ES2282433T3 - Procedimiento para la preparacion de 2,4-didesoxihexosas y 2,4,6-tridesoxihexosas. - Google Patents

Procedimiento para la preparacion de 2,4-didesoxihexosas y 2,4,6-tridesoxihexosas. Download PDF

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Abstract

Procedimiento para la preparación de una 2, 4-desoxihexosa o 2, 4, 6-tridesoxihexosa a partir de un compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno - y un aldehído no sustituido o sustituido en presencia de una aldolasa y agua, caracterizado porque la reacción entre el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno - y un aldehído no sustituido o sustituido se lleva a cabo a una concentración de carbonilo de entre 0, 6 y 6 moles/l de mezcla de reacción y la concentración final de la 2, 4-didesoxihexosa o la 2, 4, 6-tridesoxihexosa es al menos del 2% en masa de la mezcla de reacción.

Description

Procedimiento para la preparación de 2,4-didesoxihexosas y 2,4,6-tridesoxihexosas.
La invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una 2,4-desoxihexosa o una 2,4,6-tridesoxihexosa a partir de un compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y un aldehído no sustituido o sustituido en presencia de una aldolasa y agua.
Se conoce un procedimiento de este tipo a partir del documento US-A-5.795.749, que describe la síntesis de 2,4,6-tridesoxihexosas mediante un producto intermedio de 3-hidroxibutanal 4-sustituido. Se hace uso de acetaldehído y un adehído 2-sustituido como reactivos y de una aldosa como catalizador.
Gijsen y otros (1994) [JACS 116, 8422-8423] describen reacciones catalizadas por DERA (2-desoxiribosa-5-fosfato aldolasa) de una variedad de aldehídos C2 sustituidos como sustrato aceptor inicial y acetaldehído como un dador para formar las correspondientes 2,4-didesoxihexosas 6-sustituidas.
Gijsen y otros (1995) [JACS 117, 7585-7591] describen la síntesis estereoselectiva de 2,4,6-tridesoxihexosas 6-sustituidas mediante una reacción catalizada por DERA de una sola etapa doble partiendo de un acetaldehído y un aldehído aceptor.
Un inconveniente conocido de tales condensaciones aldólicas catalizadas por enzimas es que la capacidad de producción es baja. Esto se debe particularmente al hecho de que las condensaciones aldólicas de este tipo se llevan a cabo generalmente a bajas concentraciones de aldehído, debido a que se supuso de manera general que la aldolasa usada estaría inactiva en gran medida, a más altas concentraciones de aldehído. También es evidente el apoyo a la afirmación anterior en, por ejemplo, Matsumura y otros (1999) [Nature Biotechnology 17, 696-701], la tesis de W.R.K. Schoevaart (2000) [ISBN90-9013780-71], págs. 117-118, y Greenberg y otros (2004) [PNAS 101 (16), 5788-5793].
Otro inconveniente de las bajas concentraciones usadas es que al final de la reacción, la concentración de la 2,4,6-tridesoxihexosa en la mezcla de reacción es baja, lo que influye fuertemente en los costes de, por ejemplo, purificación. Como consecuencia, no era de esperar que fuera posible desarrollar un procedimiento comercialmente atractivo para la preparación de 2,4-didesoxihexosas y 2,4,6-tridesoxihexosas en base a una tecnología de este tipo.
La invención proporciona un procedimiento comercialmente atractivo para la preparación de una 2,4-didesoxihexosa o una 2,4,6-tridesoxihexosa por medio de una condensación aldólica catalizada por enzimas.
Esto se logra, según la invención, llevando a cabo la reacción entre el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y el aldehído no sustituido o sustituido a una concentración de carbonilo de como máximo 6 moles/l de mezcla de reacción, de modo que la concentración final de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa sea al menos del 2% en masa de la mezcla de reacción.
