NL1018525C2 - Werkwijze voor de bereiding van 2,4-dideoxyhexosen en 2,4,6-trideoxyhexosen. - Google Patents

Description

- 1 - 5 WERKWIJZE VOOR DE BEREIDING VAN 2.4-DIDEOXYHEXOSEN EN 2.4,6-

TRIDEOXYHEXOSEN

De uitvinding betreft een werkwijze voor de bereiding van een 2,4-dideoxyhexose of een 2,4,6-trideoxyhexose uit een al dan niet 10 gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en een al dan niet gesubstitueerd aldehyde in aanwezigheid van een aldolase en water.

Een dergelijke werkwijze is bekend uit US-A-5,795,749, waarin de synthese van 2,4,6-trideoxyhexosen via een 4-gesubstitueerd 3-15 hydroxybutanal-intermediair wordt beschreven. Hierbij worden als reactanten aceetaldehyde en een 2-gesubstitueerd aldehyde toegepast en als katalysator een aldolase.

Een bekend nadeel van dergelijke enzym gekatalyseerde aldolcondensaties is dat de productiecapaciteit laag is. Dit is met name het gevolg 20 van het feit dat dergelijke aldolcondensaties in het algemeen bij lage aldehydeconcentraties worden uitgevoerd, omdat algemeen werd aangenomen dat het gebruikte aldolase bij hogere aldehydeconcentraties in sterke mate geïnactiveerd zou worden. Een ander nadeel van de gebruikte lage concentraties is dat aan het einde van de reactie de concentratie van het 2,4,6-trideoxyhexose 25 in het reactiemengsel laag is, hetgeen de kosten voor bijvoorbeeld opwerking in sterke mate beïnvloedt. Dientengevolge was het niet te verwachten dat het mogelijk zou zijn om op basis van een dergelijke technologie een commercieel aantrekkelijk proces voor de bereiding van 2,4-dideoxyhexosen en 2,4,6-trideoxyhexosen te ontwikkelen.

30 De uitvinding voorziet in een commercieel aantrekkelijk proces voor de bereiding van een 2,4-dideoxyhexose of een 2,4,6-trideoxyhexose met behulp van een enzym gekatalyseerde aldolcondensatie.

Dit wordt volgens de uitvinding bewerkstelligd door de reactie tussen de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 35 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en het al dan niet gesubstitueerde aldehyde uit te voeren bij een carbonylconcentratie van ten hoogste 6 mol/l reactiemengsel, zodanig dat de eindconcentratie van het 1018525i -2- 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose ten minste 2 massa% van het reactiemengsel bedraagt.

In de bekende werkwijze voor de synthese van 2,4-dideoxyhexosen en 2,4,6-trideoxyhexosen worden carbonylconcentraties van 5 maximaal 0,4 mol per liter reactiemengsel toegepast. Hierbij worden eindconcentraties van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose verkregen die maximaal rond 1 massa% van het reactiemengsel liggen. Verrassenderwijs heeft aanvraagster gevonden dat carbonylconcentraties tot 6 mol/l geschikt kunnen worden toegepast, terwijl toch de mate van 10 enzymdeactivatie ondanks de hoge carbonylconcentratie beperkt blijft. Hierdoor kunnen hogere eindconcentraties van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose worden verkregen, waardoor de productiecapaciteit wordt verhoogd en de kosten voor o.a. de opwerking van het product worden verlaagd. Als gevolg hiervan bleek het mogelijk te zijn een commercieel aantrekkelijk proces 15 te ontwikkelen.

Onder carbonylconcentratie wordt in het kader van de uitvinding verstaan de som van de concentraties van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één a-waterstofatoom, het al dan niet gesubstitueerde aldehyde en het tussenproduct 20 dat gevormd wordt in de reactie van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één a-waterstofatoom met het al dan niet gesubstitueerde aldehyde.

De carbonylconcentratie wordt tijdens het syntheseproces is essentie lager dan 6 mol/l gehouden. Het zal voor de deskundige duidelijk zijn dat 25 licht hogere concentraties gedurende (zeer) korte tijd weinig nadelig effect zullen hebben, en derhalve nog binnen het kader van de uitvinding toelaatbaar zijn. Bij voorkeur ligt de carbonylconcentratie tussen 0,1 en 5 mol per liter reactiemengsel, met meer voorkeur tussen 0,6 en 4 mol per liter reactiemengsel.

