JP4272231B2 - キラルなヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法 - Google Patents
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Description
本発明は、炭素数が２から６の置換または無置換の脂肪族アルデヒド化合物に対し、アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合する、もしくはさらに２分子目のアセトアルデヒドをアルドール縮合することで、炭素数が２または４増加したヒドロキシアルデヒド化合物を製造する方法に関するものである。
Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（ＥＣ４．１．２．４）（以下、「ＤＥＲＡ」と略記する。）は、グリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドを基質とし、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸を合成するアルドール縮合およびその逆反応（レトロアルドール反応）を触媒する酵素の総称である。大腸菌由来のＤＥＲＡについては、その反応性が詳細に解析されており、比較的広い基質特異性を持ち、種々のアルデヒドのアルドール縮合を触媒し、キラルなヒドロキシアルデヒドを生成することが報告されている（非特許文献１を参照。）。
図１に示した反応スキームのように、種々のアルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合では、１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合したヒドロキシアルデヒドに、さらにもう１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合し、炭素数が４増加した化合物が得られることが報告されている。この際２分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合した化合物は、安定なラクトール構造をとるために、主反応生成物として生成すると報告されている（非特許文献２を参照。）。
しかし、従来知られているＤＥＲＡによる上述のような種々のアルデヒドに対する活性は、本来の基質であるグリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドの場合に比べ極端に低く１００分の１未満と報告されている（非特許文献３を参照。）。また、アルデヒド類は酵素に対して強力な阻害剤であり、ＤＥＲＡもアルデヒドによる阻害を受けることが報告されている。（非特許文献４を参照。）。したがって、これらアルデヒドのアルドール縮合を行うには大量の酵素が必要となる。例えば、前記の特許文献１には、４-置換-３-ヒドロキシブチルアルデヒド中間体を経由する、２，４，６-トリデオキシヘキソース誘導体の合成が記載されているが、基質であるアセトアルデヒドと置換アセトアルデヒドとの合計モル数に対し、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼを約１２５Ｕ〜１５０Ｕ／ｍｍｏｌという高用量で実施されている。同様に、アセトアルデヒドを1分子縮合させることを目的とする反応においても、約８０Ｕ〜１００Ｕ／ｍｍｏｌという高用量で加える必要があるとされている。さらには、阻害を緩和する目的から、アルデヒドとＤＥＲＡを数回に分けて分割添加するなどの方法も検討されている（特許文献２を参照。）。
ＤＥＲＡによるアルドール縮合反応のもうひとつの問題は、縮合するアセトアルデヒドの分子数を制御することが困難であるということである。アルドール縮合に供する２種のアルデヒドの濃度比を変える、または、酵素量を変えるなどの方法で試みられてはいるが、α位またはβ位にヒドロキシ基があるいくつかのアルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合の場合を除いては制御が困難であった（非特許文献５、非特許文献６及び特許文献３を参照。）。このような問題から、ＤＥＲＡによるアルドール縮合反応は実用化することが困難であった。
安定性の高いＤＥＲＡという観点では、超好熱菌アエロパイラム・ペルニックス（Ａｅｒｏｐｙｒｕｍ ｐｅｒｎｉｘ）由来の耐熱性ＤＥＲＡが報告されている（特許文献４を参照。）。この酵素は、耐熱性が高いことと、メタノールやエタノール等の極性有機溶媒に対する安定性が高いことが報告されている（非特許文献８を参照。）。そのほかにも、サーモトガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ．ｍａｒｉｔｉｍａ）、サーマス・サーモフィラス（Ｔｈｅｒｍｕｓ ｔｈｅｒｍｏｐｈｉｌｕｓ）などの好熱性菌由来ＤＥＲＡが報告されているが、これら好熱性菌由来ＤＥＲＡのアルデヒドに対する安定性や、それらのアルドール縮合の活性などについては一切報告されていない（非特許文献９を参照。）。
一般的に好熱性菌由来酵素は、本来の生育温度付近である高温領域において高い活性を示し、常温領域では著しく活性が低い。アルデヒドのような反応性の高い化合物を基質とするアルドール縮合の場合、高温領域での反応では様々な副反応を起こしてしまうことが予想される。それゆえ、アルドール反応を低温条件で実施する必要があり、好熱性菌由来ＤＥＲＡを利用することは一般的には考えにくいことである。また、アルデヒドがタンパク質中のリジン残基などと反応する性質を持つことから、単に熱安定性が高いという理由から、アルデヒドに対する安定性も高いと推察することは困難であった。
米国特許５，７９５，７４９号公報
ＷＯ ０３／００６６５６
ＷＯ０３／０７７８６８
特開２００３−２５０５５３号
Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ｖｏｌ．１１２， ｐｐ．２０１３-２０１４（１９９０）
Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ｖｏｌ．１１６， ｐｐ．８４２２-８４２３（１９９４）
Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ｖｏｌ．１１４， ｐｐ．７４１-７４８（１９９２）
ＰＮＡＳ． Ｖｏｌ．１０１， ｐｐ．５７８８−５７９３（２００４）
Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ｖｏｌ．１１７， ｐｐ．３３３３-３３３９（１９９５）
Ａｎｇｅｕ． Ｃｈｅｍ． Ｉｎｔ． Ｅｄ． ｖｏｌ．３９， ｐｐ．１３５２-１３７４（２０００）
Ｊ.Ａｍ.Ｃｈｅｍ.Ｓｏｃ. ｖｏｌ．１１４， ｐｐ．７４１-７４８（１９９２）
Ｊ.Ｂｉｏｌ.Ｃｈｅｍ. ｖｏｌ．２７８， ｐｐ．１０７９９-１０８０６（２００３）
Ｊ.Ｍｏｌ.Ｂｉｏｌ. ｖｏｌ．３４３， ｐｐ．１０１９-１０３４（２００４）
本発明は、従来のＤＥＲＡの問題点であった、アルデヒドに対する安定性が低い、アルドール縮合の触媒活性が低い、及び縮合するアセトアルデヒド数を制御できないという問題を解決し、ヒドロキシアルデヒド類を効率よく製造する工業的方法を提供することを目的としている。
本発明者らは、アルデヒドに対し安定性が高く、かつアルドール縮合の触媒活性が高い、ＤＥＲＡを鋭意探索した。その結果、超好熱性菌サーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）由来、及びパイロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌａｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）由来のＤＥＲＡが、アルデヒドに対する安定性が著しく高いことを見出した。また、天然の基質であるグリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドに対する２５℃での活性は既存の大腸菌由来の酵素に対し著しく低いが、非天然基質であるアルデヒドとアセトアルデヒドに対するアルドール縮合反応の活性は、既に報告されている大腸菌由来ＤＥＲＡよりはるかに高いことを見出した。さらに、超好熱性菌パイロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌｕｍ
ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）由来ＤＥＲＡにおいては、１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合したβ−ヒドロキシアルデヒドに、さらにもう１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合する反応が起こりにくく、炭素数が２増加したβ−ヒドロキシアルデヒドが優先的に得られるという特徴があることを見出し、本発明を完成するに至った。
ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）由来ＤＥＲＡにおいては、１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合したβ−ヒドロキシアルデヒドに、さらにもう１分子のアセトアルデヒドがアルドール縮合する反応が起こりにくく、炭素数が２増加したβ−ヒドロキシアルデヒドが優先的に得られるという特徴があることを見出し、本発明を完成するに至った。
サーモトーガ・マリティマ（Ｔｈｅｒｍｏｔｏｇａ ｍａｒｉｔｉｍａ）及びパイロバキュラム・アエロフィラム（Ｐｙｒｏｂａｃｕｌａｍ ａｅｒｏｐｈｉｌｕｍ）については、ゲノム情報がすでに公開されており（Ｎａｔｕｒｅ,
ｖｏｌ．３９９， ｐｐ．３２３-３２９（１９９９）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ｖｏｌ．９９ ｐｐ．９８４-９８９（２００２））、これらの情報を基に大腸菌由来ＤＥＲＡとの相同性から両菌株のＤＥＲＡをコードしていると思われるＤＮＡ配列が推定されていた。しかしながら、これら超好熱性菌由来ＤＥＲＡについての詳細解析はなされておらず、本発明以前にこれらＤＥＲＡにこのような効果があるとは想定することもできなかった。このように本発明は、種々のアルドール縮合反応への応用性が未知であった超好熱性菌由来ＤＥＲＡの効果について初めて実証し、明らかにしたものである。
ｖｏｌ．３９９， ｐｐ．３２３-３２９（１９９９）、Ｐｒｏｃ． Ｎａｔｌ． Ａｃａｄ． Ｓｃｉ． Ｕ．Ｓ．Ａ． ｖｏｌ．９９ ｐｐ．９８４-９８９（２００２））、これらの情報を基に大腸菌由来ＤＥＲＡとの相同性から両菌株のＤＥＲＡをコードしていると思われるＤＮＡ配列が推定されていた。しかしながら、これら超好熱性菌由来ＤＥＲＡについての詳細解析はなされておらず、本発明以前にこれらＤＥＲＡにこのような効果があるとは想定することもできなかった。このように本発明は、種々のアルドール縮合反応への応用性が未知であった超好熱性菌由来ＤＥＲＡの効果について初めて実証し、明らかにしたものである。
即ち、本発明は、
