CN105567655A - 一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 - Google Patents
一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6-取代-3,5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了编码该卤醇脱卤酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该卤醇脱卤酶的制备方法，以及该卤醇脱卤酶在催化取代反应中的用途。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程领域，具体涉及一种卤醇脱卤酶，含有编码该酶的核酸序列的重组表达载体和重组表达转化体，表达的重组酶和该重组酶的制备方法，以及在催化邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。
背景技术
他汀类药物是羟甲基戊二酰辅酶A(HMG-CoA)还原酶抑制剂，其通过竞争性抑制内源性胆固醇合成限速酶(HMG-CoA)还原酶，阻断细胞内羟甲戊酸代谢途径，使细胞内胆固醇合成减少，从而反馈性刺激细胞膜表面(主要为肝细胞)低密度脂蛋白受体数量和活性增加、使血清胆固醇清除增加、水平降低。他汀类药物还可抑制肝脏合成载脂蛋白B-100，从而减少富含甘油三酯AV、脂蛋白的合成和分泌。因此，他汀类药物在降血脂方面被称为“神奇的药物”。
结构式所示的6-取代-3，5-二羟基己酸酯衍生物是人工合成他汀类药物的重要中间体，如瑞舒伐他汀、阿托伐他汀、普伐他汀、匹伐他汀、氟伐他汀和洛伐他汀等。
制备上述结构式所示化合物的方法主要包括利用氢氰酸或氰酸盐进行化学合成。例如，US6344569B1公开了6-氯代-3，5-二羟基己酸酯与氰化钠在N，N-二甲基甲酰胺中80℃反应生成6-氰基-3，5-二羟基己酸酯的方法。但是，利用化学法均具有收率低下、副产物过多、分离纯化困难等缺点。
因此，近年来，研究的热点集中在生物催化法方面。与化学法相比，生物催化法具有反应条件温和、反应转化率高、产物化学纯度和光学纯度高等优点。目前报道的生物催化酶主要有卤醇脱卤酶。卤醇脱卤酶是一类通过分子内亲核取代机制催化邻卤醇转化为环氧化物的脱卤酶，可以高效高选择性的催化环氧化物和邻卤醇之间的转化，因而可以用来合成具有光学纯的环氧化物，具有传统化学合成法无法比拟的优越性。美国专利US7125693和US7132267公布了Codexis公司对于该项目的研究，以(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯为原料，采用卤醇脱卤酶催化，控制pH为7左右，40℃条件下，在水相中与氰化钠及氢氰酸反应，其中氰化钠与底物(S)-4-氯-3-羟基丁酸乙酯的摩尔比为2.82，合成了(R)-4-氰基-3-羟基丁酸乙酯，化学纯为98％，光学纯为99％，收率为67.13％。后续均是针对上述方法进行改进研究，如江苏阿尔法药业的CN102168117。但是，现有工艺基本都是以4-卤代-3-羟基丁酸酯为原料，氰化物与底物的摩尔比过高，由此带来了严重的工业三废问题，并且反应的路线较长，收率不高，增加了生产成本。
发明内容
针对现有技术中存在的酶用量过高、反应条件不适当、以及反应转化率较低、反应步骤较长等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6-取代-3,5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了编码该卤醇脱卤酶的核酸序列，含有该核酸序列的重组表达载体、重组表达转化体及该卤醇脱卤酶的制备方法，以及该卤醇脱卤酶在催化取代反应中的用途。
本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供了一种卤醇脱卤酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQIDNo：4所示氨基酸序列组成的蛋白质。
SEQIDNo：4所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有取代卤素的功能，是一种新的卤醇脱卤酶。
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。
其中，所述的“几个”是指2个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有卤醇脱卤酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有卤醇脱卤酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQIDNo：4所示氨基酸序列蛋白质(a)分子中进行1～20个氨基酸残基的突变，仍然保持卤醇脱卤酶活性。
(c)与(a)的氨基酸序列具有至少90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。
SEQIDNo：4所示的卤醇脱卤酶和其他已知的卤醇脱卤酶如HheC之间的同一性为72％。本发明中氨基酸序列如SEQIDNo：4所示的卤醇脱卤酶与已知的卤醇脱卤酶的氨基酸序列的同一性低于90％，具有显著的差异性。
