JP6473175B2 - ジカルボニル還元酵素突然変異体及びその応用 - Google Patents
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Description
本発明は、ジカルボニル還元酵素突然変異体及びその応用に関し、特に、本発明は部位特異的飽和突然変異によって得た触媒活性等の性質が改善されたジカルボニル還元酵素突然変異体に関し、つまり、前記ジカルボニル還元酵素突然変異体を利用して３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物を調製する応用に関する。
カルボニル基還元酵素は、酸化還元酵素で、生物有機体の多くの生体内変化において重要な作用を果たしている。触媒作用によって高く対応する選択性のキラルアルコールを発生することができるので、カルボニル基還元酵素は通常、極めて重要な生物触媒として化学や製薬産業においてキラル中間体の合成に応用されている。一方、ジカルボニル還元酵素は、立体選択的にジケトン酸エステルの二つのカルボニル基を同時に対応するヒドロキシ基に還元することができるので、核心薬物の中間体の合成に用いられることができ、特に、スタチン系薬物のキラルジヒドロキシ基ヘキサン酸鎖、例えば世界でよく売れているコレステロール低下薬物であるアトルバスタチン（Ａｔｏｒｖａｓｔａｔｉｎ、リピトール）やロスバスタチン（Ｒｏｓｕｖａｓｔａｔｉｎ）の合成に用いられる。
現在周知のジカルボニル還元酵素は生物触媒とすることができ、一つのステプによってジケトン反応物質を還元し、単一光学純度に近いスタチン系脂質低下薬物の核心キラル中間体３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステルを調製していて、合成工程を簡略化し、製造汚染を低下した。しかし、工業生産の応用において、例えば、酵素の触媒活性が低く、酵素液の使用量が多く、且つ反応体系の総体積が増加して、生産回数やコストが高くなる等の解決すべき問題が依然として存在している。これらの問題を、酵素分子を進化させて、ジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）の自分触媒活性を向上させることで解決することができる。酵素は生物触媒として、生物体内において高効率及び高特異性の特徴を十分に発揮することができる。しかし、工業応用において、工業生産条件に適応できず、非天然反応物質に対する触媒力が低い等の問題が存在している。必ず、異なる応用要求を満たすように、タンパク質工程方法によって酵素分子を改善しなければならない。タンパク質工程方法は、合理的設計（ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）、不合理的設計（ｉｒｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）、半合理的設計（ｓｅｍｉ−ｒａｔｉｏｎａｌ ｄｅｓｉｇｎ）との三つに分けられる。
合理的設計とは、タンパク質の空間構造を理解した上、部位特異的突然変異（Ｓｉｔｅ−ｄｉｒｅｃｔｅｄ Ｍｕｔａｇｅｎｅｓｉｓ）又は他の方法によってタンパク質分子中の個別のアミノ酸を改善して、新しい性状のタンパク質を発生することを言う。このような方法は、理論上の対象が明確であって、主に天然酵素蛋白の触媒活性、反応物質特異性、安定性の改善や抑制剤タイプ、補酵素特異性の改造等に利用される。
部位特異的飽和突然変異技術は、タンパク質工程中の一つの重要な技術で、上記した半合理的設計に属されるが、合理的設計と不合理的設計のメリットも結合していて、それぞれの不足を補充していて、対象蛋白のコード化遺伝子を改造し、短時間内に標的部位のアミノ酸がそれぞれ他の１９種類のアミノ酸で入れ替えられた突然変異体を得る。当該技術は、タンパク質の配向改造を行う強力な工具であると共に、タンパク質の構造と機能の関係を研究する重要な手段でもある。研究によると、複数部位が突然変異すると、通常、単一部位が突然変異する場合より一層理想的な進化体が得られる。複数部位の突然変異は、部位特異的突然変異によって直接に得られるものではない。部位特異的突然変異技術が解決することのできないこれらの問題が、ちょうど部位特異的飽和突然変異技術の独特点である。
従って、部位特異的飽和突然変異技術によってジカルボニル還元酵素を改善し、その触媒活性、反応物質特異性及び／又は安定性を向上させることができれば、既存技術における例えば酵素液の使用量が多く、製造コストが高い等の問題を解決することができる。
従って、本発明の一つの目的は、部位特異的飽和突然変異技術によってジカルボニル還元酵素を改善して、その触媒活性、反応物質特異性及び／又は安定性を向上させることである。
本発明の第１の態様によると、
ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、
ｂ）、ａ）に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有する配列、又は、
ｃ）、ａ）中の配列から、一つ又は複数のアミノ酸残基を削除、追加及び／又は入れ替えすることで得たものであって、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有する配列から選ばれる一つのアミノ酸配列を含有し、
ｂ）に示す配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列ではないジカルボニル還元酵素突然変異体を提供する。
ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６、
ｂ）、ａ）に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有する配列、又は、
ｃ）、ａ）中の配列から、一つ又は複数のアミノ酸残基を削除、追加及び／又は入れ替えすることで得たものであって、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有する配列から選ばれる一つのアミノ酸配列を含有し、
ｂ）に示す配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す配列ではないジカルボニル還元酵素突然変異体を提供する。
一実施方案において、前記ジカルボニル還元酵素突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５又は６に示すアミノ酸配列を含有する。
他の一実施方案において、前記ジカルボニル還元酵素突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２又は３に示すアミノ酸配列を含有する。
