ES2278143T3 - Procedimiento para preparar alfa-hidroxicetonas aromaticas quirales usando 2-hidroxi-3-oxoacido sintasa. - Google Patents
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Abstract
Un procedimiento para preparar una a-hidroxicetona aromática de fórmula (I) (Ver fórmula) en la que R es H o alquilo C1 - 6, y Ar es arilo, en la que dicho arilo contiene opcionalmente uno o más heteroátomos escogidos de N, S, y O, y consiste opcionalmente en anillos condensados, y dichos alquilo y arilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes escogidos de alquilo C1 - 3, alcoxi C1 - 3, F, Cl, Br, I, OH, NH2, CN, y NR1R2, en la que R1 y R2 pueden ser independientemente H o alquilo C1 - 4, y dicho alquilo C1 - 3 puede estar sustituido adicionalmente con un sustituyente escogido de F, Cl, Br, I, y OH; procedimiento el cual comprende hacer reaccionar un aldehído de fórmula (II) (Ver fórmula) con un 2-oxoácido de fórmula (III) (Ver fórmula) en la que Ar y R, en las fórmulas (II) y (III), tienen los significados definidos para la fórmula (I), en presencia de una mezcla que comprende 2-hidroxi-3-oxoácido sintasa escogida de AHAS (acetoxihidroxiácido sintasa) y TSAS (tartronato semialdehído sintasa), y pirofosfato de tiamina (TPP), flavinadenindinucleótido (FAD), iones metálicos, y un tampón.
Description
Procedimiento para preparar
\alpha-hidroxicetonas aromáticas quirales usando
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de biotransformación para preparar
\alpha-hidroxicetonas aromáticas quirales,
incluyendo PAC, a partir de arilaldehídos opcionalmente sustituidos
y 2-oxoácidos, usando
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasas, tales como las enzimas relacionadas con la familia de
AHAS.
La estereoespecificidad (enantioespecificidad)
es muy importante para la función de compuestos bioactivos, tales
como los fármacos, puesto que sólo uno de los enantiómeros tiene
habitualmente la actividad biológica deseada, mientras que el otro
es inactivo o incluso tóxico. Por lo tanto, una síntesis química de
tales moléculas debe implicar una etapa fatigosa de separación de
los enantiómeros en algún punto del procedimiento, o dicha síntesis
debe de comenzar con un único enantiómero de un precursor quiral
(un sintón quiral). El uso de enzimas en la síntesis de compuestos
orgánicos, además de reducir la formación de subproductos, y de
proporcionar velocidades de reacción elevadas en condiciones de
reacción suaves, obvia las dificultades mencionadas anteriormente
de la síntesis puramente química, puesto que las reacciones
enzimáticas son regioselectivas y estereoespecíficas. Muchas
biotecnologías aprovechan la biocatálisis, usando enzimas libres o
células que las contienen.
Las \alpha-hidroxicetonas
quirales son bloques de construcción versátiles para la química
orgánica y farmacéutica, por ejemplo para la síntesis de vitamina
E, de ciertos antifúngicos, de antidiabéticos, etc. Una
\alpha-hidroxicetona quiral importante es
(R)-fenilacetilcarbinol
((R)-PAC), usado como un sintón en la
producción de diversos fármacos que tienen propiedades \alpha y
\beta adrenérgicas, incluyendo L-efedrina,
pseudoefedrina, norefedrina, norpseudoefedrina, y
fenilpropanolamina. Estos fármacos se usan como descongestionantes,
antiasmáticos, vasoconstrictores, etc.
Durante muchas décadas, (R)-PAC
se ha obtenido mediante biotransformación de benzaldehído usando
diversas especies de levadura fermentadora, principalmente
Saccharomyces cerevisiae (Esquema 1).
Esquema
1
La actividad de la enzima piruvato
descarboxilasa (PDC) es responsable de la formación de PAC en la
levadura [Hanc O. et al., Naturwissenschaften 43 (1956)
498], en una reacción secundaria sintética que acompaña a la
descarboxilación normal de la enzima, de piruvato a
acetaldehído.
Al igual que otras biotransformaciones que usan
células, el procedimiento anterior está limitado por la toxicidad
del benzaldehído hacia las células de levadura, y mediante la
formación de muchos subproductos, por ejemplo alcohol bencílico,
debido a la acción de diferentes enzimas celulares. Estos factores
reducen el rendimiento del producto diana, y complican el
procedimiento de purificación. La patente checa CS 93627 (1960)
describe cómo pretratar las células de levadura mediante ácidos
fuertes para aumentar su resistencia a la mezcla de reacción antes
de comenzar la biotransformación de molasas, sacarosa bruta y
benzaldehído en PAC. La patente de Alemania del Este DD 51651
(1966) describe cómo dosificar acetaldehído junto con benzaldehído
a un caldo de fermentación de levadura para empujar la reacción en
la dirección de los productos requeridos. El documento WO 9004631
(1990) usa las levaduras Saccharomyces cerevisiae o
Candida flarei, mejoradas mediante mutagénesis, en una
biotransformación de benzaldehído y piruvato en PAC. La publicación
japonesa JP 09234090 (1997) describe la fabricación de
(1R,2S)-1-fenil-1,2-propanodiol
mediante una biotransformación de benzaldehído y piruvato usando
Saccharomyces cerevisiae. El documento WO 9963103 (1999) se
refiere a una biotransformación de un aldehído aromático sustituido
y un piruvato en las hidroxilcetonas correspondientes, que
comprende la catálisis, mediada por levaduras, en disolventes
orgánicos. La publicación JP 2000093189 (2000) describe la
fabricación de \alpha-hidroxicetonas ópticamente
activas usando levaduras de los géneros Torulopsis y
Candida. En la publicación WO 0144486 (2001), se condensan
aldehídos aromáticos sustituidos o no sustituidos y piruvato para
producir compuestos de carbinol usando levadura, en presencia de un
líquido supercrítico o de un gas licuado.
