KR100828625B1 - 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주및 그 균주를 이용한 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의동시 생산방법 - Google Patents

알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주및 그 균주를 이용한 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의동시 생산방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 글루탐산과 과당으로부터 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 균주 및 이를 이용하여 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 방법에 관한 것으로,
NAD+ 또는 NADP+를 조효소로 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADH 또는 NADPH를 조효소로 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 이용하여,
알파-케토-글루타레이트 및 만니톨을 동시에 생산할 수 있는 뛰어난 효과를 나타낸다.
과당, 글루타메이트, 동시생산, 만니톨, 알파-케토-글루타레이트

Description

알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주 및 그 균주를 이용한 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법{Recombinant microorganism to produce alpha-keto-glutarate and manitol simultaneously and the method for production of alpha-keto-glutarate and manitol thereof}
도 1은 본 발명의 글루타메이트 데하이드로지나아제 및 만니톨 데하이드로지나아제를 대장균에서 동시 발현하기 위한 동시 발현벡터의 재조합 과정을 나타낸다.
본 발명은 글루탐산과 과당으로부터 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 균주 및 이를 이용하여 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 방법에 관한 것이다.
알파-케토-글루타레이트(α-keteltoglutarate, AKG)는 크렙스 회로를 통해 전신 및 장 대사에 있어 중추 역할을 하는 분자로서, 생체 내에서 아미노기 전이반 응에 의해서 L-프롤린(L-proline), L-오르니틴(L-ornithine), L-시트룰린(L-citrulline) 등으로 전환되는데, 생체 내의 질소 발란스(nitrogen balance)를 유지시키는데 중요한 역할을 하며, 요독증(uremia) 등의 증상을 완화시키는 효과가 있는 것으로 알려져 있다.
한편, L-오르니틴-알파-케토-글루타레이트는 건강 증진(athletic performance) 효과와 더불어 상처 치료(wound healing)를 개선시키는 효과를 발휘한다.
또한, 만성 신우염 환자들의 혈액투석을 위한 복강 내 용액(endoperitoneal solution)의 성분으로 매우 유용하며, 탄산칼슘(calcium carbonate)과 에리스로포이어틴(erthropoietin), 로우-프로테인 다이어트(low-protein diet) 등과 함께 장기 복용하면 신장염과 단백뇨(proteinuria)의 증상을 개선시키는 보고도 있다.
현재, AKG는 글루타릴산과 차염소산나트륨(Sodium hypochlorite)을 화학촉매하에 반응시킨 후 정제하여 상업적으로 생산되고 있다. 그러나 이 방법은 냄새, 폐기물의 발생 등 환경친화적이지 못하고, 제조원가가 상대적으로 높은 문제가 있다. 이에 AKG를 환경친화적인 발효법을 이용하여 생산하려는 시도도 계속되고 있으나 아직까지 상업화된 예는 보고되지 않고 있으며, 다만 AKG를 생산하는 방법에 관련된 실험적 수준의 선행 논문으로는 'Production of ketoglutarate by Penicillium chrysogenum' (Nature . 1951 Dec 15;168(4285):1043)가 있으며, 선행 특허로는 미국특허 5,607,848 에 개시된 'Process for producing optically active 4-hydroxy-2-ketoglutaric acid using microorganisms' 이 있다.
한편, 만니톨은 탄소수가 6개인 기능성 당알코올이고, 제약의 기초 원료로 사용되고 있으며, 국내시장은 1999년 기준 400톤 규모이다. 그러나 현재 국내에 이의 제조를 담당하는 제조사가 없어 전량 수입에 의존하고 있는 실정이다. 세계시장 규모는 약 1억 5천만불(일본의 경우 연간 6,000톤 정도 생산)이며 현재 전 세계적으로 불고 있는 식품에 대한 선호도 변화 추세로 인하여 매년 10% 이상의 성장률을 보이고 있는 상태이다.