En el procedimiento conocido para la síntesis de 2,4-didesoxihexosas y 2,4,6-tridesoxihexosas se aplican concentraciones de carbonilo de como máximo 0,4 moles por litro de mezcla de reacción. Se obtienen concentraciones finales de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa que son, como máximo, de aproximadamente el 1% en masa de la mezcla de reacción. Sorprendentemente, el solicitante ha encontrado que las concentraciones de carbonilo de hasta 6 moles/l pueden aplicarse de manera adecuada, siempre que el grado de desactivación de la enzima permanezca limitado a pesar de la alta concentración de carbonilo. Como resultado, pueden obtenerse concentraciones finales más altas de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa, de modo que se aumenta la capacidad de producción y se disminuyen los costes de, entre otros, purificación del producto. Como consecuencia, esto prueba que es posible desarrollar un procedimiento comercialmente atractivo.
En el marco de la invención, se entiende que la concentración de carbonilo es la suma de las concentraciones de los compuestos carbonílicos no sustituidos o sustituidos con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha, el aldehído no sustituido o sustituido y el producto intermedio que se forma en la reacción del compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha con el aldehído no sustituido o sustituido.
La concentración de carbonilo se toma en esencia a un valor por debajo de 6 moles/l durante el procedimiento de síntesis. Estará claro para un experto en la técnica que concentraciones ligeramente más altas durante un tiempo (muy) corto tendrán un efecto adverso pequeño, y por tanto son todavía admisibles dentro del marco de la invención. La concentración de carbonilo se encuentra preferiblemente entre 0,1 y 5 moles por litro de mezcla de reacción, más preferiblemente entre 0,6 y 4 moles por litro de mezcla de reacción.
La concentración final de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa en la práctica general se encuentra entre el 5 y el 50% en masa, por ejemplo entre el 8 y el 40% en masa, en particular entre el 10 y el 35% en masa, calculada en relación a la mezcla de reacción al final de la reacción.
No es muy crítica la secuencia de adición del compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha, el aldehído no sustituido o sustituido y la aldolasa. Preferiblemente se añade la aldolasa a la mezcla de reacción antes de la adición del compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha. Más preferiblemente se mezcla la aldolasa con una disolución de al menos una parte del aldehído no sustituido o sustituido antes de añadir el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha, particularmente cuando, en las condiciones elegidas, el aldehído no sustituido o sustituido que se usa reacciona consigo mismo en un grado menor que el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha que se usa. Preferiblemente se suministra más de 0,1 moles/l de mezcla de reacción de aldehído no sustituido o sustituido, más preferiblemente más de 0,3 moles por litro de mezcla de reacción, en particular más de 0,6 moles por litro de mezcla de reacción. Esta elección de la concentración inicial del aldehído no sustituido o sustituido tiene un efecto favorable sobre la velocidad de reacción inicial del procedimiento enzimático. La aldolasa puede añadirse o dosificarse durante la reacción en varias porciones.
En una realización de la invención, se añaden a la mezcla de reacción de una vez tanto el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha como el aldehído no sustituido o sustituido y la aldolasa. Haciéndolo así, pueden añadirse ambos al mismo tiempo y consecutivos el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de carbono \alpha, el aldehído no sustituido o sustituido y la aldolasa. Según esta realización, la suma de las cantidades adecuadas de compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y aldehído no sustituido o sustituido puede ascender generalmente a hasta 6 moles por litro de mezcla de reacción y en la práctica, se consiguen normalmente concentraciones de producto final entre el 7 y el 15% en masa, en particular, entre el 5 y el 20% en masa de la mezcla de reacción.
En otra realización de la invención, la adición del compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y/o el aldehído no sustituido o sustituido se lleva a cabo en al menos dos porciones, teniendo lugar cada adición siguiente después de que se haya convertido al menos una parte de los reactivos de la adición anterior. Esto hace posible que la suma de las cantidades de compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y el aldehído no sustituido o sustituido añadidos en el curso de la reacción ascienda a más de 6 moles por litro de mezcla de reacción, mientras que al mismo tiempo, la concentración de carbonilo en la mezcla de reacción en cualquier instante durante la reacción es inferior a 6 moles/l para limitar la desactivación de la enzima. Si se desea, puede añadirse la aldolasa de una vez o en al menos dos porciones.