La aplicación de enzimas puras como
catalizadores de la reacción deseada tiene el potencial de superar
algunos inconvenientes de la biotransformación mediante células
completas. Se ha investigado [por ejemplo, Crout D.H.G. et
al., Biocatalysis 9 (1994) 1-30] el potencial
sintético de piruvato descarboxilasas (PDC) procedentes de S.
cerevisiae y Zymomonas mobilis, y de benzoilformiato
descarboxilasa procedente de Pseudomonas putida. Cuando se
desarrolla un proceso industrial fiable basado en las enzimas
purificadas para producir (R)-PAC, dos
factores tienen una importancia fundamental - la eficacia de la
formación de (R)-PAC, y la estabilidad de la
enzima en las condiciones de producción. Bruhn et al. [Eur.
J. Biochem 234 (1995) 650-6; y el documento DE
19523269 (1996)] mejoró las propiedades catalíticas de PDC de
Zymomonas mobilis por medio de mutagénesis dirigida al
sitio. Sin embargo, la eficacia global de la utilización de
piruvato para la reacción de carboligación siguió siendo muy baja,
convirtiéndose sólo 3,5% del piruvato en el producto deseado, y
sufriendo la gran parte del piruvato una descarboxilación a
acetaldehído.
Por lo tanto, es un objeto de esta invención
proporcionar un procedimiento de biotransformación para la
preparación de \alpha-hidroxicetonas aromáticas
quirales, incluyendo PAC, con un rendimiento elevado, a partir de
arilaldehídos opcionalmente sustituidos y
\alpha-cetoácidos. Se han llevado a cabo estudios
sistemáticos de acetohidroxiácido sintasas (AHAS; que pertenecen al
grupo de clasificación internacional EC 4.1.3.18; también conocidas
como acetolactato sintasa). La reacción fisiológica normal,
catalizada por AHAS, es la
descarboxilación-condensación de dos
\alpha-cetoácidos (Esquema 2), produciendo un
(S)-acetohidroxiácido, y no requiriendo
ninguna fuerza motora adicional ni agentes redox. No es necesaria
para la síntesis la regeneración de cofactores tales como ATP o
NAD; sólo deben de estar presentes el cofactor de flavina adenina
dinucleótido (FAD), pirofosfato de tiamina (TPP), y un ion metálico
divalente.
Esquema
2
Se ha descubierto que las enzimas de AHAS
también pueden utilizar sustratos "no naturales" [Barak Z.
et al., J. Bacteriol. 169 (1987) 3750-6;
Gollop N. et al., Biochemistry 28 (1989)
6310-7; e Ibdah M. et al., Biochemistry 35
(1996) 16282-91].
Otra
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa, la tartronato semialdehído sintasa (TSAS; que pertenece al
grupo de clasificación internacional EC 4.1.1.47; también conocida
como glioxilato carboligasa), está estrechamente relacionada con
AHAS, no sólo por su actividad catalítica, sino también por su
secuencia, así como por otras propiedades. Su reacción fisiológica
normal es también una descarboxilación-condensación
de dos 2-oxoácidos, y habitualmente produce el
semialdehído del ácido tartrónico a partir de ácido glioxílico
(Esquema 3).
Esquema
3
Se ha encontrado que también TSAS puede utilizar
sustratos no naturales como sus agentes reaccionantes.
Por lo tanto, un objeto adicional de esta
invención es proporcionar un procedimiento de biotransformación
para preparar \alpha-hidroxicetonas aromáticas
quirales, incluyendo PAC, a partir de arilaldehídos opcionalmente
sustituidos y 2-oxoácidos, usando una
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa relacionada con la familia de AHAS.
La presente invención se refiere a un
procedimiento de biotransformación para preparar
\alpha-hidroxicetonas quirales aromáticas,
incluyendo PAC, a partir de arilaldehídos opcionalmente sustituidos
y 2-oxoácidos con rendimientos elevados, usando una
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa, tal como AHAS, o tartronato semialdehído sintasa. Dicho
procedimiento de biotransformación comprende preparar un compuesto
de fórmula (I)
en la que R es H o alquilo
C_{1-6}, y Ar es arilo, en la que dicho arilo es
un sistema aromático que contiene opcionalmente uno o más
heteroátomos escogidos de N, S, y O, y que consiste opcionalmente
en anillos condensados, y dichos alquilo y arilo están
opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes escogidos de
alquilo C_{1-3}, alcoxi C_{1-3},
F, Cl, Br, I, OH, NH_{2}, CN, y NR_{1}R_{2}, en el que R_{1}
y R_{2} pueden ser independientemente H o alquilo
C_{1-4}, y dicho alquilo
C_{1-3} puede estar sustituido además con un
sustituyente escogido de F, Cl, Br, I, y OH, haciendo reaccionar
un compuesto de fórmula
(II)
con un compuesto de fórmula
(III)
en la que Ar y R, en las fórmulas
(II) y (III), tienen los significados definidos anteriormente, en
presencia de la mezcla que comprende la
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa, un tampón, TPP, FAD, e iones magnesio, u otros cationes
metálicos divalentes que sean capaces de sustituir al magnesio en
la activación de la
enzima.