만니톨을 생산하는 방법에 관련된 선행 특허로는 미국특허 4,029,878 'Process for preparing mannitol from glucose'에 6가의 몰리브덴 (hexavalent molybdenum)의 촉매 하에서 글루코오스(glucose)나 글루코오스 중합체(glucose polymers)로부터 만노즈를 생산한 후 만노즈의 탈수소화를 통해 만니톨을 생산하는 방법이 개시되어 있고, 미국 특허 6,649,754, 'Method for producing mannitol'에 라니 구리 촉매(Raney copper catalyst) 하에서 과당을 탈수소화(hydrogenation)시켜 만니톨을 생산하는 방법이 개시되어 있다.
또한, 미생물을 이용하여 만니톨을 생산하는 방법으로는 미국특허 6,602,691, 'Process for the production of mannitol by immobilized micro-organisms' 및 미국특허 6,528,290, 'Candida magnoliae producing mannitol and fermentation method for producing mannitol' 등이 개시되어 있다.
그러나, 종래에 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 균주 및 그 동시 생산 방법에 대해서는 전혀 알려진 바 없다.
이에 본 발명은 상기 종래의 문제점을 해결하기 위해 안출된 것으로, 생물공정에 의해 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시 생산할 수 있는 균주를 제공하는데 그 목적이 있다.
또한, 그 균주를 이용하여 생물공정에 의해 알파-케토-글루타레이트와 만니톨을 동시에 생산하는 방법을 제공하는데 그 목적이 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 NAD+를 조효소로 사용하는 서무스 속 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADH를 조효소로 사용하는 류코노스톡 또는 쉬도모나스 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 제공한다.
또한, NADP+를 조효소로 사용하는 대장균 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADPH를 조효소로 사용하는 칸디다 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 제공한다.
또한, 본 발명의 특허청구범위 제1항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 특허청구범위 제2항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 특허청구범위 제1항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가); 발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및 회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법을 제공한다.
또한, 본 발명의 특허청구범위 제2항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가); 발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및 회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법을 제공한다.
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이하, 본 발명의 구성에 대해 하기에서 더욱 상세히 설명하고자 한다.
AKG가 생산되는 과정을 도시하면 다음과 같은데, 현재 AKG를 발효나 효소법으로 생산하는데 있어 중요한 기술요소는 NAD(P)+를 NAD(P)H로부터 재생시키는 것이다.
조효소로는 NADP+와 NAD+ 를 모두 사용할 수 있으나, NADP+는 NAD+에 비해서 불안정하고 고가이기 때문에 기질에 넣고 반응시키는 것은 경제적이지 못하다. 즉, 미생물을 접종하여 배양하면서 AKG와 만니톨을 동시생산하는 경우는 NADP+ 또는 NAD+를 조효소로 하는 효소체계를 모두 사용할 수 있는나, 일단 균체를 배양 완료한 후 균체 내의 효소체계를 이용하여 AKG와 만니톨을 동시생산하고자 하는 경우는 NAD+를 조효소로 하는 효소체계를 사용하는 것이 바람직하다.
Figure 112006090072558-pat00001
한편, NADH를 NAD+ 로 재생시키는 과정은 다음의 몇 가지 경우에 의해서 가능하다.
첫째, NADH 데하이드로지나아제(dehydrogenease, oxidase)를 이용하여 산소분자(molecular oxigen)를 전자 수용체(electron acceptor)로 사용하면 NAD+ 와 H2O가 생성되는 것이다.
둘째, Nar 오페론(operon)을 사용하여 전자수용체로서 NO3 -를 이용하여 NAD+와 NO2 - 및 H2O를 생성하는 것이다. NADH 산화효소(oxidase)를 사용한 경우가 대표적인 예로서, NAD+를 재생산(regeneration)한 많은 보고가 있으나, 대부분의 경우 H2O2를 생성하게 됨으로써 세포에 치명적이 되기 때문에 카탈라아제(catalase)를 첨가하여야 하는 단점이 있다.
셋째, NADH 의존성 만니톨-1 인산 데하이드로지나아제(NADH-dependent mannitol-1-phosphate dehydrogenase)를 인코딩(encoding) 하는 mtlD 유전자를 클로닝하여 사카로마이세스 세레비지애(yeast Saccharomyces cerevisiase)에 형질전환함으로써 부산물(byproduct)로서 만니톨을 얻고 동시에 NAD+를 재생산하는 효율적인 방법이 있다(Costenoble et al. FEMS yeast Res. 3:12-25. 2003).
