CN105624127B - 一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 - Google Patents
一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN105624127B CN105624127B CN201410588562.2A CN201410588562A CN105624127B CN 105624127 B CN105624127 B CN 105624127B CN 201410588562 A CN201410588562 A CN 201410588562A CN 105624127 B CN105624127 B CN 105624127B
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- glucose dehydrogenase
- recombinant expression
- reaction
- hemiacetal
- lactone
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
- 108010050375 Glucose 1-Dehydrogenase Proteins 0.000 title claims abstract description 67
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 title claims abstract description 11
- 229940121710 HMGCoA reductase inhibitor Drugs 0.000 title claims abstract description 8
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 title claims abstract description 8
- 239000002471 hydroxymethylglutaryl coenzyme A reductase inhibitor Substances 0.000 title claims abstract description 7
- 229940079593 drug Drugs 0.000 title abstract description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 title abstract description 5
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 claims abstract description 53
- 238000003259 recombinant expression Methods 0.000 claims abstract description 28
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 26
- 150000002596 lactones Chemical class 0.000 claims abstract description 25
- -1 6- substituted-tetrahydro pyran-2-one Chemical class 0.000 claims abstract description 21
- 150000002373 hemiacetals Chemical class 0.000 claims abstract description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 18
- 238000006555 catalytic reaction Methods 0.000 claims abstract description 11
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 claims abstract description 9
- 241000588724 Escherichia coli Species 0.000 claims description 23
- 125000003275 alpha amino acid group Chemical group 0.000 claims description 15
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 14
- 238000007254 oxidation reaction Methods 0.000 claims description 14
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 12
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 claims description 11
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 229910052799 carbon Inorganic materials 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 10
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 9
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 9
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 9
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 9
- 125000004432 carbon atom Chemical group C* 0.000 claims description 8
- 150000001875 compounds Chemical class 0.000 claims description 8
- MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N pyrroloquinoline quinone Chemical compound C12=C(C(O)=O)C=C(C(O)=O)N=C2C(=O)C(=O)C2=C1NC(C(=O)O)=C2 MMXZSJMASHPLLR-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 7
- OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N Carbon Chemical group [C] OKTJSMMVPCPJKN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 claims description 5
- 239000008103 glucose Substances 0.000 claims description 5
- 239000000203 mixture Substances 0.000 claims description 5
- 238000005215 recombination Methods 0.000 claims description 5
- 230000006798 recombination Effects 0.000 claims description 5
- 125000000217 alkyl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 125000003118 aryl group Chemical group 0.000 claims description 4
- 150000001721 carbon Chemical group 0.000 claims description 4
- 239000003054 catalyst Substances 0.000 claims description 4
- 238000006356 dehydrogenation reaction Methods 0.000 claims description 4
- 238000000926 separation method Methods 0.000 claims description 4
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 3
- 125000004423 acyloxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000003545 alkoxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004453 alkoxycarbonyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000005257 alkyl acyl group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000004104 aryloxy group Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000000852 azido group Chemical group *N=[N+]=[N-] 0.000 claims description 2
- 239000013602 bacteriophage vector Substances 0.000 claims description 2
- 125000001797 benzyl group Chemical group [H]C1=C([H])C([H])=C(C([H])=C1[H])C([H])([H])* 0.000 claims description 2
- 239000003795 chemical substances by application Substances 0.000 claims description 2
- 229910052736 halogen Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000002367 halogens Chemical group 0.000 claims description 2
- 125000002887 hydroxy group Chemical group [H]O* 0.000 claims description 2
- 230000010355 oscillation Effects 0.000 claims description 2
- 125000001820 oxy group Chemical group [*:1]O[*:2] 0.000 claims description 2
- 125000002130 sulfonic acid ester group Chemical group 0.000 claims description 2
- 241001515965 unidentified phage Species 0.000 claims description 2
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 claims description 2
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 claims 2
- 239000004927 clay Substances 0.000 claims 1