在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的卤醇脱卤酶。优选地，所述核酸是由SEQIDNo:1所示核苷酸序列组成的。
由SEQIDNo：1所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境基因组DNA，其可以从土壤样本中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离得到，也可以全基因人工合成获得。
本发明中，SEQIDNo：1所示的基因命名为BYKY-HhdC，全长780bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第777个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAG。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQIDNo：4所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQIDNo：4的氨基酸序列的核酸序列不仅仅局限于SEQIDNo：1。本发明的卤醇脱卤酶基因的核酸序列也可以是编码序列表中SEQIDNo：4所示氨基酸序列的其他任何核酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核酸序列SEQIDNo：1的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或增加来制得。
SEQIDNo：1的同系物也指启动子变体。在所述的核酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQIDNo：1的同系物还指在标准条件下能够与SEQIDNo：1所示序列的核酸进行杂交的核酸序列。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行；ColdSpringHarborLaboratoryPress，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocolsinMolecularBiology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的编码卤醇脱卤酶的核酸序列的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明所述的编码卤醇脱卤酶基因或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选pET系列质粒。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的目的核酸片段与表达载体pET21a分别用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切，形成互补的粘性末端，经T4DNA连接酶连接，形成含有本发明的编码卤醇脱卤酶的核酸序列的重组表达质粒pET21-BYKY-HhdC或含有编码其突变体的核酸序列的重组表达质粒。
本发明的第四个方面是提供一种包含本发明所述的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的卤醇脱卤酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.coliBL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET21-BYKY-HhdC或其突变体转化至E.coliBL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.coliBL21(DE3)/pET21-BYKY-HhdC或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化，热击条件较佳的是：42℃，热击90秒。
本发明的第五个方面是提供一种重组卤醇脱卤酶的制备方法，包括如下步骤：培养本发明所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组卤醇脱卤酶。
本发明中催化卤醇进行取代反应的催化剂，可以是上述重组表达转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的卤醇脱卤酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
本发明的第六个方面是提供上述卤醇脱卤酶、重组卤醇脱卤酶或催化剂在催化邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。
在上述应用中，式II所示的邻-卤醇化合物在催化作用下与R1M’反应生成式I所示的卤素被取代的化合物。
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、具有1-6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
M各自独立地选自-C(＝O)-、-CH(OH)-或-CH2-；n为0或1-9的整数；
R1选自叠氮基、-CN、-OH、-COOR2、或R3R4NCH2，其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
M’选自碱金属、卤素或H。