En otra realización más, se dosifican en el tiempo el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y/o el aldehído no sustituido o sustituido en la mezcla de reacción durante la reacción. Preferiblemente, en esta realización, se suministra al menos una parte del aldehído no sustituido o sustituido junto con la aldolasa. Si se desea, puede añadirse la aldolasa de una vez, añadirse en varias porciones, o dosificarse en el tiempo.
Las dos últimas realizaciones pueden conducir a concentraciones finales de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4, 6-tridesoxihexosa que son superiores al 40% en masa. Además, se ha encontrado que la dosificación dentro de la mezcla de reacción del compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha, el aldehído no sustituido o sustituido y/o la aldolasa, puede conducir a ahorros considerables en los costes de la enzima.
También son posibles combinaciones de las realizaciones anteriores.
La temperatura de reacción y el pH no son muy críticos, y ambos se eligen en función del sustrato. La reacción se lleva a cabo preferiblemente en fase líquida. La reacción puede llevarse a cabo, por ejemplo, a una temperatura de reacción entre -5 y 45ºC, preferiblemente entre 0 y 10ºC y un pH entre 5,5 y 9, preferiblemente entre 6 y 8.
La reacción se lleva a cabo preferiblemente a pH más o menos constante, haciéndose uso por ejemplo de un tampón o de valoración automática. Como tampón pueden aplicarse, por ejemplo, bicarbonato de sodio y potasio, fostato de sodio y potasio, trietanolamina/HCl, bis-tris-propano/HCl y HEPES/KOH. Preferiblemente se aplica un tampón de bicarbonato de sodio o potasio, por ejemplo en una concentración de entre 20 y 400 mmoles/l de mezcla de reacción.
La razón molar entre la cantidad total de compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha que se añade a la cantidad total de aldehído no sustituido o sustituido no es muy crítica, y se encuentra preferiblemente entre 1,5:1 y 4:1, en particular entre 1,8:1 y 2,2:1. También pueden aplicarse otras razones, pero no ofrecen ventajas.
Como catalizador en el procedimiento según la invención, se hace uso de una aldolasa que cataliza la condensación aldólica entre dos aldehídos o entre un aldehído y una cetona. La aldolasa que se usa preferiblemente es 2-desoxirribosa-5-fosfato aldolasa (DERA, EC 4.1.2.4) o mutantes de la misma, más preferiblemente DERA de Escherichia coli o mutantes de la misma. La cantidad de DERA que ha de usarse no es muy crítica y se elige en función de, por ejemplo, los reactivos aplicados, las concentraciones de reactivo, la velocidad de reacción deseada, la duración de la reacción deseada y otros factores económicos. La cantidad de DERA que ha de usarse se encuentra entre, por ejemplo, 50 y 5000 U/mmol del aldehído no sustituido o sustituido. 1 U (unidad) es una medida de la actividad enzimática, y corresponde a la conversión de 1 \mumol de 2-desoxirribosa-5-fosfato por minuto a 37ºC.
El compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha tiene preferiblemente 2-6 átomos de carbono, más preferiblemente 2-4 átomos de carbono. Puede hacerse uso, por ejemplo, de aldehídos, por ejemplo acetaldehído y propanal, y cetonas, por ejemplo acetona y fluoroacetona. Cuando se usa un aldehído como compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha, puede por supuesto aplicarse en forma de su (hemi)acetal, por ejemplo como acetal de un alcohol, en particular metanol, etanol o glicol.