他の一実施方案において、前記ジカルボニル還元酵素突然変異体は、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含有する。
本発明の第２の態様によると、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示す配列を含有しない前記ジカルボニル還元酵素突然変異体のヌクレオチド酸コード化配列を提供する。
一実施方案において、前記ヌクレオチド酸コード化配列は、
ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９−１４に示す配列、
ｂ）、ａ）に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコード化する配列、又は、
ｃ）、ａ）に示す配列と高謹厳条件で交雑し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコード化する配列を含有する。
ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９−１４に示す配列、
ｂ）、ａ）に示す配列と少なくとも７０％の同一性を有し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコード化する配列、又は、
ｃ）、ａ）に示す配列と高謹厳条件で交雑し、且つ改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するタンパク質をコード化する配列を含有する。
本発明の第３の態様によると、上記したヌクレオチド酸コード化配列を含有する発現カセットを提供する。
本発明の第４の態様によると、上記したヌクレオチド酸コード化配列を有効に接続した再構成ベクターを提供し、好ましくは、前記再構成ベクターが再構成発現ベクターである。
本発明の第５の態様によると、上記した再構成ベクターを含有する宿主細胞を提供する。
本発明の第６の態様によると、上記ジカルボニル還元酵素突然変異体又は上記ヌクレオチド酸コード化配列によりコード化したタンパク質又は上記した発現カセット又は上記した再構成ベクター又は上記した宿主細胞で取得したタンパク質とジケトン類化合物とを、前記ジカルボニル還元酵素に作用を発揮させた条件で、一定の時間接触させる工程を含み、
ここで、ジケトン類化合物は、市場で商業化された原料又は簡単に製造できる一般式Ｉで示すケトン系化合物であって、
ここで、ジケトン類化合物は、市場で商業化された原料又は簡単に製造できる一般式Ｉで示すケトン系化合物であって、
ここで、Ｒ１は、芳香基、アルキル基、ナフテン基、アルキル基で置換した芳香基、ハロゲンで置換した芳香基、芳香族複素環基、環状ヘテロアルキル基又は環状ヘテロアルキル化アルキル基から選ばれ、Ｒ２は、アルキル基、ナフテン基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化ナフテン基から選ばれる３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基化合物を製造する方法を提供する。
一実施方案において、前記ジケトン類化合物は、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ネオペンチルエステル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸メチル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸エチルから選ばれる。
言い換えれば、本発明は、ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ１２１菌株のジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）遺伝子（例えば、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：７に示す）を出発遺伝子として、遺伝子突然変異を行って、定方向選別を行う方法で、酵素活性が向上されたジカルボニル還元酵素突然変異体を得る。
本発明のロドコッカス・エリスロポリス ＳＫ１２１菌株からのジカルボニル還元酵素の突然変異体のアミノ酸配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＦ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ ＋Ｆ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＶ２３９Ｉ＋Ｒ２５７Ｋで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＩＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＶ１５１Ｑ＋Ｒ２５７Ｋで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、又は、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ
の配列を含有する。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＦ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ ＋Ｆ２３１Ｗで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＷＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＶ２３９Ｉ＋Ｒ２５７Ｋで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＶＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＩＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＶ１５１Ｑ＋Ｒ２５７Ｋで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＩＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＫＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ、又は、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６に示すアミノ酸配列：突然変異部位はＩ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑで、