- 230000003197 catalytic effect Effects 0.000 abstract description 3
- 230000003321 amplification Effects 0.000 abstract description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 abstract description 2
- 230000001590 oxidative effect Effects 0.000 abstract description 2
- 239000002904 solvent Substances 0.000 abstract description 2
- 238000010189 synthetic method Methods 0.000 abstract 1
- 108010029645 galactitol 2-dehydrogenase Proteins 0.000 description 27
- 108010000445 Glycerate dehydrogenase Proteins 0.000 description 25
- 101000928995 Caenorhabditis elegans Putative deoxyribose-phosphate aldolase Proteins 0.000 description 14
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 14
- 102100037802 Deoxyribose-phosphate aldolase Human genes 0.000 description 14
- 238000000855 fermentation Methods 0.000 description 14
- 230000004151 fermentation Effects 0.000 description 14
- XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acetate Chemical compound CCOC(C)=O XEKOWRVHYACXOJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 12
- 239000000047 product Substances 0.000 description 12
- 241000894006 Bacteria Species 0.000 description 11
- 239000013613 expression plasmid Substances 0.000 description 11
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 10
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 10
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 10
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 9
- 238000001514 detection method Methods 0.000 description 9
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 9
- 238000005839 oxidative dehydrogenation reaction Methods 0.000 description 9
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 description 8
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 8
- 108090000854 Oxidoreductases Proteins 0.000 description 7
- LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N ethylene glycol Natural products OCCO LYCAIKOWRPUZTN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N hydroxyacetaldehyde Natural products OCC=O WGCNASOHLSPBMP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 7
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 7
- 102000004316 Oxidoreductases Human genes 0.000 description 6
- UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M Sodium bicarbonate Chemical compound [Na+].OC([O-])=O UIIMBOGNXHQVGW-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 6
- 230000001580 bacterial effect Effects 0.000 description 6
- 239000012043 crude product Substances 0.000 description 6
- 239000012634 fragment Substances 0.000 description 6
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 6
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 description 6
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 6
- 239000000758 substrate Substances 0.000 description 6
- QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 2-chloro-acetaldehyde Chemical compound ClCC=O QSKPIOLLBIHNAC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 5
- 102000012410 DNA Ligases Human genes 0.000 description 5
- 108010061982 DNA Ligases Proteins 0.000 description 5
- 239000007853 buffer solution Substances 0.000 description 5
- 229930027945 nicotinamide-adenine dinucleotide Natural products 0.000 description 5
- 230000035939 shock Effects 0.000 description 5
- IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N Acetaldehyde Chemical compound CC=O IKHGUXGNUITLKF-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 101710088194 Dehydrogenase Proteins 0.000 description 4
- NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N Propionic aldehyde Chemical compound CCC=O NBBJYMSMWIIQGU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 4
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 4
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 4
- AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L barium carbonate Chemical compound [Ba+2].[O-]C([O-])=O AYJRCSIUFZENHW-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 4
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 4
- 229960005091 chloramphenicol Drugs 0.000 description 4
- WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N chloramphenicol Chemical compound ClC(Cl)C(=O)N[C@H](CO)[C@H](O)C1=CC=C([N+]([O-])=O)C=C1 WIIZWVCIJKGZOK-RKDXNWHRSA-N 0.000 description 4
- 238000004140 cleaning Methods 0.000 description 4
- 230000002255 enzymatic effect Effects 0.000 description 4
- 229940093499 ethyl acetate Drugs 0.000 description 4
- 235000019439 ethyl acetate Nutrition 0.000 description 4
- 239000000284 extract Substances 0.000 description 4
- 239000003862 glucocorticoid Substances 0.000 description 4
- BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N isopropyl beta-D-thiogalactopyranoside Chemical compound CC(C)S[C@@H]1O[C@H](CO)[C@H](O)[C@H](O)[C@H]1O BPHPUYQFMNQIOC-NXRLNHOXSA-N 0.000 description 4
- 239000006166 lysate Substances 0.000 description 4
- BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N nicotinamide-adenine dinucleotide Chemical compound C1=CCC(C(=O)N)=CN1[C@H]1[C@H](O)[C@H](O)[C@@H](COP(O)(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@@H](O2)N2C3=NC=NC(N)=C3N=C2)O)O1 BOPGDPNILDQYTO-NNYOXOHSSA-N 0.000 description 4
- 230000003647 oxidation Effects 0.000 description 4
- 108091033319 polynucleotide Proteins 0.000 description 4