Como aldehído no sustituido o sustituido puede hacerse uso de, por ejemplo, aldehídos con 2-20 átomos de carbono, por ejemplo, acetaldehído, propanal, butanal, un dialdehído acetal-protegido o un aldehído sustituido, en particular un acetaldehído sustituido con la fórmula HC(O)CH_{2}X en la que X representa un grupo que es idéntico a, o puede convertirse en el sustituyente requerido en el producto final, por ejemplo, un grupo CN, o un sustituyente que puede separarse como grupo saliente en una reacción posterior, por ejemplo un halógeno, en particular Cl, Br o I; un grupo tosilato; un grupo mesilato; un grupo aciloxilo, en particular un grupo acetoxilo; un grupo fenacetiloxilo; un grupo alquiloxilo o un grupo ariloxilo, siendo particularmente adecuado cloroacetaldehído.
El acetaldehído no sustituido o sustituido puede aplicarse como tal o en forma de su (hemi)acetal, por ejemplo como acetal de un alcohol tal como metanol, etanol o glicol.
La 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa de fórmula 1
1 
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es, por ejemplo, un producto intermedio deseado en la preparación de diversas medicinas, en particular para la síntesis de inhibidores de la HMG-CoA reductasa, más en particular para la síntesis de estatinas, por ejemplo lovastatina, cerivastatina, rosuvastatina, simvastatina, pravastatina y fluvastatina, en particular para ZD-4522 tal como se describe en Drugs of the future (1999), 24(5), 511-513, por M. Watanabe y otros, Bioorg. & Med. Chem. (1997), 5(2), 437-444. Por tanto, la invención proporciona una ruta nueva, económicamente atractiva para 2,4-didesoxihexosas o 2,4,6-tridesoxihexosas que puede usarse para la síntesis de, por ejemplo, el ácido 2-(6-hidroximetil-1,3-dioxan-4-il)acético, que es un producto intermedio deseado para la preparación de medicinas, en particular estatinas.
La 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa de fórmula 1 pueden prepararse con la ayuda del procedimiento según la invención a partir de acetaldehído y HC(O)CH_{2}X, en la que X es tal como se define anteriormente, y puede convertirse posteriormente, por ejemplo, mediante métodos conocidos, en la correspondiente 4-hidroxi-tetrahidropiran-2-ona, de fórmula 2
2 
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en la que X es como se define anteriormente. Reactivos adecuados para esta conversión son, por ejemplo, Br_{2} con, como base, carbonato de calcio (Tetrahedron Lett. 30 (47), 1989 pág. 6503), dicromato de piridinio en diclorometano (Carbohydrate Res. 300 1997 pág. 301) y tetra-N-propilamoniotetra-oxorrutenato (J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1987 pág. 1625).
El 4-hidroxi-tetrahidropiran-2-ona obtenido puede convertirse posteriormente, si se desea, en un derivado del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético de fórmula 3
3
en la que X es tal como se define anteriormente, y R_{1}, R_{2} y R_{3} representan cada uno independientemente un grupo alquilo con 1-3 átomos de carbono. Esta conversión puede efectuarse, por ejemplo, en presencia de un agente de formación de acetal y un catalizador ácido.
Posteriormente el derivado del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético puede hidrolizarse en presencia de una base y agua para formar una sal de fórmula 4
4
en la que Y es un metal alcalino, un metal alcalinotérreo o un grupo amonio no sustituido o sustituido, preferiblemente Na, Ca o un compuesto de tetraalquilamonio, y en la que X, R_{1} y R_{2} son tal como se define anteriormente. La hidrólisis puede ir seguida de la conversión en el correspondiente ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético según la fórmula 4 con
Y = H.
La sal del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético según la fórmula 4 puede convertirse en un correspondiente éster del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético según la fórmula 3 con X, R_{1} y R_{2} tal como se define anteriormente y en la que R_{3} representa un grupo alquilo con 1-12 átomos de carbono, un grupo arilo con 6-12 átomos de carbono o un grupo aralquilo con 7-12 átomos de carbono en un modo conocido de por sí. Preferiblemente, la sal del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético se convierte en el correspondiente t-butiléster del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético.