De eindconcentratie van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-30 trideoxyhexose ligt in de praktijk meestal tussen 5 en 50 massa-%, bijvoorbeeld tussen 8 en 40 massa-%, in het bijzonder tussen 10 en 35 massa-% berekend ten opzichte van het reactiemengsel aan het einde van de reactie.

De volgorde van toevoeging van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één 1018525* -3- α-waterstofatoom, het al dan niet gesubstitueerde aldehyde en het aldolase is niet bijzonder kritisch. Bij voorkeur wordt het aldolase aan het reactiemengsel toegevoegd vóór de toevoeging van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één a-5 waterstofatoom. Met meer voorkeur wordt het aldolase gemengd met een oplossing van ten minste een deel van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde alvorens de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom wordt toegevoegd, met name wanneer het gebruikte al dan niet gesubstitueerde aldehyde onder de gekozen 10 omstandigheden in mindere mate met zichzelf reageert dan de gebruikte al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom. Bij voorkeur wordt meer dan 0,1 mol/l reactiemengsel van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde voorgelegd, met meer voorkeur meer dan 0,3 mol per liter reactiemengsel, in het bijzonder meer 15 dan 0,6 mol per liter reactiemengsel. Door deze keuze van de initiële concentratie van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde wordt de initiële reactiesnelheid van het enzymatische proces gunstig beïnvloed. Aldolase kan tijdens de reactie in meerdere porties worden toegevoegd of gedoseerd.

In één uitvoeringsvorm van de uitvinding worden zowel de al dan 20 niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom als het al dan niet gesubstitueerde aldehyde en het aldolase elk in één keer aan het reactiemengsel toegevoegd. Hierbij kunnen de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom, het al dan niet gesubstitueerde aldehyde en het 25 aldolase zowel tegelijk als na elkaar toegevoegd worden. Volgens deze uitvoeringsvorm kan in het algemeen de som van de toegevoegde hoeveelheden al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en al dan niet gesubstitueerd aldehyde tot 6 mol per liter reactiemengsel bedragen en worden in de praktijk meestal 30 eindproductconcentraties bereikt tussen 7 en 15 massa-% van het reactiemengsel.

In een andere uitvoeringsvorm van de uitvinding wordt de toevoeging van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en/of het al dan niet 10185251 - 4 - gesubstitueerde aldehyde in ten minste twee porties uitgevoerd, waarbij elke volgende toevoeging plaatsvindt nadat ten minste een deel van de reactanten uit de voorgaande toevoeging omgezet is. Hiermee wordt bewerkstelligd dat de som van de in de loop van de reactie toegevoegde hoeveelheden al dan niet 5 gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één a-waterstofatoom en al dan niet gesubstitueerd aldehyde meer dan 6 mol per liter reactiemengsel kan bedragen, terwijl tevens de carbonylconcentratie in het reactiemengsel op elk willekeurig tijdstip tijdens de reactie lager is 6 mol/l om inactivering van het enzym te beperken. Het aldolase kan desgewenst in één 10 keer of in ten minste twee porties worden toegevoegd.

In weer een andere uitvoeringsvorm worden tijdens de reactie de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en/of het ai dan niet gesubstitueerde aldehyde aan het reactiemengsel gedoseerd in de tijd. Bij 15 voorkeur wordt in deze uitvoeringsvorm ten minste een gedeelte van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde tezamen met het aldolase voorgelegd. Het aldolase kan desgewenst in één keer worden toegevoegd, in meerdere porties worden toegevoegd of in de tijd worden gedoseerd.

De laatste twee uitvoeringsvormen kunnen leiden tot 20 eindconcentraties van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose die hoger zijn dan 40 massa-%. Bovendien is gebleken dat het doseren van de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom, het al dan niet gesubstitueerde aldehyde en/of het aldolase aan het reactiemengsel kan leiden tot aanzienlijke besparingen op de 25 enzymkosten.

Combinaties van de hierboven beschreven uitvoeringsvormen zijn ook mogelijk.

De reactietemperatuur en de pH zijn niet bijzonder kritisch en worden beide gekozen in functie van het substraat. Bij voorkeur wordt de reactie 30 in de vloeistoffase uitgevoerd. De reactie kan bijvoorbeeld worden uitgevoerd bij een reactietemperatuur tussen -5 en 45 °C, bij voorkeur tussen 0 en 10 °C en een pH tussen 5,5 en 9, bij voorkeur tussen 6 en 8.