El procedimiento de biotransformación según esta
invención muestra una elevada eficacia de carboligación, puesto
que menos de 1% del compuesto de fórmula (III) se pierde en la
descarboxilación a RCH=O. Además, mediante la elección apropiada de
las condiciones, más del 98% del compuesto de fórmula III, o más
del 99% del compuesto de fórmula II, se puede convertir en el
producto deseado I.
Otra característica del procedimiento según esta
invención es la quiralidad del producto, que es una
\alpha-hidroxicetona aromática quiral, tal como
(R)-arilacilcarbinol. En un aspecto de la
invención, los sustratos son piruvato y benzaldehído, y el producto
es PAC, con un exceso enantiomérico de
(R)-PAC que supera 97%.
El procedimiento de esta invención se refiere a
una reacción enzimática, aprovechando las propiedades especiales
de las
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasas relacionadas con la familia de AHAS, tales como la
acetolactato sintasa y la tartronato semialdehído sintasa. El
procedimiento puede usar enzimas de AHAS o TSAS vegetales o
bacterianas, que pueden ser de tipo natural, recombinante,
procedente de ingeniería genética, y mutada, y pueden estar
inmovilizadas o se pueden estabilizar de cualquier otro modo.
Se ha encontrado ahora que las enzimas de AHAS y
TSAS pueden catalizar eficazmente la reacción de condensación de
aldehídos aromáticos y de 2-oxoácidos para formar
\alpha-hidroxicetonas quirales. Se ha examinado la
estereoespecificidad de la reacción, y se ha encontrado que se
forman (R)-arilacilcarbinoles con un elevado
exceso enantiomérico cuando se hacen reaccionar con
2-oxoácidos los benzaldehídos sustituidos.
Las biotransformaciones se llevaron a cabo en
una mezcla que contiene un tampón, Mg^{2+}, TPP, FAD, dos
sustratos, y una enzima de AHAS o TSAS. El balance global se puede
representar como se muestra en el esquema 4, en el que R y Ar
tienen los mismos significados como se definen en el Sumario de la
Invención.
Esquema
4
La mezcla se extrajo con éter etílico u otro
disolvente orgánico, al final de la reacción enzimática, y los
productos se analizaron con GC equipada con detectores FID y MS.
Las estructuras de los productos se confirmaron mediante
espectroscopia de RMN ^{1}H, y midiendo la rotación óptica. La
pureza enantiomérica de los productos se determinó mediante GC con
un detector FID, usando una columna con una fase estacionaria
quiral. También se siguió, mediante espectrofotometría, la
velocidad de consumo de los derivados aldehídicos.
La mezcla de reacción en la que se llevó a cabo
el procedimiento de biotransformación según la invención contiene
un tampón que mantiene el pH preferiblemente de 6 a 9, estando su
concentración entre 0,01 M y 0,25 M, y que se escoge
preferiblemente del grupo que consiste en, pero que no se limita a,
MES, BIS-TRIS, PIPES, BES, MOPS, TES, HEPES, TRIS,
Tricina, Bicina, y fosfato. La mezcla de reacción contiene además
TPP, FAD, iones magnesio, dos sustratos en concentraciones entre
0,1 mM y 100 mM, y opcionalmente una o más sales no tamponantes en
una concentración total de 0 a 150 mM. Los iones magnesio se pueden
sustituir mente por otros cationes metálicos divalentes que sean
capaces de activar la enzima, tales como calcio, bario, manganeso,
cinc, cobalto y níquel. La mezcla contiene mente un disolvente
orgánico miscible con agua, preferiblemente escogido del grupo que
consiste en, pero que no se limita a, 2-propanol,
dimetilsulfóxido, dimetilformamida, y acetamida, en concentraciones
desde 0 hasta 50% (v/v). La concentración de la enzima es
0,01-1,0 mg/ml o 0,1-10 U/ml, en la
que las unidades representan \mumol de
\alpha-hidroxicetona formada/min. La mezcla de
reacción contiene opcionalmente un agente reductor, tal como
ditiotreitol (DTT), en concentraciones entre 0,01 y 10 mM, para
mejorar la estabilidad enzimática. La temperatura preferida de la
mezcla está entre 15 y 40ºC.
En una realización preferida, el procedimiento
de biotransformación según la invención comprende un pH de
6,5-7,5, una temperatura de 30ºC, una agitación
suave, 1 mM de Mg^{2+}, 0,1 mM de TPP, 0,05 mM de FAD, y 60 mM de
KCl.
Se encontró que la formación de subproductos, en
la reacción catalizada por AHAS, dependía de las concentraciones
del sustrato. Además, se encontró que el arilaldehído no se
consumió en ninguna reacción secundaria oxidativa, según se indica
mediante un efecto insignificante de la concentración de oxígeno en
el consumo de aldehído, y la ausencia de productos de oxidación
detectados mediante HPLC.
En una realización preferida de una
biotransformación según esta invención, la enzima
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa es la isozima II de AHAS de tipo natural procedente de
Escherichia coli (WT), preparada como se describe en
Bar-Ilan et al. [Biochemistry 40 (2001)
11946-54]. En otra realización preferida de esta
invención, la enzima de AHAS es una isozima II de AHAS
recombinante, con una fusión N-terminal que permite la
purificación por afinidad. En otra realización preferida de esta
invención, la enzima de AHAS es una isozima I de AHAS recombinante,
con una fusión N-terminal. Según otras realizaciones de
esta invención, AHAS comprende una enzima escogida de enzima
bacteriano, enzima de levadura, enzima fúngica, y enzima
vegetal.