El derivado del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético de fórmula 3, en la que R_{3} representa un grupo alquilo con 1-12 átomos de carbono, un grupo arilo con 6-12 átomos de carbono o un grupo aralquilo con 7-12 átomos de carbono, puede convertirse en el derivado del ácido acético del correspondiente ácido 2-(6-hidroximetil-1,3-dioxan-4-il)acético de fórmula 5
\vskip1.000000\baselineskip
5
en la que R_{1}, R_{2} y R_{3} son tal como se define anteriormente, por ejemplo como se describe en el documento US-A-5594153 o en el documento WO-A-200008011, mediante la conversión en un compuesto según la fórmula 3 con X = aciloxilo, por ejemplo, un grupo acetoxilo, y R_{1}, R_{2} y R_{3} son tal como se define anteriormente, seguida de la sustitución del grupo aciloxilo, de un modo conocido de manera general, por un grupo hidroxilo.
La 4-hidroxi-tetrahidropiran-2-ona de fórmula 2
6
en la que X es tal como se define anteriormente, puede convertirse también en el correspondiente ácido dihidroxihexanoico de fórmula 6
7
con la ayuda de un ácido o una base.
El ácido dihidroxihexanoico de fórmula 6 puede convertirse posteriormente en un derivado del ácido 2-(1,3-dioxan-4-il)acético de fórmula 3, en la que X, R_{1}, R_{2} y son tal como se define anteriormente y R_{3} representa un grupo alquilo con 1-12 átomos de carbono, un grupo arilo con 6-12 átomos de carbono o un grupo aralquilo con 7-12 átomos de carbono, por ejemplo en presencia de un agente de formación de acetal y un catalizador ácido.
La invención se aclarará en base a los ejemplos, sin limitarse a ellos, sin embargo.
Ejemplos Preparación y métodos de medida 1. Preparación de una cantidad de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa como material de referencia para el análisis por CG
Se añadieron 76 ml (0,60 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 50% y 84 ml (1,47 moles) de acetaldehído a 0,62 l de disolución de NaHCO_{3} 100 mM a 10ºC tras lo que se ajustó el pH hasta pH 7,0 con la ayuda de NaOH 4N. Se comenzó la reacción enzimática mediante adición de 220 g de disolución de enzima (2050 U/g). Se midió mediante CG una conversión máxima a 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa tras aproximadamente 18 horas de agitación. Se paró la reacción añadiendo 1,7 l de acetona. Se añadieron 4 g de dicalite a esta mezcla y se filtró la mezcla tras aproximadamente 30 minutos de agitación. Se evaporó el filtrado durante 5 horas a 40ºC a vacío. Se purificó el aceite resultante por medio de cromatografía en columna de gel de sílice (400 ml) y se eluyó con un eluyente que consistía en una mezcla de éter de petróleo (punto de ebullición: 40-70ºC) y acetato de etilo en una razón volumétrica de 1:2. Se aislaron en total 26 g de la 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa tras la evaporación de la fracción con un valor de Rf de 0,33. El término valor de Rf de una fracción se conoce bien por un experto en la técnica y se define como la distancia que cubre una fracción en la columna dividida por la distancia cubierta por el disolvente móvil en la columna o el tiempo que necesita una fracción para cubrir una distancia en particular en la columna dividido por el tiempo que necesita el disolvente móvil para cubrir la misma distancia en la columna.
La pureza de la 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa se determinó por medio de 1H-RMN de acuerdo con un método descrito por P.P. Lankhorst en Pharmacopeial Forum, 22, (3), 2414-2422.