이 방법은 산소분자(molecular oxygen)를 전자수용체로 사용하는 것에 비해 부산물(byproduct)로 만니톨을 얻을 수 있고 NAD+의 재생산이 매우 효율적인 장점이 있는 것으로 보고되었으나, 만니톨이 혐기성 생장(anaerobic growth)시에만 생성되 어 실제 사용이 어려운 단점이 있다.
한편, 본 발명자는 수년 동안 연구한 결과, 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae)의 만니톨 생성과정에서 만니톨 데하이드로지나아제(mannitol dehydrogenase, mdh)가 과당을 기질로 하고, NAD(P)H를 조효소(coenzyme)로 하여 만니톨을 생성하는 것을 밝혀냈으며, 이때, NAD(P)+를 재생할 수 있는 것으로 밝혀냈다.
그 후, 이 반응을 글루타메이트 및 그 유도체로부터 AKG를 생산하는 반응과 커플링시켜 NAD(P)H 및 NAD(P)+가 원활하게 재생되는 시스템을 균주 내에 구축하여 재조합 미생물을 제조함으로써 본 발명을 완성한 것이다. 커플링 반응에 대한 개요는 하기와 같다.
Figure 112006090072558-pat00002
상기와 같은 커플링 반응으로부터 본 발명은 NAD+를 조효소로 사용하는 서무스 속 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADH를 조효소로 사용하는 류코노스톡 또는 쉬도모나스 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 제공하고, 또한 NADP+를 조효소로 사용하는 대장균 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADPH를 조효소로 사용하는 칸디다 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 제공한다.
재조합 균주로는 당업계에서 형질전환이 가능한 것으로 알려진 재조합 균주 제작용 호스트라면 어느 것을 사용하여도 무방하나, 바람직하게는 유전자 정보 및 배양학적 기술이 많이 축적된 대장균 또는 효모를 사용하는 것이 좋다.
한편, 본 발명에서의 상기 '발현'은 효소가 호스트 내에 자체적으로 존재하지 않을 경우, 외부에서 클로닝 된 것으로 효소를 암호화 하는 유전자를 호스트 내에 도입시켜 효소를 발현시키는 것을 의미하는 용어이며, '과발현'은 호스트 내에 자체적으로 효소가 존재하는 경우, 이의 발현량을 증대시킨 것을 의미하는 용어이다.
본 발명의 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주는 효소가 발현 또는 과발현되도록 그 시스템이 호스트 내부에 도입이 되었는데, 발현 또는 과발현시스템은 벡터에 효소를 암호화하는 유전자를 삽입하여 구축된 재조합 벡터인 것이 좋다.
발현 벡터의 프로모터는 배양 중 유전자 발현 단계 조절의 필요성 유무 및 그 외의 다양한 필요에 의해 항시발현 프로모터(Constitutive promoter) 또는 유도 프로모터(Inducible promoter)가 특정의 종류에 국한되지 않고 사용될 수 있으며, 유도 프로모터로는 온도의 변화에 의해 작동될 수 있는 프로모터 또는 유도물질에 의해 작동이 될 수 있는 프로모터들이 다양하게 사용될 수 있다.
또한, 상기 재조합 벡터를 호스트 내에 도입하는 방법으로는 벡터를 호스트 내로 도입시키기 위한 다양한 유전공학적 방법이 특정의 방법에 국한되지 않고 사용될 수 있으며, 바람직하게는 형질전환(transformation)의 방법에 의해 수행되는 것이 좋다.
한편, 본 발명의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소는 글루타메이트 또는 그 유도체를 알파-케토-글루타레이트로 전환시키는데, 유도체로는 글루타메이트 데하이드로지나아제에 의해 알파-케토-글루타레이트로 전환되는 것이라면 특정의 것에 한정되지 않고 사용될 수 있으나, 바람직하게는 당업계에 식품소재로 많이 알려진 모노 소디움 글루타메이트(MSG; Mono Sodium Glutamate)인 것이 좋다.