De reactie wordt bij voorkeur uitgevoerd bij min of meer constante pH, waarbij bijvoorbeeld gebruik wordt gemaakt van een buffer of van 1018525" -5- automatische titratie. Als buffer kunnen bijvoorbeeld toegepast worden natrium-en kaliumbicarbonaat, natrium- en kaliumfosfaat, triethanolamine/HCI, bis-tris-propaan/HCI en HEPES/KOH. Bij voorkeur wordt een kalium- of natriumbicarbonaatbuffer toegepast, bijvoorbeeld in een concentratie tussen 20 5 en 400 mmol/l reactiemengsel.

De molaire verhouding van totaal toegevoegde al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom tot totaal toegevoegde al dan niet gesubstitueerde aldehyde is niet bijzonder kritisch en ligt bij voorkeur tussen 1,5:1 en 4:1, in het 10 bijzonder tussen 1,8:1 en 2,2:1. Andere verhoudingen kunnen ook worden toegepast maar bieden geen voordelen.

In de werkwijze volgens de uitvinding wordt als katalysator een aldolase toegepast, dat de aldolcondensatie tussen twee aldehyden of tussen een aldehyde en een keton katalyseert. Bij voorkeur wordt als aldolase 2-deoxyribose-15 5-fosfaataldolase (DERA, EC 4.1.2.4) of mutanten hiervan toegepast, met meer voorkeur DERA afkomstig van Escherichia coli of mutanten hiervan. De hoeveelheid toe te passen DERA is niet bijzonder kritisch en wordt gekozen als functie van bijvoorbeeld de toegepaste reactanten, de reactantconcentraties, de gewenste reactiesnelheid, de gewenste reactieduur en andere economische 20 factoren. De hoeveelheid toe te passen DERA ligt bijvoorbeeld tussen 50 en 5000 U/mmol van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde. Hierin is 1 U (unit) een maat voor de enzymatische activiteit en komt overeen met de omzetting van 1 μηηοΙ 2-deoxyribose-5-fosfaat per minuut bij 37 °C.

De al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten 25 minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom heeft bij voorkeur 2-6 koolstofatomen, met meer voorkeur 2-4 koolstofatomen. Bijvoorbeeld kunnen worden gebruikt aldehydes, bijvoorbeeld aceetaldehyde en propanal, en ketonen, bijvoorbeeld aceton en fluoraceton.

Als al dan niet gesubstitueerd aldehyde kunnen bijvoorbeeld 30 worden gebruikt aldehydes met 2-20 koolstofatomen, bijvoorbeeld aceetaldehyde, propanal, butanal, een acetaal beschermde dialdehyde of een gesubstitueerd aldehyde, in het bijzonder een gesubstitueerd aceetaldehyde met de formule HC(0)CH2X waarin X voorstelt een substituent die in een vervolgreactie als ‘leaving group’ afgesplitst kan worden, bijvoorbeeld een halogeen, in het bijzonder 1 01 8525 * -δα, Br of I; een tosylaatgroep; een mesylaatgroep; een acyloxygroep, in het bijzonder een acetoxygroep; een fenacetyloxygroep; een alkyloxygroep of een aryloxygroep, waarbij in het bijzonder chlooraceetaldehyde geschikt is.

Het 2,4-dideoxyhexose of 2,4,6-trideoxyhexose met formule 1 is 5 //\^°\γ/°Η (1)

OH

bijvoorbeeld een gewenst tussenproduct in de bereiding van diverse 10 geneesmiddelen, in het bijzonder voor de synthese van HMG-CoA reductase inhibitors, meer in het bijzonder voor de synthese van statines, bijvoorbeeld lovastatine, cerivastatine, rosuvastatine, simvastatine, pravastatine en fluvastatine, in het bijzonder voor ZD-4522 zoals beschreven in Drugs of the future, (1999), 24(5), 511-513 van M. Watanabe et al., Bioorg. & Med. Chem.

15 (1997), 5(2), 437-444. De uitvinding voorziet derhalve in een nieuwe, economisch aantrekkelijke route naar 2,4-dideoxyhexosen of 2,4,6-trideoxyhexosen, die kunnen worden gebruikt voor de synthese van bijvoorbeeld 2-(6-hydroxymethyl- 1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur, dat een gewenst tussenproduct is voor de bereiding van geneesmiddelen, in het bijzonder statines.