2. Análisis por CG
Se determinó la concentración de la 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa durante la reacción enzimática por medio de un análisis por cromatografía de gases. Se hizo uso de un CG Hewlett Packard con un detector de ionización de llama, serie II del tipo HP5890, provisto con una columna Chrompack CP-Sil 5 CB (25 m * 0,25 mm, d_{r} 1,2 \mum). Se determinaron las concentraciones en base a una curva de calibración de la 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa con pureza (1) química conocida en acetona.
3. Preparación de la disolución de DERA
Se aplicaron las técnicas habituales para sobreexpresar la enzima DERA en células de Escherichia coli recombinante. Tales técnicas se describen en Sambrook y otros, "Molecular Cloning: A Laboratory Manual", Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. En este caso se clonó el gen deoC de Escherichia coli W3110 en el vector de expresión comercialmente disponible pBADMyc-HisB (Invitrogen, Groningen, NL). Se multiplicó el gen (incluyendo el codón de terminación) por medio de una reacción en cadena de polimerasa y se introdujo en los sitios NcoI y EcoRI del vector de modo que el codón de iniciación ATG de deoC fue igual al codón ATG en el sitio NcoI del vector (fusión de traducción). Debido a que se clonó también el codón de finalización de deoC, se impidió la formación de una proteína de fusión con el His tag, que se codifica también en el vector. Se cultivaron las células de Escherichia coli DH10B (Life Technologies, Breda, NL) con el plásmido resultante pBAD DERA 2,2 en un reactor de tanque agitado y oxigenado de 10 l en un medio de Luria Bertani complejo con 100 \mug/ml de carbenicilina y se indujo por adición de arabinosa hasta el 0,01%. Para aumentar la densidad celular, se añadieron dos disoluciones acuosas adicionales que contenían glicerol puro (alimentación 1) y extracto de levadura al 13% y triptón al 1,3% (Difco, Michigan, EE.UU.) (alimentación 2) después de que las células habían consumido el medio LB. Se obtuvieron de este modo aproximadamente 350 g de células húmedas a partir de un cultivo de 10 l, que se recuperaron por medio de centrifugado, después de lo que se volvieron a suspender en un tampón de fostato de potasio de pH 7,2 y se centrifugaron de nuevo. Se eliminó el sobrenadante tras lo que se almacenó el gránulo a -20ºC.
En la bibliografía se describen procesos diferentes para la purificación de DERA a partir de células de E. coli recombinante, por ejemplo, en Chen y otros, J. Am. Chem. Soc., vol. 114, 1992, 741-748, y Wong y otros, J. Am. Chem. Soc., vol. 117, 1995, 3333-3339. Sin embargo, la purificación no es una condición para el uso eficaz de DERA en reacciones aldólicas, véase, por ejemplo, Wong y otros, J. Am. Chem. Soc., vol. 117, 1995, 3333-3339. Se aplicaron técnicas habituales para la purificación parcial de DERA. Se suspendieron los gránulos congelados en un tampón de fosfato de potasio 100 mM a pH 7,2 (1 parte en peso de las células húmedas y 2 partes en peso del tampón), tras lo que se destruyeron las paredes celulares por medio de ultrasonidos continuos. Se obtuvo el extracto bruto claro por medio de centrifugado y se usó directamente o se almacenó a -20ºC. La disolución puede concentrarse de manera adicional si se desea por medio de ultrafiltración, por ejemplo con ayuda de membranas de ultrafiltración Millipore con un valor límite de 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, EE.UU.). Las actividades específicas típicas que se obtuvieron por medio de este proceso están entre 1400 y 5300 unidades por g de disolución.