[１] 下記の（１）または（２）のＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（または該酵素を含む細胞またはその処理物）の存在下、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物と1分子のアセトアルデヒドとをアルドール縮合反応させる、炭素数が２増加したヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法（一般式（１）〜一般式（３）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示し、Ｒ ２ は水素原子、水酸基またはメチル基を示し、Ｒ ３ は水素原子または水酸基を示す。）、
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する、
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する、
[２]下記の（１）または（２）のＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（または該酵素を含む細胞またはその処理物）の存在下、一般式（１）で示される脂肪族アルデヒド化合物と２分子のアセトアルデヒドとをアルドール縮合反応させる、炭素数が４増加したヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法（一般式（１）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示す。）、
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する、
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する、
に関するものである。
[１] 下記の（１）または（２）のＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（または該酵素を含む細胞またはその処理物）の存在下、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物と1分子のアセトアルデヒドとをアルドール縮合反応させる、炭素数が２増加したヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法（一般式（１）〜一般式（３）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示し、Ｒ ２ は水素原子、水酸基またはメチル基を示し、Ｒ ３ は水素原子または水酸基を示す。）、
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する、
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する、
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する、
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する、
本発明によれば、アルデヒドに対し安定性が高く、かつアルドール縮合の触媒活性が高いＤＥＲＡを用いることにより、少ない酵素量で反応器当りの生産性を向上させることができる。また、アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合する活性の高いＤＥＲＡと、アセトアルデヒドを２分子アルドール縮合する活性の高いＤＥＲＡを使い分けることで、所望のヒドロキシアルデヒド化合物を高収率で得ることが可能となる。
１００ｍMのクロロアセトアルデヒドを含有する水媒体中、２５℃で３０分間処理した後の残存活性は、本発明に用いられるＤＥＲＡの好適なｐＨに設定された１００ｍＭの緩衝成分と１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む水溶液に、適当量のＤＥＲＡを溶解し２５℃で３０分間処理したあと、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行い、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量の合計値及び該処理をせずにアルドール縮合反応を行った場合の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量の合計値を求め、後者の値に対する前者の値の割合と定義される。なお、本明細書において、１００ｍMのクロロアセトアルデヒドを含有する水媒体中、２５℃で３０分間処理した後の残存活性の評価を、単に「クロロアセトアルデヒド耐性の評価」といい、１００ｍMのクロロアセトアルデヒドを含有する水媒体中、２５℃で３０分間処理した後の残存活性の値を「クロロアセトアルデヒド耐性値」と略記することもある。
本発明に用いられるＤＥＲＡの活性は、２５℃で１分間当たり１μｍｏｌのＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸をＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドに分解する酵素量を１Ｕと定義される。Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸の分解によって生じるＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸は、トリオースリン酸イソメラーゼでジヒドロキシアセトンリン酸に変換し、これをグリセロール-３-リン酸脱水素酵素で反応させた際のＮＡＤＨ（ニコチンアミドアデニンジヌクレオチド還元型）の減少量により定量する。
本発明において用いられるＤＥＲＡは、上記の１００ｍMのクロロアセトアルデヒドを含有する水媒体中、２５℃で３０分間処理した後の残存活性が、５０％以上の残存活性値を示すＤＥＲＡであれば何ら制限は受けない。このようなＤＥＲＡとして、配列番号１に示されるアミノ酸配列を有するＤＥＲＡまたは配列番号２に示されるアミノ酸配列を有するＤＥＲＡが好適なものとして挙げられる。
配列番号１に示すアミノ酸配列を有するＤＥＲＡは、例えば、ジャパン コレクション オブ マイクロオ-ガニズムズ（Ｊａｐａｎ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｍｉｃｒｏｏｒｇａｎｉｓｍｓ（ＪＣＭ））から入手できるサーモトーガ・マリティマ（ＪＣＭ番号１００９９）より得られる。配列番号１に示すアミノ酸配列は、本発明に見られる効果が保持されている限りにおいて、配列番号１に示すアミノ酸配列の１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されるといった変異が導入された配列であっても良い。
配列番号２に示すアミノ酸配列を有するＤＥＲＡは、例えば、ＪＣＭから入手できるパイロバキュラム・アエロフィラム（ＪＣＭ番号９６３０）より得られる。配列番号２に示すアミノ酸配列は、本発明に見られる効果が保持されている限りにおいて、配列番号２に示すアミノ酸配列の１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されるといった変異が導入された配列であっても良い。
近年の分子生物学および遺伝子工学の進歩により、前記のＤＥＲＡ遺伝子および発現に必要な制御領域が挿入された組換えプラスミドを構築し、これを任意の宿主に導入し、該蛋白質を発現させた遺伝子組換え菌を作出することが可能となり、かつ、比較的容易にもなった。かかる技術水準に鑑み、このようなＤＥＲＡの遺伝子を任意の宿主に導入した遺伝子組換え菌も本発明のＤＥＲＡを発現している微生物に包含されるものとする。ここでいう発現に必要な制御領域とは、プロモーター配列（転写を制御するオペレーター配列を含む）・リボゾーム結合配列（ＳＤ配列）・転写終結配列等を示している。プロモーター配列の具体例としては、大腸菌由来のトリプトファンオペロンのｔｒｐプロモーター・ラクトースオペロンのｌａｃプロモーター・ラムダファージ由来のＰLプロモーター及びＰRプロモーターや、枯草菌由来のグルコン酸合成酵素プロモーター（ｇｎｔ）・アルカリプロテアーゼプロモーター（ａｐｒ）・中性プロテアーゼプロモーター（ｎｐｒ）・α−アミラーゼプロモーター（ａｍｙ）等が挙げられる。また、ｔａｃプロモーターのように独自に改変・設計された配列も利用できる。リボゾーム結合配列としては、大腸菌由来または枯草菌由来の配列が挙げられるが、大腸菌や枯草菌等の所望の宿主内で機能する配列であれば特に限定されるものではない。たとえば、１６ＳリボゾームＲＮＡの３’末端領域に相補的な配列が４塩基以上連続したコンセンサス配列をＤＮＡ合成により作成してこれを利用してもよい。転写終結配列は必ずしも必要ではないが、ρ因子非依存性のもの、例えばリポプロテインターミネーター・ｔｒｐオペロンターミネーター等が利用できる。これら制御領域の組換えプラスミド上での配列順序は、５’末端側上流からプロモーター配列、リボゾーム結合配列、ＤＥＲＡをコードする遺伝子、転写終結配列の順に並ぶことが望ましい。ここでいうプラスミドの具体例としては、大腸菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＢＲ３２２、ｐＵＣ１８、Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ
ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などの大腸菌(Escherichia
coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
ＩＩ ＳＫ（＋）、ｐＫＫ２２３−３、ｐＳＣ１０１、ｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）等や、枯草菌中での自律複製可能な領域を有しているｐＵＢ１１０、ｐＴＺ４、ｐＣ１９４、ρ１１、φ１、φ１０５等をベクターとして利用することができる。また、２種類以上の宿主内での自律複製が可能なプラスミドの例として、ｐＨＶ１４、ＴＲｐ７、ＹＥｐ７及びｐＢＳ７をベクターとして利用することができる。ここでいう任意の宿主には、後述の実施例のように大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）などの大腸菌(Escherichia
coli)が代表例として挙げられるが、とくに大腸菌に限定されるのものではなく枯草菌(Bacillus subtilis)等のバチルス属菌、酵母や放線菌等の他の微生物菌株も含まれる。
形質転換等、遺伝子組換えの手法に関しては、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ，Ａ ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ， ｓｅｃｏｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ， Ｃｏｌｄ
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。形質転換された組換え細胞は、適切な条件下で培養し、その培養物から公知の精製方法によりＤＥＲＡを調製することができる。
Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ（１９８９）等に記載されている方法に準じて行うことができる。形質転換された組換え細胞は、適切な条件下で培養し、その培養物から公知の精製方法によりＤＥＲＡを調製することができる。