20 Het 2,4-dideoxyhexose of 2,4,6-trideoxyhexose met formule 1 kan met behulp van de werkwijze volgens de uitvinding worden bereid uit aceetaldehyde en HC(0)CH2X, waarin X als boven is gedefinieerd, en kan vervolgens bijvoorbeeld via bekende methoden worden omgezet tot het overeenkomstige 4-hydroxy-tetrahydropyran-2-on met formule 2, 25 LJ (2)

OH

waarin X als boven is gedefinieerd. Geschikte reagentia voor deze omzetting zijn 1018525 ’ -7- bijvoorbeeld Br2met als base calciumcarbonaat (Tetrahedron Lett. 30(47), 1989 p.6503), pyridiniumdichromaat in dichloormethaan (Carbohydrate Res. 300 1997 p. 301) en tetra-N-propylammoniumtetra-oxoruthenaat (J. Chem. Soc, Chem. Commun. 1987 p. 1625).

5 Vervolgens kan het verkregen 4-hydroxy-tetrahydropyran-2-on desgewenst worden omgezet in een 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat met formule 3, /\ o XA--AA.0Rj (3) 10 waarin X als boven is gedefinieerd en Ri, R2 en R3 elk onafhankelijk een alkylgroep met 1-3 koolstofatomen voorstellen. Deze omzetting kan bijvoorbeeld worden bewerkstelligd in aanwezigheid van een geschikt acetaliseringsmiddel en 15 een zure katalysator.

Vervolgens kan het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat gehydrolyseerd worden in aanwezigheid van een base en water tot een zout met formule 4, A o (4) 20 waarin Y staat voor een alkalimetaal, een aardalkalimetaal, of een al dan niet gesubstitueerde ammoniumgroep, bij voorkeur Na, Ca of een tertraalkylammoniumverbinding en waarin X, R1 en R2 als boven gedefinieerd zijn. 25 De hydrolyse kan gevolgd worden door omzetting tot het overeenkomstige 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur volgens formule 4 met Y = H.

Het zout van het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur volgens formule 4 101 8525'i -8- kan worden omgezet in een overeenkomstige ester van het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur volgens formule 3 met X, Ri en R2 als boven gedefinieerd en waarin R3 een alkylgroep met 1-12 koolstofatomen, een arylgroep met 6-12 koolstofatomen of een aralkylgroep met 7-12 koolstofatomen voorstelt op op zich 5 bekende wijze. Bij voorkeur wordt het zout van het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur omgezet in de overeenkomstige t-butylester van het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur.

Het2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat met formule 3, waarin R3 een alkylgroep met 1-12 koolstofatomen, een arylgroep met 6-12 koolstofatomen of een aralkylgroep met 7-12 koolstofatomen voorstelt kan worden 10 omgezet in het azijnzuurderivaat van het overeenkomstige 2-(6-hydroxymethyl- 1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuur met formule 5, waarin Ri, R2 en R3 als boven zijn gedefinieerd, bijvoorbeeld zoals beschreven in US-A-5594153 rVR2 A, o 15 of in WO-A-200008011, via omzetting naar een verbinding volgens formule 3 met X = acyloxy, bijvoorbeeld een acetoxygroep, en R^ R2 en R3 als boven gedefinieerd, gevolgd door vervanging van de acyloxygroep, op overigens algemeen bekende wijze door een hydroxylgroep.

20 Het 4-hydroxy-tetrahydropyran-2-on met formule 2 χ/γ'γ0 kJ (2)

OH

waarin X als boven is gedefinieerd, kan ook worden omgezet in het overeenkomstige dihydroxyhexaanzuur met formule 6 met behulp van een zuur of 25 een base.

1018525* (6) -9- OH OH 0

Het dihydroxyhexaanzuur met formule 6 kan vervolgens worden omgezet in een 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat met formule 3, waarin X, Ri 5 en R2 als boven zijn gedefinieerd en R3 een alkylgroep met 1-12 koolstofatomen, een arylgroep met 6-12 koolstofatomen of een aralkylgroep met 7-12 koolstofatomen voorstelt, bijvoorbeeld in aanwezigheid van een geschikt acetaliseringsmiddel en een zure katalysator.

De uitvinding wordt verder toegelicht aan de hand van de 10 voorbeelden, zonder evenwel daardoor te worden beperkt.