ＭＴＥＬＫＱＩＴＶＬＧＴＧＶＬＧＳＱＩＡＹＱＴＡＣＨＧＦＤＶＶＡＹＤＩＮＡＥＶＩＥＫＡＫＡＲＦＤＳＬＡＡＡＹＫＡＥＮＶＥＧＡＫＥＧＫＡＤＥＡＬＱＲＩＴＹＳＹＤＬＧＥＡＶＡＫＡＤＬＶＩＥＡＶＰＥＤＩＡＩＫＲＤＴＹＥＫＬＡＴＶＡＰＥＨＴＶＦＡＴＮＳＳＴＬＬＰＳＤＬＫＥＦＴＧＲＰＥＫＦＬＡＬＨＦＡＮＨＶＷＱＮＮＴＡＥＶＭＧＴＥＳＴＤＰＡＶＹＲＥＶＶＥＦＡＫＮＩＧＭＶＰＩＥＬＫＫＥＫＡＧＹＶＬＮＳＬＬＶＰＬＬＮＡＡＳＤＬＬＩＤＧＩＡＤＰＤＭＶＤＫＴＷＲＩＧＴＧＡＰＦＧＰＦＱＩＭＤＶＶＧＬＴＴＶＹＮＩＳＳＱＧＧＥＫＱＲＥＦＡＤＹＩＫＫＮＹＩＤＥＧＫＬＧＶＡＶＧＤＧＦＹＮＹＫＧ
の配列を含有する。
上記ジカルボニル還元酵素突然変異体のコード化ＤＮＡ配列は、
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、且つ第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異し、且つ第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第７１５〜７１７ｂｐのＧＴＣがＡＴＴ、ＡＴＣ又はＡＴＡに突然変異し、且つ第７６９〜７７１ｂｐのＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ第７６９〜７７１ｂｐのＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、又は、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のＤＮＡ配列を含有する。
（１）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９と、
（２）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、且つ第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１０と、
（３）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第６９１〜６９３ｂｐのＴＴＣがＴＧＧに突然変異し、第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異し、且つ第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１１と、
（４）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第７１５〜７１７ｂｐのＧＴＣがＡＴＴ、ＡＴＣ又はＡＴＡに突然変異し、且つ第７６９〜７７１ｂｐのＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１２と、
（５）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ第７６９〜７７１ｂｐのＣＧＣがＡＡＡ又はＡＡＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１３、又は、
（６）ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：８に示すジカルボニル還元酵素遺伝子配列中の第４５１〜４５３ｂｐのＧＴＣがＣＡＡ又はＣＡＧに突然変異し、且つ第２８０〜２８２ｂｐのＡＴＴがＧＴＴ、ＧＴＣ、ＧＴＡ又はＧＴＧに突然変異したＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１４のＤＮＡ配列を含有する。
本発明の上記突然変異体を利用して３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物を製造し、得られた３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基化合物のｅｅ値は９９％を超えていて、ｄｅ値は９０％程度である。本発明のジカルボニル還元酵素突然変異体は核心な薬物中間体で、特に、スタチン系薬物のキラルジヒドロキシ基ヘキサン酸鎖の合成のために効率的な触媒を提供し、３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基化合物の生産コストを大幅に低減させることができる。
本願は、部位特異的飽和突然変異の方法でジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）の遺伝子に突然変異を行うことで、酵素のアミノ酸配列を変更し、タンパク質構造や機能の改善を実現し、さらに、定方向選別の方法によって、酵素活性が大幅に向上されたジカルボニル還元酵素突然変異体を得る。酵素活性はジカルボニル還元酵素母体の２倍以上、ひいては３倍に向上され、３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基化合物の工業生産コストを大幅に低減させる。一部の実施方案において、得られた製品のｅｅ値は９９％を超えていて、ｄｅ値は９０％程度である。
本発明の一実施方案によると、本発明の突然変異体は３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物転換反応において、ジカルボニル還元酵素突然変異体の使用量は出発遺伝子コード化のジカルボニル還元酵素使用量の３４％にすぎず、産業応用に適応する。
一実施方案において、本発明は部位特異的飽和突然変異技術を利用して、ロドコッカス・エリスロポリスＳＫ１２１菌株からのジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）遺伝子を出発遺伝子として、遺伝子突然変異を行って、定方向選別の方法で、酵素活性が向上されたジカルボニル還元酵素突然変異体を得る。本発明のジカルボニル還元酵素突然変異体の突然変異アミノ酸残基は、反応物質結合部位又は反応物質とＮＡＤとの結合に関連する、ＮＡＤ陽子伝送に関連する領域に位置し、例えば１９４はＮＡＤ結合領域に、Ｖ１５１、Ｆ２３１、Ｖ２３９、Ｒ２５７の四つのアミノ酸はいずれも反応物質結合部位付近に位置し、これらのアミノ酸の変更によって、反応物質結合の特異性を向上させ、酵素の活性を向上させることができる。本発明の実験結果によると、単一のＦ２３１Ｗ突然変異によってもジカルボニル還元酵素の活性を顕著に向上させることができる。Ｆ２３１Ｗ突然変異の元に、さらにＩ９４Ｖ及び／又はＶ１５１Ｑ突然変異を導入すると、ジカルボニル還元酵素の活性を一層向上させることができる。Ｒ２５７Ｋの突然変異とＶ２３９Ｉ又はＶ１５１Ｑの突然変異とを組み合わせると、ジカルボニル還元酵素の活性を顕著に向上させることができる。