１００ｍMのクロロアセトアルデヒドを含有する水媒体中、２５℃で３０分間処理した後の残存活性が５０％以上であるＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼの存在下、炭素数が２から６の置換または無置換の脂肪族アルデヒド化合物と1分子のアセトアルデヒドをアルドール縮合反応させることにより、炭素数が２増加したヒドロキシアルデヒド化合物を製造することができる。このアルドール縮合反応は、通常、水溶液中で実施される。反応にあたっては、最適なｐＨを維持する目的で、適切な緩衝成分を加えてもよいし、酸またはアルカリにより適宜ｐＨ調整をしても良い。また、反応を阻害しない程度に、水と混和する有機溶媒、または水と混和しない有機溶媒を加えて反応を行っても良い。
炭素数が２から６の置換または無置換の脂肪族アルデヒド化合物における炭素数が２から６の置換の脂肪族アルデヒド化合物は、炭素数が２から６の無置換の脂肪族アルデヒド化合物に結合する任意の位置の水素原子（ただし、アルデヒド基の水素原子を除く）が置換基で置換されている化合物である。このような置換基としては、アルドール縮合反応に悪影響を与えないものであれば特に限定されないが、例えば、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、アルコキシ基またはアルカン酸基などが挙げられる。
炭素数が２から６の置換または無置換の脂肪族アルデヒド化合物としては、例えば、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される化合物が挙げられる。これら脂肪族アルデヒド化合物に対し、アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合することで、それぞれに対応する一般式（４）、一般式（５）または一般式（６）で示される化合物が合成される。また、一般式（１）で示される化合物に対し、アセトアルデヒドを２分子アルドール縮合することで、一般式（７）で示される３−５−ヒドロキシアルデヒド化合物が合成される。尚、一般式（１）〜（７）中のＲ１は、水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、または炭素数が１から４のアルコキシ基から選択される。Ｒ２は、水素原子、水酸基またはメチル基から選択される。また、Ｒ３は、水素原子または水酸基から選択される。
一般式（２）で示される化合物としては、アセトアルデヒド、クロロアセトアルデヒド、グリコールアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、３，４−ジヒドロキシブチルアルデヒド、マロン酸セミアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドなどが例示できる。特にクロロアセトアルデヒドは本発明の効果が顕著に現れるが故に好適に使用される。クロロアセトアルデヒドに対し、アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合することで、炭素数が２増加した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドが合成され、さらに２分子目のアセトアルデヒドを連続してアルドール縮合することで、炭素数が４増加した６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースが合成される。一般式（３）で示される化合物では、代表的なものとしてＤ-グリセルアルデヒド、イソブチルアルデヒドなどが例示できる。一般式（４）で示される化合物としては例えばＤ-エリトロース、３−４−ジヒドロキシブチルアルデヒドが例示できる。
一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される化合物に対する、アセトアルデヒドの仕込みモル量は、０．５モル等量以上３．０モル等量以内の範囲で設定するのが好適である。例えば、クロロアセトアルデヒドに対し、アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合させて、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを合成する場合、クロロアセトアルデヒドに対するアセトアルデヒドの仕込みモル量は、通常０．５モル等量以上１モル等量の間で選択される。より好ましくは、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡのようなアセトアルデヒドを２分子アルドール縮合する活性が低いＤＥＲＡを用いれば、クロロアセトアルデヒドに対するアセトアルデヒドの仕込みモル量を、０.５モル等量以上３モル等量以内に設定すれば、収率よく４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを合成することができる。
また、クロロアセトアルデヒドに対し、アセトアルデヒドを２分子アルドール縮合させて、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを合成する場合、クロロアセトアルデヒドに対するアセトアルデヒドの仕込みモル量は、通常２モル等量以上３モル等量の間で選択される。サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡのようなアセトアルデヒドを２分子アルドール縮合する活性が高いＤＥＲＡを用いれば、収率よく６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを合成することができるのでより好ましい。
前記の反応に用いられるＤＥＲＡの使用量は以下の範囲で規定される。アセトアルデヒドを１分子アルドール縮合することで、３-ヒドロキシアルデヒドを合成する場合、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示されるアルデヒド化合物とアセトアルデヒドの合計モル数に対し、ＤＥＲＡを０．１Ｕ／ｍｍｏｌ以上８０Ｕ／ｍｍｏｌ以下の割合で加え反応させることができる。
アセトアルデヒドを２分子アルドール縮合することで、３-５-ジヒドロキシアルデヒドを合成する場合、一般式（１）で示される化合物とアセトアルデヒドの合計モル数に対し、ＤＥＲＡを０．１Ｕ／ｍｍｏｌ以上１２０Ｕ／ｍｍｏｌ以下の割合で加え反応させることができる。
前記の反応におけるｐＨ範囲、反応温度は、目的生成物の収率等を考慮して適宜最適な条件を選択すればよい。例えば、反応液のｐＨ範囲は、好ましくはｐＨ４〜１２、さらに好ましくはｐＨ５〜９である。これらの範囲の緩衝液を調製するに際しては、充分な緩衝作用を有する任意のｐＨ緩衝剤が利用できる。反応温度は０℃から１００℃の範囲内で選択可能であるが、好ましくは、０℃から４０℃の範囲、より好ましくは０℃から２５℃の範囲である。
反応に要する時間は目的生成物の収率が最も高くなるよう設定すればよい。目的生成物は反応液より、抽出、共沸蒸留、または晶析などの公知の精製方法により分離、回収することができる。
以下、実施例により本発明をさらに具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例により何ら限定されるものではない。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡの調製
〔１〕サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡの調製
サーモトーガ・マリティマの培養には、ＪＣＭ２３７培地（以下のように調製する。５．０ｇ 可溶性デンプン、０．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１５．０ｍｌ
添加ミネラル液（蒸留水１ｌあたり、１．５ｇ Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ
ＭｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、１．０ｇ ＮａＣｌ、０．１ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２， ０．０１ｇ Ｈ３ＢＯ３、 ０．０１ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを組成とし、まずＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄを溶解しＫＯＨによりｐＨを６．５に調製した後、残りのミネラルを添加して、ｐＨ７．０に調製したミネラル液）、２．０ｍｇ ＮｉＣｌ２・Ｈ２Ｏ、２０．０ｇ
ＮａＣｌ、０．５ｇ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０ｍｇ Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ、０．５ｇ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、２５０ｍｌ
人工海水（蒸留水１ｌあたりに２７．７ｇ ＮａＣｌ、７．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．５ｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．６５ｇ
ＫＣｌ、０．１ｇ ＮａＢｒ、３０．０ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、１５．０ｍｇ ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ
Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、０．０５ｍｇ ＫＩ、２．２５ｇ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏを溶解した組成液）、蒸留水 ７５０ｍｌの組成物で、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除く組成物を混合しｐＨをＨ２ＳＯ４により６．５に調製する。窒素雰囲気下でフィルタ-濾過により無菌化する。５％溶液としてＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを中和し、窒素雰囲気下で高圧滅菌（１２１℃、２０分間）する。植菌前に、殺菌したＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを添加し、必要に応じてｐＨを６．５に調製する。）を用いた。保存菌株（ＪＣＭ番号１００９９）を、脱気後、窒素通気により嫌気条件を維持しながら、８０℃で、２４から９６時間、マグネッチクスタ-ラ-により撹はん培養し、２Ｌの培養液を調製した。培養終了後、得られた培養液中の菌体を遠心分離（５０００ｇ、１０分間）により集菌し、３％