Voorbereiding en meetmethodes 15 1, Bereiding van een hoeveelheid 6-chloro-2A6-trideoxvhexose als referentiemateriaal voor GC-analvse

Aan 0,62 L 100 mM NaHC03 oplossing werd bij 10 °C 76 mL (0,60 mol) van een 50% chlooraceetaldehyde-oplossing en 84 mL (1,47 mol) aceetaldehyde toegevoegd waarna de pH m.b.v. 4N NaOH op pH 7,0 werd 20 gebracht. De enzymatische reactie werd gestart door toevoeging van 220 g enzymoplossing (2050 U/g). Na ca. 18 uur roeren werd via GC een maximale conversie tot 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose gemeten. De reactie werd gestopt door toevoegen van 1,7 L aceton. Aan dit mengsel werd 4 g dicalite toegevoegd en na ca. 30 minuten roeren werd het mengsel gefiltreerd. Het filtraat werd 25 gedurende 5 uur bij 40 °C onder vacuüm ingedampt. De zo ontstane olie werd gezuiverd d.m.v. kolomchromatografie op een silicagel-kolom (400 mL) en geëlueerd met een eluent bestaande uit een mengsel van petroleumether (kookpunt: 40-70 °C) en ethylacetaat in een volumeverhouding van 1:2. Na indampen van de fractie met een Rf-waarde van 0,33 werd in totaal 26 g van het 30 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose geïsoleerd. Hierbij is de term Rf-waarde van een fractie bekend bij de vakman en is gedefinieerd als de afstand die een fractie aflegt in de kolom gedeeld door de afstand die het loopmiddel aflegt in de kolom 101 8525 * - 10- of de tijd die een fractie nodig heeft om een bepaalde afstand in de kolom af te leggen gedeeld door de tijd die het loopmiddel nodig heeft om diezelfde afstand in de kolom af te leggen.

De zuiverheid van het 6-chloor-2,4,6-trideoxyhexose werd 5 bepaald d.m.v. 1H-NMR volgens een methode beschreven door P.P. Lankhorst in Pharmacopeial Forum, 22, (3), 2414-2422.

2. GC-analvse

De concentratie van het 6-chloor-2,4,6-trideoxyhexose tijdens de 10 enzymatische reactie werd bepaald d.m.v. gaschromatografische analyse. Hierbij werd gebruik gemaakt van een Hewlett Packard GC met vlam-ionisatiedetector, type HP5890 serie II, voorzien van een Chrompack CP-Sii 5 CB kolom (25 m * 0,25 mm, df 1,2 pm). Concentraties werden bepaald aan de hand van een calibratiecurve van het 6-chloor-2,4,6-trideoxyhexose met bekende chemische 15 zuiverheid (1) in aceton.

3. Bereiding van de DERA-oplossinq

Standaardtechnieken werden toegepast om het enzym DERA tot overexpressie te brengen in recombinant Escherichia coli cellen. Dergelijke 20 technieken worden beschreven in Sambrook et al., “Molecular Cloning: A

Laboratory Manual”, Cold Spring Harbor, N.Y., 1989. In het onderhavige geval werd het deoC-gen van Escherichia coli W3110 gekloneerd in de commercieel verkrijgbare expressievector pBADMyc-HisB (Invitrogen, Groningen, NL). Het gen (inclusief het stopcodon) werd vermenigvuldigd door middel van een 25 polymerasekettingreactie en ingébracht in de Nco\ en EcoRI plaatsen van de vector op een dusdanige manier dat het ATG-startcodon van deoC gelijk was aan het ATG-codon op de Λ/col-plaats van de vector (translatie fusie). Doordat het deoC stopcodon meegekloneerd werd, werd voorkomen dat een fusie-eiwit met de His-tag, die ook op de vector wordt gecodeerd, gevormd werd. Escherichia coli 30 DH10B cellen (Life Technologies, Breda, NL) met het resulterende plasmide pBAD_DERA2.2 werden gekweekt in een 10 L beluchte en geroerde tankreactor op een complex Luria Bertani medium met 100 pg/mL carbenicilline en geïnduceerd door toevoeging van arabinose tot 0,01%. Om de celdichtheid te vergroten werden, nadat de cellen het LB-medium hadden geconsumeerd, twee io 1 8525^ -11 - extra waterige oplossingen toegevoegd die pure glycerol (voeding 1) en 13% gistextract en 1,3% trypton (Difco, Michigan, US) (voeding 2) bevatten. Op deze manier werden uit een 10 L cultuur ca. 350 g natte cellen verkregen, die door middel van centrifugeren gewonnen werden, opnieuw in een kaliumfosfaatbuffer 5 van pH 7,2 werden gesuspendeerd en nogmaals werden gecentrifugeerd. Het supernatant werd verwijderd waarna de pellet werd opgeslagen bij -20°C.

