Met Phe Glu Ala Leu Ser Ile Phe Pro Ile Leu

100 105 110

Leu Leu Gln Ser Ala Ile Ala Pro Leu Arg Ala Ala Gly Gly Ala Ser

115 120 125

Val Ile Phe Ile Thr Ser Ser Val Gly Lys Lys Pro Leu Ala Tyr Asn

130 135 140

Pro Leu Tyr Gly Pro Ala Arg Ala Ala Thr Val Ala Leu Val Glu Ser

145 150 155 160

Ala Ala Lys Thr Leu Ser Arg Asp Gly Ile Leu Leu Tyr Ala Ile Gly

165 170 175

Pro Asn Phe Phe Asn Asn Pro Thr Tyr Phe Pro Thr Ser Asp Trp Glu

180 185 190

Asn Asp Pro Glu Leu Arg Asp Arg Val Glu Arg Asp Val Pro Leu Gly

195 200 205

Arg Leu Gly Arg Pro Asp Glu Met Gly Ala Leu Ile Thr Phe Leu Ala

210 215 220

Ser Arg Arg Ala Ala Pro Ile Val Gly Gln Phe Phe Ala Phe Thr Gly

225 230 235 240

Gly Tyr Leu Pro

<210> 2

<211> 735

<212> DNA

<213> 壤霉菌(Agromyces mediolanus)

<400> 2

atgcgtatcg ctctggtgac gcacgcacgt cacttcgcag gtcctgcagc tgtagaagca 60

ctgacccgtg atggttacac ggtagtctgc catgacgcta gcttcgcaga cgcagctgag 120

cgtcagcgtt ttgagagcga gaaccctggt accatcgcac tggctgagca gaagccagaa 180

cgtctggtcg acgctaccct gcagtacggt gaagcaatcg acaccatcgt gagcaacgac 240

tacatcccgc gtccaatgaa ccgcctgcca atcgaaggca ccagcgaagc tgacatccgt 300

cagatgttcg aagcgctgtc catcttcccg atcctgctgc tgcagtccgc tatcgctccg 360

ctgcgtgctg ccggtggcgc ctctgttatt ttcatcacct cctctgtggg taaaaaaccg 420

ctggcctaca acccgctgta cggtccggcg cgtgcggcca ctgttgcgct ggttgaatct 480

gccgcgaaaa ctctgtctcg cgatggcatt ctgctgtatg cgattggtcc gaatttcttc 540

aacaacccga cctatttccc gacctccgac tgggaaaacg atccggaact gcgtgatcgc 600

gtagaacgcg atgttccgct gggtcgcctg ggccgcccgg atgaaatggg cgcgctgatt 660

actttcctgg cgtctcgtcg cgcggcgccg attgttggcc aattttttgc gtttactggc 720

ggctatctgc cgtaa 735

<210> 3

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 3

gactacatcc cgnnsccaat gaaccgcctg cc 32

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 4

gcggttcatt ggsnncggga tgtagtcgtt gc 32

<210> 5

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 5

cgtccaatga acnnsctgcc aatcgaaggc 30

<210> 6

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 6

cttcgattgg cagsnngttc attggacgcg g 31

<210> 7

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 7

cacgcacgtc acnnsgcagg tcctgcagct gtag 34

<210> 8

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 8

gcaggacctg csnngtgacg tgcgtgcgtc ac 32

<210> 9

<211> 33

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 9

ccgcgtccaa tgnnscgcct gccaatcgaa ggc 33

<210> 10

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (18)..(19)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 10

cttcgattgg caggcgsnnc attggacgcg g 31

<210> 11

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 11

catcacctcc tctnnsggta aaaaaccgct g 31

<210> 12

<211> 28

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 12

cggtttttta ccsnnagagg aggtgatg 28

<210> 13

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 13

ggtaaaaaac cgnnsgccta caacccgctg 30

<210> 14

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 14

cgggttgtag gcsnncggtt ttttacccac 30

<210> 15

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 15

ccgctggcct acnnsccgct gtacggtccg gc 32

<210> 16

<211> 36

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (15)..(16)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 16

gaccgtacag cggsnngtag gccagcggtt ttttac 36

<210> 17

<211> 34

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (16)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 17

ctgtatgcga ttgctnnsaa tttcttcaac aacc 34

<210> 18

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 18

gttgaagaaa ttsnnagcaa tcgcatacag c 31

<210> 19

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 19

gcgattggtc cgnnsttctt caacaacccg 30

<210> 20

<211> 31

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (14)..(15)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 20

gttgttgaag aasnncggac caatcgcata c 31

<210> 21

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (13)..(14)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 21

gactacatcc cgnnsccaat gaacctcctg cc 32

<210> 22

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (12)..(13)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 22

ggttcattgg snncgggatg tagtcgttg 29

<210> 23

<211> 30

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 23

cgcggatcca tgcgtatcgc tctggtgacg 30

<210> 24

<211> 29

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 24

cccaagcttt tacggcagat agccgccag 29

<210> 25

<211> 49

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (29)..(29)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 25

caacgactac atcccgndtc caatgaacnd tctgccaatc gaaggcacc 49

<210> 26

<211> 62

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<220>

<221> misc_feature

<222> (17)..(17)

<223> n is a, c, g, or t

<220>

<221> misc_feature

<222> (41)..(41)

<223> n is a, c, g, or t

<400> 26

ggaccgtaca gcggahngta ggccagcggt tttttaccah nagaggaggt gatgaaaata 60

ac 62

Claims

1.一种卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(1)～(4)中的一种或两种以上的组合；

(1)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丙氨酸、丝氨酸、组氨酸或天冬酰胺；；

(2)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸、缬氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、苯丙氨酸或异亮氨酸；

(3)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第136位的缬氨酸替换为苏氨酸或丝氨酸；

(4)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸、组氨酸或苏氨酸。

2.如权利要求1所述的卤醇脱卤酶突变体，其特征在于，所述卤醇脱卤酶突变体为下列(A)～(E)中的一种；

(A)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；

(B)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；

(C)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸；

(D)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第84位的精氨酸替换为丝氨酸，第88位的精氨酸替换为亮氨酸，第136位的缬氨酸替换为苏氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸；

(E)将SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的第88位的精氨酸替换为苯丙氨酸，第136位的缬氨酸替换为丝氨酸，第144位的天冬酰胺替换为半胱氨酸。

3.一种如权利要求1或2任一项所述卤醇脱卤酶突变体的编码基因。

4.一种包含权利要求3所述编码基因的表达载体。

5.一种包含权利要求3所述编码基因的基因工程菌。

6.如权利要求1或2任一项所述的卤醇脱卤酶突变体或权利要求5所述的基因工程菌在催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯制备(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯中的应用。

7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，包括：以卤醇脱卤酶突变体或基因工程菌为催化剂，催化(3R,5S)-6-氯-3,5-二羟基己酸叔丁酯和NaCN进行脱卤氰化反应，反应结束后，经分离纯化，得到(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯。

8.如权利要求7所述的应用，其特征在于，所述脱卤氰化反应的温度为30～60℃，pH为5.5～10。