上述のように得たジカルボニル還元酵素突然変異体は、遺伝子工程手段によって、その遺伝子をｐＥＴ−２２ｂ（＋）及び他の発現ベクターに接続した後、大腸菌にて過剰発現される。過剰発現されたジカルボニル還元酵素突然変異体がＳＤＳ−ＰＡＧＥで現した分子量は約３０ＫＤであって、３０℃、ｐＨ６．０の条件で、1つのステップによって３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物の調製原料を還元し、光学純度が高い３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物を得ることができる。
本発明に記載の３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物の調製原料は、既に市場で商業化された原料又は簡単に製造できるケトン系化合物
であって、ここで、Ｒ１は、芳香基、アルキル基、ナフテン基、アルキル基で置換した芳香基、ハロゲンで置換した芳香基、芳香族複素環基、環状ヘテロアルキル基又は環状ヘテロアルキル化アルキル基から選ばれ、Ｒ２はアルキル基、ナフテン基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化ナフテン基から選ばれる。上述したジヒドロキシ産物は以下の化学一般式
で表し、ここで、Ｒ１は、芳香基、アルキル基、ナフテン基、アルキル基で置換した芳香基、ハロゲンで置換した芳香基、芳香族複素環基、環状ヘテロアルキル基又は環状ヘテロアルキル化アルキル基から選ばれ、Ｒ２は、アルキル基、ナフテン基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化ナフテン基から選ばれる。
定義
本願で使用される用語「同一性」は本分野の周知の通常の意味を持ち、当業者は異なる配列間の同一性を測定するルール、標準が分かる。本発明における異なるレベルの同一性で限定した配列は改善されたジカルボニル還元酵素活性を有しなければならない。ジカルボニル還元酵素の活性の測定、変異体配列の選別方法及び手段は当業者が周知のものである。当業者は本願に開示された内容から示唆を得て、簡単にこのような変異体配列を得られる。一部の実施方案において、前記ジカルボニル還元酵素変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：７又は８に示す配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％の同一性を有し、且つ又は改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列を有し或いはコード化する。例えば、前記アミノ酸配列中の一つ又は複数のアミノ酸残基に保存アミノ酸の入れ替えを行うことができ、例えば一つ又は１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のような複数のアミノ酸残基の入れ替えを行うことができる。アミノ酸の保存アミノ酸は周知のものである。
本願で使用される用語「同一性」は本分野の周知の通常の意味を持ち、当業者は異なる配列間の同一性を測定するルール、標準が分かる。本発明における異なるレベルの同一性で限定した配列は改善されたジカルボニル還元酵素活性を有しなければならない。ジカルボニル還元酵素の活性の測定、変異体配列の選別方法及び手段は当業者が周知のものである。当業者は本願に開示された内容から示唆を得て、簡単にこのような変異体配列を得られる。一部の実施方案において、前記ジカルボニル還元酵素変異体の配列は、ＳＥＱ ＩＤ Ｎo：７又は８に示す配列と少なくとも約７５％、８０％、８５％、９０％、９１％、９２％、９３％、９４％、９５％、９６％、９７％、９８％、９９％、９９．１％、９９．２％、９９．３％、９９．４％、９９．５％、９９．６％の同一性を有し、且つ又は改善されたジカルボニル還元酵素活性を有するアミノ酸配列を有し或いはコード化する。例えば、前記アミノ酸配列中の一つ又は複数のアミノ酸残基に保存アミノ酸の入れ替えを行うことができ、例えば一つ又は１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のような複数のアミノ酸残基の入れ替えを行うことができる。アミノ酸の保存アミノ酸は周知のものである。
本願で使用される用語「改善されたジカルボニル還元酵素活性」は、部位特異的飽和突然変異技術で得たジカルボニル還元酵素の生物活性が初期のジカルボニル還元酵素に比べ改善されたことを指し、例えば、触媒活性が増加し、反応物質スペクトルが広くなり、熱安定が増加し、ｐＨ安定性が増加し、又は発現量が増加したことを指し、例えば、初期のジカルボニル還元酵素に比べ、少なくとも５％、１０％、２０％、３０％、４０％、５０％、１００％、１５０％、２００％、５００％増加し、又はさらに多く増加したことを指す。
本願で使用する用語「高謹厳条件」は、（１）洗浄に低イオン強度と高温度を利用し、例えば、０．０１５Ｍ塩化ナトリウム／０．００１５Ｍクエン酸ナトリウム／０．１％ラウリル硫酸ナトリウム、５０℃、（２）交雑中に変性剤、例えば、ホルムアミドを使用し、例えば、５０％（ｖ／ｖ）ホルムアミドと０．１％ウシ血清アルブミン／０．ｌ％ Ｆｉｃｏｌｌ／０．１％ポリビニルピロリドン／５０ｍＭリン酸三ナトリウム緩衝液を使用し、ｐＨ６．５、７５０ｍＭ塩化ナトリウムと７５ｍＭクエン酸ナトリウムとを有し、４２℃、又は（３）５０％ホルムアミド、５Ｘ ＳＳＣ（０．７５Ｍ ＮａＣｌ、０．０７５Ｍクエン酸ナトリウム）、５０ｍＭリン酸三ナトリウム（ｐＨ６．８）、０．１％ピロリン酸ナトリウム、５Ｘ Ｄｅｎｈａｒｄｔ溶液、超音波処理したサケ精子ＤＮＡ（５０ｇ／ｍｌ）、０．１％ ＳＤＳと１０％デキストラン硫酸を使用し、４２℃、４２℃で０．２Ｘ ＳＳＣ（塩化ナトリウム／クエン酸ナトリウム）と５０％ホルムアミド中で洗浄し、５５℃、その後、５５℃でＥＤＴＡを含有する０．１ ＸＳＳＣ中で高謹厳性洗浄を行う。