In de literatuur zijn verschillende werkwijzen beschreven voor de zuivering van DERA uit recombinant E. coli cellen, bijvoorbeeld in Chen et al, J. Am. Chem.

Soc. Vol 114, 1992, 741-748 en Wong et al., J. Am. Chem. Soc. Vol 117,1995,

10 3333-3339). Zuivering is echter geen voorwaarde voor efficiënt gebruik van DERA

in aldolreacties, zie bijvoorbeeld Wong et al., J. Am. Chem. Soc. Vol 117, 1995, 3333-3339. Voor het gedeeltelijk zuiveren van DERA werden standaardtechnieken toegepast. Bevroren pellets werden gesuspendeerd in een 100 mM kaliumfosfaatbuffer bij pH 7,2 (1 gewichtsdeel natte cellen en 2 15 gewichtsdelen buffer), waarna de celwanden door middel van continue ultrasonificatie werden vernietigd. Het heldere ruwe extract werd verkregen door middel van centrifugeren en direct gebruikt of opgeslagen bij -20°C. De oplossing kan indien gewenst verder geconcentreerd worden door middel van ultrafiltratie, bijvoorbeeld met behulp van Millipore ultrafiltratiemembranen met een cut-off 20 waarde van 10.000 Dalton (Millipore, Bedford, USA). Typische specifieke activiteiten die door middel van deze werkwijze verkregen werden liggen tussen 1400 and 5300 units per g oplossing.

4.Bepaling van de aktiviteit van DERA

25 Recombinant E. coli cellen die DERA synthetiseren werden onderworpen aan sonificatie in een 50 mM kaliumfosfaatbuffer en gecentrifugeerd (18.500 rpm, 30 min) om het celmateriaal te verwijderen. Het resulterende vrije celextract werd verdund en gebruikt in een gekoppelde spectrofotometrische test. Hierbij werd 2-deoxyribose-5-fosfaat omgezet in D-glyceraldehyde-3-fosfaat en 30 aceetaldehyde, waarna het D-glyceraldehyde-3-fosfaat werd omgezet in dihydroxyacetonfosfaat in aanwezigheid van triosefosfaat isomerase (TiM, EC 5.3.1.1). Dihydroxyacetonfosfaat werd vervolgens omgezet in glycerol-3-fosfaat in aanwezigheid van glycerolfosfaat dehydrogenase (GDH, EC 1.1.1.8). In de laatste stap werd nicotineamineadenine dinucleotide in gereduceerde vorm (NADH) 35 geconsumeerd, wat spectrofotometrisch gevolgd werd via bepaling van de 1 o 1 85 2 5 * -12- afname in absorptie bij 340 nm. Typisch werd een totaal volume van 3 ml toegepast, bevattende 2878,5 μΜ van een 50 mM triethanolaminebuffer met pH 7,2, 30 μΙ van een 12 mM oplossing van NADH in water, 11,5 μΙ van een enzymsuspensie bevattende 30 eenheden GDH en 500 eenheden TIM in 3,2M 5 waterig ammoniumfosfaat, en 30 μΙ van een 50 mM oplossing van 2-deoxyribose-5-fosfaat in water. De reactie werd opgestart door toevoeging van 50 μΙ vrij celextract. De temperatuur bedroeg 37 °C. De activiteit, uitgedrukt in U(nits), waarin 1 unit gelijk is aan de enzymatische activiteit die overeenkomt met de omzetting van 1 μίτιοΙ 2-deoxyribose-5-fosfaat per minuut bij 37 °C, werd 10 berekend uit de lineaire afname van de absorptie bij 340 nm.

Voorbeelden

Voorbeeld I

15 Bereiding van 6-chloro-2.4.6-trideoxvhexose in een batch experiment

Aan 37 mL van een 100 mM buffer-oplossing van NaHC03 werd bij een temperatuur van 4 °C 4,3 mL (0,03 mol) van een 45% oplossing van chlooraceetaldehyde en 3,4 mL (0,06 mol) aceetaldehyde toegevoegd. De pH van dit mengsel bedroeg 7,3. De enzymatische reactie werd gestart door toevoeging 20 van 6,3 mL (5270 U/g) enzymoplossing. De reactie werd bij een constante pH van 7,5 uitgevoerd. Op regelmatige tijdstippen werd het mengsel geanalyseerd d.m.v. GC. De reactie werd gestopt door toevoeging van 100 mL aceton nadat een concentratie van het 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose van ongeveer 80 g/L (8 massa%) was bereikt.