ＮａＣｌで洗菌を行った。菌体湿重量２ｇの菌体を８ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。この菌体懸濁液に１０ｍｇ／ｍｌ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液２ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ溶液 １００μｌを加え３７℃で、３０分間インキュベーションした後、２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液５０μｌを加え、１０分後、３０ｍｇ／ｍｌ
Ｎ-Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ Ｎａ溶液 １ｍｌを加えて、さらに４５分間インキュベーションした。当量のＣＩ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え穏やかに混和し、遠心分離（７０００ｇ、１５分間）して、水層を分取した。同じ操作をもう一度繰り返した後に、ＰＣＩ（水平衡化フェノール：ＣＩ＝１：１）処理をＣＩ処理と同様に２回繰り返した。さらに２回ＣＩ処理した後、０．１倍量の３Ｍ
酢酸ナトリウムを加えて撹拌し、当量のイソプロパノールを加えて軽く撹拌した。析出したＤＮＡをディスポチューブで巻き取り、７０％エタノールで、洗浄し乾燥させ、ＴＥ緩衝液
５００μｌに溶解することにより、サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡを得た。
〔１〕サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡの調製
サーモトーガ・マリティマの培養には、ＪＣＭ２３７培地（以下のように調製する。５．０ｇ 可溶性デンプン、０．５ｇ ＫＨ２ＰＯ４、１５．０ｍｌ
添加ミネラル液（蒸留水１ｌあたり、１．５ｇ Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ ａｃｉｄ、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ
ＭｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、１．０ｇ ＮａＣｌ、０．１ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ
ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ
ＡｌＫ（ＳＯ４）２， ０．０１ｇ Ｈ３ＢＯ３、 ０．０１ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを組成とし、まずＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄを溶解しＫＯＨによりｐＨを６．５に調製した後、残りのミネラルを添加して、ｐＨ７．０に調製したミネラル液）、２．０ｍｇ ＮｉＣｌ２・Ｈ２Ｏ、２０．０ｇ
ＮａＣｌ、０．５ｇ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０ｍｇ Ｒｅｓａｚｕｒｉｎ、０．５ｇ Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏ、２５０ｍｌ
人工海水（蒸留水１ｌあたりに２７．７ｇ ＮａＣｌ、７．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、５．５ｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、０．６５ｇ
ＫＣｌ、０．１ｇ ＮａＢｒ、３０．０ｍｇ Ｈ３ＢＯ３、１５．０ｍｇ ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、１０．０ｍｇ
Ｃｉｔｒｉｃ ａｃｉｄ、０．０５ｍｇ ＫＩ、２．２５ｇ ＣａＣｌ２・Ｈ２Ｏを溶解した組成液）、蒸留水 ７５０ｍｌの組成物で、Ｎａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを除く組成物を混合しｐＨをＨ２ＳＯ４により６．５に調製する。窒素雰囲気下でフィルタ-濾過により無菌化する。５％溶液としてＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを中和し、窒素雰囲気下で高圧滅菌（１２１℃、２０分間）する。植菌前に、殺菌したＮａ２Ｓ・９Ｈ２Ｏを添加し、必要に応じてｐＨを６．５に調製する。）を用いた。保存菌株（ＪＣＭ番号１００９９）を、脱気後、窒素通気により嫌気条件を維持しながら、８０℃で、２４から９６時間、マグネッチクスタ-ラ-により撹はん培養し、２Ｌの培養液を調製した。培養終了後、得られた培養液中の菌体を遠心分離（５０００ｇ、１０分間）により集菌し、３％
ＮａＣｌで洗菌を行った。菌体湿重量２ｇの菌体を８ｍｌのＴＥ緩衝液（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１ｍＭ ＥＤＴＡ）に懸濁した。この菌体懸濁液に１０ｍｇ／ｍｌ
Ｌｙｓｏｚｙｍｅ溶液２ｍｌ、１０ｍｇ／ｍｌ ＲＮａｓｅ溶液 １００μｌを加え３７℃で、３０分間インキュベーションした後、２０ｍｇ／ｍｌ Ｐｒｏｔｅｉｎａｓｅ Ｋ溶液５０μｌを加え、１０分後、３０ｍｇ／ｍｌ
Ｎ-Ｌａｕｒｏｙｌｓａｒｃｏｓｉｎｅ Ｎａ溶液 １ｍｌを加えて、さらに４５分間インキュベーションした。当量のＣＩ（クロロホルム：イソアミルアルコール＝２４：１）を加え穏やかに混和し、遠心分離（７０００ｇ、１５分間）して、水層を分取した。同じ操作をもう一度繰り返した後に、ＰＣＩ（水平衡化フェノール：ＣＩ＝１：１）処理をＣＩ処理と同様に２回繰り返した。さらに２回ＣＩ処理した後、０．１倍量の３Ｍ
酢酸ナトリウムを加えて撹拌し、当量のイソプロパノールを加えて軽く撹拌した。析出したＤＮＡをディスポチューブで巻き取り、７０％エタノールで、洗浄し乾燥させ、ＴＥ緩衝液
５００μｌに溶解することにより、サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡを得た。
〔２〕サーモトーガ・マリティマＤＥＲＡ遺伝子のクローニング、及び、該ＤＥＲＡを発現する大腸菌株の調製
サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、配列番号１のサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理し、同じくＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理した市販の発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションすることにより、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９を得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡを発現する大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９を得た。
サーモトーガ・マリティマ染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号３及び配列番号４に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、配列番号１のサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理し、同じくＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理した市販の発現ベクターｐＥＴ１５ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションすることにより、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９を得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）を形質転換し、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡを発現する大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９を得た。
〔３〕組換え大腸菌からのサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡの精製
組換え大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＳＢ（１Ｌ中、トリプトン １２ｇ、酵母エキス ２４ｇ、グリセロール
５ｍｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．８ｇ）培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で、ＯＤ660＝０．６になるまで培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を加え、さらに３時間培養した。培養終了後、遠心分離（５０００ｇ
１０分間）により、集菌し、０．８５％ ＮａＣｌ溶液で、洗菌し、湿菌体重量の９倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に懸濁させ、超音波破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液を８０℃で、１０分間熱処理し、遠心分離により熱変性した不溶性蛋白質を除去した。ニッケルを配位させた金属アフィニティーカラム（Ｈｉ
Ｔｒａｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製））に、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
イミダゾールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で、平衡化した後、熱処理後の不溶性蛋白質を除去した粗酵素液を吸着させ、イミダゾール濃度を０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍと段階的に上昇させて、活性画分を回収した。こうして得られたサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡの純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、均一に精製されていることを確認した。またその蛋白質量は、Ｂｉｏ-Ｒａｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社製）を用いて定量した。
組換え大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＴＭ１５５９は、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含むＳＢ（１Ｌ中、トリプトン １２ｇ、酵母エキス ２４ｇ、グリセロール
５ｍｌ、Ｋ２ＨＰＯ４ １２．５ｇ、ＫＨ２ＰＯ４ ３．８ｇ）培地１００ｍｌに植菌し、３７℃で、ＯＤ660＝０．６になるまで培養した後、終濃度が１ｍＭになるようにＩＰＴＧ（イソプロピル-β-チオガラクトピラノシド）を加え、さらに３時間培養した。培養終了後、遠心分離（５０００ｇ