En una realización preferida de esta invención,
el piruvato se hace reaccionar con benzaldehído opcionalmente
sustituido, en presencia de isozima II de AHAS. Se midieron las
concentraciones de dos compuestos esperados derivados de la
condensación enzimática de piruvato con benzaldehído durante dicha
reacción, a saber, PAC y 2-hidroxipropiofenona
(2-HPP) (Esquema 5), mediante GC y HPLC.
Esquema
5
Los productos 2-HPP constituyen
menos de 0,2-0,8% del producto total cuando la
reacción se sometió a tratamiento sin calentamiento. El producto de
oxidación fenilpropanodiona (PPD) no se puede detectar en las
condiciones preferidas de almacenamiento, constituyendo menos del
0,1% del producto. La PPD sólo se detecta después de un
almacenamiento prolongado. Se encontró que la configuración
absoluta de PAC era R(-).
Se encontró que la actividad específica de la
enzima de AHAS usada en la biotransformación anterior, basada en
la velocidad inicial de la formación de PAC, era mayor que 3 U/mg.
En una biotransformación que usa AHAS I recombinante, la eficacia
de la carboligación en la condensación de benzaldehído y piruvato
fue más de 98% basado en el piruvato consumido cuando el
benzaldehído estaba presente en exceso, y más de 99% basado en el
benzaldehído cuando el piruvato estaba en exceso. Se encontró que
el exceso enantiomérico del (R)-PAC formado
en la reacción era \geq97%.
Algunas ventajas de la presente invención se
pueden observar a partir de una comparación con la técnica
anterior. La siguiente tabla compara biotransformaciones realizadas
según esta invención y según el documento US 6.004.789, que usó
una piruvato descarboxilasa mutante procedente de Zymomonas
mobilis.
La tabla muestra que AHAS II de tipo natural
(WT) presenta mejores parámetros en la biotransformación que una
enzima de PDC, incluso si dicha enzima de PDC se usó sólo después
de mejorar su sitio activo mediante una mutación, mientras que la
enzima de ARAS se usó aquí directamente como un tipo natural. El
sitio activo de las enzimas de AHAS parece que está mejor diseñado
para acomodar al segundo sustrato para la reacción de condensación
que el sitio activo de las enzimas de PDC.
En otra realización de la presente invención, se
usó una enzima de AHAS II de tipo WT mutada, en la que la mutación
cambia la especificidad de la enzima, o aumenta su actividad
específica. En una de las realizaciones preferidas, se usó la
enzima W464L, que es una proteína de fusión recombinante, marcada
con hexahistidina, manipulada mediante ingeniería genética, basada
en AHAS II de tipo WT, sobreexpresada en E. coli, que tiene
una única mutación. La mutación W464L, que se sabe que disminuye la
especificidad de la enzima por 2-cetobutirato con
respecto al piruvato como segundo sustrato en la reacción natural
[Ibdah M. et al., Biochemistry 35 (1996)
16282-91], disminuye la sensibilidad de la enzima a
la inhibición por concentraciones elevadas del sustrato
benzaldehído por el producto PAC, en comparación con la proteína
natural. En otra realización preferida, se usó la enzima M250A,
que es otra proteína de fusión recombinante, manipulada mediante
ingeniería genética, basada en AHAS II de tipo WT, que tiene una
única mutación. El mutante M250A muestra la misma velocidad de
formación de (R)-PAC que la enzima de tipo
natural, pero muestra una velocidad más lenta de formación del
producto de AHAS normal, el acetolactato (AL), dando como resultado
una eficacia mejorada de la formación de
(R)-PAC. Estos hallazgos muestran
posibilidades para otras modificaciones de la enzima que podrían
cambiar las propiedades de la enzima en la dirección deseada,
incluyendo el aumento de la especificidad con respecto a ciertos
sustratos, o el aumento de la actividad, o la mejora de la
estabilidad y resistencia a la inactivación por sustratos y
productos.
En otra realización preferida, se usó una
proteína de fusión recombinante, marcada con hexahistidina, basada
en AHAS I de tipo WT, sobreexpresada en E. coli. Esta enzima
es capaz de convertir acetolactato en (R)-PAC
en presencia de benzaldehído, de forma que se maximiza el
rendimiento de (R)-PAC, a pesar del hecho de
que la velocidad inicial de formación de acetolactato es mayor que
la velocidad de formación de PAC, cuando están presentes el
piruvato y el benzaldehído en cantidades equimolares.
En otras realizaciones preferidas de esta
invención, se hace reaccionar un oxoácido, escogido de ácido
glioxílico, ácido pirúvico, ácido 2-cetobutírico, y
ácido 2-cetovalérico, con un arilaldehído, en el
que el arilo se escoge de fenilo, naftilo, bencilo, piridinilo,
furilo y tienilo.
En otra realización preferida de esta invención,
se hace reaccionar un benzaldehído opcionalmente sustituido con
piruvato en presencia de la isozima I de AHAS. En la condensación de
piruvato con 3-hidroxibenzaldehído catalizada por
AHAS I de tipo WT, se encontró que se consumió >99% del
3-hidroxibenzaldehído. De forma similar, se
encontraron conversiones en hidroxicetonas de >90% con la
isozima I de ARAS, cuando se hace reaccionar piruvato con un
aldehído escogido de 4-hidroxibenzaldehído,
3-metoxi-, 4-metoxibenzaldehído,
2-metil-, 3-metil- y
4-metilbenzaldehído, 3-ciano- y
4-cianobenzaldehído,
2-formilpiridina, 3-formilpiridina,
4-formilpiridina, 2-formilnaftaleno,
y ciorobenzaldehído.