25

Voorbeeld II

Bereiding van 6-chloro-2,4,6-trideoxvhexose in een repetitief batchexperiment

Het experiment uit voorbeeld I werd herhaald. Echter nadat een concentratie van het 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose van ongeveer 80 g/L werd 30 bereikt werd nogmaals 4,3 mL (0,03 mol) van een 45% oplossing van chlooraceetaldehyde, 3,4 mL (0,06 mol) aceetaldehyde en 6,3 mL (5270 U/g) enzymoplossing toegevoegd. Dit werd nog drie maal herhaald, steeds nadat de conversie een constante waarde had bereikt en niet verder toenam. Op deze manier werd in totaal 0,15 mol van een 45% oplossing van chlooraceetaldehyde 101 8525 ' - 13- en 0,30 mol aceetaldehyde toegevoegd. De reactie werd bij een constante pH van 7,5 uitgevoerd. Monsters uit het reactiemengsel werden geanalyseerd m.b.v. GC. De uiteindelijke concentratie 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose bedroeg circa 240 g/L (24 massa%).

5

Voorbeeld III

Bereiding van 6-chloro-2,4,6-trideoxvhexose d.m.v. doseren van de reactiecomponenten.

Aan 6,2 L gedemineraliseerd water werd 84 g (1,0 mol) NaHC03 10 toegevoegd waarna de oplossing werd gekoeld tot circa 2 °C. Vervolgens werd hieraan 72,3 mL (0,4 mol) van een 45 % oplossing van chlooraceetaldehyde toegevoegd waarna de oplossing met behulp van 32 % HCI op pH 7,3 werd gebracht. Aan dit mengsel werd een enzymoplossing (6,8x106 U) toegevoegd waarna het volume werd aangevuld tot 7,5 L. Gedurende 2 uur werd aan dit 15 mengsel in totaal 1,3 L (9,5 mol) van een 45% chlooraceetaldehyde oplossing en 0,9 L (9,9 mol) van een 50% aceetaldehyde oplossing gedoseerd. Hierna werd gedurende 5 uur 0,86 L (9,5 mol) van een 50% aceetaldehyde oplossing toegevoegd. Het reactiemengsel werd overnacht geroerd bij 2 °C en een constante pH van 7,5. Het totale gewicht van het reactiemengsel bedroeg 10,9 kg. 20 Het gehalte aan 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose werd bepaald d.m.v. gaschromatografie en bedroeg 126 g/L (12,6 massa%).

Voorbeeld IV

Bereiding van 6-chloro-2,4,6-trideoxvhexose d.m.v. doseren van de 25 reactiecomponenten.

Aan 0,44 L gedemineraliseerd water werd 11,8 g (0,14 mol) NaHC03 toegevoegd waarna de oplossing werd gekoeld tot circa 2 °C.

Vervolgens werd hieraan 10 mL (0,07 mol) van een 45% oplossing van chlooraceetaldehyde toegevoegd waarna de oplossing met behulp van 32 % HCI 30 op pH 7,3 werd gebracht. Aan dit mengsel werd een enzymoplossing (1,03 x 106 U) toegevoegd. Gedurende 2 uur werd aan dit mengsel 0,193 L (1,35 mol) van een 45% chlooraceetaldehyde oplossing en 0,127 L (1,40 mol) van een 50% aceetaldehyde oplossing gedoseerd. Hierna werd gedurende 5 uur 0,134 L (1,46 mol) van een 50 % aceetaldehyde oplossing toegevoegd. Het reactiemengsel 101 8525 ' - 14- werd overnacht geroerd bij 2 °C een constante pH van 7,5. Het gehalte aan 6-chloro-2,4,6-trideoxyhexose werd bepaald d.m.v. gaschromatografie en bedroeg 180 g/L (18,0 massa%).

5 101 8525"

Claims (19)

1. Werkwijze voor de bereiding van een 2,4-dideoxyhexose of een 2,4,6-trideoxyhexose uit een al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding 5 met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en een al dan niet gesubstitueerd aldehyde in aanwezigheid van een aldolase en water, met het kenmerk, dat de reactie tussen de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en het al dan niet gesubstitueerde 10 aldehyde wordt uitgevoerd bij een carbonylconcentratie van ten hoogste 6 mol/l reactiemengsel en de eindconcentratie van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose ten minste 2 massa% van het reactiemengsel bedraagt.