한편, 본 발명의 글루타메이트 또는 그 유도체를 알파-케토-글로타레이트로 전환시키는 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소는 글루타메이트 또는 그 유도체로부터 H+를 받을 수 있는 조효소를 필요로 하는데, 이때 조효소로는 NAD+ 또는 NADP+가 사용될 수 있다. 효소는 그 특성에 따라 NAD+ 또는 NADP+에 대해 특별히 선호하는 친화도를 가지고 있으나, 전적으로 둘 중 어느 하나만을 이용하는 경우는 매우 드물고, 특히나 대장균의 경우는 NADPH 와 NAD+ 간에 수소이온의 교환이 생겨 NADP+ 와 NADH를 생산하는 하이드로지네이션(hydrogenation) 반응에 의해 NADP+ 및 NAD+가 서로 변환될 수도 있으므로, 조효소로서 NAD+ 또는 NADP+ 중 하나에 반드시 국한될 필요는 없다.
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또한, 과당을 만니톨로 전환시키는 만니톨 데하이드로지나아제 효소도 조효소로서 NADH 또는 NADPH를 둘 다 사용할 수 있으며, 그 중 하나에 반드시 국한될 필요는 없다.
다만, 바람직하게는 NAD+ 를 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소는 NPDH를 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제와 NADP+ 를 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제는 NADH를 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제와 커플링시키는 것이 좋다.
한편, 상기 NAD+를 조효소로 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제 또는 NADH를 조효소로 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제는 다양한 미생물 집단으로부터 얻어질 수 있으나, 바람직하게 상기 글루타메이트 데하이드로지나아제는 서무스(Thermus) 속 유래이고, 만니톨 데하이드로지나아제는 류코노스톡(Leuconostoc) 또는 쉬도모나스(Pseudomonas) 속 유래인 것이 좋다. 서무스 속 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제가 NAD+에 대한 친화도가 높고, 류코노스톡 또는 쉬도모나스 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제가 NADH에 대한 친화도가 높기 때문이다.
한편, 상기 NADP+를 조효소로 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제 또는 NADPH를 조효소로 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제는 다양한 미생물 집단으로부터 얻어질 수 있으나, 바람직하게 상기 글루타메이트 데하이드로지나아제는 대장균 유래이고, 만니톨 데하이드로지나아제는 칸디다(Candida) 속 유래인 것이 좋다. 대장균 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제가 NADP+에 대한 친화도가 높고, 칸디다 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제가 NADPH에 대한 친화도가 높기 때문이다.
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한편, 본 발명은 본 발명의 특허청구범위 제1항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법을 제공하고, 또한 본 발명의 특허청구범위 제2항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법을 제공한다.
본 생산방법은 재조합 균주가 기질로서 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 흡수하여 그 내부에서 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨로 변환시킨 후 그 외부로 배출함으로써 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨을 동시 생산하는 것이다.
한편, 상기 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당;을 함유하는 기질용액은 발효 초기부터 배지에 첨가할 수도 있고, 기타 경제성 등의 다양한 요구에 부합하는 발효방식에 따라 당업계에 알려진 적절한 방식으로 첨가될 수 있으나, 바람직하게는 글루타메이트 또는 그 유도체를 효소의 발현이 유도된 후, 유가식으로 투입하는 것이 좋다. 초기에 포도당과 과당을 같이 첨가하게 되면 삼투압이 지나치게 높아져서 균체의 생육에 안 좋은 영향을 끼칠 수 있기 때문에, 초기 포도당이 어느 정도 소진된 후, 과당을 넣어주는 것이 좋다.
한편, 배지에는 균의 생육을 위해 포도당을 비롯한 여러 성분들이 첨가될 수 있다.
또한, 본 발명은 본 발명의 특허청구범위 제1항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가); 발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및 회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법을 제공하고, 또한 본 발명의 특허청구범위 제2항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가); 발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및 회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법을 제공한다. 이 방법은 효소를 대량으로 생산하는 공정과 기질로부터 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨을 생산하는 공정이 2개로 나누어진 것으로서, 먼저 재조합 균주 내에서 효소를 충분히 과발현시킨 후, 균체를 회수하고 여기에 기질로서 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 용액을 첨가하여 반응시키는 것이다. 따라서, 본 방법에 있어서는 균체를 키우는 배지 중에 글루타메이트 또는 그 유도체 및 과당을 첨가할 필요가 없다.