- 102000040430 polynucleotide Human genes 0.000 description 4
- 239000002157 polynucleotide Substances 0.000 description 4
- 229910000030 sodium bicarbonate Inorganic materials 0.000 description 4
- 108091032973 (ribonucleotides)n+m Proteins 0.000 description 3
- 108010021809 Alcohol dehydrogenase Proteins 0.000 description 3
- 102000007698 Alcohol dehydrogenase Human genes 0.000 description 3
- 241000219095 Vitis Species 0.000 description 3
- 235000009754 Vitis X bourquina Nutrition 0.000 description 3
- 235000012333 Vitis X labruscana Nutrition 0.000 description 3
- 235000014787 Vitis vinifera Nutrition 0.000 description 3
- GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N bromine Chemical compound BrBr GDTBXPJZTBHREO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 239000003153 chemical reaction reagent Substances 0.000 description 3
- KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N citric acid Chemical compound OC(=O)CC(O)(C(O)=O)CC(O)=O KRKNYBCHXYNGOX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 3
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 description 3
- 239000000499 gel Substances 0.000 description 3
- 239000001257 hydrogen Substances 0.000 description 3
- 229910052739 hydrogen Inorganic materials 0.000 description 3
- 230000001939 inductive effect Effects 0.000 description 3
- SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N kanamycin Chemical class O[C@@H]1[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](CN)O[C@@H]1O[C@H]1[C@H](O)[C@@H](O[C@@H]2[C@@H]([C@@H](N)[C@H](O)[C@@H](CO)O2)O)[C@H](N)C[C@@H]1N SBUJHOSQTJFQJX-NOAMYHISSA-N 0.000 description 3
- 229930027917 kanamycin Natural products 0.000 description 3
- 238000012805 post-processing Methods 0.000 description 3
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 description 3
- 238000012216 screening Methods 0.000 description 3
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 3
- 238000013519 translation Methods 0.000 description 3
- PPYKTTGONDVGPX-UHFFFAOYSA-N 2-(chloromethyl)oxane Chemical compound ClCC1CCCCO1 PPYKTTGONDVGPX-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- GUPGZURVZDIQPM-UHFFFAOYSA-N 2-oxoethyl acetate Chemical compound CC(=O)OCC=O GUPGZURVZDIQPM-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 6-methoxy-1,2,3,4-tetrahydroquinoline Chemical compound N1CCCC2=CC(OC)=CC=C21 FRXSZNDVFUDTIR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N Acetic acid Chemical compound CC(O)=O QTBSBXVTEAMEQO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N Ammonia chloride Chemical compound [NH4+].[Cl-] NLXLAEXVIDQMFP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N Atorvastatin Chemical compound C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CC[C@@H](O)C[C@@H](O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-KAYWLYCHSA-N 0.000 description 2
- XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N Atorvastatin Natural products C=1C=CC=CC=1C1=C(C=2C=CC(F)=CC=2)N(CCC(O)CC(O)CC(O)=O)C(C(C)C)=C1C(=O)NC1=CC=CC=C1 XUKUURHRXDUEBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N Bromine atom Chemical compound [Br] WKBOTKDWSSQWDR-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N Hydrogen Chemical compound [H][H] UFHFLCQGNIYNRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 2
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N Phosphoric acid Chemical compound OP(O)(O)=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000012181 QIAquick gel extraction kit Methods 0.000 description 2
- PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L Sodium Sulfate Chemical compound [Na+].[Na+].[O-]S([O-])(=O)=O PMZURENOXWZQFD-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 2
- FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M Sodium chloride Chemical compound [Na+].[Cl-] FAPWRFPIFSIZLT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N [[(2r,3r,4r,5r)-5-(6-aminopurin-9-yl)-3-hydroxy-4-phosphonooxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl] [(2s,3r,4s,5s)-5-(3-carbamoylpyridin-1-ium-1-yl)-3,4-dihydroxyoxolan-2-yl]methyl phosphate Chemical compound NC(=O)C1=CC=C[N+]([C@@H]2[C@H]([C@@H](O)[C@H](COP([O-])(=O)OP(O)(=O)OC[C@@H]3[C@H]([C@@H](OP(O)(O)=O)[C@@H](O3)N3C4=NC=NC(N)=C4N=C3)O)O2)O)=C1 XJLXINKUBYWONI-DQQFMEOOSA-N 0.000 description 2
- IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N acetaldehyde Chemical compound [14CH]([14CH3])=O IKHGUXGNUITLKF-XPULMUKRSA-N 0.000 description 2
- 125000003368 amide group Chemical group 0.000 description 2
- 229960005370 atorvastatin Drugs 0.000 description 2
- 125000001584 benzyloxycarbonyl group Chemical group C(=O)(OCC1=CC=CC=C1)* 0.000 description 2
- 229910052794 bromium Inorganic materials 0.000 description 2
- 239000000460 chlorine Substances 0.000 description 2
- 125000004218 chloromethyl group Chemical group [H]C([H])(Cl)* 0.000 description 2
- 230000004186 co-expression Effects 0.000 description 2
- XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N cyanic acid Chemical compound OC#N XLJMAIOERFSOGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 238000000605 extraction Methods 0.000 description 2
- 238000013467 fragmentation Methods 0.000 description 2
- 238000006062 fragmentation reaction Methods 0.000 description 2
- 108020001507 fusion proteins Proteins 0.000 description 2