本願で使用する用語「発現カセット」は、線状又は環状の核酸分子を指す。特定のヌクレオチド酸配列を適切な宿主細胞で発現させることを指導するＤＮＡとＲＮＡ配列をカバーする。通常、標的ポリヌクレオチド酸と有効に接続したプロモーターを含み、任意の一つは終了信号及び／又は他の制御素子と有効に接続される。発現カセットはさらに、ヌクレオチド酸配列を正確に翻訳するに必要な配列を含む。コード化領域は通常、標的蛋白のコード化を行うが、センス又はアンチセンス方向でも標的機能ＲＮＡのコード化を行うことができ、例えば、アンチセンスＲＮＡ又は非翻訳のＲＮＡのコード化を行うことができる。標的ポリヌクレオチド酸配列を含む発現カセットが嵌め合わせられるものであることができ、少なくとも一つの組成が少なくとも他の一つの組成と出所が異なることを指す。発現カセットは天然に存在するものであってもよいが、非相同発現の有効再構成によって得られるものである。
本願で使用する用語「有効接続」は、コード化ヌクレオチド酸を正確且つ円滑に複製、転写又は発現するように、前記コード化ヌクレオチド酸をベクターの適切な位置に置く接続方式を指す。
本願で使用する用語「ベクター」は、二重鎖又は単一鎖線状又は環状形式の任意のプラスミド、コスミド、ファージ又はアグロバクテリウム二次元核酸分子を含む。再構成発現ベクターであることが好ましい。前核発現ベクターであることができれば真核発現ベクターであることもできるが、前核発現ベクターであることが好ましい。一部の実施方案において、前記再構成ベクターは、ｐＥＴ−２２ｂ（＋）、ｐＥＴ−３ａ（＋）、ｐＥＴ−３ｄ（＋）、ｐＥＴ−ｌｌａ（＋）、ｐＥＴ−１２ａ（＋）、ｐＥＴ−１４ｂ（＋）、ｐＥＴ−１５ｂ（＋）、ｐＥＴ−１６ｂ（＋）、ｐＥＴ−１７ｂ（＋）、ｐＥＴ−１９ｂ（＋）、ｐＥＴ−２０ｂ（＋）、ｐＥＴ−２１ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ａ（＋）、ｐＥＴ−２３ｂ（＋）、ｐＥＴ−２４ａ（＋）、ｐＥＴ−２５ｂ（＋）、ｐＥＴ−２６ｂ（＋）、ｐＥＴ−２７ｂ（＋）、ｐＥＴ−２８ａ（＋）、ｐＥＴ−２９ａ（＋）、ｐＥＴ−３０ａ（＋）、ｐＥＴ−３１ｂ（＋）、ｐＥＴ−３２ａ（＋）、ｐＥＴ−３５ｂ（＋）、ｐＥＴ−３８ｂ（＋）、ｐＥＴ−３９ｂ（＋）、ｐＥＴ−４０ｂ（＋）、ｐＥＴ−４１ａ（＋）、ｐＥＴ−４１ｂ（＋）、ｐＥＴ−４２ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ａ（＋）、ｐＥＴ−４３ｂ（＋）、ｐＥＴ−４４ａ（＋）、ｐＥＴ−４９ｂ（＋）、ｐＱＥ２、ｐＱＥ９,ｐＱＥ３０、ｐＱＥ３１、ｐＱＥ３２、ｐＱＥ４０、ｐＱＥ７０、ｐＱＥ８０、ｐＲＳＥＴ−Ａ、ｐＲＳＥＴ−Ｂ、ｐＲＳＥＴ−Ｃ、ｐＧＥＸ−５Ｘ−ｌ、ｐＧＥＸ−６ｐ−ｌ、ｐＧＥＸ−６ｐ−２、ｐＢＶ２２０、ｐＢＶ２２１、ｐＢＶ２２２、ｐＴｒｃ９９Ａ、ｐＴｗｉｎｌ、ｐＥＺＺ １８、ｐＫＫ２３２−１８、ｐＵＣ−１８又はｐＵＣ−１９から選ばれる。一部の実施方案において、前記ベクターはｐＥＴ−２２ｂ（＋）である。
本願で使用する用語「宿主細胞」は、前核細胞、イースト又は高等真核細胞を含む。適切な前核細胞は、例えばグラム陰性又はグラム陽性生物、例えば大腸菌等の腸内細菌科の真正細菌を含むがこれらに限定されることはなく、各種の大腸菌菌株は簡単に得られるものである。
本願で使用する用語「前記ジカルボニル還元酵素に作用を発揮させる条件」は、前記ジカルボニル還元酵素がその反応物質が対応する産物に転換するように触媒作用を果たす条件を指す。一部の実施方案において、前記「前記ジカルボニル還元酵素に作用を発揮させる条件」は、ジカルボニル還元酵素、ジカルボニル還元酵素の反応物質、補酵素、適切な緩衝体系を含む。
本願で使用する用語「一定の時間接触させる」とは、前記ジカルボニル還元酵素変異体と反応反応物質とが、前記ジカルボニル還元酵素に作用を発揮させる条件で、前記反応物質の少なくとも一部が対応する産物に転換するように、充分の時間反応することを指す。
本発明において前記ポリヌクレオチド酸を限定する時に用語「含む」を利用しているが、前記ポリヌクレオチド酸の両端に任意にその機能と関連しない他の配列を追加できることを意味することではないことは当業者であれば理解できることである。再構成操作の要求を満たすため、前記ポリヌクレオチド酸の両端に適切な制限性エンドヌクレアーゼの酵素分解部位を追加し、又は開始コドン、終止コドン等を追加しなければならないので、閉鎖式表現方式で前記二重特異性の４価抗体を限定すると、このような状況を真実にカバーできないことは当業者が理解できるものである。
また、コード化したアミノ酸を変更しない状況下、前記ヌクレオチド酸配列中の一つ又は複数のコドンに対して、一つ又は幾つかのコドン、例えば１、２、３、４、５、６、８、９、１０、１５、２０、３０、４０、５０個のコドンの同等の入れ替えを行うことができることは当業者が理解できるものである。コドン使用テーブルは当業者が周知のものである。
以下、非制限性実施例によって本発明を一層詳しく説明し、本発明の旨を離脱しない範囲内で、本発明に各種の変更を行うことができ、このような変更は全て本発明の範囲に含まれることは当業者が理解できることである。
特別な説明がない限り、以下の実験方法はいずれも通常の方法であって、また、特別な説明がない限り、使用される実験材料も商業会社から簡単に得られるものである。本発明の以下の実施例で使用する各種の抗体はいずれも商業用途の標準抗体である。
実施例
実施例１：ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ １２１菌株からのジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ７）の部位特異的飽和突然変異
ジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）のアミノ酸配列を、Ｓｗｉｓｓ−ｍｏｄｅｌウェブサイトにてタンパク質の三次元構造を模倣し、その後、Ｄｏｃｋｉｎｇによって反応物質とタンパク質の結合を模倣し、最後に、Ｐｙｍｏｌ分析を介して、反応物質とＮＡＤとの結合に関連する、ＮＡＤ陽子伝送に関連するアミノ酸を突然変異アミノ酸として選択する（図４）。
実施例１：ロドコッカス・エリスロポリス（Ｒｈｏｄｏｃｏｃｃｕｓ ｅｒｙｔｈｒｏｐｏｌｉｓ）ＳＫ １２１菌株からのジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ ： ７）の部位特異的飽和突然変異
ジカルボニル還元酵素（ＤＫＲ）のアミノ酸配列を、Ｓｗｉｓｓ−ｍｏｄｅｌウェブサイトにてタンパク質の三次元構造を模倣し、その後、Ｄｏｃｋｉｎｇによって反応物質とタンパク質の結合を模倣し、最後に、Ｐｙｍｏｌ分析を介して、反応物質とＮＡＤとの結合に関連する、ＮＡＤ陽子伝送に関連するアミノ酸を突然変異アミノ酸として選択する（図４）。