La presente invención proporciona así un
procedimiento para la síntesis de ciertas
\alpha-hidroxicetonas quirales, incluyendo
precursores de los fármacos relacionados con efedrina, usando una
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa relacionada con la familia de AHAS. La enzima puede estar
en diversas formas, como es conocido por los expertos en la
técnica, incluyendo una proteína bruta o una enzima pura, que
comprende una enzima no estabilizada libre o una enzima
estabilizada, eventualmente inmovilizada. Los componentes de la
reacción enzimática se pueden añadir a la mezcla de reacción en una
sola porción, o se pueden añadir continuamente. La reacción se
puede llevar a cabo en un sistema de dos fases con un disolvente no
acuoso inmiscible o parcialmente miscible. Los productos del
procedimiento de biotransformación según esta invención se pueden
aislar según métodos conocidos en la técnica, por ejemplo
extrayendo desde la fase acuosa hasta la fase de éter dietílico,
seguido de la purificación adicional según métodos conocidos.
Como ya se ha dicho, esta invención se refiere a
un procedimiento de biotransformación para preparar una
\alpha-hidroxicetona aromática de fórmula (I)
en la que R es H o alquilo
C_{1-6}, y Ar es arilo, en la que dicho arilo es
un sistema aromático que contiene opcionalmente uno o más
heteroátomos escogidos de N, S, y O, y que consiste opcionalmente
en anillos condensados, y dichos alquilo y arilo están
opcionalmente sustituidos con 1 a 3 sustituyentes escogidos de
alquilo C_{1-3}, alcoxi C_{1-3},
F, Cl, Br, I, OH, NH_{2}, CN, y NR_{1}R_{2}, en el que R_{1}
y R_{2} pueden ser independientemente H o alquilo
C_{1-4}, y dicho alquilo
C_{1-3} puede estar sustituido además con un
sustituyente escogido de F, Cl, Br, I, y OH, haciendo reaccionar
un compuesto de fórmula
(II)
con un 2-oxoácido
de fórmula
(III)
en la que Ar y R, en las fórmulas
(II) y (III), tienen los significados definidos para la fórmula
(I), en presencia de una mezcla que comprende una
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa escogida de AHAS y tartrónico semialdehído sintasa, un
tampón, TPP, FAD, y un catión de magnesio u otro catión metálico
divalente capaz de activar la
enzima.
El piruvato de sodio, FAD, TPP, el benzaldehído,
y otros aldehídos aromáticos se obtuvieron de
Sigma-Aldrich. Todos los otros materiales tuvieron
grado analítico.
La isozima II de AHAS procedente de
Escherichia coli, de tipo natural (WT), se obtuvo como una
proteína N-terminal marcada con hexahistidina,
sobreexpresada en la cepa BL21/pRSETilvGM de E. coli,
al igual que lo fueron los mutantes AHAS II W464L y ARAS II M250A.
Los genes ilvBN que codifican AHAS I se amplificaron juntos
mediante PCR a partir de ADN de E. coli, y se insertaron en
el vector de expresión pET28(c). El plásmido resultante, que
expresa una proteína de fusión de AHAS I marcada con
hexahistidina, se transformó en BL21 de E. coli. El
crecimiento bacteriano y la expresión del gen clonado se llevaron
a cabo como se describe en otra parte [Bar-Ilan
et al., Biochemistry 40 (2001) 11946-54]. Las
proteínas se purificaron en una columna de agarosa
Ni-NAT (Quiagen, Hilden, Alemania), con el
protocolo no desnaturalizante descrito previamente [Mendel et
al., J. Mol. Biol. 325 (2003) 275-84].
La reacción se pudo seguir mediante uno de
varios métodos. En un ensayo espectroscópico directo para
determinar el consumo del aldehído aromático, se determinó la
velocidad inicial de la reacción enzimática mediante la velocidad
de desaparición del benzaldehído seguida espectroscópicamente a una
longitud de onda de 302 nm (\varepsilon = 454 M^{-1}cm^{-1}).
La reacción enzimática se llevó a cabo a 37ºC en una cubeta de
cuarzo de 1 ml en un espectrofotómetro Beckman (DU 640), en un
tampón apropiado que contiene piruvato sódico y benzaldehído o
benzaldehído sustituido. La reacción se inició añadiendo AHAS II
hasta una concentración final de 0,2-0,5 mg/ml.
Para ayudar a la disolución del benzaldehído, se puede añadir tanto
como 2% de un disolvente orgánico miscible con agua, tal como
isopropanol, dimetilsulfóxido, etc.
La posibilidad de que el benzaldehído se
consumiera en una reacción secundaria oxidativa se estudió llevando
a cabo la reacción en una tensión baja de oxígeno (burbujeo de
N_{2} a través de la disolución de la reacción); no se observó
ningún efecto significativo del oxígeno sobre la velocidad de
consumo del benzaldehído.
La velocidad inicial de formación de PAC y de
acetolactato en una reacción enzimática también se pudo determinar
simultáneamente mediante un método colorimétrico diferencial
mediante creatina-naftol, relacionado con el ensayo
de Westerfeld, con algunas modificaciones. La reacción se inició
mediante la adición de ARAS a una mezcla de reacción que contiene
tampón, sustratos y cofactores. En diferentes momentos, se tomaron
alícuotas de 500 \mul de la mezcla de reacción, y se añadieron a
50 \mul de H_{2}SO_{4} al 50% (v/v) para terminar la
reacción. Las muestras se incubaron durante 15 minutos a 37ºC para
provocar la conversión de acetolactato en acetoína. Se llevaron
porciones de la muestra paralizada (5-150 \mul)
hasta 1,4 ml, y se añadieron 1 ml de disolución de creatina al 0,5%
y 1 ml de disolución al 5% de naftol (en 2,5 N de NaOH). Después
de la incubación durante 15 minutos a 37ºC, se determinó la
absorbancia a longitudes de onda de 490 y 580 nm en un
espectrofotómetro Beckman. Los productos coloreados derivados de
PAC y de acetolactato tienen diferentes espectros de absorbancia,
permitiendo la determinación simultánea de la concentración de
ambos productos.