优选地，式II化合物选自：
或
或
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
更优选地，式II化合物选自：
或
或
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
上述的式II化合物可以通过本领域常规的反应制备，也可以由式III所示的内酯化合物制备而成：
当使用内酯化合物作为原料时，可将式III所示的内酯化合物在溶剂中开环生成邻-卤醇化合物，然后不经后处理直接在上述卤醇脱卤酶、重组卤醇脱卤酶、或催化剂的催化作用下与R1M’反应，生成如下式I所示的卤素被取代的化合物；
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、具有1-6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
R1选自叠氮基、-CN、-OH、-COOR2、或R3R4NCH2，其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
M’选自碱金属、卤素或H。
优选地，式III化合物选自：
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I。
本发明上述式III所示的内酯化合物的开环反应可参照本领域此类反应的常规条件进行。较佳地，在碱性条件下水解开环。
本发明上述取代反应的反应条件可按照本领域此类反应的常规条件进行选择。较佳地，所述应用包括下述步骤：在pH7.0-9.0的甲醇水溶液中，在上述催化作用下，邻-卤醇化合物进行取代反应。
优选地，邻-卤醇化合物或内酯化合物在反应液中的浓度为1-800mmol/L；卤醇脱卤酶用量为催化有效量，较佳地为0.1-50g/L；反应试剂R1M’的浓度为1-1100mol/L。所述溶液可以为本领域常规的缓冲液，只要其pH范围在7.0-9.0即可，优选磷酸盐缓冲液。磷酸盐缓冲液的浓度较佳为0.05-0.1mol/L，所述浓度是指缓冲溶液中共轭酸碱的总浓度。所述甲醇的浓度优选为5～50％(V/V)。所述取代反应优选在振荡或搅拌条件下进行。所述取代反应的温度优选30-50℃。所述取代反应的时间较佳的以反应过程中，底物剩余浓度低于5％的时间为准。取代反应结束后，可按照本领域常规方法从反应液中提取产物。
在符合本领域常识的基础上，上述各优选条件，可任意组合，即得本发明各较佳实施例。本发明所用试剂和原料均可市售获得。
本发明的积极进步效果在于：针对已报道的合成他汀类药物及其中间体的工艺中氰化物与底物的摩尔比过高、工业三废问题严重、反应路线较长、收率不高、生产成本增加等缺点，提供一种催化活性高、反应收率高、对环境友好的卤醇脱卤酶，以及使用该卤醇脱卤酶进行取代合成6-取代-3,5-二羟基己酸酯衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1是卤醇脱卤酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图。
图2是卤醇脱卤酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，A泳道为诱导前，B泳道为诱导后。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
E.coliDH10b和E.coliBL21(DE3)感受态细胞购自北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司。
实施例1：脱卤酶的酶活力测定
卤醇脱卤酶的活性：通过在含有50mMTris-SO4Buffer及一定浓度底物的反应体系中测定卤离子的浓度来评估酶的催化效率。
试剂I：0.25MNH4Fe(SO4)2溶于9MHNO3；用8倍体积的三蒸水稀释。
试剂II：Hg(SCN)溶于无水乙醇的饱和溶液。
(1)底物是2-溴乙醇，用溴化钾或溴化钠做标准曲线；用紫外分光光度计测定其在460nm吸收值，以水为空白对照。
(2)另外一个做法是用氯代物做底物，用氯化钾或氯化钠做标准曲线；
实施例2：筛选脱卤酶
采集土壤样品DNA(ChromaSpinTE-1000，ClontechLaboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集2-8kb的片段，回收并连接到pUC19的BamHI位点，得到质粒文库。将文库转化到E.coliDH10b并涂布到含有100ug/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500uLLB(100ug/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板，37℃培养4小时后加1mMIPTG诱导，30℃继续培养过夜；然后各取50uL深孔培养物到含有50mM磷酸钠缓冲液(pH7.5)的新的96孔板，-80℃反复冻融使细菌裂解；加入2mM6-氯-3,5-二羰基己酸叔丁酯以及实施例1中的试剂I与试剂II，30℃温浴4小时，460nm测吸光度，挑取吸光度最高的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序。用NCBI的ORFFinder分析其开放读码框(ORF)，得到ORF核苷酸序列SeqIDNO：1，并进一步得到其编码的氨基酸序列SEQIDNo：4。
实施例3：脱卤酶重组菌的构建和表达