2. Werkwijze volgens conclusie 1, met het kenmerk, dat de eindconcentratie 15 van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose tussen 5 en 50 massa% van het reactiemengsel ligt.

3. Werkwijze volgens conclusie 2, met het kenmerk, dat de eindconcentratie van het 2,4-dideoxyhexose of het 2,4,6-trideoxyhexose tussen 10 en 35 massa% van het reactiemengsel ligt.

4. Werkwijze volgens één der conclusies 1-3, met het kenmerk, dat de carbonylconcentratie in het reactiemengsel tijdens het syntheseproces tussen 0,6 en 4 mol/l reactiemengsel ligt.

5. Werkwijze volgens één der conclusies 1-4, met het kenmerk, dat ten minste 0,1 mol/l van het al dan niet gesubstitueerde aldehyde wordt 25 voorgelegd.

6. Werkwijze volgens één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en/of het al dan niet gesubstitueerde aldehyde in ten minste twee porties worden toegevoegd 30 aan het reactiemengsel.

7. Werkwijze volgens één der conclusies 1-5, met het kenmerk, dat de al dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom en/of het al dan niet 1 01 852 5'' - 16- gesubstitueerde aldehyde in de tijd worden gedoseerd aan het reactiemengsel.

8. Werkwijze volgens één der conclusies 1-7 met het kenmerk, dat de molaire verhouding van totaal toegevoegde al dan niet gesubstitueerde 5 carbonylverbinding met ten minste 2 koolstofatomen en ten minste één α-waterstofatoom tot totaal toegevoegd al dan niet gesubstitueerd aldehyde tussen 1,5:1 en 4:1 ligt.

9. Werkwijze volgens één der conclusies 1-8, met het kenmerk, dat als de aldolase een 2-deoxyribose-5-fosfaataldolase wordt toegepast.

10. Werkwijze volgens conclusie 9, met het kenmerk, dat de 2-deoxyribose- 5-fosfaataldolase afkomstig is uit Escherichia coli.

11. Werkwijze volgens één der conclusies 1-10, met het kenmerk, dat ais al dan niet gesubstitueerd aldehyde een gesubstitueerd aceetaidehyde met de formule HC(0)CH2X wordt toegepast, waarin X voorstelt een 15 halogeen, een tosylaatgroep, een mesylaatgroep, een acyloxygroep, een fenacetyloxygroep, een alkyloxygroep of een aryloxygroep.

12. Werkwijze volgens conclusie 11, met het kenmerk, dat het gesubstitueerde aceetaidehyde chlooraceetaldehyde is.

13. Werkwijze volgens één der conclusies 1-12, met het kenmerk, dat als al 20 dan niet gesubstitueerde carbonylverbinding aceetaidehyde wordt toegepast.

14. Werkwijze volgens conclusies 11 en 13, waarin het verkregen 2,4-dideoxyhexose of het verkregen 2,4,6-trideoxyhexose vervolgens wordt omgezet in het overeenkomstige 4-hydroxy-tetrahydropyran-2-on.

15. Werkwijze volgens conclusie 14, waarin het 4-hydroxy-tetrahydropyran-2- on vervolgens wordt omgezet in een 2-(1,3-dioxaan-4-yljazijnzuurderivaat.

16. Werkwijze volgens conclusie 15, waarin 2-(1,3-dioxaan-4-yljazijnzuurderivaat vervolgens wordt omgezet in het overeenkomstige 2- 30 (6-hydroxymethyl-1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat.

17. Werkwijze volgens conclusies 15 of conclusie 16, waarin het 2-(1,3-dioxaan-4-yl)azijnzuurderivaat de t-butylester van het 2-(1,3-dioxaan-4-yljazijnzuur is. 1 o 1 85 2 5"! - 17-

18. Toepassing van een 2,4-dideoxyhexose of een 2,4,6-trideoxyhexose, verkregen door middel van een werkwijze volgens één der conclusies 1-13 in de bereiding van een geneesmiddel.

19. Toepassing volgens conclusie 17, met het kenmerk, dat het 5 geneesmiddel een HMG-CoA reductase inhibitor is, bij voorkeur een statine. 1 01 85 2 5 1