El transcurso de la reacción para formar PAC y
su isómero 2-HPP se siguió alternativamente
mediante HPLC en una columna C18-TSKgel (250 mm x
4,6 mm), con 30% de acetonitrilo/0,5% de ácido acético (v/v) como
eluyente, usando un sistema de suministro de disolvente Waters 600
E y un espectrómetro de conjunto de diodos Jasco
MD-2010. Esto no permitió la detección de
acetolactato.
La reacción se llevó a cabo en una mezcla que
contiene 0,1 M de PIPES-KOH, pH 6,5, 1 mM de
MgCl_{2}, 60 mM de KCl, 0,1 mM de TPP, y 0,05 mM de FAD, en
presencia de 5-30 mM de piruvato sódico y
benzaldehído en una relación 1:1. Se usó isopropanol (2% final)
para ayudar a la disolución del benzaldehído. La isozima II de AHAS
se añadió hasta la concentración final de 0,3 mg/ml, para empezar
la reacción. Al final de la reacción enzimática, la mezcla se
extrajo dos veces con 10 ml de éter etílico. La fase orgánica se
secó con MgSO_{4}, el disolvente se eliminó a vacío, y los
productos se separaron y analizaron mediante
GC-MS.
Los productos se analizaron con un sistema de GC
equipado con un detector de MS (Hewlett Packard). La separación se
realizó en una columna capilar de 30 m RTX-1,
usando helio como gas portador. La temperatura del inyector fue
250ºC. El régimen de temperaturas de la columna fue: 5 min. a 50ºC,
y después se incrementó hasta 250ºC a 15ºC/min. Los tiempos de
retención fueron: 11,9 min. para PPD, 12,7 min. para PAC, y 13,1
min. para 2-HPP. Se usó un detector de ionización
por llama (220ºC) para evaluar las cantidades relativas de los
compuestos. La identificación de los productos se confirmó mediante
espectroscopía de RMN ^{1}H.
La pureza enantiomérica de PAC se determinó
mediante GC usando una columna quiral de 0,25 \mum Lipodex E
(0,25 mm x 25 m), con hidrógeno como gas portador. Las condiciones
de funcionamiento fueron: 200ºC en el inyector, 120ºC en la
columna, y 220ºC en un detector de FID. Los tiempos de retención
fueron: 10,23 min. para (S)-PAC y 11,34 min.
para (R)-PAC. La rotación óptica se midió en
cloroformo usando un polarímetro Perkin-Elmer
341.
\vskip1.000000\baselineskip
En un espectrofotómetro a 37ºC se colocó una
cubeta de cuarzo de 1 ml que contiene 1 ml de la mezcla de reacción
que contiene 5 mM de piruvato sódico y 5 mM de benzaldehído, en un
tampón de reacción que contenía 0,1 M de
Tricina-HC1, pH 7, 5, 1 mM de MgCl_{2}, 60 mM de
KCl, 0,1 mM de TPP, y 0,05 mM de FAD. La reacción se inició
añadiendo 10 \mul de una disolución de isozima II de AHAS que
contiene 33 mg de enzima/ml. El valor de la absorbancia a 302 nm
disminuyó linealmente a una velocidad de 0,161 OD/min., lo que
produjo una disminución de la concentración de benzaldehído de 0,36
\mumoles/min., cuando se usa un \varepsilon = 454
M^{-1}cm^{-1}. La actividad correspondiente fue 1,07 U/mg.
\vskip1.000000\baselineskip
La velocidad de reacción se midió como se
describe en el Ejemplo 1, usando como sustratos 5 mM de piruvato y
5 mM de 3-hidroxibenzaldehído. Los valores de la
absorbancia a 346 nm disminuyeron linealmente a una velocidad de
0,15 OD/min., lo que produjo una disminución de la concentración de
hidroxibenzaldehído de 0,3 \mumoles/min., cuando se usa un
\varepsilon = 480 M^{-1}cm^{-1}. La actividad correspondiente
fue 0,93 U/mg.
Se agitaron a 30ºC dos matraces de 20 ml,
conteniendo cada uno diez ml de la mezcla de reacción como se
describe anteriormente en el párrafo de Biotransformación. Uno de
los matraces contenía sustratos a las concentraciones de 10 mM, y
el otro de 30 mM. La reacción comenzó añadiendo 3 mg de isozima II
de AHAS, y se terminó después de 1 h añadiendo 10 ml de éter
dietílico, y extrayendo, seguido de una segunda extracción con 10
ml. El extracto se secó como se describió, se evaporó para
eliminar completamente el disolvente, y se redisolvió en
diclorometano. Esta muestra se analizó mediante
GC-MS y GLC usando detección de FID. El espectro de
masas mostró tres componentes que corresponden a
fenilacetilcarbinol (PAC), 2-hidroxipropiofenona
(2-HPP), y fenilpropanodiona (PPD). La siguiente
tabla muestra las áreas relativas que corresponden a los tres
productos mediante FID.