- 102000037865 fusion proteins Human genes 0.000 description 2
- 239000012074 organic phase Substances 0.000 description 2
- UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N phenylmethyl ester of formic acid Natural products O=COCC1=CC=CC=C1 UYWQUFXKFGHYNT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 2
- 235000017557 sodium bicarbonate Nutrition 0.000 description 2
- 230000000392 somatic effect Effects 0.000 description 2
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 2
- 230000009182 swimming Effects 0.000 description 2
- 230000009466 transformation Effects 0.000 description 2
- KLWVUDQIPZIXER-UHNVWZDZSA-N (4r,6s)-6-(chloromethyl)-4-hydroxyoxan-2-one Chemical compound O[C@@H]1C[C@@H](CCl)OC(=O)C1 KLWVUDQIPZIXER-UHNVWZDZSA-N 0.000 description 1
- FKGBHDMAIUNVOB-XSYQQOMZSA-N (4r,6s)-6-(chloromethyl)oxane-2,4-diol Chemical compound O[C@H]1CC(O)O[C@H](CCl)C1 FKGBHDMAIUNVOB-XSYQQOMZSA-N 0.000 description 1
- UKWCJZWOXWIZRC-UHFFFAOYSA-N 1-methylpyrrolidine-2,4-diol Chemical compound CN1CC(O)CC1O UKWCJZWOXWIZRC-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-L 2,2-diethylpropanedioate Chemical compound CCC(CC)(C([O-])=O)C([O-])=O LTMRRSWNXVJMBA-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 2-amino-2-(hydroxymethyl)propane-1,3-diol;hydron;chloride Chemical compound Cl.OCC(N)(CO)CO QKNYBSVHEMOAJP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- ILRPDUAULRTNPN-UHFFFAOYSA-N 2-methyloxane-2,4-diol Chemical compound OC1(OCCC(C1)O)C ILRPDUAULRTNPN-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FKGBHDMAIUNVOB-UHFFFAOYSA-N 6-(chloromethyl)oxane-2,4-diol Chemical class OC1CC(O)OC(CCl)C1 FKGBHDMAIUNVOB-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L Calcium chloride Chemical compound [Cl-].[Cl-].[Ca+2] UXVMQQNJUSDDNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N Chlorine atom Chemical compound [Cl] ZAMOUSCENKQFHK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 108020004705 Codon Proteins 0.000 description 1
- 101150077682 DERA gene Proteins 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- 241001522296 Erithacus rubecula Species 0.000 description 1
- 102000001390 Fructose-Bisphosphate Aldolase Human genes 0.000 description 1
- 108010068561 Fructose-Bisphosphate Aldolase Proteins 0.000 description 1
- 230000005526 G1 to G0 transition Effects 0.000 description 1
- 108010020056 Hydrogenase Proteins 0.000 description 1
- DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M Ilexoside XXIX Chemical compound C[C@@H]1CC[C@@]2(CC[C@@]3(C(=CC[C@H]4[C@]3(CC[C@@H]5[C@@]4(CC[C@@H](C5(C)C)OS(=O)(=O)[O-])C)C)[C@@H]2[C@]1(C)O)C)C(=O)O[C@H]6[C@@H]([C@H]([C@@H]([C@H](O6)CO)O)O)O.[Na+] DGAQECJNVWCQMB-PUAWFVPOSA-M 0.000 description 1
- 238000012408 PCR amplification Methods 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 229940123934 Reductase inhibitor Drugs 0.000 description 1
- 239000005708 Sodium hypochlorite Substances 0.000 description 1
- 108091081024 Start codon Proteins 0.000 description 1
- 108020005038 Terminator Codon Proteins 0.000 description 1
- DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N acetaldehyde Diethyl Acetal Natural products CCOC(C)OCC DHKHKXVYLBGOIT-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 150000001241 acetals Chemical class 0.000 description 1
- 229960000583 acetic acid Drugs 0.000 description 1
- 239000002253 acid Substances 0.000 description 1
- 239000008186 active pharmaceutical agent Substances 0.000 description 1
- 150000001299 aldehydes Chemical class 0.000 description 1
- 229910000147 aluminium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 125000000539 amino acid group Chemical group 0.000 description 1
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 description 1
- 235000019270 ammonium chloride Nutrition 0.000 description 1
- 229960000723 ampicillin Drugs 0.000 description 1
- AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N ampicillin Chemical compound C1([C@@H](N)C(=O)N[C@H]2[C@H]3SC([C@@H](N3C2=O)C(O)=O)(C)C)=CC=CC=C1 AVKUERGKIZMTKX-NJBDSQKTSA-N 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N beta-D-glucose Chemical compound OC[C@H]1O[C@@H](O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-VFUOTHLCSA-N 0.000 description 1
- 239000001110 calcium chloride Substances 0.000 description 1
- 229910001628 calcium chloride Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000000969 carrier Substances 0.000 description 1
- 239000012159 carrier gas Substances 0.000 description 1
- 239000012295 chemical reaction liquid Substances 0.000 description 1
- 229910052801 chlorine Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000005515 coenzyme Substances 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 230000009089 cytolysis Effects 0.000 description 1
- 238000010790 dilution Methods 0.000 description 1
- 239000012895 dilution Substances 0.000 description 1
- 125000000118 dimethyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N ethyl 2-amino-4-(trifluoromethyl)-1,3-thiazole-5-carboxylate Chemical compound CCOC(=O)C=1SC(N)=NC=1C(F)(F)F XJRPTMORGOIMMI-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000004817 gas chromatography Methods 0.000 description 1
- 101150019455 gdh gene Proteins 0.000 description 1
- 238000010353 genetic engineering Methods 0.000 description 1