１０分間）により、集菌し、０．８５％ ＮａＣｌ溶液で、洗菌し、湿菌体重量の９倍量の１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に懸濁させ、超音波破砕後、遠心分離し、上清を粗酵素液とした。粗酵素液を８０℃で、１０分間熱処理し、遠心分離により熱変性した不溶性蛋白質を除去した。ニッケルを配位させた金属アフィニティーカラム（Ｈｉ
Ｔｒａｐ ａｆｆｉｎｉｔｙ ｃｏｌｕｍｎｓ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社製））に、０．５Ｍ ＮａＣｌ、１０ｍＭ
イミダゾールを含む１０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液で、平衡化した後、熱処理後の不溶性蛋白質を除去した粗酵素液を吸着させ、イミダゾール濃度を０．１Ｍ、０．２Ｍ、０．３Ｍ、０．４Ｍ、０．５Ｍと段階的に上昇させて、活性画分を回収した。こうして得られたサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡの純度をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、均一に精製されていることを確認した。またその蛋白質量は、Ｂｉｏ-Ｒａｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキット（Ｂｉｏ-Ｒａｄ社製）を用いて定量した。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡの調製
パイロバキュラム・アエロフィラムの培養は、ＪＣＭ２１５培地（以下に調製法をしめす。１２５ｍｌ 海洋培地／合成海水混合液（４７．１５ｇ ＮａＣｌ，１８．１０ｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７．０ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．１３ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３.２４ｇ Ｎａ２ＳＯ４、０．１ｇ
Ｎａ２ＣＯ３、０．１ｇ ＮａＢｒ、８０．０ｍｇ ＫＢｒ、７２．０ｍｇ ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５２．０ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３、８．１ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．４ｍｇ ＮａＦ、０．４ｍｇ
Ｓｏｄｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ、０．０５ｍｇ ＫＩを1ｌの蒸留水に溶解した溶液）、１０．０ｍｌ 添加ミネラル液（蒸留水１ｌあたり、１．５ｇ Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、１．０ｇ
ＮａＣｌ、０．１ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２、０．０１ｇ
Ｈ３ＢＯ３、０．０１ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを組成とし、まずＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄを溶解しＫＯＨによりｐＨを６．５に調製した後、残りのミネラルを添加して、ｐＨ７．０に調製したミネラル液）、２．０ｍｇ Ｆｅ（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ、２．０ｍｇ （ＮＨ４）２Ｎｉ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４、０．１ｍｇ ＮａＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．２ｇ ＮａＨＣＯ３、０．０７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０ｇ ＮａＳ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ、８６５．０ｍｌの蒸留水を混合溶解し、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整後、フィルタ-濾過により滅菌した。窒素・二酸化炭素・酸素の混合比が８０：２０：１の組成の気体雰囲気下で培地を培養器に入れた。）を用い植菌後２００ｋＰａに加圧して、９５℃で培養した。パイロバキュラム・アエロフィラム染色体ＤＮＡは、保存菌株（ＪＣＭ番号９６３０）より実施例１と同様の方法で調製した。パイロバキュラム・アエロフィラム染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、配列番号２のパイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ遺伝子の開始コドンＧＴＧは大腸菌での発現のためＡＴＧに変更した。配列番号２には変更後のＤＮＡ配列を示している。
パイロバキュラム・アエロフィラムの培養は、ＪＣＭ２１５培地（以下に調製法をしめす。１２５ｍｌ 海洋培地／合成海水混合液（４７．１５ｇ ＮａＣｌ，１８．１０ｇ ＭｇＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、７．０ｇ
ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、３．１３ｇ ＣａＣｌ２・２Ｈ２Ｏ、３.２４ｇ Ｎａ２ＳＯ４、０．１ｇ
Ｎａ２ＣＯ３、０．１ｇ ＮａＢｒ、８０．０ｍｇ ＫＢｒ、７２．０ｍｇ ＳｒＣｌ２・６Ｈ２Ｏ、５２．０ｍｇ
Ｈ３ＢＯ３、８．１ｍｇ Ｎａ２ＨＰＯ４、２．４ｍｇ ＮａＦ、０．４ｍｇ
Ｓｏｄｉｕｍ ｓｉｌｉｃａｔｅ、０．０５ｍｇ ＫＩを1ｌの蒸留水に溶解した溶液）、１０．０ｍｌ 添加ミネラル液（蒸留水１ｌあたり、１．５ｇ Ｎｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄ、３．０ｇ ＭｇＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．５ｇ ＭｎＳＯ４・ｘＨ２Ｏ、１．０ｇ
ＮａＣｌ、０．１ｇ ＦｅＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＣｏＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．１ｇ ＺｎＳＯ４・７Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＣｕＳＯ４・５Ｈ２Ｏ、０．０１ｇ ＡｌＫ（ＳＯ４）２、０．０１ｇ
Ｈ３ＢＯ３、０．０１ｇ Ｎａ２ＭｏＯ４・２Ｈ２Ｏを組成とし、まずＮｉｔｒｉｌｏｔｒｉａｃｅｔｉｃ
ａｃｉｄを溶解しＫＯＨによりｐＨを６．５に調製した後、残りのミネラルを添加して、ｐＨ７．０に調製したミネラル液）、２．０ｍｇ Ｆｅ（ＮＨ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．２５ｇ
ＮＨ４Ｃｌ、２．０ｍｇ （ＮＨ４）２Ｎｉ（ＳＯ４）２・６Ｈ２Ｏ、０．１ｍｇ
Ｎａ２ＳｅＯ４、０．１ｍｇ ＮａＷＯ４・２Ｈ２Ｏ、２．２ｇ ＮａＨＣＯ３、０．０７ｇ
ＫＨ２ＰＯ４、０．５ｇ Ｂａｃｔｏ ｙｅａｓｔ ｅｘｔｒａｃｔ（Ｄｉｆｃｏ社製）、１．０ｇ ＮａＳ２Ｏ３・５Ｈ２Ｏ、８６５．０ｍｌの蒸留水を混合溶解し、１Ｎ Ｈ２ＳＯ４でｐＨを７．０に調整後、フィルタ-濾過により滅菌した。窒素・二酸化炭素・酸素の混合比が８０：２０：１の組成の気体雰囲気下で培地を培養器に入れた。）を用い植菌後２００ｋＰａに加圧して、９５℃で培養した。パイロバキュラム・アエロフィラム染色体ＤＮＡは、保存菌株（ＪＣＭ番号９６３０）より実施例１と同様の方法で調製した。パイロバキュラム・アエロフィラム染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号５及び配列番号６に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、配列番号２のパイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ遺伝子の開始コドンＧＴＧは大腸菌での発現のためＡＴＧに変更した。配列番号２には変更後のＤＮＡ配列を示している。
得られたＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理し、同じくＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理した市販の発現ベクターｐＥＴ１５ｂにライゲーションすることにより、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ発現プラスミドｐＥＴ１５ｂ-ＰＡＥ１２３１を得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株を形質転換し、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ発現大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＰＡＥ１２３１を得た。
組換え大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１５ｂ-ＰＡＥ１２３１からのパイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡの精製は実施例１の〔３〕に記載の方法と同様の方法に従った。
［参考例１］ 大腸菌由来ＤＥＲＡの精製
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から入手できる大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３２５）培養菌体より、実施例１と同様の方法で調製した大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、大腸菌由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。この大腸菌由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理し、同じくＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理した市販の発現ベクターｐＥＴ１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションすることにより、大腸菌由来ＤＥＲＡ発現プラスミドｐＥＴ１１ｂ-ＤＥＲＡを得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株を形質転換し、大腸菌由来ＤＥＲＡ発現大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１１ｂ-ＤＥＲＡを得た。組換え大腸菌から実施例１の方法に従って粗酵素液を調製し、硫安沈殿（５０〜７０％飽和濃度）での分画後、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に透析した。この粗酵素液を、Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ疎水クロマトグラフィー（東ソー製）にかけ、１〜０Ｍ 硫安を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液の直線濃度勾配にて溶出し、得られた活性画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、大腸菌由来ＤＥＲＡが均一に精製されていることを確認した。蛋白質量は、Ｂｉｏ-Ｒａｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いて定量した。
アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクション（Ａｍｅｒｉｃａｎ ｔｙｐｅ ｃｕｌｔｕｒｅ ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ））から入手できる大腸菌Ｗ３１１０（ＡＴＣＣ番号２７３２５）培養菌体より、実施例１と同様の方法で調製した大腸菌染色体ＤＮＡを鋳型とし、配列番号７及び配列番号８に記載の配列を有するオリゴヌクレオチドをプライマーとして用いたＰＣＲにより、大腸菌由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を得た。この大腸菌由来ＤＥＲＡ遺伝子を含むＤＮＡ断片を、制限酵素ＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理し、同じくＮｄｅＩ、ＢａｍＨＩを用いて処理した市販の発現ベクターｐＥＴ１１ｂ（Ｎｏｖａｇｅｎ社製）にライゲーションすることにより、大腸菌由来ＤＥＲＡ発現プラスミドｐＥＴ１１ｂ-ＤＥＲＡを得た。この発現プラスミドを用いて大腸菌ＢＬ２１［ＤＥ３］株を形質転換し、大腸菌由来ＤＥＲＡ発現大腸菌株ＢＬ２１［ＤＥ３］／ｐＥＴ１１ｂ-ＤＥＲＡを得た。組換え大腸菌から実施例１の方法に従って粗酵素液を調製し、硫安沈殿（５０〜７０％飽和濃度）での分画後、５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液に透析した。この粗酵素液を、Ｐｈｅｎｙｌ ５ＰＷ疎水クロマトグラフィー（東ソー製）にかけ、１〜０Ｍ 硫安を含む５０ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）緩衝液の直線濃度勾配にて溶出し、得られた活性画分をＳＤＳ-ＰＡＧＥにて分析し、大腸菌由来ＤＥＲＡが均一に精製されていることを確認した。蛋白質量は、Ｂｉｏ-Ｒａｄ
Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａｓｓａｙキットを用いて定量した。
Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸分解活性の比較
実施例１で得られたサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ、実施例２で得られたパイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ、及び、参考例１で得られた大腸菌由来ＤＥＲＡの２５℃でのＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸分解活性を測定した。測定は生成したＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸をトリオースリン酸イソメラーゼでジヒドロキシアセトンリン酸に変換し、これをグリセロール-３-リン酸脱水素酵素で反応させた際のＮＡＤＨの減少を測定することで行った。
実施例１で得られたサーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ、実施例２で得られたパイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ、及び、参考例１で得られた大腸菌由来ＤＥＲＡの２５℃でのＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸分解活性を測定した。測定は生成したＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸をトリオースリン酸イソメラーゼでジヒドロキシアセトンリン酸に変換し、これをグリセロール-３-リン酸脱水素酵素で反応させた際のＮＡＤＨの減少を測定することで行った。
１ｍｌの活性測定液（５０ｍＭ トリエタノールアミン-ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、０．５ｍＭ Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸、３．９Ｕ トリオースリン酸イソメラーゼ（ＳＩＧＭＡ社製）、１１Ｕ
グリセロール-３-リン酸脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１２ｍＭ ＮＡＤＨ、及び、測定対象の活性画分）のうち、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセロール-３-リン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨを除く組成を２５℃で３分間保温し、その後残りの組成を加えた。２５℃で保温しながら吸光度を測定できる分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸光度の減少を１分間測定した。ＤＥＲＡの活性１単位（Ｕ）は、２５℃で１分間当たり１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量と定義した。また、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とした。このようにして測定した、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ及び大腸菌由来ＤＥＲＡの２５℃における１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ）を表１に示す。
グリセロール-３-リン酸脱水素酵素（ＳＩＧＭＡ社製）、０．１２ｍＭ ＮＡＤＨ、及び、測定対象の活性画分）のうち、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸、トリオースリン酸イソメラーゼ、グリセロール-３-リン酸脱水素酵素、ＮＡＤＨを除く組成を２５℃で３分間保温し、その後残りの組成を加えた。２５℃で保温しながら吸光度を測定できる分光光度計を用いて、３４０ｎｍの吸光度の減少を１分間測定した。ＤＥＲＡの活性１単位（Ｕ）は、２５℃で１分間当たり１μｍｏｌのＮＡＤＨを減少させる酵素量と定義した。また、ＮＡＤＨの３４０ｎｍにおけるモル吸光係数は６．２２ｍＭ−１ｃｍ−１とした。このようにして測定した、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ及び大腸菌由来ＤＥＲＡの２５℃における１ｍｇあたりの酵素活性（Ｕ）を表１に示す。
クロロアセトアルデヒド耐性の評価
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解し、２５℃で３０分間保温した。保温後、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。対照区として、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ
クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解し、２５℃で３０分間保温した。保温後、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。対照区として、サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ
クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
同様に、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）中に溶解し、２５℃で３０分間保温した。保温後、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。対照区として、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ
酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
同様に、大腸菌由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解し、２５℃で３０分間保温した。保温後、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。対照区として、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ２５０μｇを、１００ｍＭのクロロアセトアルデヒドを含む１００ｍＭ
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）中に溶解し、１００ｍＭになるようアセトアルデヒドを添加し２５℃で２時間アルドール縮合反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過して除蛋白することで反応を停止し、ＨＰＬＣ分析により、生成した４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースを定量した。対照区の、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド及び６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計に対する、処理区の生成量合計の割合を算出した。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ、パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ、及び、大腸菌由来ＤＥＲＡの４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドによるクロロアセトアルデヒド耐性の評価結果を表２に示す。
４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒド、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの高速液体クロマトグラフィー（ＨＰＬＣ）による定量法
ＨＰＬＣカラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰＡＱＥＯＵＳカラム（野村化学製）を使用し、カラム温度４０℃で、水を溶離液として分析した。アプライ量は、２０μＬで、ＲＩ検出器（日本分光製）を用い検出を行った。