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한편, 상기 본 발명의 동시 생산방법들에 있어서, 글루타메이트 또는 그 유도체는 알파-케토-글루타레이트의 생산량의 증대를 위해 발효가 수행될 수 있는 한도 내에서 최대한 고농도로 제공되는 것이 좋으나, 바람직하게 배지 또는 기질용액 중 최종농도로 3~15 중량%인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 7~10 중량%로 하는 것이 좋다.
또한, 상기 본 발명의 동시 생산 방법들에 있어서, 과당은 만니톨의 생산량 증대를 위해 발효가 수행될 수 있는 한도 내에서 최대한 고농도로 제공되는 것이 좋으나, 바람직하게 배지 또는 기질용액 중 최종농도로 5~20 중량%인 것이 좋고, 더욱 바람직하게는 10~15 중량%인 것이 좋다.
각각 권장되는 상기의 중량%에서 효소반응속도가 빠르고 생성물의 농도를 높이는 것이 용이하기 때문이다.
한편, 상기 본 발명의 동시 생산방법들에 있어서, 상기 배지 또는 기질용액은 바람직하게 NADH 또는 NADPH를 배지 또는 기질용액 중에 최대 1mM 농도까지 함유하는 것이 좋은데, 효소의 반응속도가 빨라져 생산성이 좋아지기 때문이다.
한편, 배양에 있어서 pH 조정은 염산이나 황산과 같은 무기산, 가성소다와 같은 알칼리를 이용하여 조정할 수 있으나, 초산과 같은 유기산은 효소반응에 저해를 줄 수 있기 때문에 바람직하지 못하다.
이하, 본 발명의 구성을 하기 실시예를 통하여 더욱 상세히 설명하고자 하지만, 본 발명의 권리범위가 하기 실시예에만 반드시 한정되는 것은 아니고, 등가의 기술적 사상을 가지는 변형까지를 포함한다.
실시예 1: NADP + 및 NADPH 조효소계를 이용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제(Gdh)와 만니톨 데하이드로지나아제(M dh) 효소활성을 가진 미생물의 제조
공지의 클로닝 기술을 이용하여 대장균(E. coli) DH5α(ATCC 53868)의 gdh와 캔디다 매그노리아(Candida magnoliae) (KCCM 10252)의 mdh 유전자를 클로닝한 후, 통상적인 방법으로 상용 발현벡터(pGEM-T easy)에 도입한 후 서브클로닝을 통해 하나의 백터에 gdh와 mdh를 동시에 도입하였다(도 1의 pDRIVE couple vector). 이 벡터를 형질전환의 방법으로 대장균(E. coli) DH5α (ATCC 53868)에 삽입함으로써 재조합 대장균을 제조하였다.(도 1 참조)
한편, 이때 사용된 프라이머 리스트는 하기 표 1과 같았다.
대장균(E. coli) DH5α(ATCC 53868)의 gdh 정방향 CCG GGT GGC AAA ACT T
역방향 ACG CCT GAA ATT TTG CC
캔디다 매그노리아(Candida magnoliae) (KCCM 10252)의 mdh 정방향 ATG CAT GCT AAG AAC TTC TCC
역방향 TTA GGG AAG CGT GTA G
이어 상기 재조합 대장균을 배양하여 단백질 발현유무를 확인한 후, 발현능을 보이는 균주를 선별하여 배양하였다.
Gdh 활성은 재조합 균주가 모균주에 비해서 70배 높은 활성을 보였고, Mdh 활성은 재조합 균주가 모균주에 비해서 60배의 높은 활성을 보였다. 이때 조효소로서 NADP+와 NADPH가 사용되었다.
한편, 본 실시예에 제시된 형질전환 균주의 제조 과정은 상기에 개시된 프라이머를 이용하여 PCR을 통해 수행이 가능하며 구체적인 실험조건(PCR 등)은 실험의 효율을 위해 일부 변경이 가능하고 이와 같은 사항은 당업자에게 자명하다.
실시예 2: 실시예1에서 제작한 글루타메이트 데하이드로지나아제(Gdh)와 만니톨 데하이드로지나아제(M dh) 효소 활성을 가진 미생물의 복합효소활성 측정
실시예 1에 따라 제조된 재조합 대장균과 대조구로서 호스트로 사용된 대장균을 각각 100 ㎍/㎖ 암피실린이 첨가된 3 ㎖ LB 배지와 암피실린이 첨가되지 않은 배지에서 배양한 다음, 이를 다시 동일한 배지 10 ㎖에 1％ 접종하여 37℃에서 배양하였다.