- 239000012362 glacial acetic acid Substances 0.000 description 1
- 229930182478 glucoside Natural products 0.000 description 1
- 239000003292 glue Substances 0.000 description 1
- 239000001307 helium Substances 0.000 description 1
- 229910052734 helium Inorganic materials 0.000 description 1
- SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N helium atom Chemical compound [He] SWQJXJOGLNCZEY-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 description 1
- 230000001976 improved effect Effects 0.000 description 1
- 238000011534 incubation Methods 0.000 description 1
- 230000006698 induction Effects 0.000 description 1
- 239000003112 inhibitor Substances 0.000 description 1
- 238000003780 insertion Methods 0.000 description 1
- 230000037431 insertion Effects 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N kalafungina Chemical compound O=C1C2=C(O)C=CC=C2C(=O)C2=C1[C@@H](C)O[C@H]1[C@@H]2OC(=O)C1 XUWPJKDMEZSVTP-LTYMHZPRSA-N 0.000 description 1
- 229940050906 magnesium chloride hexahydrate Drugs 0.000 description 1
- DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L magnesium dichloride hexahydrate Chemical compound O.O.O.O.O.O.[Mg+2].[Cl-].[Cl-] DHRRIBDTHFBPNG-UHFFFAOYSA-L 0.000 description 1
- 230000002503 metabolic effect Effects 0.000 description 1
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 1
- 229910000402 monopotassium phosphate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000019796 monopotassium phosphate Nutrition 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 231100000989 no adverse effect Toxicity 0.000 description 1
- 239000003960 organic solvent Substances 0.000 description 1
- PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N phosphoric acid;potassium Chemical compound [K].OP(O)(O)=O PJNZPQUBCPKICU-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229960002797 pitavastatin Drugs 0.000 description 1
- VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N pitavastatin Chemical compound OC(=O)C[C@H](O)C[C@H](O)\C=C\C1=C(C2CC2)N=C2C=CC=CC2=C1C1=CC=C(F)C=C1 VGYFMXBACGZSIL-MCBHFWOFSA-N 0.000 description 1
- 239000013600 plasmid vector Substances 0.000 description 1
- 238000002264 polyacrylamide gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000008092 positive effect Effects 0.000 description 1
- 125000002924 primary amino group Chemical group [H]N([H])* 0.000 description 1
- 238000012545 processing Methods 0.000 description 1
- 239000002994 raw material Substances 0.000 description 1
- 238000011160 research Methods 0.000 description 1
- 229920005573 silicon-containing polymer Polymers 0.000 description 1
- 239000011734 sodium Substances 0.000 description 1
- 229910052708 sodium Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000011780 sodium chloride Substances 0.000 description 1
- SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N sodium hypochlorite Chemical compound [Na+].Cl[O-] SUKJFIGYRHOWBL-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229910052938 sodium sulfate Inorganic materials 0.000 description 1
- 235000011152 sodium sulphate Nutrition 0.000 description 1
- 239000002689 soil Substances 0.000 description 1
- 239000000126 substance Substances 0.000 description 1
- 238000012549 training Methods 0.000 description 1
- 238000002525 ultrasonication Methods 0.000 description 1
- 230000003519 ventilatory effect Effects 0.000 description 1
- 238000012795 verification Methods 0.000 description 1
- 238000010792 warming Methods 0.000 description 1
- 210000004885 white matter Anatomy 0.000 description 1
Landscapes
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Enzymes And Modification Thereof (AREA)
Abstract
本发明提供了一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6‑取代四氢吡喃‑2‑酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶‑化学合成方法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物工程技术领域，尤其涉及一种葡萄糖脱氢酶突变体，生产该葡萄糖脱氢酶突变体的基因工程菌的构建，该葡萄糖脱氢酶突变体的生产及应用。
背景技术
本发明涉及制备如下式I所示的化合物的方法。
上述的化合物适于在若干药物活性成分的制备中作为中间体，特别是制备HMG-CoA还原酶抑制剂时，更特别地，制备斯达汀(statin)时，例如制备阿托伐他汀(Atorvastatin)时。现有技术中对于制备上述结构式I化合物的方法一般包括：
例如，Advanced Synthesis&Catalysis,2008,350,1751-59公开了6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇在液溴-水氧化下生成内酯；又如，美国专利US6870059公开了利用溴的溶液氧化6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇生成内酯的反应；再如，PNAS,2004,101,5788-93公开了6-氯代甲基-四氢吡喃-2,4-二醇在次氯酸钠和冰醋酸氧化下生成内酯的反应；再如，国际申请WO2006134482中公开了6-氨基乙基-四氢吡喃-2,4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；再如，国际申请WO2009019561中公开了6-氨基乙基-四氢吡喃-2,4-二醇在碳酸钡和液溴作用下生成内酯的反应；又如，国际申请WO2013068917中公开了如下式II所示的化合物在醇脱氢酶作用下生成式I所示的化合物，如下所示：
但是，上述的方法或者存在反应比较剧烈，后处理难以进行，或者存在对环境不友好的缺点，或者存在反应试剂价格昂贵等缺点，所以不适合工业化大生产的进行。
由于化学法存在着上述的缺点与不足，现在对于生物催化的方法开始进行较多的研究，比如：国际申请WO2013068917公开了(4R,6S)-6-氯代甲基四氢-2H-吡喃-2,4-二醇在醇脱氢酶(ADH)作用下生成(4R,6S)-6-氯代甲基-4-羟基四氢-2H-吡喃-2-酮的方法。Lek公司在Metabolic Engining上报道了用大肠杆菌来源的吡咯喹啉醌(PQQ)依赖的葡萄糖脱氢酶(PQQ-GDH)实现半缩醛到内酯的氧化，但是转化过程中需要补加昂贵的PQQ，成本较高。
发明内容
针对现有技术中半缩醛氧化成内酯的反应中反应比较剧烈，后处理难以进行，或者对环境不友好，或者反应试剂价格昂贵，添加了价格较为昂贵的辅酶，不适合工业化大生产等缺点，本发明提供一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。还提供了该葡萄糖脱氢酶的基因，含有该基因的重组表达载体、重组表达转化体及，该葡萄糖脱氢酶的高效制备方法，以及该葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛氧化成内酯中的用途。
本发明通过下述技术方案以解决上述技术问题：
本发明的第一方面提供了一种分离的葡萄糖脱氢酶，其是如下(a)、(b)或(c)的蛋白质：
(a)由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
SEQ ID No:1所示的氨基酸序列组成的蛋白质由环境DNA编码，具有氧化脱氢的功能，是一种新的葡萄糖脱氢酶。