\vskip1.000000\baselineskip
| Sustratos | PAC | 2-HPP | PPD |
| 10 mM | 80 | 15 | 5 |
| 30 mM | >99 | no detectable | no detectable |
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó lentamente a 30ºC un matraz que
contiene 50 ml de 40 mM de benzaldehído y 70 mM de piruvato (2
mmoles y 3,5 mmoles totales, respectivamente), en 0,1 M de
HEPES/KOH, pH 7, 0, 5 mM de MgCl_{2}, 0,1 mM de TPP, 0,05 mM de
FAD, 60 mM de KCl, 0,5 mM de DTT. La reacción comenzó mediante
adición de 16 mg de isozima I de AHAS, y se terminó después de 1,5
h añadiendo 50 ml de éter dietílico, y extrayendo, seguido de una
segunda extracción con 50 ml. El extracto se secó sobre MgSO_{4},
se evaporó para eliminar completamente el disolvente, y una muestra
se redisolvió en cloroformo. Esta muestra se analizó mediante
GC-MS y GLC, usando detección de FID. El espectro
de masas mostró tres componentes que corresponden a
fenilacetilcarbinol (PAC), 2-hidroxipropiofenona
(2-HPP), y fenilpropanodiona (PPD). La siguiente
tabla muestra las áreas relativas que corresponden a los tres
productos detectados mediante FID.
\vskip1.000000\baselineskip
| PAC | 2-HPP | PPD |
| 99,1 | 0,7 | 0,2 |
\vskip1.000000\baselineskip
La conversión de benzaldehído en productos fue
>99% mediante HPLC y GC. Después del tratamiento, se
obtuvieron 264 mg de PAC, con una pureza final de 98,6% (1,74
mmoles de PAC puro), que comprenden un 87% del rendimiento teórico
(2 mmoles de PAC). La muestra se analizó mediante GC usando una
columna quiral y FID, y la actividad óptica se comprobó mediante un
polarímetro. La rotación óptica fue negativa (izquierda),
confirmando que el producto fue (-)-(R)-PAC. El
exceso enantiomérico de este (R)-PAC fue
>97%.
\vskip1.000000\baselineskip
Se agitó suavemente a temperatura ambiente un ml
de la mezcla de reacción que contiene 30 mM de
3-hidroxibenzaldehído y 50 mM de piruvato sódico,
en un tampón descrito en el ejemplo anterior. La reacción se
comenzó mediante adición de 0,5 mg de isozima I de AHAS, y se
terminó después de 1 h añadiendo 1 ml de cloroformo, y extrayendo,
seguido de la centrifugación a alta velocidad. Las muestras de la
fase orgánica se analizaron mediante GC-MS y GC
usando detección de FID. El análisis mostró una conversión total de
3-hidroxibenzaldehído en los productos. El espectro
de masas mostró tres componentes que corresponden a
3-hidroxi-fenilacetilcarbinol
(3-OH-PAC),
1-(3-hidroxifenil)-2-hidroxipropan-1-ona
(HPH), y
1-(3-hidroxifenil)-propano-1,2-diona
(HPP). La siguiente tabla muestra las áreas relativas que
corresponden a los tres productos detectados mediante FID.
| 3-OH-PAC | HPH | HPP |
| 95,6 | 3,2 | 1,2 |
La velocidad de reacción enzimática se midió
como se describe en el Ejemplo 1, usando los mutantes de AHAS II:
W464L y M250A, comprendiendo cada uno una mutación única dirigida
al sitio. Se encontraron, respectivamente, las actividades 1,72 y
1,66 U/mg (1 U = 1 \mumol de benzaldehído consumido/min.). Esto
mostró que la sustitución de los aminoácidos implicados en la
formación de un bolsillo de unión para un segundo sustrato (según
el modelo estructural) puede conducir a la mejora de las
propiedades catalíticas de la enzima.
Se incubó a 30ºC una muestra que contiene 30 mM
de benzaldehído y 30 mM de piruvato en 0,1 M de HEPES/KOH, pH 7,
0, 5 mM de MgCl_{2}, 0,1 mM de TPP, 0,05 M de FAD, 60 mM de KCl y
0,5 mM de DTT. La reacción se inició mediante la adición de 0,32
mg/ml del mutante M250A de AHAS II, que comprende una única
mutación dirigida al sitio. Las velocidades iniciales de la
formación de PAC y AL se midieron mediante el método colorimétrico
diferencial, y se encontró que eran 2,7 y 0,24 \mumol
min^{-1}mg^{-1}, respectivamente. Las concentraciones finales
calculadas de PAC y AL, después de 2 h de reacción, fueron 18 mM y
2 mM, respectivamente. Esto demostró que la sustitución de los
aminoácidos implicados en el bolsillo de unión a sustrato o el
canal de acceso, puede conducir a los rendimientos mejorados en el
procedimiento enzimático incrementando la especificidad por el
benzaldehído, y disminuyendo la formación de subproductos.
Mientras que esta invención se ha descrito en
términos de algunos ejemplos específicos, son posibles muchas
modificaciones y variaciones. Por lo tanto, se entiende que, dentro
del alcance de las reivindicaciones anejas, la invención se puede
realizar de otro modo distinto del descrito específicamente. Se
mostró que las enzimas relacionadas con la familia de AHAS, tales
como acetolactato sintasas y tartronato semialdehído sintasas,
pueden aceptar diferentes aldehídos como sustratos, y también se
mostró que una mutación de una enzima natural puede cambiar las
propiedades de la enzima en una dirección deseada. La persona
experta apreciará que se pueden usar otras enzimas relacionadas con
EC 4.1.3.18 o EC 4.1.1.47 para llevar a cabo la presente invención.