재조합 대장균을 배양한 배양액의 600 nm에서의 흡광도가 0.8 정도가 되었을 때, 온도를 40℃로 옮겨서 클로닝된 gdh와 mdh 유전자의 발현을 유도하였다. 온도를 올린 후 6시간 더 배양시킨 다음, 6,000 rpm에서 5분간 원심분리를 하여 균체를 회수하였다. 한편, 대조구의 대장균은 37 ℃에서 계속 배양한 후, 균체를 회수하였다.
균체를 회수한 후 재조합 균체 및 대조구 균체의 복합효소활성을 측정하였는데 그 방법은 다음과 같았다.
<Gdh와 Mdh 복합효소활성의 측정>
AKG와 만니톨의 생성속도로부터 각각 Gdh와 Mdh의 활성을 구했다. 활성을 측정하기 위하여 다음과 같이 액을 조제했다.
ⅰ) MSG 50 g, 과당 70 g 을 증류수 1 리터에 용해하여 2N 염산으로 pH를 7로 맞춘 수용액
ⅱ) 0.3 mmol NADPH 수용액
ⅲ) 재조합 균체 및 대조구 균체의 파쇄액 (0.1 g 습균체/10 mL)
복합효소 활성을 측정하기 위해서 '10 ml의 액ⅰ)', '1 ml의 액ⅱ)', 그리고 '0.1ml의 액ⅲ)'을 잘 혼합하여 37 ℃에서 흔들어 주었다. 30분 후 1ml의 5N 가성소다수용액을 첨가하여 반응을 중지시키고 HPLC로 AKG와 만니톨의 농도를 측정하였다. 이때 활성을 구하는 식은 다음의 수학식 1과 같았다.
Figure 112006090072558-pat00003
회수된 재조합 균체의 Gdh와 Mdh의 복합효소활성은 수학식 1에 의해 계산한 결과, 39 U/g-습균체이었고, 대조군(형질전환되지 않은) 균체의 Gdh와 Mdh 복합효소활성은 3 U/g-습균체 이하였다.
따라서, 상기 실시예1에서 제조한 본 발명의 재조합 균주가 대조군 대비 우수한 효소활성을 가짐을 확인할 수 있었다.
실시예 3: 실시예1에서 제작한 글루타메이트 데하이드로지나아제(Gdh)와 만니톨 데하이드로지나아제(Mdh) 효소활성을 가진 미생물로부터 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 생산
실시예1에서 제작한 재조합 대장균을 통상적인 방법으로 5 리터의 배지에 접종하여 37 ℃에서 습균체농도가 20 g/ℓ가 될 때까지 배양한 후 40 ℃로 온도를 올렸다.
이어 미리 살균한 기질용액을 0.25 ℓ/h의 유량으로 10시간 주입하였다. 기질 용액은 글루탐산 20%(w/v), 과당 28%(w/v)의 농도가 되도록 하고 pH 7.0로 맞추었다.
기질용액의 투입이 완료 된 후 12시간 경과 한 후 배양을 종료하였다. 기질 투입이 완료 된 후 AKG와 만니톨의 경시변화를 하기 표 2에 나타내었다. 하기 표에서 %단위는 용액 100 ml 당 g수를 의미하는 %(w/v)이다.
Figure 112006090072558-pat00004
실시예 4: NAD + /NADH 조효소계를 이용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제(Gdh)와 만니톨 데하이드로지나아제(Mdh) 효소활성을 가진 미생물로부터 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 생산
서무스 서모필러스(Thermus Thermophilus) HB8 (ATCC 27634) 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제(Gdh)와 류코노스톡 쉬도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) KCTC 3652 유래의 만니톨 디하이드로지나아제(Mdh)를 클로닝한 후, 실시예 1에서 사용한 방법으로 하나의 벡터에 두 개의 유전자를 동시에 삽입한 후, 실시예 1의 대장균에 도입하여 형질전환시킴으로써 재조합 대장균을 제조한 후, 실시예 2와 같은 방법으로 배양하여 재조합 균체를 회수하였다.