4. Determinación de la actividad de DERA
Se sometieron a sonicación las células de E. coli recombinante que sintetizan para DERA en un tampón de fosfato de potasio 50 mM y se centrifugaron (18.500 rpm, 30 min) para eliminar el material celular. Se diluyó el extracto celular libre resultante y se usó en una prueba espectrofotométrica encadenada. En esta prueba se convirtió 2-desoxirribosa-5-fosfato en D-gliceraldehído-3-fosfato y acetaldehído, tras lo que se convirtió el D-glicerladehído-3-fosfato en el dihidroxiacetona fosfato en presencia de triosafosfato isomerasa (TIM, EC 5.3.1.1). Entonces se convirtió dihidroxiacetona fosfato en glicerol-3-fosfato en presencia de glicerol fosfato deshidrogenasa (GDH, EC 1.1.1.8). En la última etapa se consumió nicotinamina adenina dinucleótido en forma reducida (NADH), que se monitorizó espectrofotométricamente mediante determinación de la disminución de la absorción a 340 nm. Típicamente se aplicó un volumen total de 3 ml, que contenía 2878,5 \muM de un tampón de trietanolamina 50 mM con pH 7,2, 30 \mul de una disolución 12 mM de NADH en agua, 11,5 \mul de una suspensión de enzima que contenía 30 unidades de GDH y 500 unidades de TIM en fosfato de amonio acuoso 3,2 M, y 30 \mul de una disolución 50 mM de 2-desoxirribosa-5-fosfato en agua. Se inició la reacción mediante adición de 50 \mul de extracto celular libre. La temperatura era de 37ºC. La actividad, expresada en U (unidades), siendo 1 unidad igual a la actividad enzimática que corresponde a la conversión de un \mumol de 2-desoxirribosa-5-fosfato por minuto a 37ºC, se calculó a partir del descenso lineal de la absorción a 340 nm.
Ejemplo I
Preparación de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa en un experimento por etapas
Se añadieron 4,3 ml (0,03 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45% y 3,4 ml (0,06 moles) de acetaldehído a 37 ml de una disolución tampón 100 mM de NaHCO_{3} a una temperatura de 4ºC. El pH de esta mezcla era 7,3. Se inició la reacción enzimática mediante la adición de 6,3 ml (5270 U/g) de disolución de enzima. Se llevó a cabo la reacción a pH constante de 7,5. Se analizó la mezcla a intervalos regulares por medio de CG. Se paró la reacción mediante la adición de 100 ml de acetona después de que se alcanzara una concentración de la 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa de aproximadamente 80 g/l (8% en masa).
Ejemplo II
Preparación de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa en un experimento por etapas repetitivo
Se repitió el experimento del ejemplo 1. Sin embargo, después de que la concentración de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa alcanzara aproximadamente 80 g/l, se añadieron de nuevo otros 4,3 ml (0,03 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45%, 3,4 ml (0,06 moles) de acetaldehído y 6,3 ml (5270 U/g) de disolución de enzima. Esto se repitió tres veces más, cada vez después de que la conversión había alcanzado un valor constante y ya no aumentaba más. De este modo se añadieron en total 0,15 moles de una disolución de cloroacetaldehído al 45% y 0,30 moles de acetaldehído. La reacción se llevó a cabo a un pH constante de 7,5. Se analizaron muestras de la reacción con ayuda de CG. La concentración final de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa fue aproximadamente 240 g/l (24% en masa).
Ejemplo III
Preparación de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa por medio de dosificar los componentes de la reacción
Se añadieron 84 g (1,0 mol) de NaHCO_{3} a 6,2 l de agua desmineralizada tras lo que se enfrió la disolución hasta aproximadamente 2ºC. Posteriormente, se añadieron a esto 72,3 ml (0,4 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45%, tras lo que se ajustó el pH de la disolución hasta 7,3 con ayuda de HCl al 32%. Se añadió una disolución de enzima (6,8 x 10^{8} U) a esta mezcla, tras lo que se aumentó el volumen hasta 7,5 l. En 2 horas, se dosificaron a esta mezcla en total, 1,3 l (9,5 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45% y 0,9 l (9,9 moles) de una disolución de acetaldehído al 50%. Tras esto, se añadieron, en 5 horas, 0,86 l (9,5 moles) de una disolución de acetaldehído al 50%. Se agitó la mezcla de reacción durante toda la noche a 2ºC y a un pH constante de 7,5. El peso total de la reacción ascendió a 10,9 kg. Se determinó el contenido en 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa por medio de cromatografía de gases y se encontró que era 126 g/l (12,6% en masa).