ＨＰＬＣカラムとして、Ｄｅｖｅｌｏｓｉｌ ＲＰＡＱＥＯＵＳカラム（野村化学製）を使用し、カラム温度４０℃で、水を溶離液として分析した。アプライ量は、２０μＬで、ＲＩ検出器（日本分光製）を用い検出を行った。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡによるクロロアセトアルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０.２３Ｕ）を、１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）、３００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃で２４時間反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９５％であった。また、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回行い、３回分の酢酸エチル相を合わせて減圧濃縮した。濃縮物を少量の酢酸エチルで溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライした。酢酸エチル：ヘキサン＝９：１の溶離液で溶離し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソース画分を分画した。各々のカラム分取物を１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、特許文献１、非特許文献２での報告と合致することを確認した。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０.２３Ｕ）を、１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）、３００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃で２４時間反応を行った。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９５％であった。また、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回行い、３回分の酢酸エチル相を合わせて減圧濃縮した。濃縮物を少量の酢酸エチルで溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライした。酢酸エチル：ヘキサン＝９：１の溶離液で溶離し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソース画分を分画した。各々のカラム分取物を１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、特許文献１、非特許文献２での報告と合致することを確認した。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡによるクロロアセトアルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、３００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて２４時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９３％であった。また、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は５０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回行い、３回分の酢酸エチル相を合わせて減圧濃縮した。濃縮物を少量の酢酸エチルで溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライした。酢酸エチル：ヘキサン＝９：１の溶離液で溶離し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソース画分を分画した。各々のカラム分取物を１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、特許文献１、非特許文献２での報告と合致することを確認した。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、３００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて２４時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９３％であった。また、６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は５０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回行い、３回分の酢酸エチル相を合わせて減圧濃縮した。濃縮物を少量の酢酸エチルで溶解し、シリカゲルカラムクロマトグラフィーにアプライした。酢酸エチル：ヘキサン＝９：１の溶離液で溶離し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソース画分を分画した。各々のカラム分取物を１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、特許文献１、非特許文献２での報告と合致することを確認した。
［参考例２］ 大腸菌由来ＤＥＲＡによるクロロアセトアルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合
大腸菌由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（２４．４Ｕ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を、３００ｍＭ アセトアルデヒド（純正化学）、１００ｍＭ クロロアセトアルデヒド（東京化成製）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて２４時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は４％であった。
大腸菌由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（２４．４Ｕ）を、１００ｍＭ Ｔｒｉｓ-ＨＣｌ緩衝液（ｐＨ７．５）を、３００ｍＭ アセトアルデヒド（純正化学）、１００ｍＭ クロロアセトアルデヒド（東京化成製）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて２４時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は４％であった。
クロロアセトアルデヒドにアセトアルデヒドを１分子アルドール縮合して４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを合成する方法
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、４℃にて２時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９０％であった。また、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は８０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回繰り返し、酢酸エチル層を合わせ減圧下、酢酸エチルを蒸発させた。得られた油状物を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（９：１）を溶出液として、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを単離した。単離した、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、非特許文献２の報告と合致することを確認し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドであることを確認した。さらに、ＨＰＬＣ分析により光学純度が９７.８％ｅｅであることを確認した。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
クロロアセトアルデヒドの組成からなる反応液１ｍｌに添加し、４℃にて２時間反応させた。反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）で濾過し除蛋白した後に、ＨＰＬＣを用いて４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドと６-クロロ-２，４，６-トリデオキシヘキソースの生成量合計を定量した。生成量合計から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は９０％であった。また、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドの生成量から求めたクロロアセトアルデヒドの転化率は８０％であった。反応液を、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回繰り返し、酢酸エチル層を合わせ減圧下、酢酸エチルを蒸発させた。得られた油状物を少量の酢酸エチルに溶解し、シリカゲルクロマトグラフィーにかけ、酢酸エチル：ｎ−ヘキサン（９：１）を溶出液として、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを単離した。単離した、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドを１Ｈ
ＮＭＲ、１３Ｃ ＮＭＲ分析し、非特許文献２の報告と合致することを確認し、４-クロロ-３-ヒドロキシブチルアルデヒドであることを確認した。さらに、ＨＰＬＣ分析により光学純度が９７.８％ｅｅであることを確認した。
ＨＰＬＣによる光学純度分析
反応液を、４℃に冷却し１０％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ９．０に調整した後、水素化ホウ酸ナトリウムを添加し、３０分間攪拌した。反応液を２Ｎ塩酸でｐＨ６．０に調整し、残存する水素化ホウ酸ナトリウムを分解した。その後、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回繰り返し、酢酸エチル層を合わせ減圧下、酢酸エチルを蒸発させた。得られた油状物を少量のｎ−ヘキサン：エタノ−ル（５０：５０）に溶解しＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−Ｈ カラム（ダイセル化学（社）製）を使用し、カラム温度４０℃で、ｎ−ヘキサン：エタノ−ル（９２．５：７．５）を溶離液として分析した。アプライ量は、１０μＬで、ＲＩ検出器（日本分光製）を用い検出を行った