한편, 클로닝에 사용된 프라이머 세트는 하기 표 3과 같았다.
서무스 서모필러스(Thermus Thermophilus) HB8 (ATCC 27634)의 gdh 정방향 CCA TGG AAA AGA GCG AAC CCC TTT CCT AC
역방향 TTA AGG GTA TAG GCC CCG GAG
류코노스톡 쉬도메센테로이데스(Leuconostoc pseudomesenteroides) KCTC 3652dml mdh 정방향 ATG CAT GAA GCA CTT GTG TTA ACT GGT AC
역방향 TTA TGC CTC TTC GCC ACC AAC
이 후 이 균체를 기질에 작용시켰는데, 균체의 농도는 글루탐산 1 g당 복합효소활성 50 U에 해당하도록 하고, 기질의 농도는 글루탐산의 농도 5%, 과당의 농도가 9%, NAD+ 0.3 mmol이 되도록 하였다. 50℃에서 3시간, 8 시간, 12시간, 24시간, 48시간 반응시켰다.
기질용액의 시간에 따른 전환율을 하기 표 4에 나타내었다. 하기 표에서 %단위는 용액 100 ml 당 g수를 의미하는 %(w/v)이다.
Figure 112006090072558-pat00005
이상 상기에서 살펴본 바와 같이 본 발명은 NAD+ 또는 NADP+를 조효소로 사용하는 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및, NADH 또는 NADPH를 조효소로 사용하는 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주를 이용하여 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨을 동시에 생산해 낼 수 있는 뛰어난 효과를 발휘하는 바, 생물산업에 있어서 매우 유용한 것이다

Claims (15)

  1. NAD+를 조효소로 사용하는 서무스 속 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및,
    NADH를 조효소로 사용하는 류코노스톡 또는 쉬도모나스 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주
  2. NADP+를 조효소로 사용하는 대장균 유래의 글루타메이트 데하이드로지나아제 효소; 및,
    NADPH를 조효소로 사용하는 칸디다 속 유래의 만니톨 데하이드로지나아제 효소;를 발현 또는 과발현하는 시스템이 균주 내에 도입된 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주
  3. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 발현 또는 과발현 시스템은,
    글루타메이트 데하이드로지나아제 효소 및 만니톨 데하이드로지나아제 효소를 발현 또는 과발현시킬 수 있도록 효소를 암호화하는 유전자가 삽입된 재조합 벡터인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주
  4. 제1항 또는 제2항에 있어서,
    상기 재조합 균주는,
    대장균 또는 효모인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산 재조합 균주
  5. 제1항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법
  6. 제2항의 재조합 균주를 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당을 기질로 함유하는 배지에 접종하여 배양하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨 동시 생산방법
  7. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 글루타메이트 또는 그 유도체; 및 과당;을 함유하는 기질은,
    효소의 발현이 유도된 후, 유가식으로 투입되는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  8. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 글루타메이트 또는 그 유도체의 총 함량은,
    최종농도로 배지 중 3~15 중량%인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  9. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 과당의 총 함량은,
    최종농도로 배지 중 5~20 중량%인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  10. 제5항 또는 제6항에 있어서,
    상기 배지는,
    NADH 또는 NADPH를 최대 1mM 농도까지 함유하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  11. 제1항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가);
    발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및
    회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  12. 제2항의 재조합 균주를 배양하면서 효소의 발현을 유도하는 단계(가);
    발현을 유도한 후 균체를 회수하는 단계(나); 및
    회수된 균체에 글루타메이트 또는 그 유도체; 및, 과당;을 함유하는 기질용액을 작용시키는 단계(다);를 포함하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  13. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 글루타메이트 또는 그 유도체의 총 함량은,
    최종농도로 기질용액 중 3~15 중량%인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  14. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 과당의 총 함량은,
    최종농도로 기질용액 중 5~20 중량%인 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
  15. 제11항 또는 제12항에 있어서,
    상기 기질용액은,
    NADH 또는 NADPH를 최대 1mM 농도까지 함유하는 것을 특징으로 하는 알파-케토-글루타레이트 및 만니톨의 동시 생산방법
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Applied and Environmental Microbiology, Vol. 69(9), pp. 4438-4447

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