突然変異アミノ酸及びその両側の塩基性基配列（突然変異アミノ酸については表１．中の突然変異部位を参照）に基づいて、Ｐｒｉｍｍｅｒ５．０で対応する突然変異プライマーを設計する（表１）。ジカルボニル還元酵素遺伝子を含有するｐＥＴ２２ｂ（＋）発現ベクター（Ｎｏｖａｇｅｎから購入、製品番号 ６９７４４）をモデルとして、全プラスミドＰＣＲによって、完全な線形断片を得て、上記ＰＣＲ産物をＤＰｎ ｌによって消化して母体モデルを除去した後、大腸菌ＢＬ２ Ｋ（ＤＥ３）に転換し、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢシャーレに塗布し、３７℃で一夜培養した。
実施例２：ジカルボニル還元酵素突然変異体の初期選別
実施例１に記載の内容に基づいて、上記シャーレ上の単集落を９６深孔プレートに接種し、各孔に予めて５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基０．５ｍｌを投入し、３７℃で３ｈ振動培養した後、濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８℃で１６ｈ誘導発現し、６０００ｇにｌ０ｍｉｎ遠心処理を行って、菌体を得て、菌体を超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社）で細胞を破砕し、４℃、ｌ００００ｇに２０ｍｉｎ遠心処理を行って、上澄みを得て、マイクロプレートリーダーで活性初期選別を行う。９６孔プレートに３０μＬ ＤＭＳＯ、ｌ．５μＬ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル（３０ｍｇ／ｍｌをＤＭＳＯに溶解する）、２．５μＬ ＮＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍＬ）、２１６μＬりん酸塩緩衝液（ｌ００ｍＭ、ｐＨ=６．０）を添加し、３４０ｎｍにてバックグラウンド検出を行った後、それぞれ、各孔に既に製造された突然変異体酵素液５０μＬを添加し、すぐに３０℃で３４０ｎｍでの吸光光度値の変化を検出する。
実施例１に記載の内容に基づいて、上記シャーレ上の単集落を９６深孔プレートに接種し、各孔に予めて５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基０．５ｍｌを投入し、３７℃で３ｈ振動培養した後、濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８℃で１６ｈ誘導発現し、６０００ｇにｌ０ｍｉｎ遠心処理を行って、菌体を得て、菌体を超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社）で細胞を破砕し、４℃、ｌ００００ｇに２０ｍｉｎ遠心処理を行って、上澄みを得て、マイクロプレートリーダーで活性初期選別を行う。９６孔プレートに３０μＬ ＤＭＳＯ、ｌ．５μＬ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル（３０ｍｇ／ｍｌをＤＭＳＯに溶解する）、２．５μＬ ＮＡＤＨ（２０ｍｇ／ｍＬ）、２１６μＬりん酸塩緩衝液（ｌ００ｍＭ、ｐＨ=６．０）を添加し、３４０ｎｍにてバックグラウンド検出を行った後、それぞれ、各孔に既に製造された突然変異体酵素液５０μＬを添加し、すぐに３０℃で３４０ｎｍでの吸光光度値の変化を検出する。
酵素活性計算式：酵素活性（ｕ／ｍＬ）＝（△Ａ×６０×Ｖ１）／（６．２２×ｔ×Ｖ２）
ΔΑ：反応中の吸光光度値の変化
Ｖ１：反応体系の総体積
６．２２：消光係数
ｔ：ΔΑの検出時間
Ｖ１：添加した酵素液の体積を表す。
ΔΑ：反応中の吸光光度値の変化
Ｖ１：反応体系の総体積
６．２２：消光係数
ｔ：ΔΑの検出時間
Ｖ１：添加した酵素液の体積を表す。
実施例３：ジカルボニル還元酵素突然変異体の再度選別
実施例２中の酵素活性が母体を超える突然変異体を５０μｌ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基５００ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６００=０．６なるまで振動培養し、濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８℃で、誘導発現を行う。１６ｈ誘導した後、６０００ｇにｌ０ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。菌体を超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社）で細胞を破砕し、４℃で、１００００ｇに２０ｍｉｎ遠心処理を行って、上澄みを得て、活性の検出に使用した。１０ｍｌのフラスコに０．０５ｇ主原料
実施例２中の酵素活性が母体を超える突然変異体を５０μｌ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基５００ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６００=０．６なるまで振動培養し、濃度が０．２ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８℃で、誘導発現を行う。１６ｈ誘導した後、６０００ｇにｌ０ｍｉｎ遠心処理して菌体を収集した。菌体を超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社）で細胞を破砕し、４℃で、１００００ｇに２０ｍｉｎ遠心処理を行って、上澄みを得て、活性の検出に使用した。１０ｍｌのフラスコに０．０５ｇ主原料
（６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル）、０．５ｍｌポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料が溶解された後、４．０ｍｌりん酸塩緩衝液（ｌ００ｍＭ、ｐＨ=６．０）を添加し、主原料を緩衝液に均一に分散させ、１．５ｍｇ ＮＡＤ＋、２０．６ｍｇギ酸アンモニウム、１０ｍｇ補酵素ギ酸デヒドロゲナーゼ、０．５ｍｌジカルボニル還元酵素を投入し、体系ｐＨ＝６．０であって、３０±３℃で１６ｈ保温した後、薄層クロマトグラフィー（ＴＬＣ）にて追跡し、転換製品点が明確で、主原料点が不明確である体系を選択して、酢酸エチル抽出を行って、放置して分液し、有機相を取ってＨＰＬＣ分析を行った。