反応液を、４℃に冷却し１０％水酸化ナトリウム水溶液によりｐＨ９．０に調整した後、水素化ホウ酸ナトリウムを添加し、３０分間攪拌した。反応液を２Ｎ塩酸でｐＨ６．０に調整し、残存する水素化ホウ酸ナトリウムを分解した。その後、２倍容の酢酸エチルで抽出する操作を３回繰り返し、酢酸エチル層を合わせ減圧下、酢酸エチルを蒸発させた。得られた油状物を少量のｎ−ヘキサン：エタノ−ル（５０：５０）に溶解しＨＰＬＣで分析した。ＨＰＬＣカラムとして、ＣＨＩＲＡＬＰＡＫ ＡＤ−Ｈ カラム（ダイセル化学（社）製）を使用し、カラム温度４０℃で、ｎ−ヘキサン：エタノ−ル（９２．５：７．５）を溶離液として分析した。アプライ量は、１０μＬで、ＲＩ検出器（日本分光製）を用い検出を行った
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡによる各種脂肪族アルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０.２３Ｕ）を、１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
各種脂肪族アルデヒド（プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル、コハク酸セミアルデヒド）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて反応させた。
サーモトーガ・マリティマ由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０.２３Ｕ）を、１００ｍＭ クエン酸-クエン酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ６．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
各種脂肪族アルデヒド（プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル、コハク酸セミアルデヒド）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて反応させた。
反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた濾過処理により除蛋白した後に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析にかけ、生じたスポットにより各種脂肪族アルデヒドとアセトアルデヒドとのアルドール縮合反応化合物を検出した。反応に供した脂肪族アルデヒドのすべてについて、アセトアルデヒドとのアルドール縮合化合物が検出された。
ＴＬＣ分析条件
シリカゲルプレート：シリカ ゲル ６０（メルク社製）
展開液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９：１
スポット量：反応液 １μｌ
検出方法：１２モリブド（６価）リン酸ｎ水和物（和光純薬工業（株）社製）をエタノ−ルにより７％溶液とし、サンプルを展開したシリカゲルプレ−トを浸漬し加熱して発色させた。
ＴＬＣ分析条件
シリカゲルプレート：シリカ ゲル ６０（メルク社製）
展開液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９：１
スポット量：反応液 １μｌ
検出方法：１２モリブド（６価）リン酸ｎ水和物（和光純薬工業（株）社製）をエタノ−ルにより７％溶液とし、サンプルを展開したシリカゲルプレ−トを浸漬し加熱して発色させた。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡによる各種脂肪族アルデヒドとアセトアルデヒドのアルドール縮合
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
各種脂肪族アルデヒド（プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル、コハク酸セミアルデヒド）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて反応させた。
パイロバキュラム・アエロフィラム由来ＤＥＲＡ ４００μｇ（０．０４Ｕ）を、１００ｍＭ 酢酸-酢酸Ｎａ緩衝液（ｐＨ５．５）、１００ｍＭ アセトアルデヒド、１００ｍＭ
各種脂肪族アルデヒド（プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、ｎ−バレルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドメチルエステル、コハク酸セミアルデヒド）の組成からなる反応液１ｍｌに添加し、２５℃にて反応させた。
反応液をＵＬＴＲＡＦＲＥＥ-ＭＣフイルター（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ社製）を用いた濾過処理により除蛋白した後に、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）分析にかけ生じたスポットにより各種脂肪族アルデヒドとアセトアルデヒドとのアルドール縮合反応化合物を検出した。
反応に供した脂肪族アルデヒドのすべてについて、アセトアルデヒドとのアルドール縮合化合物が検出された。
ＴＬＣ分析条件
シリカゲルプレート：シリカ ゲル ６０（メルク社製）
展開液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９：１
スポット量：反応液 １μｌ
検出方法：１２モリブド（６価）リン酸ｎ水和物（和光純薬工業（株）社製）をエタノ−ルにより７％溶液とし、サンプルを展開したシリカゲルプレ−トを浸漬し加熱して発色させた。
ＴＬＣ分析条件
シリカゲルプレート：シリカ ゲル ６０（メルク社製）
展開液：酢酸エチル：ｎ−ヘキサン＝９：１
スポット量：反応液 １μｌ
検出方法：１２モリブド（６価）リン酸ｎ水和物（和光純薬工業（株）社製）をエタノ−ルにより７％溶液とし、サンプルを展開したシリカゲルプレ−トを浸漬し加熱して発色させた。
本発明の製造方法に用いられる超好熱性菌等に由来するＤＥＲＡは、非天然基質を用いたアルドール縮合反応の触媒活性が高く、また、高い基質濃度でも酵素の安定性が高いため、本発明の製造方法は、従来の大腸菌由来ＤＥＲＡを用いた方法と比較して、反応容器当りのキラルなヒドロキシアルデヒド化合物の生産性を向上させることができる。
Claims (9)
- 下記の（１）または（２）のＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（または該酵素を含む細胞またはその処理物）の存在下、一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物と1分子のアセトアルデヒドとをアルドール縮合反応させる、炭素数が２増加したヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法（一般式（１）〜一般式（３）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示し、Ｒ ２ は水素原子、水酸基またはメチル基を示し、Ｒ ３ は水素原子または水酸基を示す。）。
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する。
- アルドール縮合反応させて得られる、対応する炭素数が２増加したヒドロキシアルデヒド化合物がそれぞれ一般式（４）、一般式（５）または一般式（６）で示されるアルデヒド化合物である、請求項１記載の製造方法（一般式（４）〜一般式（６）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示し、Ｒ ２ は水素原子、水酸基またはメチル基を示し、Ｒ ３ は水素原子または水酸基を示す。）。
- 一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物に対し、アセトアルデヒドを０．５モル等量以上３．０モル等量以内の範囲で使用する、請求項１または２記載の製造方法。
- 一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物とアセトアルデヒドの合計モル数に対し、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼを０．１Ｕ／ｍｍｏｌ以上８０Ｕ／ｍｍｏｌ以下の割合で用いて（１Ｕは、２５℃で１分間当たり１μｍｏｌのＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸をＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドに分解する酵素量を表す）反応させる、請求項１乃至３いずれかに記載の製造方法。
- 一般式（１）、一般式（２）または一般式（３）で示される脂肪族アルデヒド化合物が、アセトアルデヒド、クロロアセトアルデヒド、グリコールアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、イソブチルアルデヒド、３，４−ジヒドロキシブチルアルデヒド、マロン酸セミアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドから選ばれるアルデヒドである、請求項１乃至４いずれかに記載の製造方法。
- 下記の（１）または（２）のＤ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼ（または該酵素を含む細胞またはその処理物）の存在下、一般式（１）で示される脂肪族アルデヒド化合物と２分子のアセトアルデヒドとをアルドール縮合反応させる、炭素数が４増加したヒドロキシアルデヒド化合物の製造方法（一般式（１）中、Ｒ １ は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基、炭素数が１から４のアルキル基、アルコキシ基またはアルカン酸基を示す。）。
（１）配列番号１または配列番号２に示されたアミノ酸配列を有する。
（２）配列番号１または配列番号２記載のアミノ酸配列の、１ないし数個のアミノ酸が欠失、または他のアミノ酸残基に置換され、或いは他のアミノ酸残基が挿入されたアミノ酸配列を有する。
- アルドール縮合反応させて得られる、対応する炭素数が４増加したヒドロキシアルデヒド化合物が一般式（７）で示される化合物である、請求項６記載の製造方法（一般式（７）中、Ｒ 1 は水素原子、水酸基、ハロゲン原子、アジド基、カルボキシル基または炭素数が１から４のアルコキシ基を示す。）。
- 一般式（１）で示される脂肪族アルデヒド化合物とアセトアルデヒドの合計モル数に対し、Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸アルドラーゼを０．１Ｕ／ｍｍｏｌ以上１２０Ｕ／ｍｍｏｌ以下の割合で用いて（１Ｕは、２５℃で１分間当たり１μｍｏｌの該Ｄ-２-デオキシリボース-５-リン酸をＤ-グリセルアルデヒド-３-リン酸とアセトアルデヒドに分解する酵素量を表す）反応させる、請求項６または７記載の製造方法。
- 一般式（１）で示される脂肪族アルデヒド化合物が、アセトアルデヒド、クロロアセトアルデヒド、グリコールアルデヒド、プロピオンアルデヒド、ブチルアルデヒド、３，４−ジヒドロキシブチルアルデヒド、マロン酸セミアルデヒド、コハク酸セミアルデヒド、アジピン酸セミアルデヒドから選ばれるアルデヒドである、請求項６乃至８いずれかに記載の製造方法。
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