(b)在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸残基衍生的具有氧化脱氢活性的蛋白质。
其中，所述的“几个”是指2个至小于100个，更佳的小于30个。比如添加一个外分泌信号肽的融合蛋白，本发明发现这样的融合蛋白同样具有氧化脱氢酶活性。也就是说，只要由(a)衍生的蛋白质具有氧化脱氢酶活性，且衍生方式如上所述，都可以达到本发明的发明目的。根据本发明，在如SEQ ID No:1所示氨基酸序列的蛋白质(a)分子中进行1～30个氨基酸残基的突变，仍然保持氧化脱氢酶活性。
(c)和(a)的氨基酸序列具有至少80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％同一性且具有氧化脱氢活性的蛋白质。
SEQ ID No:1所示的葡萄糖脱氢酶和已知的葡萄糖脱氢酶，如大肠杆菌来源的PQQ依赖的GDH之间的同一性为76％，具有显著的差异性。
蛋白质(b)是在(a)的氨基酸序列中经过取代、缺失或添加一个或几个氨基酸且具有氧化脱氢酶活性的由(a)衍生的并和(a)的氨基酸序列至少95％相同的蛋白质。
在本文中，氨基酸序列之间的同一性是根据序列的全长进行计算，优选采用NCBIBlastp程序进行比对，默认参数。
本发明的第二个方面提供了一种分离的核酸，其编码本发明的葡萄糖脱氢酶。优选地，所述核酸是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。
SEQ ID No:2所示的核苷酸序列组成的核酸来源于环境DNA，其可以从含有该核酸的土壤或培养基中分离获得，也可以从含有该核酸的重组表达载体中或重组转化体中分离获得，也可以全基因人工合成获得。
本发明中，SEQ ID No:2所示的基因命名为BYKY-GDH，全长786bp。其中，其编码序列(CDS)从第1个碱基起至第783个碱基止，起始密码子为ATG，终止密码子为TAA。该序列无内含子，其编码的氨基酸序列如序列表中SEQ ID No:1所示。
如本领域技术人员所知，由于密码子的简并性，编码SEQ ID No:1的氨基酸序列的核苷酸序列不仅仅局限于SEQ ID No:2。本发明的氧化脱氢酶基因的核苷酸序列也可以是编码序列表中SEQ ID No:1所示氨基酸序列的其他任何核苷酸序列。另外，还可以通过适当引入替换、缺失或插入来提供一个多聚核苷酸的同系物。本发明中多聚核苷酸的同系物可以通过对核苷酸序列SEQ ID No:2的一个或多个碱基在保持酶活性范围内进行替换、缺失或添加来制得。
SEQ ID No:2的同系物也指启动子变体。在所述的核苷酸序列之前的启动子或信号序列可通过一个或多个核苷酸的替换、插入或缺失而改变，但这些改变对启动子的功能没有负面影响。而且通过改变启动子的序列或甚至用来自不同种生物体的更有效的启动子完全替换，可提高目标蛋白的表达水平。
SEQ ID No:2的同系物还指在标准条件下能够与SEQ ID No:2所示序列的多聚核酸进行杂交的多聚核酸。在标准条件下进行杂交可根据《分子克隆实验指南》中描述的方式进行：Cold Spring Harbor Laboratory Press，分子生物学中的通用方案(CurrentProtocols in Molecular Biology)。具体来说，杂交可以按照如下步骤进行：将一个载有被转录的待测DNA或RNA分子的膜与一个标记探针在杂交缓冲液中进行杂交；杂交缓冲液的组成为0.1wt％SDS、5wt％硫酸右旋糖苷、一盒1/20的稀释抑制剂以及2～8×SSC；20×SSC为3M氯化钠和0.3M的柠檬酸组成的溶液；杂交温度为50～70℃；在培养几个小时或过夜后，用清洗缓冲液清洗膜；清洗温度为室温，更优选为杂交温度；清洗缓冲液的组成为6×SSC+0.1wt％SDS溶液，更优选为5×SSC+0.1wt％SDS；当用这种清洗缓冲液清洗完膜后，就可以通过DNA或RNA分子内被杂交的探针上的标记来识别DNA或RNA分子。
本发明的第三个方面提供了一种包含本发明的葡萄糖脱氢酶基因的重组表达载体。其可通过本领域常规方法将本发明的氧化脱氢酶基因或其突变体的核酸序列连接于各种表达载体上构建而成。所述的表达载体可为本领域常规的各种载体，如市售的质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体等，优选质粒载体。较佳的，可通过下述方法制得本发明的重组表达载体：将通过PCR扩增所得的核酸产物与表达载体pET21a分别用NdeI和XhoI酶切，形成互补的粘性末端，经T4 DNA连接酶连接，形成含有本发明的葡萄糖脱氢酶基因的重组表达质粒pET21-GDH或其突变体表达质粒。
本发明的第四个方面是提供一种包含本发明的重组表达载体的重组表达转化体。可通过将本发明的重组表达载体转化至宿主细胞中制得。所述的宿主细胞可为本领域常规的宿主细胞，只要能满足重组表达载体可稳定地自行复制，且所携带的本发明的葡萄糖脱氢酶基因可被有效表达即可。本发明优选大肠杆菌(E.coli)，更优选E.Coli BL21(DE3)。将前述重组表达质粒pET21-GDH或其突变体转化至E.Coli BL21(DE3)中，即可获得本发明优选的基因工程菌株，即E.Coli BL21(DE3)/pET21-GDH或其突变体。转化方法可选择本领域常规方法，如电转法、热击法等，较佳地选择热击法进行转化即可，热击条件较佳的是：42℃，热击45秒。
本发明的第五个方面是提供一种重组葡萄糖脱氢酶的制备方法，其包括如下的步骤：培养本发明的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组葡萄糖脱氢酶。
本发明中催化半缩醛进行氧化反应形成内酯的催化剂，可以是上述产生重组葡萄糖脱氢酶的转化体的培养物，也可以是通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。这里“加工的制品”是指由转化体得到的提取物、或通过对提取物中的葡萄糖脱氢酶进行分离和/或纯化得到的分离产品，或者通过固定化转化体细胞或提取物或转化体的分离产品而得到的固定化制品。
本发明的第六个方面提供了一种本发明的葡萄糖脱氢酶或重组葡萄糖脱氢酶在催化半缩醛化合物进行氧化反应形成内酯中的应用。
所述的半缩醛化合物较佳的为6-取代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃衍生物，更佳的是6-取代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃，最佳的是(4R,6S)-6-取代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃，即式I所示的化合物：
其中，
X选自离去基团、叠氮基、具有1～6个碳原子的叠氮烷基、-CN、-OH、或-COOR1基团；R1选自具有1～6个碳原子的烷基或具有6～12个碳原子的芳基；
R为H或羟基保护基，优选为H。
优选地，R为H、碳链长度为1～8个碳原子的烷基或苄基。
优选地，离去基团选自卤素、磺酸酯基团、酰氧基；苯乙酰氧基、烷氧基、芳氧基、或者R2R3NCH2；其中R2、R3各自独立的选自H、具有2～7个碳原子的烷氧羰基、具有8～14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6～12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7～19个碳原子芳基烷基、具有2～7个碳原子的烷基酰基或邻苯二甲酰亚氨基；
更优选X为Cl，R为H，即式I是6-氯代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃，最优选为(4R,6S)-6-氯代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃。
本发明所述的氧化脱氢反应的各条件可按照本领域此类反应的常规条件进行选择，较佳地，所述的应用包括下述的步骤：合成半缩醛，同时或随后加入葡萄糖脱氢酶，使半缩醛氧化成内酯。
其中，所述的半缩醛化合物在反应液中的较佳的浓度为1～100g/L。本发明的葡萄糖脱氢酶为催化有效量，较佳地为0.1～10g/L。所述的水溶液可为本领域常规缓冲液，只要其pH范围在5.0～8.0即可，如碳酸氢钠水溶液。碳酸氢钠水溶液的浓度较佳为0.05～0.1mol/L。任选地，所述反应液中还添加0～1.0mM的吡咯喹啉醌(PQQ)。所述的氧化反应较佳地在振荡或搅拌条件下进行。所述的葡萄糖脱氢酶氧化反应的温度较佳为10～40℃，更佳为25～37℃。所述的氧化反应的时间较佳的以反应过程中，产物浓度不再持续提高的时间为准。葡萄糖脱氢酶氧化反应结束后，可按本领域常规方法从反应液中提取内酯化合物。
在一个具体的实施方案中，将收集的重组表达大肠杆菌菌体加入0.05～0.1M的NaHCO3缓冲液(pH 7.2)中，所述的NaHCO3缓冲液的量为1～3倍体积。反应后离心取上清粗酶液。DERA酶加入浓度为0.3～1M氯乙醛(或乙酰氧基乙醛、苄氧基羰基胺基丙醛)和浓度为0.45～2.5M乙醛，在10～30℃反应4～8h。反应结束后用乙酸乙酯萃取得到半缩醛粗品，将该半缩醛粗品溶于10倍体积的NaHCO3缓冲液(pH 7.2)，加15～25％体积的GDH发酵液；或在2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)催化的反应体系中直接加入15～25％体积的GDH发酵液，控制pH 6.8～7.0，在25～37℃反应得到相应的内酯。
在另一个具体的实施方案中，将6-位被氯甲基、乙酰氧基或苄氧羰基氨基甲基取代的四氢吡喃-2,4-二羟基中加入5～15倍体积的NaHCO3缓冲液(pH 7.2)，再加入15～25％体积的GDH发酵液，反应得到相应的内酯。
在第三种具体的实施方式中，在DERA-GDH发酵液中加入氯乙醛(或乙酰氧基乙醛、苄氧基羰基胺基丙醛)和乙醛，控制pH 6.8-7.0，在25～37℃反应得到相应的内酯。
本发明所用试剂和原料均可市售获得。
本发明的积极进步效果在于：针对已报道的制备他汀类药物及其中间体的反应中反应比较剧烈，后处理难以进行，或者对环境不友好，或者反应试剂价格昂贵，不适合工业化大生产等缺点，提供一种催化活性高、反应收率高，对环境友好的葡萄糖脱氢酶进行氧化合成6-取代四氢吡喃-2-酮衍生物，进而进一步合成他汀类药物中间体的酶-化学合成方法。使用本发明方法制备所得的产物收率高，纯度高，溶剂易回收，反应条件温和，对环境友好，操作简便，易于工业放大，因此具有很好的工业应用前景。
附图说明
图1是pWF-1的质粒图谱。
图2是葡萄糖脱氢酶基因PCR产物的琼脂糖凝胶电泳图，M为DNA分子量标准。
图3是葡萄糖脱氢酶粗酶液的聚丙烯酰胺凝胶电泳图。M为分子量标准，泳道1为全菌蛋白裂解液。
图4是醛缩酶和葡萄糖脱氢酶共表达质粒的表达图谱。M为分子量标准，泳道1为全菌蛋白裂解液。
图5是NADH氧化酶的表达图谱。
具体实施方式
下面通过实施例来进一步说明本发明，但本发明并不受其限制。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照制造厂商所建议的条件。
实施例1克隆葡萄糖脱氢酶(GDH)
从华东理工大学采集土壤样品DNA(Chroma Spin TE-1000，ClontechLaboratories，Inc.，USA)，用Sau3AI部分酶切，电泳收集1～4kb的片段，回收并连接到pWF-1(质粒图谱见图1)的BamHI位点，得到质粒文库；将文库转化到E.coliJM109，涂布到含有100μg/mL氨苄青霉素的LB平板，挑选阳性克隆到加有500μL LB(含100μg/mL氨苄青霉素)的96深孔孔板，37℃培养4小时后加1mM IPTG诱导，30℃继续培养过夜，然后各取100μL深孔培养物到新的96孔板，离心收菌，用50mM Tris-HCl(pH 7.0)重悬细菌，加入10μL 10×Bugbuster master mix使细菌裂解。取新的96孔板，各加入100μL含有20mM半缩醛、200mM氢氰酸和0.002％溴甲酚紫的水溶液。45℃反应30min，紫色变化最快的即为活力最高的菌落。挑取对应的孔所对应的深孔培养物，提取质粒并测序，用NCBI的ORF Finder分析其开放读码框(ORF)，得到GDH基因编码序列(SEQ ID No:2)和相应的氨基酸序列(SEQ ID No:1)。