触媒活性が母体より優れている突然変異体を選択して順序を測定して、突然変異部位を分析し、拡大培養して、触媒活性を再び測定して、突然変異体Ｆ２３１Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１）、Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２）、Ｉ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ＋Ｆ２３１Ｗ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３）、Ｖ２３９Ｉ＋Ｒ２５７Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４）、Ｖ１５１Ｑ＋Ｒ２５７Ｋ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：５）、Ｉ９４Ｖ＋Ｖ１５１Ｑ（ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６）の触媒活性が確かに母体に比べ顕著に向上されたことが確定され、表２に再度選別結果を示す。ソフトウェアでジカルボニル還元酵素の三次元構造のコンピュータ模擬分析を行って、ここで、Ｉ９４はＮＡＤ結合領域に位置し、Ｖ１５１、Ｆ２３１、Ｖ２３９、Ｒ２５７の四つのアミノ酸はいずれも反応物質の結合部位付近に位置し、このようなアミノ酸の変更によって反応物質結合の特異性を向上させ、酵素の活性が向上された（図５）。
実施例４：ジカルボニル還元酵素突然変異体のクローンと発現
ジカルボニル還元酵素突然変異体の発現及び評定の便宜を図るため、その遺伝子の５'と３'末端に交換性のある制限性酵素分解部位を設計した。Ｎｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉとを用いて、それぞれ標的遺伝子とｐＥＴ−２２ｂ（＋）（他の大腸菌でタンパク質を発現できる発現プラスミドも使用する）とを同時に酵素分解を行って、酵素分解後の標的遺伝子とプラスミドとの大きい断片にＴ４ ＤＮＡ接続酵素で接続反応を行って、接続産物を大腸菌 ＤＨ５α菌株の受容性細胞に転換し、その後、転換後の受容性細胞を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培養プレートに塗布し、３７℃で一夜培養した。
ジカルボニル還元酵素突然変異体の発現及び評定の便宜を図るため、その遺伝子の５'と３'末端に交換性のある制限性酵素分解部位を設計した。Ｎｄｅ ＩとＸｈｏ Ｉとを用いて、それぞれ標的遺伝子とｐＥＴ−２２ｂ（＋）（他の大腸菌でタンパク質を発現できる発現プラスミドも使用する）とを同時に酵素分解を行って、酵素分解後の標的遺伝子とプラスミドとの大きい断片にＴ４ ＤＮＡ接続酵素で接続反応を行って、接続産物を大腸菌 ＤＨ５α菌株の受容性細胞に転換し、その後、転換後の受容性細胞を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培養プレートに塗布し、３７℃で一夜培養した。
上記シャーレに育成した単集落を選択して、５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基に接種し、３７℃で一夜振動培養し、菌体を収集してプラスミド抽出を行って、ＰＣＲ評価及び双酵素分解評価を行った後、正確なクローンベクターをｐＥＴ２２ｂ（＋）−Ｒ−Ｍと命名し、大腸菌ＢＬ２１（ＤＥ３）に転換し、転換された大腸菌 ＢＬ２１（ＤＥ３）を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ培養プレートに塗布し、３７℃で一夜培養した。上記培養プレートで育成した単集落を選択して５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基５ｍｌに接種し、コロニーＰＣＲで評価し、正確な発現ベクターを含有する大腸菌に後続の誘導発現を行った。上記菌液を５０μｇ／ｍｌアンピシリンを含有するＬＢ液体培養基５００ｍｌに接種し、３７℃でＯＤ６００=０．５〜０．６まで振動培養し、濃度がそれぞれ０．２〜１．０ｍＭになるまでＩＰＴＧを添加し、１８〜２５℃で、１０〜１６ｈ誘導発現した後、菌液を取り出して、６０００ｇにｌ０ｍｉｎ遠心処理を行って菌体を収集し、−２０℃で冷凍保存した。菌体を超音波破砕機（ＪＹ９２−２Ｄ、寧波新芝生物科学技術株式会社）で細胞を破砕し、４℃で、ｌ００００ｇに２０ｍｉｎ遠心処理を行って上澄みと沈殿物を得て、上澄みを縦型スラブゲル電気遊動アセンブリでＳＤＳ−ＰＡＧＥ検出を行った。発現されたジカルボニル還元酵素突然変異体がＳＤＳ−ＰＡＧＥで現れた分子量は約３０ＫＤであった。
実施例５：ジカルボニル還元酵素突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗの３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ化合物の調製における応用
一般式Ｉ
一般式Ｉ
に符合するジケトン化合物を初期原料として選択し、ここで、Ｒ１は、芳香基、アルキル基、ナフテン基、アルキル基で置換した芳香基、ハロゲンで置換した芳香基、芳香族複素環基、環状ヘテロアルキル基又は環状ヘテロアルキル化アルキル基から選ばれ、Ｒ２は、アルキル基、ナフテン基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化ナフテン基から選ばれる。上述したジヒドロキシ産物は化学一般式ＩＩ：
によって表し、ここで、Ｒ１は、芳香基、アルキル基、ナフテン基、アルキル基で置換した芳香基、ハロゲンで置換した芳香基、芳香族複素環基、環状ヘテロアルキル基又は環状ヘテロアルキル化アルキル基から選ばれ、Ｒ２は、アルキル基、ナフテン基、ハロゲン化アルキル基又はハロゲン化ナフテン基から選ばれる。
（１）ジカルボニル還元酵素突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗの３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステルの調製における応用
２５０ｍｌフラスコに５ｇ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル：
２５０ｍｌフラスコに５ｇ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル：
２０ｍｌポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料を溶解させた後、１６０ｍｌりん酸塩緩衝液（ｌ００ｍＭ、ｐＨ=６．０）を添加し、主原料を緩衝液に均一に分散させ、０．１５ｇ ＮＡＤ＋、２０．６ｇギ酸アンモニウム、０．２５ｇ補酵素ギ酸デヒドロゲナーゼ、２ｗｔジカルボニル還元酵素突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗの粗い酵素液を添加し、体系ｐＨ=６．０であって、３０±３℃で１７ｈ保温し、２００ｍｌ酢酸エチルで反応を停止し、１２５ｇ硅藻土でろ過し、２００ｍｌ酢酸エチルで２回抽出し、放置して分液し、有機相を得て、乾燥、ろ過、濃縮して粗製品を得て、製品３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル：体系中