\newpage
Ejemplo IV
Preparación de 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa por medio de dosificar los componentes de la reacción
Se añadieron 11,8 g (0,14 moles) de NaHCO_{3} a 0,44 l de agua desmineralizada tras lo que se enfrió la disolución hasta aproximadamente 2ºC. Posteriormente, se añadieron a esto 10,0 ml (0,07 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45%, tras lo que se ajustó el pH de la disolución hasta 7,3 con ayuda de HCl al 32%. Se añadió a esta mezcla una disolución de enzima (1,03 x 10^{6} U). En 2 horas se dosificaron a esta mezcla 0,193 l (1,35 moles) de una disolución de cloroacetaldehído al 45% y 0,127 l (1,40 moles) de una disolución de acetaldehído al 50%. Tras esto, se añadieron, en 5 horas, 0,134 l (1,46 moles) de una disolución de acetaldehído al 50%. Se agitó la mezcla de reacción durante toda la noche a 2ºC y a un pH constante de 7,5. Se determinó el contenido en 6-cloro-2,4,6-tridesoxihexosa por medio de cromatografía de gases y se encontró que era 180 g/l (18,0% en masa).

Claims (12)

1. Procedimiento para la preparación de una 2,4-desoxihexosa o 2,4,6-tridesoxihexosa a partir de un compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y un aldehído no sustituido o sustituido en presencia de una aldolasa y agua, caracterizado porque la reacción entre el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y un aldehído no sustituido o sustituido se lleva a cabo a una concentración de carbonilo de entre 0,6 y 6 moles/l de mezcla de reacción y la concentración final de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa es al menos del 2% en masa de la mezcla de reacción.
2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la concentración final de la 2,4-didesoxihexosa o la 2,4,6-tridesoxihexosa se encuentra entre el 5 y el 50% en masa de la mezcla de reacción.
3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque la concentración final de la 2,4-didesoxihexosa y la 2,4,6-tridesoxihexosa se encuentra entre el 10 y el 35% en masa de la mezcla de reacción.
4. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-3, caracterizado porque la concentración de carbonilo en la mezcla de reacción durante el procedimiento de síntesis se encuentra entre 0,6 y 4 moles/l de mezcla de reacción.
5. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, caracterizado porque se suministra al menos 0,1 moles/l del aldehído no sustituido o sustituido.
6. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-5, caracterizado porque se añaden el compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha y/o un aldehído no sustituido o sustituido a la mezcla de reacción en al menos dos porciones.
7. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-6, caracterizado porque la razón molar entre la cantidad total de compuesto carbonílico no sustituido o sustituido con al menos 2 átomos de carbono y al menos un átomo de hidrógeno \alpha que se añade y la cantidad total de aldehído no sustituido o sustituido que se añade se encuentra entre 1,5:1 y 4:1.
8. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, caracterizado porque se aplica una 2-desoxiribosa-5-fosfato aldolasa como la aldolasa.
9. Procedimiento según la reivindicación 8, caracterizado porque la 2-desoxiribosa-5-fosfato aldolasa se origina a partir de Escherichia coli.
10. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1-9, caracterizado porque como aldehído no sustituido o sustituido se hace uso de un acetaldehído sustituido con la fórmula HC(O)CH_{2}X, en la que X representa CN, un halógeno, un grupo tosilato, un grupo mesilato, un grupo aciloxilo, un grupo fenacetiloxilo, un grupo alquiloxilo o un grupo ariloxilo.
11. Procedimiento según la reivindicación 10, caracterizado porque X es un grupo saliente.
12. Procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1-11, caracterizado porque se usa acetaldehído como compuesto carbonílico no sustituido o sustituido.
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