Las propiedades recientemente descubiertas de dichas enzimas
tienen un gran potencial para competir con procesos biocatalíticos
existentes, para producir una variedad de
\alpha-hidroxicetonas quirales, así como para
proporcionar nuevas vías a otros sintones quirales importantes.
Claims (44)
1. Un procedimiento para preparar una
\alpha-hidroxicetona aromática de fórmula (I)
en la que R es H o alquilo
C_{1-6}, y Ar es arilo, en la que dicho arilo
contiene opcionalmente uno o más heteroátomos escogidos de N, S, y
O, y consiste opcionalmente en anillos condensados, y dichos
alquilo y arilo están opcionalmente sustituidos con 1 a 3
sustituyentes escogidos de alquilo C_{1-3},
alcoxi C_{1-3}, F, Cl, Br, I, OH, NH_{2}, CN, y
NR_{1}R_{2}, en la que R_{1} y R_{2} pueden ser
independientemente H o alquilo C_{1-4}, y dicho
alquilo C_{1-3} puede estar sustituido
adicionalmente con un sustituyente escogido de F, Cl, Br, I, y OH;
procedimiento el cual comprende hacer reaccionar un aldehído de
fórmula
(II)
con un 2-oxoácido
de fórmula
(III)
en la que Ar y R, en las fórmulas
(II) y (III), tienen los significados definidos para la fórmula
(I), en presencia de una mezcla que comprende
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa escogida de AHAS (acetoxihidroxiácido sintasa) y TSAS
(tartronato semialdehído sintasa), y pirofosfato de tiamina (TPP),
flavinadenindinucleótido (FAD), iones metálicos, y un
tampón.
2. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que uno de los enantiómeros del compuesto de fórmula (I) se
forma en exceso.
3. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que la \alpha-hidroxicetona aromática es
\alpha-hidroxicetona aromática quiral.
4. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto de fórmula (I) es
(R)-arilacilcarbinol.
5. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el 2-oxoácido es ácido pirúvico.
6. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el 2-oxoácido se escoge de ácido
glioxílico, ácido 2-cetobutírico, y ácido
2-cetovalérico.
7. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el arilo se escoge de fenilo, bencilo, naftilo, furilo,
piridinilo y tienilo.
8. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el aldehído es un benzaldehído sustituido.
9. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el aldehído es benzaldehído.
10. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto de fórmula (I) es fenilacetilcarbinol
(PAC).
11. Un procedimiento según la reivindicación 1,
en el que el compuesto de fórmula (I) es
(R)-PAC.
12. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que el PAC constituye más del 95% de los productos de la
reacción enzimática.
13. Un procedimiento según la reivindicación 10,
en el que el PAC constituye más del 99% de los productos de la
reacción enzimática.
14. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el (R)-PAC constituye más del 90%
del PAC producido en la reacción enzimática.
15. Un procedimiento según la reivindicación 11,
en el que el (R)-PAC constituye más del 95%
del PAC producido en la reacción enzimática.
16. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima de origen bacteriano.
17. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima escogida de una enzima de levadura,
una enzima fúngica y una enzima vegetal.
18. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína de tipo natural.
19. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína recombinante.
20. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína manipulada mediante ingeniería
genética.
21. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína mutante.
22. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima de AHAS.
23. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima de TSAS.
24. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína de la isozima I de AHAS procedente
de Escherichia coli.
25. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína de la isozima II de AHAS procedente
de Escherichia coli.
26. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende TSAS procedente de Escherichia coli.
27. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una proteína marcada con histidina.
28. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 15, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende mutantes dirigidos específicos de ARAS II
sobreexpresados en células hospedantes.
29. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 25, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima estabilizada.
30. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 26, en el que dicha
2-hidroxi-3-oxoácido
sintasa comprende una enzima inmovilizada.
31. Un procedimiento de biotransformación según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que todos los
componentes de la reacción enzimática se añaden a la mezcla de
reacción en una sola porción.
32. Un procedimiento de biotransformación según
una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 27, en el que algunos de
los componentes de la reacción enzimática se añaden a la mezcla de
reacción en más porciones, o continuamen-
te.
te.
33. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el pH de la mezcla es de 5 a 9.
34. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el pH de la mezcla es de 6,5 a 7,5.
35. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que la mezcla comprende un tampón escogido del grupo
que consiste en MES, BIS-TRIS, PIPES, BES, MOPS,
TES, HEPES, TRIS, Tricina, Bicina, y fosfato.
36. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el tampón tiene una concentración entre 0,01 M y
0,25 M.
37. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el aldehído y el oxoácido se añaden a
concentraciones entre 2 mM y 100 mM.
38. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el TPP y el FAD se añaden a concentraciones
entre 0,02 mM y 0,2 mM.
39. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que los iones magnesio se añaden a una concentración
entre 0,2 mM y 2 mM.
40. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que el DTT (ditiotreitol) se añade a una
concentración entre 0,1 mM y 2 mM.
41. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que la enzima se añade a una concentración entre
0,01 mg/ml y 1,0 mg/ml.
42. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que la enzima se añade a una concentración entre 0,1
y 10 U/ml.
43. Un procedimiento según las reivindicaciones
28 ó 29, en el que la temperatura de la mezcla está entre 15 y
40ºC.
44. Un procedimiento según una cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 40, en el que dicha mezcla comprende un
disolvente orgánico miscible con agua, escogido de
2-propanol, dimetilsulfóxido, dimetilformamida, y
acetamida, en concentraciones de 0 a 50% (v/v).
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