（６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル）の割合は８６〜９１％で、収率は８０〜８６％で、ｅｅ値は９９．５％を超えていて、ｄｅ値は８８〜９５％である。
得られた製品の核磁性データは、４００Ｈｚ、ＣＤＣ１３：δ７．２９（ｍ，５Ｈ）、４．５４（ｓ，２Ｈ）、４．２２（ｍ，１Ｈ）、４．０７（ｍ，１Ｈ）、３．４５〜３．４０（ｍ，４Ｈ）、２．４１（ｄ，２Ｈ）、１．６５（ｔ，２Ｈ）、１．４３（Ｓ，９Ｈ）である。
他の五つのジカルボニル還元酵素突然変異体の主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステルに対する触媒活性や反応方法が類似するので、ここでは詳細な説明を省略する。
（２）ジカルボニル還元酵素突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗの３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ネオペンチルエステルの調製における応用
５００ｍｌフラスコに５ｇ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ネオペンチルエステル
５００ｍｌフラスコに５ｇ主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ネオペンチルエステル
１０ｍｌポリエチレングリコールＰＥＧ−４００を投入し、原料が溶解した後、１６０ｍｌりん酸塩緩衝液（ｌ００ｍＭ、ｐＨ=６．０）を添加し、主原料を緩衝液に均一に分散させ、０．１５ｇ ＮＡＤ＋、２０．６ｇギ酸アンモニウム、０．２５ｇ補酵素ギ酸デヒドロゲナーゼ、９ｗｔジカルボニル還元酵素突然変異体Ｉ９４Ｖ＋Ｆ２３１Ｗ粗い酵素液を添加し、体系ｐＨ=６．０であって、３０±３℃で１７ｈ保温し、２００ｍｌ酢酸エチルで反応を停止し、１２５ｇ硅藻土でろ過し、２００ｍｌ酢酸エチルで２回抽出し、放置して分液し、有機相を乾燥、ろ過、濃縮して粗製品を得て、３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ネオペンチルエステル：体系
（３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基−６−ベンジルオキシ基−ヘキサン酸ネオペンチルエステル）中の割合は８０〜９０％で、収率は７５〜８５％で、ｅｅ値は９９．３％を超えていて、ｄｅ値は９０〜９６％である。
得られた製品の核磁性データは、４００Ｈｚ、ＣＤＣＩ３：７．２６〜７．３５ｐｐｍ（ｍ，５Ｈ）、４．５６ｐｐｍ（ｓ，２Ｈ）、４．２４ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）、４．０８ｐｐｍ（ｍ，１Ｈ）、３．７９ｐｐｍ（ｓ，１Ｈ）、３．４５ｐｐｍ （ｄ，２Ｈ）、３．３０ｐｐｍ（ｄ，１Ｈ）、２．４４ｐｐｍ （ｄ，２Ｈ）、１．７９ｐｐｍ（q，２Ｈ）、１．６０〜１．６５ｐｐｍ（ｄｄ，２Ｈ）、１．４３ｐｐｍ（ｓ，６Ｈ）、０．８８ｐｐｍ（ｔ，３Ｈ）である。
他の五つのジカルボニル還元酵素突然変異体の主原料６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ネオペンチルエステルに対する触媒活性や反応方法が類似するので、ここでは詳細な説明を省略する。
Claims (10)
- ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１乃至ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：６から選ばれる一つのアミノ酸配列を含有する、ジカルボニル還元酵素突然変異体。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１、２、３、４、５又は６に示すアミノ酸配列を含有する請求項１に記載のジカルボニル還元酵素突然変異体。
- ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に示すアミノ酸配列を含有する請求項１又は２に記載のジカルボニル還元酵素突然変異体。
- ヌクレオチド酸コード化配列が、
ａ）、ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：９乃至１４に示す配列
を含有する、請求項１に記載のジカルボニル還元酵素突然変異体。 - 請求項４に記載のヌクレオチド酸コード化配列を含有する発現カセット。
- 請求項４に記載のヌクレオチド酸コード化配列を有効に接続する再構成ベクター。
- 再構成発現ベクターである請求項６に記載の再構成ベクター。
- 請求項６または７に記載の再構成ベクターを含有する宿主細胞。
- 請求項１乃至３の中のいずれかに記載のジカルボニル還元酵素突然変異体又は請求項４又は５に記載のヌクレオチド酸コード化配列によりコード化したタンパク質又は請求項５に記載の発現カセットを有するベクターを含有する宿主細胞で取得したジカルボニル還元酵素突然変異体又は請求項６または７に記載の再構成ベクターを有する宿主細胞で取得したジカルボニル還元酵素突然変異体又は請求項８に記載の宿主細胞で取得したジカルボニル還元酵素突然変異体とジケトン類化合物とを、前記ジカルボニル還元酵素に作用を発揮させた条件で、一定の時間接触させる工程を含み、
ここで、ジケトン類化合物は、市場で商業化された原料又は簡単に製造できる一般式Ｉで示すケトン系化合物であって、
- 前記ジケトン類化合物は、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ｔ−ブチルエステル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸ネオペンチルエステル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸メチル、６−ベンジルオキシ基−３,５−ジオキソ−ヘキサン酸エチルから選ばれる請求項９に記載の３Ｒ,５Ｓ−ジヒドロキシ基化合物の製造方法。
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