实施例2 GDH的表达
将实施例1中所得的葡萄糖脱氢基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和XhoI酶切后的质粒pET21a在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含100μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基，筛选阳性克隆即得到重组表达质粒pET21-GDH。
将上述重组表达质粒转化到大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)感受态细胞中，转化条件为42℃，热击90秒，在含有100μg/mL氨苄青霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(见图2)。培养重组菌，即获得阳性重组转化体E.coliBL21(DE3)/pET21-GDH。
实施例3 GDH和DERA的共表达
将实施例1中所得的葡萄糖脱氢酶基因DNA片段在37℃用限制性内切酶NdeI和XhoI双酶切8h，经琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段在T4 DNA连接酶的作用下，与同样经NdeI和XhoI酶切后的质粒载体pACYC-Duet在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板，筛选阳性克隆即得到重组表达质粒pACYC-GDH。将中国专利申请CN201310381492中的野生型大肠杆菌2-脱氧-D-核糖-5-磷酸醛缩酶(DERA)基因(核苷酸序列为SEQ ID No:3)用限制性内切酶NcoI和HindIII双酶切4小时，经过琼脂糖凝胶电泳纯化，利用琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收目标片段。将目标片段用T4 DNA连接酶连接到经同样NcoI和HindIII双酶切的pACYC-GDH质粒，在16℃下连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态，涂布于含有30μg/mL氯霉素的LB固体平板，筛选阳性克隆即得到重组共表达表达质粒pACYC-GDH-DERA。
将上述重组表达质粒转化到E.coliBL21(DE3)感受态细胞中，转化条件为42℃，热击90秒，在含有30μg/mL氯霉素的抗性平板上对阳性重组体进行筛选，挑取单克隆，菌落PCR验证阳性克隆(见图4)。培养重组菌，即获得阳性重组转化体E.coli BL21(DE3)/pACYC-GDH-DERA。
实施例4 GDH和DERA的共转化
将实施例1中所得的葡萄糖脱氢酶基因DNA片段用NdeI和XhoI酶切并连接到pET28a的相同位点，在含有50μg/mL卡那霉素的LB培养皿上筛选阳性菌株，得到GDH表达质粒pET28-GDH。将该质粒转化到E.coliBL21(DE3)得到含有GDH表达质粒的大肠杆菌菌株，以它作为宿主制备感受态细胞，将含有DERA基因(核苷酸序列为SEQ ID No:3)的质粒pET21-DERA(参见中国专利申请CN201310381492)转化到上述菌株中，在LB培养皿上得到同时具有卡那霉素和氨苄西林抗性的阳性菌落。
实施例5 NADH氧化酶
NADH氧化酶基因(NCBI登录号AF014458.2，SEQ ID No:5，编码的氨基酸序列为SEQID No:4)通过DNA合成得到，在5’-端和3-’端分别引入NdeI和XhoI位点，通过T4 DNA连接酶连接到同样用NdeI和XhoI双酶切的pET28a载体中，连接产物16℃反应过夜，转化到E.coliTop10，得到NADH氧化酶表达质粒pET28-NADH-Ox。后者经过测序验证后，转化到E.coliBL21(DE3)中，在含有30μg/mL卡那霉素抗性的LB平板上筛选阳性菌落，即为NADH氧化酶表达菌株E.coli BL21(DE3)/pET28-NADH-Ox(见图5)。
实施例6 GDH单表达菌株的高密度发酵
将按照实施例2获得的重组大肠杆菌E.coli BL21(DE3)/pET21-GDH接种于含有100μg/mL氨苄西林的200mL LB培养基中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基，含葡萄糖4g/L，磷酸氢二钠12.8g/L，磷酸二氢钾3g/L，氯化铵1g/L，硫酸钠0.5g/L，氯化钙0.0152g/L，六水氯化镁0.41g/L)中，在25～35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
实施例7 GDH与DERA共表达菌株的高密度发酵
将按照实施例3或4获得的重组大肠杆菌接种于含有30μg/mL氯霉素(实施例3)或同时含有50μg/mL卡那霉素和100μg/mL氨苄西林(实施例4)的200mLLB培养基中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基)中，在25～35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
实施例8 NADH氧化酶的高密度发酵
将按照实施例5获得的E.coli BL21(DE3)/pET28-NADH-Ox重组大肠杆菌接种于含有30μg/mL氯霉素的200mL LB培养基中，于37℃，180～220rpm培养10～16h。将上述培养好的种子按10％(v/v)的比例接种于3L上罐发酵培养基(M9培养基)中，在25～35℃，300～800rpm，空气流量2～6L/min的条件下培养。培养6～10h后，以5～20mL/h的速率流加含60％甘油的补料培养基，持续至发酵结束。流加补料培养基数小时至OD600达到20～40时，添加0.1～1mM IPTG开始诱导。诱导5～15h后，放罐，5000rpm离心收集菌体。
实施例9 GDH转化半缩醛到内酯
GDH粗酶液的制备：取实施例4收集的GDH单表达大肠杆菌菌体2L，加入1～3倍体积的0.05MNaHCO3缓冲液(pH 7.2)。超声破碎30min，10000rpm离心取上清作为GDH粗酶液，用于酶催化反应。
DERA的催化：在2L的催化反应体系中，氯乙醛的浓度为3M，乙醛的浓度为6.5M溶于有机溶剂中，加入氯乙醛质量5％的DERA酶。反应温度：10～30℃，催化时间：4～8h。
GDH的催化：DERA催化反应结束后用5倍体积乙酸乙酯萃取得到半缩醛粗品，溶于10倍体积的NaHCO3缓冲液(pH 7.2)，直接加入15％体积的GDH粗酶液，300～400rpm搅拌，控制pH 6.8～7.0，通气0.3L/min，30～37℃反应3～4h，GC检测反应，结束后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋干得到内酯粗产物379g，纯度96.8％，摩尔收率78％，e.e.值>99％。
实施例10～11 GDH转化半缩醛到内酯
基本按照实施例9的方法转化表1中的底物。
表1 各种底物的转化
实施例12 GDH转化半缩醛到内酯
在2L的催化体系中，3M的(4R,6S)-6-(氯甲基)四氢-2H-吡喃-2,4-二醇中加入10倍体积的NaHCO3缓冲液(pH 7.2)，加入15％体积的实施例9中制备的GDH粗酶液，按照实施例9的方法反应5h后，旋干得到相应的内酯粗品461g，纯度96.8％，摩尔收率95％，e.e.值>99％。
实施例13～14 GDH转化半缩醛到内酯
基本按照实施例12的方法转化表2中的底物。
表2 各种底物的转化
实施例15 GDH和DERA的共表达菌株的转化得到内酯
在2L反应体系中，加入实施例7得到的DERA-GDH发酵液800mL，实施例8得到的NADH氧化酶200mL，30分钟内流加600mM氯乙醛和1300mM乙醛，使总体积达到2L，控制pH 6.8～7.0，在30～37℃反应4h，维持通气量0.7L/min。气相检测反应进程，反应结束后用乙酸乙酯萃取三次，合并有机相，旋干得到内酯粗品87.5g，纯度96.8％，摩尔收率90％，e.e.值>99％。
实施例16～17 GDH和DERA的共表达菌株的转化得到内酯
基本按照实施例15的方法转化表3中的底物。
表3 各种底物的转化
实施例18 GDH的测活，反应的检测
用于前述实施例中的GDH酶活力检测和产物检测按如下方法进行：
GDH酶活力检测：每2mL反应液包括100μL大肠杆菌裂解液，10mM半缩醛，250μMNADP+，PBS缓冲液，340nm波长下用分光光度计检测NADPH的生成速度。
NADH氧化酶的酶活力检测：每2mL反应液包括：100μL大肠杆菌裂解液，10mM半缩醛，250μM NADH，pH7.0的PBS缓冲液，340nm波长下用分光光度计检测NADH的生成速度。
酶活单位定义为每分钟生成或消耗1μmol的NADH的酶量。
产物检测：采用气相色谱法，以丙二酸二乙酯为内标，色谱柱为非极性柱，固定相为100％聚二甲基硅氧烷；柱温50℃(停留2min)，后以10℃/min升温到240℃；载气为氦气；进样口温度：300℃；离子源温度250℃；两个产物峰分别在11.3min、13.1min；内标峰出峰在8.1min。
Claims (21)
1.一种分离的葡萄糖脱氢酶，其是由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质。
2.编码权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶的分离的核酸。
3.根据权利要求2所述的核酸，其是由SEQ ID No:2所示核苷酸序列组成的。
4.包含权利要求2或3所述的核酸的重组表达载体。
5.根据权利要求4所述的重组表达载体，其选自质粒、粘粒、噬菌体或病毒载体。
6.根据权利要求5所述的重组表达载体，其是pET21a。
7.包含权利要求4-6任一项所述重组表达载体的重组表达转化体。
8.根据权利要求7所述的重组表达转化体，其是大肠杆菌。
9.根据权利要求8所述的重组表达转化体，其是E.coli BL21(DE3)。
10.一种重组葡萄糖脱氢酶的制备方法，其包括如下步骤：培养权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体，以及从培养物中获得重组葡萄糖脱氢酶。
11.一种催化半缩醛进行氧化反应形成内酯的催化剂，其选自权利要求7-9任一项所述的重组表达转化体的培养物，或通过将该培养物离心分离后得到的转化体细胞或者用其加工的制品。
12.权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组葡萄糖脱氢酶，或权利要求11所述的催化剂在催化半缩醛进行氧化反应形成内酯化合物中的应用。
13.根据权利要求12所述的应用，所述的半缩醛化合物选自如下式Ι所示的化合物：
其中，
X选自离去基团、叠氮基、具有1～6个碳原子的叠氮烷基、-CN、-OH、或-COOR1基团；R1选自具有1～6个碳原子的烷基或具有6～12个碳原子的芳基；
R为H或羟基保护基。
14.根据权利要求13所述的应用，其中，R为H、碳链长度为1～8个碳原子的烷基或苄基。
15.根据权利要求13所述的应用，其中，X选自卤素、磺酸酯基团、酰氧基；苯乙酰氧基、烷氧基、芳氧基、或者R2R3NCH2；其中R2、R3各自独立地选自H、具有2～7个碳原子的烷氧羰基、具有8～14个碳原子芳基烷氧基羰基、具有6～12个碳原子的芳基磺酸酯基、具有7～19个碳原子芳基烷基、具有2～7个碳原子的烷基酰基或邻苯二甲酰亚氨基。
16.根据权利要求13所述的应用，其中，X为Cl，R为H。
17.根据权利要求13所述的应用，其中，式Ι的化合物为(4R,6S)-6-氯代甲基-2,4-二羟基-四氢吡喃。
18.根据权利要求13-17任一项所述的应用，其中所述的半缩醛化合物在反应液中的浓度为1～100g/L，葡萄糖脱氢酶的用量为0.1～10g/L，任选地，所述反应液中还添加0～1.0mM的吡咯喹啉醌(PQQ)，反应在振荡或搅拌条件下进行，反应温度为10～40℃。