合成引物对P1(核苷酸序列为SeqIDNO：2)和P2(核苷酸序列为SeqIDNO：3)。使用P1和P2克隆全长卤醇脱卤酶基因。
PCR体系如下：10×KOD-PlusPCRbuffer2μL，25mMMgSO41.2μL，2mMdNTP2μL，KOD-PlusPCR高保真酶0.3μL，DNA模板0.5μL(含DNA模板0.1μg)，ddH2O13μL，P1和P2各0.5μL(10mmol/L)。PCR扩增步骤为：(1)95℃，预变性3min；(2)98℃，变性15s；(3)58℃退火30s；(4)72℃延伸1min；步骤(2)～(4)重复30次；(5)72℃继续延伸10min，冷却至4℃。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收700～800bp区间的目标条带(见图1)，获得一条完整的基因序列，经DNA测序，全长780bp。
PCR产物用NdeI/XhoI酶切后连接到pET21a原核表达载体，并转化到E.coliBL21(DE3)感受态细菌，在含有卡那霉素(50ug/mL)的LB平板培养，挑选阳性菌落(重组大肠杆菌)接种到100ml液体LB培养基进行培养。过夜培养物转入1L新鲜的LB培养基，培养到OD600至0.6-0.8，加入IPTG至终浓度为200uM诱导重组蛋白表达，降温至30℃继续培养24小时。5000rpm离心收集菌体，用0.2MpH7.0的磷酸钠缓冲液洗一次，1g菌体重悬于5mL上述磷酸盐缓冲液中，超声波破碎后，SDS-PAGE检验表达水平，结果如图2。
实施例4：脱卤酶的高密度发酵
将实施例3获得的重组大肠杆菌接种于装有200mLLB培养基的1L摇瓶中，于37℃，180-220rpm培养10-16h。将上述培养好的种子培养液按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L、磷酸氢二钠12.8g/L、磷酸二氢钾3g/L、氯化铵1g/L、硫酸钠0.5g/L、氯化钙0.0152g/L、六水氯化镁0.41g/L)中，在25-35℃，300-800rpm，空气流量2-6L/min的条件下培养。培养6-10h后，以5-20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20-40时，添加0.1-1mMIPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体，均质后得到粗酶液。
实施例5：脱卤酶的生物催化
在50mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)中加入根据实施例4制备的脱卤酶的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为100mmol/L的如表1中所示的底物之一，加入50mL甲醇，加入终浓度为110mmol/L的R1M’，控制pH值，30-50℃反应，HPLC或GC检测反应进程，底物剩余低于5％时视为反应结束。反应结束后用饱和Na2CO3调pH至10～11，用乙酸乙酯萃取，旋干得粗产物，测定收率。
结果见表1。
表1脱卤酶催化邻-卤醇化合物取代反应的结果
实施例6：内酯水解后脱卤酶的生物催化
将终浓度为100mmol/L的(4R,6S)-6-氯甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮在水中用氢氧化钠溶液调至pH为8～9，搅拌1小时。向其中加入50mL磷酸盐缓冲液(100mmol/L，pH7.5)和根据实施例4制备的脱卤酶的粗酶液至最终蛋白浓度为10g/L，加入终浓度为110mmol/L的NaCN，控制pH值，30-50℃反应，HPLC或GC检测反应进程，底物剩余低于5％时视为反应结束。反应结束后用饱和Na2CO3调pH至10～11，用乙酸乙酯萃取，旋干得粗产物，测定收率为89％。
Claims (24)
1.一种卤醇脱卤酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQIDNo：4所示氨基酸序列组成的蛋白质；
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质；
(c)与(a)的氨基酸序列具有至少90％同一性且具有卤醇脱卤酶活性的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的卤醇脱卤酶的分离的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQIDNo：1所示核苷酸序列组成的。
4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET系列质粒。
7.包含权利要求4-6任一项所述的重组表达载体的重组表达转化体。
8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E.coliBL21(DE3)。
10.一种重组卤醇脱卤酶的制备方法，包括如下步骤：培养权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组卤醇脱卤酶。
11.一种催化邻-卤醇化合物进行取代反应的催化剂，其选自权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品；优选地，所述制品是由所述转化体细胞得到的提取物、通过对提取物中的卤醇脱卤酶进行分离和/或纯化得到的分离产品、或通过固定化转化体细胞或提取物或提取物的分离产品而得到的固定化制品。