19.一种合成6-取代甲基-4-羟基-四氢吡喃-2-酮的方法，包括使用权利要求1所述的葡萄糖脱氢酶，权利要求10所述的方法制备的重组葡萄糖脱氢酶，或权利要求11所述的催化剂催化半缩醛进行氧化反应形成内酯化合物。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述的氧化反应由SEQ ID No:1所示氨基酸序列组成的蛋白质催化，反应液中含有100g/L的半缩醛，0.1～10g/L的葡萄糖脱氢酶，反应pH为6.8～7.5，反应温度为25～37℃。
21.一种合成他汀类中间体(3R,5S)-6-取代-3,5-二羟基己酸酯的方法，包括使用权利要求19或20所述的方法合成内酯化合物。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410588562.2A CN105624127B (zh) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | 一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201410588562.2A CN105624127B (zh) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | 一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN105624127A CN105624127A (zh) | 2016-06-01 |
| CN105624127B true CN105624127B (zh) | 2019-07-26 |
Family
ID=56039476
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201410588562.2A Active CN105624127B (zh) | 2014-10-28 | 2014-10-28 | 一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN105624127B (zh) |
Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680363A (zh) * | 2000-07-19 | 2005-10-12 | 阿斯特拉曾尼卡英国有限公司 | 2－（6－取代的1，3－二噁烷－4－基）乙酸衍生物的制备方法 |
| CN103911403A (zh) * | 2014-04-28 | 2014-07-09 | 中国药科大学 | 一种制备阿托伐他汀手性中间体的方法 |
-
2014
- 2014-10-28 CN CN201410588562.2A patent/CN105624127B/zh active Active
Patent Citations (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1680363A (zh) * | 2000-07-19 | 2005-10-12 | 阿斯特拉曾尼卡英国有限公司 | 2－（6－取代的1，3－二噁烷－4－基）乙酸衍生物的制备方法 |
| CN103911403A (zh) * | 2014-04-28 | 2014-07-09 | 中国药科大学 | 一种制备阿托伐他汀手性中间体的方法 |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| GenBank：ERI09548;NCBI;《NCBI》;20130911;ORIGIN |
| Tadeja Vajdič等.Engineered, highly productive biosynthesis of artificial, lactonized statin side-chain building blocks: The hidden potential of Escherichia coli unleashed.《Metabolic Engineering》.2014,摘要、第2.1节、第3.1节和图3. |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN105624127A (zh) | 2016-06-01 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| Ni et al. | Highly stereoselective reduction of prochiral ketones by a bacterial reductase coupled with cofactor regeneration | |
| CN111172124B (zh) | 一种羰基还原酶突变体及其在制备(r)-4-氯-3-羟基-丁酸酯中的应用 | |
| JP6473175B2 (ja) | ジカルボニル還元酵素突然変異体及びその応用 | |
| CN106164260B (zh) | 一种假丝酵母羰基还原酶及用于制备(r)-6-羟基-8-氯辛酸酯的方法 | |
| CN107142251B (zh) | 沙雷氏菌羰基还原酶及其在制备光学活性烷基内酯中的应用 | |
| CN105624125A (zh) | 醛酮还原酶及其在合成(2s,3r)-2-苯甲酰氨甲基-3-羟基丁酸酯中的应用 | |
| CN111454998B (zh) | 一种手性羟基酸酯的生物制备方法 | |
| CN105567652B (zh) | 一种酮还原酶及其在不对称合成手性羟基化合物中的应用 | |
| CN105441401B (zh) | 一种单胺氧化酶及其在合成手性氮杂双环化合物中的应用 | |
| CN106701723B (zh) | D-果糖-6-磷酸醛缩酶a突变体、重组表达载体、基因工程菌及其应用和反应产物 | |
| JP4272231B2 (ja) | キラルなヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法 | |
| CN111411128B (zh) | 一种生产α,ω-二元羧酸的整细胞生物催化方法及其应用 | |
| CN105018439B (zh) | 一种羰基还原酶及其在合成手性羟基化合物中的应用 | |
| CN104830921B (zh) | 一种酶法制备他汀类化合物中间体的方法 | |
| CN105624127B (zh) | 一种葡萄糖脱氢酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 | |
| CN105567655B (zh) | 一种卤醇脱卤酶及其在合成他汀类药物中间体中的应用 | |
| CN114008211A (zh) | 由聚对苯二甲酸乙二醇酯产生高附加值化合物的方法 | |
| KR101479133B1 (ko) | 신규 ｄ－솔비톨 탈수소화효소 및 이를 이용한 ｌ－소르보스의 생산방법 | |
| JP2008283917A (ja) | 乳酸の製造方法 | |
| KR100713103B1 (ko) | 뉴로스포라 크라사 유래 ｌ-카르니틴 생합성 관련 유전자를포함하는 엔테로박테리아세 속 미생물 및 이를 이용한ｌ-카르니틴의 제조방법 | |
| CN109536466B (zh) | 醛脱氢酶及其基因、重组菌构建及其在呋喃羧酸合成中的应用 | |
| WO2015137565A1 (ko) | 신규 포름알데하이드 탈수소효소 및 이를 이용한 포름알데하이드의 생산방법 | |
| CN110591995A (zh) | 一种共表达重组菌及其在合成呋喃羧酸中的应用 | |
| ES2437615T3 (es) | Producción de compuestos de carbonilo alfa-oxifuncionalizados | |
| WO2005123921A1 (ja) | 新規グリセロール脱水素酵素、その遺伝子、及びその利用法 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| TA01 | Transfer of patent application right |
Effective date of registration: 20180207 Address after: 201203 Shanghai city China (Shanghai) free trade zone fanchun Road No. 400 Building 1 room 436 4 Applicant after: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: Pu Si Road in Pukou District of Nanjing City, Jiangsu province 210032 No. 18 Taishan street, science and Technology Innovation Park 1 building 408 room Applicant before: NANJING ABIOCHEM BIOMEDICAL TECHNOLOGY CO.,LTD. |
|
| TA01 | Transfer of patent application right | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| CP02 | Change in the address of a patent holder |
Address after: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200240 Patentee after: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. Address before: 201203 Shanghai, China (Shanghai) free trade trial area, No. 1, 4 floor, 1 room, 400 Fang Chun road. Patentee before: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CP02 | Change in the address of a patent holder | ||
| CP03 | Change of name, title or address |
Address after: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241 Patentee after: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. Address before: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200240 Patentee before: ABIOCHEM BIOTECHNOLOGY Co.,Ltd. |
|
| CP03 | Change of name, title or address | ||
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |
Address after: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241 Patentee after: Yikelai Biotechnology (Group) Co.,Ltd. Address before: Room 3114, Building B, 555 Dongchuan Road, Minhang District, Shanghai, 200241 Patentee before: Ecolab Biotechnology (Shanghai) Co.,Ltd. |
|
| CP01 | Change in the name or title of a patent holder |