12.权利要求1所述的卤醇脱卤酶、权利要求10所述的方法制备的重组卤醇脱卤酶、或权利要求11所述的催化剂在催化邻-卤醇化合物进行取代反应中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：式II所示的邻-卤醇化合物在权利要求1所述的卤醇脱卤酶、权利要求10所述的方法制备的重组卤醇脱卤酶、或权利要求11所述的催化剂催化作用下与R1M’反应，生成式I所示的卤素被取代的化合物；
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、具有1-6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
M各自独立地选自-C(＝O)-、-CH(OH)-或-CH2-；n为0或1-9的整数；
R1选自叠氮基、-CN、-OH、-COOR2、或R3R4NCH2，其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
M’选自碱金属、卤素或H。
14.根据权利要求13所述的应用，其中式II化合物选自：
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
15.根据权利要求14所述的应用，其中式II化合物选自：
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、甲基、乙基、异丙基或叔丁基。
16.根据权利要求13所述的应用，其中式II所示的邻-卤醇化合物由式III所示的内酯化合物制备而成：
17.根据权利要求12所述的应用，其特征在于：式III所示的内酯化合物在溶剂中开环生成邻-卤醇化合物，不经后处理直接在权利要求1所述的卤醇脱卤酶、权利要求10所述的方法制备的重组卤醇脱卤酶、或权利要求11所述的催化剂催化下与R1M’反应，生成式I所示的卤素被取代的化合物；
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I；
R为H、具有1-6个碳原子的烷基，优选甲基、乙基、异丙基或叔丁基；
R1选自叠氮基、-CN、-OH、-COOR2、或R3R4NCH2，其中，R2选自具有1-6个碳原子的烷基或具有6-12个碳原子的芳基，R3和R4各自独立地选自H、具有2-7个碳原子的烷氧羰基、具有8-14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6-12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7-19个碳原子芳基烷基、具有2-7个碳原子的烷基酰基、或邻苯二甲酰亚氨基；
M’选自碱金属、卤素或H。
18.根据权利要求17所述的应用，其中式III化合物选自：
其中，
X为卤素，优选Cl、Br或I。
19.根据权利要求12-18任一项所述的应用，其中所述的取代反应在含有磷酸盐缓冲液的pH7.0-9.0的甲醇水溶液中进行。
20.根据权利要求12-18任一项所述的应用，其中所述的邻-卤醇化合物在反应液中的浓度为1-800mmol/L，所述的卤醇脱卤酶浓度为0.1-50g/L，反应试剂R1M’的浓度为1-1100mol/L，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为30-50℃。
21.一种合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，包括：在权利要求1所述的卤醇脱卤酶、权利要求10所述的方法制备的重组卤醇脱卤酶、或权利要求11所述的催化剂的催化作用下使(3R,5S)-6-氯代-3,5-二羟基己酸叔丁酯进行卤素取代反应。
22.一种合成(3R,5R)-6-氰基-3,5-二羟基己酸叔丁酯的方法，包括：将(4R,6S)-6-氯甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮在溶剂中开环，不经后处理直接在权利要求1所述的卤醇脱卤酶、权利要求10所述的方法制备的重组卤醇脱卤酶、或权利要求11所述的催化剂的作用下进行卤素取代反应。
23.根据权利要求21或22所述的方法，其中，反应液中含有100-800mmol/L的(3R,5S)-6-氯代-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(4R,6S)-6-氯甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮、10-50g/L的卤醇脱卤酶、和100-1100mmol/L的M’CN，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为30-50℃，M’选自碱金属、卤素或H。
24.根据权利要求21或22所述的方法，其中所述取代反应由SEQIDNo.：4所示氨基酸序列组成的蛋白质催化，反应液中含有100mmol/L的(3R,5S)-6-氯代-3,5-二羟基己酸叔丁酯或(4R,6S)-6-氯甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮、10g/L的脱卤酶、和110mmol/L的NaCN，反应pH为7.0-9.0，反应温度为30-50℃。
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